DIFERENCIAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS PELA COMPOSIÇÃO DA PAREDE
CELULAR IDENTIFICADAS ATRAVÉS DA ESPECTROSCOPIA RAMAN
Juliana Francielli Oenning de Souza; Livia Helena M. da Silva;
Landulfo Silveira Jr.; Marcos Tadeu T. Pacheco
Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade Camilo Castelo Branco, Parque Tecnológico de São José
dos Campos; Estr. Dr. Altino Bondesan, 500, São José dos Campos, SP, 12247-016
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Resumo: A identificação microbiológica realizada pelas técnicas tradicionais ainda é demorada e a
espectroscopia Raman pode ser uma técnica alternativa, proporcionando resultados precisos, rápidos e de
baixo custo. Este estudo demonstrou que a partir da técnica de espectroscopia Raman (excitação em 830
nm), cepas clínicas envolvidas em infecções do trato urinário podem ser classificadas de acordo com a
metodologia de coloração de Gram, em negativas e positivas; e utilizando a ferramenta estatística Principal
Components Analysis (PCA), foi possível discriminar o tipo de parede celular. A técnica de espectroscopia
Raman apresentou 100% de sensibilidade e especificidade em relação às bactérias do gênero
Staphylococcus spp. e Enterococcus sp.
Palavras-chave: espectroscopia Raman, bactérias, coloração de Gram.
Área de conhecimento: Engenharias
Introdução
Metodologia
A espectroscopia Raman é uma forma de
espectroscopia molecular no qual consiste em um
processo inelástico que ocorre quando uma
amostra é iluminada por uma fonte de luz
monocromática (laser). (GUIMARÃES et al., 2006).
Cada molécula tem o seu próprio espectro
característico e, dessa forma, o espectro Raman
pode fornecer uma “impressão digital” de uma
substância da qual a composição molecular pode
ser determinada (LORINCZ et al., 2004).
A principal vantagem desta técnica é
permitir que o procedimento de análise seja
realizado em tempo real, proporcionando
resultados mais precisos com baixo custo, sem
que seja necessário o uso de corantes ou
reagentes (SHEN et al., 2007).
Com
base
nas
dificuldades
de
identificação microbiológica, no qual são
realizadas técnicas tradicionais e bioquímicos
demoradas, em alguns casos podem demoram de
três a cinco dias (WALKER et al.; 1990), a
utilização de técnicas ópticas, como a
espectroscopia Raman, se torna uma ferramenta
alternativa.
Este estudo tem como objetivo discriminar,
pela espectroscopia Raman, diferentes cepas
clínicas do trato urinário, de acordo com a
metodologia de coloração de parede celular Gram,
em Gram-negativas e Gram-positivas, sem a
utilização de corantes ou reagentes, a partir das
diferenças espectrais obtidas pela técnica
Principal Components Analysis (PCA).
Foram utilizados 5 cepas de Escherichia
coli, 2 cepas de Enterococcus sp., 5 cepas de
Klebsiella pneumoniae, 2 cepas de Proteus
mirabilis, 2 cepas de Staphylococus aureus e 2
cepas
de
Staphylococcus
saprophyticus,
inoculadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion).
Após 48 horas em estufa bacteriológica (37°C),
foram retiradas 90 µL de cada amostra e
colocadas em poços de alumínio para realização
das análises espectrais.
Os espectros Raman foram adquiridos em
um espectrômetro Raman dispersivo que utiliza
como fonte de excitação um laser de diodo em
830 nm acoplado a um cabo de fibras ópticas
“Raman probe”, obtendo-se na saída do cabo
óptico cerca de 250 mW de potência laser. A
coleta do sinal luminoso espalhado pela amostra é
efetuada pelo “Raman probe” e este é acoplado ao
espectrômetro, que possui um espectrógrafo com
grade de difração de 1200 linhas/mm acoplado a
uma câmera CCD “back thinned, deep-depleted”
de
1340X100
pixels
refrigerada
termoeletricamente a -75°C. A aquisição e o
armazenamento dos espectros é realizada
utilizando o software RamanSoft (Lambda
Solutions, Inc., MA, EUA, modelo P1 microRaman), que controla via conexão USB do PC o
tempo de exposição do detector e o número de
aquisições
por
amostra
e
realiza
o
armazenamento dos espectros para posterior
análise e interpretação. O tempo de exposição
para a obtenção dos espectros foi de 5 s com 10
Encontro de Pós-Graduação e Iniciação Científica – Universidade Camilo Castelo Branco
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acumulações por espectro. Com objetivo de
determinar a reprodutibilidade dos resultados,
todas as cepas foram analisadas em cinco
repetições a partir de culturas independentes de
cada cepa da bactéria estudada (OLIVEIRA;
2012).
Por seguinte, os espectros foram
submetidos a uma etapa de pré processamento
para remoção da fluorescência de fundo através
da subtração de um polinômio de ordem cinco
(filtro passa-baixas) e remoção de ruídos espúrios
provenientes de raios cósmicos.
Para
desenvolver
um
modelo
diferenciação das espécies clínicas entre os
espectros Raman, de acordo com a semelhança
das
características
espectrais
aplicáveis
relacionadas com as espécies de bactérias, os
espectros obtidos foram submetidos à PCA, uma
ferramenta estatística que pode ser usada para
analisar dados de uma natureza multivariada, que
transforma um conjunto originais de variáveis
inter-correlacionados em um novo conjunto de
variáveis não correlacionadas, chamado de
componentes principais (PCs) de vetores
espectrais (OLIVEIRA; 2012).
A PCA foi calculada através de uma rotina
no software MATLAB 7.01 (“Statistics toolbox”)
utilizando todos os espectros das diferentes
cepas. As variáveis PCs foram plotadas em Excel.
Resultados
Após as análises por PCA, a maior
significância foi encontrada entre as variáveis PC2
X PC3 (Figura 1).
vermelho) das Gram-positivas (em roxo), inclusive
estas últimas pelo gênero. O modelo classificou os
gêneros Staphylococcus spp. e Enterococcus sp.
com 100% de sensibilidade e especificidade,
mesmo o experimento apresentando poucas
amostras. Oliveira et al. (2012) também
conseguiram, uma correta diferenciação das
bactérias Gram-negativas das Gram-positivas,
através da discriminação via PCA utilizando os
mesmos escores PC2 X PC3, com amostras
cultivadas em Mueller Hilton em placas de Petri e
biomassa retirada para aquisição dos espectros.
Estudos estão em desenvolvimento a fim
de aumentar o número de amostras em cada
grupo e o total de cepas usadas na discriminação.
Conclusão
No presente trabalho foi possível
discriminar cepas clínicas envolvidas em infecções
do trato urinário em Gram-negativas e Grampositivas. A espectroscopia Raman forneceu
informações
espectrais
reprodutíveis,
apresentando-se como um método confiável,
rápido,
fácil
execução,
baixo
custo,
e
principalmente sem a utilização de corantes e
reagentes sendo considerada uma ferramenta
promissora na Microbiologia.
Referências Bibliográficas
- GUIMARÃES, A.E. et al. Near Infrared Raman
Spectroscopy (NIRS): A technique for doping
control, Spectrosc. Int. J. 20: 185-194, 2006.
- LORINCZ, A. et al. Raman spectroscopy for
neoplastic tissue differentiation: a pilot study. J.
Pediatr. Surg. 39(6): 953-6; 2004.
- OLIVEIRA, S.S.F.; GIANA, H.E.; SILVEIRA, L.
“Discrimination of selected species of pathogenic
bacteria using near-infrared Raman spectroscopy
and principal components analysis. J. Biomed.
Opt. 17: 107004, 2012.
- SHEN, A. et al. Study on then in vitro and in
vivo activation of rat hepatic stellate cells by
Raman spectroscopy. J. Biomed. Opt. 12:
034003, 2007.
Figura 1- Plotagem binária das variáveis PC2 X
PC3.
- WALKER, H. K.; HALL, W. D.; HURST, J. W.,
Clinical Methods: The History, Physical, and
Laboratory Examinations. Boston: Butterworths,
1990, pp 999-1004.
Discussão
A partir das análises por PCA, foi possível
discriminar as bactérias Gram-negativas (em
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