ANDERSON RICARDO SOARES
LIGNIFICAÇÃO DE RAÍZES DE SOJA
SOB AÇÃO DE L-3,4-DIIDROXIFENILALANINA (L-DOPA)
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas (área de
concentração
Biologia
Celular)
da
Universidade Estadual de Maringá, para
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas.
Maringá
Abril – 2006
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
S676L
Soares, Anderson Ricardo
Lignificação de raízes de soja sob a ação de L-3,4diidroxifenilalanina (L-Dopa) / Anderson Ricardo Soares. –
Maringá, PR : [s.n.], 2006.
45 f. : il. color.
Orientadora : Prof. Dr. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá.
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2006.
1. Soja - Alelopatia (L-DOPA). 2. Soja - Lignina Determinação. 3. Soja - Raízes - Crescimento. 4. Soja Compostos fenólicos - Determinação. 5. Soja - Peroxidases Determinação das atividades. 6. Soja - Fenilalanina amônia
liase (PAL) - Determinação da atividade. I. Universidade
Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas. II. Título.
CDD 21.ed.635.655
ANDERSON RICARDO SOARES
LIGNIFICAÇÃO DE RAÍZES DE SOJA
SOB AÇÃO DE L-3,4-DIIDROXIFENILALANINA (L-DOPA)
Profª Drª Maria de Lourdes Lucio Ferrarese
Orientadora
Maringá
Abril – 2006
2
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação é composta de uma Revisão e de um Artigo científico que trata dos
efeitos do L-DOPA na lignificação de raízes de soja. O artigo foi redigido de acordo com as
normas da revista Journal of Chemical Ecology.
Anderson Ricardo Soares; Maria de Lourdes Lucio Ferrarese; Rita de Cássia Siqueira;
Franciele Mara Lucca Zanardo Böhm and Osvaldo Ferrarese-Filho. L-DOPA increases
lignification associated to Glycine max root growth-inhibition (submetido).
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RESUMO GERAL
As plantas superiores regularmente liberam compostos orgânicos no ambiente os quais
são adicionados ao solo. Alguns destes compostos têm sido citados como agentes de interações
entre plantas, fenômeno conhecido como alelopatia. Estes compostos são liberados por vários
mecanismos incluindo a lixiviação pela água pluvial, exsudação pelas raízes, decomposição
natural de partes das plantas na superfície ou no próprio solo. A ação primária dos compostos
alelopáticos ainda não foi estabelecida, mas alguns efeitos fisiológicos são conhecidos.
Tipicamente os aleloquímicos interferem nas plantas superiores suprimindo a germinação,
causam injúrias durante o crescimento da raiz e meristemas e, então, inibem o crescimento das
plantas. Embora as plantas de cobertura do solo forneçam valor à colheita quando adicionadas
em sistemas agronômicos, muitas espécies utilizadas como coberturas são tóxicas devido às altas
concentrações de fitoquímicos, próprios da alelopatia.
Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis é um exemplo de planta de cobertura do solo bem
sucedida e com vários produtos naturais altamente ativos. Mucuna tem sido amplamente
cultivada em áreas tropicais como enriquecedora do solo, cobertura para controle de plantas
daninhas e silagem. Tem sido relatado que vários agentes químicos secundários são produzidos
pelas sementes, folhas e raízes de Mucuna. O principal composto fitotóxico encontrado é o
aminoácido não-protéico L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), que é utilizado no tratamento
sintomático da doença de Parkinson. Além disso, este composto é liberado das raízes de Mucuna
para o solo e inibe o crescimento de espécies de plantas vizinhas. Esta ação alelopática tem sido
relatada em um grande número de espécies de plantas, mas o conhecimento sobre o mecanismo
de ação do L-DOPA é escasso.
Nas plantas, L-DOPA é precursor de muitos alcalóides, catecolaminas, flavonóides,
melanina e fenilpropenóides. A via dos fenilpropenóides é uma das mais importantes devido ao
seu papel na síntese de compostos fenólicos e de uma ampla série de produtos secundários em
plantas, incluindo lignina. Fenilalanina amônia liase (PAL) e peroxidase (POD) têm sido
associadas com a polimerização de monolignóis e consequentemente a lignificação. Não há
relatos sobre os efeitos de L-DOPA exógeno em raízes de soja. Devido ao importante papel da
lignificação no crescimento da raiz, esta pesquisa tem por objetivo investigar a absorção e os
efeitos de L-DOPA nas atividades da PAL e peroxidases, nos conteúdos de compostos fenólicos
e de lignina e no crescimento das raízes de soja.
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Plântulas obtidas após três dias de germinação, foram cultivadas em solução nutriente,
pH 6.0, contendo ou não L-DOPA (0.1 a 1.0 mM). Os experimentos foram acondicionados em
uma câmara de crescimento (25°C, 12-h luz/12-h escuro, irradiação de 280 µmol m-2 s-1) durante
24 horas. Depois da incubação, a absorção de L-DOPA pelas raízes e os efeitos sobre as atividades
enzimáticas, compostos fenólicos, conteúdos de lignina e o crescimento da raiz foram avaliados.
Os dados são expressos como médias de três a seis experimentos independentes ± erro padrão da
média. Para testar a significância das diferenças observadas foi realizada a análise de variância.
A diferença entre os parâmetros foi avaliada pelo teste de múltiplas comparações de Dunnett e
valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
Os resultados mostraram que 1) a média total do comprimento das raízes foram 20.9 a
76,7% menores do que os controles para tratamentos com 0.25 a 1.0 mM, respectivamente. As
biomassas frescas das raízes diminuíram 11,2 e 14,3% nos tratamentos com 0.5 e 1.0 mM,
respectivamente. Nas mesmas concentrações, as biomassas secas diminuíram 16,1 e 14,9% em
relação aos controles. 2) Os teores de L-DOPA aumentaram progressivamente nas raízes. Após
tratamento com 0.1 mM, os conteúdos foram 0,099 mg g-1 de matéria seca enquanto, a 1.0 mM,
este contedúdo foi 0,306 mg g-1 de matéria seca. 3) L-DOPA aumentou a atividade da PAL de
82% a 106%, após os tratamentos com 0.25 a 1.0 mM. As atividades das peroxidases solúveis
aumentaram cerca de 39% enquanto as atividades das peroxidases ligadas à parede celular
aumentaram em torno de 31% independentemente das concentrações de L-DOPA. 4) Os
conteúdos de compostos fenólicos aumentaram significativamente de 84% (a 0.1 mM) a 145% (a
1.0 mM). 5) Os conteúdos de lignina aumentaram 56%, de 0.25 a 1.0 mM de L-DOPA.
Os resultados revelam que o crescimento da raiz (comprimento e biomassa) diminuiu
após a absorção de L-DOPA, enquanto as atividades da PAL e POD, os compostos fenólicos e os
conteúdos de lignina aumentaram. Com exceção da soja, a redução do crescimento da raiz por LDOPA foi relatada em várias espécies de plantas. Algumas plantas são tolerantes, outras não. Em
termos gerais, a redução do crescimento de raízes de plântulas tem sido associada com a
lignificação precoce das paredes celulares induzida pelo aleloquímico, acompanhada por
aumento nos teores de compostos fenólicos e atividades da PAL e POD. Sabe-se que as paredes
celulares se tornam lignificadas quando a expansão celular cessa, quando se diferenciam em
xilema ou quando a célula está sob estresse abiótico ou biótico. A POD e polifenoloxidase
mediam a oxidação de L-DOPA para formar dopaquinona e, posteriormente, melanina. Durante
esta via, espécies reativas ao oxigênio (EROs) são liberadas e as plântulas podem sofrer estresse.
5
Como resposta, a via de fenilpropenóides é acelerada aumentando as atividades da PAL e das
peroxidases, produzindo compostos fenólicos e lignina. Este parece ser o caso relatado no
presente trabalho.
Concluindo, os resultados indicam a suscetibilidade da soja ao L-DOPA e reforçam o
papel deste aminoácido não-protéico como forte aleloquímico. Além disso, os resultados
sugerem que a inibição induzida por L-DOPA no crescimento das raízes de plântulas de soja,
pode ser devido a um processo de enrijecimento da parede celular relacionado à produção de
lignina. Se a parede celular é o sítio de ação do L-DOPA, estas descobertas fortalecem as
informações a respeito de como este composto afeta o crescimento das plantas.
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GENERAL ABSTRACT
Since higher plants regularly release organic compounds in the environment, their decay
products are often added to the soil matrix and a few have been reported as agents of plant-plant
interactions, a characteristic of allelopathy. These compounds are released by various
mechanisms, which include release in soil by rainwater, excretion or exudation from roots, and
by natural decay of parts of plants lying above or below the ground. The primary mode of action
has not been established for any allelopathic compound, albeit some physiological actions are
known. Allelochemicals, active against higher plants, typically suppress seed germination, cause
injury to root growth and other meristems, and inhibit seedling growth. Although cover crops
provide an added crop value in the agronomic system, many cover-crop species are too toxic due
to high concentrations of phytochemicals, proper to allelopathy.
Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis is an example of a successful cover crop with
several highly active natural products. Mucuna has long been cultivated in tropical areas as soilimproving crop, as cover crop to control weeds, and as forage plants. It has been reported that
several secondary chemicals agents are produced by seeds, leaves and roots of Mucuna. The
main phytotoxic compound encountered is held to be the non-protein amino acid L-3,4dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), which is chiefly used in treating the symptoms of
Parkinson's disease. Moreover, this compound is released from the Mucuna roots into soils and
inhibits the growth of nearby plant species. Allelopathic action has been reported in many plant
species but knowledge on L-DOPA’s mechanism is scanty.
In plants, L-DOPA is a precursor of many alkaloids, catecholamines, flavonoids, melanin
and phenylpropenoids. The phenylpropenoid pathway is one of the most important metabolic
pathways since it synthesizes phenolic compounds and a wide range of secondary products in
plants, including lignin. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and peroxidase (POD) have been
associated with monolignol polymerization and, consequently, with lignification.
No reports on the effects of exogenous L-DOPA on soybean roots are available so far.
Due to the important role of lignification in root growth, current research investigates the
absorption of L-DOPA by soybean roots and their effects on PAL and POD activities, phenolic
compounds and lignin contents.
Three-day-old seedlings were cultivated in nutrient solution, pH 6.0, containing or not 0.1
to 1.0 mM L-DOPA. Experiments were carried in a growth chamber (25°C, 12-h light/12-h dark
7
cycle, irradiance of 280 µmol m-2 s-1) during 24 hours. After incubation, the absorption of LDOPA by roots and their effects on enzymatic activities, phenolic compounds and lignin contents
and root growth were evaluated. Data are expressed as means of three to six independent
experiments ± S.E. Whereas variance tested the significance of the observed differences, the
difference between parameters was evaluated by Dunnett´s multiple comparison test and P
values <0.05 were considered to be statistically significant.
Results showed that 1) mean total root lengths were 20.9 to 76.7% less than controls for
0.25 to 1.0 mM treatments, respectively. Fresh root weights decreased 11.2 and 14.3% at 0.5 and
1.0 mM treatments, respectively. In similar concentrations, dry root weights decreased 16.1 and
14.9% less than those of controls. 2) L-DOPA was progressively absorbed by the roots. After
exogenous 0.1 mM treatment, the L-DOPA content in the roots reached 0.099 mg g-1 dry weight
while, at 1.0 mM, this content amounted to 0.306 mg g-1 dry weight. 3) L-DOPA increased PAL
activities from 82% to 106% after 0.25 to 1.0 mM treatments. Soluble POD activities increased
around 39%, while cell wall-bound POD activities approximately increased 31% regardless of LDOPA concentrations. 4) Phenolic compound content was significantly increased from 84% (at
0.1 mM) to 145% (at 1.0 mM). 5) Lignin content increased around 56% from 0.25 to 1.0 mM LDOPA.
Results show that root growth (length and weight) decreased, while PAL and POD
activities and phenolic compounds and lignin contents increased under L-DOPA action. Except
in soybean, reduction of root growth by L-DOPA has been related in several plants. Some
species are tolerant but others are not. In general terms, reduction of seedling roots has been
associated with premature allelochemical-induced lignification of the cell walls accompanied by
increase in phenolic compounds and PAL and POD activities. Cell walls are know to become
lignified when cell expansion ceases, when it differentiates to particular specialization, notably
the xylem, or when the cell is under abiotic or biotic stresses. It is known that POD and
polyphenoloxidase (PPO) mediate the oxidation of L-DOPA to form dopaquinone and, further,
melanin. During this pathway, reactive oxygen species (ROS) are released and seedlings may be
stressed. As response, the phenylpropenoid pathway is accelerated, increasing PAL and POD
activities, producing phenolics compounds, and consequently lignin. This seems to be the case
reported in current research.
Current results indicate the susceptibility of soybean to L-DOPA and reinforce the role of
this non-proteic amino acid as a strong allelochemical. Results further suggest that L-DOPA-
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induced inhibition of soybean root growth may be due to cell wall stiffening process associated
with lignin production. If the cell wall is a target site of L-DOPA, findings corroborate the
manner the compound affects the growth of plant species.
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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Aspectos gerais
O termo alelopatia foi originalmente sugerido por Hans Molish, em 1937, para definir o
fenômeno da interinfluência entre plantas (incluindo microorganismos), sem a necessidade de
contato físico (Tang et al., 1995). Tal interação à distância é promovida pela liberação de
biossintatos para o ambiente por um produtor e sua absorção pelo receptor (Rice, 1984). O
estabelecimento de relações causais entre cada um deles e os efeitos alelopáticos é complexo: um
mesmo organismo produz e segrega inúmeros aleloquímicos; estes uma vez liberados interagem
entre si e com outros agentes bióticos e abióticos do meio. Além disso, cada espécie vegetal
desenvolveu um modo próprio de responder ao estresse alelopático. Assim, de um modo geral,
infere-se que a interação alelopática depende da concentração e estabilidade dos aleloquímicos,
da atividade microbiana e da resistência da planta (Blum et al., 1984). Os compostos com ação
alelopática são primordialmente oriundos do metabolismo secundário. Dentre os milhares de
aleloquímicos destacam-se os compostos fenólicos, os terpenos e os compostos nitrogenados
entre os quais os aminoácidos não-protéicos, motivo do presente estudo.
Os aleloquímicos interferem em muitos processos vitais das plantas e sua atuação não é
específica. As funções prejudicadas, com maior freqüência, são a utilização de água e
assimilação de nutrientes (Lyu e Blum, 1990; Bergmark et al., 1992; Booker et al., 1992), o
crescimento de raízes e expansão de folhas (Blum e Dalton, 1985), a fotossíntese e a síntese de
proteínas (Mersie e Singh, 1993), a respiração celular e a permeabilidade da membrana celular e
atividades enzimáticas (Baziramakenga et al., 1995; Politycka, 1996, 1997, 1998).
Grande parte dos estudos no campo da alelopatia está voltada para o isolamento e
identificação de estruturas dos compostos que causam efeito alelopático. Há abundantes
informações sobre as estruturas químicas e aspectos pertinentes de sua interação com o
ambiente. Entretanto, investigações mais consistentes voltadas à absorção desses compostos
(Lehman e Blum, 1999; Ferrarese et al., 2000; Silva et al., 2000, Herrig et al., 2000), bem como
seus efeitos metabólicos nas plantas (Baleroni, 1999; Baleroni et al., 2000; Herrig et al. 2002; Ng
et al., 2003; Doblinski et al., 2003; Santos et al., 2004; Böhm et al., 2006) apontam para a
necessidade de maior atenção dos pesquisadores das áreas de fisiologia e bioquímica das plantas.
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O maior desafio desses cientistas é determinar o mecanismo de ação dos aleloquímicos.
Não existe uma simples equação que explique o modo de ação dos aleloquímicos. Outra questão
em aberto, é que não tem sido possível separar, com clareza, os efeitos primários dos
secundários. Diferentes componentes estruturais da célula podem sofrer os efeitos dos
aleloquímicos, muito embora as perturbações a nível de membrana indicam ser este o ponto
inicial para as múltiplas ações destes compostos. Os dados obtidos até o momento levam a crer
que a atividade destes compostos, sobre as membranas, desencadeia subseqüentes alterações
fisiológicas. É possível que a fitotoxicidade de muitos destes compostos não seja devida a um
sítio localizado de interferência, mas talvez decorrente da ação sobre múltiplos sítios (Einhellig,
1995). Além disso, um dos grandes déficits de conhecimento acerca das atividades dos
aleloquímicos é uma clara explicação para as diferenças de sensibilidade entre as espécies. Não
há um aleloquímico genérico! Diferentes modos de ação dentre os inúmeros compostos são
possíveis, e têm sido freqüentemente relatados (Macias, 1995).
Como se nota, estudos sobre a ação de aleloquímicos, sua absorção pelas raízes, seus
efeitos sobre o metabolismo celular constituem, de um modo geral, assunto indiscutivelmente
fascinante. A variabilidade de respostas, os controversos efeitos sobre as espécies estudadas são
pontos que desafiam os pesquisadores na busca do entendimento do modo de ação desses
compostos.
O aleloquímico L-DOPA
As leguminosas vêm sendo utilizadas na agricultura desde os tempos remotos, há mais de
dois mil anos. O gênero Mucuna (Leguminosae) compreende aproximadamente 160 espécies. As
espécies mais comumente encontradas são deeringiana, utilis, pruriens, cochichinensis, nivea,
capitata, hassjoo, diabolica, aterrima e cinérea. Estas espécies são muito utilizadas como
silagem e planta de cobertura do solo devido à grande quantidade de matéria orgânica de alta
digestibilidade que produz, além da sua capacidade de controlar fitonematóides (Vargas-Ayala et
al., 2000). Mucuna spp (Fig. 1), de ocorrência tropical e amplamente usada como cobertura do
solo, contém em suas folhas, sementes e raízes um importante agente alelopático, L-DOPA (L3,4-dihidroxifenilalanina) (Prakash et al., 2001; Nishihara et al., 2002).
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Fig. 1. A planta e seu composto alelopático L-3,4-diidroxifenilalalnina (L-DOPA).
L-DOPA, cuja formação é resultado da hidroxilação da tirosina, é um aminoácido nãoprotéico, precursor de alcalóides, fenilpropenóides, flavonóides, lignina e melanina. Além desta
característica, recente estudo envolvendo sua aplicação em diferentes espécies vegetais revelou
que ele possui atributos típicos de um aleloquímico (Nishihara et al., 2004). Estes autores
observaram variabilidade das respostas de diferentes plantas ao L-DOPA. Por exemplo, os
tratamentos de espécies de Gramíneae e Leguminosae mostraram-se menos afetados, no que
tange ao crescimento das raízes, que os tratamentos de espécies de Brassicaceae, Compositae,
Hydrophyllaceae e Cucurbitaceae. Estes resultados permitiram concluir que L-DOPA constitui
um poderoso aleloquímico haja vista que as concentrações requeridas para ocasionar 50% de
inibição (EC50) variaram de 5 a 50 µg/ml. Além da possibilidade de afetar o crescimento de
várias plantas, em especial o crescimento das raízes, outro aspecto a ser destacado é a capacidade
destas plantas detoxificarem L-DOPA. Estas respostas protetoras ao L-DOPA são consideradas
como resultantes da sua oxidação. Durante este processo, L-DOPA pode ser descarboxilado
formando dopamina, pela ação da L-DOPA descarboxilase, ou formando 3-O-metildopa pela
ação da catecol-O-metiltransferase (Often et al., 2001).
L-DOPA tem despertado muita atenção devido sua ação preventiva contra a doença de
Parkinson, caracterizado pela deficiência na síntese do neurotransmissor dopamina, nas células
nervosas. L-DOPA é descarboxilado a dopamina quando entra nas células nervosas. Vered et al
(1994) relataram que o conteúdo de L-DOPA nas plântulas de Vicia faba é alto. A injeção do
extrato destas plântulas em ratos aumentou o conteúdo de dopamina no cérebro e a excreção pela
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urina de L-DOPA, dopamina e seus metabólitos de maneira similar àquela observada após a
administração de L-DOPA na sua forma sintética.
O estresse ambiental é fator limitante à produtividade vegetal e ao rendimento das
colheitas. Muitos dos processos deletérios sofridos por plantas submetidas às condições adversas
são mediados por espécies reativas de oxigênio (EROs) como peróxido de hidrogênio (H2O2),
ânion superóxido (•O2) e radicais hidroxil (•OH) e perhidroxil (•O2H) geradas em diferentes
compartimentos celulares como consequência do funcionamento inadequado das vias
metabólicas e em processos fisiológicos normais (Allen, 1995; Apel e Hirt, 2004). Estas
moléculas reativas, especialmente •OH, são altamente destrutivas para lipídios, ácidos nucléicos
e proteínas podendo ocasionar a morte celular. De um modo geral tem sido aceito que EROs, ao
lado de outros mediadores como o Ca2+, atuam como mensageiros secundários nas respostas aos
estresses bióticos e abióticos e na sinalização hormonal. Neste cenário, H2O2, que é
relativamente estável e difusível através das membranas, é reconhecido atualmente como uma
molécula sinalizadora, atuando em diversas respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares,
tanto em nível celular como da planta inteira. Assim, a adição de H2O2 ou a sua produção
experimental em tecidos vegetais tem demonstrado que esta espécie química atua como sinal
indutor da expressão gênica de diversas proteínas, entre elas, enzimas antioxidativas. Outro
aspecto não menos importante, é que EROs como •O2 e H2O2 são também requeridas para
lignificação (Buchanan et al., 2000).
Existem vários processos biológicos capazes de provocar reduções eletrônicas gerando
EROs. Todas estas espécies são mais reativas que o O2 e, em conseqüência, mais tóxicos
(Boveris, 1984; Fridovich, 1998). EROs podem se originar nas mitocôndrias, via cadeia
respiratória. A NADH desidrogenase e a ubiquinona, nas formas reduzidas, são capazes de
transferir elétrons ao O2 gerando •O2 (Gardner e Boveris, 1990). Além disso, peroxissomos
vegetais contém várias oxidases capazes de produzir •O2 e H2O2 (Del Rio et al., 1998).
Entretanto, a fonte mais importante de EROs nas plantas é o cloroplasto. Muitos intermediários
da cadeia transportadora de elétrons são encontrados na forma reduzida, o que aumenta o risco
de transferência de elétrons ocasionando a formação de •O2 (Palatnik et al., 2002). Após
sucessivas reações esta espécie química pode gerar significativo número de espécies reativas.
Normalmente, os mecanismos protetores das células (superóxido dismutase, catalase,
peroxidases, por exemplo) podem eliminar estes compostos sem maiores dificuldades. Todavia,
quando estes sistemas de defesa falham, ou quando aumenta anormalmente a produção de EROs,
13
o balanço entre oxidantes e antioxidantes favorece os primeiros e se estabelece a condição
conhecida como estresse oxidativo. Os complexos ferro/enxofre das metaloproteínas, em
particular os centros Fe-S presentes em enzimas como a aconitase e a fumarase, são rapidamente
destruídos por •O2 com inativação das enzimas (Asada, 1999). O H2O2 inibe reversivelmente
várias enzimas do ciclo de fixação do carbono e de outras vias metabólicas pela oxidação de tióis
funcionais, sendo também capaz de ocasionar a peroxidação de lipídios e pigmentos (Dietz,
2003).
Albrecht e Kohlenbach (1990) constataram que L-DOPA é encontrado em quantidades
significativas nos vacúolos de folhas de Vicia faba e o H2O2 formado nos cloroplastos se difunde
para os vacúolos. Peroxidase vacuolar oxida L-DOPA a dopacromo e outros compostos como a
melanina. A oxidação do L-DOPA também tem sido relatada por Takahama (1992) em
protoplastos de células do mesófilo de Vicia faba e em vacúolos isolados dos protoplastos,
quando tratados com H2O2. Peroxidase vacuolar, isolada de folhas de Vicia faba, oxidam DOPA
lentamente (Takahama e Oniki, 1998).
Bem recentemente, Hachinohe e Matsumoto (2005) estudando o metabolismo de L-DOPA em
Echinochloa crus-galli e Lactuca sativa relataram que pode ocorrer formação de EROs durante
a biossíntese de melanina, gerada por uma cascata de autoxidações do L-DOPA. Estas reações
ocorrem sem catálise enzimática, mas a taxa é aumentada na presença de concentrações traços de
íons metálicos (Fe3+ e Cu2+). A perda de um elétron de L-DOPA produz o radical semiquinona
DOPA-SQ-. Este pode ser oxidado para dopaquinona (DOPA-Q) que é um intermediário da via
de oxidação de L-DOPA (O’Brien, 1991; Bolton et al., 2000). Este processo pode ocorrer pela
transferência de elétrons a íon metálico com propriedade redox adequada, O2 molecular ou
outros aceptores de elétrons como o peróxido de hidrogênio (Beyer, 1992). DOPA-Q também
pode ser gerado pela perda direta de dois elétrons de L-DOPA através de reação enzimática.
Nesse caminho tem sido proposto que a oxidação do L-DOPA pode resultar em danos a
outras moléculas através de reações diretas ou indiretas (O’Brien, 1991; Bolton et al., 2000).
DOPA-SQ• pode transferir elétrons para outras moléculas, ou retirar átomos de hidrogênio.
Danos indiretos podem ocorrer pela produção de EROs, via redução direta de peróxidos ou via
redução de O2 molecular para radicais superóxidos (•O2) e subsequente dismutação destas
espécies para H2O2; na presença de alguns íons metais de transição, H2O2 pode formar radicais
HO•. DOPA-Q pode ser oxidado e os produtos deste processo são compostos indólicos, que
podem sofrer reações posteriores formando melanina. Em adição, a taxa de oxidação de L-
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DOPA é marcadamente dependente do pH. Em pH ácido L-DOPA é relativamente estável; em
pH fisiológico a oxidação ocorre em poucas horas enquanto que em solução básica a oxidação é
muito rápida (Pattison et al., 2002).
Outros estudos têm mostrado que a incubação de L-DOPA, ou dos seus produtos de
oxidação, com proteínas (por exemplo, creatina quinase) na presença de Fe3+ pode resultar na
geração de ambos DOPA-SQ• e radicais sobre a proteína alvo. A formação de radicais pode
ocorrer via múltiplos mecanismos incluindo átomos de hidrogênio retirados direto da proteína
por DOPA SQ-. Como resultado há formação de •OH e subsequente ataque desta espécie sobre a
proteína, podendo levar à inibição enzimática (Pattison et al., 2002). A inativação mediada por
oxidação direta de grupos SH no sítio ativo da enzima por DOPA-SQ• foi proposta por Takasaki
e Kawakishi (1997). Estes autores revelaram que os produtos de oxidação do L-DOPA, como
dopaquinona, se ligam aos grupos SH de proteínas (cisteína) formando 5-S-cisteinildopa.
Dopaquinona é um intermediário altamente reativo e na ausência de compostos SH sofre
ciclização eventualmente direcionada para a formação de melanina.
Pattison et al. (2002) relataram que a incubação de Fe3+ (ou Cu2+) unido a ADP com LDOPA na presença de DNA plasmídio, resulta na formação de uma forma circular relaxada
como resultado da quebra da fita simples, com grandes danos resultantes do aumento das
concentrações de ADP-Fe3+ e L-DOPA. Os problemas observados foram amenizados pela adição
de catalase e manitol, que diminuem os níveis de H2O2 e de •OH nas células. Interações de
DOPA com Mn2+, Ni2+ e Co2+ na presença de DNA foram investigadas, porém, sem a
constatação de qualquer dano, o que tem sugerido que isto possa ser decorrente da ausência de
radicais •OH, eventualmente produzidos.
Vários estudos têm constatado que a citotoxicidade do L-DOPA, nas células animais, é
atribuída às EROs geradas durante sua oxidação para melanina. Em células de neuroblastoma,
Lai e Yu (1997) demonstraram correlação entre a citotoxicidade de L-DOPA e a formação de
melanina. As células sofreram danos oxidativos causados por EROs que romperam a integridade
da membrana plasmática resultando na redução do crescimento ou morte celular. Mena et al.
(1997) relataram que a incubação de L-DOPA e neurônios pós-natais de camundongos, contendo
superóxido dismutase mutada, causou morte celular. Estes autores sugerem que a enzima mutada
aumenta a formação de radicais livres, sujeitando a célula ao estresse oxidativo, o qual pode
eventualmente desencadear a morte celular.
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Os danos oxidativos do L-DOPA em plantas, avaliados pela quantificação da peroxidação
lipídica nas membranas celulares de Echinochloa crus-galli, Lactuca sativa e Daucus carota
foram estimados por Hachinohe e Matsumoto (2005). Os níveis de peróxidos lipídicos foram
maiores em comparação com experimentos controles, sugerindo o envolvimento de EROs num
mecanismo similar às células animais. Os efeitos citotóxicos descritos foram completamente
reduzidos por antioxidantes (ácido ascórbico e α-tocoferol) ou enzimas (catalase e superóxido
dismutase).
A via dos fenilpropenóides
A presença da parede celular, acima de todas as outras características, distingue as células
vegetais das células animais. Ela contém uma variedade de enzimas, além de desempenhar papel
importante na absorção, transporte e secreção de substâncias e de atuar na defesa do vegetal
contra agentes patogênicos como bactérias ou fungos (Buchanan et al., 2000). Depois da
celulose, o polímero mais abundante das paredes celulares é a lignina, sendo que sua
incorporação na parede celular ocasiona rigidez estrutural e resistência dos tecidos das plantas
(Polle et al., 1994). Isto se dá devido ao mecanismo de espessamento que diminui a
extensibilidade da parede celular em decorrência da formação de pontes difenil entre polímeros
da parede, por ação da peroxidases (Sánchez et al., 1996). Muito do que se sabe a respeito da
lignificação nas plantas se deve aos estudos de enzimas envolvidas neste processo,
principalmente peroxidases, solúveis e ligadas à parede celular, catalase, fenilalanina amônia
liase (PAL), cinamil álcool desidrogenase (CAD), além de outras (Abreu, 1994).
Lignina é um polímero formado a partir de monômeros de álcool cinamílico sendo que
ocorrem variações nos seus tipos, dependendo de onde esta foi sintetizada. Nas gimnospermas, a
lignina é composta principalmente de unidades de álcool coniferílico, e nas angiospermas,
apresenta polímeros onde há igual proporção de unidades de álcoois coniferílico e sinapílico.
Existe ainda, uma pequena porção de álcool p-cumarílico em ambos os tipos de lignina. As
ligações intermoleculares que formam estes polímeros também são bastante complexas, sendo
que se atribui às ligações denominadas de pontes difenil a rigidez característica das paredes
celulares durante sua maturação (Whethen et al., 1998).
Existem várias enzimas envolvidas na síntese de lignina, sendo a sequência metabólica
que conduz a esse processo conhecida como via de fenilpropenóides. A primeira reação da via é
16
catalisada pela PAL, que converte L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico. Este, apesar de não
ser ainda um composto fenólico, é precursor imediato dos mesmos (Jones, 1984). Outra etapa na
via de síntese de fenilpropenóides, de grande importância no desenvolvimento de plantas é a que
gera fenólicos precursores para síntese e deposição de lignina na parede celular. Os precursores
são relatados por Hahlbrock e Schell (1989), como sendo monômeros de álcoois cinamílicos
hidroxilados e metoxilados que são sintetizados em dois passos pela cinamil álcool-CoA
redutase (CCR) e cinamil álcool desidrogenase (CAD). Esta última atua na síntese de álcoois
cinamílicos, dos seus correspondentes cinamaldeídos, e é considerada, por sua alta
especificidade, como marcadora do processo de lignificação. Ao final da via de fenilpropenóides,
precursores monoméricos de lignina são enzimaticamente desidrogenados a radicais fenóxidos
por peroxidases. Estes radicais se polimerizam espontaneamente, gerando complexas ligações
rígidas entre proteínas, ligninas e polissacarídeos (Polle et al., 1994). Peroxidases têm sido
implicadas nessas ligações cruzadas pelo fato de terem sido localizadas nas paredes celulares de
tecidos lignificantes. A presença da peroxidase (aniônica e catiônica) ligada à parede celular
pode estar relacionada às isoenzimas com altas afinidades com essa parte da célula. Deste modo,
acredita-se que peroxidase ligada à parede celular, em especial a catiônica, têm grande afinidade
por precursores de lignina. Os citados autores verificaram que, em hipocótilos de abeto (Picea
abies L.), em processo de lignificação, peroxidase catiônica estava localizada no xilema durante
o espessamento secundário. Ao mesmo tempo, enzimas envolvidas na síntese de
fenilpropenóides, como PAL e cinamato 4-hidrolase, foram localizadas no citosol e vesículas de
Golgi, respectivamente, pressupondo-se co-regulação durante a síntese de lignina. A lignificação
por peroxidases requer H2O2 como co-substrato. Aumento na produção de H2O2 leva ao aumento
da atividade da peroxidase ligada à parede celular e aumento na síntese de dímeros de ácidos
fenólicos. A formação desses dímeros e a ativação da síntese de lignina na parede celular
aumentam a rigidez desta ocasionando a inibição do crescimento das raízes (Ishii, 1998; Santos
et al., 2004).
L-DOPA e fenilpropenóides: os objetivos
Como se notou a via de fenilpropenóides é de fundamental importância para o
desenvolvimento das plantas, em especial nos estádios iniciais do crescimento das raízes. Por ela
são produzidos compostos fenólicos com ampla variedade de funções, com destaque ao processo
17
de lignificação. Como visto anteriormente, os efeitos do L-DOPA no processo de lignificação
das raízes não têm sido descritos na literatura especializada.
Levando em conta as informações descritas é que o presente trabalho está sendo
apresentado. As questões fundamentais que se pretendeu responder foram: 1. as enzimas da via
de fenilpropenóides, especialmente aquelas relacionadas à lignificação, seriam afetadas, nas
raízes de soja, por níveis crescentes de L-DOPA? e 2. as possíveis alterações enzimáticas
causadas pelo L-DOPA comprometeriam o crescimento das raízes de soja?
L-DOPA
L-DOPA
Fig. 2 Visão geral do suposto modo de ação do L-DOPA nas raízes de soja.
18
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25
L-DOPA INCREASES LIGNIFICATION
ASSOCIATED TO Glycine max ROOT GROWTH-INHIBITION
ANDERSON RICARDO SOARES; MARIA DE LOURDES LUCIO FERRARESE; RITA DE
CÁSSIA SIQUEIRA; FRANCIELE MARA LUCCA ZANARDO BÖHM AND OSVALDO
FERRARESE-FILHO
Correspondence to:
Maria de Lourdes Lucio Ferrarese
Laboratory of Plant Biochemistry
Department of Biochemistry
State University of Maringá
Av. Colombo, 5790
87020-900, Maringá, PR
BRAZIL
E-mail: [email protected]
Fax: +55 44 2633655
26
L-DOPA INCREASES LIGNIFICATION
ASSOCIATED TO Glycine max ROOT GROWTH-INHIBITION
ANDERSON RICARDO SOARES; MARIA DE LOURDES LUCIO FERRARESE∗; RITA DE
CÁSSIA SIQUEIRA; FRANCIELE MARA LUCCA ZANARDO BÖHM AND OSVALDO
FERRARESE-FILHO
Laboratory of Plant Biochemistry, Department of Biochemistry,
State University of Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brazil
Abstract – L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine), an allelochemical exuded from the roots
of velvet bean (Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis) displays a high inhibitory action to plant
growth. L-DOPA´s effects on phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5) and peroxidase
(POD, EC 1.11.1.7) activities, phenolic compounds and lignin contents in soybean (Glycine max
(L.) Merr.) roots were investigated to determine its possible phytotoxic mechanism. Three-dayold seedlings were cultivated in half-strength Hoagland nutrient solution (pH 6.0), without or
with 0.1 to 1.0 mM L-DOPA, in a growth chamber (25°C, 12L:12D photoperiod, irradiance of
280 µmol m-2 s-1) for 24 hr. In general, length, fresh weight and dry weight of roots decreased,
while PAL and POD activities, phenolic compounds and lignin contents increased after L-DOPA
treatments. Data indicate the susceptibility of soybean to L-DOPA and reinforce the role of this
non-proteic amino acid as a strong allelochemical. Results also suggest that L-DOPA-induced
inhibition in soybean roots may be due to a cell wall stiffening process related to the formation
of cross-linking between cell wall polymers linked to lignin production.
Key Words – Allelopathy, L-DOPA, lignin, peroxidase, phenolic compounds, phenylalanine
ammonia-lyase, root growth, soybean.
∗
To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]
27
INTRODUCTION
For years it has been known that plants release organic compounds into the environment from
their aerial or sub-aerial parts as exudates, volatiles, and/or decomposition residues. These
compounds may accumulate in the soil environment and affect the growth and development of
neighboring plants, an interaction called allelopathy (Einhellig, 1995). Velvet bean (Mucuna
pruriens (L.) DC. var. utilis) is one of these plant species which has been long cultivated tropical
regions as soil-improving crop, as cover crop to control weeds, and as green manure and forage
plant (Anaya et al., 1999; Tarawali et al., 1999; Vargas-Ayala et al., 2000).
Using in vitro bioassays and field studies, Fujii et al. (1991) identified secondary chemical
agents produced and released by leaves and roots of Mucuna. The main phytotoxic compound
encountered was the non-protein amino acid L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), which
represented about 1% of the fresh tissues. L-DOPA exudes from the Mucuna roots to soils
(Furubayashi et al., 2005) and its concentrations may reach 1 ppm in water culture solution and
50 ppm in the vicinity of roots (Anaya et al., 1999). This concentration is enough to affect the
growth of neighboring plants. It reduces seed germination and suppresses root growth more than
shoots of different plant species (Fujii et al., 1991; Fujii, 1999; Nakajima et al., 1999; Nishihara
et al., 2004; Hachinohe et al., 2004; Nishihara et al., 2005). L-DOPA´s physiological mechanism
in plants, however, is poorly understood. In animals L-DOPA is a well-known precursor of the
neurotransmitter dopamine and the most effective therapeutic agent for the symptomatic relief of
Parkinson’s disease (Mercuri and Bernardi, 2005). In plants L-DOPA is a precursor of many
alkaloids, catecholamines, flavonoids, melanin and phenylpropenoids (Hahlbrock and Scheel,
1989).
The phenylpropenoid pathway is one of the most important metabolic pathways since it
synthesizes phenolic compounds and a wide range of secondary products in plants, including
lignin. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is regarded as the primary enzyme of the
phenylpropenoid biosynthetic pathway, wheareas peroxidase (POD) within the cell wall, in
either the free or bound state, has been shown to be associated with monolignol polymerization
and, therefore, in lignin synthesis (Passardi et al., 2005). To date, no reports on the effects of
exogenous L-DOPA on soybean roots are available. Due to the important role of lignification in
root growth, the question in current research was whether L-DOPA affects PAL and POD
activities, phenolic compounds and lignin contents of soybean roots.
28
METHODS AND MATERIALS
General Procedures. Soybean (Glycine max (L.) Merr. cv. BRS-133) seeds, surfacesterilized with 2% sodium hypochlorite for 5 min and rinsed extensively with deionized water,
were dark-germinated (at 25°C) on three sheets of moistened filter paper. Twenty-five 3-day-old
seedlings of uniform size were supported on an adjustable acrylic plate and transferred into a
glass container (10 × 16 cm) filled with 200 ml of half-strength Hoagland’s solution (pH 6.0),
without or with 0.1 to 1.0 mM L-DOPA. The container was kept in a growth chamber (25°C,
12L:12D photoperiod, irradiance of 280 µmol m-2 s-1). Roots were measured at the start and at
the end of experiments (24 hr). Fresh root weight was determined immediately after incubation
and dry weight estimated after oven-drying at 80°C, for 24 hr. L-DOPA was purchased from
Sigma Chemical Co. (St Louis, USA) and all other reagents used were of the purest grade
available or chromatographic grade.
Enzymatic Assays. After incubation, all treated or untreated seedling roots were detached
and enzymes were extracted. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) was extracted, as described
by Ferrarese at al. (2000). Fresh roots (2 g) were ground at 4ºC in 0.1 M sodium borate buffer
(pH 8.8). Homogenates were centrifuged (2,200g, 15 min) and the supernatant was used as the
enzyme preparation. The reaction mixture (100 µmoles sodium borate buffer, pH 8.7, and a
suitable amount of enzyme extract in a final volume of 1.5 ml) was incubated at 40°C, for 5 min,
for PAL activity assay. Fifteen µmoles of L-phenylalanine were added to start the reaction which
was stopped after 1 hr of incubation by the addition of 50 µl 5 N HCl. Samples were filtered
through a 0.45 µm disposable syringe filter and analyzed (20 µl) with a Shimadzu® Liquid
Chromatograph (Tokyo, Japan) equipped with a LC-10AD pump, a Rheodine® injector, a SPD10A UV detector, a CBM-101 Communications Bus Module, and a Class-CR10 workstation
system. A reversed-phase Shimpack® GLC-ODS (M) column (150 × 4.6 mm, 5 µm) was used at
room temperature, with an equivalent pre-column (10 × 4.6 mm). The mobile phase was
methanol:water (70%:30%) with a flow rate of 0.5 ml min-1. Absorption was measured at 275
nm. Data collection and integration were performed with Class-CR10 software (Shimadzu®,
Tokyo, Japan). t-Cinnamate, the product of PAL, was identified by comparing its retention time
with that of standard’s. Parallel controls without L-phenylalanine or with t-cinnamate (added as
internal standard in the reaction mixture) were made as described elsewhere (Ferrarese et al.,
2000). PAL activity was expressed as µmol t-cinnamate hr-1 g-1 of fresh weight.
29
Peroxidase (POD) was extracted from fresh roots (0.5 g) with 67 mM phosphate buffer (5
ml, pH 7.0). Extract was centrifuged (2,200g, 5 min, 4°C), and the supernatant was used to
determine the activity of soluble POD. For cell wall-bound POD isolation, the pellet was washed
with deionized water until no soluble POD activity was detected in the supernatant. Pellet was
then incubated in 1 M NaCl (2 ml, 1 hr, 4°C), and the homogenate was centrifuged (2,200g, 5
min). The supernatant contained the cell wall-(ionically)-bound POD. Guaiacol-dependent
activities of the soluble and cell wall-bound POD were determined according to Cakmak and
Horst (1991), with slight modifications. The reaction mixture (3 ml) contained 25 mM sodium
phosphate buffer, pH 6.8, 2.58 mM guaiacol and 10 mM H2O2. Reaction started by adding the
enzyme extract in phosphate buffer. Guaiacol oxidation was followed for 5 min, at 470 nm, and
enzyme activity was calculated from the extinction coefficient (25.5 mM-1 cm-1) for
tetraguaiacol. Blank consisted of a reaction mixture without enzyme extract whose absorbance
was subtracted from the mixture with enzyme extract. POD activities were expressed as µmol
tetraguaiacol min-1 g-1 fresh weight.
Extraction and quantification of L-DOPA in roots. Exogenous L-DOPA-treated roots (0.1 g
dry weight) were put into 5 ml of deionized water in 30 ml polypropylene tubes. Extraction was
performed by immersing the tubes into a sonication bath for 5 min (St-Laurent et al., 2002).
Extracts were then centrifuged at 2,200g for 2 min and diluted (1:1) in the chromatographic
mobile phase containing water:methanol:phosphoric acid (97.5:2:0.1). The solution was filtered
through 0.45 µm disposable syringe filter and analyzed (20 µl) with a Shimadzu® Liquid
Chromatograph (Tokyo, Japan), as described earlier. A reversed-phase Shimpack® GLC-ODS
(M) column (150 × 4.6 mm, 5 µm) was used, at room temperature, with an equivalent pre-
column (10 × 4.6 mm). The mobile phase was applied with a flow rate of 0.5 ml min-1.
Absorption was measured at 280 nm. Data collection and integration were performed with ClassCR10 software (Shimadzu®, Tokyo, Japan). L-DOPA was identified by comparing its retention
time with that of standard’s. L-DOPA content was expressed as mg g-1 of dry weight.
Phenolic Compounds Quantification. Dry root (0.25 g) was boiled for 30 min in 5 ml of 2 N
HCl. After cooling, the homogenate was filtered through a Whatman® paper and the filtrate used
to determine total phenolic compounds. Samples (5 ml) were mixed with 0.75 ml of 1.9 M
Na2CO3 plus 0.25 ml of Folin-Ciocalteau phenol reagent. This mixture was kept in the dark, at
room temperature (23 ºC - 25 ºC), for 1 hr, before its absorption was read at 750 nm (Blum et al.,
1991). Ferulic acid was used as standard. Since L-DOPA absorbed by the roots might to
30
overestimate results, data obtained by HPLC (described earlier) were subtracted from total
phenolics. Results were expressed as mg total phenolics g-1 dry weight.
Lignin Quantification. After the incubation period, dry roots (0.3 g) were homogenized in
50 mM potassium phosphate buffer (7 ml, pH 7.0) with mortar and pestle, and transferred into a
centrifuge tube (Ferrarese et al., 2002). The pellet was centrifuged (1,400g, 4 min) and washed
by successive stirring and centrifugation, as follows: twice with phosphate buffer pH 7.0 (7 ml);
× 3 with 1% (v/v) Triton® X-100 in pH 7.0 buffer (7 ml); × 2 with 1 M NaCl in pH 7.0 buffer (7
ml); × 2 with distilled water (7 ml); and × 2 with acetone (5 ml). Pellet was dried in an oven
(60°C, 24 hr) and cooled down in a vacuum desiccator. The dry matter obtained was defined as
protein-free cell wall fraction. Further, all dry protein-free tissue was placed into a screw-cap
centrifuge tube containing the reaction mixture (1.2 ml of thioglycolic acid plus 6 ml of 2 M
HCl) and heated (95ºC, 4 hr). After cooling at room temperature, the sample was centrifuged
(1,400g, 5 min) and the supernatant decanted. The pellet was washed × 3 with distilled water (7
ml) and the product extracted by shaking (30ºC, 18 hr, 115 oscillations min-1) in 0.5 M NaOH (6
ml). After centrifugation (1,400g, 5 min), the supernatant was stored and mixed with supernatant
obtained from a second pellet washed with 0.5 M NaOH (3 ml). The combined alkali extracts
were acidified with concentrated HCl (1.8 ml). The lignothioglycolic acid (LTGA), formed after
4 hr at 0ºC was recovered by centrifugation (1,400g, 5 min) and washed × 2 with distilled water
(7 ml). The pellet was dried at 60°C, dissolved in 0.5 M NaOH, and diluted to yield an
appropriate absorbance for spectrophotometric determination at 280 nm. Lignin was expressed
as mg LTGA g-1 dry weight.
Statistical Design. The experimental design was completely randomized and each plot was
represented by one glass container with twenty-five seedlings. Data are expressed as mean of
three to six independent experiments ± S.E. Significance of differences was undertaken by oneway variance analysis with GraphPad Prism package (Version 2.0, GraphPad Software Inc.,
USA, 1995). Difference between parameters was evaluated by Dunnett´s multiple comparison
test and P values <0.05 were considered statistically significant.
31
RESULTS
To detect absorption of L-DOPA, soybean roots were incubated with this compound (0.1 to
1.0 mM) for 24 hr. Figure 1 shows that L-DOPA has been progressively absorbed by the roots.
After exogenous 0.1 mM treatment, L-DOPA content determined in the roots reached 0.099 mg
g-1 dry weight while, at 1.0 mM, this content amounted to 0.306 mg g-1 dry weight.
Root lengths and root fresh and dry weights decreased with increasing concentrations in
soybean seedlings grown during short-term exposure (24 hr) in nutrient solution containing LDOPA (Table 1). Mean total root lengths were 20.9, 72.5 and 76.7% less than controls for 0.25,
0.5 and 1.0 mM treatments, respectively. Low concentration (0.1 mM) did not impair root
length. Root fresh weight decreased 11.2 and 14.3% at 0.5 and 1.0 mM treatments, respectively,
when compared to control. A similar behavior was also evident in root dry weights determined
as 16.1 and 14.9% less than those of controls with 0.5 and 1.0 mM L-DOPA. No appreciable
changes in fresh and dry weights of roots exposed to L-DOPA at low concentrations (≤ 0.25
mM) were recorded.
L-DOPA-affected PAL activities were significantly different from controls (Figure 2). The
allelochemical increased the enzymatic activities from 82% to 106% after 0.25 to 1.0 mM
treatments. No significant change was observed in PAL activity after 0.1 mM L-DOPA
exposure. Soluble POD activities (Figure 3A) increased around 39% and cell wall-bound POD
activities (Figure 3B) increased around 31% regardless of L-DOPA concentrations, when
compared to control conditions.
Phenolic compound content was significantly increased from 86% (at 0.1 mM) to 150% (at
1.0 mM) when compared to untreated roots (Figure 4). Finally, data revealed that the lignin
content increased around 56% from 0.25 to 1.0 mM L-DOPA, while no change was recorded at
0.1 mM treatment when compared to untreated roots (Figure 5).
DISCUSSION
The main fact revealed in current research is that root growth (length and weight) decreased
(Table 1) after L-DOPA absorption (Fig. 1), while PAL and POD activities and phenolic
compounds and lignin contents increased (Fig. 2 to 5).
32
Reduction of root growth by L-DOPA has been reported in several plant species. Nishihara
et al. (2004) used a treatment of 250 µg/ml (about 1.27 mM) and showed that L-DOPA strongly
inhibited (<25% of control) root growth of cabbage (Brassica oleraceae), komatsuna (Brassica
campestris), qing gin cai (Brassica chinensis), baby blue eyes (Nemophila menziesii), watercress
(Nasturtium officinale), pumpkin (Cucurbita moschata), lettuce (Lactuca sativa) and cucumber
(Cucumis sativus). However, tall fescue (Festuca arundinacea), perennial ryegrass (Lolium
perenne), creeping bentgrass (Agrostis palustris), red clover (Trifolium pratense), milk vetch
(Astragalus sinicus), hairy vetch (Vicia villosa) and corn (Zea mays) were less inhibited (>75%
of control) and suggested a possible resistance to L-DOPA. The effect of L-DOPA (0.01 or 0.1
mM) on root growth of 32 species was examined at the germination stage (Hachinohe et al.,
2004). Root growth was <50% at the control value for 7 or 19 of the species treated with 0.01 or
0.1 mM L-DOPA, respectively. Barnyard grass (Echinochloa crus-galli) was more tolerant than
lettuce, one of the most susceptible (about 80% of inhibition by 0.1 mM L-DOPA). Since LDOPA reduced the soybean root growth and fresh and dry weights (Table 1), its susceptibility
was indicated and the amino acid’s role as a strong allelochemical was reinforced.
Investigations about absorption of L-DOPA in plant species are scanty. Using 14C-L-DOPA,
Hachinohe et al. (2004) reported that this compound was largely absorbed and metabolized by
roots of barnyard grass and lettuce. The authors verified that metabolites (dopamine,
phenylalanine and tyrosine) derived from
14
C-L-DOPA are not directly involved in L-DOPA
phytotoxicity. Since results reported in the present work indicate that L-DOPA has been
effectively absorbed by soybean roots (Fig. 1), reduction of root growth by L-DOPA, verified
after 24 hr treatments (Table 1), may be, at least partly, due to this active form in the roots.
The discovery that L-DOPA stimulated the lignin production (Fig. 5) is of particular
interest. Reduction of seedling roots has been associated with premature allelochemical-induced
lignification of the cell walls accompanied by increases in phenolic compounds and PAL and
POD activities (Devi and Prasad, 1996; Politycka, 1999: Herrig et al., 2002; Santos et al., 2004).
PAL is regarded as the entry enzyme into the phenylpropenoid pathway responsible for the
synthesis of a diverse array of phenolic metabolites, whereas structural lignin has been reported
to be a response of plants against allelopathic stress. PAL participates in maize (Devi and Prasad,
1996), cucumber (Politycka, 1999) and soybean (Herrig et al., 2002; Santos et al., 2004) root
growth reductions, under stress of cinnamic and benzoic acids derivatives, in association with
cell wall stiffening related to the formation of cross-linking among cell wall polymers and lignin
33
production. Likewise, higher activities of PAL (Fig. 2) in soybean root tissues were accompanied
by increase in phenolic compounds contents (Fig. 4) after L-DOPA treatments.
Phenolic compounds play a vital role in plant growth, regulation and are mainly produced to
protect plants from abiotic and biotic stresses. They are known for their anti-oxidative properties
scavenging free radicals (Appel, 1993). Phenolic compounds are derived originally by enzymatic
deamination of phenylalanine and tyrosine via nitrogen-free skeletons of cinnamate or pcoumarate. Once formed, the latter compound is converted, whitin the phenylpropanoid
metabolism, into a broad range of secondary metabolites, such as caffeic, ferulic and sinapic
acids and, further, lignin (Boerjan et al., 2003). PAL and POD are involved in this pathway and
the production of phenolic compounds has been often observed when levels of phenylpropenoid
pathway intermediates or end products are artificially increased. Stress caused by addition of
exogenous allelochemicals (ferulic and vanillic acids) in soybean stimulated the accumulation of
phenolic compounds and lignin (Herrig et al., 2002; Santos et al., 2004).
As mentioned earlier, L-DOPA is a precursor of phenylpropenoids. It has been shown that
L-DOPA-treated roots of cucumber accumulated phenylalanine and tyrosine supposedly due to
its metabolic detoxification (Nakajima et al., 1999). Dopamine (product of enzymatic
decarboxylation of L-DOPA), tyrosine (substrate of tyrosine decarboxylase to form dopamine)
and phenylalanine (substrate of PAL in the first reaction of phenylpropenoid pathway) failed to
increase in lettuce roots after exogenous L-DOPA treatments (Hachinohe et al., 2004). In the
authors’ opinion, these metabolites are not directly involved in the phytotoxicity of L-DOPA
since they may be further metabolized into other compounds. Like lettuce, soybean is susceptible
to L-DOPA (Table 1) and an accumulation of phenylalanine and tyrosine may not occur because
they are precursors of phenylpropenoids and lignin. It seems that these facts may explain results
obtained for PAL (Fig. 2) and phenolic compounds (Fig. 4) reported in this study.
Increased activities of soluble POD induced by L-DOPA treatment (Fig. 2A) are consistent
with the role of this enzyme in plants. It has been frequently emphasized that one of the most
accepted functions for soluble POD is to catalyze the breakdown of H2O2, with the concomitant
dependent oxidation of a wide variety of substrates (Bolwell and Wojtaszek, 1997; Passardi et
al., 2005). Therefore, it is often regarded as an antioxidant enzyme, protecting cells from the
destructive influence of reactive oxygen species (ROS). Under normal circumstances, plants
scavenge ROS by invoking this enzymatic defensive system. However, if the capacity of the
cells to scavenger ROS is exceeded, the phenolic substrates oxidation by soluble POD produces
34
quinones which cause oxidative stress (Appel, 1993). The final consequence may be the
depolarization of the root cell membrane enhancing its permeability with electrolyte leakage,
blocking the plant nutrient uptake and hindering the root growth (Einhellig, 1995).
Another relevant fact is that POD mediates the oxidation of L-DOPA to form dopaquinone
and, further, melanin (Albrecht and Kohlenbach, 1990; Takahama and Egashira, 1991). Melanin
biosynthesis is linked to production of ROS (1O2, O2, HO● and H2O2) or other L-DOPA
oxidation products, such as semiquinone radicals, quinones and metal ion-L-DOPA complexes
(Kruk et al., 1999; Pattison et al., 2002). The toxicity of L-DOPA in animals has been attributed
to its auto-oxidative breakdown in the presence of molecular oxygen. Highly unstable
electrophilic L-DOPA-quinones are formed which may induce oxidative damage (Bindoli et al.,
1992). Hachinohe and Matsumoto (2005) have recently reported that L-DOPA increased the
levels of melanin and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in lettuce, which suggests
that this action was due to ROS released during melanin synthesis. Although low temperature at
flowering leads to the formation of a melanin-like compound in soybean seed coats (Takahashi
and Akiyama, 1993), it is not possible to state with surety that melanin is synthesized in soybean
roots. Since soybean radicle becomes light brown or black after 0.1 and 1.0 mM L-DOPA
treatments, respectively, it is plausible that increase in soluble POD activities (Fig. 3A) may be
due to oxidation of L-DOPA and, presumably, to melanin formation.
L-DOPA also increased the cell wall-bound POD activities (Fig. 3B). There are longstanding evidences that this enzymatic form causes oxidative polymerization of monolignols
from phenolic compounds, such as ferulic, p-coumaric and caffeic acids. This process appears to
need oxidative coupling, dependent on H2O2, which causes a rapid cross-linking of cell wall
polymers. H2O2 may act as a signaling molecule triggering secondary defenses which may cause
an untimely cell wall lignification, thereby, decreasing cellular viability and resulting in growth
reduction (Passardi et al., 2005). If cell wall-bound POD regulates cell wall stiffening and lignin
polymerization, there must be a sufficient supply of H2O2. As mentioned earlier, this relatively
stable form of ROS may be formed during oxidative transformation of L-DOPA into melanin
(Kruk et al., 1999). Other emerging evidences suggest that H2O2 may be also produced by pH
dependent cell wall POD and by NADPH oxidase complex (Bolwell and Wojtaszek, 1997) or its
levels may be regulated by the POD´s peroxidative cycle (Passardi et al., 2005).
It has become clear from this study that L-DOPA treatment of soybean seedlings resulted in
an increase of PAL activity producing phenolic compounds. Further, H2O2-dependent POD
35
reactions convert phenolic substances into phenoxyl radicals which may produce lignin
monomers. These monomers form a complex network that solidifies the plant cell and
subsequently restrict the root growth. According to the results of current research, it is probable
that L-DOPA-induced inhibition in soybean roots may be due to a cell wall stiffening process
related to the formation of cross-linking among cell wall polymers and lignin production. If this
is the L-DOPA´s working mode, the cell wall may be a site for allelopathic action and indicate
how the compound affects the growth of plant species. One may ask whether these effects have
been exclusively due to L-DOPA itself or to products of its metabolism. Notwithstanding the fact
that L-DOPA has been absorbed by roots (Fig. 1), its metabolism has not explored in soybean
seedlings. However, Hachinohe and Matsumoto (2005) evaluated the L-DOPA metabolism in
other plant species and suggested that its phytoxicity is due to metabolism and not to its
absorption. Therefore, the possibility cannot be discarded that data reported here are results of LDOPA-induced oxidative stress due to ROS released during its transformation into melanin
and/or due to its auto-oxidative breakdown. Further studies are required to elucidate L-DOPA
metabolism in soybean roots and to identify ROS generated during this pathway. This is the
challenge of a new study in progress.
Acknowledgements – Research was financially supported by the Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O. Ferrarese-Filho and M.L.L. Ferrarese are
research fellow of CNPq. A.R. Soares is the recipient of a CNPq fellowship. The authors kindly
thank Aparecida M. D. Ramos and Gisele A. Bubna for their technical assistance.
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39
L-DOPA in root (mg g-1 dry weight)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.1
0.25
0.5
1.0
L-DOPA (mM) in nutrient solution
FIG. 1. L-DOPA contents in roots treated exogenously with L-DOPA (0.1 to 1.0 mM) after 24 hr
(N = 3 ± SE).
40
TABLE 1. CHANGES IN ROOT LENGTH, ROOT FRESH AND DRY WEIGHTS OF
SOYBEAN SEEDLINGS TREATED WITH L-DOPA FOR 24 HR.
L-DOPA
(mM)
0
0.1
0.25
0.5
1.0
ROOT
LENGTH
(cm)
2.15 ± 0.101
2.37 ± 0.222ns
1.70 ± 0.066*
0.59 ± 0.056*
0.50 ± 0.066*
%
20.9
72.5
76.7
FRESH
WEIGHT
(g)
2.58 ± 0.012
2.77 ± 0.024 ns
2.44 ± 0.052 ns
2.29 ± 0.099*
2.21 ± 0.053*
%
11.2
14.3
DRY
WEIGHT
(g)
0.174 ± 0.001
0.192 ± 0.001ns
0.162 ± 0.005ns
0.146 ± 0.009*
0.148 ± 0.003*
%
16.1
14.9
Note. Means (N = 5 ± SE) significantly smaller than the experiment control (Dunnett´s
multiple comparison test) are marked *. ns = not significant at 0.05 level. The symbol %
represents inhibition of statistically significant means when compared to control (0 mM).
41
PAL (µmol hr-1 g-1 fresh weight)
0.5
*
0.4
*
*
0.3
0.2
0.1
0.0
0
0.1
0.25
0.5
1.0
L-DOPA (mM)
FIG. 2. Effects of L-DOPA on phenylalanine ammonia-lyase (PAL). *Values (N = 4 ± SE) differ
statistically (Dunnett´s multiple comparison test) from control (P < 0.05).
42
2.0
A
*
*
*
*
B
*
6
*
*
*
1.5
4
1.0
2
0.5
0
0.0
0
0.1 0.25 0.5 1.0
L-DOPA (mM)
0
Bound POD (µmol min-1 g-1 fresh weight)
Soluble POD (µmol min-1 g-1 fresh weight)
8
0.1 0.25 0.5 1.0
L-DOPA (mM)
FIG. 3. Effects of L-DOPA on soluble (A) and cell wall-bound (B) peroxidases (POD). *Values
(N = 5 ± SE) differ statistically (Dunnett´s multiple comparison test) from control (P < 0.05).
43
Phenolics (mg g-1 dry weight)
35
*
28
*
*
0.25
0.5
*
21
14
7
0
0
0.1
1.0
L-DOPA (mM)
FIG. 4. Effects of L-DOPA on total phenolics contents. *Values (N = 4 ± SE) differ statistically
(Dunnett´s multiple comparison test) from control (P < 0.05).
44
Lignin (mg g-1 dry weight)
25
*
*
*
20
15
*
10
*
5
0
0
0.1
0.25
0.5
1.0
L-DOPA (mM)
FIG. 5. Effects of L-DOPA on lignin contents. *Values (N = 6 ± SE) differ statistically (Dunnett´s
multiple comparison test) from control (P < 0.05).
45