IL-4 MODULA A EXPRESSÃO DO RECEPTOR MUSCARINICO M3 EM CÉLULAS
DA RETINA DE RATOS NEONATOS LISTER HOODED MANTIDAS EM
CULTURA.
¹Marcelo Gomes Granja; ²Luis Eduardo Gomes Braga; ³Aline Araujo dos Santos Rabelo;
4
Elizabeth Giestal de Araujo.
RESUMO
A interleucina 4 é uma citocina pleiotrópica capaz de também regular a sobrevida e a
diferenciação de células do sistema nervoso. Em retinas diferenciadas, o receptor muscarínico
M3, está presente em células amácrinas, ganglionares e bipolares. Neste trabalho
investigamos a expressão do receptor muscarínico M3, na cultura de células da retina de ratos
tratadas com a IL-4, por diferentes intervalos de tempo. Observou-se que culturas tratadas
com IL-4 e mantidas por 48h e 72h, apresentaram um significativo aumento na expressão do
receptor M3, em comparação com os seus controles. Nossos dados sugerem que a IL-4
desempenhe um papel modulador da expressão colinérgica em cultura de células da retina de
ratos participando, portanto, da diferenciação destas células.
Palavras-Chave: Receptor Muscarínico, Interleucina 4, cultura celular, retina, rato.
ABSTRACT
Interleukin 4 is a pleiotropic cytokine also involved in the regulation of survival and
differentiation in the nervous system. In differentiated retinas, muscarínico receptor is present
in amacrine, ganglion and bipolar cells. In this paper, we investigated the expression of
muscrinic receptor M3 in rat retinal cell cultures treated with IL-4, after different time
intervals. It was observed that cultures treated with IL-4 and kept for 48 hours and 72 hours,
expressed a significant increase in the M3 receptor when compared to the controls. Our data
suggest that IL-4 plays a modulator role in cholinergic differentiation of rat retinal cells
indicating.
Keywords: muscarinic receptor, interleukin-4, cell culture, retina, rat.
A interleucina 4 é capaz de aumentar de maneira dose-dependente a sobrevida de
neurônios hipocampais de embriões de ratos mantidos em cultura por 24 e 72 horas
(ARAUJO & COTMAN, 1993). Igualmente esta citocina aumenta a sobrevida de células
ganglionares de ratos neonatos submetidas ao processo de axotomia e mantidas em cultura por
48h. Este efeito é mediado por receptores muscarínicos do tipo 1 (M1) e depende da
proliferação celular nas culturas (SHOLL-FRANCO et al., 2001). Na retina adulta, a
acetilcolina é o neurotransmissor dominante de uma subpopulação de células amácrinas e
trabalhos mostram que receptores para esse neurotransmissor do tipo muscarínico (mAChRs)
são expressos por células amácrinas, ganglionares, e bipolares. As células imaturas da retina
neural (células neuroblásticas) podem também liberar acetilcolina, pois marcadores
colinérgicos são transitoriamente expressos na retina de mamíferos mesmo antes do período
_______________________
¹ Médico Veterinário, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF.
² Farmacêutico, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF.
³ Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Adjunto I da
Universidade Federal Fluminense/UFF.
4
Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Associada III
pela Universidade Federal Fluminense/UFF. Endereço: Rua Outeiro de São João Batista s/n, Centro – Niterói –
Rio de Janeiro. CEP 24210-130. E-mail: [email protected]
de sinaptogênese (MARTINS et al, 2008). O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da
interleucina 4 (IL-4) na expressão do receptor muscarínico M3 nas células da retina mantidas
em cultura por diferentes intervalos de tempo. Ratos neonatos (P0-P2) da linhagem Lister
Hooded foram sacrificados por decapitação e suas retinas dissecadas em solução salina livre
de cálcio e magnésio (CMF). Em seguida, as retinas foram incubadas em solução de 0,1% de
tripsina para ocorrer a separação enzimática das células. Posteriormente ocorre uma
dissociação mecânica com auxílio de uma pipeta Pasteur de ponta afilada. As células foram
plaqueadas em densidade de 1,0 x105 cel/cm2 em placas de Petri, previamente tratadas com
25µg/mL de poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em meio completo (meio 199, 5%
BSE, glutamina e antibióticos) ou em presença de meio completo na presença de IL-4
(50U/mL). As culturas foram incubadas em atmosfera controlada com 5% de CO2 e 95% de
ar, mantidos a 37°C por diferentes intervalos de tempo. A expressão do receptor muscarínico
M3 foi determinado pela analise de Western Blot. Os resultados foram expressos em unidades
artitrárias após análise das imagens pelo programa SCION.Os procedimentos experimentais
com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFF (projeto
00124/09). Analisando o efeito da IL-4 na expressão do receptor M3, observamos que
tratamentos com a IL-4 por 15 minutos (CT 15min=30842,5 е=3947,7; IL-4= 30981,5
е=12945; n=3) (Figura 1), 45 minutos (CT 45min =17496 е=3907,7; IL-4 =16670,6
е=4067,7; n=3) (Figura 2) e 24 horas (CT 24h =15567 е=3722,2; IL-4= 18225,5 е=4827,4;
n=3) (Figura3) não interferiram na expressão dos receptores M3 em células da retina mantidas
em cultura. Entretanto, em 48h e 72h [48 horas (CT=10450,33 е=1970,44; IL-4=21581
е=581,5; n=4) (Figura4) e 72 horas (CT 48h =13380 е=2038; IL-4= 21830 е=708; n=3)
(Figura 5)], foi possível observar um significativo aumento, em comparação aos seus
controles, na expressão deste receptor em culturas tratadas com IL-4. O tratamento com a IL4 é capaz de induzir também um efeito neuritogênico em nossas culturas, sugerindo um papel
da IL-4 na diferenciação dessas células mantidas em cultura (dados não mostrados). Dados da
literatura vêm demonstrando que astrócitos expressam receptores muscarínicos e que
análogos da acetilcolina como o carbacol, ativam os receptores muscarínicos do tipo M3 nos
astrócitos corticais ou hipocampais, promovendo o crescimento de neuritos (GUIZZETTI et
al., 2011). A mudança no padrão da expressão dos receptores muscarínicos pode de alguma
forma estar envolvida com a transição do período de proliferação celular para o de
diferenciação. Os dados apresentados neste resumo indicam que a IL-4 possa regular a
diferenciação colinérgica através do perfil de expressão de receptores muscarínicos M3,
indicando um possível papel para esta citocina na diferenciação colinérgica de células da
retina.
Fonte financeira: CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI e PRONEX.
Referências Bibliográficas
ARAUJO, D.M. AND COTMAN, C.W. (1993) Trophic effects of interleukin-4, -7 and –8 on
hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res., v.
600 (1), p. 49-55.
GUIZZETTI, M., MOORE, N.H., VANDEMARK, K. L., GIORDANO, G., COSTA, L.G.
(2011) Muscarinic receptor-activated signal transduction pathways involved in the
neuritogenic effect of astrocytes in hippocampal neurons. Eur. J. Pharmacol. v. 659 p. 102107.
MARTINS, R.A.P & PEARSON, R.A. (2008) Control of cell proliferation by
neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res v. 1192 p. 37-60.
SHOLL-FRANCO, A.; FIGUEIREDO, K. G. A. AND ARAUJO, E. G. (2001) Interleukin- 2
and interlukin-4 increase the survival of retinal ganglion cells in culture. Neuroreport. v.12
(22), p. 109-112.
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Figura 1. Expressão do receptor M3 após tratamento com IL-4 por 15 minutos.
Efeito da interleucina 4 (IL-4) na expressão de receptores muscarínico M3 na cultura de células da retina de
ratos, mantido por 15 minutos de estimulo.
Figura 2. Expressão do receptor M3 após tratamento com IL-4 por 45 minutos.
Efeito da interleucina 4 (IL-4) na expressão de receptores muscarínico M3 na cultura de células da retina de
ratos, mantido por 45 minutos de estimulo.
Figura 3. Expressão do receptor M3 após tratamento com IL-4 por 24 horas.
Efeito da interleucina 4 (IL-4) na expressão de receptores muscarínico M3 na cultura de células da
retina de ratos, mantido por 24 horas de estimulo.
Figura 4. Expressão do receptor M3 após tratamento com IL-4 por 48 horas.
Efeito da interleucina 4 (IL-4) na expressão de receptores muscarínico M3 na cultura de células da
retina de ratos, mantido por 48 horas de estimulo.*p<0,001
Figura 5. Expressão do receptor M3 após tratamento com IL-4 por 72 horas.
Efeito da interleucina 4 (IL-4) na expressão de receptores muscarínico M3 na cultura de células da
retina de ratos, mantido por 72 horas de estimulo.*p<0,001
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