Virologia Fonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-2&user_login=HugoSousa1 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II Técnicas real-time PCR Biologia Molecular TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Detecção do genoma viral Futuro do diagnóstico de vírus Necessidade de equipamento e pessoal treinado Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2 TÉCNICAS PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3 4 Extração de Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Extração Ácidos Nucléicos PCR real-time Técnicas Lise alcalina; Neutralização; Precipitação de Proteínas e detritos celulares; Purificação Ácidos Nucleicos Precipitação Eluição em colunas Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Biologia Molecular 5 Extração Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 6 Extração Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 7 Extração Ácidos Nucléicos PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Utilização Nucleases Remoção DNA Remoção RNA Add DNase + DNase (protein) Add RNase + RNase (protein) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 8 Extração Ácidos Nucléicos PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm. [dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL) [ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 9 10 Técnicas de Amplificação AN Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Polymerase Chain Reaction Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 11 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Amplifica um fragmento de DNA especifico; Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido; Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida; 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ Região Alvo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 12 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular MISTURA DE REAÇÃO: DNA Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos); Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção; Mg2+ (Magnésio): Ajuda na nucleotídeos e estabilidade da Taq; dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G); Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efetua a cópia da sequência alvo do DNA. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II ligação dos 13 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular PROCEDIMENTO 1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC); 2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC); 3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC); 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ ATCCGAT (…) – 5’ 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ 5’ – (…) ATGCGTA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular PROCEDIMENTO 4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo; FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Electroforese em Gel de Agarose: Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular; DNA e RNA possuem carga elétrica negativa migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram); Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!) Amostras da PCR carregadas no gel; Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Pólo Positivo (+) Pólo Negativo (-) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 17 Polymerase Chain Reaction PCR real-time Técnicas Biologia Molecular APLICAÇÕES Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ... DESVANTAGENS Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefatos. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18 RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 19 Restriction Polymorphism (RFLP) PCR real-time Fragment TécnicasLength Biologia Molecular Baseada na técnica da PCR; Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais); Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica) Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA. 5’ – (…) ACTGA (…) – 3’ 3’ – (…) TGACT (…) – 5’ Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 20 Restriction Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Fragment TécnicasLength Biologia Molecular 21 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 22 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR real-time Técnicas Biologia Molecular APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 24 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Baseada na técnica da PCR; Análise de polimorfismos/mutações; Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente; Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 25 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 26 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) PCR real-time Técnicas APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Biologia Molecular Reverse Transcriptase PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 28 Reverse Transcriptase PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Baseada na técnica da PCR; Análise de expressão de mRNA; Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA; Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA; mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’ TTTTTTTTTT – 5’ Molécula Alvo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 29 Reverse Transcriptase PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 30 Reverse Transcriptase PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular VANTAGENS Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31 Reverse Transcriptase PCR APLICAÇÕES Expressão mRNA viral Avaliação da replicação viral DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Real Time PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 33 Real Time PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow for accurate quantitation Requires post-PCR processing Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34 Real Time PCR Monitora a fluorescência emitida durante a reação de PCR como um indicador da produções de amplicons em cada ciclo de PCR; Monitorização em tempo real; Detecção da amplificação nos estádios precoces da reação – maior precisão; Alvo: DNA ou RNA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 35 Real Time PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 36 Real Time PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 37 PCR real-time Técnicas Biologia Real Time PCR SYBR Green I Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Molecular Sonda de Hibridação Sonda TaqMan 38 Real Time PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Exponential If 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise Linear High variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade. PCR phases in linear view Plateau [DNA] Plateau End-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – degradation of PCR products. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Exponential Linear Cycle # 39 Real Time PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument. Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold Rn – (Rn-baseline) NTC – no template control DRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 40 Real Time PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular CT = threshold cycle Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 41 Real Time PCR PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Aplicações Quantificação carga viral Monitoração carga viral Monitoração terapêutica VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42 Sequenciação Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 43 Sequenciamento PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Usada para determinar a sequência de nucleotídeos Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização 3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44 Sequenciamento Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 45 Sequenciamento Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 46 47 Técnicas de Hibridização Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II Técnicas de Hibridização Alvo – DNA ou RNA Utilização de sondas específicas Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 48 Captura Híbrida Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 49 Captura Híbrida PCR real-time Técnicas Biologia Molecular Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semi-quantitativo Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reação com anticorpo secundário conjugado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50 PCR real-time Técnicas Biologia Captura Híbrida Molecular 45 minutes at 65ºC 60 minutes at 65ºC 15 minutes 30 minutes 60 minutes agitação Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51 Southern Blot Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 52 Southern Blot Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 53 Hibridização em tiras Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 54 Hibridização em tiras Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 55 Chips Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 56 PCR real-time Técnicas Biologia Chips Tipagem de vírus: Molecular HPV, HCV, HIV Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 57 Chips Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II PCR real-time Técnicas Biologia Molecular 58 We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up with just a maybe… Professor Mark Pallen Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59 Virologia Ano Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II
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