A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL
para as CIÊNCIAS da SAÚDE
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Medicina Dentária - Mestrado Integrado – UBA 1 BQ - MTBarros
Capítulo III. A Cinética Enzimática
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 Catalisadores biológicos
 Poder catalítico e especificidade
 Reguladas
Nem todas as enzimas são proteínas
Ribozimas...
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As enzimas podem aumentar a velocidade das reacções
pelo menos 1 milhão de vezes... COMO ?
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PROTEÍNAS - Enzimas: cofactores
Muitas enzimas (APOENZIMAS)
necessitam de
cofactores - Metais
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Enzimas: cofactores
…Metais
Anidrase carbónica humana: requer zinco, que está ligado aos
anéis imidazol de 3 resíduos de histidina e a uma molécula de água
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Enzimas: cofactores
Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de
Pequenas moléculas orgânicas - COENZIMAS
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Enzimas: cofactores
… Pequenas moléculas orgânicas (coenzimas)
Fosforilase do glicogénio: envolvida na utilização de glicogénio para produzir
energia, requer a coenzima piridoxal fosfato (PLP)
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Enzimas: cofactores
COFACTORES
Iões Metálicos
Iões Activadores
Iões do
local activo
Coenzimas
Cosubstratos
Grupos
prostéticos
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Enzimas: classificação
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Enzimas: funcionamento
Catálise Enzimática
Depende de interacções precisas com o
substrato...
... As interacções com o substrato,
envolvem:
• forças de van der Waals
• forças electrostáticas
• pontes de hidrogénio
• interacções hidrofóbicas
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Enzimas: especificidade
Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)
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Enzimas: funcionamento
As enzimas não conseguem alterar as leis da termodinâmica → não alteram
o equilíbrio de uma reacção química
A+B
AB
Uma enzima acelera os dois sentidos da reacção
exactamente na mesma proporção
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Enzimas: funcionamento
Formação de um complexo que representa o estado de transição...
E+S
ES
E+P
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Enzimas: funcionamento
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Enzimas: funcionamento
Facilitam a ocorrência do estado de transição, diminuindo a energia de
activação, e consequentemente, aumentando a velocidade da reacção
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Enzimas: funcionamento
O estado de transição existe?
Para uma concentração constante de
enzima, a velocidade da reacção
aumenta com o aumento da
concentração do substrato, até se
atingir uma velocidade máxima...
•... todos os centros catalíticos estão
preenchidos e, consequentemente, a
velocidade da reacção …
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Enzimas: funcionamento
O estado de transição existe?
Alterações
nas
características
espectroscópicas de enzimas quando se
adiciona substrato -
complexo enzima
substrato.
A intensidade da fluorescência
da sintetase do triptofano
varia com a adição de serina e
de indol (substratos)
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Enzimas: local activo
Resolução de estruturas
por cristalografia de
raios-X
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Lisosima
Enzimas: local activo
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 8-10 aminoácidos no local activo
 Preferência por resíduos hidrofóbicos
Nomenclatura dos aminoácidos no local activo P3-P2-P1 – P`1-P`2-P´3
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Asp catalíticos
Protease aspártica
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S`1
S3
S1
S`2
S2
S`3
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S`1
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S1
Pepsina :
I30, D32, Y75, T77, F111, F117, - , D215, G217, T218
Catepsina D: - , D32, Y75, S77, F112, F117, I120, D215, G217, T218
Cardosina A : - , D32, Y75, T77, F112, F117, I120, D215, G217, T218
S`1
Pepsina :
G34, G76, Catepsina D: G34, G76, Cardosina A : - , G76, -
,Y189, I213, D215, - , M289, Y291, I300
, - , I213, D215, T218, M289, I291, I300
,Y189, F213, D215, - , M289, - , I300
Loop Flexível para coordenação com o substrato
Pepsina :
L71, S, I, T, Y, G76, T, G, S, M, T, G82
Catepsina D: F71, A, I, H, Y, G76, S, G, S, L, S, G82
Cardosina A: G71, A, I, I, Y, G76, T, G, S, I, T, G82
Cardosina B: A71, S, I, Q, Y, G76, T, G, A, I, V, G82
S2 na cardosina e pepsina
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Enzimas: local activo
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Enzimas: local activo
Modelo do encaixe induzido
...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
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Enzimas: local activo
...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
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Enzimas: local activo
O que se passa
no local activo?
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Enzimas: local activo
Para promover interacções efectivas com o substrato
Ribulose-1,5-bifosfato
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Enzimas: especificidade
Definida pela estrutura 3D (ou 4D)
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Modelo de Michaelis e Menten
Enzimas: Cinética Enzimática
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Modelo de Michaelis e Menten
Enzimas: Cinética Enzimática
V, varia com a [S] para uma concentração fixa de enzima [E0]
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Enzimas: Cinética Enzimática
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Enzimas: Cinética Enzimática
... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M
KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato
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Enzimas: Cinética Enzimática
... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M
Kcat - “turnover number”
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Enzimas: Cinética Enzimática
Como medir a eficiência de uma enzima?
...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima)
Perfeição enzimática
Algumas enzimas aproximam-se destes valores...
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Enzimas: Cinética Enzimática
Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com
que encontram o substrato em solução
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Enzimas: Cinética Enzimática
Influência da temperatura e pH
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Influência da temperatura
Enzimas: Cinética Enzimática
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Enzimas: Cinética Enzimática
Influência do pH
Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer
devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e
coenzima
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Enzimas: Cinética Enzimática
Influência do pH – Regula a actividade
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Enzimas: Cinética Enzimática
Substratos múltiplos
Reacções com transferência de grupos funcionais de um
substrato para o outro...
...nas reacções de oxidação redução, são transferidos electrões
Reacções que envolvem substratos múltiplos, classificam-se em duas
classes:
• Deslocamento sequencial
• Deslocamento duplo
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Substratos múltiplos
Enzimas: Cinética Enzimática
Deslocamento sequencial
Todos os substratos têm que estar ligados antes da
libertação de qualquer produto
Dividem-se em duas subclasses:
• Sequencial ordenado
• Sequencial aleatório
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Enzimas: Substratos múltiplos
Enzimas: Cinética Enzimática
• Deslocamento sequencial
• Deslocamento duplo
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Substratos múltiplos
Enzimas: Cinética Enzimática
Deslocamento sequencial
Num mecanismo sequencial ordenado, a ordem de ligação do
substrato e de libertação do produto é importante
Forma-se um complexo ternário
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Enzimas: Cinética Enzimática
Enzimas: Substratos múltiplos
Deslocamento sequencial
Num mecanismo sequencial aleatório, a ordem de ligação do substrato e
de libertação do produto não é importante
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Enzimas: Cinética Enzimática
Substratos múltiplos
Deslocamento duplo
Também designadas de reacções “ping pong”
 Um dos produtos é libertado antes de todos os substratos estarem
ligados
 Neste tipo de reacções, forma-se um complexo enzima - substituída
1.
2.
3.
Um grupo funcional é transferido do primeiro substrato para a
enzima
O primeiro produto é libertado
Liga-se o segundo substrato e o grupo funcional ligado à
enzima é transferido para ele
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Substratos múltiplos
Enzimas: Cinética Enzimática
Deslocamento duplo
Catalisa a transferência de um grupo amina do aspartato
para o -Cetoglutarato
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Deslocamento sequencial
ordenado
Enzimas: Cinética Enzimática
Deslocamento duplo
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
A actividade de diversas
enzimas pode ser inibida pela
ligação
de
pequenas
moléculas específicas e de
iões
Algumas drogas e agentes
tóxicos
podem
inibir
o
funcionamento
de
certas
enzimas
A
inibição
pode
ser
reversível ou irreversível
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição reversível
O complexo enzima – inibidor
dissocia-se rapidamente
Dois tipos de inibição:
1. Competitiva
2. Não competitiva
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Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição reversível: Competitiva
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição reversível: Não - Competitiva
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Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição reversível
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição reversível: Mista
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Inibidor
Gly76
Inibidor
Gly76
C-terminal
Loop flexível
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição irreversível
Os inibidores irreversíveis
ligam-se
covalentemente
aos resíduos dos locais
activos
Desenho Racional de Fármacos
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Inibidor
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Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição irreversível
Existem três classe de inibidores irreversíveis:
Específicos de grupos
Proteases tiólicas
Ligam-se a cadeias laterais específicas
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição irreversível
Marcadores de afinidade
Moléculas
estruturalmente
semelhantes ao substrato
e que modificam
covalentemente o local
activo
Mais selectivos que os
específicos de grupos
O TPCK é um marcador de afinidade para a quimotripsina – DIAGNÓSTICO?
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibição irreversível
Inibidores suicidas
São substratos modificados e
são os mais específicos para
marcar o local activo
Ligam-se como se fossem
substrato e o mecanismo
catalítico normal é activado,
produzindo uma espécie
reactiva que posteriormente se
liga covalentemente à enzima
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Desenho Racional
de Fármacos -
Inibidores
para o estado
de transição
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Regulação e Inibidores
Desenho Racional de Fármacos -
Enzimas: Cinética Enzimática
Inibidores para o estado de transição
Moléculas que imitam o estado de transição do substrato, são inibidores potentes
Biblioteca de péptidos
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Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática
Desenho Racional de
Fármacos -
Inibidores para o
estado de
transição
Como são
feitos os
estudos?
PROPOSTA
PELOS ALUNOS
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