EXTRAÇÃO DE GLICOPROTEINAS DA PAREDE CELULAR DE Candida
albicans COM LÍQUIDO DE COCA
Emília Ângela Sippert (PIBIC/CNPq-UNIOESTE), Daniela Cristina Tartari,
João Henrique de Souza, Taise da Silva, Rita de Cássia Garcia Simão,
Rinaldo Ferreira Gandra (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Centro de Ciências Médicas e
Farmacêuticas/Cascavel, PR.
Área Ciências da Saúde, subárea Farmácia
Palavras-chave: Candida albicans, SDS-PAGE, Líquido de Coca.
Resumo:
A levedura Candida albicans é um comensal comum de mucosas oral,
vaginal e trato gastrointestinal de humanos, provoca não só infecções
oportunistas em pacientes imunocomprometidos, mas também reações
alérgicas em pessoas sensibilizadas por C. albicans. O presente estudo
avaliou a capacidade do líquido de Coca em extrair glicoproteínas
consideradas antígenos fúngicos, de amostras de Candida albicans, sendo
visualizadas as bandas de proteínas através de eletroforese SDS-PAGE.
Concluímos que o Líquido de Coca apresentou boa capacidade de extração
de carboidratos e proteínas de Candida albicans, é um método simples e
barato podendo ser utilizados para extração de alérgenos fúngicos desta
espécie.
Introdução
Candida albicans é um fungo comensal comum na microbiota dos seres
humanos. No entanto, em hospedeiros predispostos a candidíase, com
AIDS, diabetes, transplantes de órgãos, tumores, estas leveduras podem
atuar como patógenos (1). Espécies comensais de Candida que habitam a
cavidade oral, canal vaginal e o trato gastrointestinal do hospedeiro podem
então começar o processo infeccioso (2).
A parede celular dos fungos é formada por aproximadamente 80 a
90% de carboidratos. Três constituintes básicos formam a porção
polissacarídica da parede celular: polímeros de glicose com ligações β-1,3 e
β -1,6 (β -glucanas); polímeros de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) com
ligações β-1,4 (quitina) e polímeros de manose (manana) em associação
covalente com proteínas (glicomanoproteínas). Além disso, a parede celular
apresenta proteínas (6 a 25%) e uma pequena porção de lipídeos (1 a 7%)
(3,4)
.
A literatura apresenta vários trabalhos que demonstram o
envolvimento de fungos nos processos alérgicos, sendo que muitas
pesquisas buscam parâmetros para o aprimoramento das técnicas de
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diagnóstico de alergia por estes microrganismos (5). Entre os fungos mais
envolvidos como agentes etiológicos encontram-se as leveduras do gênero
Candida (6). Na avaliação da hipersensibilidade a fungos, através do teste de
puntura, os alérgenos utilizados são os extratos brutos do próprio fungo,
obtidos através de diferentes métodos descritos na literatura. O nosso
trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade do líquido de Coca em
extrair glicoproteínas considerados antígenos fúngicos, de amostras de
Candida albicans.
Materiais e métodos
Foram utilizadas neste estudo 4 cepas de Candida albicans micotecadas no
Laboratório de Micologia do Laboratório de Análises Clinicas Estudo Pesquisa
e Extensão (LACEP) da Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Em
frascos de erlenmeyer contendo 200 mL de caldo Saboraund, foram
adicionados 105 UFC/mL de leveduras a partir de cultivos em Ágar
Saboraund por 48horas à 36-37°C. Esses frascos foram incubados por 5
dias à 36-37°C. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a
4.000 rpm por 5 minutos, em seguida foram lavadas três vezes com água
destilada estéril e colocadas em estufa a aproximadamente 40°C para
desidratação. As células secas e pesadas (0,700 g) foram colocadas em
contato com o Líquido de Coca, na concentração de 5% p/v (14 mL) e
mantidas à 4°C por uma semana. Em seguida as amostras foram
centrifugadas e no sobrenadante mediu-se a concentração de carboidratos
pelo método de antrona, posteriormente foram dialisados em membranas
semipermeáveis de sacos de diálise em água destilada a 4 °C com troca de
água 3 vezes ao dia durante 1 dia, foram liofilizadas e armazenadas a -20ºC.
As amostras liofilizadas foram precipitadas com acetona, o sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspendido em 100 μL de água deionizada estéril
para realização da dosagem de proteínas pelo Método de Bradford(7).
As proteínas foram submetidas a fracionamento, segundo seu peso
molecular, por eletroforese em gel de poliacrilamida acrescido de dodecil
sulfato de sódio (SDS-PAGE). Aplicou-se em cada canaleta do gel o
correspondente a 30 µg de proteínas, as condições de corrida utilizadas
foram: 100 miliamperes, 100 volts por aproximadamente 2 horas. Em
seguida os géis foram corados com “Cromassie Blue” onde permaneceram
por 12 horas. A descoloração foi realizada trocando-se o corante por solução
descorante, até que foram visíveis as bandas protéticas.
Resultados e Discussão
Com a incubação em meio de cultura de 105 UFC/mL de leveduras obteve-se
um peso de extrato seco de células para as 4 amostras variando de 0,793 à
1,570 g. A concentração de proteínas obtidas a partir da extração com o
Líquido de Coca demonstrou que, apesar da quantidade de extrato seco e
volume de líquido de Coca utilizados para a extração de proteínas serem
iguais para todas as amostras (0,700 g e 14 mL), a concentração de
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proteínas e de carboidrato variou de uma cepa para outra (cepa 1
apresentou maior concentração de proteínas e de carboidrato do que a 2, 3
e a 4), demonstrando a capacidade de extração do método como também as
diversidades bioquímicas existentes entres as amostras de Candida albicans
(Tabela 1).
Tabela 1: Concentração de proteínas e de carboidratos dos extratos de
parede celular de Candida albicans obtidos com Líquido de Coca.
Amostra de Candida
albicans
1
2
3
4
Concentração de
carboidratos (µg/mL)
2261,50
1982,35
1500,00
1494,12
Concentração de proteínas
(µg/mL)
11,54
11,11
10,48
10,29
A Figura 1 mostra o perfil eletroforético das amostras de Candida albicans
obtidos com o líquido de Coca. As amostras 1, 2, 3 e 4 apresentaram
respectivamente 4, 7, 6 e 3 frações protéicas, sendo que algumas frações
com pesos moleculares de aproximadamente 20, 30, 50 KDa são comuns
entre os quatro tipos de extratos.
M
1
2
3
1
3
2
4
4
KDa
120
100
80
70
60
50
30
20
15
10
Figura 1: perfil eletroforético SDS-PAGE de 4 amostras de Candida albicans extraídas com
Líquido de Coca, M: marcador .
Muitos procedimentos diferentes e Tampões têm sido utilizados para
extrato de alérgenos de fungos e nenhum procedimento padrão parece
apropriado para todas as espécies. Fatores reconhecidamente importantes e
que devem ser otimizados incluem o tampão de extração, tempo de extração
e as condições de extração como pH, temperatura, estes devem ser
determinados para cada espécie para uma maior eficiência. A extração
através do Líquido de Coca demonstrou que este método pode ser usado
para a extração de antígenos fúngicos para a espécie Candida albicans(8).
Recentemente, alguns dos principais alérgenos de proteínas de C.
albicans foram identificados por imunoblotting com anticorpos específicos de
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IgE humana. Shen et al.(9) e Savolainen et al. (8) identificaram pelo menos 16
componentes alergênicos com massas moleculares respectivamente
variando de 20-94 e 16-135 kDa, estes alérgenos reagiram com os
anticorpos das amostras de soro de cerca de 30 pacientes asmáticos. No
estudo feito por Shen et al.(9), anticorpos IgE de 77% das amostras testadas
reagiram com o componente antigênico de 40 kDa. No estudo feito por
Savolainen et al.(8), 77% das amostras de soro testadas reagiram com as
frações contendo a proteína de 46 KDa. Para ampliar estes estudos de
alergénos e estudar alergia por Candida, a identificação e caracterização da
ligação antígeno de Candida e IgE são essenciais.
Conclusões
O Líquido de Coca apresentou boa capacidade de extração de carboidratos
e de proteínas de Candida albicans, é um método simples e barato podendo
ser utilizados para extração de alérgenos fúngicos desta espécie.
Referências
1. Kaaren, G.V.; Joly, S. Carriage frequence, intensity of carriage, and
strains of oral yeast species vary in the pogression to oral candidíases
in guman immunodeficiency virus-positive individuals. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 341-350.
2. Mata, A.L.; Rosa, R.T.; Rosa, E.A.R.; Golçalves, R.B.; Höfling, J.F.
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electrophoresis analysis. Oral Microbiol. Immunol. 2000,15,350-354.
3. Lopez-Ribot, J. L.; Casanova, M.; Martinez, J. P. Characterization of
cell wall proteins of yeast and hydrophobic mycelial cells of Candida
albicans. Infect Immun. 1991, 59, 2324-32.
4. Cabib, E.; Roh, D. H.; Schmidt, M. Crotti, L.B.; Varma, A. The yeast
cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis.
J Biol Chem. 2001, 276,19679-82.
5. Horner, W. E.; Helbling,A.; Salvaggio, J. E.; Lehrer, S. B.; Fungal Allergens. Clinical Microbiology Reviews. 1995, 161–179.
6. Savolainen, J., A. Koivikko, K. Kalimo, E. Nieminen, and M. Viander.
IgE, IgA and IgG antibodies and delayed skin response towards Candida albicans antigens in atopics with and without saprophytic growth.
Clin. Exp. Allergy.1990, 549–554.
7. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Analyt. Biochem.1976, 72, 248-254.
8. Savolainen, J.; Viander, M.; Koivikko, A.; IgE, IgA and IgG-antibody responses to carbohydrate and protein antigens of Candida albicans in
asthmatic children. Allergy. 1990, 54- 63.
9. Shen, H.D., K. B. Choo, R. B. Tang, C. F. Lee, J.Y. Yeh, and S. H.
Han. Allergenic components of Candida albicans identified by immunoblot analysis. Clin. Exp. Allergy.1989,191- 196.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.