Marcadores Moleculares
Até meados da década de 60
 Marcadores morfológicos de fácil identificação
Ex.: características das ervilhas de mendel; nanismo; deficiência clorofítica etc.
MARCADORES MOLECULARES:
 todo fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, ou de um segmento
específico de DNA;
 a sequência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou
não ser conhecidas;
 ao se verificar o seu comportamento de acordo com as leis básicas de
herança de Mendel, um marcador molecular é adicionalmente definido como
marcador genético.
Isoenzimas
 grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma
espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma
das enzimas;
 diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são resultantes
de diferenças nas sequências de DNA que codificam tais enzimas;
 co-dominante, ou seja, genótipos heterozigotos
determinado loco são facilmente identificados.
e
momozigotos
de
um
Ex. Anemia Falciforme
- a hemoglobina de pessoas saudáveis e com anemia movem-se
para posições diferentes
- Ácido glutâmico  Valina
Vantagens
 técnica barata e acessível
Desvantagens
 poucos locos;
 co-dominantes
 baixo polimorfismo por loco;
 limitada a regiões transcritas;
 material deve ser fresco;
 influencia das condições ambientais;
 estágios diferentes de desenvolvimento;
 dificil interpretação dos zimogramas;
Marcadores Moleculares
RFLP – “Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição”
 DNA de indivíduos distintos difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita;
 a presença ou ausência de sítios de restrição pode variar entre indivíduos;
 inserções/deleções/inversões na sequência de DNA de diferentes indivíduos
podem alterar a distância entre pares de sítios de restrição.
Marcadores Moleculares
Ex. 1 – Anemia Falciforme
Ex. 2 – Fibrose Cística
Alelo Normal: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile-Fen-Gli-Val-COOH
Alelo F508: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile-. . . -Gli-Val-COOH
Vantagens
Desvantagens
 nº de locos praticamente ilimitado;
 muito laboriosa (melhorou com PCR);
 nivel de polimorfismo > isoenzimas
 necessidade de sondas disponíveis;
 co-dominantes;
 manuseio de material radioativo;
 sondas de cDNA ou não
 PCR facilitou muito
Marcadores Moleculares
RAPD – “Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso”
 Geração de marcadores baseado na técnica de PCR;
 utiliza um primer único relativamente curto (10 nucleotídeos);
 primer único com sequencia arbitrária, portanto, sua sequência alvo é desconhecida;
 duas sequências complementares ao primer arbitrário devem estar próximas
(<4000pb) e em orientação oposta.
Marcadores Moleculares
Ex. 1 – “Fingerprint” para duas variedades de Uva
Ex. 2 – Detecção de RFLP em fragmentos monomórficos RAPD
Vantagens
Desvantagens
 técnica muito simples e barata;
 Dominante;
 nº de locos praticamente ilimitado;
 difícil interpretação de algumas bandas;
 alto nível de polimorfismo;
 baixa reprodutibilidade;
 quantidade mínima de DNA necessária;
 cobertura de todo o genoma.
Marcadores Moleculares
AFLP – “Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado”
 geração de marcadores baseado na técnica de PCR;
 combina a especificidade e resolução da digestão com enzima de restrição com a
velocidade e praticidade da PCR;
 consiste em 4 estapas principais:
a) DNA genômico total é clivado com 2 enzimas de restrição;
b) adaptadores específicos são ligados aos terminais gerados pelas
enzimas de restrição;
c) uma fração dos fragmentos gerados é amplificada via PCR utilizando
primers que reconhecem as sequências dos adaptadores;
d) a população de fragmentos amplificados é separada em géis de alta
resolução.
Vantagens
Desvantagens
 grande número de locos analisados;
 Dominante;
 Extremamente polimórfico;
 Exige um grande número de etapas;
 quantidade mínima de DNA necessária;
 DNA deve ser mais puro;
 maior robustez quando comparado ao RAPD;  marcação radioativa
 cobertura de todo o genoma.
Marcadores Moleculares
SSR (“Sequencias simples repetidas” ou “Microssatélites”)
 consistem de pequenas sequências, com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento,
repetidas em tandem:
Ex: (GA)n, (TG)n, (AGC)n, etc.
 já foram descritos no nDNA, cpDNA e mtDNA;
 polimorfismo devido ao “escorregão” natural da polimerase
Marcadores Moleculares
Um único locos SSR pode apresentar mais de 50 alelos...
Detecção de SSR em gel ou sequenciador...
Multiplex...
Vantagens
 hipervariáveis
 co-dominantes
 cobertura de todo o genoma;
 baseados em PCR;
Desvantagens
 grande
trabalho
para
desenvolvimento prévio dos marcadores
(biblioteca de SSR)
 Exige marcação radioativa ou uso de
sequenciador automático
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