ALINE IGNACIO SILVESTRE DA SILVA
AVALIAÇÃO DE ALGUNS MICRORGANISMOS DA MICROBIOTA
INTESTINAL ENDÓGENA DE CRIANÇAS EUTRÓFICAS, COM
SOBREPESO E OBESAS EM IDADE ESCOLAR
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
Área de Concentração: Microbiologia
Orientadora: Profa. Dra. Viviane Nakano
Versão corrigida. A versão original
eletrônica encontra-se disponível tanto na
Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações da USP
(BDTD)
São Paulo
2014
RESUMO
SILVA, A. I. S. Avaliação de alguns microrganismos da microbiota
intestinal de crianças eutróficas, com sobrepeso e obesas em idade
escolar. 2014. 86 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014.
O trato gastrintestinal é um ecossistema extremamente complexo. Diversos
fatores influenciam o processo de colonização como: tipo de parto e de
alimentação e o uso precoce de antimicrobianos. Em adultos, a maioria das
bactérias encontradas na microbiota intestinal é pertencente aos gêneros
Bacteroides, Parabacteroides (Bacteirodetes) e Clostridium (Firmicutes).
Atualmente a obesidade é considerada uma das principais doenças de saúde
pública e sua relação com a microbiota intestinal passou a ser discutida
recentemente. No Brasil, os índices de obesidade vêm alarmando a
comunidade médica, principalmente em se tratando de obesidade infantil onde
tem sido observado um crescimento vertiginoso dos casos. Desta forma, o
objetivo deste trabalho foi analisar comparativamente alguns microrganismos
que compõe a microbiota intestinal endógena de crianças eutróficas (30), com
sobrepeso (24) e obesas (30) entre 3 a 11 anos, a partir de amostras fecais.
Foi realizado o isolamento de espécies de Clostridium, Bacteroides e
Parabacteroides; a identificação de B. fragilis e C. perfringens
enterotoxigênicos; e a detecção quantitativa por PCR (SybrGreen) de B.
fragilis, B.vulgatus, P. distasonis, C. perfringens, C. difficile, Bifidobacterium
spp., Lactobacillus spp., Bacteroidales e Clostridium (cluster I). Adicionalmente,
no ato da coleta foi aplicado um questionário a respeito do tipo de parto, tipo de
amamentação, uso de antibiótico na tentativa de correlacionar com os
resultados quantitativos obtidos com essas variáveis qualitativas. Os nossos
resultados mostraram que a média de idade para as crianças obesas e com
sobrepeso corresponde aos 8 anos, enquanto eutróficos apresentaram média
de 6 anos de idade; as espécies de C. perfringens e B. vulgatus foram as mais
isoladas em todos os grupos estudados. Nenhum dos isolados de B. fragilis foi
enterotoxigênico; todos os isolados de C. perfringens foram classificados como
tipo A e destes 8,7% e 12,2% albergaram os genes tepL e netB,
respectivamente, sendo que alguns isolados produziram efeito citotóxico em
células Vero. Pelo método de isolamento observou-se que o grupo dos
sobrepeso teve maior diversidade de espécies isoladas; e no grupo dos obesos
foram observados o maior número de isolados (175) em relação ao grupo dos
eutróficos (112) e sobrepeso (120). A análise quantitativa revelou que C.
perfringens, C. difficile e Bifidobacterium spp. estão em maior quantidade em
crianças eutróficas, enquanto que obesos e com sobrepeso apresentaram
maior número de Lactobacillus spp. e Bacteroidales. Nenhuma das variáveis
qualitativas apresentou associação com o estado nutricional da criança bem
como os resultados obtidos no qPCR. Outros estudos devem ser realizados
para melhor compreensão do papel da microbiota sobre o ganho de peso,
principalmente em crianças.
Palavras-chave: Microbiota intestinal. Obesidade. Crianças. Bacteroides.
Clostridium. PCR quantitativo.
ABSTRACT
SILVA, A. I. S. Evaluation of some microorganism from endogenous
intestinal microbiota of normal weight, overweight and obese
schoolchildren. 2014. 86 p. Masters thesis (Microbiology) - Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014.
The intestinal tract is a complex ecosystem. Several factors can influence the
process of colonization as: type of delivery and supply and the early use of
antimicrobials. In adults, the majority of the bacteria found in gut are belonging
to the genera Bacteroides, Parabacteroides (Bacteirodetes) and Clostridium
(Firmicutes). Currently obesity is considered one of the main diseases of public
health and its relationship with the intestinal microbiota has been discussed
recently. In Brazil, the rates of obesity have become worrying especially in the
case of childhood obesity where there has been a rapid growth of cases. The
goal of this study was to evaluate some microorganism from endogenous
intestinal microbiota of normal weight (30), overweight (24) and obese children
between 3 and 11 years, from fecal samples. It was performed the isolation of
species of Bacteroides, Parabacteroides and Clostridium; the identification of B.
fragilis and C. perfringens enterotoxigenic; and the quantitative detection by
PCR (SybrGreen) B. fragilis, B. vulgatus, P. distasonis, C. perfringens, C.
difficile, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Bacteroidales and Clostridium
(cluster I). Additionally, a survey about the type of delivery, type of
breastfeeding and the use of antibiotics was applied to correlate with the
quantitative results obtained with these qualitative variables. Our results
showed that the average age for obese and overweight children corresponds to
8 years, while normal weight had a mean age of 6 years; the species of C.
perfringens and B. vulgatus were the most isolated. No B. fragilis isolated was
enterotoxigenic; all C. perfringens were classified as type A and these 8.7% and
12.2% harbored tpeL and netB genes, respectively, and some of them produce
cytotoxic effect in Vero cells. The overweight group had highest species
diversity and obese group had the highest isolate number (175) compared with
normal weight (112) and overweight (120) group. C. perfringens, C. difficile and
Bifidobacterium spp. were in greater quantity in normal weight children while
that obese and overweight showed a greater number of Lactobacillus spp. and
Bacteroidales. None of the qualitative variables were significantly associated
with the nutritional status of the children as well as the results obtained in
qPCR. Other studies should be conducted to better understand the role of
microbiota on weight gain, especially in children.
Keywords: Intestinal microbiota. Obesity. Children. Bacteroides. Clostridium.
Quantitative PCR.
INTRODUÇÃO
O trato gastrintestinal (TGI) é um ecossistema extremamente complexo
que envolve as condições físicas do hospedeiro, a dieta alimentar, os sistemas
fisiológico e imunológico e as interações com as diversas espécies
microbianas. Os microrganismos que residem de forma estável no ambiente
intestinal constituem a microbiota residente, também denominada microbiota
endógena ou autóctone, que atua como primeira linha defesa do hospedeiro
contra a invasão e proliferação de organismos exógenos e oportunistas
(HOOPER; BRY; GORDON, 1998).
Durante muitos anos, acreditou-se que um feto saudável se desenvolve
em um ambiente estéril e que a colonização do TGI se iniciava durante o
nascimento. Este conceito amplamente aceito se deve principalmente a
observação e forte correlação entre a ocorrência de partos prematuros
acompanhados
de
infecções
intra-uterinas
(GOLDENBERG;
HAULTH;
ANDREWS, 2000; GONÇALVES; CHAIWORAPONGSA; ROMERO, 2002).
Entretanto, estudos sobre o ambiente uterino saudável mostraram a presença
de algumas espécies, como E. faecium, S. epidermidis, P. acnes, L. rhamnosus
e Bifidobacterium spp., no sangue do cordão umbilical e anexos placentários
(DiGIULIO et al., 2005; JIMENÉZ et al., 2005; SATOKARI et al., 2009). Assim,
acredita-se que algumas bactérias iniciam a colonização do intestino do feto
como uma forma de adaptá-lo à vida fora do útero e posteriormente, o
processo continua durante e após o parto e com a amamentação (JIMENÉZ et
al., 2008).
Diversos fatores são determinantes para a colonização do trato
gastrintestinal: ao nascer de parto normal, as primeiras bactérias que
colonizam o intestino são as provenientes do canal vaginal e períneo da mãe,
sendo a maioria anaeróbia; diferentemente, em partos cesáreas, a microbiota
que se instala primeiramente é caracterizada microrganismos microaerófilos,
facultativos e esporulados provenientes do ambiente e dos profissionais da
área de saúde (BEZIRTZOGLOU, 1997).
Outro fator importante que influencia o processo de colonização
intestinal nos primeiros meses de vida é a alimentação. O leite materno é
composto por lactose, caseína, cálcio e fosfato; e possui baixo poder
tamponante que favorece o desenvolvimento de Bifidobacterium spp.. Acreditase que espécies Bifidobacterium inibem a proliferação de E. coli e alguns
anaeróbios como Bacteroides spp. e Clostridium spp., devido à síntese de
grandes quantidades de ácido acético, prevenindo assim quadros de
gastrenterites (BEZIRTZOGLOU, 1997).
O uso de antibióticos também merece destaque; a antibióticoterapia
precoce é muitas vezes empregada na prevenção de enfermidades, em casos
de nascimento prematuro, uma vez que a hospitalização permite a exposição a
possíveis agentes patogênicos, que para um sistema imune imaturo, pode ser
fatal. Estudos mostram que o uso de antibióticos nos primeiros meses de vida
diminui a diversidade microbiana, favorecendo a instalação de S. aureus e
Klebsiella spp. nos primeiros vinte dias de vida, diminuindo a incidência de
anaeróbios (MAGNE et al.; 2005).
Ainda que a colonização do trato gastrintestinal possa ser iniciada de
diferentes formas e sob diversas influências, após em média 12-24 meses de
vida, esta microbiota torna-se mais estável, quando o consumo de alimentos
sólidos passa a substituir o leite e assemelha-se cada vez mais à composição
da microbiota na fase adulta. Em adultos, a maioria das bactérias encontradas
é pertencente a três filos: Bacteroidetes (gram-negativos), Actinobacteria e
Firmicutes
(gram-positivos)
(ADLERBERTH;
WOLD,
2009;
MUSSO;
GAMBINO; CASSEDER, 2011).
Dentre os gêneros agrupados nestes filos, os gêneros Bacteroides e
Parabacteroides (Bacteroidetes) e Clostridium (Firmicutes) estão entre os mais
populosos constituintes do ecossistema intestinal e merecem atenção por
albergarem espécies que possuem diversidade bioquímica e potencial
patogênico (produção de toxinas e enzimas proteolíticas, capacidade de
invasão e elevada resistência aos antimicrobianos) (HOOPER; BRY;
GORDON, 1998; MUSSO; GAMBINO; CASSEDER, 2011).
A relação entre obesidade e microbiota intestinal passou a ser discutida
nos últimos 30 anos quando se observou redução de peso após cirurgia
bariátrica acompanhada de alterações na microbiota intestinal (MUSSO;
GAMBINO; CASSEDER; 2011). Atualmente a obesidade é considerada uma
das principais doenças de saúde pública mundial por apresentar grande
impacto sobre o corpo, com maiores modificações no metabolismo energético e
nos mecanismos regulatórios, podendo levar ao diabetes tipo 2, doenças
cardiovasculares, alguns tipos de câncer, doenças gastrintestinais, incluindo
doenças inflamatórias no intestino (CONTERNO et. al., 2011).
Alguns dos fatores que interferem na obesidade são: fatores genéticos,
hábitos alimentares, idade, gasto energético e estilo de vida. A redução no
gasto energético da vida moderna e a predominância da dieta ocidental em
países desenvolvidos e em desenvolvimento estão implicadas no aumento da
obesidade no mundo (CONTERNO et al., 2011, WHO 2012).
Os carboidratos que não são digeridos pelo homem são fermentados
pelas bactérias intestinais e têm como produtos finais ácidos graxos de cadeia
curta (short-chain fatty acids – SCFAs). Estima-se que a produção de SCFAs
no cólon corresponde a 10% da energia diária requerida pelo homem e que a
sua absorção é, geralmente, realizada através de difusão passiva ou via
transportadores de ácidos mono-carboxílicos (CONTERNO et. al., 2011,
MUSSO; GAMBINO; CASSEDER, 2011).
Em estudo comparativo com humanos (30 eutróficos, 35 sobrepeso e 33
obesos) observou-se um aumento na concentração de SCFAs nas amostras
fecais de indivíduos com sobrepeso e obesos, além do aumento da população
de Firmicutes acompanhada da diminuição de Bacteroidetes (SCHWIERTZ et
al., 2010).
Adicionalmente, em adolescentes obesos que receberam dieta menos
calórica e que apresentaram perda de peso, a proporção de Firmicutes e
Bacteroidetes foi contrária à observada com o ganho de peso, havendo
aumento de Bacteroidetes e diminuição de Firmicutes (SANTACRUZ et al.,
2009). Entretanto, até o momento nenhum trabalho demonstrou haver uma
relação de causalidade entre a microbiota intestinal e o desenvolvimento da
obesidade.
Nas últimas décadas o Brasil vem sofrendo uma transição no estado
nutricional de sua população, em que se observa um declínio da desnutrição e
aumento da população com sobrepeso e obesa, independentemente da faixa
etária e estratos sociais (IBGE, 2010).
Sabe-se que crianças com sobrepeso estão mais propensas, a se tornarem
adultos com sobrepeso ou obesos (IBGE, 2010). Sendo assim, uma das formas
mais eficientes de se prevenir à obesidade na idade adulta é através de
intervenções durante a infância. Poucos são os estudos que reportam a
situação nutricional das crianças brasileiras e sendo a obesidade uma doença
de incidência mundial, de consequências futuras à saúde humana e de
desenvolvimento não totalmente elucidado, este trabalho se justifica por
investigar um dos possíveis aspectos envolvidos com a obesidade – a
composição da microbiota intestinal.
CONCLUSÕES
Com os resultados deste trabalho pode-se concluir que:
1. Das amostras fecais avaliadas, as espécies mais isoladas foram B. vulgatus
e C. perfringens; entretanto foi observado que a frequência aumentada de
determinadas espécies obtidas em cultivo não é acompanhada do aumento do
seu número de células/g de fezes na avaliação quantitativa;
2. Nenhuma cepa de B. fragilis foi enterotoxigênica, sendo classificadas como
NTBF padrão III e II. Todas as cepas de C. perfringens foram toxinotipo A. Foi
verificado também a presença dos genes tpeL e netB nos isolados de C.
perfringens.
3. A avaliação quantitativa demonstrou maior quantidade de microrganismos
pertencentes à ordem Bacteroidales e ao gênero Lactobacillus nos grupos do
sobrepeso e obesos; e Cluster I, C. perfringens, C. difficile e Bifidobacterium
spp. no grupo dos eutróficos;
4. Em relação as variáveis qualitativas foi observado que: crianças a partir dos
oito anos de idade tendem a adquirir excesso de peso quando comparadas
com crianças mais novas; crianças eutróficas apresentam maior quantidade de
Bifidobacterium spp. independente do tipo de alimentação nos primeiros seis
meses de vida e por fim, as diferenças observadas para determinadas
espécies, em função do estado nutricional, pode não ser acompanhada por
diferenças em seus respectivos gênero, ordem ou agrupamento.
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