MANUTENÇÃO DE CANDIDA ALBICANS IN VITRO E PREPARO DE AMOSTRAS
PARA ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓPTICA
Érica Ribeiro Guerra Urtado, Adriana Barrinha Fernandes, Milene da Silva Melo,
Juliana Francielli Oenning, Carlos José de Lima
Universidade Camilo Castelo Branco - UNICASTELO/Instituto de Engenharia Biomédica, Rodovia
Presidente Dutra, Km 138 - São José dos Campos, SP
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Resumo - A candida albicans é um fungo oportunista que têm despertado estudos quanto aos melhores
métodos para a sua eliminação. No entanto, antecedendo a aplicação de um meio desinfetante, outras
etapas devem ser executadas pelo pesquisador, como o cultivo desse micro-organismo e visualização
microscópica. Este estudo objetivou elaborar e discorrer um protocolo no desenvolvimento dessas etapas,
descrevendo-as passo a passo, à fim de nortear a condução e execução das mesmas, facilitando o
desenvolvimento e andamento da pesquisa. Os resultados conferiram efetividade no processo, podendo-se
concluir que o uso do protocolo proposto contribui e pode conferir suporte à trabalhos futuros, sobretudo ao
pesquisador que desconhece como manipular esse micro-organismo.
Palavras-chave: Candida albicans, Microscopia Óptica, protocolo de pesquisa
Área do Conhecimento: Engenharia Biomédica, Isolamento do micro-organismo.
Introdução
A candida albicans é uma espécie de fungo
diplóide, oportunista, constantemente isolado em
infecções nosocomiais de grande importância,
podendo ser letal em pacientes graves e
imunussuprimidos. Nesse contexto, sabe-se que a
desinfecção é a principal aliada resolutiva e
quando eficaz, reduz consideravelmente as
concentrações de micro-organismos patogênicos
no ambiente, dificultando a ocorrência ou
propagação de infecções. (RIBEIRO, et al, 2004)
As técnicas de desinfecção fundamentadas nas
metodologias utilizam desinfetantes diversos e o
cloro e seus derivados são os mais utilizados por
possuir características: bactericida, virucida,
fungicida e esporicida. No entanto, segundo a
APECIH (2004), possui algumas desvantagens
como: de ser inativo em presença de matéria
orgânica; corrosivo em metais; de odor forte e
desagradável, de causar irritabilidade nos olhos e
mucosas, além de resultar em toxinas
cancerígenas como produto final. Esses fatores
têm despertado o interesse em diversos
pesquisadores na utilização de outros métodos
desinfetantes que minimizem esses efeitos
negativos, executando testes, sobretudo in vitro,
em seus experimentos.
Para que se utilize um método de eliminação
de leveduras nos experimentos laboratoriais,
primeiramente faz-se necessário o cultivo e
semeio do micro-organismo, bem como sua
identificação por visualização microscópica,
etapas que requerem atenção e manuseio correto
para o sucesso do intento, que por vezes geram
dúvidas na sua execução, principalmente da parte
do pesquisador que desconhece essas técnicas,
podendo resultar contaminação do cultivo e perda
do mesmo. Frente a esses fatores, este estudo
objetivou elaborar e discorrer um protocolo no
desenvolvimento dessas etapas, descrevendo-as
passo a passo, à fim de nortear a condução e
execução
das
mesmas,
facilitando
o
desenvolvimento e andamento da pesquisa. A
candida albicans foi a levedura de escolha, devido
sua importância patogênica e e alta incidência em
infecções de cunho nosocomial.
Metodologia
Este protocolo foi desenvolvido no Laboratório
de Microbiologia do Centro de Engenharia
Biomédica, pertencente a Universidade Camilo
Castelo Branco de São José dos Campos,
objetivando a preparação de candida albicans
para microscopia óptica como etapa preliminar de
testes desinfetantes. Para o cultivo, semeio e
análise, uma cepa de Candida albicans ATCC
(18804) que foi submetida aos seguintes passos:
Primeiramente, o meio de cultura Ágar
Saboraud Dextrose foi preparado - meio
recomendado para o cultivo de fungos
patogênicos e leveduras. Para esse experimento,
utilizou-se 250ml da água destilada e 16,2g de
meio, quantia indicada pra esse volume. Depois
de diluído por aquecimento e agitação foram
distribuídos em 10 tubos de vidro, limpos e secos,
25 ml da diluição em cada um, e logo foram
autoclavados. Enquanto ocorria esse processo,
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uma capela protetora para manuseio de meios
estéreis, sob luz UV, fora ligada, em torno de 40
minutos contendo duas placas de pétri estéreis.
Os tubos autoclavados foram removidos para
solidificarem sob uma superfície, em ângulo de 15º
e em temperatura ambiente. Desses tubos, um
deles, utilizou-se para preencher as placas de pétri
que estavam na capela de UV, de forma
asséptica.
Após a solidificação do meio nos tubos e
placas, na capela de UV, uma pequena porção da
cepa Candida albicans ATCC (American Type
Culture Collection) fora semeada nesses
recipentes, utilizando-se alças plásticas estéreis e
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a seguir, mantidas em estufa a 37 C, por um
período de 48h. A partir do crescimento do fungo,
foi feita então, a coloração de gram para
visualização microscópica da levedura.
Em uma lâmina contendo esfregaço seco,
gotas de corante violeta-de-metila foram pingadas
cobrindo o esfregaço agindo por 15 segundos; à
seguir, adicionou-se água destilada sobre o
corante, cobrindo toda a lâmina, agindo por mais
45 segundos. Após o tempo corrido, o corante foi
escorrido e o esfregaço foi lavado em um filete de
água. Logo, a lâmina foi coberta com lugol, que
agiu por 60 segundos e lavada em um filete de
água. Aplicou-se álcool etílico a 95% para
descorar a lâmina por 10 a 20 segundos e
novamente, lavou-se em um filete de água. A
seguir, toda a lâmina foi coberta com fucsina e
deixada a corar por aproximadamente 30
segundos. Após enxague, aguardou-se então a
secagem da lâmina e aplicou-se uma gota de óleo
de imersão sobre o esfregaço que posteriormente
fora observado no microscópio óptico marca
Reychert Polyvar 2 MET com objetiva 100X. Em
todo o tempo, o pesquisador manteve-se
paramentado
e
respeitando
os
padrões
assépticos.
Resultados
As etapas propostas como protocolo, de forma
clara e
sequencial, facilitam a execução da
pesquisa e demonstram eficácia, como observa-se
na figura 1, em que as leveduras apresentam-se
em sua forma caracterítica e desprovidas de
contaminação sob visualização microscópica.
A visualizado via figura 1, permitiu ainda observar
as dimensões da candida albicans, que é de
aproximadamente 5µm.
Discussão
As etapas elaboradas para o preparo da
Candida
albicans
demandaram
resultados
positivos e facilitadores atingindo a proposição
esperada quando se elabora um protocolo,
conforme apontaram Cummings e colaboradores
(2003), bem como Hulley (2003), que em seu
estudo expressou que quando esse instrumento
se apresenta organizado, de forma lógica e
eficiente funciona como um guia prático para o
andamento da pesquisa.
Ao avaliar a questão da contaminação não
ocorrida no preparo dos tubos e placas contendo
Candida albicans, pôde-se afirmar que os padrões
assépticos foram eficazes, pois segundo os
autores PAULA e colaboradores (2007) e APECIH
(2004) todo o ambiente conglomera microorganismos, os quais são encontrados nas mais
diversas superfícies, quer sejam elas de
equipamentos, ou de portas, maçanetas, pisos e
azulejos, contaminando todo o espaço físico.
Conclusão
Pôde-se concluir com este estudo que o uso do
protocolo proposto contribui e pode conferir
suporte à trabalhos futuros, sobretudo ao
pesquisador que desconhece o manipular dessas
técnicas.
Referências
Associação Paulista de /estudos e Controle de
Infecção Hospitalar (APECIH). Limpeza e
desinfecção de artigos e áreas hospitalares e antisepsia. 2ª ed. revisas. São Paulo, 2004.
Cummings, et al. Delineando a pesquisa clínica:
uma abordagem epidemiológica. 2ª Ed. Porto
Alegre: Artmed, p: 35-41, 2003.
Hulley, et al. Delineando a pesquisa clínica: uma
abordagem epidemiológica. 2ª Ed. Porto Alegre:
Artmed, p: 21-34, 2003.
Paula, C.R., et al. Infecção hospitalar fúngica:
Experiência em hospitais públicos de São Paulo.
Prática Hospitalar. São Paulo, v. 9, n. 52, p. 63-66.
2007.
Figura 1 – Imagens candida albicans a partir de
microcópio óptico.
Ribeiro, et al. Aspectos das leveduras de Cândida
vinculadas às infecções nosocomiais. News Lab.
Goiás. v. 64, n. 1, p. 106- 128. 2004.
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