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Medidas de Geração de espécies reativas causadas por diferentes
complexos de cobre
Lago C.C.Larissa 1 e Cerchiaro Giselle1
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Universidade federal do ABC, Centro de ciências naturais e humanas, Santo André-sp, Brasil.
Este trabalho analisou a formação de radicais livres devido à interação com o cobre sob diversas formas, em diferentes classes de
complexos. Pode-se medir a formação de radicais totais, como também especificamente a formação de radicais hidroxila neste sistema
oxidante. Os resultados obtidos foram comparados com os efeitos experimentais obtidos com os diferentes complexos de cobre no
cultivo de células tumorais de mamíferos. Pode-se concluir há muitas interações diferentes atuando no meio biológico.
Palavras Chave— Radicais livres, cobre, peptídeos, espectroscopia.
I. INTRODUÇÃO
N
os últimos tempos a preocupação com a patologia
ocasionada por radicais livres incentivou diversas
pesquisas neste campo.1-5 Esses estudos propiciaram um
melhor entendimento do assunto, levando a um avanço
significativo na área.
Radicais livres são caracterizados por moléculas
extremamente reativas que possuem orbitais com um ou mais
elétrons desemparelhados.6 As espécies reativas de oxigênio
(ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (ERN), chamados
usualmente por radicais livres, influenciam no organismo
causando dano celular mas também sabe-se que desempenham
um importante papel fisiológico nos seres vivos.1
Os radicais livres são formados nas mitocôndrias, no
citoplasma ou na membrana celular, e geralmente danificam
macromoléculas como proteínas, lipídeos e DNA. Quando em
excesso ERO e ERN irão causar o estresse oxidativo, o qual
está sendo estudado podendo estar envolvido em algumas
doenças como: diabetes, doenças neurodegenerativas, câncer e
cardiopatias.
Sabe-se que metais de transição, como ferro e cobre, são
catalisadores de reações na oxidação de biomoléculas, logo
aumentam a velocidade da geração de radicais livres.5 O
Cobre é o terceiro metal traço mais abundante em mamíferos7,
e possui dos dois níveis oxidativos +2 e +1. Portanto há uma
grande importância de estudos feitos com o cobre.
Estruturalmente os complexos de cobre utilizados do tipo
base de Schiff e os complexos de cobre com ligantes estão
representados na figura 1.
Figura 1- Estruturas dos complexos utilizados.
Materiais e métodos
Materiais:
Utilizou-se para este estudo os seguintes complexos de
cobre: Cu(Isa-pn), Cu(Isa-en), Cu(Isa-epy), Cu(Isa-amiquin) e
Sulfato de Cobre.
Outros complexos com ligantes pepitídeos de baixa massa
molecular também foram utilizados como: Tri-glicina (G3),
Tetra-glicina (G4) e Glicinaglicina-histidina (GGH), formando
complexos com Cu2+.
As sondas utilizadas para identificação da formação de
radicais livres foram: NADH e DHR123.
Os demais reagentes utilizados foram: tampão fosfato,
tampão fosfato salino(, peróxido de hidrogênio, bicarbonato de
sódio, 2-deoxy-D-ribose,ácido tiobarbitúrico.
Além da vidraria e materiais usualmente utilizados em
laboratório utilizou-se um espectofotômetro da marca
Shimadzu modelo uv-180 e cubetas de quartzo com caminho
ótico igual a 1,000 cm.
Métodos:
A primeira etapa consistiu em analisar de oxidação do
NADH mediadas pelos seguintes complexos de cobre: Cu(Isapn), Cu(Isa-en), Cu(Isa-epy), Cu(Isa-amiquin) e Sulfato de
Cobre, em ambiente oxidante. Utilizou-se concentrações de
complexo de cobre (50 μM), bicarbonato de sódio (25 mM),
NADH (50 μM) e peróxido de hidrogênio (3 mM) e
PBS(10mM, pH=7,4), misturou-se tudo em um tubo
eppendorf e rapidamente pipetou-se em uma cubeta de
quartzo, medindo a cinética de oxidação do NADH para
NAD+ no espectofotômetro.(λ=340 nm).
A segunda etapa foi feita para confirmar os resultados
obtidos na primeira etapa do trabalho, portanto trocou-se a
sonda utilizada por DHR123. Utilizou-se concentrações de
complexo de cobre (50μM), bicarbonato de sódio(25mM),
DHR123(50μM) e peróxido de hidrogênio(3mM), misturou-se
tudo em um eppendorf e rapidamente pipetou-se em uma
cubeta de quartzo, medindo a cinética de oxidação da DHR à
rodamina no espectofotômetro.(λ=500 nm).
A terceira etapa do trabalho consistiu em analisar a
formação de radicais hidroxila, utilizando o método
TBARS(substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico).9 Os
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complexos de cobre utilizados foram: Cu(Isa-pn), Cu(Isa-em),
Cu(Isa-epy), Cu(Isa-amiquin) e Sulfato de Cobre. Utilizou-se
das seguintes concentrações: 2-deoxy-D-Ribose (2,5 mM);
tampão fosfato (50mM, pH=7,4), complexos de cobre(50
μM); bicarbonato de sódio (25 mM)
e
peróxido de
Hidrogênio (3mM).
A etapa final do trabalho consistiu em analisar a formação
de radicais hidroxila, utilizando ligantes (Tri-Glicina(G3),
Tetra Glicina(G4) e GlicinaGlicinaHistidina(GGH)) ligados a
Cu2+. Utilizou-se das seguintes concentrações: das seguintes
concentrações: 2-deoxy-D-Ribose (2,5mM); tampão fosfato
(50mM,pH=7,4) , ligante com o cobre(300μM); bicarbonato
de sódio (25 mM) e peróxido de Hidrogênio (3mM).
II. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Ao medir a absorbância do NADH, feita na primeira parte
do trabalho, foi possível descobrir a oxidação ocasionada por
radicais livres. Os resultados encontram-se na figura 2.
Figura 2 Gráfico da oxidação do NADH
, n=5, Onde * p< 0,05.
Observa-se uma linha de tendência na oxidação do NADH
provocada por complexos de cobre, onde o sulfato de cobre foi
o mais reativo. No entanto as barras de erros ficaram grandes e
não se pode afirmar que a tendência é exatamente igual à
média das vezes, então para confirmar a tendência oxidativa
fez-se o mesmo processo utilizado a sonda DHR123 ao invés
da sonda NADH. Os resultados obtidos encontram-se na
figura 3.
espécies reativas. Notou-se que claramente o sulfato de cobre
é o composto mais oxidante seguido pelos outros compostos.
Para entender um pouco melhor a interação dos radicais
com o meio oxidante fez-se a identificação dos radicais
hidroxila a partir do método TBARS.9 Os resultados Obtidos
encontram-se na figura 3.
Figura 4- Formação dos Radicais Hidroxila. n=3, Onde
* p< 0,05 e *** p < 0,001
Pode-se notar a mesma tendência, encontrada na oxidação
das sondas gerada por radicais livres. Implica que os radicais
hidroxila são os que mais formam no processo.
Ao comparar a estrutura de cada complexo de cobre podese notar uma similaridade entre Cu(Isa-pn) e Cu(Isa-epy), e
entre Cu(Isa-em) e Cu(Isa-amiquin). Devido à semelhança
entre as estruturas pode-se notar uma analogia aos níveis de
oxidação provocados complexos.
Biologicamente se pode observar o efeito ocorrido nos
estudos.Nota-se que em experimentos feitos com células
tumorais, tratamentos que utilizam Cu(Isa-pn) e Cu(Isa-epy)
há uma morte celular maior que os tratamentos utilizados
somente sulfato de cobre.11 Primeiramente acreditava-se que a
morte celular era devido à formação de radicais livres
ocasionados pelos complexos de cobre. No entanto hoje, já se
sabe que esses complexos de cobre possuem uma interação
lipofílica e portanto quando testados empiricamente com
células, os complexos entram dentro das células e degradam a
membrana mitocondrial levando a morte celular.12
Sabe-se que o cobre raramente está sozinho dentro do
corpo, está na maior parte das vezes ligado a proteínas
carregadoras. Aplicou-se o método TBARS utilizando cobre
ligado a ligantes peptídicos simples (G4,G3 ou GGH). Os
resultados obtidos encontram-se no gráfico 4.
Figura 3- Gráfico da oxidação do DHR, n=3,
Onde * p< 0,05 e ** p < 0,01.
A partir dos resultados obtidos na primeira e na segunda
etapa pôde-se notar que há uma tendência sim na formação de
Figura 5- Formação de radicais hidroxila
proporcionados por cobre junto ao ligante, n=3,
Onde ** p< 0,01 e *** p < 0,001
3
Nessa parte do experimento a primeira amostra foi o
controle. Como já se sabe que o cobre catalisa a formação de
radicais5, na ausência desse metal a formação de radicais
livres será bem menos intensa. Verificou-se que o cobre
funciona mesmo como um catalisador na formação de
espécies reativas, quando ligado a estes ligantes peptídeos.
O experimento mostra que a formação de radicais possuiu
maior concentração nas amostras que continham
respectivamente: glicina-glicina histidina(GGH); Tetraglicina(G4); Tri-glicina(G3) e Sulfato de cobre.
Biologicamente pode-se notar esse mesmo efeito em
estudos feitos com células.11Estudos recentes mostram que a
interação entre os radicais livres e as células tumorais podem
levar a proliferação celular.11 Nota-se que o tratamento que
utiliza como ligante GGH, as células se proliferaram mais do
que os outros tratamentos, seguindo a mesma tendência
mostrada pelo gráfico 4.
Ao comparar os resultados, pode-se notar que o sulfato de
cobre é a barreira intermediária entre ligantes do tipo base de
Schiff associados ao cobre e os complexos de cobre com
peptídeos de baixa massa molecular.
Por muito tempo acreditou-se que os radicais livres eram
exclusivamente prejudiciais ao organismo. Atualmente sabe-se
que muitas espécies reativas são mediadoras de sinais
celulares como o peróxido de hidrogênio.
III. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que
complexos de cobre com ligantes do tipo base de Schiff
geram EROs em um ambiente oxidante de maneira semelhante
entre si, mas diferente dos complexos de cobre com peptídeos.
Estes últimos geram muito mais EROs, e em ambiente celular
levam a proliferação como resposta. Isso implica na
importância dos radicais livres em meio celular.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pelo Programa de Iniciação
Científica da UFABC, e pelas agências FAPESP e CNPq.
REFERÊNCIASS
[1]Vasconcelos S.M.L., Goulart M.O.F., Moura J.B.F., Benfato V.M,
Manfredini V., Kubota L.T. Quim. Nova(2007) Vol-30 No.1323-1338
[2]Cerchiaro G, Ferreira AMDC, J. Braz. Chem. Soc. 2006, 17 (8),
1473.
[3] Ruben G. M. Moreno, María V. Alipázaga, Marisa H. G. Medeiros e
Nina Coichev. Quim. Nova(2006), Vol. 29, No. 5, 1086-1093.
[4] BIANCHI M.D.L.P.Lusânia, ANTUNES L.M.G. Rev. Nutr.,
Campinas(1999), 12(2): 123-130, maio/ago.
[5]FERREIRA A.L.A., MATSUBARA L.S.. Rev Ass Med Brasil (1997);
43(1): 61-8
[6] HALLIWELL, B. & GUTTERIDGE, J.M.C. Free Radical in Biology
and Medicine. 2º ed. Oxford,
University Press. 1989. 543pp.
[7]Adman ET, Advances in Protein Chemistry, (1991), v.42, CRC
Press, 145.
[8]Paul A. Cobine, Fabien Pierrel, Dennis R. Winge, Biochimica et
Biophysica Acta 1763 (2006) 759–772.
[9]Azellini M.A.A., Bagatin I. A., Ferreira A.M.D.C. . Redox
Report(2006), vol.11, No.1
[10] Vogel A.I. Química analítica qualitativa.5ª edição.
[11] Estudos realizados pelo grupo de pesquisa coordenado pela
professora Dra. Giselle Cerchiaro, ainda em andamento.
[12] Filomeni G., Piccirillo S., Graziani I. Cardaci S., Ferreira A.M.D.C.,
Rotilio G,Ciriolo M.R.. Carcinogenesis(2009) vol.30 no.7 pp.1115–
1124.