Cromatografia Gasosa de
Lipídios como Ferramenta
para Estudos de Ecologia
Microbiana
Marcelo Ferreira Fernandes
Resumo
• Parte I. Ecologia Microbiana
• Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da
Composição Química de Lipídios em Microrganismos
• Parte III. Lipídios como Ferramenta para Estudos de
Ecologia Microbiana
PARTE I
Ecologia Microbiana
Ecologia Microbiana
• Objetivos:
– Entender a biodiversidade de microrganismos na
natureza e como diferentes guildas interagem em
comunidades microbianas
– Medir a atividade dos microrganismos na natureza e
monitorar seus efeitos sobre o ecossistema
(componentes bióticos e abióticos)
Interações entre
Microrganismos e Impactos
Ambientais e Econômicos
Derivados de suas Atividades
O Exemplo do Ciclo do Nitrogênio
N2 (80% atmosfera)
N
N
Outros Exemplos de Impactos
Ambientais e Econômicos
Derivados da Atividade de
Microrganismos
•
Controle da disponibilidade de nutrientes minerais para as plantas
–
Ciclagem de nutrientes, associações simbióticas (FBN, micorrizas), perdas de nutrientes
•
Seqüestro de carbono e balanço de gases de efeito estufa
•
Melhoria da qualidade física e química do solo
–
Formação de húmus, formação e estabilização de agregados de solo
•
Controle biológico de pragas e doenças vegetais e animais
•
Processos infecciosos (doenças) em plantas e animais
•
Decomposição de alimentos e outros bens
•
Biolixiviação de minerais de importância econômica (cobre, ouro, urânio...)
•
Biorremediação de xenobióticos (pesticidas, petróleo, explosivos, nylon...)
•
Tratamento de águas; eutroficação de águas e poluição de lençóis freáticos
•
Corrosão de metais, entupimento de tubulações de água e óleo
•
Produção de enzimas de importância industrial, fármacos, combustíveis,
polímeros para plásticos biodegradáveis etc
...
•
Fatores que Controlam Estes
Processos e Impactos
• Bióticos
– Presença e atividade de uma guilda específica
– Interações entre guildas
• Abióticas
A Atividade do “Fator Biótico” Visa à
Sobrevivência
• Obtenção de energia ou de compostos para síntese
celular
– Ciclos biogeoquímicos (C, N, P, S, Fe, Mn, Hg...)
– Associações simbióticas com plantas e animais
– Patógenos, predadores e parasitas
• Transformação de compostos tóxicos ao crescimento
microbiano
– Ciclos biogeoquímicos
• Proteção contra fatores ambientais adversos
• ...
Diversidade Metabólica Microbiana
• Vasta diversidade de “modos de vida” ou
de conseguir recursos para sobrevivência
– Entre espécies de microrganismos
– Dentro da mesma espécie
Obtenção de Energia (Aerobiose)
– Corg → CO2 (Fungos, bactérias, protozoários...)
• Decomposição de restos animais e vegetais
• Formação do solo (CO2 + H2O
H2CO3), formação de humus, ciclagem de nutrientes
– NH4+ → N2O → NO → NO3- (Nitrosomonas, Nitrobacter...)
• Contaminação de águas com NO3• Gases de efeito estufa
– Fe2+ → Fe3+ (Thiobacillus ferroxidans)
• Biolixiviação de metais (cobre, ouro, urânio...)
– CH4 + 2 O2 → CO2 + 2 H2O
• Importante dreno de metano
– So + H2O + 1 ½ O2 → SO42- + 2 H+ (Thiobacillus, Beggiatoa...)
• Solubilização de fosfatos de rocha pela acidificação do solo, corrosão de estruturas
metálicas...
– 2 H2 + O2 → 2H2O (Alcaligenes, Ralstonia...)
– CO + ½ O2 → CO2 (carboxidotróficas: Pseudomonas carboxydovorans)
• Principal dreno de monóxido de carbono da Terra
Obtenção de Energia (Anaerobiose:
Aceptores de Elétrons)
– CO2 → CH4 (Arqueas metanogênicas: Methanobacterium, Methanococcus)
• Gás de efeito estufa e combustível
– NO3- → NO → N2O → N2 (Alcaligenes, Pseudomonas...)
• Perda de fertilizantes
• Gases de efeito estufa
– Fe3+ → Fe2+ (Geobacter, Shewanella, Geospirillum, Thiobacillus
ferroxidans, Sulfolobus...)
• Degradação de compostos aromáticos (benzoato, toleno) utilizados como
fonte de energia (doadores de elétrons)
• Biolixiviação de metais de sulfetos metálicos.
– SO42- + acetato ou H2 → H2S (Desulfovibrio, Desulfobacter...)
• Toxidez à vida aquática
• Desclorinação redutiva de pesticidas clorados
Obtenção de Compostos para Síntese e
Metabolismo Celulares
• Fotoautotrofia (algas, cianobactérias, Euglena)
– Fixação de CO2, via luz
• Quimoautotrofia (muitas bactérias e arqueas)
– Fixação de CO2, via oxidação de compostos minerais
• Heterotrofia (fungos, protozoários, bactérias,
arqueas)
– C orgânico (saprofitismo, simbiose, parasitismo ou predação)
• Fixação Biológica do N2 (algumas bactérias)
– N2
• ...
Dinitrogenase
NH4+
Interações entre Guildas Microbianas
• Rizóbios (fixadores simbióticos de N2) vs. actinomicetos
(produtores de antibióticos) → controle do processo da FBN em
soja
• Fermentadores (diversos mcgs) vs. metanogênicos (arqueas
anaeróbicas) vs. metanotróficos (bactérias anaeróbicas):
balanço de metano entre solo e atmosfera → controle do
processo de efeito estufa
H2
CO2
CH4
Fatores Abióticos de Controle da
Atividade, Biomassa e Composição
de Comunidades Microbianas
Atividade, Biomassa e Composição
Microbianas são Afetadas por:
– Disponibilidade de oxigênio
• De modo geral, bactérias e arqueas mais versáteis que eucariotos
– Disponibilidade de água
• Fungos e actinomicetos mais resistentes a seca
• Holoarqueas = extremófilos
Temperatura
• Extremófilos = poucas bactérias; ultra-extremófilos = muitas arqueas
– Disponibilidade de nutrientes
• Oligotróficos vs. copiotróficos
– Disponibilidade de energia
– pH
• Fungos = ácido; bactérias = neutro (Extremos em Arquea e Bacterias)
– Toxidez por produtos naturais e artificiais
– Interações biológicas...
Impactos Antropogênicos sobre a
Microbiota e Processos Associados
• Preparo do solo:
–
aeração, temperatura, umidade, pH
• Pesticidas e outros compostos químicos:
–
toxidez seletiva ou geral
• Culturas, sistemas de culturas, mudanças de uso da terra
–
quantidade e qualidade de substrato, relações hospedeiro e microrganismos,
temperatura e umidade
• Adubações e calagem:
–
disponibilidade de nutrientes, pH...
• Irrigação e drenagem:
–
disponibilidade de água, temperatura e oxigênio...
• Pecuária:
–
disponibilidade de nutrientes, oxigênio...
• Deposições atmosféricas industriais:
–
disponibilidade de nutrientes, pH...
Exemplos de Impactos de
Atividades Humanas sobre a
Atividade, Biomassa e
Composição das Comunidades
Microbianas
Mudança do Uso da Terra
• Substituição de florestas por pastagens:
– Pisoteio animal → compactação do solo → reduz
fluxo de oxigênio para o solo
• Ambiente aeróbico → anaeróbico
• Favorecimento de metanogênicos em detrimento de
metanotróficos
• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
– Remoção da cobertura vegetal → maior incidência
solar → dessecamento da superfície do solo
• Limitação de água na superfície, mas não no subsolo
• Menor atividade de metanotróficos
• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
Ecologia Microbiana
Atividades
Humanas
Meio
Ambiente
Atividades
Microbianas
PARTE II
Diversidade Genética,
Estrutural e da Composição
Química de Lipídios em
Microrganismos
De Onde Vem a Capacidade dos
Microrganismos de Realizar
Tantas Funções e de se Adaptar a
Tantos Ambientes Distintos?
Diversidade Genética
• “Alta diversidade de genes”
– Diversidade metabólica potencial determinada pelos
genes de cada espécie.
– Evolução cria novos genes a partir de outros
existentes
– Acúmulo de genes diferentes do ancestral: nova sps.
• Taxonomia molecular baseada em similaridade
nas seqüências de genes
– Seqüências rRNA (Woese, 1990)
– Três domínios muito distintos
• Bacteria
• Archea
• Eukarya
Árvore da Vida (Woese, 1990)
Evolução, estruturas celulares e
composições de macromoléculas
• Além de gerar diversidade metabólica, a
evolução genética resultou em diferenças
marcantes em estruturas celulares e
composições de macromoléculas entre grupos
taxonômicos de microganismos:
– Ex: parede celular e estrutura química dos lipídios
Estruturas Celulares Microbianas
Ricas em Lipídios
Bactérias Gram +
MP*
Bactérias Gram -
MP*
PC
PC
(Peptidoglicano)
Fungos e Algas
MP*
PC
(Fungos: Quitina)
(Algas: Celulose, glicoproteínas)
Protozoários
MP*
Peptidoglicano
Membrana Externa*
Estruturas Celulares Microbianas
Ricas em Lipídios (cont.)
Achaea
MP*
PC
(Pseudpeptidoglicano ou glicoproteínas
ou proteínas ou polissacarídeos)
Bacteria
Lipídios Principais
nas Membranas
Bactérias G+
PL (MP)
GL (MP)
Bactérias G-
PL (MP, MExt)
LPS (MExt.)
Actinomicetos
PL (MP)
Ácidos Graxos
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7c
LPS: 3-OH-FA
PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
Bacteria
Lipídios Principais
nas Membranas
Bactérias G+
PL (MP)
GL (MP)
Bactérias G-
PL (MP, MExt)
LPS (MExt.)
Actinomicetos
PL (MP)
Ácidos Graxos
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7c
LPS: 3-OH-FA
PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
Archaea
Eucarya
Lipídios Principais nas
Membranas
Fungos
Eucariotos
Ácidos graxos
PL (MP)
Ergosterol (MP)
PL: 18:2ω6c
Não se aplica
PL (MP)
Esteróis (MP)
PL: 20:4ω6c
Não se aplica
PARTE III
Lipídios como Ferramenta
para Estudos de Ecologia
Microbiana
Ecologia Microbiana
Aspectos de Interesse
• Biomassa microbiana
• Atividade microbiana
• Composição ou estrutura da comunidade
Métodos para Investigação da Estrutura
da Comunidade Microbiana
• Dependentes de cultivo
– Meios seletivos para organismos de interesse
– Plaqueamento da amostra em meio de
cultura sólido
– Enumeração e identificação de
microrganismos
Organismos Cultiváveis
Fungos
Actinomicetos
Protozoários,
Bactéria
Archaea
Algas
Organismos Viáveis, Não-Cultiváveis
• Torsvik, V. et al. High Diversity in DNA of Soil Bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, 56(3):782-787, 1990.
• Apenas 1 a 10% dos microrganismos na natureza são cultiváveis em
laboratório;
• Embora não cultiváveis, esses organismos são ativos na natureza;
• Exemplos de impacto:
– Morris et al. (Nature, 2002):
• SAR 11, ser vivo mais abundante do planeta, não-cultivável.
– Nitrificação:
• Bactérias Nitrosomonas e Nitrobacter (Winogradsky, 1888)
• Wuchter et al. (PNAS, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): 100-1000 x mais abundante que bactérias nos oceanos
• Leininger et al. (Nature, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): ~3000x mais abundante que bactérias no solo
Métodos de Investigação da
Comunidade Microbiana
Independentes de Cultivo
Métodos Independentes de Cultivo
– DNA
• taxons e funções mais específicos
• Primers específicos para grupos taxonômicos microbianos
(rRNA) ou genes para enzimas relacionadas a uma
determinada função (ex: bactérias nitrificantes = gene
amo...)
– Lipídios
• em geral, compara grandes grupos taxonômicos de
microrganismos
• poucos marcadores para grupos funcionais específicos
• em alguns casos, atividade de guilda com uma função
específica pode ser investigada em associação com técnicas
isotópicas
• Marcador fenotípico
Métodos Baseados em DNA (opcional)
• Extração do DNA da amostra ambiental
• Amplificação de regiões específicas do DNA (PCR e primers
específicos)
– Taxonomia (rRNA)
– Funções (genes específicos)
• Padrão de bandas em gel de eletroforese
– DGGE
– LH-PCR
– T-RFLP ...
• Clonagem e seqüenciamento de fragmentos amplificados ou
recuperados das bandas do gel
• Identificação microbiana utilizando-se ferramentas de comparação
de similaridades entre seqüências obtidas com as disponíveis em
bancos de dados de seqüências de DNA (NCBI)
Métodos Baseados em Lipídios
• Princípio de avaliação da estrutura das
comunidades microbianas:
– Diversidade Estrutural de Ácidos Graxos
– Associação entre estrutura e grupos microbianos
(biomarcadores microbianos)
– Inferências sobre mudanças na estrutura da
comunidade a partir de mudanças no perfil de ácidos
graxos
Diversidade Química de Ácidos
Microbianos
ex: 18:26c
Saturado (ex: 17:0)
ex: 18:36c
Poliinsaturado
Monoinsaturado (ex: 18:19c)
Ramificado (iso, iX:0)
Ramificado (anteiso; aX:0)
Ciclopropeno (ex: 19:0cy8c)
Nomenclatura dos Ácidos Graxos
• X:Y
– X = no de carbonos da molécula
– Y = no de insaturações (duplas ligações)
Ex: 16:0 (ácido hexadecanóico)
– Se Y>0 (insaturados):
• X:YZc, onde Z é a posição da primeira insaturação à partir do C
distal, e “c” indica a conformação “cis”, e t, a “trans”
Ex: 16:15c; 18:17t; 18:26c
• iX:Y, aX:Y, X:Y 10-Me
– Radical metil lateral na posição 2, 3 ou 10, a partir do C distal
Ex: i15:0; a15:0; i17:0; 18:0 10-Me
• X:Ycy Zc
– cy representa presença de anel ciclopropeno
Ex: 19:0cy 8c
Ácidos Graxos Biomarcadores
• Grupos Taxonômicos
• Poucos de Grupos Funcionais Específicos
Biomarcadores
Tipo
FAME
Grupo Microbiano
Poliinsaturados
18:2ω6c
Fungos
Poliinsaturado
20:5ω6c
Poliinsaturado
20:4ω6c
Fungos micorrízicos
arbusculares
Protozoários, nematóides
Metil C ω10
16:0 10Me; 17:0 10Me; 18:0 10Me
Metil C ω10
16:0 10Me
Ciclopropil
17:0cy; 19:0cy
Desulfobacter (redutoras
do SO42-)
Bactéria Gram negativas
Iso/anteiso
i15:0; a15:0; i16:0; i17:0, i17:0
Bactéria Gram positivas
Monoinsaturado
18:1ω7c
Bactéria Gram negativas
Monoinsaturado
16:1ω5c (NLFA)
Monoinsaturado
16:1ω5c (PLFA)
Monoinsaturado
ω8c
Misto
16:1ω8c, 18:1ω8c
Fungos micorrízicos
arbusculares
FMA, Flavobacterium/
Cytophaga
Bactérias metanotróficas
i17:1ω7c
Actinomicetos
Desulfovibrio (redutoras
do SO42-)
Ácidos Graxos em Diferentes Classes
de Lipídios Complexos
• Ácidos graxos raramente ocorrem livres
em células
• Normalmente, eles integram lipídios
estruturalmente mais complexos
• Diferentes tipos de ligações químicas
unem os ácidos graxos ao restante da
molécula dos lipídios complexos
Ligações Químicas dos Ácidos Graxos
• Lipídios com ligações éster
– ex: triacilgliceróis
– R-COO•
• Lipídios com ligações éter
– ex: plasmalógenos, Archaea
– R-CH2O•
• Lipídios com ligação amida
– ex: esfingolipídios
– R-CO • NH-R’
Éster Metílico de Ácido Graxo
“Fatty Acid Methyl Ester”(FAME)
Ácido Graxo
COOHR
Metanólise Alcalina Branda (PLFA e EL-FAME) ou
Saponificação – Metanólise Ácida (MIDI)
FAME
COOCH3
Altamente volátil
Saponificação/Metilação
• Duas etapas:
– Saponificação: Ácido graxo
sabão
– Metilação: substituição do Na por metil
FAME
• Condições de reação:
– Saponificação: altas temperaturas, 3,8 M NaOH em MeOH:H2O
(100oC, 30’)
– Metilação: presença de água, 6 M HCl:MeOH (85oC, 10’)
• Ligações-alvo:
– Éster, éter, amina, ácidos graxos livres
• Altamente danosas à estrutura de alguns ácidos graxos:
– ciclopropanos
Metanólise Alcalina Branda
• Uma só etapa (transesterificação)
– Separação de ácidos graxos das moléculas complexas
e esterificação com ·CH3
• Condições de reação:
– 0,2M KOH em MeOH (37oC, 1h)
– Ausência de água
• Ligações-alvo
– Ésteres
Principais Lipídios
Complexos Contendo Ácidos
Graxos
Fosfolipídios
• Universal em membranas celulares, proporções
aproximadamente constantes por massa celular
– Exceto em Archaea, ligações são principalmente éster
• Rápida hidrólise do fosfato após morte
microbiana (Fosfolipídio -> Lipídio Neutro)
• Microbiota viável
O
H2C
O
C
O
O
R
O
P
O-
CH O
O
CH2
C
Lipídios Neutros
• Presentes em:
• Células mortas
• Reserva em eucariotos
• Reservas de LN em procariotos são raras
O
H2C
O
C
O
CH O
HO
CH2
C
Glicolipídios
• EL-glicolipídios
O
H2C
O
OH OH
H
CH O
O
H
O
HO
H
H
OH
H
CH2
C
O
C
18
19
20
21
22
20.852
20.961
20.575
17.695
17.310
22
23.145
22.687
21.408
21.188
21.056
19.588
19.087
18.896
18.456
17.483
16.980
17.088
16.153
15.746
22.959
22.108
21.543
20.962
21.059
20.853
21.411
21.235
20.630
20.344
20.454
19.659
19.335
19.061
19.162
18.898
18.673
15.012
17.306
18.452
18.528
17.486
17.213
16.983
16.600
15.746
15.854
15.175
19:0 cy
50
16:0 DCA
17
21
18:0 10Me
16
20
18:0
40
17.697
18:1ω7c
18:1ω9c
15
16:0ωOH
60
18:2ω6c
14
19
17:0 10Me
NLFA
16:1 2OH
pA
18
17:0 cy
20
17
17:0a
17:0i
30
16
17:1i
16:0 10Me
14
15
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230409.D)
16:1ω5c
16:1ω7c
70
15.010
40
15.176
pA
16:0
50
16:0i
20
PLFA
15:0a
15:0i
30
14.545
14.623
60
13.746
70
13.742
Reserva vs. Células Mortas em NLFA
Pastagem (Corvallis, OR, EUA)
Agosto 2005
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230405.D)
23 min
23 min
Protocolos para Extração de
FAMEs do Solo
Principais Protocolos de Extração de
FAMEs
• PLFA (Phospholipid Fatty Acids)
– White e Ringelberg (1998)
• MIDI (Microbial Identification™)
- Sasser (1990)
• EL-FAME (Ester-linked FAME)
– Direto do solo (Schutter e Dick, 2000)
– Extrato lipídico (Drjiber et al., 2000)
Método: PLFA
• Método mais utilizado (padrão)
• Mais caro e trabalhoso
– Coluna de SPE-Si: ~R$ 10,00 (no Brasil)
– 40-50 ml de clorofórmio, acetona e metanol amostra-1
– 24 amostras em 2 dias
• Extrai apenas ácidos graxos esterificados em
fosfolipídios
Protocolo PLFA
Fase 1.
Extração de Lipídios Totais do Solo
• Bligh e Dyer (1959) modificado
– Mistura monofásica metanol:clorofórmio:tampão
fosfato 50 mM (2:1:0,8)
– Solo:clorofórmio (1:1, m/v)
– Volumes de água e tampão fosfato 100 mM
– Ex: 4 g solo úmido com 25% umidade (b.u.)
•
•
•
•
3 g solo seco + 1 g água
6 ml de metanol, 3 ml de clorofórmio, 2,4 ml TF 50 mM
2,4 ml TF 50 mM (combinação de água e TF 100 mM)
1 ml água do solo + 0,2 ml água adicionada + 1,2 ml TF 100
mM
1.1. Solo e mistura de solventes em tubo de centrífuga
com tampa com revestimento interno de teflon;
1.2. Agitar por 2 h, decantar “overnight”
–
Variações:
•
•
sonicação (2 min)
tempo de agitação, omissão da decantação;
1.3. Ressuspender solo e centrifugar (10 min e 2000 x g);
1.4. Filtrar sobrenadante papel Whatman #1;
1.5. Adicionar metanol:clorofórmio ao solo remanescente
no tubo e repetir passos 1.3 e 1.4 mais duas vezes;
1.6. Partição do filtrado em duas fases: adicionar solução
NaCl 2 M (solução:clorofórmio, 1:1);
1.7. Esperar até que a desaparecimento da turbidez na
fase superior (aquosa);
1.8. Transferir a fase inferior (orgânica) para um tubo de
ensaio e secá-la sob atmosfera de N2 ultra-puro, a
37oC. Armazenar a -20oC.
Fase 2.
Fracionamento das Classes de Lipídios
(Cromatografia de Afinidade)
• Extração em fase sólida (ácido silícico)
• Partição de lipídios entre radicais silanóis ativos
nos grânulos de ácido silícico e solventes de
polaridade crescente (clorofórmio, acetona e
metanol)
2.1. Colocar coluna de ácido silícico (3 ml, 500 mg) em aparato de vácuo
com tubo de ensaio diretamente abaixo da mesma;
2.2. Adicionar 2 ml de clorofórmio à coluna, sem deixar drenar;
2.3. Ressuspender extrato de lipídios em volume mínimo (100-200 μL) de
clorofórmio e transferir para coluna de ácido silícico. Repetir 3 vezes
para assegurar transferência quantitativa;
2.4. Acionar vácuo e adicionar 3 x 2 ml de clorofórmio, e coletar esses
volumes no tubo de ensaio colocado abaixo;
2.5. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de acetona, e
coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.6. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de metanol, e
coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.7. Secar frações sob atmosfera de N2 ultrapuro , a 37oC, armazenar a
-20oC.
Esquema do Fracionamento de
Lipídios
Clorofórmio
Neutros
Metanol
Acetona
PLFA
NLFA
Esteróis
Fosfolipídios
Glicolipídios
Poli-β-hidroxialcanoatos
Fase 3. Metanólise Alcalina para
Produção dos FAMES de PL
• Geração dos FAMEs a partir de fosfolipídios
esterificados;
• Remoção dos ácidos graxos do restante da molécula
lipídica e substituição das ligações com glicerol por
grupos metil > aumenta a volatilidade dos compostos
• Para PLFA, proceder reação apenas na fração contendo
fosfolipídios;
• Nota: Dependendo do objetivo do estudo, a fração
neutra e glicolipídica também poderão ser tratadas
posteriormente para análise cromatográfica de
compostos de interesse.
3.1. Redissolver os lipídios fracionados secos em 1 ml de tolueno: metanol (1:1,
v/v) e 1 ml de KOH metanólico (0,2 N);
3.2. Agitar tubo em vortex, rapidamente, e colocá-los em banho-maria a 37oC por
15 min.;
3.3. Após amostras esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 2 ml de
hexano:clorofórmio (4:1, v/v), e misturar amostra;
3.4. Neutralize pH (6 a 7) da mistura com adição de 0,2 ml de ácido acético 1N.
Verificar pH final em papel de tornassol;
3.5. Adicione 2 ml de água destilada para separar fases e misture amostra em
vortex por 30 s. Esperar separação de fases se completar (~10-15 min.);
3.6. Transferir fase orgânica (superior) para um tubo de ensaio novo,
3.7. Reextrair fase inferior: adicionar 2 ml de clorofórmio:hexano (4:1 v/v),
agitar em vortex 30 s., esperar separação de fases, transferir para tubo novo
(repetir 2x)
3.8. Evaporar solvente sob N2 ultrapuro, a 37oC; armazenar a -20oC, sob N2.
PLFA (Esquema Geral)
2 h, agitar 100 rpm
adição de NaCl 2M
centrifugar 500 x g
partição de fases
3 g solo +
CHCl3:CH3OH:tampão
(1:2:0,8)
Filtrar (Whatman 1), repetir 2x
após adicionar CHCl3 e CH3OH
ao solo remanescente, vortex e
centrifugação
tranferir fase
orgânica
secar sob
N2
40oC
Fase orgânica (inferior)
contém lipídios totais
extrato
lipídico
extrato
lipídico seco
Transesterificação (geração de FAMEs)
KOH (0,2 N) em metanol, 40oC
ressuspender em
3 x 200 ul CHCl3
transferir para
coluna SPE-silica
Eluir c/ CHCl3,
acetona e CH3OH
Clorofórmio
Metanol
secar sob N2,
40oC
Partição com água, recuperar FAMEs
(fase superior) em hexano, secar sob
N2, resuspender em hexano
Acetona
FAMEs em hexano,
em frasco GC
CG-FID
Lipídios Neutros
Glicolipídios
Descartar
Fosfolipídios
Perfil de FAMEs
Fase 4. Preparo de Amostras, Separação
em CG, Quantificação e Identificação de
Compostos
4.1. PLFA secos são ressuspensos em hexano, agitados em vortex, e transferidos para frasco
GC com “insert” de 200 μL;
4.2. Injeção em CG-FID, equipado com coluna não-polar (ex: 5% diphenyl, 95%
methylpolysiloxane fase estacionária; ex: Ultra-2, DB-5, HP-5), com 25 m, 0,2 mm
diam. int.; 0,33m espessura filme); rampa de temperatura: 170-280oC a 4oC min-1;
mais 5 min. a 280oC para limpeza da coluna.
4.3. Curva-padrão: FAME 13:0 (“methyl tridecanoic acid”): relação entre área de pico
cromatográfico e quantidades conhecidas do FAME.
Alternativamente: adição de padrão interno: usualmente FAME 19:0.
Resultados em mol de FAMEs individuais por g de solo (pmol FAME g-1 solo seco).
4.4. Misturas padrões de FAMEs microbianos (BAME e FAME-37): comparar TR com amostras
4.5. ECL vs. TR (Biblioteca de ECLs. Ex: MIDI)
- Relação linear entre TR e número de C de série homóloga de ácidos graxos saturados
de cadeia linear
4.5. CG-EM (confirmação de compostos): importante, mas, em geral, não realizada.
Curva Padrão
Tridecanoato de Metila (FAME 13:0)
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210213.D)
0 pmol ml-1
2.031
-1
pmol FAME 13:0 ml
100
5
10
15
20
100
5
10
15
20
100
5
10
15
20
100
5
10
15
20
5
10
5
15
20
151
87.6
302
187.6
605
368.5
1210
716
min
25
min
25
min
1210 pmol ml-1
12.411
9.415
2.029
4.887
100
35.9
800
y = 0.5935x + 2.3384
700
R = 0.9996
2
500
400
300
200
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210218.D)
pA
25
605 pmol ml-1
12.401
2.033
100
60
600
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210217.D)
pA
0
min
302 pmol ml-1
12.396
2.032
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210216.D)
pA
25
Área CG
0
min
151 pmol ml-1
12.394
2.037
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210215.D)
pA
25
60 pmol ml-1
12.394
pA
2.031
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210214.D)
Área (CG)
pA
100
0
0
500
1000
FAME 13:0 (pmol ml-1)
10
15
20
25
min
1500
Brancos
- Verificar contaminações das amostras durante procedimento de extração
- Todo o procedimento é realizado de modo idêntico às amostras, porém
sem solo
17
19
20
21
22.959
22.108
21.543
21.411
PLFA
21.235
20.853
20.962
21.059
20.630
20.344
20.454
19.659
19.335
18.898
18
19.061
19.162
18.673
18.452
18.528
17.697
17.486
17.213
17.306
15.012
15
16
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230413.D)
16.983
16.600
20
15.746
15.854
30
14.545
14.623
40
15.175
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230405.D)
pA
22
23
min
PLFA Br
pA
40
30
20
15
16
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230410.D)
17
18
19
20
21
22
15
16
FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230416.D)
17
18
19
20
21
23
min
22.687
21.409
20.850
20.957
21.056
20.569
19.086
18.899
18.525
17.692
17.484
17.303
16.980
15.012
20
15.178
30
min
NLFA
pA
40
23
22
NLFA Br
pA
18.458
40
30
20
15
16
17
18
19
20
21
22
23
min
Efeito do Desmatamento sobre a
Estrutura da Comunidade Microbiana
30
20
16
17
18
19
20
20.125
21
22
23.333
23
23
23.505
22
23.062
23.143
23.231
22.862
22.721
22.465
22.524
22.585
22.296
22.349
21.437
21
22.067
22.169
21.902
21.767
21.540
21.598
70
21.332
pA
90
21.229
20
20.930
20.992
21.065
21.100
20.810
20.697
20.268
19.694
19
19.834
19.936
20.009
19.542
18.881
18
19.413
18.941
19.027
19.138
19.248
18.753
18.807
17
23.059
23.138
22.860
22.466
22.525
22.349
22.065
22.163
21.897
21.763
21.534
21.595
21.101
20.935
20.986
20.807
20.694
20.263
20.125
19.834
19.935
20.005
23.326
21.214
21.321
19.690
19.408
19.513
19.244
18.751
18.802
18.877
18.939
19.022
18.421
18.487
50
18.042
60
18.136
18.192
70
18.406
18.495
>150 anos
18.052
17.655
17.733
17.835
17.542
17.327
16.939
17.004
16.080
16.187
16.246
15.934
~ 10 anos
18.141
17.838
17.661
60
17.735
17.541
17.330
17.217
16
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10170346.D)
16.938
17.007
16.810
16.497
16.081
16.189
16.250
20
15.933
40
15.621
50
15.761
80
15.346
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10170355.D)
21.424
18:26c fungo
30
15.511
pA
90
16:0 comum
40
15.350
80
15.513
Floresta Adulta (>150 a) vs. Floresta
Recem-Cortada (10 a)
min
min
Método: MIDI
• Adaptado de método comercial para identificação de bactérias em
cultura pura, de acordo com perfil de lipídios celulares totais
• Mais rápido (?) e barato que PLFA
• Requer menor quantidades de solo (??)
• Mais perigoso (base e ácido concentrados, alta temperatura)
• Extração direta, sob condições extremas de pH e temperatura
(saponificação/metilação ácida)
• Extrai FAMEs de potencialmente todos os lipídios celulares (éster,
éter, amida...) e não-celulares (reserva, células mortas, fontes nãomicrobianas, matéria orgânica do solo...), incluindo ácidos graxos
livres
• Forte potencial de alterar a estrutura química de muitos ácidos
graxos, especialmente os com aneis ciclopropeno e os insaturados
Protocolo MIDI
Saponificação
• Pesar 3 g de solo em tubo de de vidro (20 ml) com
tampa de rosca revestida com Teflon;
• Adicionar 3 ml de solução de NaOH (3,8N) em
água:metanol (1:1 v/v);
• Agitar em vortex e ferver por 30 min.
• Produto: sais de sódio de cadeia longa (sabão)
Metilação Ácida
• Adicionar 6 ml de mistura HCl (6M):metanol (1:0,85
v/v);
• Aquecer em banho-maria 85oC, 10 min.
• Produto: FAMEs
Recuperação dos FAMEs
• Adicionar 3 ml de hexano (partição de fases);
• Transferir todo conteúdo do frasco para para tubos de
centrífuga de 35 ml, com rosca revestida por Teflon;
• Centrifugar a 480 x g por 10 min. para separar MOS da
fase orgânica;
• Transferir fase orgânica (superior) para tubos de 13 x
100 mm com tampa revestida de Teflon;
Lavagem da Fase Orgânica
• Adicionar 3 ml de base fraca (0,3 M NaOH) para lavar
residual de reagentes ácidos
• Agitar tubo lentamente por 5 min
• Transferência da fase superior para tubos CG (2ml)
Análise cromatográfica, quantificação
e identificação dos compostos
• Idem PLFA
Método: EL-FAME
• Mais rápido (!), fácil (!) e barato que PLFA
• Extrai ácidos graxos esterificados em diversas classes
de lipídios (neutros, glicolipídios e fosfolipídios)
• Contribuição de lípídios de reserva e de células mortas
(LN), além de glicolipídios esterificados, para o perfil
de FAMEs
• Duas variações de extração:
– direta do solo (Schutter e Dick, 2000);
– a partir do extrato de lipídios totais (Drijber et al., 2000).
Protocolo EL-FAME
Metanólise Alcalina Branda
• Pesar 3 g de solo em tubo centrífuga de 35 ml com tampa revestida
de Teflon;
• Adicionar 15 ml de KOH (0,2 N) em metanol;
• Agitar em vortex e incubar a 37oC por 1 h (transesterificação,
idêntica à do PLFA)
• Agitar tubos em vortex a cada 10 min. durante o tempo de
incubação.
• Adicionar 3 ml de ácido acético 1,0 M para neutralizar pH do
conteúdo do frasco
Recuperação dos FAMEs
• Partir fases adicionando 10 ml de hexano;
• Centrifugar a 480 x g, 10 min.;
• Transferir fase orgânica para tubo de ensaio e secar sob
N2 ultrapuro;
• Ressuspender extrato seco em 3 x ~70 µL de hexano,
agitando em vortex após cada adição do solvente, e
transferir para frasco CG, com insert de 200 µL.
Análise cromatográfica, quantificação
e identificação dos compostos
• Idem PLFA
Comparação entre Métodos
AG Totais
MIDI
AG Éster
EL-FAME
PLFA
AG Éster
Fosfolipídios
20
30
25
16
17
18
19
19.268
20
21
22
22.417
22
pA
23
23
23
23.544
23.291
23.350
22.997
23.093
22
23.140
23.251
23.345
22.759
22.429
22.492
22.553
18.065
23.291
23.350
22.492
22.552
21.930
21.793
21.627
21.243
21.345
21.445
20.727
20.839
19.970
20.037
19.719
19.439
19.547
19.275
18.832
18.903
18.964
19.048
18.164
17.863
17.578
17.681
17.354
16.973
16.113
16.220
pA
22.989
22.591
22.698
22.813
21
22.219
21.928
21.793
21.244
21.350
21
22.183
22.247
21.681
21.788
21.888
21.446
21.571
21.623
21.129
35
21.439
21.236
21.341
20
21.009
20.725
20.836
19.878
19.964
20.037
19.718
20
21.000
19
20.722
19.275
19.438
19.545
19
19.963
20.034
19.828
18
19.436
19.538
19.606
19.710
18.833
18.903
18.966
19.048
18
18.828
18.898
18.964
19.043
19.139
17
18.510
18.070
pA
18.163
17
18.671
35
18.061
17.682
17.863
17.588
17.354
17.185
15.372
15.538
30
18.153
17.857
17.592
17.676
17.348
17.173
16
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10040329.D)
16.975
17.038
16.526
16
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\09300315.D)
16.970
16.515
16.109
16.215
20
16.103
16.211
15.957
15.684
25
15.371
30
15.537
20
15.531
25
15.366
15.177
Impacto da Escolha do Método de Extração
sobre os Perfis de Ácidos Graxos
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10020330.D)
35
PLFA
min
EL-FAME
min
MIDI
min
Efeito da Escolha do Protocolo de
Extração sobre a Interpretação
de Resultados de Estrutura da
Comunidade Microbiana
Amostras de Solo
• 29 amostras de solo através do Estado do Oregon,
EUA (0-10 cm depth)
• Ecossistemas diversos
– Sem vegetação na data de amostragem
– Herbáceas (culturas anuais, pastagens e pomares)
– Florestas (gimnospermas com >150a; clareiras de 10 a; mistas)
• Ampla faixa de propriedades do solo
– COT, MOP, MO-nP, pH, textura
• Amostras de solo peneiradas (< 2mm)
• Extração de FAMEs pelos 3 métodos
Análise de FAMEs
• Cromatografia gasosa
• Identificação inicial por comparação dos TR entre
amostras e padrões de FAMEs microbianos
• Confirmação de compostos abundantes por EM
• Dados de composição de AG analisados em mol%
Mol%
MIDI versus PLFA
• Análise estatística: ordenação multivariada NMS
– Distância de Sorensen
– PC-ORD 4, modo autopiloto “lento e abrangente”
– Correlações com variáveis de solo e caracterização
da mudanças no perfil de FAMEs utilizando
coeficiente de Pearson (“joint plots”)
MIDI versus PLFA - Resultados
• CG-MS: alguns biomarcadores de substâncias vegetais
(cutina, suberina, e ceras) presentes em grandes
quantidades no extrato de MIDI, mas não em PLFA
CG-EM
Compostos Vegetais
16:0 16OH suberina, cutina, ceras
CG = 19cy:0 10c
14:0 14OH cutina, ceras
CG = 17:17c
12:0 12OH
cutina, ceras
16:0 alcohol suberina
16:0 DCA
suberina, cutina, ceras
Compostos de Planta
MIDI vs. PLFA
mol%
16:0
16:0
16:0
14:0
12:0
FAMEs
Alcohol
16OH
DCA
14OH
12OH
MIDI
1.62
6.70
2.87
6.61
1.69
PLFA
0.00
0.29
0.06
0.00
0.00
FAMEs
MIDI vs. PLFA
mol%
FAMEs
17:0cy
19:0cy
18:1ω7c
17:0i
17:0a
16:0 10Me
17:0 10Me
18:0 10Me
MIDI
0.75
0.41
2.14
0.53
0.67
1.14
0.34
0.53
PLFA
3.51
5.40
9.80
1.67
1.90
4.66
1.05
2.03
Non-metric Multidimensional Scaling
PLFA
mol% of FAMEs
Forest
Correlation Axis 1MIDI vs. Axis 1PLFA: r = 0.87
Correlation Axis 2MIDI vs. Axis 2PLFA: r = 0.28
MIDI
Forest
MIDI
EL-FAME versus PLFA
• Mesmo método de produção de FAMEs
(metanólise alcalina branda)
• Diferentes reservatórios de lipídios alvos
de produção de FAMEs
PLFA vs. PLFA + NLFA + GLFA
EL-FAME versus PLFA
Objetivo:
Avaliar a interferência de NL e GL no que se refere à comparação da
interpretação de dados de comunidade microbiana entre o EL-FAME e
o PLFA (padrão)
Amostras de solo:
Idem estudo de comparação entre PLFA vs. MIDI
Análises estatísticas:
Modelos de regrassão múltipla (stepwise)
Ordenação das amostras com base na relação entre EL/PL com
respeito às concentrações molares dos FAMEs (mol%) nos respectivos
extratos
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (method of extraction, vegetation, POM, nPOM, pH)
controls(
PLFA
,
no veg
)
TOTAL FAME (EL)
=
(EL=1) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
14485 * 4.8
4.8
TOTAL FAME (PL)
=
(EL=0) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
1.0
14485 * 4.8
TOTAL FAME (EL/PL) =
4.8
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil)
Organic C
FAMEs
FUNGI
GP
GN
ACT
AMF
EUK
16:0
18:0
16:1ω7c
18:1ω9c
Total
Intercept
534***
2335***
1806***
1049***
299***
90***
1817***
353***
932***
1208***
14485***
EL
10.0***
4.1***
2.5***
3.1***
0.4ns*
7.4***
7.9***
7.1***
5.5***
8.2***
4.8***
POM
11.6***
14.5***
19.3***
14.8***
19.8***
4.3***
12.5***
11.4***
20.0***
18.1***
17.2***
nPOM
Vegetation
pH
Herb
1.0ns
1.6*s*
2.0***
1.09***
1.10***
1.2ns*
Forest
6.6***
3.4***
4.0***
3.9***
6.5***
4.6***
4.1***
3.9***
4.0***
3.7***
4.0***
EL vs.
pH
Interactions
EL vs. EL vs.
Forest
Herb
***
0.45
1.68**
0.44**
0.57**
0.63**
POM-C
vs. Forest
0.14***
0.07***
0.07***
0.08***
0.05***
0.27***
0.10***
0.10***
0.06***
0.07***
0.07***
R2
0.92
0.92
0.91
0.91
0.90
0.93
0.95
0.94
0.92
0.94
0.93
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (lipid source, vegetation, POM, nPOM, pH)
Vegetation: non-vegetation at sampling (control), herbaceous, and forest
Lipid source: PLFA (control), NLFA or GLFA
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil) associated with
lipid sources (neutral lipids vs. phospholipids; and glycolipids vs.
phospholipids
FAMEs
Fungi
GP
GN
Act
AMF
Euk
16:0
18:0
16.1ω7c
18.1ω9c
Total
Lipid
Source Interactions NL vs.
NL
Forest
Herb Model R2
2.27***
0.56*
0.83
***
0.31
0.82
***
0.19
0.86
***
0.17
0.90
***
**
8.65
0.32
0.71
***
1.95
0.80
***
1.52
0.65
ns
0.78
0.76
***
*
**
2.95
0.45
0.31
0.59
***
2.19
0.75
ns
1.02
0.70
Lipid
Source Interactions GL vs.
GL
Forest
Herb Model R2
0.28***
0.84
***
0.23
0.89
***
0.09
0.94
***
0.19
0.92
***
***
0.31
0.46
0.81
0.00
0.65***
0.84
***
0.69
0.81
***
***
0.19
0.63
0.90
***
0.34
0.86
***
0.32
0.89
NMS with EL-FAME:PLFA mol% ratios
EL-FAME (mol%)
15:0i
18:26c
…
20:46
c
CO
0.05
0.26
0.20
PMa
0.09
0.21
0.23
Forest
No vegetation
…
OGc
0.01
0.34
0.12
PLFA (mol%)
15:0i
18:26c
CO
0.12
0.15
0.11
PMa
0.16
0.12
0.16
OGc
0.06
0.22
0.22
ELFA/PLFA
15:0i
18:26c
CO
0.41
1.73
1.82
PMa
0.56
1.75
1.44
0.17
1.53
0.55
…
20:46
c
…
…
20:46
c
…
OGc
Herbaceous
Outros Lipídios Importantes
• Ergosterol (esterol):
– exclusivo de fungos (biomassa de fungos)
– altamente correlacionado com PLFA 18:26c
• Poli-hidroxialcanoatos (PHAs)
– reservas em bactérias
– em SPE-Si é eluído com acetona
Outros Usos dos Métodos Baseados em
Lipídios na Investigação da Microbiota
• Diversidade e estrutura da comunidade
microbiana
• Biomassa microbiana
– Total
– Grupos microbianos específicos
• Estado nutricional de fungos do solo
• Respostas de bactérias a estresses
ambientais
Biomassa Microbiana Viável
Método 1. Soma dos PLFAs
BM total: soma de todos os PLFAs
3,0 x 104 células/pmol PLFA (bactéria)
1,2 x 104 células/pmol PLFA (algas)
BM grupo-específica: soma de PLFAs do grupo
Dados quantitativos obtidos na análise de PLFA
Método 2. Quantificação do P na fase orgânica
Princípio: P na fase orgânica do extrato é derivado de
fosfolipídios.
Vantagem: simples, dispensa CG
Efeito da Substituição de Floresta por
Agricultura (Trigo ~26 anos) sobre a BM
30
20
15
16
17
18
19
20
21
18.873
22
23
23.513
23.058
23.136
23.251
22.861
22.172
22.291
22.345
22.460
22.521
22.581
21.896
21.761
21.532
21.592
20.693
20.805
20.916
20.989
21.098
20.266
19.830
19.934
20.004
20.122
19.686
19.409
19.515
19.245
18.942
19.022
18.803
18.417
18.486
18.134
17.833
17.654
17.325
21.324
23.321
50
23.570
22
23.257
23.318
21
22.460
22.523
21.896
21.761
21.210
21.316
21.415
21.532
21.593
20
20.985
20.694
20.808
19
19.935
20.006
19.686
19.410
19.513
18
19.243
17
18.802
18.875
18.935
19.020
18.038
17.733
17.540
16.935
21.424
21.220
18.045
Floresta
18.134
17.832
17.562
17.653
17.325
15
16
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180306.D)
16.943
16.077
16.187
15.625
15.345
15.510
30
16.080
16.188
60
15.343
40
15.511
20
15.111
60
14.820
14.874
14.946
pA
14.952
Método BM 1 (Soma dos PLFAs)
Floresta vs. Agricultura (Trigo ~26 anos)
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180305.D)
23
min
pA
Agricultura
50
40
min
Método BM 2. Quantificação do P na
Fase Orgânica do Extrato de Solo
•
Protocolo: White et al. (1979) (resumo)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Extração de lipídios totais, por 2 h (Bligh e Dyer, 1959);
Partição com NaCl 2 N;
Recuperação da fase orgânica (inferior);
Secagem sob N2 ultrapuro;
Digestão com ácido perclórico, 180oC (3-4h);
Adicionar solução molibdênio (White et al., 1979);
Após 10 min, adicionar solução de ANSA (1-amino-2-naftol-4ácido sulfônico);
Ferver por 10 min. em banho-maria;
Ler absorvância a 830 nm.
8.
9.
Comparação com Outros Métodos de
Deteminação da BM
(Frostegard et al., 1991)
• P-lipídio vs. SIR (respiração induzida por substrato)
SIR (g CO2/g solo) = 17,6 + 0,13 P-lipídio (nmol P/g solo)
R2 = 0,86
• P-lipídio vs. conteúdo celular de ATP
ATP (g ATP/g solo) = 0,92 + 0,0046 P-lipídio (nmol P/g solo)
R2 = 0,89
Estado Nutricional de Fungos do Solo
• Bååth, 2003
– Princípio: sob excesso de C e deficiência de N ou P, a
comunidade fúngica não cresce, mas acumula
lipídios.
– Experimento e Resultados:
• Glucose apenas: NL aumenta e PL permanece constante
• Glucose + N + P: NL constante e PL aumenta
– Bååth, E. Microbial Ecology, 45:373-383, 2003
Protocolo:
Estado Nutricional de Fungos do Solo
• Bååth et al., 2003
• Idem procedimento para estrutura da
comunidade, exceto:
–
–
–
–
Não descartar a fração LN
Fração de LN e PL são transesterificada
Relação NL:PL do FAME 18:26c (fungo)
Quanto maior a relação NL:PL maior é a deficiência
nutricional (N ou P) da comunidade fúngica
Respostas de Bactérias a Estresses
Ambientais
• Sob estresses (dessecamento do meio e
restrição nutricional)
– Aumento da relação entre FAMEs cíclicos e
precursores
• 19:0cy / 18:17c ou 17:0cy /16:17c
– Kieft et al., 1994, AEM, 60:3292-3299, 1994
– Custo de manutenção para mitigar estresse:
aumenta gasto de energia, menor eficiência de
conversão de carbono em biomassa microbiana:
impacto na conservação de MOS.
Experimento
(Fernandes, 2007)
• Incubação por 425 d, microcosmos, solo de Tabuleiros Costeiros, SE
(Argissolo amarelo)
• 3 resíduos x 2 N x 7 datas, 4 repetições
– Resíduos: controle, palha de milho, casca de coco
– Doses N: equivalente 15 e 150 kg N ha-1
– Datas: 12, 33, 54, 112, 212, 350 e 425 dias
– 130 aos 280 d sob seca (-1,5 MPa)
• Variável resposta: 19:0cy/18:17c
• Estatística: Regressão múltipla
– stepwise, forward
– Modelo inicial: grande média
– Modelo cheio: todas as interações entre todos os fatores
– F para incluir termos no modelo < 4,0
Regressão Múltipla (stepwise forward)
•
Call: lm(formula = ST ~ MILHO + TIME + UMIDO + TIME:MILHO, data
= STRESS.19.INCUB, na.action = na.exclude)
•
•
•
Residuals:
Min
1Q
Median
3Q
Max
-0.4682 -0.1053 -0.006328 0.111 0.6178
•
•
•
•
•
•
•
Coefficients:
•
•
•
Residual standard error: 0.1823 on 163 degrees of freedom
Multiple R-Squared: 0.8908
F-statistic: 332.3 on 4 and 163 df, the p-value is 0
(Intercept)
MILHO
TIME
UMIDO
TIME:MILHO
Value Std. Error t value Pr(>|t|)
1.9131
0.0448
42.7342
0.0000
-0.6297
0.0451
-13.9688
0.0000
0.0023
0.0001
20.2161
0.0000
-0.3261
0.0404
-8.0648
0.0000
-0.0011
0.0002
-5.6939
0.0000
19:0cy/18:7c = f(resíduo, t, umidade, N)
SECA
3.50
3.00
19:0 cy / 18:1w7c
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0
100
200
300
Dias de Incubação
400
500
• FIM
Obrigado pela atenção
Marcelo F. Fernandes
[email protected]
4009 1360