UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA: MEDICINA A N-ACETILCISTEÍNA (NAC) POTENCIALIZA A AÇÃO DO INTERFERON EM CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR NÉLSON ALEXANDRE KRETZMANN FILHO Porto Alegre 2010 A N-ACETILCISTEÍNA (NAC) POTENCIALIZA A AÇÃO DO INTERFERON EM CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR NÉLSON ALEXANDRE KRETZMANN FILHO Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Hepatologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do Grau de Doutor. Orientador Dr. Claudio Augusto Marroni Coorientadora Drª Norma Anair Possa Marroni Porto Alegre 2010 “Quando verificares com tristeza que nada sabes, terás feito teu primeiro progresso no aprendizado”. Jigoro Kano (1860-1938 d.C.) Nada é impossível para aquele que persiste. Alexandre (356-323 a.C.) III DEDICATÓRIA À professora Dra Norma Anair Possa Marroni e ao professor Dr Claudio Augusto Marroni, minha gratidão por terem confiado no meu trabalho e no meu profissionalismo, abrindo um novo horizonte, com dificuldades e criticas, mas sempre afirmando “tem que dar certo”. Pela orientação e também pelo carinho, meu reconhecimento e agradecimento. IV Aos meus pais, tudo que sou devo à educação que me foi dada por quem foi e é de suma importância na minha formação. Com vocês, aprendi a lutar pelo que é certo e justo. O maior desejo dos Homens é o de encontrar na vida alguém que os faça fazer o melhor que puderem... Não me foi necessário procurar, encontrei-o em vocês. V À minha irmã, pessoa ímpar, dotada de sentimento e companheirismo, obrigado pela tua força e luta que me servem como exemplo. VI Agradecimentos Aos meus orientadores, professor Dr Claudio Augusto Marroni e à professora Dra Norma Anair Possa Marroni, meu agradecimento pela perseverança neste trabalho. À minha mãe, sempre zelosa pelos seus, minha força nesta e em outras caminhadas. Aos meus avós, por acreditarem que as dificuldades da vida devem ser superadas com muito trabalho, é assim que o verdadeiro valor aparece. À minha tia Rita Maria e aos meus primos, agradeço o companheirismo e carinho de sempre. Ao professor José Luiz Mauriz, agradecimentos pelo apoio científico e tecnológico. À professora Úrsula da Silveira Matte, obrigado pela paciência em relação às minhas idéias e experimentos, pela acolhida em seu laboratório e pelo carinho nos momentos de desabafo. Ao Dr Henrique Fillmann, um grande amigo sempre disposto a ouvir minhas idéias, obrigado pela ajuda no meu crescimento profissional e pessoal. Ao amigo e colaborador Eduardo Chiela, meu reconhecimento pelo apoio e ajuda nos experimentos, sem esquecer as correções sempre muito bem colocadas. Ao professor Guido Lenz, agradeço a disposição na utilização do laboratório e o apoio técnico-científico nos experimentos. Aos colegas do Centro de Terapia Gênica, em especial, à Carolina Uribe e ao Guilherme Baldo, que estiveram ao meu lado em boa parte dessa caminhada, meu carinho VII Aos colegas do Laboratório de Hepatologia Experimental e Fisiologia e do Laboratório de Estresse Oxidativo pela cooperação e sugestões Aos colegas do laboratório de Vias Aéreas e Pulmão, Luiz Alberto Forgiarini e Luiz Felipe Forgiarini, agradeço a atenção e dedicação. Ao Tio Sílvio e a todos os amigos da Escola de Equitação do Cristal, obrigado pelas oportunidades de convivência, pois sem vocês nada seria igual. À Laura, uma pequena grande mulher, meu reconhecimento, admiração e afeto VIII SUMARIO Resumo......................................................................................................................................... 1 Abstract......................................................................................................................................... 2 1 Introdução ................................................................................................................................. 3 2 Referencial Teórico .................................................................................................................. 6 2.1 Epidemiologia e história natural do carcinoma hepatocelular ............................................. 7 2.2 Incidência e Mortalidade ..................................................................................................... 8 2.3 Fatores Demográficos ......................................................................................................... 9 2.3.1 Idade .............................................................................................................................. 9 2.3.2 Gênero ........................................................................................................................... 10 2.3.3 Etnia ............................................................................................................................... 10 2.4 Fatores de Risco ................................................................................................................. 11 2.4.1 Vírus de Hepatite B ........................................................................................................ 11 2.4.1.1 O Vírus da Hepatite B e o CHC ................................................................................ 13 2.4.2 Vírus da Hepatite C ........................................................................................................ 15 2.4.2.1 O Vírus da Hepatite C e o CHC................................................................................. 18 2.4.3 Aflatoxina ....................................................................................................................... 20 2.4.4 Álcool.............................................................................................................................. 21 2.5 Cirrose................................................................................................................................. 22 2.6 Fator de Transcrição Nuclear kappa B (NF-kB)................................................................... 23 2.6.1 NF-kB e Câncer.............................................................................................................. 24 2.7 Interferon.............................................................................................................................. 27 2.7.1 Interferon e Câncer......................................................................................................... 29 2.7.2 Interferon e CHC............................................................................................................. 30 2.8 N-Acetilcisteína.................................................................................................................... 31 2.8.1 N-Acetilcisteína e Câncer............................................................................................... 33 2.9 Apoptose e Morte Celular.................................................................................................... 34 3 Justificativa .............................................................................................................................. 35 4 Objetivos ................................................................................................................................... 37 4.1 Objetivo Geral:..................................................................................................................... 38 4.2 Objetivos Específicos:.......................................................................................................... 38 5 Materiais e Métodos.................................................................................................................. 39 5.1 Cultivo Celular e tratamento................................................................................................ 40 5.2 Viabilidade Celular............................................................................................................... 41 5.3 Citometria de Fluxo e Apoptose........................................................................................... 42 IX 5.4 Expressão Proteica.............................................................................................................. 43 5.5 Transfecção com siRNA e silenciamento da Expressão da subunidade p65 do NF-kB 44 5.6 Expressão do mRNA da subunidade p65 do NF-kB............................................................ 44 5.7 Análise Estatística................................................................................................................ 46 6. Resultados................................................................................................................................ 47 6.1 Avaliação da Viabilidade Celular......................................................................................... 48 6.2 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF no ciclo celular a na Apoptose.............................. 50 6.3 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF na Expressão da subunidade p65........................ 55 6.4 Envolvimento do NF-kB na resposta da NAC em células de CHC..................................... 56 7 Discussão.................................................................................................................................. 59 8 Conclusões................................................................................................................................ 70 9 Perspectivas Futuras................................................................................................................ 72 10 Referências Bibliográficas:.................................................................................................... 74 X Lista de Figuras Figura 1. Incidência global de câncer hepático em homens ...................................................................... 9 Figura 2. A distribuição geográfica da infecção crônica pelo VHB............................................................. 12 Figura 3. Distribuição global de infecção crônica de VHC.......................................................................... 18 Figura 4. Rota de ativação do NF-B......................................................................................................... 23 Figura 5: Envolvimento do NF-B na biologia tumoral............................................................................... 26 Figura 6: Inibição do NF-kB e apoptose..................................................................................................... 27 Figura 7: Estrutura Molecular do Interferon alfa Humano.......................................................................... 28 Figura 8: Estrutura Molecular da NAC........................................................................................................ 32 Figura 9: NAC potencializa o efeito do interferon, diminuindo a viabilidade celular em ambas as 49 linhagens estudadas.................................................................................................................................... Figura 10: Avaliação da distribuição do ciclo celular através da citometria de fluxo............................... 50 Figura 11: Histograma da distribuição do Ciclo Celular.............................................................................. 51 Figura 12A: Análise de morte celular com Anexina V e com PI-HepG2.................................................... 53 Figura 12B: Análise de morte celular HepG2............................................................................................. 53 Figura 12C: Análise de morte celular com Anexina V e com PI-Huh7....................................................... 54 Figura 12D: Análise de morte celular Huh7................................................................................................ 54 Figura 12E: Análise de morte celular HepG2 24 horas.............................................................................. 55 Figura 13: Avaliação da expressão do p65 por Western Blot................................................................... 56 Figura 14A: Eficiência de transfecção com siRNA..................................................................................... 57 Figura 14B: Silenciamento da subunidade p65 do NF-kB.......................................................................... 57 Figura 15: Efeito do INF e da NAC na viabilidade das células com silenciamento da subunidade 58 p65............................................................................................................................................................... XI Lista de Tabelas Tabela 1.Fatores de risco relacionados ao desenvolvimento do CHC...................................................... 11 Tabela 2 Efeito do INF, da NAC e da NAC+INF sobre a viabilidade celular das duas linhagens estudadas em diferentes tempos............................................................................... 48 Tabela 3. Distribuição do Ciclo Celular HepG2 48 horas............................................................................ 51 Tabela 4. Distribuição do Ciclo Celular Huh7 48 horas.............................................................................. 51 Tabela 5.:Análise da Anexina V por citometria de fluxo.............................................................................. 52 XII ABREVIATURAS A AAT ADH2 ALDH2 AFB1 AFP AgHBe AgHBs AIDS Anti-HBC Anti-VHC AP1 ATCC BCL Bcl-3 cDNA 5-FU CO2 CHC C282Y CYP2E1 CYP17 DD DMSO DNA DTT ECL EDTA EHNA EPHX EPHX1 EPHX2 ERO FGFs G GAPDH GSH GST GST loci GSTM1 GSTTI GSTPI GSTA4 HAART HBX Adenina Alfa1 antitripsina Álcool desidrogenase ADH2: Álcool desidrogenase Desidrogenase aldeído Aflatoxina B1 ALDH2: Desidrogenase aldeído Alfa-fetoproteína 33333333333 Antígeno e do VHB AFB1: Aflatoxina B1 Antígeno de superfície do VHB AFP: Alfa-da fetoproteína Síndrome imunodeficiência adquirida Anticorpo anti o CORE do VHB AgHBs: Antígeno Anticorpo antivírusde dasuperfície hepatite Cdo VHB Proteína AgHBe: ativadora 1 American type cell collection B-Cell AIDS: Lymphoma Síndrome da imunodeficiência adquirida B-Cell Lymphoma 3 DNA complementar 5-Fluoracil Dióxido de carbono Carcinoma hepatocelular Citocromo p450 282Y Citocromo p450 2E1 Citocromo p450 17 alfa Domínio da morte Dimetilsulfóxido Ácido desoxirribonucleico Detiotritol Enhancer Chemiluminescent Luminol Ácido etilenodiamino tetra-acético Esteato Hepatite Não Alcoólica Epóxido hidrolase Epóxido hidrolase 1 Epóxido hidrolase2 Espécies reativas de oxigênio Fatores de crescimento de fibroblastos Guanina Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase Glutationa Reduzida Glutationa-S-transferase Glutationa-S-transferase lócus Glutationa-S-transferaseM1 Glutationa-S-transferaseTI Glutationa-S-transferase PI Glutationa-S-transferase A4 Terapia antiviral altamente ativa Proteína X XIII H2O HFE HH FIH HIF-1α HIV hTERT IARC INF INF-α INF-β INF-γ INF-ω IGF-II IkB IB IB IB, IB, IKK IKK IKK IKK IL-10 IL-12 Kb KCL KH2PO4, Água Gene da Hemocromatose de Mamíferos Hemocromatose hereditária Fator induzível de Hipóxia Fator induzível de Hipóxia 1 alfa Vírus da imunodeficiência humana Transcriptase reversa da telomerase humana Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer Interferon Interferon alfa Interferon Interferon beta Bet Interferon gamma Interferon ômega insulin –like grown factor II Inibidor Kappa B Inibidor Kappa B alfa Inibidor Kappa B beta Inibidor Kappa B gama Inibidor kappa B Epson Inibidor kappa quinase Inibidor kappa quinase alfa Inibidor kappa quinase beta Inibidor kappa quinase gama Interleucina 10 Interleucina 12 Kappa B Cloreto de potássio Dihidrogenofosfato de potássico KD KDa Knockdown Quilodaltons MAPK Mitógenos ativados por kinases MHC Complexo maior de histocompatibilidade mRNA MTT RNA mensageiro Metiltetrazolium NAC N-acetilcisteína NaCl Cloreto de sódio Na2HPO4 NAT1 Fosfato de sódio NAT2 N-acetiltransferase 2 NEMO NF-B OMS PAMP Complexo de ligação NEMO Fator de transcrição nuclear Kappa B N-acetiltransferase 1 Organização Mundial da Saúde Padrão molecular associado ao patógeno XIV PB PBS PCR PCT PDGF PVDF Pi PI PIA OS RA RNA SDS Se siRNA SH SRD5A2 T TECs TNF TNFR TNFR1 TOF VEGF Pares de base Tampão fosfato-salino Reação em cadeia polimerase Porfiria cutânea tardia Fatores de crescimento derivado de plaquetas Polifluoruro de Vinilideno Inibidor de protease Iodeto de Propídeo Porfiria aguda intermitente Fosfatidilserina Receptor androgênico Ácido ribonucléico Dodecil Sulfato de Sódio Selênio Small Interfere RNA Grupo Tiol 5- alfa-redutase Timina Células endoteliais tumorais Fator de necrose tumoral alfa Receptor do fator de necrose tumoral Receptor do fator de necrose tumoral tipo 1 Transplante ortotópico de fígado Fator de crescimento epitelial vascular VHB VHC Vírus da hepatite B Vírus da hepatite C XV 1 __________RESUMO__________ O Carcinoma Hepatocelular (CHC), malignidade primária mais comum do fígado, é complicação de doença hepática crônica avançada e representa o quinto tumor mais frequente no mundo, com mais de 550.000 novos casos por ano, sendo quatro vezes mais comum em homens do que em mulheres. Uma importante via de sinalização, alterada em tumores humanos, é o módulo de sinalização IKK/NF-κB. O NF-kB pode afetar todos os seis “hallmarks” do câncer ligados à ativação da transcrição de genes associados com a proliferação celular, a angiogênese, as metástases, a promoção de tumor, a inflamação e a supressão da apoptose. Devido às suas propriedades de regulação da diferenciação e do crescimento celular, os interferons (INFs) têm sido usados na tentativa de tratar neoplasias. Ressecção cirúrgica, ablação por radiofrequência e o transplante de fígado são as opções no tratamento de pacientes com CHC. A administração da N-Acetilcistenína (NAC) pode ter papel de prevenção do câncer e uma abordagem integrada no tratamento de algumas formas de câncer, contudo, a informação nessa área ainda é preliminar. Este trabalho tem como objetivo avaliar a resposta da NAC como potencializador do efeito antitumoral do INF em linhagens de carcinoma hepatocelular humano e verificar o envolvimento da rota do NF-kB na via de ação da NAC. Células de hepatocarcinoma humano HepG2 e Huh7 foram utilizadas para avaliar a resposta da NAC (10mM), do INF(2,5 x104U/mL) e do cotratamento NAC+INF em diversos tempos. Foi avaliada a viabilidade celular (MTT), a apoptose (Anexina V), o envolvimento do NF-kB (siRNA p65) e a expressão da subunidade p65(western Blot) A NAC diminuiu a viabilidade celular em 24horas em Huh7 e, em 48 horas, em HepG2. Ao final do trabalho, demonstramos que a NAC potencializa o efeito citotóxico do INF em cotratamento, reduzindo a viabilidade celular em ambas as linhagens celulares (24, 48, 72, 96 horas). Ao avaliar a distribuição do ciclo celular, não observamos alterações em ambas as linhagens celulares e tratamentos. O INF induziu a marcação com anexina de ambas as linhagens celulares em 48 e 72 horas de tratamento, mas em níveis mais elevados nas células Huh7. NAC induziu a marcação com anexina em 48 horas nas células Huh7, mas não nas células HepG2, nas quais o resultado foi antecipado para 24 horas. Demonstramos que a NAC diminui a expressão da subunidade p65 após 72 horas de tratamento. Também demonstramos que o cotratamento com NAC mais INF diminui a expressão da subunidade p65 significantemente em cerca de 50% em ambas as linhagens, sugerindo que o NF-kB pode ser um modulador central da resposta das células de CHC no tratamento com NAC + INF. Quando utilizamos o siRNA p65, observamos redução significativa em relação ao controle siRNA. Com isso se demonstra que, quando tratamos as células com siRNA específico para a subunidade p65 ou com a NAC, o resultado de inibição é igual ao do siRNA com a NAC, demonstrando, assim, a especificidade de ação NAC pela via do NF-B. A NAC mostrou efeito potencializador na resposta antitumorall do INF, diminuindo a viabilidade celular, aumentando a apoptose e diminuindo a expressão da subunidade p65 do NF-kB 2 __________ABSTRACT__________ Hepatocellular Carcinoma (CHC), the most common liver primary malignancy, is an advanced chronic hepatic complication and represents the fifth most frequent tumour in the world, with more than 550.00 new cases per year and being four times more common in men rather than in women. An important signalisation pathway, altered in human tumours is the IKK/NF-κB signalisation module. An alteration in the NF-κB regulation have been observed in lots of tumours, and the NF-κB can affect all the six hallmarks of cancer, linked to the activation of the gene transcription associated to the cellular proliferation, angiogenesis, metastasis, tumour promotion, inflammation e apoptosis suppression. Due to the differentiation and growth regulation properties, the INF have been used in the attempt of neoplasm’s treatment. Nevertheless, little is known about the INF therapy against cancer. Surgical resection, radio frequency ablation and liver transplant are the options in the hepatocellular carcinoma (CHC) patient treatment. NAC administration can have a cancer prevention role and an integrated approach in some tipes of cancer treatment, thoug the information in this area being yet prliminar. This work aims to evaluate the NAC response as a potentiator of the antitumoural INF effect in human HCC cell lines and verify the implication of the NF-kB route in the NAC`s interaction pathway. The HepG2 and Huh7 HCC cells line has been utilized to evaluate the NAC (10mM), INF (2,5 x104U/mL) and NAC+INF co-treatment response in different times. Cellular viability (MTT) apoptosis (Anexina V), NF-kB (siRNA p65) involvement and the p65(western Blot) subunit expression. NAC decrease cell viabilty already in 24h in Huh7 and 48 hours in HepG2. At the end, it was demonstrated that the NAC potentiates the INF citoxic effect in cotreatment, decreasing the cellular viability in both cellular strains. Cell Cycle distribution weren’t observed any alterations in both cells lines and treatments. INF induced the anexin staining of both cellular lines in 48 and 72 treatment hours, but in higher levels, observed on the Huh7 cells. The NAC induced the anexin staining in 48 hours on the Huh7cells, but not in the HepG2 cells, however the NAC induced the anexin staining already in 24 hours. NAC decreases the p65 subunit expression after 72 treatment hours. It was still also demonstrated that the co-treatment with NAC plus INF decreases significantly the p65 subunit expression, around 50% and both the lines, suggesting that the NF-kB can be a central modulator of the CHC cells response in the NAC + INF treatment. When utilizing the specific p65 subunit siRNA, it was observed an also significant reduction regarding the COsiRNA. Therewith, result shows that, when treating the cells with specific p65 subunit siRNA, with the NAC the inhibition result is the same as the COsiRNA with NAC, both leading a higher cellular viability reduction regarding the COsiRNA, thus demonstrating the NAC action specificity by the NF-B pathway. The NAC demonstrated its potentiator effect in the INF antitumoral response decreasing the cellular viability, increasing the apoptosis and decreasing the NF-kB p65 subunit expression. 3 INTRODUÇÃO 4 1. INTRODUÇÃO O Carcinoma Hepatocelular (CHC), malignidade primária mais comum do fígado, é complicação de doença hepática crônica avançada e representa o quinto tumor mais frequente no mundo, com mais de 550.000 novos casos por ano, sendo quatro vezes mais comum em homens do que em mulheres(1). As doenças hepáticas crônicas são fatores de risco e predispõem à ocorrência do CHC, visto que qualquer agente ou fator que danifique lenta e cronicamente o hepatócito, induzindo a mitoses, torna o ácido desoxirribonucleico (DNA) dessa célula mais suscetível a alterações genéticas. A cirrose, de etiologia variada (alcoólica, vírus da hepatite B ou C (VHB, VHC), biliar primária, deficiência de α1-antitripsina, hemocromatose, tirosinemia), é terreno próprio para a instalação do CHC. Em pacientes VHC positivos (grande maioria dos pacientes do Rio Grande do Sul), o CHC surge, em média, trinta anos após a contaminação, quase que exclusivamente em pacientes cirróticos(2). O desenvolvimento do CHC é um processo complexo, associado ao acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas, que compõe as etapas de iniciação, promoção e progressão tumoral (2). Inúmeras observações experimentais demonstraram que produtos virais podem contribuir para a transformação maligna dos hepatócitos. Já foi comprovada a capacidade do DNA do VHB de se integrar ao DNA do hospedeiro, embora a mesma capacidade não tenha sido comprovada para o VHC. Tal fato dificulta a compreensão do mecanismo de carcinogênese pelo VHC, com a possibilidade do surgimento de um clone maligno pelos vários ciclos de regeneração e reparo do fígado. Em pacientes cirróticos com hepatite C crônica, a incidência anual de CHC é de 1,5-4%(3-6). 5 O estadiamento do CHC baseia-se em quatro critérios: tamanho do tumor, presença ou não de ascite, níveis de bilirrubina e níveis de albumina. O CHC precoce pode não apresentar manifestações clínicas distintas daquelas decorrentes da progressão da hepatopatia de base. Dor abdominal, surgimento de massa abdominal no quadrante superior direito, juntamente com hipoglicemia, hipercolesterolemia, polimiosite, porfiria adquirida e criofibrinogenemia são as suas manifestações clínicas. Em soro de pacientes, podem ser encontrados níveis elevados de fosfatase alcalina e da alfa-fetoproteína (AFP).(7). A ressecção cirúrgica pode, às vezes, ser curativa. Poucos pacientes, entretanto, possuem tumores ressecáveis pela presença da cirrose subjacente e, mesmo após a ressecção, podem surgir outros tumores no tecido remanescente. Nesse caso, o tratamento com Inteferon (INF) pode reduzir o risco de recorrência do CHC por VHC após a ressecção (8, 9). Em caso de tumor irressecável, o tratamento é limitado, visto que a doença não responde à quimioterapia e o fígado não tolera altas doses de radiação (10). O transplante ortotópico de fígado (TOF) é a opção mais adequada para o tratamento do CHC em cirróticos dentro de critérios restritos, embora persista a possibilidade da recorrência e do surgimento de metástases(11). Estudos demonstram que a progressão do carcinoma hepatocelular é acompanhada pela ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-B), e pesquisas de novas drogas capazes de inibir o crescimento tumoral são urgentes para beneficiar milhares de pacientes no mundo (12-14). 6 REFERENCIAL TEÓRICO 7 2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Epidemiologia e história natural do carcinoma hepatocelular O câncer primário de fígado é o quinto câncer mais comum no mundo e a terceira causa mais comum de morte por câncer. Cerca de 560.000 novos casos são diagnosticados a cada ano e ocorrem 550.000 óbitos anuais. A maioria (75-90%) corresponde ao carcinoma hepatocelular (CHC), assim, a incidência de câncer de fígado e de mortalidade reflete a incidência e mortalidade do CHC. (15) A cirrose hepática é o principal fator de risco para o desenvolvimento do CHC no mundo e no Brasil, onde a infecção pelo VHC é a causa mais comum em todas as regiões, mas, a infecção pelo VHB, ainda é uma importante causa de CHC em algumas regiões brasileiras. No Brasil, levantamento nacional da Sociedade Brasileira de Hepatologia sobre CHC, realizado em 2010, foram analisados 1405 casos diagnosticados entre os anos de 2004 e 2009. Encontrou-se cirrose em 98% dos casos, pacientes com média de idade de 59 anos e 78% eram homens. O Sudeste foi responsável por 77% dos casos e a presença do VHC foi de 54%. No Norte, Nordeste e no Centro Oeste, o VHB foi mais prevalente (25%) do que na região Sul e Sudeste (15%)(16). Estudos prospectivos demonstram que o CHC começa como um nódulo solitário ocorrendo em qualquer parte do fígado, sendo o lobo direito mais acometido que o esquerdo, mas isso pode estar relacionado ao seu maior volume. A forma difusa tem sido descrita em pacientes na África, contudo estudos prospectivos não foram executados para excluir a possibilidade de que esses tumores ainda comecem como nódulos únicos. O CHC geralmente invade o sistema portal e venoso, produzindo trombos tumorais na veia porta e em seus ramos (17). 8 O tempo de infecção inicial pelos vírus das hepatites B ou C para o desenvolvimento de CHC pode variar entre duas a oito décadas. Durante esse intervalo, muitas mudanças podem ocorrer no fígado, incluindo inflamação crônica, fibrose, com evolução para cirrose e aumento da taxa de morte dos hepatócitos e sua regeneração. Estudos de hepatocarcinogênese experimental em animais revelam uma sequência de eventos que começam com focos de hepatócitos fenotipicamente alterados, provenientes de focos displásicos e nódulos displàsicos (18). O ciclo contínuo de morte e regeneração celular pode, eventualmente, resultar na proliferação de células-tronco hepáticas, morfologicamente reconhecíveis como células ovais (19, 20), embora hepatócitos maduros sejam a principal fonte de substituição de células no fígado danificado. Células ovais podem dar origem a focos fenotipicamente alterados, entretanto, se essa célula oval é a única célula precursora do CHC não está claro (20). 2.2 Incidência e Mortalidade Há grande variabilidade geográfica na incidência do CHC (Figura 1). A maioria dos casos (>80%) ocorre na África subsaariana ou na Ásia Oriental. A China é responsável por mais de 50% dos casos. Com algumas exceções, os países da América do Norte, da América do Sul, do Norte da Europa e a Austrália tendem a ter taxas de incidência baixas, enquanto os países do Centro e Sul da Europa tendem a ter taxas intermediárias (21). O registro das maiores taxas de incidência de CHC ocorre em Qidong, na China, onde a incidência no sexo masculino e feminino são, respectivamente, 95,7/100.000 e 29,6/100.000 habitantes. Taxas elevadas também ocorreram em Khon Kaen, nordeste da Tailândia (masculino: 88/100.000; feminino: 35,4/100.000 habitantes), mas a maioria dos colangiocarcinomas intra-hepáticos e não CHC (22). tumores nessa região são 9 Figura 1. Incidência global de câncer hepático em homens, 2000 (15). As taxas de sobrevivência do CHC são uniformemente ruins, tanto em áreas de alta como de baixa incidência. A Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC) estima que, em determinada idade para os homens, ocorra uma incidência padronizada mundial de câncer primário do fígado, sendo de 17,4/100.000 habitantes nos países subdesenvolvidos e 8,7/100.000 habitantes nos países desenvolvidos (15, 21). 2.3 Fatores Demográficos 2.3.1 Idade A distribuição etária global de CHC varia de acordo com incidência, gênero, e etiologia (22). Na grande maioria das áreas de alto ou de baixo risco, as taxas de incidência feminina ocorrem cinco anos após as ocorridas na idade máxima dos homens. Em populações de baixo risco, a maior incidência acontece entre pessoas com mais de 80 anos, em contraste com o que acontece em áreas de alto risco (22- 10 24). Os diferentes padrões etários na incidência de CHC em diferentes áreas estão relacionados ao vírus da hepatite dominante naquela população, à idade da infecção viral e à existência de outros fatores de risco. 2.3.2 Gênero Na maioria das áreas do mundo, a incidência do CHC entre os homens é de duas a quatro vezes superior à das mulheres. As maiores diferenças entre as taxas masculinas e femininas, contudo, não ocorrem entre populações de alto risco para o CHC (15), o que levaria a supor que essas maiores diferenças ocorrem nas populações de baixo risco, como a América do norte. As razões pelas quais os homens têm maiores taxas de câncer de fígado do que as mulheres não são totalmente compreendidas. Os homens são mais suscetíveis a infecções pelos VHB e VHC, ao maior consumo de álcool, ao uso de cigarros, ao aumento dos estoques de ferro corporais pelos hormônios androgênicos e à susceptibilidade genética (25). 2.3.3 Etnia Taxas de incidência de CHC podem variar muito entre as pessoas de diferentes etnias que vivem na mesma região. Por exemplo, homens coreanos que vivem em Los Angeles têm taxas cinco vezes maiores do que as do homem branco que ali habita (26). Da mesma forma, em Cingapura, homens chineses têm taxas 2,7 vezes maiores do que a dos homens indianos, enquanto, em San Francisco, homens chineses têm taxas 4,2 vezes maiores que a taxa dos não chineses brancos (15). 11 As diferenças étnicas entre os homens são igualmente verdadeiras entre as mulheres. Essas variações podem refletir diferenças no risco de infecção pelo VHB e VHC, apesar da suscetibilidade genética e de diferentes padrões de exposição a outros fatores de risco (27). 2.4 Fatores de Risco Os principais fatores de risco para o CHC são as infecções crônicas pelos VHB ou VHC, a exposição diária à aflatoxina e o consumo de álcool. Em áreas de alta taxa de incidência de CHC, VHB e aflatoxina são os fatores dominantes, enquanto VHC e álcool são os fatores mais importantes nas áreas de baixa e média incidência (Tabela 1). Estima-se que as infecções pelos VHB e VHC são associadas e alcançam índice superior a 80% do CHC no mundo(27). Tabela 1. Fatores de risco relacionados ao desenvolvimento do CHC Fatores maiores Fatores menores Cirrose Cirrose biliar primária Hemocromatose e Doença hepática gordurosa não Tirosinemia Hereditária alcoólica VHB Exposição ao thorotraste VHC Exposição a cloreto de vinil Exposição a aflatoxinas Tabagismo Estrogênios e androgênios 2.4.1 Vírus de Hepatite B O VHB é um hepadnavírus com dupla hélice de DNA (ácido desoxirribonucleico) no seu interior. Sua descoberta deu-se em meados da década de 1960 (28), com a identificação do antígeno Austrália, hoje chamado de AgHBs. 12 Aproximadamente 5% da população do mundo (350 milhões de pessoas) está cronicamente infectada com o VHB, a maioria reside nas regiões de alto risco para o CHC: Ásia e África. Áreas com altas taxas de CHC possuem também alta prevalência de infecção crônica pelo VHB (Figuras 1 e 2) (15, 25, 29). Em regiões de alta taxa de incidência de CHC, a cirrose está intimamente associada à hepatite B crônica, precedendo a maioria dos casos de CHC (30). Na maioria das regiões, com exceção do Japão, a infecção pelo VHB está associada com cirrose, sendo de 80% ou mais, o índice dos casos de CHC. O risco de CHC em homens infectados é estimado entre 10 e 25%, enquanto o risco em mulheres infectadas é menor (31, 32). Figura 2. A distribuição geográfica da infecção crônica pelo VHB, Departament of Health and Human Services, 2006 (33) A transmissão perinatal é a principal via de aquisição do vírus nos locais de alta prevalência, seguida pela transmissão horizontal nos dois primeiros anos de vida (34, 35). Nos locais de menor prevalência, as principais maneiras de disseminação do VHB são as práticas sexuais sem proteção ou o compartilhamento de seringas no uso de drogas intravenosas. Estima-se que, no Brasil, a prevalência do VHB seja intermediária. Dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, em doadores de sangue, mostram que 0,33 a 1,14% da população é AgHBs positivo (7, 34). O risco da hepatite B tornar-se crônica varia com a idade da infecção. Menos de cinco por cento dos adultos imunocompetentes que adquirem a infecção evoluirão para a forma crônica, enquanto mais de 90% das crianças que adquirem o vírus no primeiro ano de 13 vida e cerca de 30% daquelas infectadas entre o primeiro e o quinto ano de vida terão a forma crônica (22, 36). 2.4.1.1 O Vírus da Hepatite B e o Carcinoma Hepatocelular Existe uma forte associação epidemiológica entre o VHB e o CHC, havendo superposição das áreas onde o VHB é endêmico e onde há maior incidência do CHC. A China e o Sudeste Asiático são os locais em que o CHC alcança mais de 150 casos por 100.000 habitantes (22, 23, 37). Os mecanismos pelos quais o VHB possibilita o desenvolvimento do CHC ainda não estão claros. A lesão hepática crônica com infecção, a inflamação, a regeneração e a fibrose desencadeiam a cirrose e, em consequência, indiretamente o CHC. Entretanto, sem que haja uma explicação fisiopatológica adequada (37,38) em até 40% os CHC ligados ao VHB podem não estar associados à cirrose. O VHB integra o seu DNA ao genoma do hepatócito. O sítio de integração do VHB-DNA circular é variável, contudo envolve frequentemente longas e repetidas sequências. Esse DNA integrado é, muitas vezes, incompleto ou danificado, podendo, assim, conter deleções, rearranjos, inversões ou duplicações da sequência genética normal. Essas integrações ocorrem em locais adjacentes aos genes, com conhecidos efeitos no desenvolvimento e crescimento de tumores como o insulin-like growth factor II (IGF-II) e a ciclina-A, que têm sido associados a alterações na expressão de oncogenes(38). O VHB parece ter propriedades carcinogênicas intrínsecas, pois a proteína X (HBX), sintetizada a partir do gene X do VHB, com 465 pares de bases (pb), funciona como transativador transcripcional e ativa genes relacionados ao crescimento tumoral (39). Há relatos de que a HBX liga-se ao gene supressor tumoral p53, reduz a sua transcrição e, consequentemente, reduz a inibição do crescimento celular e a entrada 14 da célula em apoptose (39, 40). Um estudo de ZHANG mostra que a HBX aumenta a regulação, a expressão e a atividade da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) em células hepáticas infectadas pelo VHB, elevando o potencial carcinogênico (41, 42). Elementos que participam na carcinogênese hepática são os radicais livres. Esses radicais, produzidos pela inflamação hepática, podem ser carcinogênicos por causarem quebras na molécula de DNA e substituição ou rearranjos nas suas bases. Tais modificações no sistema redox podem desencadear alterações enzimáticas, afetando moléculas reguladoras, oncogenes e crescimento tumoral (22, 38). Evidências mais importantes do papel primordial do VHB no surgimento do CHC decorrem, entretanto, de estudos realizados em Taiwan (43), onde o programa de vacinação em massa contra a hepatite B em recém-nascidos reduziu significativamente a incidência e a mortalidade por CHC em crianças. Em dez anos, coincidiu com o declínio da infecção crônica pelo VHB nos indivíduos vacinados, o que demonstra claramente causa/efeito. O estabelecimento de uma relação causal direta entre a incorporação do DNA do VHB e o surgimento do CHC tem sido difícil, e o mais provável é que essa integração não deva ser o gatilho para o surgimento do tumor. O ciclo contínuo de inflamação e regeneração certamente tem papel relevante na patogênese tumoral com a ativação contínua dos mecanismos da síntese de DNA e seus mecanismos de reparo que formam o terreno ideal para a ocorrência de mutações adquiridas(18). Nem todos os pacientes com infecção crônica pelo VHB têm o mesmo risco de desenvolver CHC. Os indivíduos com inflamação mais ativa ou com disfunção hepatocelular mais avançada parecem apresentar maior risco de desenvolvimento da neoplasia, enquanto os portadores compensados do AgHBs apresentam menor risco de desenvolver o CHC (44, 45). 15 É duvidoso estabelecer se o tratamento do VHB com INF alfa reduz a incidência do CHC. Os pacientes com infecção crônica pelo VHB, quando tratados com INF alfa, têm taxa de desaparecimento do AgHBe (antígeno e) e VHB-DNA do soro de 25 a 40%(44). É lícito acreditar que o tratamento precoce do VHB, levando à sua erradicação do soro, determinaria a redução na taxa do desenvolvimento do CHC. Um estudo de OON e colaboradores mostra essa associação, porém a maior parte dos estudos é limitada a este respeito(46). É possível que, no decorrer da infecção viral, haja a incorporação precoce do genoma do VHB no DNA do hepatócito do hospedeiro e mesmo o tratamento eficaz com desaparecimento do VHB-DNA sérico provavelmente não seja suficiente para erradicar o potencial oncogênico do VHB. Fato que pode corroborar essa possibilidade é a descrição da infecção críptica pelo VHB, relatada em pacientes com cirrose hepática e CHC(45, 47), em que o AgHBs é negativo e, por vezes, o anti-HBc também é negativo. Além disso, corroboram também os estudos de hibridização ou por técnicas de PCR (polymerase chain reaction), pelos quais se detecta o VHB-DNA sérico em níveis baixos e a sua presença no hepatócito (44). Outro fator importante na gênese do CHC parece ser a concomitância das infecções pelo VHB e VHC, fato não incomum, pois ambos dividem a mesma via de aquisição parenteral. A concomitância poderia determinar uma evolução mais grave, e as lesões histopatológicas hepáticas seriam predominantemente causadas pelo VHC, com raras lesões características do VHB. Evidências sugerem que o CHC é mais comum quando ocorre essa dupla infecção. (44, 48). 2.4.2 Vírus da Hepatite C O VHC é um vírus de RNA (ácido ribonucleico) da família dos Flaviridae. O VHC foi identificado, em 1989, em soros de símios infectados com soro humano de indivíduos com hepatite não-A, não-B (49). Uma das principais características do VHC é a sua heterogeneidade genética, com seis genótipos maiores (de 1 a 6) e mais de 16 cem subtipos (50). Além disso, a variabilidade do genoma viral, presente no mesmo indivíduo, resultante das mutações no decorrer do tempo da infecção, facilita o aparecimento das quasi-especies (51). Dessa heterogeneidade decorrem as principais dificuldades em se encontrar um tratamento eficaz, com altas taxas de cura e, principalmente, o desenvolvimento de uma vacina eficaz para evitar a infecção do VHC. Em 1994, a IARC passou a classificar o VHC como um carcinógeno humano, assim como o VHB(52). A evidência mais forte para um nexo de causalidade entre o VHC e o CHC é proveniente do Japão, onde, antes da identificação do vírus, Okuda e colaboradores (1987) elaboraram a hipótese de que o vírus de natureza não A não B causava uma proporção significativa de CHC (53, 54). A hipótese baseava-se na incidência de CHC ter, no período entre 1966 e1983, mais do que duplicado, enquanto a proporção de CHC relacionado ao VHB diminuíra de 50% a 30%. Quando os testes para detecção de anticorpos do VHC tornaram-se disponíveis, a hipótese foi comprovada (55). Posteriormente, os dados sobre o risco de CHC, no Japão, foram relatados em estudo com 2890 pacientes afetados pelo VHC (56). A incidência anual de CHC em pacientes com cirrose concomitante com VHC foi de 7,9%, enquanto a incidência entre os pacientes sem cirrose é de apenas 0,5%. Outra característica importante do VHC é a sua capacidade de causar infecção crônica. Cerca de 80 a 90% dos indivíduos infectados com o VHC desenvolvem a forma crônica (57, 58). A icterícia surge em menos de 20% dos infectados e parece haver correlação com níveis séricos elevados de cópias do RNA viral (57). No Brasil, a prevalência de infecção pelo VHC alcança cerca de 1,6% (59), sendo uma das principais causas de cirrose e de indicação de transplante hepático em nosso país. A principal via de transmissão do VHC é a parenteral, através de hemoderivados contaminados, ou o uso compartilhado de seringas e agulhas contaminadas, geralmente em usuários de drogas intravenosas. A transmissão sexual é incomum, sendo responsável por pequena parcela dos casos de aquisição do VHC. 17 Em outras áreas do mundo, estudos de pacientes com hepatite crônica e / ou cirrose confirmaram que o CHC pode resultar de infecção pelo VHC, em longo prazo. A proporção de pacientes que desenvolvem CHC, no entanto, varia conforme o país, o tempo de seguimento e a prevalência de cirrose. Em quase todos os casos, a cirrose precede o diagnóstico de CHC(31). Ao sintetizar dados clínicos e estudos de base populacional, Alter e colaboradores (1992) propuseram um modelo de história natural da infecção pelo VHC. Entre as pessoas com infecção aguda, 20% recuperaram-se espontaneamente e 80% desenvolveram infecção persistente. Entre aqueles com infecção persistente, 30% desenvolveram hepatite progressiva grave e 70% desenvolveram hepatite crônica estável ou doença no fígado lentamente progressiva. Essas projeções são semelhantes às da Organização Mundial da Saúde (OMS), a qual afirma que 20% dos indivíduos infectados com VHC desenvolvem cirrose e que 2 a 4% atingem CHC (57). Vários fatores influenciam a progressão da doença hepática crônica entre os indivíduos infectados. No VHB, os homens parecem estar em maior risco de desenvolver CHC, pois são mais propensos a comportamento de risco para a aquisição de coinfecções com VHB e HIV (Human Immunodeficiency Virus), o que também pode aumentar o risco de CHC (27). Cerca de 170 milhões de pessoas (3% da população mundial) estão cronicamente infectadas com VHC. Além desse dado, estima-se que 3 a 4 milhões de pessoas são anualmente infectadas e sete a nove milhões dos 170 milhões provavelmente irão morrer de CHC. A infecção crônica pelo VHC é menos comum que a infecção pelo VHB, e a distribuição mundial da infecção crônica pelo VHC (Figura 3) é diferente da distribuição de mortalidade pelo CHC (Figura 1). 18 Figura 3. Distribuição global de infecção crônica de VHC, World Health Organization, 2001 (60). 2.4.2.1 O Vírus da Hepatite C e o Carcinoma Hepatocelular Existem evidências que relacionam o VHC ao desenvolvimento do CHC, há elevada prevalência do anti-VHC em pacientes com CHC e, em alguns países europeus e no Japão, cerca de 50 a 75% dos pacientes com CHC têm anti-VHC detectável no soro (61, 62). Isso é confirmado pela detecção do VHC-RNA sérico e no tecido hepático. Além disso, muitos desses pacientes têm o vírus identificado no tecido tumoral. Ainda hoje não sabemos exatamente o mecanismo pelo qual a infecção pelo VHC resulta no CHC. Dados sugerem que o núcleo viral do VHC desregula a apoptose celular através da depleção de cálcio no retículo endoplasmático celular e que proteínas truncadas do núcleo viral poderiam ter papel importante na indução do CHC. Tais constatações trazem novos elementos ao conhecimento da carcinogênese vinculada ao vírus (58, 63). A grande maioria de tais indivíduos tem cirrose hepática associada ao CHC, o que sugere que a sequência de eventos de infecção, de inflamação, de lesão e de regeneração é fundamental para a ativação contínua da síntese celular de DNA e seus mecanismos de reparo, o que forma o terreno ideal para o surgimento de mutações e do CHC. Ao contrário do VHB, o VHC não integra o seu genoma ao genoma do hospedeiro, apesar de já ter ocorrido identificação do VHC no tecido tumoral. Entretanto, há evidências de que uma proteína do núcleo viral do 19 VHC tem propriedades carcinogênicas diretas, ao menos in vitro (64), e que camundongos modificados para expressarem a proteína do core viral possuem altas taxas de desenvolvimento de CHC (65). A proteína do core do VHC pode ainda alterar a sinalização intracelular e ativar o fator nuclear Kappa-B (66). Essas interações, ainda que não expliquem o surgimento do CHC, comprovadamente levam a alterações na apoptose e à redução da eficiência do sistema imunológico. Futuramente, tais estudos -em animais- terão importância crítica no conhecimento sobre a gênese do CHC. Em relação aos genótipos virais, apesar de controverso, parece que o genótipo 1b está associado à doença hepática mais grave e ao CHC(67, 68). Se isso reflete propriedades intrínsecas deste genótipo ou se deve à menor taxa de resposta obtida pelo tratamento com o INF alfa é uma questão ainda não resolvida pela comunidade científica. A utilidade do INF alfa em pacientes com hepatopatia crônica pelo VHC devese às propriedades antivirais do fármaco, ao efeito antifibrótico e anticarcinogênico. Há fortes evidências de que o tratamento com INF alfa, principalmente naqueles em que observamos resposta (bioquímica ou viral), tem significativo efeito em reduzir a incidência do CHC. O CHC, ligado ao VHC, ocorre quase que exclusivamente naqueles com cirrose associada, com incidência anual de 3 a 5% (69-71). O INF alfa reduziu a incidência do CHC em 13% na mortalidade e, em 16%, em pacientes com cirrose hepática ligada ao VHC. Esses fatos reforçam a ideia de que o tratamento de pacientes com cirrose ligada ao VHC, desde que compensada, pode, além de retardar a progressão da doença, reduzir significativamente a incidência do CHC a pacientes que respondem ao tratamento. Outros fatores associados à infecção pelo VHC têm importância no surgimento do CHC, como o consumo excessivo de álcool e a coinfecção pelo VHB. O maior efeito na redução dos casos de CHC ligados ao VHC talvez se obtenha, como observado na hepatite B, com o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o vírus. Recentes avanços na biologia molecular, no uso de novos adjuvantes e no 20 desenvolvimento de vacinas de DNA, podem ser a chave para o surgimento de métodos que garantam a imunidade protetora contra o VHC. 2.4.3 Aflatoxina Aflatoxina B1 (AFB1) é uma micotoxina sintetizada por fungos da espécie Aspergillus flavus e Aspergillus parasitivus. Os fungos crescem facilmente em alimentos, como milho e amendoim, quando armazenados em condições de calor e umidade. Apesar de existirem quatro principais aflatoxinas, B1, B2, G1 e G2, AFB1 é o mais potente em estudos com animais. Em 1987, a aflatoxina foi classificada, pela IARC, como cancerígeno humano (72). Uma vez ingerida, a AFB1 é metabolizada em um intermediário ativo, AFB1exo-8,9-epóxido, que é detoxicado através de uma variedade de processos metabólicos. O epóxido intermediário demonstra ligação a danos no DNA, principalmente na posição N7 da guanina(73). A alteração genética característica associada a AFB1 é uma transversão de G (Guanina) para T (Timina) na terceira base do códon 249 do gene p53. A mutação p53 249ser foi observada em 30-60% dos tumores decorrentes de pessoas que vivem em zonas de altas taxas de aflatoxinas (74). Muitos estudos ecológicos de contaminação de alimentos por AFB1, realizados nas décadas de 1970 e 1980, eram compatíveis com um papel para o agente cancerígeno no CHC. Forte evidência de uma ligação AFB1-CHC foi fornecida posteriormente por estudos baseados na detecção de marcadores de AFB1 em amostras biológicas. Além disso, a interação entre AFB1 e infecção por VHB sobre o risco de desenvolvimento do CHC foi demonstrada em estudos de curto prazo, em Xangai, na China (75). A partir desse estudo, estimou-se que a AFB1 aumentou o risco de CHC quatro vezes, o VHB aumentou o risco em sete vezes, e a combinação de AFB1 e o VHB aumentou o risco 60 vezes. Estudos mais recentes em área de alta 21 contaminação para a AFB1 em Qidong, China, relataram resultados semelhantes (76, 77). 2.4.4 Álcool A associação positiva entre o consumo de álcool e o CHC levou a IARC a concluir, em 1988, que havia uma relação causal entre eles, embora o mecanismo pelo qual o álcool aumente o risco de CHC não esteja bem compreendido. Outras questões não resolvidas incluem o risco comparativo entre homens versus mulheres e o efeito combinado do álcool e VHB versus o efeito do álcool e VHC (78). Evidências demonstram que o álcool é fator de risco importante em áreas de baixa incidência de CHC, diferente de áreas de alta incidência. Isso pode ocorrer devido ao fato de a média de consumo de álcool em população de alto risco ser menor e/ou devido ao efeito dominante da hepatite B crônica, mascarando qualquer risco adicional ao consumo de álcool. Alguns estudos em populações endêmicas de VHB demonstram associação positiva entre consumo de álcool e CHC, outros estudos não têm, entretanto, esses mesmos achados (79). Na maioria dos estudos em populações em que o VHC é o vírus dominante, o álcool é relatado como um fator de risco significativo. Estudos recentes relataram pouca diferença entre o risco imposto pelo álcool e VHC, em comparação com o álcool e VHB. Os dados sugerem também que o álcool está associado ao CHC, na ausência de qualquer infecção pelo VHB ou VHC, embora, na ausência de infecção viral (80) sejam necessários níveis mais elevados de consumo para o desenvolvimento do CHC. A associação do álcool com CHC está mais fortemente relacionada ao gênero feminino do que ao masculino, o que a torna difícil de estudar, uma vez que as mulheres têm menor probabilidade de beber compulsivamente e menor probabilidade de desenvolver CHC do que os homens. O maior efeito do álcool sobre as mulheres foi postulado com base em diferenças na atividade da álcool desidrogenase e na evidência de maior associação entre álcool e cirrose entre as mulheres (80). Alguns 22 dos mecanismos pelos quais o álcool pode aumentar o risco de CHC incluem a produção de acetaldeído e radicais livres durante o metabolismo do álcool, a indução do citocromo p4502E1 (CYP2E1), a modulação de regeneração celular, a promoção ou a exacerbação de deficiências nutricionais e alterações do sistema imunológico (81). O envolvimento desses mecanismos relaciona o consumo de álcool à cirrose, entretanto, se o álcool está relacionado ao CHC independente da cirrose é o que não está completamente definido (82). 2.5 Cirrose A grande maioria dos CHCs estão associados à cirrose, que é doença hepática crônica, a qual se caracteriza por graus variados de inflamação e fibrose. O grau ou estádio de fibrose correlaciona-se com melhor ou pior prognóstico. Embora várias classificações de fibrose tenham sido propostas, há consenso de que a cirrose é a fase mais avançada de fibrose, e caracteriza-se histopatologicamente por nódulos e hepatócitos rodeados por bandas de tecido fibroso denso (83). A cirrose é definitivamente diagnosticada por biópsia hepática. Devido a isso, um pequeno número de estudos prospectivos está sendo realizado para demonstrar a taxa em que se desenvolve o CHC em fígados cirróticos. Exceção é o estudo Dionysos em que 6917 pessoas, no norte da Itália, foram registradas em um estudo populacional baseado em doença hepática (84). De 78 pessoas identificadas com cirrose no início do estudo, oito desenvolveram CHC no seguimento de nove anos (85). Entre as 81 pessoas infectadas com o vírus VHB, nenhum desenvolveu CHC, enquanto cinco pessoas que tinham cirrose e eram VHC positivos desenvolveram CHC. Entre as 1349 pessoas sem VHB ou VHC que consumiram mais de 30g de álcool por dia, dois desenvolveram CHC. 23 2.6 Fator de Transcrição Nuclear kappa B O Fator de Transcrição Nuclear kappa B (NF-B) é fator de transcrição que desempenha importante e determinante papel, tanto em situações normais como na coordenação de respostas imunes adaptáveis, regulando a expressão de muitos mediadores celulares (86). Esse fator foi primeiramente descrito, em 1986, por Sen e Baltimore como capaz de ligar-se a sítios específicos kappa, como enhancer nas regiões promotoras dos genes das imunoglobulinas em células B (87). Reconhece-se também que o NF-B é expresso na maioria dos tipos celulares, sendo constituído por um dímero composto dos membros da família da Rel. A família do NF-B/Rel compreende cinco subunidades, chamadas p50, p52, p65 (RelA), c-Rel, e RelB. Essas subunidades formam homodímeros e heterodímeros em várias combinações. Geralmente o NF-B é constituído de dois polipeptídeos: um de 50 kDa (p50) e um de 65 kDa (p65) (Figura 4). Em células em homeostase, o NFkB mantém-se no citoplasma em sua forma inativa, associado com as proteínas inibidoras do sítio kB, denominadas inibidores kB (IB). Sete espécies de IBs são descritas: IB, IB, IB, IB, Bcl-3, p100, e p105. O NF-B pode ser ativado por uma variedade de sinais relevantes, conforme a etiologia e a fisiopatologia inflamatórias (86). Radicais Livres e Oxidantes IKK I B p50 p65 I B P p50 p65 B I Degradaç Degradação 26S p50 p65 Dano Tecidual Figura 4: Rota de ativação do NF-B(88). Citocinas e outros mediadores inflamat ó rios Ativa ção Leucocitá Leucocitá ria 24 Para ativar o NF-B, são necessários estímulos intracelulares e/ou extracelulares, podendo ser desencadeados pelos seguintes agentes: produtos bacterianos (endotoxinas, peptideoglicanos), vírus e componentes virais, protozoários, citocinas (fator de necrose tumoral (TNF-), interleucinas), radicais livres e/ou oxidantes (86). A ativação do NF-B requer a fosforilação de seus inibidores fisiológicos (particularmente o IB) em resíduos específicos de Serina (Ser-32 e Ser-36). Tal fosforilação é mediada por um complexo proteico, o complexo kinase kappa B (IKKs). O complexo IKK é composto de três subunidades, duas unidades catalíticas IKK-, IKK-, e uma unidade reguladora IKK (NF-B essential modulator, NEMO). Após a fosforilação, ocorre a subsequente degradação das IBs através das ubiquitinas, formando um proteossoma 26S (89). A degradação proteolítica dos IKBs permite a translocação do NF-B ao núcleo, onde ele regula a expressão de centenas de genes que são importantes na resposta imune inflamatória. 2.6.1 NF-kB e Câncer O Câncer é uma das maiores causas de morte nos países industrializados(90). A taxa de mortalidade por câncer tem decaído nos últimos anos devido ao diagnóstico precoce e às terapias eficazes, entretanto muitas formas de câncer ainda são incuráveis. É importante ressaltar que ele não é uma, e sim muitas doenças, cada uma com diferentes características, exigências e opções terapêuticas diferentes. A progressiva sequência de mutações e alterações epigenéticas nos oncogenes promove a transformação maligna das células progenitoras do câncer, alterando processos-chave envolvidos no controle da multiplicação celular normal e na homeostase dos tecidos (91). Além disso, a instabilidade genômica é uma característica comum, senão universal, dos tumores avançados. 25 Distinguir as mutações causadoras de câncer das alterações irrelevantes é o maior desafio dos pesquisadores. Além dessas mudanças intrínsecas das células malignas, o desenvolvimento e a progressão são também dependentes do microambiente que as circunda, sendo este, em muitos casos, de natureza inflamatória. (92). O papel do microambiente inflamatório na história natural e na progressão da maioria dos tumores oferece novas oportunidades de intervenção baseadas no apontamento dos componentes inflamatórios do tumor em vez das células malignas propriamente ditas, que apresentam rápida mutação e adquirem resistência às drogas (93, 94). O atual arsenal da oncologia médica inclui muitos agentes ativos anticâncer que são aplicados em vários tipos de tumores. Nenhuma dessas drogas anticâncer largamente ativas é uma cura ideal. A maioria das drogas tem pequeno valor terapêutico e não consegue distinguir as células malignas das células normais, problema que é amplificado pela inevitável resistência e a subsequente ocorrência do tumor. Ultimamente, o foco das novas terapias moleculares busca rotas específicas que levem ao impedimento da multiplicação e da sobrevivência celular, oferecendo a promessa de maior especificidade, associada com a redução da toxicidade sistêmica. Essas estratégias baseiam-se em novas abordagens para o estudo da genética do câncer, como o perfil da expressão gênica utilizando “microarrays”, sequenciamento do DNA e o “screeening” do genoma em busca de um gene alterado. O êxito do desenvolvimento de uma terapia racionalmente designada e molecularmente orientada para o tratamento de um tumor específico é mais bem ilustrado pelo lançamento de terapias baseadas em anticorpos para o tratamento de câncer de mama, como Herceptina (95, 96), e o uso de Gleevee (ST1571/Imatinibe) como um inibidor de quinase no tratamento de mieloma crônico.(97) Na validação e seleção de alvos moleculares e rotas para uma intervenção terapêutica no câncer, a frequência com que um alvo particular ou uma rota sofre mutação ou desregula é um indicador valioso e tem crucial importância no processo de malignidade e no uso potencial de uma droga que age nesse alvo ou rota. Uma importante via de sinalização alterada em tumores humanos é o módulo de sinalização IKK/NF-κB. Uma alteração na regulação do NF-κB tem sido observada em muitos 26 tumores, e o NF-kB pode afetar todos os seis “hallmarks” do câncer ligados à ativação da transcrição de genes associados com a proliferação celular, a angiogênese, as metástases, a promoção de tumor, a inflamação e a supressão da apoptose (Figura 5) (98-103). Em vários modelos de câncer em ratos, nos quais a ativação da IKK/NF-κB foi bloqueada por meios genéticos, destacou-se o papel fundamental do NF-κB como importante promotor de cânceres ligados à inflamação. (104-106) Figura 5. Envolvimento do NF-B na biologia tumoral. Uma das funções do NF-κB é a sua habilidade de promover a sobrevivência celular devido à indução de genes específicos, cujos produtos inibem a maquinaria apoptótica tanto em células normais quanto em malignas. (101, 107, 108) O NF-κB também impede a necrose programada por induzir genes codificantes de proteínas antioxidantes (107). Já que células tumorais frequentemente usam o NF-κB para alcançar a resistência a drogas e a radiações, a inibição no NF-κB parece ser uma promissora opção na melhoria da eficácia das terapias anticâncer convencionais (109, 110). Todavia, apenas recentemente a investigação genômica do câncer mostrou-se aplicável para demonstrar o papel importante do NF- κB na carcinogênese e para identificar os passos críticos que levam a essa ativação (Figura 6). 27 Figura 6: Inibição do NF-kB e apoptose, modificado de Nakanishi 2005 (109). O NF-kB está frequentemente alterado no câncer. Na maioria dos casos, a ativação do NF-kB em células malignas, como resposta a um estímulo inflamatório originado no microambiente tumoral, não ocorre devido a mutações intrínsecas e sim em genes regulados pela modulação do NF-kB (111). 2.7 Interferon (INF) O sistema imune é constituído por um complexo de células diferentes que recebem e emitem diversos sinais dirigidos às células leucocitárias, regulando, assim, os mecanismos de defesa do organismo. Os mediadores dessa interação são proteínas, peptídeos e outras substâncias que, por sua atividade, recebem o nome de imunomoduladores. Os Interferons (INFs) são glicoproteínas que possuem diversas ações biológicas, dentre elas, efeitos antivirais, imunomoduladores e antiproliferativos complexos (Figura 7). Sua produção e liberação endógena ocorrem em resposta a vírus e a outros indutores, com exceção de exotoxinas bacterianas, poliânions, alguns compostos de baixo peso molecular e micro-organismos com crescimento intracelular (112). 28 Além de inibir a proliferação celular em uma série de tumores, o INF possui importantes funções imunomodulatórias tais como o aumento da atividade das células natural killer, o estímulo para liberação de outras citocinas e o aumento da expressão de antígenos de histocompatibilidade na superfície das células (113, 114). Figura 7: Estrutura Molecular do INF alfa Humano Uma grande gama de vírus ARN e ADN é sensível ao Interferon, porém o mecanismo e o grau do efeito são variáveis com o vírus. A sua atividade antiviral está baseada no fato de se combinarem aos receptores superficiais celulares específicos e inibirem a penetração, a proliferação e a liberação dos vírus; sendo o principal efeito a inibição da síntese proteica viral. Os INFs com potencial antiviral relativamente alto são denominados INF antivirais ou tipo I e não são encontrados em tecidos ou no soro, mas podem ser rapidamente sintetizados pela maioria das células em resposta a infecções por vírus, bactérias ou protozoários, ou pela exposição a certas citocinas. Existem três formas principais de INF do tipo I: INF-α, INF-β e INF-ω. O INF-α consiste em pelo menos quatorze glicoproteínas e é o principal INF produzido por leucócitos. Os fibroblastos e a maioria das outras células não leucocitárias expressam primariamente o INF-β, uma citocina apenas 30% idêntica ao INF-α, o INF- ω possui 60-70% de homologia com o INF-α e pode ser liga tanto aos receptores do INF-α quanto do INF- β (115). Os INFs do tipo I ligam-se a um único receptor de múltiplas cadeias, o qual está estruturalmente relacionado ao receptor da IL-10 e é expressado em quase todos os tipos celulares. Essa ligação leva à expressão aumentada de, aproximadamente, trinta proteínas diferentes na célula-alvo, entre elas as proteínas do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe I. Essas proteínas permitem a apresentação de antígenos virais pela célula infectada, a qual é, então, destruída por Linfócitos T Citotóxicos. O INF-α também possui a capacidade de estimular a produção de INF-γ 29 independentemente da IL-12, o que aumenta a função das células T e dos macrófagos (112, 114). O mecanismo pelo qual o Interferon exerce sua atividade antitumoral não é bem compreendido. Acredita-se, no entanto, que exerça ação antiproliferativa em células tumorais e modulação da resposta imune do hospedeiro, que possui papel importante na atividade antitumoral (116). 2.7.1 Interferon e Câncer Devido às suas propriedades de regulação da diferenciação e do crescimento celular, os INFs têm sido usados na tentativa de tratar neoplasias.(114). Várias formas de leucemia e tumores sólidos têm sido tratadas com INF com algum sucesso; pouco se sabe, porém, sobre a terapia com INF contra o câncer. Mesmo antes que os INFs recombinantes estivessem disponíveis, remissões eram publicadas com o uso de INFα em pacientes com “hairy-cell” leucemia(117), geralmente uma forma rara de leucemia de células B com progressão lenta. Algum sucesso também foi atingido no tratamento de mieloma, forma mais comum da doença nas células B(115). Em ambos os tipos de leucemia, formas mais efetivas de terapia foram descobertas dado ao rápido avanço no conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na geração e progressão de algumas formas de câncer. Como consequência, os INFs não são mais utilizados na linha de frente das terapias no tratamento dessas leucemias(118). Em melanoma cutâneo com metástases de linfonódos locais, pode haver beneficio com a diminuição da mortalidade e da taxa de recorrência, com melhora na qualidade de vida, quando o INF alfa é usado em altas doses. Devido à toxicidade associada ao uso de altas doses de INF em um intervalo longo de tempo, estudos europeus com doses menores de INF foram utilizados. Apesar disso, nenhum dos regimes com baixa dose resultou em sobrevivência livre de recorrência tumoral(116). 30 A propriedade antiangiogênica do INF tem sido empregada no tratamento de hemangiomas extensos e perigosos em crianças. Esses hemangiomas geralmente respondem a tratamentos com corticóides. Quando esse tratamento não é efetivo o uso de INF-α por várias semanas ou meses é, todavia, eficiente (119). Na prática clínica, o uso mais corriqueiro de INF é como agente antiviral, principalmente em hepatites B e C. Além disso, o INF-α isolado ou em combinação com outras drogas anticâncer, como o 5-Fluoracil, tem sido utilizado no tratamento de outras doenças malignas, incluindo leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica, linfoma cutâneo de células T, linfoma não-Hodgkin, câncer renal, melanoma e CHC avançado (114, 115, 117). Apesar de ser uma droga de eleição no tratamento das doenças hepáticas virais, o INF apresenta resposta limitada ou até nula em alguns pacientes. Sabe-se que sua resposta pode ser limitada pelo tipo e prognóstico da doença. Maior entendimento do comportamento celular frente à exposição ao INF pode ajudar na escolha de terapias para doenças hepáticas tais como o carcinoma hepatocelular. 2.7.2 Interferon e Carcinoma Hepatocelular Ressecção cirúrgica, ablação por radiofrequência e transplante de fígado são as opções no tratamento de pacientes com carcinoma hepatocelular (CHC), entretanto o prognóstico é limitado devido à alta incidência de recorrência pós-operatória e metástases (120, 121). Terapias pós-operatórias efetivas são, portanto, muito importantes na melhoria das taxas de sobrevivência dos pacientes com CHC. Por ser um tumor altamente vascularizado, o CHC é um forte candidato ao tratamento com antiangiogênicos. Estudos mostram que o INFα diminui a metástase e a recorrência de CHC devido ao seu efeito antiangiogênico, que é mediado pela baixa regulação da expressão do VEGF(122). Estudos clínicos randomizados comprovaram a redução da recorrência e o aumento na sobrevida dos pacientes que tiveram tratamento pós- 31 operatório com INFα, embora o mecanismo base, especialmente a reação das células endoteliais tumorais (TECs) com o tratamento com o INFα, não esteja elucidado (122). A metástase tumoral envolve a comunicação entre as células tumorais e as células endoteliais. Onde a ativação das células endoteliais tem papel muito importante durante a indução “angiogenic switch”. Ativadores de TEC, originados pelas células tumorais ou no estroma, são receptores e ligantes de tirosina quinase como VEGF, fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) e fatores de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), os quais podem exercer o papel importante na revascularização do tumor. Enquanto isso, as alterações das células endoteliais ativadas também são muito importantes durante esse processo recíproco (122). Recentemente foram identificados alguns genes supra-expressos em TECs de CHC altamente metastático, o que pode ser utilizado como marcador de prognóstico ou alvo terapêutico. Quando combinado com o Imatinibe, uma proteína tirosina quinase inibidora de um desses genes, o efeito antitumoral do INFα foi significativamente aumentado (123). Mudanças na expressão gênica em TECs que recebem tratamento com INFα podem contribuir essencialmente para o efeito antiangiogênico e para a subsequente inibição da progressão do tumor. Estudos mostram que INFα induz diretamente a apoptose de TECs, interfere na função homofílica de adesão (adesão celular mediada por proteínas idênticas) e normaliza os vasos sanguíneos do tumor. As mudanças na expressão gênica em TECs podem ser as bases moleculares desse efeito antitumoral (122). 2.8 N-acetilcisteína A N-acetilcisteína (NAC), que é precursora da glutationa reduzida (GSH), é utilizada clinicamente há mais de trinta anos como mucolítico. Além da ação mucolítica, a NAC tem sido estudada e utilizada em condições caracterizadas por um decréscimo de GSH (Glutationa) ou estresse oxidativo, tais como HIV, câncer e doenças cardíacas. Devido à sua atividade hepato-protetora, a NAC vem sendo usada, via intravenosa acetaminofeno (124). ou oral, como tratamento do envenenamento por 32 A NAC é um composto tiólico, cuja fórmula é C5H9NO3S, e seu peso molecular é 163,2 (Figura 8). Ela é rapidamente absorvida quando administrada oralmente. Entretanto o extensivo metabolismo de primeira pasasgem feito pelas células do intestino delgado e do fígado resulta na incorporação da NAC em cadeias peptídicas proteicas e na formação de uma variedade de metabólitos da NAC. Apenas uma pequena porcentagem de moléculas de NAC intactas chega ao plasma e aos tecidos subsequentes(125). O OH HS HN CH3 O Figura 8: Estrutura Molecular da NAC Apenas 3% da NAC radioativamente marcada é eliminada nas fezes após a administração oral da droga, o que indica a absorção quase completa dela e de seus metabólitos. O pico de concentração no plasma aparece em menos de uma hora após a administração oral. A meia-vida da NAC livre no plasma é estimada em 2,15 horas e, virtualmente, nenhuma NAC é detectada 10-12 horas pós-administração (126). O grupo tiol (SH) é responsável por grande parte da atividade metabólica da NAC, enquanto o grupo ”amino acetil-substituído” torna a molécula mais estável contra a oxidação. Resultados experimentais indicam que a maioria dos compostos contendo o grupamento tiol no fluido gástrico é relativamente instável, mas apenas dezesseis por cento da NAC encontrada no fluido intestinal é oxidada, enquanto a oxidação dos outros compostos tiólicos está entre 70-75% (127). Pesquisadores estimam que a biodisponibilidade da molécula da NAC intacta via oral está entre quatro e dez por cento, todavia, as ligações bissulfídicas com proteínas e a desacetilação da NAC na mucosa intestinal e no lúmen são, provavelmente, os maiores fatores que contribuem para a aparente baixa 33 biodisponibilidade da NAC(125). Em uma administração oral, a maior parte da NAC parece ser metabolizada em outros compostos, já que, além dos níveis de NAC total e livre, existe um concomitante acréscimo nos níveis de compostos tiólicos proteicos e não proteicos e de proteínas com baixo peso molecular, ligadas a tióis, encontradas no plasma. (125, 127-129). Os mecanismos de ação da NAC estão intimamente ligados à sua habilidade em reduzir a cistina extracelular em cisteína, aumentar a atividade da glutationa-Stransferase, promover a desintoxicação, agir diretamente sobre espécies reativas de oxigênio, além de ser uma fonte de metabólitos SH e, com isso, estimular a síntese de GSH(128). 2.8.1 N-Acetilcisteína e o Câncer A administração de NAC pode ter um papel importante na prevenção do câncer e na abordagem integrada do tratamento de algumas formas de câncer, contudo, a informação nessa área ainda é preliminar. De Flora e colaboradores (1996) investigaram o efeito da NAC no metabolismo e na biotransformação de compostos carcinogênicos e/ou mutagênicos. In vitro, a NAC combate a mutagenicidade de compostos de ação direta e, em altas concentrações, inibe completamente a mutagenicidade de procarcinógenos. In vivo, a NAC pode também inibir tanto a mutagenicidade de um grande número de compostos quanto inibir a indução de tumores por alguns carcinógenos. Reportam ainda que, em várias condições experimentais, o tratamento combinado doxorubicina e NAC apresentou resultados favoráveis, de modo aparente agindo sinergicamente para reduzir a formação de tumor e prevenir metástases (130). Estudos, tanto in vitro quanto em in vivo, com animais têm demonstrado que a NAC pode proteger células normais, mas não células malignas, dos efeitos tóxicos da 34 radioterapia e da quimioterapia (131). Evidências experimentais sugerem que o prétratamento com a NAC diminui drasticamente a toxicidade cardíaca da doxorubicina em camundongos. Evidências também indicam que, embora a NAC possa ajudar a proteger contra a toxicidade resultante de raios-x ou tratamentos quimioterápicos, ela não interfere na ação antiproliferativa do raio-x e da bleomicina (130). 2.9 Apoptose e Morte Celular O desenvolvimento de tumores envolve um desequilíbrio nas vias de sobrevivência e de morte celular. Muitos fármacos têm como finalidade induzir a morte celular tanto por necrose quanto por apoptose, objetivando inibir o crescimento celular descontrolado. A fisiología normal e a fisiopatología, envolvidas no mecanismo de carcinogênese hepática, apresentam mecanismos similares para iniciar a apoptose através da ativação da via intrínseca, em resposta aos sinais intracelulares de estresse e/ou dano ou da via extrínseca, responsável pelos acontecimentos extracelulares. A via extrínseca inicia com a implicação de alguns dos numerosos receptores de morte situados na superfície celular quando, sobre eles, atua o ativador correspondente. A grande maioria dos receptores de morte envolvidos nessa via pertencem à superfamilia do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), caracterizada por conter o domínio de morte (DD) (132), um domínio citoplasmático implicado nas interações proteína-proteína. Os receptores de morte mais conhecidos são o receptor de TNF do tipo 1 (TNFR1) e uma proteína relacionada denominada Fas. A apoptose é uma via muito rápida e de escassa sofisticação, baseada no recrutamento de moléculas adaptadoras através de seus DD, cuja única função é aproximar e ativar uma caspase iniciadora, a caspase 8 ou a caspase 10 (133, 134), as quais, por sua vez, ativam (por proteólise) as caspases executoras ou efetoras, tais como as caspases 3 e 7. Essa via de apoptose pode ser inibida por uma proteína denominada FLIP, que se une com a pró- 35 caspase-8. Alguns vírus e células produzem FLIP e utilizam este inibidor para proteger as células infectadas e normais da apoptose (135). JUSTIFICATIVA 36 3 JUSTIFICATIVA Os CHCs são tumores heterogêneos tanto em relação ao fenótipo quanto ao genótipo. Ocorrem em fígados com doenças crônicas e a maioria evolui para cirrose que, juntamente com a progressão do tumor, determina a morte dos pacientes sem tratamento eficaz que não o transplante hepático. Nesse panorama de difícil manejo, a possibilidade de uso de drogas que modulem e alterem a fisiopatologia do desenvolvimento do CHC, utilizadas como terapêutica, oferece possibilidades alternativas promissoras para o futuro. Tendo em vista essas considerações, propusemo-nos a avaliar o uso da NAC, por seu efeito hepatoprotetor, associada ao Interferon e seus efeitos anticancer, em células tumorais de Carcinoma Hepatocelular. 37 OBJETIVOS 38 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral Este trabalho tem como objetivo geral avaliar a resposta da NAC como potencializador do efeito antitumoral do INF em linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano e verificar o envolvimento da rota do NF-kB na via de ação da NAC. 4.2 Objetivos Específicos 1. Avaliar a resposta da NAC e do INF na viabilidade celular através do metiltetrazolium (MTT) nos tempos de 24, 48, 72, 96 horas. 2. Verificar a ação potencializadora da NAC em cotratamento com o INF na viabilidade celular através do MTT nos tempos de 24, 48, 72, 96 horas. 3. Verificar alterações no Ciclo Celular nos diferentes tratamentos através da análise por Citometria de Fluxo com marcação de Iodeto de Propídeo. 4. Identificar alterações na morte celular nos diferentes tratamentos através da análise por Citometria de Fluxo com a marcação da Anexina V e o Iodeto de Propídeo. 5. Avaliar a expressão da subunidade p65 do NF-kB nos diferentes tratamentos. 6. Identificar o papel da via do NF-kB na ação e na resposta da NAC através do Knock Down da subunidade p65. 39 MATERIAIS E MÉTODOS 40 5 MATERIAIS E MÉTODOS Para a realização deste trabalho foram firmadas parcerias entre os laboratórios: Centro de Terapia Gênica HCPA (Cultivo Celular e Biologia Molecular); Laboratório de Hepatologia Experimental HCPA (Bioquimica); Laboratório do Professor Guido Lenz Departamento de Biofísica UFRGS (Citometria de Fluxo). Este trabalho obteve aprovação ambos os centros nos comitês de ética correspondentes em que os experimentos foram realizados (UFCSPA - UFRGS-HCPA). 5.1 Cultivo Celular e tratamento Este trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de ética e pesquisa da UFCSPA utilizando células de hepatocarcinoma humano HepG2 (p53 +) e Huh7 (p53mutado), que foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, E.U.A.). Rotineiramente as células foram cultivadas como culturas de monocamada em meio Dulbecco's Eagle, modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), glutamina (4 mm) e piruvato (100 lg / mL) em ambiente umidificado com 5% de CO 2, a 37 º C. O meio foi trocado a cada dois dias. As células foram mantidas em frascos de cultura T75 (75cm2) e a subcultura foi realizada uma vez por semana em um volume total de 10 mL de meio completo. Os reagentes utilizados para cultura de células são da marca Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.) e os frascos de cultura e placas utilizados, da marca TPP (produtos Techno Plastic, Suíça). As Células HepG2 e Huh7 cresceram em meio completo e foram plaqueadas nas condições adequadas para os experimentos em placas de seis poços, contendo INF alfa 2A (BLASIEGELIND Ltda, SP-Brasil) em concentrações que variaram de 0 a 105 UI/ml e de NAC (Sigma, Brasil) em concentrações de 5mM, 10mM e de 20mM adicionadas ao meio. O RNA de interferência para o p65 na concentração de 250mm 41 (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA) foi utilizado para suprimir a via do NF-kB. As células foram analisadas após 24, 48, 72 e 96 horas de tratamento. As células controle (não tratadas) foram incubadas apenas com meio de cultura e com veículo. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. 5.2 Viabilidade Celular Para avaliar a viabilidade celular, utilizamos o reagente Metiltetrazolium (MTT3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide). As células foram 4 semeadas em placas de 96 poços na densidade de 3x10 células por poço, em um volume total de 200L de meio. Para determinar a viabilidade celular, as células foram tratadas com INF alfa 2A (Blasiegelind Ltda, SP-Brasil) em concentrações que variaram de 0 a 105 IU/mL e NAC nas concentrações de 5mM, 10mM e 20mM. As doses finais utilizadas neste trabalho, INF 2,5x104 IU/mL e NAC 10mM, foram obtidas através de curvas de dose e temporesposta previamente estabelecidas. Essas combinações de drogas foram avaliadas por 24, 48, 72 e 96 horas através do MTT. O MTT foi realizado conforme descrito por Denizot e Lang (1986) (136). Após a exposição das células aos tratamentos INF, NAC, NAC+INF e siRNA, o meio foi trocado por meio sem soro fetal bovino. O MTT foi adicionado em cada poço na concentração de 5mg/mL. Após a adição do MTT, as células foram incubadas por quatro horas e, ao final desse intervalo, o meio contendo MTT foi descartado e foi adicionado DMSO para solubilizar o precipitado formado pela reação. As densidades ópticas foram analisadas em espectro-fotômetro a 492 nm, utilizando um leitor de placas (Zenyth 200rt Microplate Reader; Anthos, Áustria). 42 5.3 Citometria de Fluxo: Ciclo Celular e Apoptose A análise em citometria de fluxo foi realizada para verificação da redistribuição do ciclo celular. Células das linhagens HepG2 e Huh7 foram cultivadas a 70% de confluência e foram tratadas com INF, NAC e NAC+INF para 48 e 72 horas. As células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato gelado (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 Na2HPO4 mM e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,4) e tripsinizadas durante cinco minutos. Após esse tempo, as células foram centrifugadas a 1000 rpm durante cinco minutos. A tripsina foi aspirada, e as células foram lavadas à temperatura ambiente com PBS duas vezes. As células foram ressuspensas e fixadas em etanol gelado, a 70%, durante uma hora a 4°C. O etanol foi aspirado e os precipitados foram lavados com PBS gelado duas vezes. As células foram incubadas em 0,1 ml de solução de Iodeto de Propídeo (PI, 100 mg / ml PI, EDTA 0,1 mM e 10 mg/ml RNase em PBS) no escuro, a 4°C, durante trinta minutos. A distribuição do ciclo celular foi, então, analisada por citometria de fluxo, usando o citômetro GUAVA. (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) utilizando GUAVA EasyCyte Software (Buckinghamshire, UK). A apoptose foi avaliada segundo Vermes (1995), utilizando a anexina V, uma proteína que se liga a resíduos da fosfatidilserina (PS), os quais são expostos na superfície das células apoptóticas (137). As células foram tratadas com INF (2,5 X 104 IU/ml), NAC (10mM) e NAC+INF (10mM e 2,5 X 104 IU/ml, respectivamente), para 24, 48 e 72 horas em placas de seis poços, na densidade de 10.0000 células por poço. Após o tratamento, as células HepG2 e Huh7 foram lavadas duas vezes com PBS e coradas com PI e anexina V marcada com isotiocianato de fluorosceina (Apoptose e Necrose Quantificação Kit, Biotium Hayward, CA E.U.A.) durante quinze minutos, no escuro. As células foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo para células PI+, PI-, anexina V + e anexina V-. 43 5.4 Expressão Proteica A técnica utilizada para detecção da expressão da subunidade p65 foi a de Western blot, sendo utilizado o sistema descrito por Laemmli (1970) (138) para a eletroforese e, para o blotting, a técnica descrita por Towbin e colaboradores (1979) (139). Foi selecionada uma quantidade de amostra equivalente a 10 µg de proteína, adicionou-se a solução (H2O, tris/HCl 0,5 M, DTT 1% e azul de bromofenol), incubando-a durante cinco minutos, a 100 ºC. Posteriormente, realizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em tampão de eletroforese (Tris 25 mM, glicina 0,2 M, SDS 3,5 mM; pH 8,8). Depois de separadas, as proteínas foram transferidas para uma membrana de Polifluoruro de Vinilideno (PVDF) a fim de permitir a sua exposição aos anticorpos. Para realizar a transferência, uma vez extraído o gel, este foi equilibrado num tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 0,2 M e metanol 20). A transferência foi feita a 13 volts, durante 25 minutos. Para comprovar que a transferência estava correta, introduziu-se a membrana de PVDF numa solução de vermelho Ponceau para visualizar as proteínas totais. A membrana foi lavada com agitação durante cinco minutos com PBS (0,14 M NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl). Depois disso, foi colocada, durante trinta minutos, em solução de bloqueio (5% de leite em pó desnatado em PBS-Tween) em temperatura de 37ºC. A membrana de PVDF foi, então, incubada toda a noite a 4º C com os anticorpos primários policlonais específicos para p65 (65 kDa) e B-Actina (42kDa). Após esse período, ela foi lavada cinco vezes com PBS-Tween 20. Posteriormente, foi incubada durante uma hora e meia com um anticorpo anti-imunoglobulina de coelho, unido a HRP (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Transcorrido esse tempo, foi novamente lavada cinco vezes em PBS-Tween 20. 44 A detecção das proteínas foi realizada por quimiluminescência utilizando um kit comercial ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Grã-Bretanha), imergindo a membrana durante dois minutos nesta mistura comercial. Posteriormente, foi introduzida em um cassete junto com o filme de revelação (Amersham Hyperfilm ECL, UK) durante, aproximadamente, dois minutos. Depois de revelado, o filme foi secado e foram quantificadas as bandas por densitometria, utilizando o programa Scion Image 4.02 para Windows (Scion Corporation, Frederick, USA). Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias. 5.5 Transfecção com siRNA e silenciamento da expressão da subunidade p65 do NFkB Small Interference RNAs (siRNA, RNA de interferência pequeno) específicos para o mRNA do gene p65, foram comprados da empresa Cell Signaling Biotecnology (CA,USA) e transfectados nas células HepG2 e Huh7. Para isso, utilizamos uma solução de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Um siRNA com o conteúdo equivalente de nucleotídeos GC% foi utilizado como controle. As células foram analisadas 24 horas após a transfecção siRNA através de microscopia de fluorescência para o siRNA marcado com FTIC, para avaliar a eficiência de transfecção. O efeito da supressão de p65 foi monitorado pela expressão dos níveis de p65 mRNA. 5.6 Expressão do mRNA da subunidade p65 do NF-kB Utilizamos a metodologia de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real, segundo Kubista (2006), para quantificar a concentração de RNAm (140). 45 Primeiramente, foi realizada a extração e purificação do RNA da amostra, mediante uso de um kit comercial (Promega Corporation, Madison, USA). Em seguida, foi medida a quantidade de RNA nas amostras, mediante utilização de espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Products, Wilmington, USA) e, posteriormente, realizou-se a conversão a cDNA através do sistema Superscript III cDNA Archive Kit (Invitrogen), baseado na capacidade da transcriptase reversa de sintetizar uma cadeia complementar de DNA a partir de uma sequência molde de RNA. Após essa etapa, foi realizada a técnica de PCR em tempo real, de acordo com o descrito por Mullis e Faloona, em 1987, e por Saiki e colaboradores, em 1988, baseando-se no processo natural de replicação do DNA com amplificação cíclica. O método consta de três etapas, sendo elas: desnaturação, anelamento e alongamento, efetuadas de forma sucessiva em condições controladas de temperatura e tempo. O cDNA foi amplificado, utilizando Sybr Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) no termociclador Step One Plus (Applied Biosystems). Em cada ensaio, foi incluído um controle vazio e um controle negativo. O número de ciclos transcritos detectados foi normalizado com o número de ciclos para detecção do gene constitutivo GAPDH, utilizado como housekeeping, que codifica para a Glicose-6fosfato desidrogenase. Foram utilizados primers para a subunidade p65 (Forward Primer 5’e TTGAGGTGTATTTCACGGGACC-3’ GCACATCAGCTTGCGAAAAGG-3’) e para Reverse o GAPDH Primer (Forward Primer 5’5’- CCCATCACCATCTTCCAGG-3’ e Reverse Primer 5’-GAGATGATGACCCTTTTGGC3’). Esses genes foram avaliados através de ensaios de expressão Syber Green (Applied Biosystems, Foster City, USA). A amplificação foi realizada em termociclador StepOne Plus, real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, USA). As mudanças relativas aos níveis de 46 expressão gênica foram determinadas mediante o cálculo de 2 –ΔΔCt, tal como foi descrito por Livak (2001) (141). 5.7 Análise estatística Após a determinação de todos os parâmetros experimentais, foi realizada a análise estatística através de métodos adequados ao tamanho e ao tipo da amostra, os resultados serão expressos como média e desvio padrão para cada um dos grupos do experimento. O teste utilizado para análise de variância dos dados paramétricos foi o ANOVA, para medidas repetidas de um mesmo grupo e entre grupos diferentes, a fim de comparar as diferenças observadas em cada parâmetro estudado, seguido do teste Student-Newman-Keuls. Para análise dos dados não paramétricos, foi utilizado o teste de Mann Whitney. Para análises de apenas dois grupos, foi utilizado o teste “t” de Student. Consideramos diferença estatisticamente significativa entre as variáveis estudadas o nível de significância de pelo menos 5% (p<0,05). 47 RESULTADOS 48 6 RESULTADOS 6.1 Avaliação da Viabilidade Celular Analisando a tabela 2 e as figuras 9 A/B, mostramos que o INF reduziu significativamente a viabilidade somente após 72 horas em ambas as linhagens testadas, sendo a linhagem Huh7 mais sensível do que a linhagem HepG2. A NAC mostrou-se mais citotóxica do que o INF, diminuindo a viabilidade celular já em 24h em Huh7 e, 48 horas, em HepG2. Apesar dessa sensibilidade diferencial tempoespecífica, o efeito final da NAC (em 72 e 96h) foi semelhante para as duas linhagens. Tabela 2: Efeito do INF, da NAC e da NAC+INF sobre a viabilidade celular das duas linhagens estudadas em diferentes tempos Horas 24 CO 4 INF (2,5x10 ) 48 72 96 HepG2 Huh7 HepG2 Huh7 HepG2 Huh7 HepG2 Huh7 100 100 100 100 100 100 100 100 a a 74 ª b 63 b c 58 c 98 98 97 b NAC (10mM) 98 85 93 NAC+INF 94 94 78 c 94 82 a b 82 b 70 c 57 c,d 58 83 b,d 82 c 74 83 71 81 Resultados expressos em média da porcentegem em relação ao controle. INF (2,5x104), NAC (10mM) a-INF x CO p<0,05 b- NAC x CO p<0,01 c- NAC+INF x INF p<0,05 d-HepG2 X Huh7 p<0,05 49 A 100 viáveiscells células % de % of viability a,b,c a,b,c 80 CO b,c 60 IFN NAC 40 NAC+IFN 20 0 0 24 48 72 96 hours horas B viáveis % de cells of viability % células 100 80 CO 60 b,c a,b,c 40 IFN a,b,c NAC NAC+IFN 20 0 0 24 48 72 96 horas hours Figura 9 - NAC potencializa o efeito do Interferon, diminuindo a viabilidade celular em ambas as 4 linhagens estudadas. Células HepG2 (A) Huh7 (B), tratadas com IFN ou NAC (2.5x10 IU/mL e 10mM, respectivamente), diminuição significativa da viabilidade celular em 48, 72, e 96 horas de tratamento. O tratamento da NAC+IFN reduz significativamente a viabilidade celular em 48, 72 e 96 horas de tratamento. a-IFN x CO p<0,05 b- NAC x CO p<0,01 c- NAC+IFN x IFN p<0,05 50 6.2 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF no Ciclo Celular e na Apoptose Ao avaliar a distribuição do Ciclo celular, não observamos alterações em ambas as linhagens celulares e tratamentos (Figuras 10 e 11, Tabelas 3 e 4). A 100% G2 90% S 80% G1 70% Sub-G1 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% CO B INF NAC NAC+INF 100% G2 90% S 80% G1 70% Sub-G1 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% CO INF NAC NAC+INF Figura 10: Avaliação da distribuição do ciclo celular através da citometria de fluxo. Células HepG2 4 (A) Huh7 (B) foram tratadas com INF NAC e NAC+INF (2,5x10 e 10mM, respectivamente) por 48 e 72 horas. A distribuição do ciclo celular foi então analisada por citometria de fluxo usando o citômetro GUAVA. Resultados expressos em média e erro padrão da média. 51 Figura 11: Histograma da distribuição do Ciclo Celular As células foram tratadas com INF(I), NAC (N) 4 e NAC+INF (2,5x10 e 10mM, respectivamente, N+I) por 48 horas. A distribuição do ciclo celular foi, então, analisada por citometria de fluxo usando o citômetro GUAVA. Tabela 3: Distribuição do Ciclo Celular HepG2 48 horas MÉDIA CO INF NAC NAC+INF Sub-G1 1,1 2,9 8,2 9,1 G1 54,0 50,9 47,5 47,8 S 7,6 9,6 7,8 10,1 G2 37,2 36,6 36,5 33,1 Desvio Padrão Sub-G1 1,4 4,5 4,0 15,0 G1 12,0 5,2 1,4 10,4 S 4,4 3,7 2,3 2,9 G2 7,8 3,0 4,3 8,1 CO INF NAC NAC+INF Tabela 4: Distribuição do Ciclo Celular Huh7 48 horas MÉDIA CO INF NAC NAC+INF Sub-G1 3,5 8,4 6,0 4,8 G1 45,6 44,7 42,0 45,9 S 11,6 13,4 10,0 13,4 G2 39,3 33,5 42,0 36,0 Desvio Padrão Sub-G1 3,5 9,6 1,8 3,4 G1 3,4 8,2 2,2 4,0 S 3,0 5,9 1,2 2,5 G2 2,3 4,5 2,7 3,1 CO INF NAC NAC+INF 52 As tabelas 3 e 4 sumarizam as porcentagem de células distribuídas em cada faze do ciclo celular Os resultados acima são expressos em média e desvio padrão da média, sendo os experimentos realizados em triplicata. Avaliamos o envolvimento da indução de apoptose pela marcação com anexina V. O INF induziu a marcação com anexina de ambas as linhagens celulares em 48 e 72 horas de tratamento (Figuras 12A e 12C, Tabela 5), mas em níveis mais elevados observados nas células Huh7, fato que apresentou um ligeiro aumento da sensibilidade também no MTT (Figura 9 e Tabela 2). Tabela 5: Análise da Anexina V por citometria de fluxo HepG2 Huh7 LL 48 hours 72 hours LR UL UR LL LR UL UR CO 82,5 9,6 7,7 0,24 CO 85,3 12,1 2,5 0,1 INF 38,2 8,9 42,8 4,04 INF 21,3 11,3 55,4 2,0 NAC 83,2 9,2 6,9 0,81 NAC 49,9 15,9 32,1 2,2 NAC+INF 38,4 8,7 49,4 3,51 NAC+INF 28,4 17,0 53,0 1,6 CO 87,0 8,4 4,3 0,33 CO 79,4 10,6 9,6 0,4 INF 53,2 11,7 34,4 0,81 INF 32,5 12,0 54,0 1,5 NAC 78,8 8,3 11,9 0,92 NAC 33,3 11,9 38,7 0,7 NAC+INF 40,1 10,7 46,4 2,85 NAC+INF 40,4 15,4 43,3 0,9 Quadrante LL, Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito inferior, (PI + Anexina -), quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante UR, Up Right; direito superior, (PI+Anexina V+). Os resultados acima são expressos em média e correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em triplicata. A NAC induziu a marcação com anexina em 48 horas nas células Huh7, mas não nas células HepG2 (Figuras 12A, 12B, 12C, 12D e 12E), entretanto a NAC induziu a marcação com anexina já em 24 horas (Figuras 12A e 12E). Embora a NAC potencialize o efeito do INF, reduzindo a viabilidade celular, ela não aumentou a marcação com a anexina em relação ao INF (Figuras 12B e 12D). 53 Figura 12 A: Análise de morte celular com marcação para apoptose com Anexina V (Fluorescência verde, eixo Y) e morte com PI (Fluorescência vermelha, eixo X) nas células HepG2, Quadrante LL, Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito inferior, (PI + Anexina -), quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante UR, Up Right; direito superior, (PI+Anexina V+). – HepG2. HepG2 IP/An An + 100 IP+ e IP/An+ % de Células 80 c 60 a c a 40 b,d 20 d 0 CO INF NAC NAC+INF CO 48 horas INF NAC NAC+INF 72 horas Figura 12 B: Análise de morte celular HepG2. Marcação para apoptose com Anexina V e morte com PI em 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média e correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a-INF x CO p<0,05 b- NAC x CO p<0,05 c- NAC+INF x CO p<0,05 d- NAC x INF e NAC+INF p<0,05 54 Figura 12 C: Análise de morte celular com marcação para apoptose com Anexina V (Fluorescência verde, eixo Y) e morte com PI (Fluorescência vermelha, eixo X) nas células Huh7, Quadrante LL, Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito inferior, (PI + Anexina -), quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante UR, Up Right; direito superior, (PI+Anexina V+). – Huh7. Huh7 IP/An An + IP+ e IP/An+ 100 a % de Células 80 a c b b c 60 40 20 0 CO INF NAC 48 horas NAC+INF CO INF NAC NAC+INF 72 horas Figura 12 D: Análise de morte celular Huh7. Marcação para apoptose com Anexina V e morte com PI em 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média e correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a-INF x CO p<0.05 b- NAC x CO p<0.05 c- NAC+INF x CO p<0.05 55 HepG2 24h % de Células IP/An An + 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 IP+ e IP/An+ a b CO INF NAC NAC+INF Figura 12 E: Análise de morte celular HepG2 24 horas. Marcação para apoptose com Anexina V e morte com PI 24 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média e correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a- NAC x CO e INFp<0,05 b- NAC+INF x CO e INF p<0,05 6.3 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF na expressão da subunidade p65 Na figura 13, demonstramos que a NAC, mas não o INF, diminui significativamente a expressão da subunidade p65 após 72 horas de tratamento. O cotratamento com NAC mais INF diminui a expressão da subunidade p65 significantemente em ambas as linhagens. 56 A 120 B a % do controle 100 80 HepG2 b 60 Huh7 40 20 0 CO INF NAC NAC+INF Figura 13: Avaliação da expressão do p65 por Western Blot. (A) Para a análise por immunoblotting: 5 4 10 células foram em placas de 6 poços. As células foram tratadas por 72 horas (INF 2,5 x10 U / mL e NAC 10mM). (B) A densidade das bandas. Resultados representativos de três experimentos independentes. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média, sendo os experimentos realizados em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a- NAC x CO p<0,05 b- NAC+INF x CO x INF x NAC p<0,01 6.4 Envolvimento do NF-kB na resposta da NAC em células de CHC Para avaliar o envolvimento do NF-B na via de ação da NAC nas linhagens estudadas, através do silenciamento da subunidade p65 do NF-B, utilizamos siRNA para o p65 com eficiência de transfecção, por meio de microscopia de fluorescência de 85-95% (Figura 14A) . Ao final de 24 horas, após a transfecção, mais de 95% das células apresentaram silenciamento do mRNA p65, observado por PCR em tempo real. (Figura 14B). 57 Figura 14A: Eficiência de transfecção com siRNA. Marcação do siRNA com FTC, 24 horas após a Quantificação Relativa (dRN) transfecção. Aumento de 100X 100 80 CO siRNA 60 siRNA p65 40 20 a b 0 1 HepG2 Huh72 Figuras 14B: Silenciamento da subunidade p65 do NF-kB. Expressão do mRNA da subunidade p65 por PCR em tempo real nas células HepG2 e Huh7, 24 horas após a transfecção. Resultados expressos em média e erro padrão da média. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a-siRNA p65 x COsiRNA p<0,01 (HepG2) b- siRNA p65 x COsiRNA p<0,01 (Huh7) O tratamento de 24 horas com NAC e INF, após uma exposição por 24 horas com siRNA não específico, resultou em diminuição significativa da viabilidade celular. Quando utilizamos o siRNA específico para a subunidade p65, observamos uma redução também significativa em relação ao controle. Quando tratamos as células com 58 siRNA específico para a subunidade p65 com a NAC, o resultado de inibição é igual ao do siRNA não específico com a NAC, ambos levando à maior redução da viabilidade celular em relação ao controle (Figura 15), demonstrando, assim, a especificidade de ação NAC pela via do NF-B. 110 b 100 a % de células viáveis 90 80 c 70 60 50 40 30 20 10 CO siRNA CO siRNA+NAC siRNAp65 siRNA p65+INF siRNA p65+NAC 10mM siRNA p65+NAC20mM siRNA p65+NAC 10mM siRNA p65+NAC20mM 110 100 a % de células viáveis 90 b 80 70 c 60 50 40 30 20 10 CO siRNA CO siRNA+NAC siRNAp65 siRNA p65+INF Figura 15: Efeito do INF e da NAC na viabilidade das células com silenciamento da subunidade p65. Células HepG2 (A) Huh7 (B) foram tratadas 24 horas após a transfecção (INF 2,5x104 U/mL and NAC 10 e 20mM). A viabilidade celular foi determinada após 24 horas de tratamento. Resultados expressos em média e erro padrão da média. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: a- COsiRNA+NAC x COsiRNA x siRNAp65 p<0,01 b- siRNAp65 x COsiRNA x siRNAp65+IFN p<0,05 c- siRNAp65+IFN x COsiRNA x COsiRNA +NAC x siRNAp65 x siRNAp65+NAC (10 and 20mM) p<0,05 59 DISCUSSÃO 60 7 DISCUSSÃO O CHC é uma doença de múltiplas etapas que pode levar anos para evoluir da iniciação até a metástase. Como consequência, existem várias etapas em que a prevenção desses mecanismos fisiopatológicos pode bloquear a progressão neoplásica. Alguns mecanismos propostos para quimioprevenção do CHC incluem a inibição de crescimento celular e a indução de apoptose, como demonstrado em nosso trabalho. O INF é uma molécula capaz de reduzir a incidência de focos pré-neoplásicos e cânceres em modelos experimentais de câncer hepático (142, 143). Em experimentos in vitro, tem-se relatado o uso do INF para inibir o crescimento de uma variedade de células cancerosas, incluindo as do mieloma múltiplo, câncer de ovário e câncer de fígado (112, 116). Um dos mecanismos envolvidos no efeito inibitório do INF nessas células envolve as cascatas de apoptose, onde a elucidação, até o momento, inclui a indução da proteína p53 e, consequentemente, a ativação da via das caspases (122, 144). Em contrapartida, outros relatos demonstram que o crescimento das células tumorais do fígado não foi afetado e que, com a adição de diversas doses de INF (142, 145, 146), não se observou aumento na apoptose. Esses resultados conflitantes sobre a sensibilidade das células tumorais de fígado ao INF podem ocorrer devido a diferentes condições experimentais, tais como diferenças na sensibilidade das linhagens celulares ou diferenças nos protocolos de tratamento. Na tabela 2 e na figura 9 em nossos resultados, verificamos que após 24 horas de experimento nenhum dos tratamentos foi capaz de diminuir a viabilidade celular, porem as células tratadas com NAC esboçaram diminuir a viabilidade celular nas linhagens estudadas, o que se confirma logo na avaliação seguinte após 48 horas de tratamento. Estes achados podem corresponder aos efeitos moduladores da NAC em curto período de exposição, relacionados a sinais mitogênicos, ou longo período de 61 exposição.relacionados a reguladores de diferenciação celular e também de processos imunomediados (147). Nossos resultados, ilustrados na figura 9, com IFN na dose de 2,5 x 104 U/mL, mostraram uma estreita relação com a resposta clínica, em que os pacientes que realmente respondem ao tratamento são cerca de 30% (148). Esses dados ilustram uma resposta limitada nessas células, já que o INF reduziu a viabilidade celular, através do MTT, somente 72h após o tratamento. Em ambas as linhagens celulares obtivemos um perfil similar de resposta, apesar de que nas células Huh7 houvesse ligeiro aumento na sensibilidade. Ainda na figura 9, como citado anteriormente, podemos observar que a NAC reduz a porcentagem das células viáveis, através do MTT, 48 horas após o tratamento em ambas as linhagens celulares com um perfil similar, observamos novamente que nas células Huh7 houve um ligeiro aumento na sensibilidade, demonstrando, mesmo que não significativa, uma pequena diferença já 24 horas após o tratamento. A diminuição na viabilidade celular representada na figura 9 pelo cotratamento da NAC com o INF demonstra como os tratamentos agindo em tempos diferentes podem favorecer a diminuição da viabilidade celular, sendo o tratamento com a NAC responsável pela antecipação da resposta no cotratamento e manutenção deste efeito com concomitância com o INF nos demais tempos de experimento. Alisi e colaboradores (2009) demonstraram que dependendo da dose, tanto o H2O2, que é um metabólito do oxigênio extremamente deletério e conhecido indutor de apoptose, quanto a NAC induzem respostas celulares diferentes em duas diferentes linhagens de hepatoma. O H2O2 foi capaz de parar resposta proliferativa proporcionalmente à sua concentração, considerando que a apoptose foi induzida somente quando utilizado em uma dosagem de 5 mM. No entanto a NAC aumentou a síntese de DNA mas também com um aumento significativo da apoptose em doses de 6 mM. Não é surpreendente que, embora a NAC seja precursora da glutationa e varredora de radicais livres, alguns estudos mostrem que concentrações distintas de NAC podem agir como pró-oxidantes induzindo estresse oxidativo, desequilíbrio redox e apoptose Por outro lado, a capacidade antiproliferativa da NAC ainda não está documentada em hepatócitos(147, 149). Para este fenômeno biológico, a capacidade regenerativa do fígado é estritamente ligada ao equilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose, e vários agentes (ácido retinóico, por exemplo) em momentos e 62 concentrações específicas podem atuar como agentes citostáticos para manter este equilíbrio (150). Estudos demonstraram tratamentos que agem como facilitadores e como potencializadores de outras drogas no combate ao CHC (5-FU, Ribavirina, INF, Sorafenib). Um exemplo clínico é o uso da Ribavirina (151), que possui uma rota de ação diferente do INF, facilitando e aumentando a resposta ao tratamento com o INF em pacientes infectados com o VHC. O efeito sinérgico de drogas, como um análogo de pirimidina o 5-fluoracil (5-FU) e o INF, já foi demonstrado, a resposta, entretanto, é limitada e as consequências do uso de quimioterapia tornam-no apenas razoável, devido às complicações dessa associação (152). Em nosso estudo, foi demonstrada uma resposta aditiva e potencializadora da NAC com o INF, sugerindo que NAC e INF possuam rotas de ação diferentes, sendo a NAC mais eficiente que o INF nessas doses e nessas linhagens celulares como observado na tabela 2 e na figura 9. Como descrito em estudos relacionados com o papel antiproliferativo de compostos com propriedade antioxidantes, como a NAC, a capacidade de suprimir o crescimento de células cancerosas pode estar associada ao bloqueio da progressão do ciclo celular nos checkpoints (153). Os checkpoints do ciclo celular e a apoptose possuem importante papel na patogênese molecular do câncer e podem influenciar diretamente o resultado das quimio e radioterapias (154). A indução da morte celular e a modulação do ciclo celular são potenciais vias para combater o desenvolvimento das células cancerígenas (155). Diferentemente de outras linhagens celulares e de outros estudos, em nosso trabalho (figuras 10 A/B e 11 e tabelas 3 e 4) não foram observadas alterações significativas na distribuição do ciclo celular em ambas as linhagens celulares e tratamentos (149, 156). Ao observar a figura 10 nos deparamos com um pequeno aumento na fase de Sub-G1, fase na qual evidenciaríamos aumento na fragmentação do conteúdo de DNA nas células analisadas por citometria de fluxo, o que nos levaria a relacionar esse achado com aumento de células em processo de apoptose. Observando as tabelas 3 e 4 nos deparamos com os dados que demonstram um tendência em aumentar o numero de células na fase Sub-G1, na linhagem HepG2 melhor ilustrado pelos tratamentos com NAC e na linhagem Huh7 pelo tratamento com IFN, ambos após 48 horas de experimento, porem não significativos. 63 Menon e colaboradores (2007) demonstraram que a NAC pode modular o ciclo celular em fribroblastos NIH3T3, todavia na dose de 20mM. Neste trabalho, assim como no de Kim e colaboradores (2001), observamos como o estado redox celular pode regular o ciclo celular (156, 157). As Espécies Reativas do Oxigênio (ERO) são geradas pelo metabolismo celular e por agentes exógenos. Embora as ERO possam promover diminuição no crescimento celular, elas também podem atuar como moléculas sinalizadoras para processos que conduzam à proliferação celular (156). Para proliferar e expandir em um ambiente com nutrientes limitados, as células cancerosas cooptam por vias celulares regulatórias que facilitam a adaptação e, assim, mantêm o crescimento do tumor e o potencial de sobrevivência. A modulação do estado redox celular pode regular as cascatas que envolvem o controle do ciclo celular. A utilização da NAC como antioxidante ou antiproliferativo, em diversas concentrações e ou formulações, faz com que a modulação do estado redox celular possa ser regulado pela NAC em diferentes situações experimentais já propostas por diversos autores (38, 142, 153, 157-160). Sendo a NAC uma molécula varredora de radicais livres e moduladora da ativação de fatores de transcrição, envolvida na manutenção do ciclo celular, constatamos nas figuras 10 A/B e 11 e tabelas 3 e 4 que não foi encontrada alteração na distribuição das fases que compreendem o ciclo celular em qualquer uma das condições experimentais analisadas, o que pode estar relacionado com o mecanismo de morte celular envolvido na inibição da viabilidade celular pela NAC e pelo Interferon nas condições experimentais analisadas. Há, entretanto, necessidade de outros estudos para confirmar o envolvimento da NAC na regulação do ciclo celular, já que a meia-vida dos oxidantes e antioxidantes pode variar de acordo com o metabolismo celular e assim interferir nos mecanismos proliferativos regulados pelo ciclo celular (156, 161). A NAC é amplamente utilizada nas ciências básicas para manipular uma grande variedade de reações de oxi-redução (redox) e processos de sinalização sensíveis ao estado redox celular, incluindo a ativação e a inibição de fatores de transcrição redox-sensíveis como o NF-kB, a proteína ativadora (AP-1) e os mitógenos ativados por kinases (MAPK) (157). Embora haja uma suposição geral que permeia 64 essas rotas redutoras, a NAC afeta estados redox intracelulares, mas os mecanismos exatos da ação redutora da NAC não estão completamente compreendidos. A resistência à apoptose é uma das fundamentais características do câncer, sendo a indução seletiva de apoptose em células de câncer uma excitante possibilidade para o desenvolvimento seletivo de futuras terapias para o tratamento do CHC (162-164). Em nosso trabalho, como demonstrado na tabela 5 e na figura 12 AD, o INF foi capaz de induzir apoptose em 48 e em 72 horas, porem na avaliação de 48 horas observamos que a porcentagem média de células marcadas com anexina é maior que a marcação em 72 horas, demonstrado que o INF na dose de 2,5 x104 possui tempo de resposta específico, com diminuição gradual em ambas as linhagens. Por outro lado, a NAC (10mM) induziu a marcação com anexina em 48 horas nas células Huh7, mas não nas células HepG2, nas quais ocorreu em período menor de tratamento, pois a NAC induziu a marcação com anexina já em 24 horas. Isso sugere a ação por diferentes mecanismos de morte celular e também a inibição de crescimento nessas linhagens celulares, e que esses mecanismos têm relação concentração e tempo/resposta diretamente envolvidos com o metabolismo proliferativo celular. Sabendo que citotoxidade é um parâmetro importante em relação à utilização de drogas, devemos salientar a utilização da NAC em células não tumorais. A NAC é conhecida por induzir a apoptose em fibroblastos embrionários transformados, mas não em fibroblastos embrionários normais de camundongos. Essa especificidade de células transformadas torna-se extremamente relevante quando observamos o microambiente tumoral, onde possuímos células adjacentes ao tumor e que são de suma importância para funcionalidade do fígado e em conseqüência para todo o organismo. Estes dados também têm sido observados em células de origem humana, embora o mecanismo subjacente dos efeitos anticancerígenos da NAC não esteja totalmente compreendido (149, 153). A interação da NAC com as células tumorais e não tumorais pode estar relacionada com o metabolismo celular característico e distinto entre estas células. A NAC possui o grupamento tiol como antioxidante, sendo capaz de induzir apoptose em fibroblastos transformados e também em linhagens de células tumorais, mas não em fibroblastos normais ou em queratinócitos. Em células HeLa, o RNA do 65 gene que regula a cascata de apoptose, o p53 é expresso, mas não encontramos a sua proteína, o que demonstra que a NAC é capaz de induzir apoptose independentemente da presença ou ausência da proteína p53, que é uma característica da grande maioria dos tumores (165). Dentre as linhagens celulares utilizadas, a HepG2 tem a característica de possuir a p53 funcional, mas a linhagem Huh7 apresenta uma mutação no gene p53, possuindo, assim, uma proteína defeituosa. Geralmente se acredita que a presença do p53 facilitaria a indução da apoptose pela NAC (149, 166). Contudo, em nosso estudo, demonstramos que o tratamento com NAC leva à apoptose tanto em células HepG2 como em células Huh7. Podemos observar os dados brutos na tabela 5, os plots gerados pela análise do citômetro de fluxo e os histogramas com as respectivas barras de erro padrão da média na figura 12 A-E. Observamos ainda, nas figuras 12 A-D, que o INF possui resposta similar a encontrada nos experimentos com MTT na figura 9, sugerindo que, onde constatamos diminuição da viabilidade celular apenas após 72 horas de experimento, seja uma conseqüência do aumento da apoptose em 48 horas de experimento. Da mesma forma encontramos nas figuras 12 A-E resultados que corroboram os experimentos da figura 9 para o tratamento com a NAC, onde o aumento da apoptose já em 24 horas na linhagem HepG2 se reflete na diminuição da viabilidade celular em 48 horas após o tratamento na figura 9. Dados estes que vão ao encontro com outros estudos onde a diminuição do numero de células é acompanhado pelo aumento de apoptose (144, 147, 167, 168). Embora a NAC potencialize o efeito do INF reduzindo a viabilidade celular (figura 9), ela não aumentou a marcação com a anexina em relação ao INF, sugerindo que esses compostos possam agir em momentos diferentes, 24 e 48 horas, e não exerçam efeito direto através da morte de células apoptóticas (figura 12), envolvendo reguladores da proliferação e morte celular com o NF-kB. Sabe-se que vários carcinógenos e promotores tumorais agem pela ativação do NF-kB, que a expressão constitutiva do NF-kB é frequentemente encontrada em células neoplásicas, que a ativação do NF-kB induz à resistência das células neoplásicas a agentes quimioterápicos e radiação, que vários genes envolvidos na iniciação, promoção e progressão tumoral são regulados pelo NF-kB e que a ativação do NF-kB pode suprimir a apoptose e promover a proliferação celular (169). Baseados nestas premissas buscamos avaliar a expressão do NF-kB nos tratamentos estudados 66 Por meio dos dados obtidos em nosso estudo na figura 13, confirmamos achados de trabalhos anteriores que demonstraram diminuição na expressão da subunidade p65 em estudos in vitro e in vivo, utilizando tratamentos com NAC(170-172). Por outro lado na dose de 2,5x104 utilizada em nosso estudo e ilustrada na figura 13 A/B, o INF não diminuiu a expressão da subunidade p65 do NF-kB, em contraponto com a literatura (14, 34, 70, 77, 104, 130, 173, 174). Podemos constatar ainda que o cotratamento da NAC com o INF diminuiu mais a expressão da subunidade p65 do NF-kB após 72 horas de experimento que nos tratamentos individuais, como demonstrado na figura 13 A/B. Estes resultados possivelmente estão relacionados com envolvimento da NAC na modulação de mediadores inflamatórios responsáveis pela regulação da resposta imune (128, 175). O método que utilizamos nesta análise foi a expressão da subunidade p65 do NF-kB pela técnica de Western Blot, que possibilita a extrapolação dos resultados da figura 13 A/B relacionando a diminuição da expressão com a inativação deste fator de transcrição. Muitos estudos demonstram o envolvimento do NF-kB com o desenvolvimento tumoral, contudo é controverso o papel da NAC e também do INF na resposta de células tumorais. Estes estudos, porem, são realizados em condições experimentais distintas o que dificulta a compreensão destes mecanismos que são simultâneos, pois a biodisponibilidade da NAC esta relacionada com o metabolismo celular e em diferentes respostas frente ao período de exposição, curto ou longo (114, 122, 147). Como já foi citado anteriormente, nas situações de mobilização da viabilidade celular, o NF-kB encontra-se ativado, dissociado da sua proteína inibitória, o IkB, transduzindo ao núcleo e ativando inúmeros genes de sobrevivência celular e inflamatórios. Para elucidar os mecanismos de ação envolvidos na resposta da NAC nas células de CHC e no efeito potencializador envolvido na resposta do cotratamento com o INF, utilizamos um RNA de interferência, responsável pela degradação do RNA gene específico para a subunidade p65 do NF-kB. Avaliações essas sugeridas como rota de ação por estudos que relataram a NAC como inibidor da via do NF-kB, possivelmente devido à sua ação na inativação da via do NF-kB, sensível ao estresse oxidativo e à resposta inflamatória (171, 176). A utilização desta ferramenta dá suporte para o teste de hipóteses envolvendo um rota ou mobilização gene específica. Inúmeros são os estudos que utilizam a ferramenta de silenciamento gênico para 67 elucidar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos em determinadas doenças(149, 177, 178). Em nosso estudo, após transfectar as células com siRNA para a subunidade p65 do NF-kB e realizar a confirmação das transfecções por microscopia de fluorescência, como demonstrado na figura 14A, avaliamos a expressão dos níveis de RNA mensageiro da subunidade p65 através da reação em cadeia de polimerase em tempo real, 24 horas após as linhagens celulares serem transfectadas com o siRNA, na figura 14B. Com a confirmação do silenciamento (Knock down) da subunidade p65, inviabilizamos a utilização desta via de transcrição pelas células utilizadas no estudo. Trabalhos relacionam a NAC com a inibição do NF-kB e realizam a expressão das proteínas relacionadas com a ativação do fator de transcrição, não confirmando e não refletindo uma relação direta com a resposta da utilização da NAC (150, 179, 180). Em nossos experimentos, na figura 14 A/B, obtivemos o silenciamento da subunidade p65 do NF-kB em ambas as linhagens celulares. Recentemente Wu e colaboradores (2010) descreveram o envolvimento da subunidade p65 na proliferação de células da linhagem HepG2, demonstrando que nas células tumorais de fígado a subunidade p65 tem sua expressão aumentada comparada à células normais da linhagem LO2. Neste mesmo estudo foi utilizado siRNA para a subunidade p65 do NFkB e a avaliação da expressão no mesmo período de tratamento de nosso estudo. Esses dados vão ao encontro dos resultados da figura 13 A/B obtidos tanto em células da linhagem HepG2 quanto em células da linhagem Huh7 e tratadas com a NAC. Outro resultado de Wu (2010) com siRNA pode ser corroborado com os experimentos realizados em nosso estudo. O silenciamento da subunidade p65 confirmado pela diminuição da expressão da subunidade p65 do NF-kB vai ao encontro dos dados obtidos no tratamento com a NAC, nas figuras 13 A/B e 14 A/B, onde foi demonstrada uma diminuição da expressão da subunidade p65 do NF-kB concomitante com aumento da apoptose (177). A fim de avaliar se a NAC tinha a mesma resposta e a mesma via de ação das células silenciadas para a subunidade p65, tratamos, então, essas células com a NAC e observamos que apresentaram a mesma resposta, como demonstrado nas figuras 15 A/B. Para esta avaliação salientamos os seis tratamentos utilizados nas células 68 transfectadas; dois utilizando o controle de transfecção, com o siRNA não específico e quatro com o siRNA alvo. Demonstramos que a transfecção com o siRNA para a subunidade p65 diminui a viabilidade celular na mesma proporção que as células transfectadas com o controle de transfecção e tratadas com a NAC. Por outro lado, na figuras 15 A/B, quando tratamos as células transfectadas com o siRNA para a subunidade p65 com a NAC, seja na dose de 10mM ou 20mM, não observamos diferença em relação às células transfectadas com o siRNA para a subunidade p65 sem os tratamentos com a NAC. Esses resultados sugerem que se o RNA mensageiro está silenciado e, consequentemente, a proteína da subunidade p65 do NF-kB não está expressa, a NAC não teria alvo ação, indicando necessariamente mobilização desta via para ação da NAC nas linhagens celulares estudas. Neste panorama a utilização de um composto como a NAC na modulação de um fator de transcrição, como o NF-kB, traz a possibilidade de combinar os mecanismos envolvidos no desenvolvimento tumoral com alvos moleculares. Quando analisamos, nas figuras 15 A/B, a viabilidade das células transfectadas com o siRNA para a subunidade p65 e tratadas com INF, fomos confrontados com o aumento da resposta, ou seja, diminuição da viabilidade celular, sendo esta a mesma resposta observada para o cotratamento da NAC com INF em células não transfectadas. Estudos demonstram o envolvimento do NF-kB na resposta celular frente ao tratamento com o INF. A modulação, contudo, não é específica, podendo, assim, outras vias estarem envolvidas nas interações com o INF (14, 178, 181-185). Essas interações explicariam por que o INF é um imunomodulador que se relaciona com o NF-kB através da resposta imune (14, 178, 181-184). Assim, nas figuras 9 e 12 A-E, o efeito aditivo na supressão do crescimento celular, através da diminuição da viabilidade celular e o aumento da apoptose demonstrado pelo nosso estudo usando o cotratamento da NAC com o INF, é atribuível à inibição da via do NF-kB, já que possui relação direta com a presença da proteína subunidade p65 do heterodímero do NF-kB. O balanço entre a proliferação e a morte celular é fator determinante na progressão ou inibição do processo de carcinogênese. Uma grande variedade de mecanismos pode ser ativada ou inativada para induzir apoptose (149, 161, 163, 186). Moléculas antioxidantes, como a NAC, apresentam a capacidade de desencadear 69 vários desses mecanismos em diferentes tipos de linhagens de tumores humanos (171, 187). Um desses mecanismos refere-se à hiper-regulação de genes próapoptóticos aliado à hiporregulação de genes inibidores de apoptose, muitas vezes acompanhado do aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial e da liberação do citocromo c, ativando a cascata das caspases. Todos esse eventos são regulados pela ativação ou inativação do NF-kB (150, 163, 186). Em nosso estudo, ilustrado nas figuras 12 A-E, utilizou-se a NAC como um potencial regulador da morte celular, tendo em vista que ela demonstrou ser capaz de induzir apoptose em algumas linhagens tumorais(188). O seu papel e o seu efeito associado ao INF em células de câncer hepático eram até então desconhecidos. A principal observação do nosso estudo foi que a NAC pode inibir a viabilidade das células de carcinoma hepatocelular humano, HepG2 e Huh7, através do bloqueio da via do NF-kB, demonstrado no ensaio de MTT (figura 9), marcação com anexina V (figura 12 A-E), down regulation da expressão proteica da subunidade p65 (figura13 A/B) e do silenciamento da subunidade p65 (figura 14 A/B). Além disso, mostramos que a NAC foi mais eficiente em reduzir a viabilidade celular que o INF, de acordo com o perfil das linhagens celulares testadas e das doses utilizadas. Finalmente, como demonstrado na figura 9, o crescimento celular foi inibido em torno de 55% após o cotratamento com a NAC e com o INF em 96 horas de tratamento nas duas linhagens celulares, resultados estes mais expressivos que os compostos individuais, o que sugere um efeito aditivo potencializador. Tendo e vista nossos resultados consideramos de grande valia a realização de estudos futuros para identificar e elucidar ainda mais o exato envolvimento do INF, da NAC e do NF-kB em células de CHC. 70 CONCLUSÕES 71 8 CONCLUSÕES A NAC mostrou efeito potencializador na resposta antitumoral do INF, diminuindo a viabilidade celular, aumentando a apoptose e diminuindo a expressão da subunidade p65 do NF-kB. 1. A NAC e o INF diminuem a viabilidade celular através do MTT nos diferentes tempos de experimento, a partir de 48 horas. 2. A NAC possui ação potencializadora na redução da viabilidade celular, em cotratamento com o INF na viabilidade celular, através do MTT, nos diferentes tempos de experimento. 3. Os diferentes tratamentos utilizados não apresentaram alterações significativas através da avaliação do Ciclo Celular. 4. Os diferentes tratamentos utilizados induzem a morte celular, constatada através da análise em Citometria de Fluxo. 5. Os diferentes tratamentos com a NAC modulam a expressão da subunidade p65 do NF-kB. 6. A resposta da NAC e sua ação estão implicadas na mobilização da via do NF-kB 72 PERSPECTIVAS 73 9 PERSPECTIVAS FUTURAS Há interesse crescente da comunidade científica nos mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos do envolvimento do NF-kB no CHC. Ainda pouco se sabe sobre o papel de antioxidantes como a NAC na regulação dos mecanismos que envolvem o CHC, principalmente por alguns resultados encontrados em situações experimentais distintas. A NAC mostra grande potencial terapêutico em diversas doenças e pode auxiliar o entendimento dos mecanismos das vias de carcinogênese em situações experimentais e clínicas. A partir dos resultados obtidos, verificamos que a NAC mostra efeitos benéficos na inibição da viabilidade celular e aumento de apoptose envolvendo a via do NF-kB. Essas evidências despertam grande interesse e abrem perspectivas para investigar de forma mais aprofundada os efeitos sobre a ativação de cascatas moleculares antitumorais, tanto em linhagens celulares humanas como no fígado de ratos com CHC. Nossas perspectivas focam a continuidade de estudos, investigando os mecanismos que envolvem o estresse oxidativo, a ativação da rota do NF-kB e a transcrição de proteínas inflamatórias relacionadas com imunomodulação das células tumorais no fígado de ratos com CHC. Esse objetivo é condizente com a aplicabilidade terapêutica da NAC, pois ela se mostrou muito eficaz na inibição do crescimento celular in vitro. 74 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75 10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. RAOUL J L. Natural history of hepatocellular carcinoma and current treatment options. Semin Nucl Med 2008; 38(2): S13-8. 2. CERVELLO M, MONTALTO G. Cyclooxygenases in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2006; 12(32): 5113-21. 3. 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