Utilizando informações do genoma da
Xylella fastidiosa para controle da CVC
Alessandra Alves de Souza
[email protected]
Centro Avançado de Pesquisa
Tecnológica do Agronegócio de Citros
Sylvio Moreira – CAPTACSM/IAC
CVC - Xylella fastidiosa
Todas as
variedades
Elevadas perdas
econômicas
CVC
Todos os
estados
Problema brasileiro
Diminuição na
produtividade e
Manejo
Xylella fastidiosa genome - 2000
2.800 genes
Quais os envolvidos com patogenicidade?
Quais os alvos genéticos para possível controle?
Como atingir esses alvos?
Genoma Funcional
Experimentos biológicos
Genes
Patogenicidade/modelo
Avirulenta x Virulenta
De Souza et al., MPMI 2003
x
Ponto
de
inocula
ção
• Adesão no
hospedeiro
• Adaptação
em condições
de estresse
Rápida
colonização e
maior população
Crescimento
em biofilme vantagens
adaptativas
O que é biofilme ?
Capacidade das
células (bactérias)
aderirem e uma
superfície e
formarem
microcolônias
Vantagem das células em biofilme
• Toxinas
• R esistência a
compostos
antimicrobianos
•  E s t r e s s e
nutricional,
temperatura etc
Estudo em patógenos
de Humanos
e em Xylella?
Características de planta com CVC x colonização da bactéria
• Clorose e necrose foliar
• Deficiência de Zn e Fe
• Redução do tamanho dos frutos
Estresse hídrico
Parte aérea
X
B
L
O
Q
U
E
I
O
• Água
• Nutrientes
Raíz
Genoma Funcional – identificação de genes e proteínas
•  Biofilme X vida livre
De Souza et al., Fems Microbiol, 2004
controlardoXylella
•  Como
Desenvolvimento
biofilme
De Souza et al., 2005
Microbiol ????
fastidiosa
emCurrent
biofilme
De Souza et al., 2006 RAPP, v. 14 p.1-57
•  Expressão de proteínas de adesão no biofilme
Caserta et al., 2010 Appl. Env. Microbiol.
•  Expressão global de proteínas no biofilme maduro
Silva et al, 2011 Proteomic science (in press)
Como controlar Xylella fastidiosa em biofilme ????
Rodrigues et al., 2008 Appl. Microbiol. Biotech.
Biofilme 3 – 100X mais
resistente a compostos
antimicrobianos
Mecanismo de resistência de XF em biofilme
Específico e geral que
confere alta resistência a
antimicrobianos
Biofilme X vida livre – cobre, zinco e antibióticos
Muranaka et al., Mol. Microbiol (submetido)
Modelo - resposta molecular de X. fastidiosa a cobre e tetraciclina
cobre
Tetraciclina
O que é feito em bactérias que formam biofilme e
causam doenças em seres humanos???
•  Antibióticos
•  Agentes mucolíticos
Um agente mucolítico é uma substância que quebra as
ligações das proteínas que constituem o muco, fazendo com
que ele seja mais facilmente eliminado, pois se torna menos
viscoso, "pegajoso"
NAC - o que é e como age?
N-acetil –L-cysteina (NAC)
•  É análogo do aminoácido cisteína que tem sido usado como medicamento para doenças respiratórias.
•  É uma das menores moléculas usada como drogas que tem efeito anti-bacteriano
• A molécula contém um grupo tiol que desfaz pontes de sulfeto do muco por competição de uso com o
aminoácido cisteína.
CISTEINA
NAC
Modelo proposto para explicar a adesão de X. fastidiosa no xilema
Leite et al., 2002 Braz J. Med. Biol. Res 35: 645-650
Se X. fastidiosa precisa de pontes de sulfeto para adesão e
formação de biofilme, o NAC poderia ser utilizado para
desestruturar o biofilme de X. fastidiosa restaurado o fluxo
do xilema
Testes para verificar o efeito do NAC no biofilme da X. fastidiosa Experimentos em laboratório
Isolamento da Bactéria Concentrações
de NAC 1,0 ; 2,0 ;
6,0 mg /ml
Inóculo + Meio
XDM2 + NAC
7 dias Olofsson et al. (2002)
Appl Environ Microbiol.,
8:4814-22
Correção pH com NaOH 1M Análise das amostras -  Biofilme
-  Células vivas
-  EPS
Efeito do NAC no biofilme de X. fastidiosa
Controle
Com 1mg/mL NAC
Biofilme
Biofilme
Planctônico –
vida livre
Efeito do NAC no número de células vivas de X. fastidiosa
Mortas! Efeito do NAC na produção de exopolissacarídeo (EPS) pela X. fastidiosa
Sem NAC
Com 2mg/mL NAC
Staphilococcus ephidermidis
Conclusões dos experimentos em laboratório
- O NAC foi capaz de desestruturar o biofilme de X. fastidiosa em doses
acima de 1mg/mL
- O NAC apresentou atividade anti-bacteriana para X. fastidiosa em
todas as doses testadas
Resultados similares aos econtrados para
patógenos de humanos
Qual seria o efeito do NAC no biofilme de X. fastidiosa na planta?
Experimentos na planta – como conduzir?
-­‐ Dosagens: mesma uBlizada em medicamento -­‐120 mg e 600 mg (1500 mg) -­‐ Como aplicar? Xilema absorção via raíz
Vasos de Leonard
Solução nutritiva de
Hoaglad e Arnon + NAC
- Plantas com CVC com
mesma idade e com uma
população aproximada de
bactéria
Efeito das
diferentes
concentrações do
NAC X Controle
Encostia
Condução do experimento
Tratamentos
• Com CVC sem NAC – controle 1
• Com CVC com NAC 120mg
• Com CVC com NAC 600mg
• Com CVC com NAC 1.500mg
semanal
• Sem CVC com NAC (120, 600 e 1.500mg) –
controle 2
Dois diferentes experimentos (diferentes
épocas do ano) com quatro réplicas por
tratamento
Parâmetros avaliados
Sintomatologia
Quantificação
bactéria
Quantificação do
NAC
• PCR quanBtaBvo • Isolamento da bactéria HPLC Estudo de degradação Sintomatologia
Controle com
CVC sem NAC
Com CVC com
120 mg NAC
Sintomatologia
Controle com
CVC sem NAC
Com CVC com
600 mg NAC
Sintomatologia
Controle com
CVC sem NAC
Com CVC com
1.500 mg NAC
Sintomatologia - Conclusão
Há remissão de sintomas da CVC após 3 meses de
tratamento com 120 ou 600 mg de NAC !
120 mg NAC
600 mg NAC
Há absorção do NAC pela raíz?
Média amostras biológicas
NAC total
conc. Esperada
conc. Medida
desv. Pad.
120 mg
0,48 mg/ml
0,288 mg/ml
0,0811
600 mg
2,4 mg/ml
1,98 mg/ml
0,4577
1500 mg
6 mg/ml
6,156 mg/ml
0,1818
NAC estaria sendo absorvido pela planta! Menos do que é adicionado Quantificação da bactéria por RT-qPCR
Bactéria continua no xilema: viva ou morta?
Isolamento das células após 3 meses de tratamento com o NAC
Amostra Tratament
o
I
Controle
II
Controle
III
Controle
IV
Controle
I
120 mg
II
120 mg
III
120 mg
IV
120 mg
I
600 mg
II
600 mg
III
600 mg
IV
600 mg
I
1500 mg
II
1500 mg
III
1500 mg
IV
1500 mg
No. Bactérias por mL
(isolamento)
Ind.
2,6E+06
2,58E+05
2,96E+05
9E+04
Ind.
Ind.
Ind.
3E+04
Ind.
Ind.
4,8E+04
5E+04
6E+03
2E+04
Ind.
Parte da população está morta mas há células vivas
O que estaria acontecendo dentro da planta para reversão dos
sintomas e diminuição da população bacteriana?
Modelo hipotético do efeito do NAC no biofilme de X. fastidiosa
dentro de planta sintomática
x
• Água
• Nutrientes
O que acontece após a retirada do NAC?
Controle
120 mg NAC
600 mg NAC
Conclusões e Pespectivas
•  Experimentos em laboratório o NAC matou as células – Potencial anti-bacteriano
•  Experimentos na planta houve diminuição da população com remissão de
sintomas
•  Melhorar a forma de absorção pela raiz – absorção lenta
pedidopara
de patente
INPI
• Combinar o NACDepósito
com outrasde
moléculas
otimizar seu
potencial antibacteriano (NAC+Cu, NAC+Zn ...) - (Já existe em produtos fármacos NAC+Mg,
NAC+Amida, NAC + Ac. Salicílico)
Busca por parceiros
Vantagens para uso na agricultura
• Molécula já usada como medicamento em humanos - facilitar a liberação do
produto
• Molécula pequena (aa) de fácil absorção e combinação com outras moléculas
para potencializar sua ação
• Custo relativamente baixo se produzido em larga escala
Novos experimentos
O que estamos fazendo?
O que pretendemos fazer?
Aplicação por fertirrigação
• Testar por aspersão para
CVC, HLB e
Xanthomonas citri
(NAC + Cu)
Aplicação por injeção
Aplicação no NAC antes dos sintoma
Evitar o
surgimento da
CVC em
plantas sadias
ou
assintomáticas
Agradecimentos
Genoma
Funcional
NAC
Casa de vegetação
Discussões
Laboratório Produtos Naturais– UFSCAR
Prof Dr. Moacir Rossi Forim
Profa Dra. Maria Fátima das Gracas F. Silva
A toda equipe do Centro APTA Citros Sylvio Moreira -­‐ IAC Obrigada!
Alessandra Alves de Souza
Laboratório de Biotecnologia
Centro APTA Citros Sylvio Moreira
[email protected]