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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
JULIANO CARVALHO DA SILVA
CORRELAÇÃO DAS LESÕES HISTOPATOLÓGICAS
RENAIS E CARDÍACAS EM RATOS
ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR)
Uberaba- MG
2013
JULIANO CARVALHO DA SILVA
CORRELAÇÃO DAS LESÕES HISTOPATOLÓGICAS
RENAIS E CARDÍACAS EM RATOS
ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR)
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Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como
requisito para obtenção do Título de Mestre em Patologia
Básica experimental.
Orientadora: Profª Drª Ana Carolina Guimarães Faleiros
Co-Orientador: Dr. Octávio Barbosa Neto
Uberaba- Outubro
2013
Agradecimentos
A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior
para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e
me suprir em todas as minhas necessidades.
À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e
incentivo.
À minha orientadora e amiga Profa. Dra. Ana Carolina G.Faleiros,
por
por acreditar em mim, me mostrar o caminho da ciência, fazer parte
da minha vida nos momentos bons e ruins, por ser exemplo de
profissional e de mulher e que
que sempre fará parte da minha vida.
A Dra Renata Margarida Etchebehere por sua ajuda nos momentos
mais críticos, por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o
meu crescimento profissional e por ser também um exemplo a ser
seguido. Sua participação foi fundamental para a realização deste
trabalho.
Aos amigos da Patologia Geral, Especial, Cirúrgica,
Cirúrgica, Fisiologia e PósPósGraduação,
Graduação, em especial Daniela Beatriz Souza Campos, Eliângela de
Castro Cobo, Patrícia Lins Marques, Vanesca Alessandra Silva Gomes
e Átila FredericoVieira que fizeram parte desses momentos sempre me
ajudando e incentivando. Somente Deus poderá retribuir o imenso
carinho e contribuição que tiveram nesse trabalho.
III
3
Apoio financeiro: Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Fundação
de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU) e Universidade Federal
do Triângulo Mineiro (UFTM).
4
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO................................................................................................................
1.1 HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA..................................................................
1.2.
EPIDEMIOLOGIA........................................................................................................
1.3. FISIOPATOLOGIA......................................................................................................
1.3.1. CARDIOPATIA HIPERTENSIVA.........................................................................
1.3.2. NEFROESCLEROSE...............................................................................................
1.4. MODELO EXPERIMENTAL...................................................................................
2.
OBJETIVO
GERAL....................................................................................................
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.........................................................................................
3. MATERIAL E MÉTODO................................................................................................
3.1. SELEÇÃO DE
ANIMAIS.............................................................................................
3.2. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMODINÂMICOS NOS ANIMAIS............
3.3. PROCESSAMENTO E COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS.......................................
3.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA...................................................
3.5. ANÁLISE
ESTATÍSTICA............................................................................................
4. RESULTADOS................................................................................................................
5. DISCUSSÃO....................................................................................................................
6.
CONCLUSÃO..................................................................................................................
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................
IV
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19
V
RESUMO
A hipertensão arterial sistêmica é uma das mais frequentes e preocupantes doenças nos países
do ocidente e pode ser considerada como um fator responsável por alterações estruturais e
funcionais caracterizadas por modificações como a hipertrofia dos miocardiócitos, fibrose
intersticial e nefroesclerose. Porém, não existem estudos mostrando se existe uma associação
5
entre a intensidade das lesões nesses dois órgãos alvo. O objetivo foi verificar se existe
correlação entre a intensidade de fibrose cardíaca e renal, esclerose glomerular e área de
miocardiocitos em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Foram utilizados fragmentos do
terço médio do ventrículo esquerdo do coração e polo médio do rim direito de 15 SHR, esses
órgãos foram fixados, processados e as lâminas coradas com Hematoxilina-Eosina e PicroSirius. A morfometria foi realizada no programa ImageJ. As análises foram feitas pela
contagem de pontos através da qual obtivemos o valor da área ocupada por matriz mesangial e
miocardiócitos em um2 e marcação da área de colágeno, birrefringente, obtendo-se o
percentual de fibrose por área do campo analisado. A área de matriz mesangial foi expressa
em porcentagem calculada a partir da área total do tufo glomerular. A média da área de
miocardiócitos foi de 1763,1 µm² e a média da porcentagem de área do glomérulo ocupada
por matriz mesangial foi de 36,8%. A mediana fibrose cardíaca foi 0,4% e renal de 0,7%.
Houve uma correlação positiva, porém não significativa entre: área de miocardiócitos e a área
de matriz mesangial, e entre a fibrose cardíaca e renal. Portanto, concluímos que, tanto o rim
quanto o coração são lesados pela hipertensão, lesões estas representadas pela hipertrofia
cardíaca e alteração de matriz mesangial e fibrose, porém esses processos não se desenvolvem
proporcionalmente na mesma intensidade nesses dois órgãos alvo.
Palavras-chave: Hipertensão, coração, rim
ABSTRACT
Systemic Arterial Hypertension (SAH) is one of the most common and troubling diseases in
Western countries and can be considered as a factor responsible for structural and functional
changes as characterized by cardiomyocytes’ hypertrophy, interstitial fibrosis and
nephrosclerosis. However, there are no studies showing whether there is an association
between the intensity of the lesions in these two target organs. The aim was to verify if there
is correlation between the cardiac and renal fibrosis intensity, glomerulosclerosis and
cardiomyocytes’ area in spontaneously hypertensive rats. Fragments of the middle third of the
VI
6
left ventricle and the right kidney middle pole of 15 spontaneously hypertensive rats were
used. These organs were fixed and processed and the slices were stained with hematoxylineosin and Picrosirius. The morphometry was performed using ImageJ. Analyses were done by
point counting through which the value of the area occupied by the mesangial matrix and
cardiomyocytes in um2 were obtained and the area of birefringent collagen was marked
showing the percentage of fibrosis per field area analysed. The mesangial matrix area was
expressed as a percentage from the total area of the glomerular tuft. The average area of
cardiomyocytes was 1763.1 µm² and the average percentage of the glomerular area occupied
by mesangial matrix was 36.8%. The median of cardiac and kidney fibrosis were 0.4% and
0.7%, respectively. There was a positive correlation, despite not significant, between:
cardiomyocytes and mesangial matrix areas, and; cardiac and renal fibrosis. Therefore, we
conclude that both the kidney and the heart are harmed by hypertension, lesions represented
by cardiac hypertrophy and mesangial matrix alterations and fibrosis, but these processes
don’t grow proportionately with the same intensity in these two target organs.
Keywords: Hypertension, heart, kidney.
Lista de figuras:
Figura 1. Fragmentos do terço médio do ventrículo esquerdo do coração dos ratos SHR,
fixados em paraformaldeído 10% tamponado.
Figura 2. Fragmentos do pólo médio do rim direito dos ratos SHR, fixados em
paraformaldeído 10% tamponado.
VII
7
VIII
Lista de gráficos, tabelas e quadros:
Gráfico 1. Representação da correlação entre fibrose cardíaca e renal em ratos SHR.
Gráfico 2. Representação da correlação entre área de miocardiócitos e matriz
mesangial em ratos SHR.
Quadro 1. Fórmulas utilizadas para os cálculos realizados
Tabela 1. Análise da área de miocardiócitos, matriz mesangial, fibrose cardíaca e
renal em ratos SHR.
8
IX
Lista de abreviaturas
HAS
mmhg
PA
SHR
HA
HE
PS
µm2
Hipertensão arterial distêmica
Milímetro de mercúrio
Pressão arterial
Spontaneously Hypertensive Rats
Hipertensão arterial
Hematoxilina e eosina
Picro-Sirius
Micrômetros quadrados
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1. Introdução:
1.1. Hipertensão arterial sistêmica:
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é definida como pressão sanguínea sistólica
acima de 140 mmHg e/ou pressão sanguínea diastólica acima de 90mmHg, é uma das mais
freqüentes e preocupantes doenças nos países do ocidente (GRYNBERG, 2005; IV DBHA,
2004).
De acordo com IRIGOYEN et al 2003, a HAS é uma doença multifatorial resultando
em anormalidades dos mecanismos de controle da pressão arterial (PA). Trata se de uma
síndrome cardiovascular progressiva acometendo vários órgãos como coração, rins e encéfalo
(ANWAR,2012).
Apenas a manutenção de níveis permanentemente elevados, em múltiplas medições,
em diferentes horários, posições e condições (repouso, sentado ou deitado) caracteriza HAS
(BÜHLER et al., 1994; SOUZA et al, 2010).
1.2 Epidemiologia:
Inquéritos epidemiológicos da HAS no Brasil apontam uma alta prevalência, da ordem
de 22% a 44%, sendo responsável por aproximadamente 46% dos óbitos e 31,37% das
internações com causa cardiovascular. A prevalência da HAS é maior em países
desenvolvidos do que em países em desenvolvimento, mas a grande massa populacional em
países em desenvolvimento tem contribuído de forma significativa para o número total de
indivíduos hipertensos no mundo todo (KEARNEY et al., 2005).
A hipertensão arterial por si só representa um potencial fator de risco cardiovascular,
contribuindo para a disfunção renal sendo um problema de saúde pública grave em todo o
mundo (KEARNEY et al., 2005).
10
Dessa forma, a HAS é um dos principais agravos à saúde no Brasil, elevando o custo
médico-social, principalmente pelas suas complicações, como as doenças cérebro-vascular,
arterial coronariana e vascular de extremidades, além da insuficiência cardíaca e da
insuficiência renal crônica (SBH, 2006; IV DBHA, 2004).
1.3 Fisiopatologia:
A HAS está relacionada com um aumento na “resistência” das artérias, a qual ocorre
com o aumento da idade, a obesidade, dentre outros. Embora frequentemente a HAS seja uma
predisposição genética, podem ser também desencadeada por fatores nutricionais incluindo
obesidade, resistências à insulina e excessivos consumo de álcool ou sal e o sedentarismo.
(DBHA, 2007).
Isso ocorre devido a um desequilíbrio entre vários mecanismos que contribuem para a
regulação da pressão, assim como hiperatividade do sistema simpático ou alteração do sistema
renina-angiotensina-aldosterona. (BEEVERS et al., 2001).
1.3.1 Cardiopatia hipertensiva:
Elevação da pressão arterial representa fator de risco independente, linear e contínuo
para a doença cardiovascular. Uma das principais limitações no controle da hipertensão está
alicerçada no conceito de que essa doença é complexa e poligênica e sofre influência de
fatores ambientais como dieta, ingesta de sal e obesidade, entre outros. (GANTEN & JONG,
1994; WHO, 2007).
A hipertensão não é uma doença do leito vascular, mas se torna um fator de risco
importante quando a pressão arterial se eleva a um nível muito alto, provocando o
aparecimento de lesões crônicas nas artérias e órgãos alvos como rins, coração, cérebro e
olhos (GRYNBERG, 2005).
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Estudos experimentais e clínicos realizados nas últimas quatro décadas concluíram que
existe uma relação recíproca entre doenças hipertensivas e coração. A HAS pode ser
considerada como um fator responsável por alterações estruturais e funcionais caracterizadas
por modificações como a hipertrofia e apoptose dos miocardiócitos, fibrose, hipertrofia da
parede de artérias e arteríolas intramiocárdicas (SALAZAR, 2006).
A hipertrofia cardíaca é um processo adaptativo que ocorre em resposta a uma série de
estímulos fisiológicos e patológicos (CICOGNA et al., 1997). A hipertrofia cardíaca é uma
adaptação do miocárdio sendo uma das principais complicações da hipertensão, resultando no
desenvolvimento de insuficiência cardíaca (THANDAPILLY, 2013).
Além disso, a hipertrofia ventricular esquerda representa um marcador de risco
cardiovascular independente, e pode estar associada com o aumento da incidência de doenças
cardiovasculares fatais, como doença coronária, arritmia ventricular e morte súbita. (FROLIK,
1999; LORREL & CARABELLO, 2000).
As características morfológicas da cardiopatia hipertensiva estão relacionadas à
pressão sanguínea e fatores não hemodinâmicos resultando na expressão alterada da
contratilidade dos miocardiócitos e de algumas proteínas, promovendo a hipertrofia do
ventrículo esquerdo e fibrose intersticial, respectivamente (DIAMOND et al., 2005).
A fibrose é caracterizada por excesso ou acúmulo difuso de fibras colágenas
(JIMÉNEZ NAVARRO et al., 2006), aumentando a rigidez miocárdica, podendo levar a
disfunção do ventrículo esquerdo e por último culminando com insuficiência cardíaca
(SAEED et al., 2006).
Estudos post-mortem realizados em corações de humanos (ROSSI, 1998) e em
biópsias endomiocárdicas, mostraram que a fração do volume de colágeno miocárdico,
determinado através da quantificação de fibras colágenas presentes no miocárdio, está
12
significantemente aumentada em pacientes com HAS quando comparado a um grupo sem
HAS (QUAREJETA et al 2000).
Histologicamente, a fibrose presente na cardiopatia hipertensiva é caracterizada por
um excessivo depósito de fibras colágenas tipo III e com a decorrer do tempo é acompanhada
por um aumento de fibras colágenas do tipo I. (OLIVETTI et al., 1994)
Essas fibras estão revestindo o interstício e vasos intramiocárdicos, e seu acúmulo não
fica restrito ao ventrículo esquerdo, podendo se espalhar para outras câmaras do coração.
Sendo que, a quantidade de fibras colágenas é inversamente proporcional ao número de
cardiomiócitos e diretamente proporcional ao grau de hipertrofia (PARDO MINDÁN &
PANIZO, 1993).
O aumento de fibras colágenas no coração de pacientes com cardiopatia hipertensiva é
resultado de uma combinação do aumento da síntese de fibras colágenas pelos fibroblastos e
miofibroblastos e a diminuição da sua degradação por metaloproteinases (WEBER, 1993).
1.3.2 Nefroesclerose:
Além de afetar o coração, a HAS ela também pode provocar danos nos rins causando a
nefroesclerose benigna ou a maligna. O aumento da PA pode acarretar lesão renal progressiva
agravando o quadro de PA sistêmica (FOGO, 2000; MARCANTONI et al., 2000).
Normalmente o aumento da pressão sanguínea, temporária ou permanente, é impedido
de alcançar completamente a microvasculatura renal, pois ocorre uma auto-regulação
vasoconstritora proporcional da vasculatura pré-glomerular. (ZUCCHELLI & ZUCCALA,
1995; KINCAID-SMITH, 1999).
Dessa forma, o fluxo de sangue renal e as pressões hidrostáticas do glomérulo são
mantidos relativamente constantes (BIDANI & GRIFFIN, 2002; NAVAR, 1978). Essa auto-
13
regulação levando a vasoconstrição é uma proteção contra os danos renais em hipertensos
(BIDANI & GRIFFIN, 2002; BIDANI et al., 1987).
Se a pressão sangüínea permanecer abaixo de certo limite, apenas a nefroesclerose
benigna é observada. Entretanto, se o limite for excedido, é esperado que se desenvolva a
nefroesclerose maligna, embora ainda ocorra o mecanismo de auto-regulação (BIDANI &
GRIFFIN, 2002; KARLSEN et al., 1997; LONGE et al., 2004).
A nefroesclerose benigna é o termo usado na patologia renal associada à esclerose das
arteríolas renais e pequenas artérias, é a forma mais prevalente de lesão hipertensiva em
biópsias renais com presença de hialinose e posterior fibrose das arteríolas renais
(BOCKMEYER, 2012). O efeito resultante é isquemia focal do parênquima suprido por vasos
com paredes espessadas e conseqüentemente lumens estreitados. Acredita-se que, embora a
isquemia glomerular e a perda de néfrons ocorram com o passar do tempo, a função renal não
é seriamente comprometida, porém há controvérsias (PALMER, 2002).
Alguns grupos de hipertensos com nefroesclerose benigna se encontram sob risco
aumentado de desenvolver insuficiência renal crônica: indivíduos não brancos, pacientes com
elevações mais severas de pressão arterial e paciente com uma segunda doença subjacente,
especialmente diabetes. Nesses grupos a insuficiência renal pode surgir após hipertensão
benigna prolongada, porém, a insuficiência renal mais rápida resulta do desenvolvimento da
fase acelerada ou maligna da hipertensão.
A nefroesclerose maligna é observada na HAS mais grave e apresenta um fenótipo
renal característico de rompimento vascular agudo e dano glomerular com depósito fibrinóide
proeminente e trombose. É freqüente o desenvolvimento de Isquemia glomerular por causa do
dano vascular. A hipertensão maligna é relativamente incomum, ocorrendo em 1% a 5% de
todos os pacientes com pressão arterial elevada (BIDANI & GRIFFIN, 2004; ALPERS,
2005).
14
A nefroesclerose na HAS pode levar rapidamente a insuficiência renal caso não haja
tratamento adequado. Recentemente, a United States Renal Data System juntamente com
dados europeus e latino-americanos registrou indícios de que a nefroesclerose na HAS é a
segunda principal causa de doenças renais (BIDANI & GRIFFIN, 2004).
Observações clínicas mostram que o risco de desenvolvimento de uma doença renal de
estagio final é 20% maior em pacientes hipertensos (KLAG et al., 1996). Dessa forma,
associa-se a questão genética ou ambiental induzindo o aumento dos mecanismos prófibróticos, assim como o sistema renina-angiotensina (SUTHANTHIRAN et al., 1998;
DURU et al., 1994).
Assim, a HAS é uma doença que promove sérios danos tanto no coração como nos
rins, em especial com desenvolvimento de fibrose intersticial, que representa um marcador de
prognóstico.
1.4. Modelo experimental:
Os ratos espontaneamente hipertensos SHR foram desenvolvidos como um modelo
genético de HA, que é similar em muitos aspectos à HA essencial no homem, com algumas
ressalvas. (TRIPPODO & FROHLICH, 1981).
Para melhor compreensão da fisiopatologia e da terapêutica da hipertensão arterial,
Okamoto e Aoki desenvolveram, por seleção genética, uma linhagem de ratos
espontaneamente hipertensos (OKAMOTO & AOKI, 1963).
Ao nascer, os ratos SHR são normotensos, mas por volta da quinta semana de vida, a
pressão sanguínea arterial eleva-se progressivamente, atingindo ou excedendo 220mmHg,
mantendo-se assim durante toda a vida do animal, tornando-se o modelo experimental de
maior utilidade para o estudo fisiopatológico da hipertensão essencial humana, A partir desta
idade a hipertensão se estabiliza até aproximadamente 1 a 1,5 anos de idade quando os
15
animais começam a desenvolver um quadro de insuficiência cardíaca congestiva, a qual é
associada com uma elevada taxa de mortalidade (YAMORI, 1994).
Precocemente, os animais desenvolvem hipertrofia do ventrículo esquerdo, que é
responsável pela manutenção da função cardíaca normal, apesar da elevada pressão arterial
sistêmica. Em idade mais avançada, podem ocorrer deterioração da função miocárdica e
desenvolvimento de falência cardíaca (CICOGNA et al., 1997), inflamação e fibrose renal
(DORIS, 2012).
Portanto, torna-se de suma importância entender melhor a relação existente entre a
intensidade das lesões cardíacas e renais associados a HAS, e assim, clinicamente poder fazer
inferências sobre a gravidade da lesão cardíaca com base na análise de exames renais, viceversa.
16
2. Objetivo Geral:
• Correlacionar as lesões histopatológicas cardíacas e renais acometidas pela
hipertensão arterial sistêmica em ratos SHR.
2.1 Objetivos Específicos:
• Correlacionar a porcentagem de fibrose cardíaca e renal;
• Correlacionar a porcentagem de matriz mesangial e área de miocardiócitos;
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3- Material e Método:
3.1 Seleção dos animais:
Foram utilizados 15 ratos espontaneamente hipertensos (“spontaneously hypertensive
rats” -SHRs),
com peso pareado e idade de aproximadamente 20 semanas, procedentes da
mesma linhagem do Biotério da disciplina de Fisiologia da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro (UFTM), onde foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais por gaiola
– ZOOTECH 375) de polipropileno autoclavável 414 x 344 x 168 mm com tampa (grade) em
aço galvanizado com separadores em aço inox temperatura de 22-23ºC, umidade de 40-70% e
fotoperíodo de 12 horas claro/escuro e terão livre acesso à água e alimento (Nuvilab CR1,
Nuvital Nutrientes Ltda, Curitiba, PA).
3.2. Avaliação dos parâmetros hemodinâmicos nos animais:
Os animais foram inicialmente anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.),
em seguida, cateteres de polietileno (PE-10 fundido a uma extensão de PE-50; Clay Adams
Brand, Polvethylene Tubing, Becton Dickinson, Sparks) foram introduzidos na artéria
femoral esquerda para registro direto da PA e veia femoral esquerda para infusão de drogas.
Posteriormente, os cateteres foram exteriorizados para a região dorsal dos ratos.
Imediatamente após o procedimento cirúrgico, todos os animais receberam via subcutânea,
dois mg/Kg do analgésico Butorphanol, seguido por uma frequência de administração a cada
4h até o período de 8 horas antes do início dos registros. Os animais foram alojados em caixas
individuais para recuperação pós-operatório.
Após 48 horas de recuperação cirúrgica, o cateter arterial foi conectado a um
transdutor de PA e a um amplificador de sinais (Model 8805A, Hewlett-Packard, USA), onde
o sinal foi convertido por placa analógico-digital (com freqüência de amostragem – 1000 Hz)
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e transferido a um sistema computadorizado de aquisição de dados (Aqdados, Lynx Tec.
Eletron. SA, São Paulo, Brasil) e posteriormente armazenados em computador.
Os animais permaneceram em uma sala com ambiente tranqüilo a uma temperatura de
27ºC por um período de adaptação de 15 minutos e em seguida realizados registros contínuos
da PA pulsátil por 30 minutos para obtenção dos valores basais da PA.
Ao final dos experimentos, os ratos foram eutanasiados e o rim direito e o coração
foram retirados e processados.
3.3 Processamento e colorações histológicas:
Foram utilizados fragmentos do terço médio do ventrículo esquerdo do coração e pólo
médio do rim direito fixado em paraformaldeído 10% tamponado por um período de doze
horas (Figuras 1 e 2). Após esse período os fragmentos foram processados em concentrações
crescentes de alcoóis e diafanizados em xilol. Posteriormente os fragmentos foram
emblocados em parafina e submetidos a microtomia para a confecção das lâminas com cortes
de 4 micrômetros de espessura.
As lâminas foram coradas HE, sendo a hematoxilina preparada conforme a seguinte
técnica: Solução alcoólica de 5 g de hematoxilina adicionada a 100 g alúmen de potássio e 2,5
g de óxido de mercúrio vermelho. A eosina foi preparada diluindo a solução aquosa
concentrada de eosina y e floxina com álcool a 95% até a concentração de 1%.
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As lâminas coradas com PS que é uma solução aquosa saturada de ácido pícrico
adicionado de 0,1g% de vermelho da Síria Fb3, Sirius red F3b-Bayer, para a análise da
fibrose cardíaca e renal.
Ao final de todas as colorações as lâminas foram desidratadas em álcool absoluto (I, II
e III), diafanizadas em xilol (I, II e III) e montadas com uma gota de meio de montagem não
resinoso e lamínula.
3.4. Análise morfológica e morfométrica:
A morfometria foi realizada utilizando-se uma câmera de vídeo Motic 2500
acoplada a um microscópio Carl Zeiss, que envia as imagens do microscópio (campo a ser
quantificado) a um computador. Posteriormente, essas imagens serão analisadas no programa
ImageJ .
As lâminas coradas com HE foram examinadas em microscópio de luz comum, com
objetiva de 40x para a quantificação da área dos miocardiócitos e tufo glomerular / matriz
mesangial, respectivamente. Na imagem digitalizada foi feita a quantificação através de uma
grande de pontos, em que foi contabilizado o número de pontos sobre a estrutura desejada de
acordo com as seguintes fórmulas (Mandarim-de-Lacerda, 2005):
Quadro. 1- Fórmula utilizada para cálculos realizados
Fórmulas
Volume=
Erro padrão relativo=
Número de pontos coincidentes com a
estrutura/número total de pontos
0,05
Erro padrão relativo=
√(1-Volume)/número de pontos
Número de pontos corrigido=
Número de pontos calculado/volume
Número de campos=
Número de pontos corrigido/número de
pontos da grade
Número de pontos coincidentes/número de
pontos total
Área=
20
Para a quantificação da fibrose cardíaca e renal nas lâminas coradas com PS,
marcamos na imagem digitalizada, a área de colágeno, birrefringente, com cor amarela,
obtendo-se o percentual de fibrose por área do campo analisado. As lâminas, inicialmente,
divididas em quatro quadrantes e foram analisados 10 campos por quadrante. O número
representativo de medidas foi determinado através da Média Acumulada (WILLIAMS, 1977).
3.5. Análise estatística:
Para a análise estatística foi elaborada uma planilha eletrônica (Microsoft Excel ) e a
análise dos dados foi feita no programa SigmaStat  3.5. As variáveis foram testadas para
verificar se apresentam distribuição normal, através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Na
análise descritiva as variáveis quantitativas foram expressas em média (± desvio padrão) ou
mediana (mínimo e máximo). As correlações foram feitas pelo coeficiente de correlação de
Pearson, quando a distribuição foi normal, caso contrário, ou seja, quando a distribuição foi
não normal utilizamos a correlação de Spearman. As diferenças foram consideradas
estatisticamente significantes quando p foi menor que 5% (p<0,05).
21
4. Resultados:
Realizamos a análises dos fragmentos de rim e coração de 15 animais SHR. A média
da área de miocardiócitos foi de 1763,1 µm2. A média da porcentagem de área do glomérulo
ocupada por matriz mesangial corresponde a 36,8%. Encontramos mediana de porcentagem
de fibrose cardíaca de 0,4% (0,1-3,7) e renal de 0,7% (0,0-4,6) (Tabela 1).
Tabela 1: Análise da área de miocardiócitos, matriz mesangial, fibrose cardíaca e renal em
ratos espontaneamente hipertensos.
Área
Média
Miocardiócitos
1763,1
Matriz Mesangial
36,8%
Fibrose cardíaca
Mediana
0,4%
Mínimo
0,1
Máximo
3,7
0,7%
0,0
4,6
Fibrose renal
Área de miocardiócitos expressa em um2; Matriz mesangial representa a porcentagem do tufo glomerular
ocupado por matriz mesangial; Fibrose cardíaca e renal representa a porcentagem de fibrose por campo
analisado.
Houve correlação positiva (r=0,0897), porém não significativa (p=0,18) entre a fibrose
cardíaca e renal (Figura 1).
Figura 1: Correlação entre fibrose cardíaca e renal em ratos SHR.
22
Houve uma correlação positiva (r=0,0627), porém não significativa (p=0,2) entre a
área de miocardiócitos e a área de matriz mesangial (Figura 2).
Figura 2: Correlação entre área de miocardiócitos e matriz mesangial em ratos SHR.
23
5. Discussão:
Apesar de não termos encontrado uma correlação significativa entre as lesões no
coração e no rim, é notável que existam alterações histopatológicas nesses dois órgãos alvo.
Os rins desempenham um papel importante na regulação da pressão arterial, por
influenciarem tanto na homeostasia do sódio como a resistência vascular periférica atuando
em vários fatores. No entanto, o desequilíbrio desses mecanismos pode contribuir também
para o aparecimento da hipertensão arterial. Na patogênese dessa hipertensão podemos citar
alguns fatores: estímulos neurogênicos, com maior atividade do sistema nervoso simpático,
que determinaria aumento na resistência vascular periférica; fatores humorais, como
substâncias vasoconstrictoras e deficiência de vasodilatadores; componentes hemodinâmicos,
representados pelo aumento do débito cardíaco no início, com posterior aumento da
resistência periférica por vasoconstricção (GODOY, 2006).
Neste trabalho foi quantificada a área de matriz mesangial e calculada a porcentagem
do tufo glomerular ocupada por essa matriz, dessa forma analisamos quantitativamente o grau
de esclerose glomerular e obtivemos um valor médio de 36,8%.
Outros trabalhos analisaram a esclerose glomerular, porém a grande maioria de forma
semiquantitativa por escore de acordo com a porcentagem do glomérulo que está acometida (0
ausente, 1 <25%, 2 de 25<50%, 3 >50%). Dessa forma, os resultados mostram grau de
esclerose de 0-1 (SYDOW et al, 2012; SCHULZ et al., 2011; MIHAILOVIC-STANOJEVIC
et al., 2009) e de 1-2 (ROTHERMUND et al., 2001) em SHR. Adaptando nosso resultado aos
trabalhos descritos, teríamos um escore de esclerose grau 2.
Também foi quantificada a porcentagem de fibrose intersticial, onde obtivemos no rim
uma mediana de 0,7%.
Conforme relatado anteriormente à maioria dos trabalhos utilizam escores (de acordo
com descrito acima). Os resultados apresentam valores de 0-1 (ROTHERMUND et al., 2001;
24
SCHULZ et al., 2011; MIHAILOVIC-STANOJEVIC et al., 2009). O que estaria de acordo
com nosso resultado.
Quanto ao coração, estudos experimentais e clínicos realizados nas últimas quatro
décadas concluíram que existe uma relação recíproca entre doenças hipertensivas e esse órgão
alvo. A HAS pode ser considerada como um fator responsável por alterações estruturais e
funcionais caracterizadas por modificações como a hipertrofia e apoptose dos miocardiócitos,
hipertrofia da parede de artérias e arteríolas intramiocárdicas (FROLIK, 2001).
As características morfológicas da cardiopatia hipertensiva estão relacionadas à
pressão sanguínea e fatores não hemodinâmicos resultando na expressão alterada da
contratilidade dos miocardiócitos e de algumas proteínas, promovendo a hipertrofia do
ventrículo esquerdo e fibrose intersticial, respectivamente (DIAMOND & PHILLIPS, 2005).
Em nossos resultados mostramos que área ocupada por miocardiócitos foi em média
de 1763,1 µm2 representando o grau de hipertrofia cardíaca. Na literatura encontramos relatos
relacionados ao grau de hipertrofia cardíaca em SHRs analisados através do peso cardíaco
relativo (massa cardíaca em mg/ peso corporal em g) variando de 2,4 a 3,7 (BALDO et al.,
2011; JIANG et al., 2012; PAHOR et al., 1991).
Dessa forma, a hipertrofia ventricular esquerda representa um marcador de risco
cardiovascular independente, e pode estar associada com o aumento da incidência de doenças
cardiovasculares fatais, como doença coronária, arritmia ventricular e morte súbita (FROLIK,
1999; OLIVETTI et al., 2008).
Também analisamos a fibrose cardíaca e obtivemos um valor mediano de 0,4%.
Vários trabalhos da literatura mostram uma grande amplitude nessa variável indo de 1,5 a
12% (PAHOR et al., 1991; DÍEZ et al., 1997; REHMAN et al., 2012).
No que se refere à cardiopatia hipertensiva a fibrose representa um excesso ou
acúmulo difuso de fibras colágenas (JÍMENEZ et al, 2006), aumentando a rigidez miocárdica,
25
podendo levar a disfunção do ventrículo esquerdo e por último culminando com insuficiência
cardíaca (OLIVETTI et al., 2008) . Histologicamente, essa fibrose é caracterizada por um
excessivo depósito de fibras colágenas tipo III e com a decorrer do tempo é acompanhada por
um aumento de fibras colágenas do tipo I (SAEED et al., 2006; PARDO & PANIZO, 1993).
Esse aumento de fibras colágenas é resultado de uma combinação do aumento da síntese de
fibras colágenas pelos fibroblastos e miofibroblastos e a diminuição da sua degradação por
metaloproteinases (WEBER, 2000).
A fibrose e hipertrofia cardíaca são descritas relacionadas à ação de receptores tipo 2
para angiotensina II (REHMAN et al., 2012), além disso essas duas variáveis são
correlacionadas com fibrilação ventricular, pois, a estrutura miocárdica é modificada pela
presença de extensas áreas de fibrose de substituição. Dessa forma, o efeito deletério da HAS
nas estruturas do miocárdio resultaria na fibrose e hipertrofia dos miócitos (PAHOR et al.,
1991).
Outro fator seria a ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona na HAS, que
estaria afetando o remodelamento cardíaco levando a fibrose intersticial e perivascular, além
da hipertrofia cardíaca e apoptose (BALDO et al., 2011). Também atuaria o sistema nervoso
simpático e as reposta imune/inflamatória com papel importante na hipertrofia do ventrículo
esquerdo, relacionado a várias vias de sinalização celular. Essa hipertrofia tem sido descrita
como um fator de risco independente para eventos cardiovasculares e cerebrovasculares
(JIANG et al., 1997).
Dessa, forma salientamos a importância das características e correlações
histopatológicas nos órgãos alvo da HAS, porém até o presente momento, nenhum trabalho
havia relacionado a intensidade dessas lesões. Neste estudo, pudemos esclarecer esse fato
através das correlações entre alterações celulares e intersticiais no rim e coração.
26
6. Conclusão:
Existe uma correlação positiva entre fibrose cardíaca e renal, bem como entre a área de
miocardiócitos e a matriz mesangial, porém esses processos não acometem os dois órgãos de
forma quantitativamente equivalente.
Portanto, concluímos que, tanto o rim quanto o coração são lesados pela hipertensão
arterial sistêmica, lesões estas representadas pela hipertrofia cardíaca, esclerose glomerular e
fibrose, porém esses processos não se desenvolvem proporcionalmente na mesma intensidade.
27
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