RESUMO
19ªEXPANDIDO
RAIB
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HEPATITE NECRÓTICA INFECCIOSA EM BOVINOS – RELATO DE CASO
S. Miyashiro1, A.F.C. Nassar1, O.S. Souza2
Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal, Av. Cons. Rodrigues Alves,
1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
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RESUMO
Em pesquisa de caso de morte súbita em bovinos de Jaguaruna, SC precedida por quadros de
hemoglobinúria e presença de conteúdo intestinal sanguinolento, foi possível o isolamento de
Clostridium perfringens e detectada a presença de DNA das espécies Clostridium novyi B e C. septicum
por PCR a partir de órgãos de dois animais acometidos, caracterizando quadro de hepatite
necrótica infecciosa desencadeado por alta infestação na região por Fasciola hepatica, que tem sido
controlado através de vacinação com toxóides de Clostridium spp específicos e terapia com nitroxinil.
PALAVRAS-CHAVE: Clostridium novyi B, C. septicum, C. perfringens, hepatite necrótica infecciosa,
bovinos
ABSTRACT
INFECTIOUS NECROTIC HEPATITIS IN BOVINE – A CASE REPORT. It was possible to
isolate Clostridium perfringens and to detect the presence of DNA of C. novyi B and C. septicum by
PCR from tissue samples of four bovines from Jaguaruna, SC, Brazil, that presented sudden
death preceded by hemoglobinuria and the presence of bloody intestinal content, characterizing
an infectious necrotic hepatitis case brought on by the high infestation of the region with Fasciola
hepatica, which has been controlled through vaccination with specific Clostridium spp toxoids and
nitroxinil therapy.
KEY WORDS: C. novyi B, C. septicum, C. perfringens, infectious necrotic hepatitis, bovine.
INTRODUÇÃO
Clostridiose é o nome geral dado a uma variedade
de doenças causada por bactérias desse gênero, que
pode ocorrer em qualquer parte do corpo que ofereça
condições para o seu desenvolvimento com conseqüente produção de toxinas durante sua multiplicação, sendo responsável por grandes perdas para os
produtores (BALDASSI, 2005).
Entre as espécies deste gênero, Clostridium
perfringens é o patógeno mais amplamente distribuído, sendo reconhecido como causa de muitas
doenças no homem e animais. Nos animais, várias
formas de enterite aguda, enterotoxemia fatal,
enterite hemorrágica e morte súbita têm sido relatadas (N IILO, 1980; SILVEIRA et al., 1995). C. septicum
tem distribuição mundial e é encontrado no intestino e solo, acometendo eqüinos, bovinos, ovinos,
suínos e ocasionalmente outros animais, na forma
de edema maligno ou gangrena gasosa (CARTER &
CHENGAPPA, 1991).
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C. novyi e C. haemolyticum estão entre as bactérias
mais sensíveis à presença de O2, além de serem microrganismos fastidiosos no cultivo microbiológico.
Essas espécies são responsáveis por infecções nos
animais domésticos como hemoglobinúria bacilar em
bovinos e hepatite necrótica dos ovinos, sendo o
parasitismo hepático o fator desencadeador da infecção (SMITH & WILLIAMS, 1984). C. haemolyticum não é
abundante no intestino de animais e no solo, causando doença quando há ocorrência de parasitos hepáticos. A infecção por C. haemolyticum está limitada a
bovinos e ovinos, nos quais causa hemoglobinúria
bacilar (CARTER & CHENGAPPA, 1991). C. novyi tipo B
causa a “black disease” ou hepatite necrótica infecciosa em ovinos e, ocasionalmente em bovinos, tendo
distribuição mundial onde há ocorrência de parasitos hepáticos. A via de transmissão destes dois
patógenos é por ingestão, sendo o organismo carreado
ao fígado via hematógena, originando destruição
tecidual local resultante da migração parasitária
hepática, o que provoca a germinação do organismo
Prefeitura de Jaguaruna, Jaguaruna, SC, Brasil.
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levando à produção de toxinas. Essas toxinas produzidas na lesão local são absorvidas pela circulação
sanguínea e, eventualmente causam morte, sendo que
a recuperação raramente ocorre. Congestão intensa
dos vasos sanguíneos pode resultar no escurecimento
da pele e a presença de edema subcutâneo resultante
de falência cardíaca pode ocorrer. Tanto a beta toxina
do tipo B de C. novyi quanto a beta toxina de C.
haemolyticum são uma fosfolipase C, que é letal,
necrotizante e causa lise dos eritrócitos (CARTER &
CHENGAPPA, 1991).
Enquanto o diagnóstico presuntivo das
clostridioses depende dos achados clínicos e patológicos, a confirmação da doença é geralmente dada
pelo isolamento e identificação do organismo, tais
como produção de toxinas e métodos imunológicos
(SASAKI et al., 2002; VANELLI & UZAL, 1996). Entretanto,
esses métodos diagnósticos são demorados e laboriosos (HAMAOKA & TERAKADO, 1994). Amplificação de
ácido nucléico de uma região específica do genoma
bacteriano pela reação da polimerase em cadeia (PCR)
tem sido amplamente utilizada para diagnóstico das
clostridioses (W HELEN & P ERSING , 1996). A
especificidade da PCR e a detecção de pouca quantidade de DNA da bactéria, assim como simplicidade,
rapidez e reprodutibilidade, oferecem vantagem sobre os métodos de cultivo e fenotípicos convencionais
para sua diferenciação (KUHNERT et al., 1996; UZAL et
al., 1997; WARREN et al., 1998; KOJIMA et al., 2001), tendo
sido aplicada na pesquisa de C. septicum, C.
haemolyticum, e C. novyi (SASAKI et al., 2002) a partir de
enriquecimento anaeróbico em meio de carne cozida
(cooked meat medium) de amostras de órgãos de bovinos que morreram subitamente apresentando quadros de hemoglobinúria e conteúdo intestinal sanguinolento.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram investigados dois casos de morte súbita de
novilhas de 2,5 anos com 3 meses de gestação (animal 1) e de 3 anos com 5 meses de gestação (animal 2),
precedidos de hemoglobinúria e presença de conteúdo intestinal sanguinolento ocorridos na região de
Jaguaruna, SC, em propriedade de criação extensiva
de bovinos de corte com 34 animais. Nos 12 meses
anteriores outros 14 animais com idades variadas vieram a óbito com sintomatologia semelhante, e foi relatada alta infestação pelo trematódeo Fasciola hepatica
na região, o que poderia ser o fator desencadeador da
clostridiose em questão.
À necropsia foi observada presença de rim
necrótico, icterícia do tecido subcutâneo, hepatomegalia com áreas de necrose e pontos de calcificação
e fígado friável ao corte.
As amostras (rins e fígados) dos animais acometidos foram maceradas com solução salina estéril e o
sobrenadante inoculado em tubos contendo meio de
carne cozida que logo anteriormente foi aquecido a
100º C por 10min e imediatamente resfriado em água
corrente, e incubados a 37º C por 48h. Dez microlitros
dos meios de enriquecimento foram cultivados em
ágar sangue de carneiro a 5% e incubados a 37º C por
48h em jarra de anaerobiose. Colônias de bactérias
com forma, aspecto, cor e hemólise características foram submetidas à coloração de Gram para determinação morfológica e de parede celular. Os isolados
suspeitos foram submetidos às provas de catalase,
lecitinase, gelatinase, glicose, lactose e coagulação do
leite para identificação do gênero e espécie bacteriana.
A técnica com tiocianato de guanidina (BOOM et
al., 1990) foi aplicada para extração de DNA do
sobrenadante dos tubos com meio de carne cozida.
Um mL de cada tubo foi centrifugado a 13000 x g por
20 minutos, e o sedimento foi ressuspendido em 200
μL de tampão Tris-EDTA anteriormente ao protocolo
de extração. Foram realizadas reações de PCR com
primers desenhados a partir do gene da flagelina (fliC),
descritos por SASAKI et al. (2002), específicos para C.
septicum, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B e C.
haemolyticum que amplificam fragmentos de 294 pb,
343 pb, 427 pb e 694 pb, respectivamente. O primer
forward FlaF (5´AGAATAAACAGAAGCTGGAGAT
G 3´) é comum a todas essas espécies e os primers
FlaseR (5´ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3´),
FlanaR (5´CGC CTA CTT GGA AAG TTA CTC 3´),
FlanbR (5´TTA TGC TAA CTT TAG CTG CGT C 3´) e
FlahaR (5´CTG CTG TAC CTT CTA TGA ACC 3´) são
os primers reverse para C. septicum, C. novyi tipo A,
C. novyi tipo B e C. haemolyticum respectivamente. As
reações para amplificação do DNA foram realizadas separadamente por espécie, num volume total
de 50 μL, com 200 μM de cada dNTP, 5 μL de tampão
1X, 2,5 mM de MgCl2, 30 pmol de cada primer (FlaF e
FlaseR, FlanaR, FlanbR ou FlahaR), 1,25 U Taq
polymerase e 10 μL de DNA. Antes do ciclo de temperaturas, a desnaturação inicial foi realizada a 94º
C por 5min e, ao final, extensão a 72º C por 10min.
Foram realizados trinta ciclos divididos em três fases: desnaturação a 94ºC por 60 segundos,
hibridização a 53º C por 120 segundos e extensão a
72º C por 120 segundos. C. septicum 10518 (Instituto
Biológico), C. novyi tipo A ATCC 19402, C. novyi tipo
B ATCC 25758 e C. haemolyticum ATCC 9650 foram
utilizados como controles positivos da PCR, e uma
alíquota do meio sem DNA bacteriano foi utilizada
como controle negativo. As amplificações foram realizadas em máquina termocicladora Peltier Thermal
Cycler-100 (MJ Research) e a análise dos produtos
amplificados foi realizada por eletroforese em gel de
agarose a 1.3% corado com brometo de etídeo.
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RESULTADOS
O cultivo microbiológico revelou o isolamento de
colônias de C. perfringens em uma amostra renal (rim
do animal 1). Entretanto, na PCR a partir do
sobrenadante do meio cooked meat, essa amostra foi
negativa para C. haemolyticum, C. novyi tipo A, C. novyi
tipo B e C. septicum. As amostras restantes (1 rim e 2
fígados) foram negativas para Clostridium spp no cultivo microbiológico, porém o fígado do animal 1 foi
positivo para C. novyi tipo B na PCR, e as amostras de
fígado e rim do animal 2 foram positivas para C.
septicum, sendo essas amostras negativas para as outras espécies pesquisadas (Fig. 1).
O controle das clostridioses está associado principalmente às medidas de manejo, diagnóstico correto
e imunização dos animais com bacterinas e toxóides
específicos (LOBATO & ALMEIDA, 1997). Então, se o problema continuar apesar da sua aplicação, o diagnóstico pode estar errado.
O presente relato indica a importância da aplicação de técnicas molecular para o diagnóstico das
clostridioses, auxiliando na tomada de medidas preventivas corretas e revelando associação de algumas
espécies que, mesmo não estando diretamente envolvidas no quadro clínico observado, podem ocasionar
agravamento do mesmo ou outros tipos de doença.
Após a intervenção com vacinas comerciais na
propriedade de estudo contendo toxóides das cepas
detectadas tanto por cultivo microbiológico quanto
por PCR, paralelamente ao tratamento contra
fasciolose com nitroxinil, não houve mais nenhum
caso de morte súbita.
REFERÊNCIAS
Fig. 1 - Ilustração de reação de PCR para C. novyi tipo B e
C. septicum. 1: Padrão molecular 100 bp, 2 e 3: amostras
positivas para C. septicum, 4: amostra positiva para C.
novyi tipo B, 5: controle positivo C. septicum, 6: controle
positivo C. novyi tipo B, 7: controle negativo.
DISCUSSÃO
O isolamento de algumas espécies de Clostridium
é difícil, pois requerem condições anaeróbias estritas,
e as amostras clínicas geralmente estão contaminadas com outras bactérias anaeróbias incluindo
clostrídeos no solo que crescem antes dessas espécies
num cultivo. O cultivo microbiológico do rim do animal 1 revelou a presença de Clostridium perfringens
em cultura pura, espécie menos exigente quanto à
anaerobiose. Com a instituição da reação de PCR para
detecção de outras espécies de Clostridium spp., foi
possível a identificação das espécies C.novyi B em fígado do animal 1 e C. septicum nas amostras do animal 2 neste caso, concluindo o diagnóstico que estaria mascarado se tivesse sido empregado apenas o
cultivo microbiológico, por ser uma técnica altamente
sensível e específica. SASAKI et al. (2000) descreveram
uma reação de PCR baseada na região espaçadora
16S-23S rDNA para identificação de clostrídeos
patogênicos em casos de gangrena gasosa, porém os
padrões obtidos tanto para C. haemolyticum e C. novyi
tipo B eram indistingüíveis. A reação utilizada no
presente relato descrita por SASAKI et al. (2002) foi baseada no gene da flagelina fliC, permitindo a diferenciação entre esses dois agentes.
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