Expressão heteróloga e avaliação da atividade de uma
fosfolipase recombinante de lagarta Lonomia obliqua.
Bolsista:
Brenda
Marin
Iniciação
Científica
(PIBIQ/CNPq)
Orientador: Olga Meiri Chaim / Colaboradores: Adriano Marcelo Morgon, Gabriel
Otto Meissner, Marta de Mauro Oliverio
Introdução: A lagarta Lonomia obliqua, conhecida
popularmente por taturana, é responsável por um
número elevado de envenenamentos na Região Sul
do Brasil. Seu veneno é uma mistura proteica, sendo
a fosfolipaseA2 reconhecida como causadora de
muitos dos sintomas do quadro clínico do
envenenamento, o Erucismo Lonômico.
Objetivo: Clonagem e expressão desta toxina sob
forma recombinante para testes de atividade
bioquímica e biológica.
Métodos:
- A sequência de DNA foi obtida através de PCR com
oligonucleotídeos específicos e posterior clonagem
em vetor de clonagem pGEM-T;
- Após transformação em cepa DH5α, os clones
positivos para a construção foram selecionados para
subclonagem em vetor de expressão pSMT3;
- A expressão se deu em cepa BL21 STAR (DE3)
One Shot, a 30ºC, por 4 horas, com o indutor IPTG
0,5mM;
- A expressão foi analisada por SDS-PAGE 12,5% e
Western-Blotting anti his-tag (adicionada pelo vetor)
Referências:
CHAVES-MOREIRA,
D.
Caracterização biquímica e biológica de fosfolipases
presentes em veneno de Loxosceles intermedia e
Lonomia obliqua. 349 f. Tese (Doutorado em
Biologia Celular e Molecular) – UFPR, 2011.
Resultados/Discussão:
Figura 1 – PCR de
colônia. 13 dos 14 clones
positivos na altura de
900pb.
Figura 2 – Análise da expressão por
Western Blotting da proteína PLA2
em cepa de expressão BL21 STAR
(DE3) One Shot.
As setas na Fig. 2 apontam em 32kDa, a PLA2 expressa com
0,5mM de IPTG, nos tempos 0h, 4h, na fração solúvel (S) e
no precipitado (P). Nesse teste, observa-se o baixo
rendimento da proteína solúvel, sendo a maioria sob formas
truncadas e de corpos de inclusão, mesmo com a tag de
solubilidade adicionada pelo vetor.
Como alternativa para obtenção de maior concentração
solúvel, testa-se a subclonagem em vetores da família pET.
Conclusões:
- O desenho dos primers para a clonagem em vetor de
clonagem (pGEM-T) e de expressão (pSMT3) foi eficiente
para a obtenção da sequência madura da toxina;
- Essa toxina foi, pela primeira vez, obtida através de
clonagem e expressão em cepa BL21 Star (DE3) One Shot;
- O pSMT3
não possibilitou alto rendimento da toxina
solúvel, mesmo que fusionada a uma tag de solubilidade.