XIII Encontro de Iniciação Científica
IX Mostra de Pós-graduação
06 a 11 de outubro de 2008
BIODIVERSIDADE
TECNOLOGIA
DESENVOLVIMENTO
ECB0841
PARTICIPAÇÃO DO RECEPTOR TIPO 2 ATIVADO POR PROTEASE (PAR2) NA
INFLAMAÇÃO PERIODONTAL EM HUMANOS
SILVA, V.A , HOLZHAUSEN M.
UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ –
DEPERTAMENTO DE ODONTOLOGIA,
CLÍNICA DE PERIODONTIA – TAUBATÉ, SP
RESUMO
A associação do receptor tipo 2 ativado por protease (PAR2) com a periodontite, uma inflamação
crônica oral que leva à perda óssea e subseqüente perda do elemento dental, foi primeiramente sugerida
por estudos in vitro os quais demonstraram que osteoblastos, células epiteliais orais e fibroblastos
gengivais humanos expressam o PAR2. Além disso, observou-se que a aplicação local de um agonista
seletivo do PAR2 (SLIGRL) causa infiltração granulocítica gengival e periodontite em ratos. Contudo, não
há na literatura nenhum estudo em humanos demonstrando a associação do PAR2 com as doenças
periodontais. Desta forma, neste presente estudo, será avaliada a correlação entre a expressão do PAR2
(RT-PCR) em neutrófilos presentes no fluido crevicular com a gravidade da periodontite crônica em
humanos. Será realizada análise imunológica do fluido crevicular com relação aos níveis de diferentes
mediadores pró-inflamatórios, TNF-IL1- , IL-6 e IL-8, os quais serão determinados por meio de testes
imunoenzimáticos (ELISA). A avaliação da atividade proteolítica, tipo tripsina, presente no fluído
crevicular, será mensurada através do uso de um substrato específico para serine-proteases (BApNA). A
presença de possíveis ativadores do PAR2 será determinada através da análise da expressão de proteinase3 pelos neutrófilos creviculares (RT-PCR) e presença do patógeno Porphyromonas gingivalis (por técnica
de PCR). Como resultado final deste estudo, espera-se observar uma correlação positiva entre a expressão
do PAR2 e a gravidade da doença periodontal, avaliada clínica e imunologicamente. Além disso, espera-se
encontrar elevados níveis de atividade proteolítica no fluído, mais especificamente, presença de
proteinase-3 do neutrófilo e da bactéria Porphyromonas gingivalis, produtora da gingipaína.
Palavras-chave: periodontite, receptor e inflamação.
1. INTRODUÇÃO
A periodontite é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela destruição do ligamento
periodontal e osso alveolar. Está destruição ocorre como resultado das respostas imunoinflamatórias de
um hospedeiro susceptível frente a uma ameaça microbiana persistente (Schenkein, 2006).
Os periodontopatógenos produzem diversos fatores que podem estimular as células do hospedeiro a
ativar uma variedade de respostas que levam à produção de potentes mediadores inflamatórios, tais como,
o metabólito do ácido araquidônico, prostaglandina E2, enzimas conhecidas como matriz metalo-
proteinases (MMPs) e as citocinas: interleucina (IL)- 1, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral (TNF)-α
(Schwartz et al, 1997)
Os receptores ativados por protease (PARs) caracterizam-se por um mecanismo único de ativação que
permite com que os mesmos atuem como sensores celulares da atividade proteolítica. A ativação dos
PARs ocorre através da clivagem do domínio N-terminal gerando uma nova seqüência ligante N-terminal
a qual liga-se ao próprio receptor, ativando-o e iniciando a sinalização celular (Ossovskaya & Bunnett,
2004). Após sua ativação, que ocorre de maneira irreversível por proteólise, o PAR sofre rápida
internalização e direcionamento para os lisossomos onde é destruído, prevenindo uma estimulação
descontrolada das células. Ocorre então a síntese de novos receptores PAR pelo Complexo de Golgi e a
ressensibilização dá-se pela disponibilização na superfície celular (Bohm et al., 1996).
Até o presente momento, foram identificados: PAR1, PAR3, e PAR4, os quais podem ser ativados por
trombina, e PAR2 o qual pode ser ativado por tripsinas pancreáticas e extra-pancreáticas (endoteliais e
epiteliais),triptase do mastócito, proteinase 3 do netrófilo, fatores de coagulação (VIIa/ Xa),serinoprotease-1 da membrana,ou pela protease bacteriana gingipaína, produzida pelo periodonto-patógeno
Porphyromonas gingivalis (Vergnolle et al. 2001, Loubarkos et al., 2001).
O receptor PAR2 é
encontrado em tecidos provenientes de diferentes áreas do corpo humano, possivelmente participando do
processo inflamatório in vivo, regulando as respostas do hospedeiro frente à injúria tecidual (Vergnolle
1999; Cocks and Moffat, 2000; Vergnolle 2001; Coughlin and Camerer, 2003; Loubarkos et al, 2001;
Uehara et al, 2003). Ainda, a deleção do gene do PAR2 leva à diminuição do processo inflamatório nas
vias aéreas e nas articulações (Schmidlin et al. 2002, Ferrell et al. 2003) e leva a um atraso no início da
inflamação (Lindner et al. 2000). Outros estudos in vivo demonstraram que a ativação do PAR2 pode levar
ao relaxamento dos vasos sangüíneos, hipotensão, aumento da permeabilidade vascular, adesão e
marginação leucocitária, infiltração granulocítica e dor (Cocks & Moffatt 2000, Vergnolle et al. 2001,
Coughlin & Camerer 2003), todos efeitos que levam aos sinais cardinais da inflamação. Estudos recentes
sugerem ainda uma importante associação do PAR2 com a dor de origem inflamatória. O receptor PAR2
fora identificado nos nervos sensoriais aferentes onde tem sido associado à hiperalgesia térmica e
mecânica (Vergnolle N. Bunnett N.W. et al. 2001, Coelho et al. 2002).
OBJETIVO
O objetivo estudo é avaliar se a expressão do receptor PAR2 correlaciona-se com a presença e
gravidade da periodontite crônica em humanos, explorando alguns dos possíveis fatores envolvidos com
sua ativação.
4. METODOLOGIA A SER UTILIZADA
4.1. Seleção dos pacientes
De ambos os sexos e nunca fumantes, deverão ter idade entre 20 e 45 anos e apresentar boa saúde
geral. Serão deste estudo os pacientes que apresentarem algumas destas características: uso de aparelho
ortodôntico; necessidade de medicação antibiótica prévia ao tratamento dental; uso de antibióticos,
fenitoína, antagonistas de cálcio, ciclosporina ou drogas anti-inflamatórias um mês antes da consulta
inicial; uso de contraceptivos orais ou de reposição hormonal, história de diabetes, hepatite ou infecção
por HIV ou outra doença que comprometa as funções imunes; gravidez ou lactação; quimioterapia
imunosupressora; tratamento periodontal nos 6 meses antecedentes ao início do estudo.
Após terem sido apropriadamente informados sobre a natureza do estudo, os pacientes irão assinar um
termo de consentimento previamente aprovado pelo CEP de número 439/06 da Universidade de Taubaté e
registrado no CONEP. Os pacientes serão submetidos à terapia odontológica geral e periodontal nas
clínicas de graduação e pós-graduação do Departamento de Odontologia da UNITAU.
4.2. Avaliação clínica - seleção dos sítios periodontais
Os pacientes serão clinicamente avaliados por um periodontista previamente treinado e calibrado. Da
amostra, 10% serão examinados duas vezes para cada um dos critérios clínicos avaliados, a fim de se obter
a confiabilidade diagnóstica intra-examinador aferida pela estatística de Kappa (entre 0.8 e 1.0). Serão
determinados o índice de placa e o índice gengival (Löe, 1967), medidas de profundidade de sondagem,
nível de inserção clínica relativa e sangramento à sondagem em 6 sítios (mésio-vestibular, vestibular,
disto-vestibular, mésio-lingual, lingual e disto-lingual) de cada dente, utilizando-se uma sonda periodontal
manual (PCPUNC 15, Hu-Friedy, Chicago, USA). Onde será coletado em cada sítio selecionado uma
amostra de fluído crevicular, da microbiota subgengival, e será avaliado a presença de Porphyromonas
gingivalis por PCR, a expressão de PAR2 por RT-PCR, a atividade proteolítica (atividade tipo tripsina) no
fluído crevicular e análise estatística será realizada através da variância (ANOVA) para comparar as
médias dos valores obtidos entre os diversos grupos.
7. RESULTADOS ESPERADOS
No presente estudo, nós esperamos determinar o papel do receptor PAR2 no processo inflamatório nos
tecidos periodontais em humanos. Desta forma, esperamos encontrar uma maior expressão do receptor
PAR2 em pacientes com maior destuição periodontal. Além disso, espera-se encontrar maiores níveis de
atividade proteolítica e presença de Porphyromonas gingivalis nos sítios com maior expressão do receptor
PAR2. Assim, iremos determinar com o presente estudo se em um futuro próximo a modulação
farmacológica da atividade do receptor PAR2 ou a inibição específica de seus ativadores biológicos,
poderá ser uma alternativa terapêutica importante da doença periodontal.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bohm SK, Kong W, Bromme D, et al (1996). Molecular cloning, expression and potential functions of the
human proteinase-activated receptor-2. Biochem J 314:1009–1016.
Cocks TM, Moffatt JD (2000). Proteinase-activated receptors: sentries for inflammation? TIPS 21:103108.
Coelho A, Vergnolle N, Guiard B, Fioramonti J, Bueno L (2002). Proteinases and proteinase-activated
receptor 2: a possible role to promote visceral hyperalgesia. Gastroenterology 122: 1035-1047.
Coughlin SR, Camerer E (2003). PARticipation in inflammation. J Clin Invest 111:25-27.
Ferrell WR, Lockhart JC, Kelso EB, Dunning L, Plevin R, Meek SE, Smith AJ, Hunter GD, McLean JS,
McGarry F et al. (2003). Essential role for proteinase-activated receptor-2 in arthritis. J Clin Invest
111: 35–41.
Lindner JR, et al (2000). Delayed onset of inflammation in protease-activated receptor-2- deficient mice. J
Immunol 165:6504-6510.
Ossovskaya VS, Bunnet NW (2004). Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.
Physiol Rev 84: 579-621.
Schenkein HA (2006). Host responses in maintaining periodontal health and determining periodontal
disease. Periodontology 2000 40:77-93.
Schmidlin F, et al. (2002) Protease-activated receptor 2 mediates eosinophil infiltration and
hyperreactivity in allergic inflammation of the airway. J Immunol 169:5315-5321.
Uehara A, Muramoto K, Takada H, Sugawara S (2003). Neutrophil serine proteinases activate human
nonepithelial cells to produce inflammatory cytokines through proteinase-activated receptor 2. The
Journal of Immunology 170:5690-5696.
Uehara A, Sugawara S, Muramoto K, Takada H (2002). Activation of human oral epithelial cells by
neutrophil proteinase 3 through protease-activated receptor 2. The Journal of Immunology 169:45944603.
Vergnolle N, Wallace JL, Bunnett NW, Hollemberg MD (2001). Proteinase-activated receptors in
inflammation, neuronal signaling and pain. TIPS 22:146-152.
Vergnolle N, Bunnett NW, Sharkey KA, Brussee V, Compton S, Grady E, Cirino G, Gerard N, Basbaum
A, Andrade-Gordon P, Hollenberg M D, Wallace JL (2001). Proteinase-activated receptor-2 and
hyperalgesia: a novel pain pathway. Nat Med 7, 821-826.
Vergnolle, N (1999). Proteinase-activated receptor-2-activating peptides induce leukocyte rolling,
adhesion, and extravasation in vivo. J Immunol 163, 5064-5069.