UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES GSTM1 E GSTT1 E A
ASSOCIAÇÃO COM ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO –
BRASIL
ELOÍSA HELENA KUBISZESKI
CUIABÁ, MT
2013
AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES GSTM1 E GSTT1 E A
ASSOCIAÇÃO COM ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO –
BRASIL
ELOÍSA HELENA KUBISZESKI
Orientadora: Profa. Dra. Bianca Borsatto Galera
Co-orientador: Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, para obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Concentração Reprodução Humana e
Climatério.
CUIABÁ, MT
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
K95a Kubiszeski, Eloísa Helena
Avaliação de polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e a
associação com endometriose em mulheres de Mato Grosso - Brasil
/ Eloísa Helena Kubiszeski. -- 2013
75 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Bianca Borsatto Galera.
Co-orientador: Sebastião Freitas de Medeiros.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso,
Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Cuiabá, 2013.
Inclui bibliografia.
1. endometriose. 2. polimorfismos genéticos. 3. GSTM1 e GSTT1. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a)
autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
Santo anjo do Senhor, meu zeloso e guardador, se a ti me confiou,
a piedade, divina, sempre me rege, me guarde, me
governe, me ilumine, amém!
(autor desconhecido)
DEDICATÓRIA
A DEUS, fonte inesgotável de paciência, sabedoria e perseverança!
Ao UNIVERSO que conspirou para que eu conseguisse chegar até aqui!
Aos MEUS PAIS, pelos ensinamentos que não encontramos em livros!
YUSKI e JULIA...filhos queridos, coragem, motivação, amor incondicional!
Aos queridos AMIGOS que estão presentes em todos os momentos, tristes e alegres, pois a
amizade esta na alma e a alma é eterna!
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora Profa. Dra. BIANCA BORSATTO GALERA, pelos
ensinamentos, pela amizade e confiança, tem minha eterna admiração e carinho.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. SEBASTIAO FREITAS DE MEDEIROS, que fez com que eu
percebesse que para ser mestre é preciso dedicação, espero supreendê-lo positivamente.
À minha querida amiga e mestranda JOZIANE AGNÓRIA DA SILVA SEIDEL, que de
repente apareceu em minha vida, e agora faz parte dela, obrigada pela amizade e
companheirismo.
À Dra. MARCIA MARLY WINCK YAMAMOTO DE MEDEIROS que me recebeu com
carinho e respeito, grata pelo aprendizado e admiração pelo trabalho realizado com competência
e dedicação.
À Profa. CARMEM LUCIA BASSI BRANCO, que me socorreu intelectualmente e pelos
empréstimos de algumas xícaras de açúcar...devagar eu devolvo.
Ao Prof. Dr. MARCIAL FRANCIS GALERA que participou da banca de qualificação e
contribui com sugestões importantes para a conclusão desta dissertação.
A toda equipe do Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa - INTRO,
especialmente a querida ARLENE, sempre muito prestativa, e FRANCISCA pelos cafezinhos
quentinhos.
Aos doutores DALTON FERREIRA e OACIR MONTEIRO DA SILVA JUNIOR, que
colaboraram imensamente neste estudo, oportunizando coletas de dados de suas pacientes.
Ao Dr. ACIR ANDRE NOVACZYK pela colaboração, juntamente com a dos médicos que o
auxiliam nas laparoscopias garantiram a qualidade dos dados coletados. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. COR JÉSUS FERNANDES FONTES, pela ampliação dos horizontes
epidemiológicos, e pelo auxílio durante as análises estatísticas.
Às minhas colegas do grupo de pesquisa da Genética, NAYANA LEOTTI, REGIANE FESTI,
ARIANNE MONTEIRO, JOZIANE A.S.SEIDEL, JACQUELYNE CONCEIÇÃO LIMA e
LUIZA LIMA RIBEIRO DE ALMEIDA...minha ansiedade me descompensa, mas reconheço a
importância de cada uma para a conclusão desta dissertação. Obrigada meninas!
Às pacientes por aceitarem participar do estudo, tornando um sonho possível e assim a ciência
evolui...em nome da ciência!!!
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
Lista de Tabelas
Lista de Figuras
Resumo
Abstract
1.
INTRODUÇÃO ..................................................................................................
13
2.
OBJETIVOS .......................................................................................................
15
2.1 Objetivo Geral.................................................................................................
15
2.2 Objetivos Específicos......................................................................................
15
REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
16
3.1 Endometriose: Considerações Gerais ............................................................
16
3.2 O Sistema Glutationa S Transferase ..............................................................
22
3.3 Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e endometriose ........................
26
MATERIAL E MÉTODO.................................................................................
29
4.1 Tipo de estudo e amostra ...............................................................................
29
4.2 Critérios de inclusão e de exclusão ...............................................................
29
4.3 Tamanho da amostra......................................................................................
30
4.4 Coleta de dados epidemiológicos e clínicos....................................................
30
4.5 Coleta de sangue e processamento das amostras............................................
32
4.6 Extração de DNA ...........................................................................................
32
4.7 Técnica de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase)......................................
33
4.8 Determinação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1.....................
34
4.9 Análises Estatísticas ......................................................................................
35
.
4.10 Considerações Éticas ...................................................................................
36
5.
RESULTADOS .................................................................................................
37
6.
DISCUSSÃO ......................................................................................................
43
7.
CONCLUSÕES..................................................................................................
48
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................
49
ANEXOS ............................................................................................................
54
3.
4.
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA: ácido desoxirribonucleico
dNTPs: desoxinucleotídeo trifosfato
EDTA: ácido etilenodiamintotetracético
GSH: Glutationa
GSTM1: gene mu (µ) 1 do sistema da glutationa S-transferase
GSTT1: gene theta (Ɵ) 1 do sistema da glutationa S-transferase
IMC: índice de massa corpórea
KCl: cloreto de potássio
MgCl2: cloreto de magnésio
NaCl: cloreto de sódio
pb: pares de bases
PCR: Reação de Cadeia em Polimerase
SDS: Dodecilsulfato de sódio
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TBE: tris-borato- ácido etilenodiamintotetracético
TRIS: hidroximetil aminometano
TRIS HCl: tris hidrocloreto
TRITON X-100: Octilfenolpoli (etilenoglicoleter)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequência de iniciadores utilizados para análise de PCR e os tamanhos dos
fragmentos amplificados...........................................................................................................36
Tabela 2: Perfil demográfico de mulheres com endometriose e controles............................39
Tabela 3: Frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e
controles......................................................................................................................................40
Tabela 4: Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do
polimorfismo no gene GSTM1....................................................................................................41
Tabela 5. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do
polimorfismo no gene GSTM1 entre casos e controles............................................................42
Tabela 6. Associação do volume do sangramento menstrual e a frequência do gene
GSTM1 entre casos e controles.................................................................................................43
Tabela 7. Associação do volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTT1
entre casos e controles...............................................................................................................43
Tabela 8. Combinação entre os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 encontrados e
estadiamento da endometriose..................................................................................................44
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Etapas da biossíntese da testosterona [26] e da progesterona [28]..........................27
FIGURA 2. Localização de genes da família GST classe mu...................................................29
FIGURA 3. Localização de genes da família GST classe theta.................................................30
FIGURA 4: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive
Medicine (1996).............................................................................................................................33
FIGURA 5: Eletroforese em gel agarose 1,5%............................................................................37
RESUMO
Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum, sendo caracterizada por
implante e crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Sua etiologia é
complexa e fatores imunológicos, hormonais e genéticos são propostos para explicar à
susceptibilidade a doença. Polimorfismos em genes envolvidos com a detoxicacão de
xenobióticos e metabolismo de esteróides sexuais têm sido descritos, dentre eles os genes da
classe Mu do sistema glutationa S-transferase (GSTM1) e o gene theta do sistema glutationa Stransferase (GSTT1). A presença destes polimorfismos resulta na ausência de atividades destas
enzimas e maior risco de desenvolvimento de endometriose em mulheres. Objetivo: O presente
trabalho teve como objetivos: estimar as freqüências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e
GSTT1 em mulheres com e sem endometriose e verificar possível associação com estes
polimorfismos. Material e Método: Foi realizado um estudo epidemiológico observacional do
tipo caso-controle, sendo a amostra composta por 218 mulheres (121 casos/97 controles). A
presença ou ausência de endometriose foi confirmada pela visualização das lesões por
videolaparoscopia e exame histopatológico. A extração de DNA de amostra de sangue
periférico foi realizada usando a técnica de salting out e PCR multiplex para identificação dos
polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1. Resultados: Foi observada a frequência do
polimorfismo no gene GSTM1 identificadas nas mulheres com e sem endometriose foram 54,50
e 51,50%, respectivamente. Para GSTT1, as frequências corresponderam a 20,70% nos casos e
33% nos controles (p=0,0395). Não foram observadas diferenças nas freqüências dos
polimorfismos no gene GSTM1, entre casos e controles (p=0,659). Assim, polimorfismo em
GSTM1 não conferiu suscetibilidade à endometriose. No entanto, o polimorfismo no gene
GSTT1 mostrou associação conferindo proteção às mulheres portadoras. Quando comparados o
intervalo do ciclo menstrual e polimorfismo no gene GSTM1 não mostrou associação, no
entanto, quando comparados com o GSTT1 este conferiu fator de proteção. Sugerimos que
presença do polimorfismo em GSTT1, ou seja, a ausência na atividade deste gene possa
contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio que por sua vez poderão
favorecer danos no DNA e consequentemente apoptose. Assim, em mulheres saudáveis tais
efeitos contribuem para a não implantação de tecido endometrial ectópico. Além desta
suposição, a contribuição dos produtos de outros polimorfismos em genes envolvidos com a
síntese e metabolização de esteróides, somados a outros ainda não conhecidos, devem ser
consideradas e investigadas em pesquisas futuras.
ABSTRACT
Endometriosis is a common gynecological disease, characterized by growth and implantation of
endometrial tissue outside the uterine cavity. Its etiology is complex and immune factors,
hormonal and genetic factors have been proposed to explain the susceptibility to disease.
Polymorphisms in genes involved in detoxification of xenobiotics and metabolism of sex
steroids have been described, among them the genes of the Mu class of the glutathione Stransferase (GSTM1) and theta gene system glutathione transferase (GSTT1). The presence of
these polymorphisms results in the lack of activity of these enzymes and a greater risk of
developing endometriosis in women. Objective: This study tevecomo objectives: to estimate the
frequencies of polymorphisms in GSTM1 and GSTT1 genes in women with and without
endometriosis and verify possible association with these polymorphisms. Material and
Methods: We conducted an observational epidemiological case-control, and the sample was
composed of 218 women (121 casos/97 controls). The presence or absence of endometriosis
was confirmed by the visualization of lesions by laparoscopy and histopathology. The
extraction of DNA from peripheral blood sample was performed using the technique of salting
out and multiplex PCR for identification of polymorphisms in GSTM1 and GSTT1. Results: It
was observed frequency of GSTM1 polymorphism in the gene identified in women with and
without endometriosis were 54.50 and 51.50% respectively. For GSTT1, the frequencies
corresponded to 20.70% in cases and 33% in controls (p = 0.0395). There were no differences
in the frequencies of GSTM1 gene polymorphisms in cases and controls (p = 0.659). Thus,
GSTM1 polymorphism did not confer susceptibility to endometriosis. However, the GSTT1
gene polymorphism was associated women with conferring protection. We supposed that the
presence of the polymorphism in GSTT1, the absence of this gene activity may contribute to the
increased production of reactive oxygen species, which in turn may promote DNA damage and
consequently apoptosis. Thus, such effects in healthy women not contribute to the implantation
of endometrial tissue. In addition to this assumption, the contribution of the products of other
polymorphisms in genes involved in the synthesis and metabolism of steroids, plus others not
yet
known,
should
be
considered
and
investigated
in
future
researches.
13
1. INTRODUÇÃO
A endometriose é uma doença ginecológica de controversa instalação, evolução
e repetidos fracassos no tratamento clínico e cirúrgico. Acomete aproximadamente 10 a 15%
das mulheres em idade reprodutiva, sendo caracterizada por implante e crescimento de tecido
endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina. Os principais sinais e sintomas
incluem dor pélvica crônica, infertilidade, dismenorreia, alterações intestinais e urinárias
cíclicas (Olive e Schwartz, 1993; Skenazi et al., 1997; Kennedy et al., 2005)
A etiologia da endometriose é complexa, sendo que algumas teorias foram
propostas para explicar o desenvolvimento da doença. As duas correntes principais sobre sua
etiopatogenia são a da metaplasia celômica e a da menstruação retrógrada (Meyer, 1919;
Sampson, 1927). Também são postulados fatores imunológicos, hormonais e genéticos para
explicar a susceptibilidade aumentada de algumas mulheres à endometriose (Olive & Schwartz,
1993; Braun e Dmowski, 1998; Bischoff e Simpson, 2000; Tempfer et al., 2009).
Vários estudos associando a participação de genes e seus polimorfismos com
endometriose têm sido realizados, sendo os resultados encontrados muitas vezes discordantes.
Os genes mais frequentemente associados à endometriose são aqueles que codificam citocinas,
moléculas de adesão, enzimas da matriz extracelular, proteínas envolvidas em vias de
detoxicação, metabolismo de esteróides sexuais ou que regulam o ciclo celular (Huber et al.,
2008; Tempfer et al., 2009; Anton et al., 2010; Borguese et al., 2010).
Umas das enzimas mais conhecidas são as da família da glutationa (GSH), que
impedem a ação de toxinas endógenas e exógenas sobre as células, evitando assim possíveis
danos ao DNA celular. Dentre os genes responsáveis por estas enzimas, estão incluídos os
genes GSTM1, (gene mu (μ)1 do sistema da glutationa S-transferase), mapeado em 1p13.3 e o
14
gene GSTT1 (gene theta (θ)1 do sistema glutationa S-transferase), mapeado em 22q11.2 (Huber
et al., 2008; Anton et al., 2010).
O gene GSTM1 é polimórfico na população humana, apresentando dois alelos
funcionais ativos, que possuem a mesma eficiência metabólica, e um alelo com atividade nula
por deleção em homozigose (Nakata et al., 2004; Huber et al., 2008; Rozati et al., 2009). Assim
como o GSTM1, o GSTT1 também é polimórfico na população humana, podendo apresentar seu
polimorfismo como fenótipo ausente por deleção. Sendo assim quando estes genes são
polimórficos, os mesmos não sintetizam seu produto protéico devido à grande deleção dos
genes. Homozigotos para o alelo GSTM1 ausente são considerados grupos de risco por
permitirem implantação ectópica de tecido endometrial, devido ao defeito enzimático em seu
sistema de detoxificação (Nakata et al., 2004; Huber et al., 2008; Rozati et al., 2009).
No estado de Mato Grosso, estudos como este, em mulheres com e sem
endometriose são inexistentes. As frequências de tais polimorfismos nesta população são
desconhecidas, também não se sabe se estão associados com endometriose.
Assim, o presente estudo tem como objetivo estimar as frequências dos
polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e verificar se estão associadas com ocorrência de
endometriose.
15
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estimar as frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e verificar
suas associações com a ocorrência de endometriose em mulheres de Mato Grosso.
2.2 Objetivos específicos
1. Determinar as freqüências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em mulheres com
e sem diagnóstico de endometriose;
2. Examinar possível associação entre as presenças dos polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e a
ocorrência de endometriose nas mulheres estudadas;
3. Identificar possíveis associações existentes entre freqüências das presenças dos
polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e as características clínicas das mulheres com endometriose.
16
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Endometriose: considerações gerais
A endometriose é uma afecção ginecológica caracterizada pelo implante e
crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Acomete cerca de 10 a 15% das
mulheres em idade reprodutiva, sendo uma das principais causas de infertilidade para este
gênero (Olive e Schwartz, 1993; Skenazi e Warner, 1997; Kennedy et al., 2005). Afeta ainda
40 a 60 % das mulheres que apresentam dismenorréia, 40% dos casos de dor pélvica crônica e
20 a 70% dos casos de infertilidade (Olive e Schwartz, 1993; Kennedy et al., 2005; Medeiros et
al., 2012). A lesão endometrial é uma condição esteróide-dependente, caracterizada pela
instalação de tecido endometrial fora da cavidade uterina (Olive e Schwartz, 1993; Meyer,
1919; Sampson, 1927; Borguese et al., 2010).
Esta condição foi descrita em 1893 pelo médico alemão von Recklinghausen, ao
observar achados de tecidos endometrióticos fora da cavidade uterina, em biópsia uterina. A
etiopatogenia ainda não esta bem esclarecida, porém, as evidências indicam que combinações
de fatores genéticos, hormonais e imunológicos possam contribuir para a formação e o
desenvolvimento dos focos ectópicos da endometriose (Rozati et al., 2009; Borguese et al.,
2010; Nácul e Sprintzer, 2010).
O tecido endometrial ectópico é histologicamente similar ao endométrio,
apresentando características benignas, com glândulas e estroma, implantando-se em tecidos e
órgãos, como as trompas, ovários, ligamentos útero-sacros, fundo de saco de Douglas,
peritônio, cólon, região retrovaginal e bexiga (Ulrich et al., 2006; Berbel et al., 2008; Kondo et
al., 2011).
17
Ainda do ponto de vista histológico, a lesão de endometriose não é formada
somente por tecido endometrial, mas por um tecido de cicatrização decorrente de processo
inflamatório infiltrativo, que muitas vezes acomete o tecido muscular, diferenças estas que
afetam a eficácia do tratamento (Meyer, 1919; Kennedy et al., 2005; Borguese et al., 2010).
A endometriose pode ser dividida em dois tipos, dependendo da localização.
Quando acomete os ovários, trompas e peritônio pélvico, as lesões são superficiais e quadro
clínico mais ameno, é denominada endometriose propriamente dita e a de comprometimento
central na região retro-uterina, uterina ou recesso vesical-vagina é denominada de adenomiose
(Kumar et al., 2005; Rozati et al., 2009). Nessa divisão, a classificação não é feita pela
profundidade da doença, mas sim pela expressão da atividade do endométrio ectópico, se ocorre
sangramento dependente de hormônios sexuais esteróides ou metaplasia de músculo liso
(Kumar et al., 2005; Bischoff e Simpson, 2000; Rozati et al., 2009).
Na adenomiose ocorre à diferenciação de tecido conjuntivo e muscular liso e
acredita-se que deva existir uma resposta fraca à progesterona. Assim como a camada basal do
endométrio no útero, responde aos hormônios esteróides. Já na endometriose propriamente dita,
existe sangramento dependente de hormônio esteróide até o momento em que o sítio sofre
fibrose. Conclui-se que a endometriose e adenomiose apresentam respostas diferentes a esses
hormônios, o que pode vir a ser mais um alvo no tratamento da doença (Kumar et al., 2005;
Berbel et al., 2008).
Os focos de endométrio respondem à estimulação hormonal tanto extrínseca
cíclica (ovariana) quanto intrínseca por meio de sangramento periódicos. Essa característica dos
focos leva ao aparecimento de nódulos com um aspecto que varia de vermelho-azulado a
amarelo-acastanhado sobre as superfícies serosas do local acometido ou logo abaixo delas.
Quando a doença afeta uma área grande, a organização da hemorragia leva a formação de
18
aderências fibrosas extensas entre as tubas, os ovários e outras estruturas e também a
obliteração do fundo de saco de Douglas. Os ovários podem se tornar muito distorcidos pela
presença de grandes massas císticas, endometriomas, repletos de restos de sangue degradado de
cor castanha (Kumar et al., 2005; Berbel et al., 2008).
Biologicamente, o processo da gênese do foco de endometriose, semelhante ao
do câncer, envolve: adesão, invasão, proliferação celular. No entanto, apesar do seu
comportamento ser semelhante às células neoplásicas, é uma neoplasia benigna. A diferença
principal entre ambas é que, na endometriose, em determinado momento, a lesão deixa de
crescer e diminui sua capacidade de invasão (Borguese et al., 2010). O risco da malignidade em
endometriose é atualmente discutido. Apesar das chances apresentarem-se baixas, alguns
estudos relataram a coexistência de endometriose e câncer de ovário (Borguese et al., 2010).
Existem várias teorias para explicar a etiopatogenia da endometriose, entre as
quais: a teoria da metaplasia celômica e a da menstruação retrógrada (Meyer, 1919; Sampson,
1927). A primeira, descrita em 1919 por Meyer, sugere que o epitélio celômico original sofre
metaplasia, formando glândulas endometriais e estroma, a que explicaria a endometriose
profunda.
Somente em 1927, Sampson caracterizou a endometriose como é conhecida
atualmente, elaborando a hipótese etiológica mais aceita, denominada metastática, sugerindo
que por meio da menstruação retrógrada fragmentos endometriais, descamados durante a fase
menstrual e contendo células viáveis, são transportados através das tubas uterinas até a cavidade
peritoneal onde se implantam, crescem e invadem tecidos de órgãos adjacentes (Sampson,
1927).
Algumas evidências sustentam a hipótese supracitada, como a presença de
células endometriais viáveis no efluente menstrual e fluido peritoneal, o fato do endométrio ser
19
capaz de se implantar e crescer dentro da cavidade peritoneal e cerca de 70 a 90% das mulheres
apresentarem menstruação retrógrada (Guo, 2006). Evidencia-se também que a ocorrência deste
implante, depende da influência de um ambiente hormonal favorável e de fatores imunológicos
que falharam em eliminar tais células deste local impróprio (Ulrich et al., 2006; Rozati et al.,
2009; Borguese et al., 2010).
Acredita-se que a endometriose esteja associada com a capacidade das células
ectópicas de neutralizar a resposta imune local, devido a defeitos do sistema de vigilância
imunológica e supressão de células do sistema imune (Braun e Dmowski, 1998; Tempfer,
2009).
A maioria das mulheres apresenta queixas clinicas em diferentes intensidades,
sendo as principais dismenorréia (cólicas menstruais), dispareunia de profundidade (dor durante
a relação sexual), dor pélvica crônica, sintomas intestinais cíclicos (dor ao evacuar, constipação,
hematoquezia e diarréia), sintomas urinários (disúria, cistite de repetição, polaciúria, urgência
urinária e hematúria) e infertilidade (Kennedy et al, 2005; Skaff et al., 2011; Villareal et al.,
2011; Medeiros et al., 2012).
Muitas vezes as pacientes apresentam sintomas sugestivos e, no entanto, podem
não ter endometriose. O diagnóstico final pode ser dificultado, pois a apresentação é variável e
o grau dos sintomas pode não se correlacionar com a extensão da doença (Chapron et al., 2002;
Hudelist et al., 2009; Hsu et al., 2010).
Diante desta variabilidade dos sinais e sintomas a endometriose pode ser
confundida com outras patologias pélvicas, levando a um diagnóstico geralmente tardio. O Real
Colégio de Obstetras e Ginecologistas de Londres sugere que exista uma demora de até 12 anos
de início dos sintomas até o diagnóstico definitivo (Giudice e Kao, 2004; Mackintosh et al.,
2011).
20
Em vários casos o exame ginecológico pode ser normal, mas a presença de dor à
mobilização uterina, retroversão uterina ou aumento do volume ovariano é sugestiva de
endometriose, embora não seja específica. Os sinais sugestivos de endometriose profunda
infiltrativa são nodulações palpáveis no fórnice vaginal posterior ou septo retovaginal,
espessamento dos ligamentos uterossacros ou lesões violáceas na vagina (Bischboff e Simpson,
2000; Nácul e Sprintzer, 2010; Hsu et al., 2010)
Apesar dos exames de imagens disponíveis apresentarem boa acurácia no
diagnóstico da endometriose, a videolaparoscopia com biópsia das lesões para análise
anatomopatológica ainda é o ―padrão ouro‖ no diagnóstico desta afecção. No entanto, alguns
estudos sugerem que este método apresente eficácia limitada. Assim, propõe-se que a
videolaparoscopia deve ser combinada com o exame histopatológico, a fim de melhorar a
eficácia da confirmação do diagnóstico da doença (Chapron et al., 2002; Nácul e Sprintzer,
2010; Hsu et al., 2010)
Após a realização da videolaparoscopia, a endometriose pode ser classificada de
acordo com o tipo histológico dos implantes, com a localização anatômica da doença –
peritônio, ovário ou septo retovaginal – ou pela extensão da doença sobre os órgãos pélvicos. A
classificação mais utilizada atualmente é a da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva –
revisada em 1996. Essa classificação gradua e endometriose em mínima (I), leve (II), moderada
(III) e grave (IV), pela extensão da doença no peritônio e ovários, bem como pele presença de
aderências tubo-ovarianas e obliteração do fundo de saco de Douglas (ASRM, 2008).
A endometriose é uma patologia de difícil tratamento, caracterizada como
condição crônica e, que muitas vezes, pode reicidivar apesar dos procedimentos de retirada dos
tecidos ectópicos. O tratamento deve ser individualizado, avaliando a sintomatologia mais
relevante de cada paciente. Pode ser utilizado tratamento farmacológico, cirúrgico ou a
21
combinação das duas abordagens (Giudice e Kao, 2004; Kennedy et al., 2005; Arya e Shaw,
2005; Díaz-Yamal e Sanabria- Gaitán, 2008).
A terapia medicamentosa para endometriose é baseada no fato de que esta
responde a hormônios. Duas condições fisiológicas, gravidez e menopausa, estão
frequentemente associadas à resolução da dor provocada pela endometriose. Os análogos
farmacológicos levam às condições hormonais semelhantes à vista durante a gravidez e/ou
promovem supressão do estrogênio endógeno (Navarro et al., 2006).
As terapias farmacológicas atualmente disponíveis têm o intuito de controlar a
dismenorréia, dispareunia, a dor pélvica e a infertilidade. São utilizados, preferencialmente,
analgésicos
e
anti-inflamatórios
não-esteroidais;
contraceptivos
estroprogestogênicos,
progestogênicos isolados e análogos do hormônio liberador de gonadrotofina (GnRH)
(Mounsey et al., 2006; Díaz-Yamal e Sanabria- Gaitán, 2008; Nácul e Sprintzer, 2010).
O tratamento cirúrgico da endometriose compreende procedimentos de baixa
complexidade, como a cauterização de focos superficiais e a liberação de aderências
velamentosas, até intervenções complexas nos ovários, fundo de saco de Douglas, intestino,
bexiga, ureteres, exigindo em alguns casos uma equipe multidisciplinar (Ulrich et al., 2006;
Nácul e Sprintzer, 2010).
Os mecanismos envolvidos na gênese da infertilidade em pacientes com
endometriose incluem anormalidades anatômicas causadas pelas aderências relacionadas à
endometriose (fator mecânico), alterações imunológicas no ambiente peritoneal, alterações dos
mecanismos de implantação ou mesmo alterações genéticas. A abordagem laparoscópica pode
solucionar as alterações anatômicas, mas mecanismos imunológicos possivelmente não são
corrigidos com a abordagem cirúrgica (Kumar et al., 2005; Ulrich et al., 2006; Bereck e Novak,
2008).
22
3.2 O Sistema Glutationa S Transferase
Vários estudos têm demonstrado correlação entre fatores genéticos e
endometriose. Por tratar-se de uma doença multifatorial, observa-se aumento do risco para
parentes de primeiro grau, assim como nos casos de gemelaridade monozigótica (Treolar et al.,
2002; Zondervan, 2009).
Recentemente, várias linhas de pesquisa buscam identificar genes
relacionados com a susceptibilidade à endometriose, como aqueles envolvidos com síntese de
hormônios esteroidais e processos de detoxificação do organismo, os genes do sistema GST
(Montogomery et al., 2008; Tempfer et al., 2009).
A GST é uma família de enzimas intracelulares que catalisam o ataque
nucleofílico da forma reduzida da glutationa (GSH) a compostos que apresentam um carbono,
um hidrogênio ou um átomo de enxofre eletrofílico (Huber et al., 2008).
Como estão envolvidas no metabolismo de muitos carcinógenos,
poluentes ambientais e drogas anticancerígenas supõem-se que a falta de isoenzimas específicas
tenha um efeito significante na tolerância de um organismo a carcinogênios (Morais et al.,
2008).
As GSTs são classificadas de acordo com a seqüência de aminoácidos
e/ou nucleotídeos, propriedades imunológicas, parâmetros de cinética enzimática e/ou estrutura
terciária e quaternária. Cinco classes de genes da GST foram identificadas em humanos: Alpha
(A1, A2, A3 e A4), PI (P1), Mu (M1, M2, M3, M4 e M5), Theta (T1, T2) e Zeta (Huber et al.,
2008; Anton et al., 2010).
A GST possui o principal componente sulfidril não-proteico em células
de mamíferos, atuando na neutralização de peróxidos e na proteção celular contra o estresse
oxidativo. A GSH é um tripeptídio presente tanto no estágio reduzido quanto no oxidado, cujos
23
níveis são mantidos por síntese de novo catalisada por duas enzimas, uma das quais é inibida
por compostos produzidos em resposta ao estresse oxidativo (Agarwal et al., 2005; Nwose etg
al., 2008; Andrade et al., 2010).
Esse antioxidante está presente no oócito e no fluido tubário,
participando dos processos de maturação oocitária, descondensação espermática, ativação
oocitária, além de desempenhar importante função permissiva para o desenvolvimento
embrionário pré-implantação. Uma das atividades antioxidantes da glutationa consiste em
eliminar, indiretamente, o tocoferol oxidado, importante para a reciclagem e manutenção de
níveis fisiológicos de vitamina E, essenciais para o combate ao estresse oxidativo (Pemble, et
al., 1994; Steinhoff et al., 2000; Agarwal et al., 2005; Nwose etg al., 2008; Andrade et al.,
2010).
Além da remoção de espécies reativas de oxigênio, enzimas da família da GST
realizam catálise de conjugações com substâncias endógenas, catálise de reações em vias
metabólicas não associadas com desintoxicação. Têm também sido associadas a fenômenos que
envolvem agentes de resistência a quimioterápicos, antibióticos, inseticidas e herbicidas
(Stenhoff et al., 2000; Sheehan et al., 2001; Vichi et al., 2012). Espécies reativas de oxigênio,
dentre elas, o ânion superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO),
produtos da respiração aeróbica, podem causar danos ao DNA, lipídios da membrana, proteínas,
carboidratos e outros (Pemble et al., 1994; Steinhoff et al., 2000; Huber et al., 2008; Augoulea
et al., 2012).
As enzimas da família GST também são responsáveis pela detoxificação de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, os quais são ubíquos e possivelmente o contaminante
ambiental mais nocivo (Stenhoff et al, 2000; Guo 2005).
A biossíntese da GSH ocorre no meio intracelular (exceto em células epiteliais)
pela ação consecutiva de duas enzimas. Na primeira reação, é formada uma ligação peptídica
24
entre os aminoácidos: ácido glutâmico e cisteína, catalisada pela enzima γ-glutamilcisteína
sintetase, levando à γ-L-glutamil-L-cisteína. Este dipeptídeo é então ligado à glicina pela ação
da glutationa sintetase. Estas etapas requerem ATP e Mg+2. A γ-glutamilcisteína sintetase sofre
regulação pela GSH através de um feedback negativo, o que previne a produção excessiva desta
ou o acúmulo do intermediário γ-glutamilcisteína (Vasconcelos et al., 2007; Huber et sl, 2008).
As GSTs também desempenham função no metabolismo de esteróides sexuais.
Através de várias etapas, entre elas, reações de oxidação e isomerização, o colesterol é
convertido em hormônios esteroidais, como testosterona e progesterona (Johansson e
Mannervik, 2001; Huber et al., 2008; Speroff e Fritz, 2005).
A biossíntese destes hormônios (Figura 1) envolve a formação de um
intermediário-chave comum, o 3-β-hidróxipregnenona. A clivagem da cadeia lateral de 23,
seguida da oxidação da hidroxila 3β, fornece a Δ5-androstendiona, que, sob a ação da glutationa
transferase citossólica A3-3 (GST A3-3), é convertida ao seu regioisômero Δ4-androsteniona, A
testosterona [26] é então obtida a partir de 25, após redução seletiva da carbonilacetônica
presente no anel D. Alternativamente, o intermediário 23 é oxidado à Δ5-pregnendiona, e a
isomerização da ligação dupla pela ação da GST A3-3, resultando na produção de progesterona
[28] (Speroff e Fritz, 2005).
25
FIGURA 1. Etapas da biossíntese da testosterona [26] e da progesterona [28] (Speroff e
Fritz, 2005).
26
3.3 Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e endometriose
Os genes GSTM1 e GSTT1 são polimórficos em humanos e as variantes
se apresentam como ausência dos genes (deleção em homozigose) em 10-60% dependendo da
população étnica (Rebbeck, 1997; Guo, 2005). Como os produtos destes genes catalisam
substâncias químicas cancerígenas, a presença dos polimorfismos tem sido associada à maior
risco de desenvolver câncer (Anton et al., 2010). Rebbeck (1997) relata que a freqüência do
polimorfismo no gene GSTM1 em caucasianos varia de 33 a 67%, em africanos e afro–
americanos de 22 a 35%. Em relação ao polimorfismo no gene GSTT1, observa-se, em
caucasianos, freqüência 20% maior do que as observadas em populações africanas ou asiáticas
(Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
Os polimorfismos em genes das GSTs têm sido investigados em
diferentes condições nosológicas, dentre elas a endometriose. Embora ainda não seja totalmente
elucidada, a literatura sugere correlação entre a endometriose e os polimorfismos em GSTM1 e
GSTT1 (Ertunc et al., 2005). Diante das propriedades de detoxificação da família de enzimas
GST, supõe-se que as ausências da atividade destas enzimas devido ao polimorfismo de deleção
podem predispor as mulheres a risco aumentado para endometriose (Guo, 2005).
Como mencionado, as isoenzimas citosólicas são divididas em pelo
menos cinco classes principais (α, μ, π, ɵ, δ), entre os quais polimorfismos foram detectados nos
genes que codificam as enzimas GSTM1 e GSTM3 (classe μ,), GSTP1 (classe π), GSTT1 (classe
ɵ) e GSTZ1 (classe δ) (Mitrunen e Hirvonen, 2002; Huber et al., 2008).
O gene GSTM1 (Figura 2), mapeado no cromossomo 1p13.3, codifica enzimas
da classe GST mu (μ), estando presente em dois alelos ativos: GSTM1 A, GSTM1 B e um alelo
nulo (GSTM1 0). Suas combinações correspondem aos genótipos ativos GSTM1A / A ou A / 0;
GSTM1B / B ou B / 0 e GSTM1A / B e um genótipo não ativo, GSTM10 / 0, que não é
27
transcricionalmente ativo devido a uma deleção estendida (10Kb) (Mitrunen e Hirvonen, 2002;
Parl, 2005; Costa, 2010; Fedulova et al, 2010).
Alelo Selvagem
Alelo Polimórfico
FIGURA 2. Localização de genes da família GST classe mu (da esquerda para a direita estão
representados os genes GSTM4, GSTM2, GSTM1, GSTM5, GSTM3). O alelo selvagem do gene
GSMT1 está representado por um retângulo negro; os retângulos cinzas representam regiões
flanqueadoras do gene. O alelo polimórfico mostra a deleção no gene GSTM1 (Parl, 2005).
Este polimorfismo (deleção em homozigose) foi observado influenciando a
suscetibilidade à endometriose em mulheres francesas, russas, indianas, chinesas, taiwanesas,
coreanas, japonesas e australianas (9).
O gene GSTT1(Figura 3) está mapeado no cromossomo 22q11.2. Duas
isoenzimas na classe theta foram identificadas, GSTT1-1 e GSTT2-2, sendo as duas compostas
por cinco éxons com limites de íntron/exon idênticas. Embora sejam semelhantes, apresentam
somente 55% de seqüência de aminoácidos idênticas (Mitrunen e Hirvonen, 2002; Parl, 2005;
Fedulova et al., 2010).
28
Alelo
Selvagem
Alelo
Polimórfico
FIGURA 3. Localização de genes da família GST classe theta (da esquerda para a direita
estão representadas regiões flanqueadoras, genes GSTT1, GSTT2). O alelo selvagem do gene
GSTT1 está representado por um retângulo negro maior; os retângulos cinzas menores mostram
regiões externas ao gene. O alelo polimórfico mostra a deleção no gene GSTT1 (Parl, 2005).
Estudos realizados na Grécia, França, Índia, Reino Unido, Japão e a
Coréia não mostraram correlação entre a variante GSTT1 ausente e a susceptibilidade à
endometriose, enquanto, Ivashchencko et al. (2003) em um estudo com mulheres russas
mostrou tal associação.
Os estudos brasileiros relacionados a possíveis alterações genéticas em mulheres
com endometriose são escassos, sendo que alguns demonstram resultados contraditórios
(Carvalho et al.,2003). Nesse sentido, o presente trabalho em Mato Grosso pretende preencher
esta lacuna.
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipos de estudo e amostra
O presente estudo tem desenho epidemiológico observacional do tipo casocontrole. A amostra deste estudo foi composta por mulheres com idade entre 18 a 50 anos
atendidas no Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa (INTRO), em
Cuiabá/MT, Brasil. A coleta ocorreu no período de 29 de novembro de 2010 a 8 de janeiro de
2013.
Alocaram-se como casos, mulheres com diagnóstico laparoscópico e
histopatológico positivo para endometriose e, como controles mulheres inférteis ou férteis
submetidas à laparoscopia para diagnóstico ou laqueadura tubária com ausência de lesões
endometrióticas.
4.2 Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão foram mulheres com a idade de 18 a 50 anos, com ou
sem diagnóstico laparoscópico de endometriose e que concordaram em assinar o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE (Anexo 1).
Os critérios de exclusão foram mulheres fora da faixa etária padronizada por esta
pesquisa e as que se recusaram em assinar o TCLE.
30
4.3 Tamanho da amostra
A amostra foi constituída por 218mulheres, sendo 121 casos e 97 controles. O
cálculo do tamanho amostral foi realizado a partir das frequências alélicas dos respectivos
polimorfismos estudados, conforme a literatura com frequências em torno de 15-20%,
dependendo da etnia estudada (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
O cálculo do tamanho da amostra foi de comparação de dois grupos
independentes, com poder do estudo de 80%. Para tanto foi utilizada a seguinte fórmula
(Callegari-Jaques, 2007):
n ≥ k [p1(1 - p1) + p2 (1 - p2)]
2
Onde:k = 7,8
= (p1 – p2)
4.4 Coletas de dados epidemiológicos e clínicos
Todas as mulheres incluídas no estudo (casos e controles) foram submetidas a
uma entrevista padronizada para coleta de variáveis de interesse do estudo: idade, idade na
menarca, duração e regularidade do fluxo menstrual, dispareunia, dismenorréia, dor pélvica
crônica, infertilidade, vulvodinia, alterações intestinais (diarréia, constipação, aumento do
transito intestinal, sangramento retal, puxo e tenesmo), alterações urinárias cíclicas (disúria,
polaciúria, hematúria), fibromialgia, síndrome temporomandibular, cefaleia, enxaqueca, idade
do diagnóstico da endometriose, idade no primeiro parto, paridade e número de gestações,
história familiar da endometriose, tabagismo, alcoolismo, características alimentares e práticas
esportivas.
31
As pacientes com endometriose tiveram sua doença classificada durante o
procedimento cirúrgico pelos critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASRM),
revisado em 1996, estádios I – IV.
FIGURA 4. Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de
Medicina Reprodutiva (1996).
32
4.5 Coleta de sangue e processamento das amostras
Todas as mulheres foram submetidas à coleta de amostra de sangue periférico (8
mL), com seringa e dispositivo flexível e transferido para tubo contendo EDTA
(VACUPLAST®, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e estocados em freezer -20°C
(CONSUL®), até extração de DNA. Todos os experimentos foram executados no Laboratório
de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso.
4.6 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada utilizando o método salting out descrito por
Lahiri e Nurnberg (1991), com modificações (Miller et al., 1998). Em todos os experimentos
foram utilizadas micropipetas (EPPENDORF®, Hamburg, DE) calibradas. Para tanto, foram
utilizados 4,5 mL de sangue periférico total congelado e a esta quantidade foram adicionadas 7
mL de solução de lise I (10mM Tris-HCl; 0,32M Sacarose; 5mM MgCl2; Triton X-100 0,75%)
homogeneizadas por 10 minutos e centrifugadas (SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a
7.000 rpm. O sobrenadante foi retirado e este processo foi repetido por mais duas vezes com
apenas 3 mL da solução de lise I. Quando este procedimento não foi suficiente para o
precipitado de células estar isento de hemoglobina, foi realizado mais uma vez. Após a última
centrifugação, o sobrenadante foi retirado e o pelete ressuspendido em 1 mL solução de lise II
(10mM Tris; 10mM EDTA; 10mM NaCl; 0,5% SDS) que constituiu a segunda etapa de lise.
Em seguida, foi agitado no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR), homogeneizado e adicionado
333 µL de solução de precipitação de proteínas (6M NaCl). O material foi novamente agitado
no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR) e até homogeneização e levado para centrifugação
(SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a 7.000 rpm. E seguida 1220 µL de sobrenadante
foram transferidos para dois tubos estéreis, dos quais foram adicionados 660 µL de isopropanol
33
100%. O material foi homogeneizado manualmente até que o DNA fosse observado e em
seguida centrifugado (SIGMA®, St. Louis, US) por 10 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se o
sobrenadante e adicionou-se 500 µL de álcool 70%, agitando-se no vórtex (FANEM®, São
Paulo, BR) até o desprendimento do pelete. O material foi centrifugado (SIGMA®, St. Louis,
US) por 10minutos a 13.000 rpm, sendo esta etapa repetida por mais duas vezes. Após último
descarte de sobrenadante, os tubos abertos foram acomodados sobre papel toalha, e assim
permaneceram em torno de 3 horas em temperatura ambiente. Para diluição, foram utilizados
200 µL de água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US) sendo a solução
homogeneizada com pipeta até apresentar-se gelatinosa e transparente. Caso a homogeneização
não fosse alcançada, o material era colocado ao banho maria (FANEM®, São Paulo, BR) por
24h/56ºC. Todas as amostras de DNAs extraídas foram quantificadas no aparelho Nanodrop
(MOD2000-UNISCIENCE®, Winnipeg, CA) na unidade de medida ng/µL. Finalmente, as
amostras foram congeladas e armazenadas em freezer -20ºC (CONSUL ®, Whirlpool, U.S.).
4.7 Técnica de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase)
Para realização de PCR, previamente foram selecionados os oligonucleotídeos
utilizados para cada gene investigado, além dos volumes e concentrações utilizados dos
reagentes. Para a PCR, utilizou-se como controle positivo, o gene da β globina (268pb).
Também em cada PCR, utilizou-se como controle negativo água ultra-purificada (PURELAB®,
Indianapolis, US). Na mistura da reação recém-preparada, foi adicionado 1µL de DNA
correspondente para cada amostra, já devidamente identificados em microtubos apropriados.
Para a reação de PCR foram utilizados concentrações de tampão 5 µL de 10x (Tris 100 mM/L,
pH 8,3, KCL 500 mM/L, MgCl2 20 mM/L), 0,5 µl MgCl (50mM), 0,2 µl dNTPs (10mM/µL),
1,2 µLGSTM1, 1,2 µL GSTT1 e 1,2 µL β-globina de iniciadores (10mM/µL), 0,5 µl Taq DNA
34
polimerase (5U/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 µl de amostra de DNA (100ng/µL),
completando com água ultra-purificada até completar o volume final de 18µL. Em seguida, os
tubos foram levados para o termociclador (AMPLITHERM®,) programando-se um tempo de
ciclagem de: desnaturação inicial: 95ºC por 3 minutos; 35 ciclos de desnaturação (94ºC – 1
minuto); anelamento (60ºC – 1 minuto); extensão (72ºC – 1 minuto); 1 ciclo de extensão final
(72ºC – 10 minutos). Para o preparo do gel de agarose 1,5%, foram utilizados 100mL de TBE
1x, 1,5g de agarose e 4µL de brometo de etídio. Em seguida, o material foi levado ao forno
microondas (BRASTEMP®) por 90 segundos, despejado na cuba de eletroforese aguardando
polimerização (ENDURO-LABNET®, Edison, US). Após serem amplificadas, as amostras
foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para a corrida de eletroforese de 90 v, 81 AM e 7 w,
utilizando fonte de energia específica (ENDURO-LABNET®, Edison, US).
Tabela 1: Sequência de iniciadores utilizados para análise de PCR e os tamanhos dos
fragmentos amplificados.
Gene
Sequência (5’
3’)
Tamanho do
fragmento
GSTT1
5'- GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'
5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3'
480pba
GSTM1
5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'
5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'
215pba
β Globina
5´ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3´
5´GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3´
268pba
a
Ichioka et al., 2009.
4.8 Determinação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1
Para a genotipagem de GSTM1 e GSTT1, previamente amplificadas através de
PCR Multiplex, utilizaram-se os tamanhos das bandas referentes aos fragmentos polimórficos,
35
480 pb para o genótipo GSTT1 positivo e de 215 pb para GSTM1 positivo. Como controle
interno positivo foi utilizado β-Globina com fragmento de 268 pb. Para controle negativo para
DNA foi utilizado água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US). O marcador do peso
molecular de DNA foi de 100 pb.
GSTT1(480pb) βGlobina(267pb)
GSTM1(215pb)
FIGURA 5. Eletroforese em gel agarose 1,5%: 1º – Marcador de peso molecular; 2º Controle negativo para DNA; 3º, 4º, 6º, 9º - Positivo para GSTM1 e GSTT1; 5º, 8º, 10º, 11º, 13º,
15º e 16º - Positivos para GSTT1 e negativos para GSTM1; 7º e 12º Negativos para GSTT1 e
positivos para GSTM1; 14º - Negativos para GSTM1 e GSTT1.
4.9 Análises estatísticas
Para as variáveis continuas foram calculado a media e o desvio padrão. Para a
associação entre os polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e a endometriose foram utilizados teste de
proporção qui-quadradro (χ2) de Pearson, teste Z e teste Welsh. A comparação dos genes
polimórficos GSTM1 e GSTT1 entre os grupos estudados foi utilizada razão de chance (OR),
com intervalo de confiança de 95%. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente
significante. Os dados foram armazenados e analisados com auxílio do programa EpiData
Software, version 2.2.2 build 177, Dinamarca.
36
4.10 Considerações éticas
O protocolo da pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Júlio Müller (n°954/CEP-HUJM/2010). Todas as
participantes foram esclarecidas sobre os objetivos e procedimentos (punção venosa, entrevista
e revisão de prontuários médicos) do presente estudo e sobre sua total liberdade para participar
ou não. As participantes que concordaram em fazer parte do estudo assinaram inicialmente o
TCLE. A pesquisa não conferiu nenhum risco, exceto aqueles inerentes a simples punção
venosa.
Todas as pacientes receberam os resultados dos exames e da pesquisa, sendo que
as mesmas são acompanhadas periodicamente no serviço de referência. Todas as pacientes são
acompanhadas pela equipe do projeto e aquelas que apresentarem os polimorfismos genéticos
que poderão ser considerados fatores de risco, receberão aconselhamento genético.
37
5. RESULTADOS
Os resultados referentes às distribuições de etnia, nos casos e controles estão
apresentados na Tabela 2. Para estes parâmetros, não foram encontradas diferenças estatísticas
entre os dois grupos incluídos no estudo. A média da idade dos casos foi 32,07 (±5,62) anos e
controles, 31,01 (±6,20) anos p=0,208. No que se refere à média de idade da menarca, nos
casos foi 12,68 (±2,35) anos e 12,49 (±3,19) nos controles p=0,116.
Tabela 2: Perfil demográfico de mulheres com endometriose e controles.
Casos (n=121)
Controles (n=97)
p
Idadea
32,07 (+/-5,62)
31,06 (+/-6,20)
0, 208
Idade da menarca
12,68(+/-2,35)
12,49 (+/-3,19) a
0, 116
Branco
49 (40,5%)
40 (41,2%)b
0, 762
Negro
9 (7,4%)
11 (11,3%)b
Pardo
60 (49,6%)
45 (46,4%)
Asiático
2 (1,7%)
1 (1,0 %)
Indígena
1 (0,8%)
0 (0,0%)
Sim
15 (12,4%)
8 (8,2%)
Não
106 (87,6%)
89 (91,8%)
Irmã
5 (4,13%)
2 (2,1%)
0,669
Mãe
5 (4,13%)
2 (2,1%)
0,669
Prima
3 (2,48%)
3 (3,09%)
0,892
Tia
2 (1,65%)
1(1,0%)
Não informado
106 (87,6%)
89 (91,75%)
b
Etnia
Familiares com endometriose
0, 167
Familiar acometido
a Teste de Welsh; b Teste de Proporção (Teste Z).
0, 404
38
A presença de familiares com endometriose e o grau de parentesco dos mesmos
não configurou fator de risco para esta afecção nos grupos de casos e controles. Nos casos,
foram relatados 15/121 (12,4%) de familiares acometidos e 8/97 (8,2%) nos controles p=0,167
(Tabela 2).
Na Tabela 3 não foram observadas diferenças nas frequências dos polimorfismos
no gene GSTM1, entre casos e controles: OR=1,128 (IC=95% 0,660–1,927 p=0,659). No
entanto, o polimorfismo do gene GSTT1 foi mais frequente nos controles do que nos casos,
OR=0,529 (IC95% 0,285-0,983 p=0,0395).
Tabela 3: Frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e
controles.
Genótipo
GSTM1
Casos (n%) Controles(n%)
Ausente
66 (54,50)
OR95%
50 (51,50)
1,128
GSTT1
Presente
55 (45,50)
47 (48,50)
Ausente
25 (20,70)
32 (33,0)
96 (79,30)
65 (67,0)
0,659
(0, 660-1, 927)
0,529
Presente
p
(0, 285- 0, 983)
0,0395
Quadrado-IC (95%), valor de p (bicaudal).
Nas Tabelas 4 e 5 estão apresentados os intervalos dos ciclos menstruais e a
frequência dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e controles. O
polimorfismo GSTM1, não apresentou associação com este parâmetro em casos (p=0,370) e
39
também nos controles (p=0,664). De modo semelhante, o polimorfismo no gene GSTT1 não
mostrou associação com os intervalos nos ciclos menstruais em pacientes. No entanto, esse
polimorfismo foi significativamente mais frequente nos controles com relação ao intervalo
normal do ciclo menstrual do que naquelas com intervalo anormal (p=0,052).
Tabela 4. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do
polimorfismo no gene GSTM1.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121)
Controle (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
GSTM1
*Ausente
20
46
17
0,3281 –
1,513
Presente
21
34
* Ausente = polimorfismo (deleção);
Presente=sem o polimorfismo (sem deleção).
χ 2 Pearson; IC(95%); o valor de p
1
Anormal (Intervalo < 21 e >36 dias)
2
Normal (Intervalo 22-35 dias)
33
0,370
0,5107 –
2,902
14
33
0,664
40
Tabela 5. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do
polimorfismo no gene GSTM1 entre casos e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121)
Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
GSTT1
*Ausente
9
16
6
0,4308 –
2,823
Presente
32
64
26
0,1243 1,009
0,797
25
0,052
40
* Ausente = polimorfismo (deleção);
Presente=sem o polimorfismo (sem deleção).
χ 2 Pearson; IC(95%); valor de p
1
Anormal (Intervalo < 21 e >36 dias)
2
Normal (Intervalo 22-35 dias)
Não houve associação entre os polimorfismos e o volume do sangramento
menstrual tanto em casos como no grupo controle. Para GSTM1, em relação aos casos, o
valor de p foi igual a 0, 645; nos controles, p igual a 0, 198. Para GSTT1, nos casos o valor de
p foi 0, 853 e nos controles, p foi igual a 0, 950 (Tabela 6 e 7).
41
Tabela 6. Volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTM1 entre casos
e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121)
Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
GSTM1
*Ausente
19
47
0,379-
27
46
0,762 –
0,645
Presente
0,198
1,824
18
3,938
37
12
35
* Ausente = polimorfismo (deleção); * Presente=sem o polimorfismo (sem deleção).
Qui-quadrado; IC (95%), valor de p
1
Anormal (Volume > 2 dia < 7 dias)
2
Normal (Volume entre 3 - 7 dias).
Tabela 7. Volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTT1 entre casos
e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121)
Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
Anormal1 Normal2 IC(95%)
p
GSTM1
*Ausente
Presente
8
29
17
67
13
0,402 2,787
19
0,853
26
39
0,425 –
2,446
* Ausente = polimorfismo (deleção); * Presente=sem o polimorfismo (sem deleção).
Qui-quadrado; IC (95%), valor de p
1
Anormal (Volume > 2 dia < 7 dias)
2
Normal (Volume entre 3 - 7 dias).
0,950
42
Na Tabela 8, são apresentadas as possíveis combinações entre os
polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1, identificados nos casos incluídos no estudo, em
relação ao estadiamento clínico da doença (I-mínima, II - leve III- moderada, IV-grave). Não
foram encontradas diferenças estatisticamente significantes.
Tabela 8: Combinação entre os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1
encontrados e estadiamento da endometriose.
Endometriose (n=121)
Genes
Estágio
I – II
Estágio
III – IV
Total (%)
Ausente/ausente
25
20
45 (37,2)
Ausente/presente
5
5
10 (8,3)
Presente/ausente
28
23
51 (42,1)
Presente/presente
11
4
15 (12,4)
69 (57,0)
52 (43)
p
GSTM1 e GSTT1
Total (%)
* Ausente = polimorfismo (deleção);
* Presente=sem o polimorfismo (sem deleção).
Teste Qui-quadrado=1, 963, GL=3, valor de p
121 (100,0)
0, 580
43
6. DISCUSSÃO
A endometriose é uma doença ginecológica benigna, dependente de
estrógeno e caracterizada pela implantação de tecido endometrial fora da cavidade uterina. A
intensidade com que as manifestações clínicas se apresentam pode prejudicar diretamente a vida
psicoemocional, profissional e social da mulher acometida.
Sendo uma doença frequente nos dias atuais e associada à infertilidade, é
imprescindível que pesquisas sejam conduzidas objetivando fornecer subsídios para melhora
nas formas de intervenções às mulheres acometidas.
Em nosso estudo, analisamos o efeito de variantes genéticas na
susceptibilidade à endometriose. Observamos que a presença de familiares com endometriose e
o grau de parentesco dos mesmos não contribuiu para o desenvolvimento dessa condição
clínica. Acreditamos que, através deste tipo de análise, não foi possível verificar a existência de
fator genético para familiares. Além disso, sugerimos que pelo fato da doença ser investigada
nos últimos anos com procedimentos que oferecem boa acurácia nos resultados, e assim
resultados mais fidedignos das mulheres em geral acometidas ou não pela doença.
Embora a literatura demonstre que idade da menarca, IMC, intervalos
menstruais e aumento de volume menstrual sejam possíveis precursores da endometriose (14)
em nosso estudo, não observamos associação. Levando-se em conta que fatores ambientais
também podem contribuir para doenças complexas como a endometriose, supõe-se que devam
ser investigados em mulheres de Mato Grosso.
Observamos que as frequências do polimorfismo no gene GSTM1,
identificadas nos grupos de mulheres com e sem endometriose, foram 54,50 e 51,50%,
respectivamente. Para GSTT1, as frequências corresponderam a 20,70% nos casos e 33% nos
controles.
44
Outros estudos relatam que o polimorfismo no gene GSTM1 está presente
em 53% das mulheres caucasianas e asiáticas, apresentando diferentes condições clínicas (Guo,
2005). Em decorrência de resultados conflitantes, questiona-se se de fato a deleção em GSTM1
(polimorfismo) está relacionada ao aumento no risco de desenvolvimento de endometriose
(Guo, 2005). As frequências do polimorfismo no gene GSTT1 foram observadas variando de
11-20% em caucasianas e 47% em asiáticas (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
Os primeiros estudos com desenho epidemiológico do tipo caso-controle
relatando envolvimento de polimorfismos GSTT1 no desenvolvimento da endometriose
relataram frequência de 20% deste em mulheres com endometriose e 9,7% em mulheres
saudáveis (OR=2,32). Mundialmente, a frequência do polimorfismo no gene GSTT1 varia entre
9 -74% em mulheres afetadas e entre 9-48% em mulheres sem endometriose (Guo, 2005).
No presente estudo, a presença do polimorfismo no gene GSTM1 (ausente) não
contribuiu para o desenvolvimento de endometriose. Estudos semelhantes a este, em mulheres
de diferentes etnias, como americanas, inglesas, gregas, coreanas, japonesas, iranianas e
italianas corroboram nossos achados (Hadfield et al., 2001; Baxter et al., 2001; Arvantis et al.,
2003; Hur et al., 2004; Kim et al., 2007; Matsuzaka et al., 2012; Seifati et al., 2012; Vichi et al.,
2012).
Resultados mostrando associação entre o polimorfismo em GSTM1 e
endometriose foram observados em mulheres francesas, indianas, mulheres de Taiwan,
iranianas (Baranova et al., 1997; Hsieh et al., 2004; Babu et al., 2005; Rozati et al., 2008;
Huang et al., 2010; Hosseinzadeh et al., 2011).
Em uma meta-análise, demonstrou-se que o polimorfismo no gene GSTM1 não
está associado à susceptibilidade a endometriose (Guo, 2005). Contudo, as análises do
polimorfismo no gene GSTT1 (ausente) mostraram associação com a doença. Sugere-se que
45
este resultado apresente vieses, uma vez que parâmetros como: número de indivíduos em cada
grupo estudado, critérios de inclusão /exclusão de controles foram heterogêneos em cada
estudo.
Em nosso estudo, o número de indivíduos foi calculado com intervalo de
confiança de 95% e um poder de precisão de 80%, porém a amostra recrutada foi maior, dando
força de 90% de precisão. Todas as mulheres recrutadas foram submetidas à avaliação
laparoscópica e histopatológica, considerada a melhor (padrão-ouro) para caracterização de
casos ou controles.
Nossos resultados demonstraram que o polimorfismo no gene GSTT1 foi
significativamente mais observado no grupo controle, desempenhando papel protetor.
Resultados semelhantes são observados em outros trabalhos (Vichi, 2012). Não se sabe se de
fato o polimorfismo no gene GSTT1 confere efeito protetor para endometriose.
Quando comparamos os genes polimórficos GSTM1 e GSTT1 (ausentes) com
alterações no volume do sangramento menstrual, não encontramos associação. Em relação aos
intervalos dos ciclos menstruais e associação com o gene GSTM1 (ausente), não encontramos
diferenças estatisticamente significante. No entanto, quando comparados os intervalos dos
ciclos menstruais e associação com o gene GSTT1 (ausente) este conferiu fator de proteção as
mulheres portadoras do polimorfismo, sendo as que apresentarem maior número de ciclos
menstruais normais.
Uma vez que as enzimas de GST foram encontradas em células que compõem o
tecido ovariano, e concomitantemente participando com 3β-hidroxiesteroide hidroxigenase na
conversão de pregnenolona a progesterona e desidroepiandrosterona para androstenediona e
desempenham um papel importante na gênese de esteróides sexuais (Rahilly et al, 1991). Nosso
estudo examinou uma possível ação associação entre polimorfismos GSTM1 e GSTT1 com o
46
intervalo do ciclo menstrual e volume de sangramento. A falta de associação encontrada pode
sugerir que e modificação no ciclo menstrual das mulheres com endometriose não sofreu o
impacto destes polimorfismos.
Supõem-se neste estudo que a ausência de atividade das enzimas antioxidantes
resultantes dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 não afetaram a produção de espécies
reativas de oxigênio, resultantes da resposta inflamatória na cavidade peritoneal. A condição
clínica aparentemente não está associada à presença da deleção em GSTM1.
Por outro lado, deleção em GSTT1 (polimorfismo) foi observada em mulheres
saudáveis. A ausência da enzima nesse grupo não afetou seu papel no processo de
detoxificação.
Sugerimos que presença do polimorfismo em GSTT1, ou seja, a ausência na
atividade deste gene possa contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de
oxigênio que por sua vez poderão favorecer danos no DNA e consequentemente apoptose.
Assim, em mulheres saudáveis tais efeitos contribuem para a não implantação de tecido
endometrial ectópico. Além desta suposição, a contribuição dos produtos de outros
polimorfismos em genes envolvidos com a síntese e metabolização de esteróides, somados a
outros ainda não conhecidos, devem ser consideradas e investigadas em pesquisas futuras.
47
7. CONCLUSÕES
Através do estudo da associação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1
com endometriose em mulheres de Mato Grosso, concluímos que:
1. As frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 são semelhantes às observadas
na literatura;
2. A presença do polimorfismo no gene GSTM1 não está associada à ocorrência de
endometriose na população de mulheres de Mato Grosso;
3.No entanto o polimorfismo do gene GSTT1 conferiu proteção as mulheres sadias;
4. Os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 não influenciaram as características clínicas
das mulheres com endometriose.
48
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54
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidada para participar, como voluntário, da pesquisa “Prevalência dos
polimorfismos genéticos GSTM1, GSTT1 e CYP 17 em uma população de Mato Grosso e
associação com endometriose”. Após ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de
aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias, uma delas é
sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum prejuízo em
sua relação com o pesquisador ou com a instituição que recebe assistência. Em caso de dúvida você
pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Júlio Müller- UFMT- pelo
telefone (65) 3615 8254. O objetivo deste estudo é identificação de marcadores genéticos para
endometriose. Para a realização desta pesquisa os dados serão obtidos através da aplicação de
instrumentos de coleta de dados como questionário e entrevista a você, e uma única coleta de sangue
periférico, para exames laboratoriais, que posteriormente os resultados destes exames lhe serão
entregues. Não haverá riscos relacionados com sua participação na pesquisa, exceto aqueles inerentes
a simples punção venosa. Não há benefício direto para o participante deste estudo. A sociedade
deverá se beneficiar da identificação de genéticas moleculares da endometriose. Este é um projeto de
pesquisa, e não uma forma de tratamento ou diagnóstico. Com este trabalho, acreditamos que além
dos riscos serem insignificantes, seus benefícios indiretos serão relevantes.
Os dados referentes à sua pessoa serão confidenciais e garantimos o sigilo de sua
participação durante toda pesquisa, inclusive na divulgação da mesma. Os dados não serão divulgados
de forma a possibilitar sua identificação. Sua amostra de DNA será armazenada pelo Laboratório de
Histologia e Genética da Faculdade de Ciências Médicas da UFMT.. Um registro de sua participação
nesta pesquisa será mantido, mas de forma confidencial, através do uso de códigos numéricos e
arquivos fechados. Os resultados, em sua totalidade, serão publicados em literatura científica
especializada. Os participantes que desejarem poderão ter acesso aos dados da pesquisa em qualquer
momento, ou mesmo ter suas informações pessoais removidas deste arquivo bastando para isso um
contato com os pesquisadores, Eloísa Helena Kubiszeski ([email protected]), Profª Dra.
Bianca Borsatto Galera ([email protected]), Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros,
responsáveis pelo projeto, pelo telefone (65) 8418 3135, (65)3615 8859, (65)3322 7342.
Considerando os dados acima, CONFIRMO estar sendo informado por escrito e verbalmente
dos objetivos desta pesquisa.
Eu (nome do participante).................................................................................................................,
idade:...........
sexo:...............Naturalidade:................portador(a)
do
documento
RG
Nº:....................................................declaro que entendi os objetivos, riscos e benefícios de minha
participação na pesquisa e concordo em participar.
Assinatura do participante:
.......................................................
Assinatura do pesquisador principal: ................................................................................................
Testemunha*
............................................................................................
* Testemunha só é exigido caso o participante não possa por algum motivo, assinar o termo.
Data (Cidade/dia mês e ano) ____________ ___ de ______________de 20___
55
PROTOCOLO DE ENTREVISTA E COLETA DE AMOSTRA
E_______S
Entrevistador: ______________________ Data:____/____/______.
Grupo: Caso ( ) Controle ( )
1- Nome: ____________________________________________ 2. Registro:___________________
3-
Data
de
Nasc:
_______________4-
Telefone:
_______________5-
Naturalidade:
________________
6 –Estado Civil:_______________8 – End. Completo:______________________________________
Bairro:_____________________Cidade:_______________Estado:___CEP:____________________
7 – Naturalidade do Pai:_________________da Mãe:______________________________________
8 – Naturalidade do Avô Paterno:___________________da Avó Paterno:_______________________
9 – Naturalidade do Avô Materno:__________________da Avó Materno: ______________________
10- Peso: _______________11 – Altura: ______________ 12 – Escolaridade: __________________
13 – Etnia:( ) branco ( ) negro ( ) pardo ( ) asiático ( ) índio 14 – Profissão: _________________
15- Idade da menarca:__________ 16 – Gesta:________ 17- Paridade:________ 18- Aborto:_______
19 - Ciclos menstruais: ( )regulares ( )irregulares Intervalo de dias: ________ 20 – DUM:__________
21- Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos
22– Data do Diagnóstico da endometriose:________anos. (OBS: se portadora da patologia)
23 - Principal sintoma na época do diagnóstico: ( )Infertilidade ( ) dor a menstruação (
pélvica
(
)
Dor
a
relação
sexual
quais:_________________________________
__________ (
(
(
)
Sintomas
urinários,
)
se
Dor
sim,
) Sangramento menstrual Anormal, como:
) Sintomas gástricos, se sim, quais:_____________________ (
) Cefaléia (
)
Enxaqueca ( ) Outras_________________________
24- Outras doenças que possa ter tido: (
) Ca de mama (
) Ca de ovário (
) outras
neoplasias_______________ ( ) disfunção tireoidiana ( ) doença autoimune __________________
( ) dislipidemia ( )leiomioma ( ) ovário policístico ( )
25 - Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos
26- Números de médicos que a assistiram antes do diagnóstico: _______________________________
56
27- No caso de gravidez, complicações pré-natais: _________________________________________
28 - A senhora faz algum tipo de reposição hormonal?( )sim ( )não Há qto tempo ________________
29- Usou Anticoncepcional?( )não (
) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não
30 – Usou AINES? ( ) Não ( ) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não.
31- Diagnóstico da cirurgia: ( ) Endometriose ( ) Sem doença
32-Grau da endometriose: ( )mínima (I); ( )Leve (II); ( )moderada (III); ( ) Severa(IV)
33 - Resultado da patologia comprova endometriose: ( ) Sim ( ) Não
34- Familiares com endometriose: ( ) Não ( ) Sim. quem?_________________________________
35- História familiar de câncer de ovário, mama e/ou linfoma?( ) Sim ( )Não ( ) Outras
36- Aspecto emocional (como você se sente?)
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
37- Fumo: ( )sim ( ) não
38– Álcool: ( ) sim ( ) não 39 – Atividade Física: ( ) sim ( ) não
40– Alimentação: ___________________________________________________________________
41– Amostra de Sangue: ____________ml
Elaborado por: Mestranda Eloísa Helena Kubiszeski. Cuiabá/MT. 2010.
57
58
Association of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms with endometriosis in Brazilian women
59
Association of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms with endometriosis in Brazilian women
Eloísa Helena Kubiszeski, R.N a
Joziane Agnória da Silva Seidel, R.N a
Sebastião Freitas de Medeiros, M.D, Ph.D b,c
Bianca Borsatto Galera, Ph.D a,d
a
Federal University of Mato Grosso – UFMT, Cuiabá, MT, Brazil
b
Departament of Gynecology and Obstetrics, Medical School, Federal University of Mato
Grosso – UFMT, Cuiabá, MT, Brazil
c
Tropical Institute of Reproductive Medicine and Menopause, Cuiabá, MT, Brazil
d
Departament of Sciences Basics, Medical School, Federal University of Mato Grosso –
UFMT, Cuiabá, MT, Brazil
Corresponding author:
Eloísa Helena Kubiszeski
Rua São Cristovão. 711. Apto 04. Dom Aquino. Cuiabá. MT. ZIPMAIL: 78015-150. Brazil.
Tel: (55) 65 3615 – 8859 / Fax: (55) 65 3615 - 8863
e-mail: [email protected]
Financial support: This study was supported by Coordination of higher degree Improvement Capes. National Counsel of Technological and Scientific Development - CNPq and Mato
Grosso Foundation for Research – Fapemat.
60
Capsule: The polymorphism GSTM1 null did not shows any statistically significant
difference between cases and controls, the GSTT1 null genotype showed difference,
conferring protection for endometriosis in of controls woman.
61
ABSTRACT
Objective: To compare the frequencies of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms in women
with and without endometriosis.
Design: Case-control study.
Setting: Tropical Institute of Reproductive Medicine and Menopause and Genetic Laboratory,
Medical School, Federal University of Mato Grosso.
Patient(s): Two hundred and eighteen patients with or without endometriosis.
Intervention(s): Laparoscopic biopsy of endometriotic lesions.
Main Outome Measure(s): Histopathologic confirmation of endometriosis and GSTM1 and
GSTT1 polymorphisms.
Result(s): There were no differences in the frequencies of the GSTM1 gene polymorphisms
between cases and controls: OR=1.13; 95%IC: 0.656-1.93 (p=0.659) and GSTT1 between
cases and controls: OR = 0.53; 95%CI: 0.94-0.29 (p=0.039). Were no found relationship
between menstrual cycle interval and frequency of GSTM1 polymorphisms in either cases or
controls (p = 0.370 and p = 0.664 respectively). There were relationship between menstrual
cycle interval and GSTT1 polymorphism in cases (value p = 0.797), but in controls a value p
of 0.052 found.
Conclusion(s): The frequency of the polymorphism GSTM1 null did not show any
statistically significant difference between cases and controls. The GSTT1 null genotype
showed statistically significant difference, with effect protector controls woman.
Key Words:
biology.
Endometriosis, DNA polymorphisms, glutathione S-transferase, molecular
62
INTRODUCTION
Endometriosis affects 10 to 15 percent of women in reproductive age, being
characterized by implant and growth of endometrial tissue outside of the uterine cavity
(1,2,3). The major signs and symptoms include chronic pelvic pain, infertility, and
dysmenorrhea (2,3,5). The principal theories on the etiopathogenesis endometriosis are the
coelomic metaplasia and retrograde menstruation (5,6). Also, it have been postulated that
immunological, hormonal and genetic factors could explain the increased susceptibility to
endometriosis seen in some women (4,7,8).
Nevertheless laparoscopy is the gold standard for the diagnosis of
endometriosis, its use as a routine tool is debatable (5). During gynaecological examination it
can be found painful, uterine mobilization, palpable nodules in the posterior vaginal fornix or
rectovaginal septum, thickness of the uterosacro ligaments or even violaceous lesions in the
vagina wall (3,10,11). Imaging for the diagnosis of endometriosis such us transvaginal
ultrasound, magnetic resonance should be performance after preparation of the intestines to
allow better identification of focal lesions and deep endometriosis (12,13). Concerning the
diagnosis of any clinical condition, a precise diagnosis is the found most important aspect to
support any sort of study.
Concerning the genetic role in the developing of endometriosis, several studies
have examined a possible association of endometriosis with gene polymorphisms (8). Studies
looking at the genes involved in cell cycle have shown that the endometriotic lesion may be
genetically controlled and regulated (13). Local inflammation markers, hyperestrogenism,
progesterone resistance, polymorphic genes of oestrogen and progesterone receptors may
increase the susceptibility to development of endometriosis (16,17). Among the genes related
63
to endometriosis, the glutathione family (GST) genes seem to have a still uncertain role
(15,19).
Both gene mu (µ) system 1 of the glutathione S-transferase (GSTM1) and gene
teta (θ) system 1 glutathione S-transferase (GSTT1) participate in the oxidation and
isomerisation reactions during the steroid hormones reproduction (20,21). The GSTM1 gene,
polymorphic in the human population, shows a pair of functional alleles that have the same
metabolic efficiency or shows null activity allele (22). Due to the great extension of the
deletion the latter does not synthesizes its protein product. Homozygotes individuals for the
missing GSTM1 allele are considered at risk for endometriosis, allowing implantation of
ectopic endometrial tissues, a result of the enzymatic defect in your detoxification system
(22). The GSTT1 gene also has an inactivating homozygous deletion polymorphism, which
may be related to endometriosis (23, 24).
In the clinical setting, it is essential to find molecular markers that would
permit early identification of women with higher risk of developing the most serious forms of
endometriosis. Studies concerning the possible genetic polymorphism in endometriosis in
Brazilian woman are scarce. Though, it seems to have no ethnicity difference in women with
or without endometriosis for both GSTM1 and GSTT1 polymorphism (20). The aim of the
current study was to compare the prevalence of GSTM1 and GSTT1 gene polymorphisms in
Brazilian women with and without endometriosis.
64
MATERIAL AND METHOD
Study population
The study enrolled 218 outpatient aged between 18 and 50 years at the Tropical
Institute of Reproductive Medicine and Menopause Cuiaba, Mato Grosso, Brazil, from
November 2010 to January 2013. One hundred and twenty and one women with laparoscopic
and histologic diagnosis of endometriosis were taken as cases and 97 infertile or candidates to
laparoscopic tubal sterilization without the diagnosis of endometriosis were enrolled as
controls. Women underwent a standardized interview for collection of variables of interest.
The Research Ethics Committee of Federal University of Mato Grosso (UFMT) approved this
study (954/CEP-HUJM/2010), and all participants were communicated about the study
protocol and gave us informed consent, according to the Helsinki Daclaration.
Blood Collection
Peripheral blood sample (8mL) was collect by venopunction and immediately
transferred to EDTA tubes (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Samples were frozen at 20°C and stored until DNA extraction. All experiments were performed at the Genetics
Laboratory, Medical School- Federal University of Mato Grosso.
DNA Extraction and Genotyping
Genomic DNA was extracted using the salting out method with modifications (25). The
genotyping was carried out by multiplex PCR using the following primers: for GSTM1 with
fragments of 480 bp (5 '-GAA CTC CCT AAG GAA CTA AAG C-3 ' and 5 '-GTT CTC
AAA GGG TAT ACG GTG G-3 '); for GSTT1 with of 215 bp (TTC-CTT ACT GGT CCT
CAC ATC TC-3 ' and TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3 '); β-Globin with of 268 bp (5 '
CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3 ' and 5 '-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3 ')
65
was used as positive control. For negative DNA control it was used ultrapure miliQ water
(PURELAB®, Indianapolis, USA). DNA fragment with molecular weight of 100 bp was
used as marker. For PCR reaction were used of 5µl of 10x reaction buffer (Tris 100 mM/L,
pH 8.3, KCL 500 mM/L, MgCl2 20 mM/L), 0.5µl MgCl (50mM), 0.2µl dNTPs (10mM/µl),
1.2µl GSTM1, 1.2µl GSTT1 and 1.2µl β-globina primer (10mM/µl), 0.5 µl Taq DNA
polymerase (5U/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1µl of DNA sample (100 ng/µl), and H2O
up to complete a total volume of 18 µl. The amplification happened in a cycling time of initial
denaturation at 95° C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94° C for 1 min, the annealing
temperature at 60° C for 1 min, the extension occurred at 72° C for 1 min. The final extension
occurred of 72° C for 10 minutes. The amplified samples were visualized in 1.5% agarose gel.
Eelectrophoresis procedure was runner in 90v, 81 AM and 7W, using specific power source
(ENDURO-LABNET®, Edison, NJ, USA).
Statistical analysis
Continuous variables were summarized as mean and standard deviation or median and range
where appropriate. Association between polymorphism of GSTM1 and GSTT1 was using the
proportion test χ2 of Pearson. Comparisons of GSTM1 ad GSTT1 gene polymorphisms
between groups were performed using odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (95%
CI). The p value < 0.05 was considered statistically significant. It was used EpiData Software,
version 2.2.2 build 177.
66
RESULTS
Concerning ethnicity and birthplace, cases and controls did not show difference
statistical. The average age was 32.07 ± 5.62 years in cases and 31.01 ± 6.2 years in controls
(p = 0.208). The age of menarche was 12.68 ± 2.35 and 12.49 ± 3.1 in cases and controls,
respectively (p = 0.116). Table 1 presents the frequencies of GSTM1 and GSTT1 gene
polymorphisms found in cases and controls. There were no differences in the GSTM1 gene
polymorphisms between the two groups (OR = 1.128; 95%CI: 0.660-1.927; p=0.659).
However, as seen in table 2, there was a statistically significant difference in the frequencies
of GSTM1 polymorphisms between cases and controls (OR = 0.529; 95%IC: 0.285- 0.983;
p=0.039).
Table 3 shows that they were no relationship between menstrual cycle interval
and frequency of GSTM1 polymorphisms in either cases or controls (p = 0.370 and p = 0.664
respectively). There were relationship between menstrual cycle interval and GSTT1
polymorphism in cases (value p = 0.797), but in controls a value p of 0.052 s found.
There were no association between menstrual bleeding volume and
polymorphisms glutathione S-transferase M1 and T1 in cases and controls, p=0.645 and
p = 0.198 (for GSTM1), and p = 0.853 and p = 0.950 (for GSTT1).
Also, were no association with (p value=0.580) between GSTM1 and GSTT1
gene polymorphisms and stages of the disease (I- IV).
67
DISCUSSION
Endometriosis is a multifactorial gynecological disease in which the
endometrium grows outside the uterus. Affected women may have unfavourable quality´s life,
in relation to pain and infertility present in many cases. This clinical condition is associated
wiht a general inflammatory response in the peritoneal cavity with production of reactive
oxygen species (ROS), which might increase the adhesion and growth of endometrial cells in
the peritoneal surface. Glutathione S-transferases constitute a superfamily of multifunctional
enzymes, which play a key role in phase II cellular detoxification and bio activation reactions.
So, GSTM1 and GSTT1 are considered important antioxidant enzymes (19,21,26).
The present study demonstrate that GSTM1 and GSTT1 gene polymorphisms
are present in 54.50% and 20.70% of women with endometriosis diagnosis by laparoscopy
and biopsy. One the other hand in normal women they were present in 51.50% and 33%
respectively. Then it can be accepts that with both groups did not show difference significant
statistical. The frequency of the GSTM1 null genotype was reported by others in about 53%
in Caucasians and Asians women with different clinical condition. There is no proving that
women with this null genotype have increased risk of developing endometriosis (19). The
frequency of GSTT1 null genotype was reported to be lower, ranging from 11-20% in
Caucasians, and about 47% in Asians
28
and women with this genotype present at least 29%
higher risk of developing endometriosis (19,28) .
The first case-control study reporting possible involvement of GSTT1 deletion
polymorphism in the development of endometriosis found 20% of polymorphism in women
with this condition and 9.7% in controls (OR=2.32). Worldwide these frequencies range from
9-74% in women with and from 9%-8% in women without endometriosis. An equal
frequency of GSTM1 null gene polymorphisms between cases and control, in the current
68
study support other studies, denying association between polymorphism in this gene and risk
or higher susceptibility for developing endometriosis (15, 17, 18, 33). However, the OR for
endometriosis with GSTM1 null genotype as compare with other genotypes ranged from 0.75
to 32.6 (15, 37), with a pooled summary OR of 1.96 (19).
Concerning the higher frequency of GSTT1 gene deletion seen in controls than
women with endometriosis in the present study, inconsistent results have been found in
different populations. If GSTT1 polymorphisms confer a protection effect against
endometriosis or not is uncertain. The OR for endometriosis with GSTT1 null genotype
ranged for 0.9 to 7.4 (16, 27) with a polled OR of 1.77 (19). It is not found differences
between cases and controls with respect to age of menarche, body mass index, menstrual
cycle interval, and volume of menstrual bleeding. These findings are in agreement with other
reported studies in women of different ethnicity (13).
Once GST‘s enzymes have been found in ovarian steroid cells and nay
participant with 3β-hydroxysteroiddehydrogenase in the conversion of pregnenolone to
progesterone and dehydroepiandrosterone to androstenedione (40) and to play a role in
normal steroid genesis the current study examined a possible association action between
GSTM1 e GSTT1 polymorphisms and menstrual cycle interval and bleeding volume. The
lack of association found may suggest that and modification in menstrual cycle of women
with endometriosis did not suffer the impact of this polymorphism.
It should be noted that genotype alone usually is an incomplete measure of
phenotypic effect. Levels of the enzyme activity may be affected by a number of other
endogenous and exogenous factors. The effect of other known genetic polymorphisms in
enzymes involved in the steroid synthesis and metabolism together with the yet unidentified
genes may further complicate the issue. Further investigations are necessary.
69
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74
Tables article
Table 1. Frequencies of polymorphisms in GSTM1 of the endometriosis with or without
women.
Genotype
Cases (n%)
Controls(n%)
OR 95%IC
p value
66 (54.50)
50 (51.50)
1.128
(0.660-1.927)
0.659
Present
55 (45.50)
47 (48.50)
218(100)
121(55.50)
97(44,49)
Null
GSTM1
Total
χ 2 Pearson ; IC(95%); p-value (2 – tail)
Table 2. Frequencies of polymorphisms in GSTT1 of the endometriosis with or without women.
Genotype
Null
Cases (n%)
Controls(n%)
25 (20.70)
32 (33.0)
GSTT1
Present
Total
218(100)
96 (79.30)
65 (67.0)
121(55.50)
97(44,49)
χ 2 Pearson ; IC(95%); p-value (2 – tail)
OR 95%IC
p value
0.529 (0.2850.983)
0,039
75
Table 3. Intervals of menstrual cycles and frequencies of GSTM1 and cases e controls
Interval menstrual cycle
Cases (n=121)
Controls (n=97)
Abnormal1 Normal2 95%IC
pvalue
Abnormal1 Normal2 95%IC
pvalue
GSTM1
Null
20
46
17
0.3281
– 1.513
Present
21
33
0.370
34
0.5107
– 2.902
14
0.664
33
χ 2 Pearson; IC(95%); p-value(2 – tail)
1
Abnormal (Intervals < 21 and >36 days)
2
Normal (Intervals 22-35 days)
Table 4. Intervals of menstrual cycles and frequencies of GSTT1 and cases e controls
Interval menstrual cycle
Cases (n=121)
Controls (n=97)
Abnormal1 Normal2 95%IC
pvalue
Abnormal1 Normal2 95%IC
pvalue
GSTT1
Null
9
16
6
0.4308
– 2.823
Present
32
64
χ 2 Pearson; IC(95%); p-value(2 – tail)
1
Abnormal (Intervals < 21 and >36 days)
2
Normal (Intervals 22-35 days)
26
0.1243
-1.009
0.797
25
40
0.052