I
Universidade Camilo Castelo Branco
Instituto de Engenharia Biomédica
FABRICIO LUIZ SILVEIRA
DISCRIMINAÇÃO DE TECIDOS DISPLASICOS E NEOPLASICOS DE
TECIDO NORMAL EM PELE in vivo ATRAVÉS DA ESPECTROSCOPIA
RAMAN E ESTATÍSTICA MULTIVARIADA.
DISCRIMINATION OF DYSPLASIA AND NEOPLASM FROM NORMAL SKIN
TISSUE in vivo THROUGH RAMAN SPECTROSCOPY AND STATISTICAL
MULTIVARIATE.
São José dos Campos, SP
2014
II
Fabricio Luiz Silveira
DISCRIMINAÇÃO DE TECIDOS DISPLÁSICOS E NEOPLÁSICOS DE
TECIDO NORMAL EM PELE in vivo ATRAVÉS DA ESPECTROSCOPIA
RAMAN E ESTATÍSTICA MULTIVARIADA.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
Tese de doutorado defendida no Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Biomédica da Universidade Camilo Castelo Branco, como
complementação dos créditos necessários para obtenção do título de
Doutor em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP
2014
III
IV
V
DEDICATÓRIA
Dedico esta conquista a meus pais, Landulfo e Maria Helena, e irmãos, de modo
especial ao Junior, por sempre me apoiarem e me incentivarem nos meus projetos.
Dedico também à minha noiva, Ana Paula, e agradeço por sua paciência e
cumplicidade em tudo.
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pois se esta minha consquitas pessoal não fosse
de seus planos, nada disto aconteceria. E de maneira especial a Nossa Senhora por
sempre me acolher em meus momentos de alegrias e aflições.
Aos meus pais, Landulfo e Maria Helena, pelos alicerces de companheirismo, amor,
e conhecimento transmitido através de suas vidas e, pelo incentivo e confiança que
sempre me deram.
Aos meus irmãos, Luciano, Fábio e de modo especial ao Junior, pelo grande
incentivo, companheirismo e dedicação uns para com os outros.
Agradeço a minha noiva, Ana Paula, por sempre me apoiar e por saber que posso
sempre contar com ela.
Agradeço ao Prof. Dr Renato Amaro Zângaro, Pró-Reitor de Pós-Graduação e
Pesquisa da Unicastelo, e ao Prof. Dr. Antonio G. J. Balbin Villaverde, coordenador
do Doutorado em Engenharia Biomédica pela oportunidade a mim dada e a todos os
professores que lecionaram durante a minha carreira acadêmica.
De modo especial agradeço ao meu orientador, Prof. Dr Marcos Tadeu T. Pacheco,
pela paciência, exemplo profissional e pelos ensinamentos, que me permitiram
cumprir mais uma etapa na minha carreia acadêmica.
Agradeço também a secretária e amiga Nídia, ao amigo Leandro por sempre
estarem disposto a me ajudar, e aos amigos do Instituto de Engenharia Biomédica
da Unicastelo, Henrique, Felipe, Milene, Viviane e tantos outros que passam pelo
Instituto.
Agradeço a FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)
pela concessão da bolsa de doutorado (Processo n. 2010/11111-0) e pelo apoio
financeiro ao projeto (Processos n. 2009/01788-5 e 2012/20666).
VII
EPÍGRAFE
“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas
grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que
alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam
muito nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra
cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.”
(Theodore Roosevelt)
VIII
DISCRIMINAÇÃO DE TECIDOS DISPLASICOS E NEOPLASICOS DE
TECIDO NORMAL EM PELE in vivo ATRAVÉS DA
ESPECTROSCOPIA RAMAN E ESTATÍSTICA MULTIVARIADA.
RESUMO
A espectroscopia Raman vem sendo empregada na discriminação de tecido
neoplásicos (cânceres de pele não melanoma), tecidos displásicos e tecidos não
neoplásicos (normais) in vitro e in vivo. Este estudo propõe a utilização da
espectroscopia Raman no infravermelho próximo para a discriminação in vivo entre
os cânceres de pele humana não melanoma (carcinoma basocelular - CBC,
carcinoma espinocelular - CEC), displasias (queratose actínica - KER) de lesões
benignas e tecidos normais. Os espectros foram obtidos in situ em lesões suspeitas,
pré-procedimento cirúrgico para biópsia excisional. Os espectros Raman de pele
normal foram obtidos em regiões adjacentes, diagnosticado clinicamente como
tecido normal. Os tecidos lesionados foram retirados e submetidos a exame
histopatológico. Os espectros Raman foram coletados utilizando um sistema Raman
portátil no infravermelho próximo, conectado a uma Probe (cateter a fibra óptica).
Foram desenvolvidos modelos de discriminação entre os diferentes grupos
histopatológicos baseados na Análise de Componentes Principais (PCA/DA), e como
critério de discriminação, as distâncias Euclideana, Quadrática e Mahalanobis;
também foi utilizada a análise discriminante baseado em Partial Least Squares
(PLS/DA). Os vetores espectrais de PCA e PLS mostraram algumas características
espectrais dos componentes bioquímicos da pele, como lipídios (PC2 e VL2) e
proteínas (PC4 e VL3). Os algoritmos baseados em PCA e PLS, empregando seis
variáveis, mostraram que podem discriminar os espectros de câncer de pele não
melanoma e displasias (CBC, CEC e queratose actínica), dos espectros de pele
normal e benigno (tecido benigno e normal), com uma precisão de 82,8% e 91,9%,
respectivamente, apesar das pequenas diferenças espectrais entre tecidos
neoplásicos e não neoplásicos.
IX
Palavras-chave: Espectroscopia Raman no Infravermelho Próximo, Pele, in vivo,
Diagnóstico, Análise Discriminante, Análise de Componentes Principais, Partial
Least Squares.
X
DISCRIMINATION OF DYSPLASIA AND NEOPLASM FROM NORMAL
SKIN TISSUE in vivo THROUGH RAMAN SPECTROSCOPY AND
STATISTICAL MULTIVARIATE.
ABSTRACT
Raman spectroscopy has been used in the discrimination of neoplastic tissue (nonmelanoma skin cancers), and dysplastic tissue from normal (not neoplastic tissues) in
vitro and in vivo. This study proposes the use of near-infrared Raman spectroscopy
for in vivo discrimination between human skin cancer non-melanoma (basal cell
carcinoma - BCC, squamous cell carcinoma - CPB), dysplasias (actinic keratosis KER) from benign lesions and normal tissues. The spectra were obtained in situ in
suspicious lesions, pre-surgical procedure for excisional biopsy. The Raman spectra
of normal skin were obtained from adjacent regions clinically diagnosed as normal
tissue. The injured tissues were removed and subjected to histopathological
examination. The Raman spectra were collected using a portable near infrared
Raman system, connected to a Probe (catheter optical fiber). Models of
discrimination between different histopathological groups were developed based on
Principal Component Analysis (PCA/DA), and as a discrimination criterion, Euclidean,
quadratic and Mahalanobis distances; discriminant analysis based on Partial Least
Squares (PLS/DA) was also used. The spectral vectors PCA and PLS showed some
spectral characteristics of the biochemical components of the skin, such as lipids
(PC2 and VL2) and proteins (PC4 and VL3). The algorithms based on PCA and PLS,
using six variables, showed that they can discriminate the spectra of non-melanoma
skin cancer and dysplasia (BCC, SCC and actinic keratosis) spectra of normal and
benign (benign and normal tissue) skin with an accuracy of 82.8% and 91.9%,
respectively.
Keywords: Near Infrared Raman Spectroscopy, Skin, in vivo, Diagnosis,
Discriminant Analysis, Principal Component Analysis, Partial Least Squares.
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Camadas da pele. ..................................................................................... 22
Figura 2: Figura representativa das camadas da epiderme. .................................... 23
Figura 3: Camadas da epiderme. Mibração celular para a superfície da epiderme. 24
Figura 4: Espectro eletromagnético com o espectro de luz visível espandido. ........ 29
Figura 5: Esquema representativo para diferenciar os tipos de espalhamento. E0,
estado fundamental - E1, estado virtual excitado - νi, frequência inicial do fóton
incidente - νf, frequência final do fóton espalhado. .................................................... 40
Figura 6: Sistema de Espectroscopia Raman Dispersiva. ........................................ 41
Figura 7: Tabela de Contingência (matriz de confusão). .......................................... 49
Figura 8: Momento da coleta dos espectros Raman no paciente............................. 52
Figura 11: Gráfico dos seis primeiros vetores variantes de PCA e PLS (PCs e VLs,
respectivamente) para o conjunto de dados dos espectros Raman. ......................... 61
Figura 12: Gráfico das médias das intensidades e desvio-padrão dos seis primeiros
scores PCs utilizados nos modelos discriminnates. * Indica os pares de PC com
diferenças estatisticamente significantes (p <0,05, ANOVA). ................................... 63
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Descrição das amostras, incluindo número de pacientes, lesões e
espectros utilizados na análise de discriminação. ..................................................... 53
Tabela 2: Resultados da discriminação: classificação correta por grupo; e precisão
global dos diferentes arranjos dos grupos histopatológicos. ..................................... 65
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CBC: Carcinoma Basocelular
CEC: Carcinoma Espinocelular
KER: Queratose actinica
NT: Não Tumor
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
RNA: Ácido Ribonucleico
FDA: Food and Drug Administration (Orgão federal americano que controla
alimentos, suplementos alimentares, medicamentos (humano e animal), cosméticos
e entre outros.
INCA: Instituto Nacional do Câncer
WHO: World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
OMS: Organização Mundial da Saúde
PCA: Análise de Componentes Principais (Principal Components Analisys)
PC: Componentes Principais
SVD: Decomposição do Valor Singular
PCA/DA: Análise de Componentes Principais/Análise Discriminante
PLS/DA: Mínimos Quadrados Parciais/ Análise Discriminante
XIV
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 16
1.1. Objetivo geral ................................................................................................. 20
1.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21
2.1. A Pele............................................................................................................. 21
2.1.1. Estrutura e fisiologia .................................................................................... 21
2.1.2. Epiderme ..................................................................................................... 22
2.1.2.1. Sistema queratinocítico ............................................................................ 23
2.1.2.2. Camada basal .......................................................................................... 25
2.1.2.3 Camada espinhosa ................................................................................... 25
2.1.2.4. Camada granulosa ................................................................................... 26
2.1.2.5. Camada córnea ........................................................................................ 26
2.1.3. Melanócitos ................................................................................................. 26
2.1.4. Derme ......................................................................................................... 27
2.1.5. Hipoderme................................................................................................... 27
2.2. Radiação Solar............................................................................................... 28
2.2.1 Radiação Solar Ultravioleta (UV) ................................................................. 29
2.2.1.1. Radiação Ultravioleta A (UVA) ................................................................. 29
2.2.1.2 Radiação Ultravioleta B (UVB) .................................................................. 30
2.2.1.3 Radiação Ultravioleta C (UVC) .................................................................. 30
2.3. Câncer............................................................................................................ 31
2.4. Carcinogenese ............................................................................................... 32
2.5. Câncer de pele ............................................................................................... 35
2.5.1. Ceratose actínica ........................................................................................ 36
2.5.2. Carcinoma basocelular................................................................................ 37
2.5.3. Carcinoma espinocelular ............................................................................. 38
2.6. Espectroscopia Raman .................................................................................. 38
2.7. Estatística multivariada - Análise multivariada ............................................... 41
2.7.1. Análise de agrupamento ............................................................................. 42
2.7.2. Análise de Componentes Principais ............................................................ 44
2.7.3. Medidas de distância................................................................................... 45
XV
2.7.6. Análise de variância (ANOVA) .................................................................... 47
2.7.7. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS).................................... 47
2.8.7. Tabela de Contingência (matriz de confusão) ............................................. 48
3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 51
3.1. Coleta dos espectros ..................................................................................... 51
3.1.1. Critério de inclusão e exclusão ................................................................... 51
3.1.2. Preparação e aquisição dos espectros ....................................................... 51
3.2. Equipamento Raman e processamento dos espectros .................................. 53
3.2. Modelos espectrais para análise discriminante .............................................. 54
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 57
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 66
6. CONCLUSÃO........................................................................................................ 72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 73
ANEXO A - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa ........................................ 81
16
1. INTRODUÇÃO
Durante séculos, o câncer foi amplamente considerado como uma doença dos
países desenvolvidos. Porém, a cerca de quatro décadas, a situação mudou, e a
maioria das mortes globais por câncer foram observadas nos países em
desenvolvimento, especialmente aqueles com poucos recursos. Assim, nas últimas
décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, tornando-se um problema de saúde
pública em todo o mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima uma
incidência de 27 milhões de casos de câncer para o ano de 2030 (FERLAY et al.,
2010; INCA, 2012). A falta de dados estatísticos, causada pela negligência nos
registros e a falta de comunicação entre os órgãos responsáveis pela coleta dos
registros, torna mais difícil às estimativas para o câncer de pele não melanoma, mas
a expectativa é de uma incidência atual de 2 a 3 milhões de cânceres de pele não
melanoma em todo o mundo (WHO, 2012). No Brasil, as estatísticas de câncer, para
2014, segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), indicaram 576 mil novos
casos de câncer, deste total, já o câncer de pele não melanoma terá uma incidência
em 182 mil novos casos (INCA, 2014). Estes dados estatísticos desempenham um
papel importante para o desenvolvimento e a implantação de políticas de saúde
pública, e a tomada de decisões sobre programas preventivos e detecção de
doenças em estágios precoce (HANLON et al., 2000; INCA, 2014; PARKIN et al.,
2001).
Por conta desta crescente taxa de incidência de câncer, o desafio da medicina
moderna é desenvolver técnicas que investiguem as alterações morfológicas e
bioquímicas, promovendo assim informações importantes para o diagnóstico
precoce in situ, de maneira não invasiva, não destrutiva e em tempo real em fluidos
ou tecidos biológicos (HANLON et al., 2000). As técnicas de espectroscopia
vibracional, em particular, a espectroscopia Raman, tem o potencial de se estudar a
evolução de tecidos doentes e tem sido utilizadas em vários estudos para o
diagnóstico in vitro e in vivo de tecidos biológicos, como próstata, gástrico, mama,
entre outros (HAKA et al., 2006; HUANG et al., 2010; KENDALL et al., 2011; MAGEE
et al., 2009; MOTZ et al., 2006; STONE et al., 2007).
Tecidos normais e anormais têm diferenças na constituição bioquímica e
morfológica, que são causados principalmente por diferenças no metabolismo ou
17
mudanças nas estruturas e funções celulares, principalmente relacionados à
proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, diferenças estas que poderiam ser usadas
para a discriminação entre os tecidos (DE JONG et al., 2006; HANLON et al., 2000;
LYNG et al., 2007; STONE et al., 2007). Essas alterações nestes tecidos podem ser
prontamente detectadas pela espectroscopia Raman, técnica a qual tem sido
considerada como uma ferramenta promissora para discriminar alterações dos
tecidos benignos e malignos em diferentes patologias (HANLON et al., 2000). A
utilização da espectroscopia com excitação no infravermelho próximo tem uma
vantagem importante, a diminuição da autofluorescência da amostra em tecidos
biológicos (SMITH; DENT, 2005). Sistemas de espectroscopia Raman com cateteres
a fibra óptica proporcionam a coleta dos espectros Raman com uma maior
autonomia e liberdade para a análise em fluidos e em tecidos in vitro e in vivo (HAKA
et al., 2006; HANLON et al., 2000; MOTZ et al., 2006; ZHAO et al., 2008). Sistemas
de espectroscopia Raman automatizados foram recentemente propostos para uma
avaliação in vivo dos tecidos biológicos de maneira rápida, com tempos menores do
que 1 s (MOTZ et al., 2006; ZHAO et al., 2008).
A espectroscopia Raman vem sendo utilizada para avaliar diferenças na
composição molecular de estrutura nas camadas da pele in vivo (CHRIT et al., 2005;
GREVE; ANDERSEN; NIELSEN, 2008). Darvin et al. (2005) realizaram um estudo
para determinação da quantidade de carotenoides na pele in vivo, utilizando a
espectroscopia Raman ressonante em 514 nm. Mais recentemente, Calin et al.
(2013) realizaram uma revisão da literatura, para determinar qual técnica óptica,
entre a tomografia óptica de coerência, espectroscopia de fluorescência,
espectroscopia de refletância, espectroscopia Raman e microscopia confocal,
proporciona um melhor diagnóstico para o câncer de pele. Nesta revisão, a
espectroscopia Raman mostrou ter melhores resultados de diagnóstico, tanto para
carcinomas como para melanoma, com sensibilidades e especificidades acima de
90% e 50%, respectivamente.
Estudos mostram a utilização da espectroscopia Raman para discriminação
de lesões de pele não melanoma em comparação com tecidos de pele normal (CHOI
et al., 2005; FENDEL; SCHRADER, 1998; GNIADECKA et al., 2004; GNIADECKA et
al., 1997a; GNIADECKA et al., 1997b; LIEBER et al., 2008a; LIEBER et al., 2008b;
NIJSSEN et al., 2002; NUNES et al., 2003). Alguns estudos utilizam algoritmos com
base em métodos estatísticos para a discriminação de lesões em tecidos de pele in
18
vitro e in vivo a partir de tecidos normais (BODANESE et al., 2012; BODANESE et
al., 2010; CHOI et al., 2005; GNIADECKA et al., 2004; GNIADECKA et al., 1997b;
LIEBER et al., 2008a; NIJSSEN et al., 2002; SIGURDSSON et al., 2004). Os
métodos estatísticos, como a Análise de Componentes Principais (PCA - Principal
Components Analysis), que é uma técnica de redução de dados, podem ser
utilizados para um grupo de espectros com características selecionadas de acordo
com diferenças na patologia do tecido, através de uma adequada técnica de
discriminação (tal como Análise Discriminante Linear - LDA utilizando as distâncias
Euclidiana, Quadrática ou Mahalanobis) aplicada aos componentes principais mais
relevantes (HANLON et al., 2000). Modelos de diagnóstico utilizando estatística
multivariada, como PCA foram aplicadas visando o diagnóstico de câncer com alta
sensibilidade e especificidade (BODANESE et al., 2012; BODANESE et al., 2010;
GNIADECKA et al., 2004; NUNES et al., 2003; SIGURDSSON et al., 2004), além de
modelos espectrais que detectam alterações bioquímicas que ocorrem nos tecidos
biológicos (DURAIPANDIAN et al., 2013; HU et al., 2013; HUTCHINGS et al., 2010;
KOLJENOVIĆ et al., 2004; LUO et al., 2013; MALINI et al., 2006).
A espectroscopia Raman tem sido empregada a fim de discriminar lesões de
pele não melanoma quando comparado com tecidos normais in vitro (BODANESE et
al., 2012; BODANESE et al., 2010; CHOI et al.,2005; FENDEL; SCHRADER, 1998;
GNIADECKA et al., 2004; GNIADECKA et al., 1997a; GNIADECKA et al., 1997b;
LARRAONA-PUY et al., 2009; LIEBER et al., 2008a; NIJSSEN et al., 2002;
SIGURDSSON et al., 2004) e in vivo (CHRIT et al., 2005; HUANG et al., 2004;
HUANG et al., 2001; LIEBER et al., 2008b; LUI et al., 2012; PHILIPSEN et al., 2013;
ZHAO et al., 2008). Uma das primeiras tentativas para a obtenção de um espectro
Raman de pele in vivo, para diagnóstico clínico, foi realizada por Huang et al. (2001),
na qual um espectro Raman de boa qualidade foi obtido com tempo de um segundo,
com o uso de um espectrógrafo de dispersão, uma câmera CCD (charge coupled
device) e um cateter a fibra (Probe). Lieber et al. (2008b) desenvolveram um sistema
Raman confocal portátil com uma Probe, para o estudo clínico de câncer de pele não
melanoma (CBC e CEC), comparado ao tecido normal, em 19 pacientes, na qual foi
obtida uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 91%, utilizando um
algoritmo de classificação baseado em Sparse Multinomial Logistic Regression
(SMLR) Zhao et al. (2008) demonstraram um sistema integrado de espectroscopia
Raman em tempo real para avaliação e caracterização da pele humana in vivo, onde
19
o tempo completo para coleta dos dados e processamento do espectro pode ser da
ordem de 100 ms. Lui et al. (2012) realizaram um estudo in vivo, com um
espectrômetro Raman de 785 nm, associado a uma Probe, para o diagnóstico de
câncer de pele, com um tempo de aquisição de um segundo, equipamento este, tal
como descrito em Huang et al. (2001). O estudo realizado por Lui et al. (2012) para a
discriminação dos tecidos de pele, foi realizado através de dois modelos
discriminantes diferentes, Análise de Componentes Principais (PCA - Principal
Components Analysis) e nos Mínimos Quadrados Parciais (PLS - Partial Least
Squares), em 518 amostras de 453 pacientes. As amostras de tecidos incluem
lesões benignas e malignas, tais como melanomas, carcinomas basocelulares,
carcinomas espinocelulares, queratose actínica, queratose seborreica, e nevos, os
resultados apresentam uma alta sensibilidade e especificidade.
Alguns estudos utilizam algoritmos, baseados em métodos estatísticos para a
discriminação de lesões em tecidos da pele a partir da pele normal, tanto in vitro
como in vivo (BODANESE et al., 2012; BODANESE et al., 2010; CHOI et al., 2005;
GNIADECKA et al., 2004; GNIADECKA et al, 1997a; HUANG et al., 2001; LIEBER et
al., 2008a; LIEBER et al., 2008b; NIJSSEN et al., 2002; SIGURDSSON et al., 2004).
Os métodos estatísticos incluindo a estatística multivariada PCA, que é uma técnica
de redução de dados, podem ser utilizados para um grupo de espectros com
características selecionadas, de acordo com as diferenças na patologia, por meio de
uma função de discriminação adequada, como a distâncias Euclidiana, Quadrática
ou de Mahalanobis, aplicada aos componentes principais mais relevantes (HANLON
et al., 2000). Modelos de discriminanação utilizando PCA (PCA/DA - Principal
Components Analysis/Discriminant Analysis) foram aplicados, com o objetivo de
diagnóstico de câncer com uma alta sensibilidade e especificidade (BODANESE et
al., 2012; BODANESE et al., 2010; GNIADECKA et al., 1997b; HU et al., 2013;
HUTCHINGS et al., 2010; KOLJENOVIĆ et al., 2004; LUO et al., 2013; MALINI et al.,
2006), correlacionando as alterações espectrais, alterações bioquímicas e biológicas
nos tecidos com os coeficientes dos componentes principais (BODANESE et al.,
2012; BODANESE et al., 2010). PLS é outra técnica multivariada empregada para
redução de dados, e que tem sido utilizada para fins de classificação e
discriminação, em diversos estudos em tecidos biológicos e fluidos (EVERS et al.,
2012; HUANG et al., 2004; LI et al., 2012; LLOYD et al., 2013). Discriminação por
PLS (PLS/DA - Partial Least Squares/Discriminant Analysis) poderia ser utilizado
20
com sucesso onde a variabilidade "intra grupos" é maior do que a "inter grupos"
(BARKER; RAYENS, 2003). PLS/DA tem sido usada para discriminar neoplasias
primárias e secundárias, a partir de tumores benignos, em linfonodos em cabeça e
pescoço, com uma maior taxa de sucesso quando comparado ao PCA/DA (LLOYD
et al., 2013).
1.1. Objetivo geral
O objetivo do presente trabalho é apresentar os resultados de diferentes modelos
estatísticos discriminantes, para o diagnóstico de neoplasias de pele [câncer de pele
não melanoma (carcinoma basocelular - CBC, carcinoma espinocelular - CEC)],
displasia (queratose actínica - KER) e de tecidos não alterados (normal e benigno NT) em pele humana in vivo, utilizando as estatísticas multivariadas, PCA e PLS.
Este trabalho foi realizado utilizando espectros Raman de pele in vivo obtidos de
pacientes que passariam por procedimento de biópsia excisional já prevista.
1.2. Objetivos específicos
•
1 - Mostrar os resultados estatísticos dos modelos discriminantes PCA/DA e
PLS/DA
•
2 - Comparar os modelos estatísticos PCA e PLS para a discriminação de
tecido normal das neoplasias de pele in vivo.
•
3 - Indicar qual dos modelos discriminantes obteve o melhor resultado para a
discriminação entre tecido normal e as neoplasias.
21
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A Pele
A pele do homem, que corresponde a cerca de 15% do peso corporal, é um órgão
que reveste e delimita o organismo, protegendo-o e interagindo com o meio exterior.
Caracteristicamente dinâmica, a pele apresenta alterações constantes, sendo dotada
de grande capacidade renovadora e de reparação, e com certo grau de
impermeabilidade. Tem como função maior e vital a conservação da homeostasia
(termorregulação, controle hemodinâmico e excreção de metabólitos). Desempenha
ainda, função sensorial, através dos elementos do sistema nervoso situado na
derme, e função de defesa contra agressões físicas, químicas e biológicas, para qual
se destacam, pela sua importância, a queratinização, o manto lipídico e seu sistema
imunológico (AZULAY; AZULAY, 2004; ZAIDI; LANIGAN, 2010).
No início do século XX, o patologista Rudolph Virchow compreendeu a pele
como sendo uma cobertura e uma barreira protetora para os órgãos viscerais
internos, e também como uma barreira passiva contra a perda de fluídos e lesão
mecânica. Durante as cinco últimas décadas, os inúmeros projetos científicos têm
mostrado a pele como um órgão altamente complexo, na qual suas interações
celulares e moleculares precisamente reguladas controlam respostas cruciais ao
nosso organismo (AZULAY; AZULAY, 2004).
2.1.1. Estrutura e fisiologia
A pele é composta basicamente por três camadas interdependentes: a epiderme, a
mais externa, a derme, a intermediária, e a hipoderme, a mais profunda (Figura 1). A
transição entre a epiderme e a derme é denominada junção dermoepidérmica ou
zona da membrana basal (AZULAY; AZULAY, 2004; KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005; ZAIDI; LANIGAN, 2010).
22
Figura 1: Camadas da pele)
Fonte: Santos (2013)
2.1.2. Epiderme
A epiderme, basicamente, é um tecido epitelial estratificado queratinizado, com
variações estruturais e funcionais significativas na dependência do seu sítio
anatômico, cuja espessura apresenta variações desde 0,04 mm na área das
pálpebras até 1,6 mm na região palmo-plantares. É constituída por: sistema
queratinocítico,
composto
por células
epiteliais
denominadas
queratinócitos
(ceratinócitos), responsáveis pelo corpo da epiderme e de seus anexos (pelos,
unhas e glândulas); sistema melânico, formando pelos melanócitos; células de
Langerhans, com função imunológicas; células de Merkel, integradas ao sistema
nervoso e células dendríticas que fazem parte do sistema imunológico. A derme
desempenha uma influência reguladora sobre a morfogênese e diferenciação
epidérmica, sendo fundamental para a determinação de sua espessura, arquitetura,
tipo de diferenciação e padrão dos seus anexos (AZULAY, AZULAY, 2004;
SAMPAIO, RIVITTI, 2001; ZAIDI; LANIGAN, 2010).
A epiderme é constituída de um epitélio pavimentoso estratificado, estruturado
em 4 ou 5 camadas de células, dependendo da região do corpo (Figura 2): (ANVISA,
2014)
•
camada basal - a mais profunda e em contato com a derme, formada de
células pouco diferenciadas e de forma cúbica, que se multiplicam
incessantemente;
•
camada espinhosa - constituída de células mais achatadas, queratinizadas,
que estabelecem contato estreito umas com as outras através de
desmossomas;
23
•
camada granulosa - contendo células achatadas, ricas em queratina e fibras
de colágeno, e contendo lisossomos ricos em enzimas;
•
camada lúcida - presentes na pele glabra (região do corpo sujeitas a maior
atrito e têm uma camada mais grossa, como palmas das mãos e pés), ela
apresenta células achatadas, de aspecto hialino, contendo enzimas autodigestivas, responsáveis pela destruição de suas organelas citoplásmicas e
seus núcleo;
•
camada córnea - formada de células muito achatadas, cujo citoplasma contém
quantidades importantes de queratina.
Figura 2: Figura representativa das camadas da epiderme
Fonte: Tavares (2013)
2.1.2.1. Sistema queratinocítico
Responsável por pelo mesmo 80% das células epidérmicas, é caracterizado pela
disposição lado a lado de suas células e por sua constante renovação. O alto índice
de multiplicação celular dos queratinócitos da sua camada mais profunda, a camada
basal, fornece as células, que, a seguir, vão gradativamente se modificando (por
diferenciação) e migrando para a superfície, formando a camada espinhosa. Essas
células, após passarem por um rápido estágio em que se apresentam com o
citoplasma mais basofílico e granuloso, a camada granulosa, transformam-se
subitamente em células anucleadas, corneócitos, sendo então eliminadas para o
24
meio ambiente na camada mais externa da epiderme, a camada córnea (AZULAY;
AZULAY, 2004; ZAIDI; LANIGAN, 2010).
Figura 3: Camadas da epiderme. Mibração celular para a superfície da epiderme.
Fonte: Tavares (2013).
O citoesqueleto de todas as células eucarióticas é composto por uma
complexa rede de proteínas estruturais com diferentes diâmetros de espessura,
incluindo microfilamentos de actina (6 nm), os filamanetos intermediários (10 nm) e
os microtúbulos (25 nm). No queratinócito e demais células epiteliais, os filamentos
intermediários ou tonofilamentos são compostos por queratina; eles se dispõem em
torno do núcleo e vão se conectando até alcançarem as placas desmossômicas e
nelas inserir-se, ajudando a compor o citoesqueleto dessas células (AZULAY,
AZULAY, 2004).
Além da função estrutural, os queratinócitos participam ativamente dos
processos inflamatórios e imunológicos, seja como célula alvo (por exemplo,
psoríase),
seja
como
secretores
de
citosinas,
neuropeptídios
e
outros
medicamentos. O queratinócito é capaz de produzir substâncias com ação
autócrinas (agem sobre si mesmas), parácrinas (ação sobre as células vizinhas) e,
em situações especiais, endócrinas (ação à distância) (AZULAY, AZULAY, 2004).
25
2.1.2.2. Camada basal
A camada basal é uma camada celular mais profunda da epiderme, tem participação
vital na formação e manutenção da junção dermoepidérmica. Na pele normal, ela é
composta por uma única fileira de queratinócitos justapostos, a maioria com
capacidade de multiplicação, as células germinativas, que apresentam morfologia
colunar, citoplasma basófilo e núcleo grande e oval. A população dessas células é
heterogênea; um pequeno percentual é composto de células-tronco caracterizadas
por uma velocidade baixa de mitose durante toda a vida, gerando clones de
queratinócitos denominadas células de amplificação transitória, que se dividem muito
mais rapidamente, mas são programadas para um número limitado de mitoses. A
mitose das células de amplificação transitória dá origem à células com
características diferentes: uma nova célula de amplificação transitória, que
permanece na camada basal e outra, denominada pós-mitótica ou diferenciada, que
perde a capacidade de mitose e inicia o processo de diferenciação queratinocítica e
de migração em direção até a superfície. A renovação completa, desde a divisão da
célula basal até a eliminação das lâminas córneas, faz-se em 52 a 72 dias, assim
distribuídos: o tempo de duração da divisão celular é de aproximadamente 19 dias, o
trânsito através da camada espinhosa dura de 26 a 42 dias e o trânsito através do
estrato córneo é de 19 dias (AZULAY, AZULAY, 2004; ZAIDI, LANIGAN, 2010).
2.1.2.3 Camada espinhosa
Ao deixarem a camada basal rumo à superfície, os queratinócitos sofrem contínuas
e importantes modificações morfológicas, moleculares e histoquímicas, passando a
ser poligonais, de citoplasma acidófilo e rico em desmossomos, sendo denominadas
células espinhosas ou células de Malpighi. Essas células são numerosas e dispostas
em várias fileiras, cujo número varia na dependência da localização anatômica e dos
fatores endógenos (por exemplo, hormônios, vascularização, etc) e exógenos (por
exemplo, ultravioleta, trauma, etc). Ao progredirem na sua migração, as células
espinhosas vão se achatando e tornando-se cada vez mais acidófilas. Embora os
desmossomos estejam presentes em toda a epiderme, é na camada espinhosa que
se mostram mais numerosos (AZULAY; AZULAY, 2004).
26
2.1.2.4. Camada granulosa
Ao deixarem a camada espinhosa em direção à superfície, as células formarão
algumas fileiras em que se apresentarão repletas de grânulos basófilos de queratohialina no citoplasma, constituindo a camada granulosa. Essa camada caracteriza-se
por grande atividade metabólica, objetivando a síntese dos elementos necessários
ao processo final de cornificação, que resultará no súbito surgimento da camada
córnea. Esses elementos são armazenados, em grande quantidade, na sua forma
pré-ativada, tanto no interior de organelas como livremente. Os grânulos de ceratohialina são constituídos por pró-filagrina, filamentos de ceratina e loricrina. Os
granulos lamelares, morfologicamente semelhantes aos lipossomos, contendo no
seu interior glicoproteínas, ácidos graxos, fofolipídios, glicosilceramidas e colesterol,
são inicialmente vistos nas células das porções superiores da camada espinhosa,
mas é na camada granulosa que se apresentam em grande número. Esses
componentes químicos se depositarão na forma de bainha dupla em torno de cada
célula, originando uma grande barreira lipídica à passagem de água e substâncias
polares da epiderme, formando assim uma relativa barreira lipídica da pele
(AZULAY; AZULAY, 2004).
2.1.2.5. Camada córnea
Sendo a camada mais externa da epiderme, constitui o verdadeiro limite entre o
indivíduo e o meio ambiente. As células são acidófilas e extremamente planas,
sendo as células mais largas do organismo, o que permitirá a sua descamação e a
mobilidade da região sem provocar dano à integridade do tecido (AZULAY; AZULAY,
2004).
2.1.3. Melanócitos
Os melanócitos são células dendríticas derivadas da crista neural e produtores do
pigmento intrínseco da pele, a melanina, sendo esta responsável pela absorção e
difusão das radiações ultravioletas. São vistos predominantemente na camada
basal, na proporção de 1 melanócito para 10 queratinócitos basais (AZULAY;
AZULAY, 2004).
27
2.1.4. Derme
A derme é uma camada de tecido conjuntivo, composta por um sistema integrado de
estruturas fibrosas, filamentosas e amorfas, na qual são acomodados vasos, nervos
e anexos epidérmicos. Fibroblastos, histiócitos, células dendríticas e mastócitos são
suas células residentes, enquanto linfócitos, plasmócitos e outros elementos
celulares do sangue são encontrados em número variável e de forma transitória. Sua
interação com a epiderme é fundamental para manutenção dos dois tecidos: ambos
colaboram na formação da junção dermoepidérmica e dos anexos epidérmicos,
assim como no processo de reparação da pele. A camada da derme é constituída
basicamente por colágeno, fibras elásticas e as substâncias proteoglicanas e
glicosaminoglicanas. O colágeno é distribuído amplamente pelos tecidos conjuntivos
da derme, e provê resistência e elasticidade ao tecido. As fibras elásticas estão
presentes em quase todos os órgãos em proporções variáveis. Na pele, essas fibras
formam uma rede que se estende da junção dermoepidérmica ao tecido conectivo
da hipoderme. Estas fibras formam uma trama com funções de ancoragem e de
oposição às forças de distensão e compressão. São sintetizadas por diversos tipos
de células, na pele essas são sintetizadas pelos queratinócitos e pelos fibroblastos.
A substância fundamental é formada por proteoglicanas, que tem a capacidade de
ligação a múltiplos componentes do meio extracelular, e promove a aderência entre
diversas estruturas, como células, fibras, fatores de crescimentos, água e etc,
desempenhando papel fundamental na organização e viabilidade dos tecidos
(AZULAY; AZULAY, 2004; ZAIDI; LANIGAN, 2010).
2.1.5. Hipoderme
É a camada mais profunda da pele, constituída de lóbulos de lipócitos delimitados
por septos de colágenos com vasos sanguíneos, linfáticos e nervos (AZULAY;
AZULAY, 2004).
28
2.2. Radiação Solar
O Sol é nossa fonte de luz e vida, é dele que provém energia para muitos processos
biológicos, tanto para a natureza quanto para os seres humanos que na Terra
habitam, processos esses fundamentais sem os quais seria impossível a vida. A
radiação emitida pelo Sol, chega à superfície terrestre sob vários comprimentos de
onda, ou seja, várias regiões do espectro eletromagnético, são elas: a faixa do
ultravioleta de 100 nm a 400 nm, do visível entre 400 nm a 700 nm, e a do
infravermelho que vai de 800 nm a 3.000 nm. Cerca de 9% da radiação ultravioleta
(UV) proveniente do Sol é fundamentalmente necessário para processos biológicos
saudáveis nos seres humanos, se forem feitas exposições ao Sol de modo
moderadas, ou seja, sem exageros. Porém a exposição excessiva tanto a curto e em
longo prazo podem trazer efeitos ao organismo humano, efeitos esses que podem
ser observados e sentidos imediatamente após a exposição solar, como uma
vermelhidão na pele; efeitos agudos e crônicos, que serão detectados futuramente,
onde estes são causados pelo acúmulo da exposição solar durante a vida do
indivíduo. Um desses danos, causado pela exposição contínua e acumulativa da
radiação ultravioleta solar é o câncer de pele. O grupo dos cânceres de pele que tem
como fator predominante para sua incidência à radiação ultravioleta é composto por
três tipos, são eles: carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e o melanoma
(ROUESSAC; ROUESSAC, 2007; SILVA, 2007).
Dos tipos de radiação emitidos pelo Sol a radiação visível é a mais conhecida,
mas outras faixas são também muito importantes como a do infravermelho e a
ultravioleta, afetando diretamente o equilíbrio dos ecossistemas e a vida na Terra. A
luz visível está na faixa do espectro eletromagnético com comprimentos de onda que
vão de 400 nm até 700 nm (Figura 4). Cerca de 44% da energia solar se concentra
nesta faixa, principalmente na região do verde (em torno de 500 nm). A radiação na
faixa do infravermelho é definida por comprimentos de onda de 800 a 3.000 nm, e
pode penetrar profundamente na pele, até atingir órgãos internos, podendo ser
sentida em forma de calor (CRUZ, 2014; SILVA, 2007).
29
Figura 4: Espectro eletromagnético com o espectro de luz visível expandido.
Fonte: Ronan (2014)
A radiação ultravioleta representa menos de 9% do total emitido pelo sol
(entre 100 nm e 400 nm), mesmo em quantidades pequenas ela afeta sistemas
biológicos (plantas e animais), tendo importância fundamental na saúde, no conforto
e na qualidade de vida das pessoas. A atmosfera, mais especificamente a camada
de ozônio é responsável pela absorção de parte dos raios ultravioleta provenientes
do Sol, sendo esses raios invisíveis aos olhos humanos (CRUZ, 2014).
2.2.1 Radiação Solar Ultravioleta (UV)
A radiação ultravioleta é uma parte da radiação solar referente ao comprimento de
onda de 100 nm a 400 nm, sendo não perceptível aos olhos humanos. A radiação
ultravioleta é uma onda eletromagnética composta de três faixas: ultravioleta C
(UVC) de 100 a 280 nm; ultravioleta B (UVB) de 280 a 320 nm; e ultravioleta A
(UVA) de 320 a 400 nm (CRUZ, 2014; SILVA, 2007).
2.2.1.1. Radiação Ultravioleta A (UVA)
A Radiação Ultravioleta A (UVA) tem o seu comprimento de onda próximo à região
do visível, corresponde a região entre 320 nm a 400 nm, atravessa facilmente a
atmosfera e a camada de ozônio. As raios UVA representam cerca de 95% da
radiação ultravioleta que atinge a superfície da Terra, e atinge a pele com a mesma
30
intensidade em qualquer horário do dia e época do ano, seja em meses de inverno
ou de verão (CRUZ, 2014).
A Radiação UVA apesar de causar efeitos semelhantes aos da UVB, não o
faz uniformemente ao longo de seu espectro e, por esse motivo, foi dividida em duas
regiões: UVA-1, compreendendo a faixa de 340 nm a 400 nm; e a UVA-2 entre 320 e
340 nm. A região do UVA-1, devido sua maior capacidade de penetração, reage com
oxigênio molecular, produzindo espécies reativas capazes de induzir reações
inflamatórias na pele e no DNA, do que derivam aumento da pigmentação,
fotossensibilização, e predisposição ao câncer cutâneo (BEZERRA, 2007;
CECATTO, 2014; CRUZ, 2014).
2.2.1.2 Radiação Ultravioleta B (UVB)
A Radiação Ultravioleta B (UVB) com comprimento de onda entre 290 nm e 320 nm,
têm uma menor capacidade de atravessar grandes distâncias na atmosfera e é
parcialmente filtrada na camada de ozônio. De toda a radiação ultravioleta que
atinge a superfície da Terra, cerca de 5 % é UVB, é mais intensa durante o verão,
especialmente entre às 10h e 16h. A Radiação UVB é mais eficiente em produzir
danos diretos ao DNA, fotoimunossupresão, eritema, espessamento da camada da
córnea e melanogênese, sendo, por isso, considerada a maior fator etiológico das
três formas de câncer cutâneo (BEZERRA, 2007; CRUZ, 2014).
2.2.1.3 Radiação Ultravioleta C (UVC)
A Radiação Ultravioleta C (UVC) com seu comprimento de onda ente 100 nm e 280
nm não ultrapassa a atmosfera, é completamente absorvida pela camada de ozônio,
não chegando à superfície terrestre. A Radiação UVC é basicamente germicida, pelo
fato de ser absorvida pelas proteínas e aminoácidos, mais contém um pico de
absorção da molécula de DNA (260 nm) e só não causa maior prejuízo à pele pelo
fato de ter curta penetração (BEZERRA, 2007; CRUZ, 2014).
31
2.3. Câncer
É importante relembrar que câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100
tipos diferentes de doenças que têm em comum o crescimento desordenado de
células anormais com potencial invasivo. Além disso, sua origem se dá por
condições multifatoriais. Esses fatores causais podem agir em conjunto ou em
sequência para iniciar ou promover o câncer (carcinogênese) (BODANESE, 2008).
De acordo com estimativas mundiais do projeto Globocan 2012, da Agência
Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC, do inglês International Agency for
Research on Cancer), da Organização Mundial da Saúde (OMS), houve 14,1
milhões de casos novos de câncer e um total de 8,2 milhões de mortes por câncer,
em todo o mundo, em 2012. A carga do câncer continuará aumentando nos países
em desenvolvimento e crescerá ainda mais em países desenvolvidos se medidas
preventivas não forem amplamente aplicadas (BRAY et al., 2012; INCA, 2014;
JEMAL et al., 2011).
Em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de casos novos de câncer e
13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do
envelhecimento da população, bem como da redução na mortalidade infantil e nas
mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento (BRAY et al., 2012;
INCA, 2014).
No Brasil, a estimativa para o ano de 2014 (INCA, 2014), que será válida
também para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de aproximadamente 576 mil
casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a
magnitude do problema do câncer no país. O câncer de pele do tipo não melanoma
(182 mil casos novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos
tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão
(27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil).
O desenvolvimento da maioria dos cânceres requer múltiplas etapas que
ocorrem ao longo de muitos anos. Assim, alguns tipos de câncer podem ser evitados
pela eliminação da exposição aos fatores determinantes. Se o potencial de
malignidade for detectado antes de as células tornarem-se malignas, ou numa fase
inicial da doença, tem-se uma condição mais favorável para seu tratamento e,
consequentemente, para sua cura (INCA, 2014).
32
2.4. Carcinogenese
A palavra carcinogênese é derivada da língua grega, na qual karkinos significa
câncer e genesis significa produção ou origem, portanto é o termo utilizado para
produção de carcinoma. Já carcinogenicidade se refere ao poder, habilidade ou
tendência para produzir câncer. A principal meta do estudo da carcinogênese é, sem
dúvida alguma, a prevenção do câncer (SILVA, 2000).
A primeira observação de que a produção de tumor maligno era influenciado
por substâncias exógenas foi feita por Percival Pott, médico inglês, em 1775, quando
relacionou o câncer de bolsa escrotal dos limpadores de chaminé ao contato
frequente com a fuligem. Devido a suas observações foram introduzidas, a partir
dessa época, medidas preventivas, como proteção contra fuligem, mudança de
arquitetura das casas e proibição de utilizar crianças para essa atividade. Após o
desenvolvimento pela primeira vez de câncer experimental em coelho, com o uso
alcatrão de carvão sobre a pele do animai, por Yamagiwa & Ichikawa, em 1915,
vários agentes foram descritos como carcinogênicos para o homem: arsênico (1888),
luz solar (1875), alcatrão (1876), raio X (1902) e radiação ultravioleta (1906). Essas
descrições levaram à tentativa de proteção contra carcinoma ocupacional provocado
por outras substâncias industriais e agentes físicos (SHEAR, 1937; SILVA, 2000).
O câncer pode ser considerado como um evento molecular, acidente
embriológico,
predisposição
genética,
deficiência
imunológica,
desafio
epidemiológico; no entanto, é um processo multifatorial, que envolve uma interação
complexa de fatores endógenos e exógenos, a maior parte deles ainda por elucidar.
Por estudos experimentais, já se sabe que a carcinogênese química não é um
fenômeno espécie-específico, sendo necessárias estruturas moleculares específicas
e ocorre em estágios bem separados, de iniciação ou indução, promoção e
progressão. Existem vários carcinógenos ambientais prejudiciais ao homem, que
podem ser parciais ou completos, como é a radiação ultravioleta B (SILVA, 2000).
As diversas etapas da carcinogênese foram primeiramente descritas por Rous
e Friedewald (1944). O estágio inicial, chamado de indução ou iniciação, ocorre por
um efeito carcinogênico inicial, quando há alteração do DNA, RNA ou proteínas
específicas. Vários agentes podem atuar nessa fase, sendo chamados de indutores.
O estágio seguinte é o de promoção, com alterações da dinâmica da divisão celular
ou do meio intracelular, provocada pelos promotores. A partir daí pode haver
33
progressão ou mesmo regressão do tumor quando já instalado (AZULAY; AZULAY,
2004; SILVA, 2000).
A indução é um fenômeno irreversível, pois há interação e incorporação de
fragmentos da molécula do carcinógeno ao DNA, ao RNA ou às proteínas
específicas. A expressão do genoma da célula se modifica e essa alteração é então
transmitida da célula-mãe para célula-filha, ocorrendo, portanto, reprodução celular
com genoma alterado. (SILVA, 2000).
Os fatores considerados etiológicos e/ou precipitantes dos cânceres cutâneos
são vários, como predisposição genética; radiação ultravioleta; radiação não
ultravioleta, como raios-X e radiação gama; fatores hormonais; imunossupressão;
agentes químicos e drogas citotóxicas; traumatismos; papilomavírus; queimaduras
crônicas, cicatrizes, úlceras, fístulas, osteomielite crônica, albinismo (AZULAY;
AZULAY, 2004; SILVA, 2000).
Há ainda algumas lesões consideradas como pré-cancerosas, como a
ceratose actínica, com sua variante, o corno cutâneo, leucoplasia, doença de
Bowen, e eritroplasia de Queyrat. A ceratose seborréica e o ceratoacantoma são
também considerados como pré-cancerosos por alguns autores, mas se realmente o
forem, a frequência de transformação maligna é muito pequena (ALLEN, 2010;
SILVA, 2000; SPENCER et al., 1995)
A predisposição genética como fator etiológico pode ser verificada pela maior
incidência de câncer cutâneo em indivíduos de pele clara, que têm dificuldade de
bronzeamento, ou seja, aqueles que queimam, mas não bronzeiam. Além disso, as
doenças hereditárias comprovadamente levam ao câncer cutâneo precoce, como é o
caso do xeroderma pigmentoso, doença genética autossômica recessiva rara, na
qual o paciente tem uma maior sensibilidade à radiação ultravioleta e a alguns
químicos, além de alteração do mecanismo de reparo do DNA. Com exposições
mínimas ao sol, surgem sardas, queimaduras, ceratoses actínicas múltiplas, CBC,
CEC e melanomas, além de apresentarem fotofobia, entrópio, ectrópio, ceratites e
carcinoma no olho, pela alteração das áreas expostas. Cinquenta por cento dos
pacientes já mostram alterações cutâneas antes de um ano de idade e câncer aos
oito. Há um fenótipo de xeroderma pigmentoso típico com reparo normal do DNA,
mostrando, portanto, que não só esse fenômeno interfere na gênese dessa doença
(SILVA, 2000).
34
Os agentes físicos, como o calor, provocam carcinoma nas pernas, como é o
caso de indivíduos que ficam muito próximos de brasas acesas. A luz solar provoca
câncer na pele exposta. A maior exposição ocorre quanto maior a altitude e menor a
latitude, havendo uma correlação inversa entre o grau de pigmentação e a
habilidade de bronzeamento.
A radiação ultravioleta é mais prejudicial em regiões de clima seco e
ensolarado e o fotoenvelhecimento sempre precede o câncer. O efeito do sol é
cumulativo, o da ultravioleta é maior quando aplicada em frações, e é proporcional à
dose acumulada (SILVA, 2000).
A fotocarcinogênese é uma das manifestações de processo fotobiológico,
provocando respostas locais e sistêmicas, que podem ser diretas ou indiretas. A
radiação UVB, de comprimento de onda de 290 a 320nm, tem ação
fotocarcinogênica direta, levando a CBC e CEC, atuando como indutora e promotora
potente em camundongo, levando à alteração estrutural no DNA humano, tanto in
vitro quanto in vivo. Provoca alterações mutagênicas, através de dímeros de timina,
que leva a formação de tumores. Para essas mutações existem mecanismos de
proteção com reparo do DNA, pela excisão do defeito, reparo na pós-replicação e
fotoreativação. O tumor surge quando há ausência ou deficiência nesse reparo
(SILVA, 2000).
Não se tem certeza ainda se a radiação UVA, de comprimento de onda que
vai de 320 a 400nm, tem ação fotocarcinogênica direta. É indutora em animais, no
homem e in vitro, talvez atue também como promotora. Seu mecanismo ocorre
através da formação de dímeros de pirimidina, que é a principal lesão do DNA, com
quebra de cadeias simples, crosslinks de proteína do DNA, além de reações
oxidativas com formação de radicais livres (SILVA, 2000).
Indiretamente, tanto a radiação UVA quanto a UVB tem ação local e sistêmica
no sistema imune, por efeito imunossupressor, e, em geral, os tumores induzidos por
essas radiações são altamente antigênicos. Como efeito sistêmico induzem células
supressoras tumor-específicas e, como local na pele, diminuem o número de células
de Langerhans, com inatividade das remanescentes. Com isso, há alteração da
função de apresentação do antígeno, bloqueio da ativação da função celular efetora,
levando a um bloqueio da resposta imune. Como através desse mecanismo há
prevenção da rejeição do tumor, ocorre então crescimento do mesmo (SILVA, 2000).
35
Em relação aos fotoprotetores (protetores solares), que são extremamente
benéficos, é preciso ressaltar que a proteção apenas contra a radiação UVB reduz a
queimadura imediata, aumentando o tempo de permanência no sol e a exposição à
radiação UVA, aumentando também a incidência de câncer cutâneo. A exposição à
radiação UVA alternada com exposição a ambas, como ocorre com indivíduos que
ora usam fotoprotetor apenas para radiação UVB e ora fotoprotetor para ambas,
aumenta o dano das exposições combinadas, que têm ação indutora. Ao se utilizar a
fotoproteção somente depois da queimadura, o que acontece com bastante
frequência, pois é comum os pacientes só se lembrarem do protetor solar após uma
primeira e intensa exposição ao sol, aumentando o risco do indivíduo adquirir um
carcinoma cutâneo. Os fotoprotetores podem, nesse caso, já com a pele mais
sensível, alterar o ambiente, tanto inter quanto intracelular, atuando assim como
carcinógenos promotores, e, por essas razões, o FDA (Food and Drug
Administration) questiona atualmente a eficácia e estuda uma regulamentação para
a utilização dos fotoprotetores (SILVA, 2000).
A fotocarcinogênese é um processo extremamente complexo, e os vários
efeitos da radiação ultravioleta ainda por elucidar, principalmente para o CBC, pois
não existe um modelo eficiente, como ocorre com o CEC, que pode ser provocado
em várias espécies de animais, podendo-se dessa maneira estudar a importância de
outros fatores associados, tanto locais quanto sistêmicos.
A carcinogênese é, sem sombra de dúvida, processo multifatorial induzido e
modulado por inúmeros fatores endógenos e exógenos, muitos ainda a descobrir e
confirmar, sendo seu estudo da maior importância para a prevenção do câncer.
Ainda há muito a pesquisar e elucidar sobre seus estágios bastante complexos,
estando a Ciência apenas no início dessa investigação.
2.5. Câncer de pele
O câncer de pele tem distribuição universal e costuma apresentar-se sob três formas
principais: o melanoma, o carcinoma basocelular (CBC) e o carcinoma espinocelular
(CEC) ou epidermoide. Os carcinomas basocelular e carcinoma espinocelular são
também conhecidos como câncer de pele não melanoma, tipo mais frequentes de
câncer de pele, e também é o câncer de pele mais frequente na população de pele
clara. A exposição excessiva ao sol é o principal fator de risco para o surgimento dos
36
cânceres de pele melanoma e não melanoma. O CEC ocorre quase exclusivamente
em áreas expostas continuamente à radiação solar, enquanto o CBC pode ocorrer
em áreas do corpo expostas à radiação solar de forma intermitente. Para o
melanoma, a presença de numerosos nevos cutâneos aumenta o risco (INCA,
2014).
A incidência dos cânceres de pele não melanoma aumenta com a idade, em
especial a incidência do CEC. O CBC é mais frequente que o CEC, e ambos são
mais frequentes nos homens do que nas mulheres. No Brasil, o câncer de pele não
melanoma é o tumor mais incidente em ambos os sexos (INCA, 2014).
O câncer de pele melanoma é menos frequente do que os outros tumores de
pele. Também é mais frequente em populações de pele clara e expostas à radiação
solar. Indivíduos de pele escura possuem menor risco de apresentá-lo. Seu
prognóstico é bom para os tumores localizados, enquanto, para melanomas
metastáticos, já fica comprometido (INCA, 2014).
Os cânceres de pele não melanoma são de bom prognóstico, com altas taxas
de cura se tratados de forma precoce e adequada. Contudo, situações nas quais há
demora no diagnóstico podem acarretar ulcerações na pele e deformidades físicas
graves (INCA, 2014).
Ações de prevenção primária, como a proteção individual contra a luz solar,
são altamente efetivas e de custo relativamente baixo, para a prevenção do câncer
de pele, inclusive dos melanomas. A educação em saúde para a população e a
promoção de ambientes que propiciem a proteção contra as radiações solares,
principalmente nos ambientes de trabalho e lazer, também são efetivas para a
coletividade. É recomendável que o indivíduo sob risco procure um dermatologista
ao primeiro sinal de surgimento de novas manchas ou sinais na pele, ou
modificações na cor, tamanho e bordas de lesões antigas, permitindo identificar
possíveis cânceres precocemente (INCA, 2014).
2.5.1. Ceratose actínica
Antes do desenvolvimento da malignidade se manifestar na epiderme, uma série de
alterações displásicas ocorre progressivamente, um fenômeno análogo à atipia que
precede o carcinoma de células escamosas da cérvice uterina. Como esta displasia
é geralmente o resultado de exposições crônicas à luz solar e está associada ao
37
crescimento excessivo de queratina, estas lesões são chamadas ceratoses
actínicas. Como seria de esperar, elas ocorrem com incidência particularmente alta
em
indivíduos
de
pigmentação
clara.
Exposições
à
radiação
ionizante,
hidrocarbonetos, arsenicais podem induzir lesões similares. A ceratose actínica é
considerada como uma lesão pré-cancerosa (AZULAY; AZULAY, 2004; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005).
As ceratoses actínica são geralemente menores que 1 cm de diâmetro; e as
áreas mais comuns para o aparecimento desta lesão, são as regiões da pele
comumentes expostas ao sol (face, braço, dorso das mãos) (AZULAY; AZULAY,
2004; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
2.5.2. Carcinoma basocelular
Os carcinomas basocelulares são tumores comuns, constituído por células
morfologicamente semelhantes às células basais da epiderme, de crescimento lento,
com poder de invasão local, porém restritiva, que raramente metastatizam, é
portando a neoplasia maligna de melhor prognóstico. Têm uma tendência a ocorrer
em locais de exposição crônica ao sol e em pessoas de pele clara. Como no
carcinoma de células escamosas (carcinoma espinocelular) a incidência do
carcinoma basocelular eleva-se nitidamente com a imunossupressão e nos
pacientes com defeitos herdados no reparo do DNA (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005; BODANESE, 2008).
O padrão-ouro do tratamento do CBC baseia-se na ressecção cirúrgica
completa da lesão. A taxa de cura está diretamente relacionada ao estadio da
doença e o tipo de tratamento empregado (BODANESE, 2008).
Atualmente, a confirmação dos tumores é realizada através de exames
histopatológicos. Esta técnica avalia o grau de diferenciação celular do tecido
neoformado e suas características citológicas, morfológicas e estruturais. A
histopatologia fornece informações muito valiosas na orientação da abordagem
terapêutica do câncer e possui resultaods confiáveis. No entanto esta técnica possui
algumas desvantagens e limitações, pois a biópsia convencional envolve remoção
do tecido, necessidade de preparação das amostras e depende da interpretação dos
patologistas (BODANESE, 2008).
38
A aplicabilidade da espectrocopia Raman consistirá em auxiliar o exame
histopatológico, principalmente em situações em que a biópsia não é efetiva, por
exemplo, em múltiplas lesões ou em tumores incipientes (ainda sem manifestação
clínica). Também poderá ser utilizada na detecção dos limites do tumor em tempo
real,
evitando
excisões
amplas
demais ou
com margens comprometidas
(BODANESE, 2008).
2.5.3. Carcinoma espinocelular
O carcinoma espinocelular (CEC), ou carcinoma de células escamosas, é uma
neoplasia maligna, com capacidade de invasão local e de metastizar, é o segundo
tumor mais comum decorrente de exposição solar em pessoas idosas, excedido
somente pelo carcinoma basocelular. Esta neoplasia tem maior incidência em
homens que em mulheres, exceto pelas lesões nos membros inferiores. A causa
exógena mais comum com maior fator que provoca e ocasiona a manifestação do
CEC é a exposição à luz solar (radiação UV), com subsequente dano ao DNA.
Indivíduos que estão imunossuprimidos como resultado de quimioterapia ou de
transplante de órgãos, ou pacientes que tenham xeroderma pigmentoso, estão em
elevado risco para o desenvolvimento da neoplasia (AZULAY; AZULAY, 2004;
KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
2.6. Espectroscopia Raman
A técnica de espectroscopia Raman é uma das técnicas ópticas que despontam na
literatura como ferramenta de análise das componentes moleculares de diferentes
materiais. Por ser de natureza vibracional, apresenta como característica espectro
de emissão com bandas bem estreitas em posições correspondentes às vibrações
das ligações das moléculas presentes na amostra. Pode ser considerada como uma
“impressão digital” da molécula, fornecendo informação que nenhuma outra técnica
óptica é capaz de fornecer (HANLON et al., 2000; SILVEIRA JR. et al., 2002).
É chamado de Espectroscopia Raman o método utilizado para análise da
estrutura química de compostos inorgânicos ou grupos funcionais de substâncias
orgânicas utilizando radiação eletromagnética. E esta foi descoberta em 1928, pelo
físico indiano Chandrasekhara Venkata Raman, e em 1930 ganhou o Prêmio Nobel
por este feito. Mas foi somente com o advento do laser, em 1960, que a técnica teve
39
impulso e começou a ser largamente utilizada na identificação e caracterização de
materiais (SILVEIRA JR. et al., 2001; SILVEIRA, 2008).
As técnicas espectroscópicas vêm sendo aplicadas a uma larga escala de
amostras sólidas, liquidas e em alguns gases, dentre materiais orgânicos e
inorgânicos. Esta técnica espectroscópica fornece informações importantes sobre a
estrutura das moléculas e sobre a interação com moléculas vizinhas, podendo de
este modo ser utilizada na identificação de moléculas presentes em um composto, e
assim fornecer uma análise qualitativa e quantitativa de sua composição
(NOGUEIRA et al., 2005). Estas informações das moléculas são obtidas a partir da
interpretação das bandas e picos dos espectros de absorção e/ou emissão dos
átomos e/ou moléculas da matéria a ser analisada (MICHELE, 1999).
O efeito Raman que ocorre na Espectroscopia Raman é fundamentado
basicamente na troca de energia entre a luz (radiação eletromagnética) incidente e a
matéria
incidida.
eletromagnética,
Quando
esta
uma
radiação
molécula
pode
ser
é
irradiada
absorvida
por
ou
uma
radiação
espalhada.
Este
espalhamento pode ser da mesma frequência da radiação incidida, o que chamamos
de espalhamento elástico (espalhamento Rayleigh), ou quando a radiação
espalhada sofre uma mudança na frequência em relação à frequência incidida, para
este denominamos espalhamento inelástico (espalhamento Raman), conforme visto
na Figura 5 (SILVERA JR., 2001).
Do ponto de vista dos níveis de energia da Física Quântica, o efeito Raman
pode ser descrito como uma transição da molécula do seu estado fundamental (E0)
para um estado vibracional excitado (E1) (Figura 5), No regresso ao estado
fundamental, um quantum vibracional de energia pode permanecer associado à
molécula, de onde resulta um decréscimo da frequência da radiação emitida. Se esta
molécula já estiver em um nível vibracional excitado do estado eletrônico
fundamental, pode ceder um quantum de energia vibracional, baixando a um nível
inferior, enquanto aumenta a frequência da radiação emitida (SILVEIRA JR., 2001).
Dentro do espalhamento inelástico, podem-se encontrar dois processos
distintos: Stokes e Anti-Stokes (Figura 5). No Stokes, o fóton ao incidir sobre a
molécula em nível fundamental (E0), faz com que a molécula ganhe energia
passando a um estado que chamamos de excitado (E1). Com isso, o fóton
espalhado contém energia menor que a incidente (frequência espalhada menor que
a frequência incidente). No caso do Anti-Stokes, o fóton incidente interage com a
40
molécula que está em um estado vibracional excitada, e devido a instabilidade do
estado excitado, estimula a molécula a voltar ao estado fundamental, liberando
energia. Como resultado tem-se um fóton espalhado com energia maior que a
incidente (frequência espalhada maior que a frequência incidente) (GUIMARÃES,
2004; SILVEIRA JR., 2001).
Figura 5: Esquema representativo para diferenciar os tipos de espalhamento. E0, estado fundamental
- E1, estado virtual excitado - νi, frequência inicial do fóton incidente - νf, frequência final do fóton
espalhado.
A quantidade e a qualidade das informações que podem ser extraídas de um
espectro dependem de alguns fatores: características da fonte de radiação utilizada
para excitar as amostras, dentre estes fatores destacam-se a potência e o
comprimento de onda do laser; a forma de coleta do sinal proveniente da amostra
após a interação, como tempo de aquisição; resolução temporal ou espectral do
instrumento de dispersão (espectrógrafo) utilizado, e do tipo e sensibilidade do
detector do sinal, além das propriedades físicas e coeficiente de espalhamento da
amostra em análise (AFSETH; WOLD; SEGTNAN, 2006).
41
Figura 6: Sistema de Espectroscopia Raman Dispersiva.
O sistema típico para análise molecular por Espectroscopia Raman Dispersiva
é composto por:
•
Fonte de radiação monocromática, principalmente os laseres;
•
Cabos de fibra óptica;
•
Probe, formado por filtros para remoção do espalhamento elástico ou radiação
de excitação do sinal retroespalhado;
•
Espectrógrafo acoplado a um detector CCD, a fim de produzir pontos
discretos (pixels) das informações da imagem espectral obtida;
•
Computador com placa de conversão A/D, para armazenar os dados obtidos;
2.7. Estatística multivariada - Análise multivariada
A análise multivariada consiste em um conjunto de métodos que podem ser
utilizados quando várias medições são feitas em cada indivíduo ou objeto de uma ou
mais amostras. As medidas são referidas como variáveis e os indivíduos ou objetos
como unidades (unidades investigadas, unidades de amostragem, ou unidades
experimentais) ou observações. Na prática, conjuntos de dados multivariados são
comuns, embora eles não sejam sempre analisados como tal. Mas o uso exclusivo
dos procedimentos univariados com estes dados não é mais justificável, dada a
disponibilidade de técnicas de análise multivariada e o poder da computação de
baixo custo para realizá-los (RENCHER, 2002)
42
A demanda crescente no volume de variáveis nos processos implica em
novas técnicas para organização e interpretação de dados assim como para a
interpretação dos resultados que podem ser agrupados em cada tipo de aplicação.
Nesse contexto, a Análise Multivariada dispõe de uma diversidade de técnicas que
favorecem
o
entendimento
de
muitos fenômenos
(ALVES;
BELDERRAIN;
SCARPEL, 2007).
As técnicas existentes podem ser de diversas naturezas e devem ser
utilizadas de acordo com o interesse da pesquisa. Dados qualitativos ou
quantitativos podem restringir a aplicação de algumas delas. Assim, a escolha da
técnica é justificada basicamente pelo que se pretende investigar através de um
conjunto de dados (ALVES; BELDERRAIN; SCARPEL, 2007).
Contudo, a especificação de uma determinada técnica não implica em
desutilizar a combinação de uma segunda técnica para atingir melhores resultados.
Uma análise conjunta, quando bem estruturada, pode revelar melhores respostas
para a análise (ALVES; BELDERRAIN; SCARPEL, 2007; RENCHER, 2002).
As técnicas de Análise de Agrupamentos, são consideradas técnicas de
interdependência por analisar simultaneamente todas as variáveis, requer a inclusão
de diferentes tipos de dados para sua análise, e é restrita à dados contínuos
(ALVES; BELDERRAIN; SCARPEL, 2007).
2.7.1. Análise de agrupamento
A análise de agrupamento, em sua aplicação, engloba uma variedade de técnicas e
algoritmos, sendo que o objetivo é encontrar e separar objetos em grupos similares.
Essa técnica pode ser observada, por exemplo, se tiver vários produtos em uma
determinada prateleira de um supermercado, e distribuir esses produtos, na
prateleira, segundo suas características, de um mesmo composto, ou o mesmo
princípio ativo, por exemplo. Aí está-se a praticar análise de agrupamento. Agora, se
esses produtos estiverem espalhados por toda a prateleira, significa que se terá
mais de uma característica, e, para que se possa uni-los por características comuns,
será muito trabalhoso, exigindo conceitos mais sofisticados de semelhança, e
procedimentos mais científicos para juntá-los. É em relação a esse procedimento
multidimensional que se trabalha (VICINI, 2005).
43
A análise de agrupamentos estuda todo um conjunto de relações
interdependentes.
Ela
não
faz
distinção
entre
variáveis
dependentes
e
independentes (VICINI, 2005).
A análise de agrupamento constitui uma metodologia numérica multivariada,
com o objetivo de propor uma estrutura classificatória, ou de reconhecimento da
existência de grupos, objetivando, mais especificamente, dividir o conjunto de
observações em um número de grupos homogêneos, segundo algum critério de
homogeneidade. Muitas vezes, nessa técnica, são feitas afirmativas empíricas, que
nem sempre têm respaldo teórico. Muitas técnicas são propostas, mas não há,
ainda, uma teoria generalizada e amplamente aceita. Devido a isso, devem-se
utilizar vários métodos e comparar os resultados, para que a análise dos dados seja
realizada pela técnica mais adequada (VICINI, 2005).
A análise de agrupamento é um método simples, calçada nos cálculos de
distância, no entanto, não requer conhecimento estatístico para a sua aplicação,
como é o caso quando se aplica análise de variância, de regressão, ou fatorial
(VICINI, 2005).
Genericamente, a análise de agrupamento compreende cinco etapas
(ALBUQUERQUE, 2005):
1. A seleção de indivíduos ou de uma amostra de indivíduos a serem
agrupados;
2. A definição de um conjunto de variáveis a partir das quais serão obtidas
informações necessárias ao agrupamento dos indivíduos;
3. A definição de uma medida de semelhança ou distância entre os
indivíduos;
4. A escolha de um algoritmo de classificação;
5. Por último, a validação dos resultados encontrados.
A medida de distância de uma maneira geral pode ser definida como medida
de similaridade (relações entre os pontos da base de dados) e dissimilaridade
(relações baseadas nas diferenças entre os pontos). Entre estas distâncias temos a
distância Euclidiana e a distância de Mahalanobis (ALBUQUERQUE et al., 2006;
CLESIO, 2014).
44
2.7.2. Análise de Componentes Principais
A Análise de Componentes Principais (PCA - Principal Components Analisys) é uma
técnica da estatística multivariada que consiste em transformar um conjunto de
variáveis originais em outro conjunto de variáveis de mesma dimensão denominadas
de componentes principais (PC), associada à ideia de redução de massa de dados,
com menor perda possível da informação. Foi originalmente descrita por Karl
Pearson em 1901 e posteriormente aplicada por Harold Hotelling 1933, em diversas
áreas da ciência, porém o uso desta estatística multivariada só foi acentuado quando
houve disponibilidade de recursos na área computacional (PAIVA et al., 2010).
Quando aplicamos um algoritmo de PCA em um conjunto de variáveis, como
por exemplo, espectros no infravermelho, o conjunto original destas variáveis é
substituído por um novo conjunto de variáveis denominado de Componentes
Principais (PCs). A principal característica deste novo conjunto é a ortogonalidade,
porém o mesmo é facilmente reconstruído a partir da combinação linear das
variáveis originais (espectros). Como vantagem, o novo conjunto de variáveis (PCs),
geralmente concentra a maior parte da informação (variância) em poucas variáveis,
diminuindo assim a dimensionalidade dos dados, sem perda significativa da
informação do espectro. A maioria dos aplicativos disponíveis utilizam a técnica de
decomposição em valores singulares (singular value decomposition -SVD) para obter
os PCs, sendo neste caso o primeiro componente principal (PC1) definido na direção
(eixo) de maior variância do conjunto de variáveis originais. De forma decrescente
em termos de variação são definidos os demais componentes principais, porém
estas serão sempre ortogonais a PC1 e entre si. Por exemplo, um sistema que seja
reduzido a 3 PCs (PC1, PC2 e PC3) se assemelha ao sistema cartesiano de
coordenadas, em que todos os eixos são linearmente independentes, isto é,
ortogonais entre si (SABIN; FERRÃO; FURTADO, 2004).
Os componentes principais apresentam propriedades importantes: cada
componente principal é uma combinação linear de todas as variáveis originais; são
independentes entre si e; estimados com o propósito de reter, em ordem de
estimação, o máximo de informação, em termos da variação total contida nos dados.
Procura-se redistribuir a variação observada nos eixos originais de forma a se obter
um conjunto de eixos ortogonais não correlacionados. Esta técnica pode ser utilizada
para geração de índices e agrupamento de indivíduos. A análise agrupa os
45
indivíduos de acordo com sua variação, isto é, os indivíduos são agrupados segundo
suas variâncias, ou seja, segundo seu comportamento dentro da população,
representado pela variação do conjunto de características que define o indivíduo, ou
seja, a técnica agrupa os indivíduos de uma população segundo a variação de suas
características (PAIVA et al., 2010).
A correlação entre as variáveis e as informações obtidas por análises
univariadas pode ser incompleta, principalmente quando há correlação entre as
variáveis. Nesses casos, é de grande interesse o uso de análise multivariada, pois
essa análise combina as informações múltiplas provenientes da unidade
experimental. Quando o número de características é elevado, muitas delas podem
contribuir pouco para a discriminação dos indivíduos avaliados. Essa situação
aumenta o trabalho de caracterização, mas não melhora a precisão, além de tornar
mais complexa a análise e interpretação dos dados. Assim, podem-se eliminar
aquelas características redundantes e de difícil mensuração, o que reduziria o tempo
e os custos de experimentos (PAIVA et al., 2010).
2.7.3. Medidas de distância
Para agrupar indivíduos é necessária a definição de uma medida de similaridade ou
dissimilaridade. Com base nessa medida os indivíduos similares são agrupados e os
demais são colocados em grupos separados (ALBUQUERQUE, 2005).
Existem dois tipos de medidas de semelhança: medidas de similaridade
(quanto maior o valor, maior a semelhança entre os objetos) e medidas de
dissimilaridade (quanto maior o valor, menor a semelhança entre os objetos)
(ALBUQUERQUE, 2005).
As medidas de dissimilaridade têm papel central nos algoritmos de
agrupamentos. Através delas são definidos critérios para avaliar se dois pontos
estão próximos, e, portanto, podem fazer parte de um mesmo grupo, ou não
(ALBUQUERQUE, 2005).
Existem várias medidas que podem ser utilizadas como medidas de distâncias
ou dissimilaridade entre elementos de uma matriz de dados, dentre as medidas,
temos: distâncias euclidiana, euclidiana quadrada e euclidiana padronizada,
distância de Minkowski e a distância Mahalanobis (ALBUQUERQUE, 2005; VICINI,
2005).
46
As
distâncias
mais
utilizadas
em
análise
de
agrupamento
são
(ALBUQUERQUE, 2005; VICINI, 2005):
Distância Euclidiana: a distância entre dois casos (i e j) é a raiz quadrada do
somatório dos quadrados das diferenças entre valores de i e j para todas as
variáveis (ν = 1, 2, ..., n).
Onde:
xiν - representa a característica do indivíduo i;
xjν - representa a característica do individuo j;
n - é o número de parcelas na amostra;
ν - é o número indivíduo na amostra.
Distância Euclidiana quadrada: é a distância entre dois casos (i e j) e definida
como o somatório dos quadrados das diferenças entre os valores de i e j para todas
as variáveis (v = 1, 2, ..., n).
Onde:
xiν - representa a característica do indivíduo i;
xjν - representa a característica do individuo j;
n - número de parcelas na amostra;
ν - número indivíduo na amostra.
Distância de Mahalanobis: também chamada distância generalizada, ao
contrário das apresentadas anteriormente, considera a matriz de covariância para o
cálculo das distâncias.
A distância de Mahalanobis é utilizada para a quantificação das distâncias
entre duas populações, quando existe grau de dependência entre as variáveis, dada
47
pela similaridade entre as unidades amostrais (tratamentos, indivíduos, populações),
com relação a um conjunto de características correlacionadas.
Onde:
xi - é o vetor de médias do i’ésimo grupo;
xj - é o vetor de médias do j’ésimo grupo;
∑ é a estimativa combinada da matriz da covariância/variância dentro dos grupos.
2.7.6. Análise de variância (ANOVA)
A análise de variância (ANOVA - Analise of Variance) é um teste estatístico
amplamente difundido entre os analistas, e visa fundamentalmente verificar se existe
uma diferença significativa entre as médias e se os fatores exercem influência em
alguma variável dependente (MATEMÁTICA, 2013; VICINI, 2005).
A principal aplicação da ANOVA é a comparação de médias oriundas de
grupos diferentes, também chamados tratamentos, como por exemplo, médias
históricas de questões de satisfação, empresas que operam simultaneamente com
diferentes rendimentos, entre muitas outras aplicações.
Existem dois métodos para calcular-se a variância: dentro de grupos (MQG) e
a variância das médias (MQR).
Em uma ANOVA, calcula-se esses dois componentes de variância. Se a
variância calculada usando a média (MQR) for maior do que a calculada (MQG)
usando os dados pertencentes a cada grupo individual, isso pode indicar que existe
uma diferença significativa entre os grupos.
2.7.7. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS)
O método de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS - Partial least
squares) é considerado o método de discriminação/calibração multivariado mais
utilizado para a construção de modelos de discriminação a partir de dados de
primeira ordem (MAZUR, 2012).
48
De maneira semelhante ao PCA, o PLS decompõe as matrizes de dados X e
Y de forma que cada componente principal do modelo busque a máxima covariância
entre X e Y, passando a ser chamada de variável latente (VL) (MAZUR, 2012).
Este método apresenta as vantagens de utilizar um maior número de
informações obtidas de cada amostra, diminuindo o valor do erro de análise e
permitindo determinações simultâneas até mesmo na presença de espécies
interferentes, o que faz dele um método mais robusto em relação a outros métodos
matemáticos empregados atualmente (MAZUR, 2012).
2.8.7. Tabela de Contingência (matriz de confusão)
Quando são desenvolvidos novos sistemas, métodos ou testes que envolvem a
detecção, diagnóstico ou previsão de resultados, é importante validar seus
resultados de forma a quantificar seu poder discriminativo e identificar um
procedimento ou método como bom ou não para determinada análise. No entanto,
devemos levar em conta que a simples quantificação de acertos num grupo de teste
não necessariamente reflete o quão eficiente um sistema é, pois essa quantificação
dependerá fundamentalmente da qualidade e distribuição dos dados neste grupo de
teste (MARTINEZ; LOUZADA-NETO; PEREIRA, 2003).
Para validar estes testes, outros métodos foram criados a fim de
desconsiderar eventuais desbalanceamentos nos grupos de teste. Com isso, criouse a chamada tabela de contingência (ou matriz de confusão). Seu funcionamento é
simples: consideramos valores positivos que o sistema julgou positivos como
verdadeiros positivos (acerto), valores positivos que o sistema julgou negativos como
falso negativo (erro), valores negativos que o sistema julgou como negativos como
verdadeiros negativos (acerto), e valores negativos que o sistema julgou positivos
como falso positivo (erro) (SOUZA, 2014).
49
Figura 7: Tabela de Contingência (matriz de confusão).
Fonte Souza (2014)
Sensibilidade (S) = Proporção de indivíduos com a doença que são identificados
corretamente pelo teste. Indica o quão bom é um teste em identificar a doença em
questão. (proporção de indivíduos verdadeiramente positivos [tanto no padrão ouro
quanto no teste em avaliação] entre os doentes). Indica a capacidade de um teste
detectar corretamente as pessoas com a doença/condição.
Especificidade (E) = Proporção de indivíduos sem a doença que são identificados
corretamente pelo teste. Indica o quão bom é um teste em identificar indivíduo sem
doença em questão. (proporção de indivíduos verdadeiramente negativos ou
normais [tanto no padrão ouro quanto no teste em avaliação] entre os não doentes)
Indica a capacidade de um teste excluir corretamente as pessoas sem a
doença/condição.
Verdadeiro positivo (VP): o teste é positivo e o indivíduo tem a doença. (indivíduos
com a doença tanto no teste padrão ouro quanto no teste em avaliação)
50
Falso positivo (FP): o teste é positivo e o indivíduo não tem a doença. (indivíduos
não doentes no teste padrão ouro, mas que são considerados doentes no teste em
avaliação)
Verdadeiro negativo (VN): o teste é negativo e o indivíduo não apresenta a doença.
(indivíduos sem a doença tanto no teste padrão ouro quanto no teste em avaliação)
Falso negativo (FN): o teste é negativo e o indivíduo tem a doença. (indivíduos
doentes no teste padrão ouro, mas que são considerados negativos ou normais no
teste em avaliação) (WALDMAN; ROSA, 2014).
Um bom teste possui um alto valor para a sensibilidade e para a
especificidade, pois ele identificará corretamente aqueles que têm a doença e
aqueles que não têm.
51
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Coleta dos espectros
O protocolo utilizado neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(Protocolo 2815-3035/09 CAAE 281189), seguindo diretrizes brasileiras para o uso
de seres humanos.
3.1.1. Critério de inclusão e exclusão
Os pacientes foram selecionados em um pré-exame clínico e agendado para biópsia
excisional, para retirada das lesões cutâneas. Os pacientes tinham média de idade
de 61 anos, 15 pacientes eram homens e 10 eram mulheres, todos provenientes da
região Sul do Brasil. O fototipo da pele típico entre os pacientes voluntários deste
trabalho variou entre 1 e 2.
Os exames pré-clinicos, a coleta dos espectros Raman dos tecidos suspeitos
de carcinoma e a biópsia excisional foram realizados no Hospital Regional do Oeste
em Chapecó/SC, supervisionados pelo médico dermatologista resposnsável.
3.1.2. Preparação e aquisição dos espectros
Antes da coleta dos espectros, as lesões de pele suspeitas foram higienizadas com
soro fisiológico, assim como a pele adjacente à lesão. Os espectros da lesão foram
tomados em cinco pontos: um no centro e quatro nas bordas internas das lesões. Os
espectros de tecido normal foram coledos em um local diagnosticado clinicamente
como tecido normal, próximo a região da lesão. As lesões suspeitas avaliadas eram
localizadas principalmente nas costas, ombro, tórax, rosto, nariz e antebraço. A
Figura 8 mostra o momento da coleta dos espectros Raman no paciente.
Após a coleta dos espectros, os pacientes foram submetidos à biópsia
excisional. As amostras retiradas foram fixadas em formol, e enviadas para exame
histopatológico no Instituto de Patologia Oeste em Chapecó/SC, para o diagnóstico
da lesão. Regiões normais não foram retiradas para exame histopatológico. O
exame histopatológico revelou as seguintes lesões: carcinoma basocelular - CBC;
52
carcinoma espinocelular - CEC, queratose actínica - KER e lesões benignas (nevus
e dermatite).
Para este trabalho foi considerado um total de 250 espectros de tecido
normal, 14 espectros de tecido benigno (BEN), 133 espectros de carcinoma
basocelular (CBC), 30 espectros de carcinoma espinocelular (CEC) e 57 espectros
de queratose actínica (KER), conforme apresentado na Tabela 1. Dezesseis
espectros de lesões apresentaram uma relação sinal-ruído baixa (provavelmente
devido a artefato de movimentação da Probe durante a coleta dos espectros) e
foram retiradas do estudo. Os espectros foram separados em três grupos: os tecidos
de pele normal e lesões benignas (não tumor - NT), tumores não melanoma (CBC e
CEC) e displasias (KER).
Nas lesões cutâneas mais extensas foram coletados espectros em dois sítios
da lesão, com 5 espectros cada sítio (um espectro no centro do sítio e quatro nas
bordas internas), consequentemente na região adjacente com tecido normal também
foram coletados em dois sítios, com 5 espectros cada sítio, aumentando assim o
número de espectros.
Figura 8: Momento da coleta dos espectros Raman no paciente.
53
Tabela 1: Descrição das amostras, incluindo número de pacientes, lesões e espectros utilizados
na análise de discriminação.
BEN
CBC
CEC
KER
Total
Número de pacientes
1
14
4
6
25
Número de lesões#
3
28
7
11
49
Número de espectros
14
133
30
57
234
Número total de espectros de
tecidos normais§
250
#
Nota: Uma lesão grande foi escaneada em dois sítios, resultando em 10 espectros para esta
§
lesão. O número de sítios escaneados nos tecidos normais foi o mesmo que o número
utilizado nas lesões.
3.2. Equipamento Raman e processamento dos espectros
Para a coleta de espectros Raman foi utilizado um sistema Raman portátil no
infravermelho próximo (sistema P-1 Raman, Lambda Solutions, Inc. MA, EUA), com
excitação em 830 nm, potência do laser ajustável de até 350 mW, e com uma
resolução espectral de 2 cm-1 na faixa de 200 - 1800 cm-1. O espectrômetro
(espectrógrafo com grade de dispersão de 1200 linhas/mm) foi conectado a uma
Probe (sonda a fibra óptica) (Vector probe, Lambda Solutions, Inc. MA, USA), com 3
metros de comprimento e um conjunto de filtros passa banda e rejeita banda. Na
extremidade distal da Probe, foi conectada uma ponteira para manter uma distância
focal de 10 mm entre a ponta da Probe e o tecido. A detecção do sinal luminoso
espalhado pela amostra foi efetuada por uma câmera CCD “back thinned, deep
depletion” de 1340X100 pixels refrigerada por elemento termoelétrico (Peltier),
atingindo uma temperatura de trabalho de -75°C.
Os espectros Raman foram coletados com tempos de 20 s (10 aquisições de
2 s) para todos os sítios de lesões. Para a coleta dos espectros in vivo, a potência do
laser foi ajustada para 200 mW, o spot do laser com a ponteira era de 170 µm. Este
nível de potência não mostrou sinais de queimadura na pele, tampouco queixas de
dor pelos pacientes, quando se consideram os fototipos de pele avaliados no estudo
(1 a 3).
54
A calibração do espectrômetro Raman (correção da resposta do comprimento
de onda pelo deslocamento Raman) foi verificada durante a pré-coleta de dados. O
deslocamaneto Raman foi verificado utilizando as bandas mais intensas do naftaleno
e a correção da resposta de calibração foi obtida usando uma lâmpada de filamento
de tungstênio (Oriel Instruments, CT, EUA, modelo 63358) com espectro rastreado
pelo NIST (National Institite of Standards and Technology). A fluorescência de
background foi removida após a coleta dos dados, de modo offline, através de uma
subtração de uma função polinomial de 5a ordem, na faixa de 400 - 1800 cm-1,
através de uma rotina desenvolvida no Matlab® (The Mathworks Inc., MA, EUA,
versão 5.2).
Após a calibração e a remoção do background, os espectros foram
submetidos a uma filtragem "média móvel", utilizando cinco pontos adjacentes, e
normalizados pela variação normal padrão (SNV - Standard Normal Variate)
(BARNES; DHANOA; LISTER, 1989).
3.2. Modelos espectrais para análise discriminante
Para os modelos discriminantes foram considerados um total de 250 espectros de
tecido normal, 14 espectros de tecido benigno (BEN), 133 espectros de carcinoma
basocelular (CBC), 30 espectros de carcinoma espinocelular (CEC) e 57 espectros
de queratose actínica (KER), conforme apresentado na Tabela 1.
As ferramentas estatisticas utilizdas no projeto necessitam de um grupo
treino, por isso os espectros de cada lesão foram separados de acordo com os
resultados da avaliação histopatológica. Utilizando os espectros Raman dos tecidos
da pele in vivo, e os resultados histopatológicos, desenvolvemos modelos de
discriminação: com base na Análise de Componentes Principais (PCA/DA - Principal
Components Analysis / Discriminant Analysis) e como funções de discriminação a
distancias Euclidiana, Quadrática e Mahalanobis; e com base nos Mínimos
Quadrados Parciais (PLS/DA - Partial Least Squares / Discriminant Analysis), a fim
de classificar os sítios de tecido da pele, de acordo com a presença ou ausência de
lesões.
Para identificar quais componentes principais resultariam na melhor
classificação, foi empregada a análise de variância ANOVA, com nível de
significância menor que 5% (ANOVA - teste Tukey-Kramer, p < 0,05), assim
55
encontramos quais os scores PCs com os menores níveis de significância para
discriminar os grupos histopatológicos (BODANESE et al., 2012; BODANESE et al.,
2010). Em seguida, utilizaram-se as funções discriminantes com base nas distâncias
Euclidiana, Quadrática e a de Mahalanobis, para discriminar uma amostra de um
grupo. O outro modelo discriminante, PLS/DA, utilizou o mesmo número de variáveis
latentes (VLs) dos números de scores PCs. Para ambos os modelos PCA/DA e
PLS/DA, um método de validação cruzada foi utilizado e foi baseado em uma
abordagem espectral por leave-one-out, onde o modelo é desenvolvido com um
espectro de n-1, e o espectro left-out foi testado para verificar a qual classe o
espectro pertencia. Isso foi repetido n vezes (para cada espectro left-out). A precisão
total foi calculada para cada grupo histopatológico.
Os diferentes modelos foram utilizados para discriminar as lesões dos tecidos
normais adjacentes nos grupos histopatológicos, da seguinte forma:
• Agrupamento 1: discriminação das lesões separadamente - NT X CBC X CEC
X KER;
• Agrupamento 2: discriminação das neoplasias agrupadas - NT X (CBC +
CEC) X KER;
• Agrupamento 3: discriminação da neoplasia e displasia pré-maligna
correspondente agrupadas - NT X CBC X (CEC + KER);
• Agrupamento 4: discriminação das neoplasias e displasias agrupadas - NT X
(CBC + CEC + KER).
Para a rotina de validação cruzada, usamos cada espectro individualmente,
porém o diagnóstico foi dado em relação à lesão; onde adotamos o seguinte critério
para o diagnóstico Raman: dos cinco espectros medidos, se três ou mais foram
classificados corretamente pelo respectivo modelo espectral comparada ao exame
histopatológico, a lesão foi discriminada corretamente para este mesmo grupo. Caso
contrário, a lesão foi discriminada para o maior número de espectros classificados.
Os modelos de discriminação desenvolvidos neste trabalho (PCA/DA e
PLS/DA) serão avaliados e validados através da precisão geral. Para a
discriminação de tecido normal de tecido maligno (CBC, CEC e KER), no caso o
agrupamento 4, será feita a avaliação para a validação através da tabela de
56
contigência, utilizando os valores de sensibilidade e especificidade. O modelo
discriminante ideal deve fornecer a resposta correta, ou seja, um resultado positivo
nos indivíduos com a doença e um resultado negativo nos indivíduos sem a doença.
57
4. RESULTADOS
O resultado histopatológico mostrou a presença de algumas lesões benignas (nevo e
dematite), por conta da sua não malignidade mostrada no exame histopatologico, e
do objetivo deste estudo que é de discriminar tecido normal de tecido malígno, os
espectros das lesões benignas foram agrupados com os espectros de tecido normal.
A histopatologia das lesões mostrou que todas as lesões eram in situ.
A Tabela 1 apresenta o número de pacientes, lesões e de espectro utilizados
em cada grupo histopatológico. A Figura 9 mostra as médias e o desvio padrão dos
espectros Raman de NT, CBC, CEC, e KER na região de 400 - 1800 cm-1. Os
espectros de pele apresentam picos característicos de proteínas (colágeno, elastina,
actina), lipídios (fosfolipídios, ácidos graxos) e os ácidos nucleicos (HANLON et al.,
2000; MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007; SILVEIRA JR et al., 2012). O
espectro dos diferentes tipos de tecidos, normais, benignos e patológicos,
mostraram perfis espectrais muito semelhantes entre si, mas algumas regiões do
espectro têm características diferentes, tais como picos na região de 800 –
1000 cm-1, e entre 1200 e 1300 cm-1, devido a constituições bioquímicas diferentes,
decorrentes do processo neoplásico.
58
0.016
Intensidade (un. arb.)
Média KER
Média KER
Média CEC
Média CEC
Média CBC
Média CBC
Média NT
Média NT
0.012
0.008
0.004
0.000
-0.004
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
0,016
Intensidade (un. arb.)
Média KER
Média KER
Média CEC
Média CEC
Média CBC
Média CBC
Média NT
Média NT
0,012
0,008
0,004
0,000
-0,004
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 9: Média normalizada e o desvio padrão (em cinza) dos espectros Raman de tecidos de
normal e benigno (NT), carcinoma basocelular (CBC), carcinoma espinocelular (CEC) e queratose
actínica (KER).
Para verificar a diferença espectral entre os espectros dos tecidos analisados,
foi feita a subtração do espectro médio da displasia e das neoplasias do espectro
médio do tecido normal e benigno, o respectivo resultado é mostrado na Figura 10.
59
0.012
Intensidade (um. arb.)
KER - NT
CEC - NT
CBC- NT
média NT
0.008
0.004
0.000
-0.004
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
KER - NT
CEC - NT
CBC- NT
média NT
Intensidade (um. arb.)
0,012
0,008
0,004
0,000
-0,004
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 10: Espectro da subtração dos espectros das lesões do tecido normal.
Através da Figura 10, onde é mostrado a subtração da média dos espectro da
displasia e das neoplasias da média do espectro de tecido normal e benigno,
podemos notar a diferença espectral entre o tecido BCC e CEC, na região entre 800
e 1000 cm-1, região está principalmente de bandas de proteína , e na região de 1450
60
cm-1 e em 1660 cm-1, região rica em lipídio (SILVEIRA JR et al., 2012). Podemos
verificar também uma diferença do tecido de KER em relação a CBC e CEC na
banda de 1660 cm-1.
A fim de propor um método para discriminar tecidos de pele, usando
espectros Raman in vivo, foram desenvolvidos modelos discriminantes com base em
PCA e PLS, utilizando seis scores PC (PCA) e seis variáveis latentes VL (PLS),
conforme definido pela análise ANOVA, com maior capacidade para discriminação
(PCs com baixo nível de significância entre os grupos). Estes vetores espectrais de
PCA e PLS podem ser correlacionados com os bioquímicos presentes nos tecidos, e
então, estes vetores espectrais podem ser utilizados para verificar e correlacionar as
alterações que ocorrem no tecido, após as alterações na bioquímica destes tecidos,
causados pela carcinogênese da neoplasia (BODANESE et al., 2012).
Para obtenção da discriminação dos grupos histopatológicos, os modelos
discriminantes, PCA/DA e PLS/DA, foram desenvolvidos de modo “offline”, utilizando
todos os dados espectrais dos tecidos analisados: NT, CBC, CEC e KER.
Para a discriminação entre os tecidos, as lesões benignas foram agrupadas
como não tumor, devido à sua característica histológica (nevo melanocítico
intradérmico e dermatite). CEC e CBC foram avaliadas em dois grupos separados, e
também compondo um único grupo, grupo compreendendo tumores não melanoma.
Queratose actínica foi colocada em um grupo separado, porque é uma displasia prémaligna, mas também, foi analisada em conjunto com CEC, por ser considerada
como uma displasia precursora de CEC (ALLEN, 2010; SPENCER et al., 1995). A
Figura 11 mostra os primeiros seis vetores espectrais, PC para PCA e VL para PLS,
extraídos do conjunto de dados dos espectros. Para o modelo de PCA, os primeiros
seis PCs apresentaram mais de 98% da variância para o conjunto de dados.
61
-0,12
-0,15
PC1
-0,08
-0,10
-0,04
-0,05
0,00
0,00
0,04
0,05
0,08
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
-0,04
Colágeno I
0,10
400
600
800
1000 1200 1400
800
1000 1200
1600 1800
0,60
PC2
-0,02
VL2
0,32
-0,01
0,04
0,01
-0,24
0,02
-0,52
0,04
-0,80
400
0,02
Intensidade (un. arb.)
VL1
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
400
4,50
PC3
0,01
3,00
0,01
1,50
0,00
0,00
-0,01
-1,50
-0,01
400
600
1400 1600
1800
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
800
1000
1200
1400
1600
1800
800
1000
1200
1400
1600
1800
VL3
Colágeno III
-3,00
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
0,01
400
600
800
1000 1200 1400
1600 1800
800
1000 1200 1400
1600 1800
10,00
PC4
0,00
6,00
0,00
2,00
0,00
-2,00
-0,01
VL4
-6,00
-0,01
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
0,00
-10,00
400
600
400
600
17,40
PC5
VL5
0,00
11,60
0,00
5,80
0,00
0,00
0,00
-5,80
-0,01
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
Trioleína
-11,60
400
600
800
1000
1200 1400 1600 1800
800
1000
1200
61,0
0,00
VL6
PC6
0,00
45,5
0,00
30,0
0,00
14,5
-1,0
0,00
0,00
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
-16,5
400
600
1400
1600
1800 400
600
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 11: Gráfico dos seis primeiros vetores variantes de PCA e PLS (PCs e VLs, respectivamente)
para o conjunto de dados dos espectros Raman.
O número de variáveis de PCA e PLS para serem incluídas no modelo
discriminante foram definidas pela utilização da análise ANOVA, a fim de verificar
quais teriam melhor diferenciação entre os tecidos de pele (Figura 12). O teste
ANOVA (teste Tukey-Kramer, p < 0,05) mostrou que os PCs de 1 a 6 (PC1 a PC6)
apresentaram significância para a discriminação intergrupos (ANOVA, p <0,05). PC1
e PC2 apresentaram diferenças estatísticas significantes entre NT e CBC (p <0,001),
NT e CEC (p < 0,05 para o PC1 e p < 0,001 para PC2) e NT e KER (p<0,001), onde
62
este PC pode ser utilizado para discriminar tecidos normais de neoplásicos e
displasias. O vetor espectral PC1 apresenta caracteristicas espectrais gerais da
pele. O vetor PC2 (Figura 11) apresentou características espectrais, principalmente,
de lipídios (região em 1250 – 1300 cm-1 e em torno de 1450 cm-1) e proteínas (em
1000 cm-1 e 1450 cm-1), indicando que estes compostos estavam presentes em
tumores não melanoma e queratose actínica, em quantidades diferentes que nos
tecidos benigno e normal. O PC3 mostrou diferença significante entre NT e CBC (p <
0,001), e entre NT and KER (p < 0,05 ). Este vetor, PC3, tem informação espectral
relacionada com proteínas, com uma banda em 878 – 940 cm-1, atribuída a
prolina e hidroxiprolina de uma matriz de colágeno, e picos em 1248 e 1271 cm-1
atribuído a amida III, das proteínas (SILVEIRA JR. et al., 2012; SPENCER et al.,
1995) O PC4 apresentou a maior significância entre os tecidos, NT e CBC (p <
0,001), NT e CEC (p < 0,001), NT e KER (p <0,001), CBC e CEC (p <0,001) e CBC
e KER (p < 0,001), monstrando que este score (PC4) poderia ser utilizado para
discriminação intergrupos. O vetor PC4 possui características espectrais particulares
na região 1200-1400 cm-1 semelhante aos vetores encontrados em outros estudos
com capacidades de discriminação destes mesmos tecidos (BODANESE et al.,
2012; BODANESE et al., 2010).
63
Intensidade (un. arb.)
*
*
-0.04
*
-0.04
-0.05
-0.05
-0.12
Intensidade (un. arb.)
0.20
PC1
média média
NT
CBC
*
*
-0.07
-0.02
0.03
média
NT
média
CBC
*
-0.04
média
NT
0.07
*
*
0.02
-0.03
-0.08
média média média média
NT
CBC
CEC
KER
média média média
CBC
CEC
KER
PC5
*
0.10
*
0.04
-0.02
0.16
PC3
*
0.04
média média média
NT
CBC
CEC
média média
CEC
KER
Intensidade (un. arb.)
Intensidade (un. arb.)
0.12
*
-0.08
0.08
*
*
0.16
*
PC2
PC4
0.12
-0.12
média média
CEC
KER
Intensidade (un. arb.)
Intensidade (un. arb.)
-0.04
0.09
PC6
média
KER
*
*
*
*
0.02
-0.05
-0.12
média média média
NT
CBC
CEC
média
KER
Figura 12: Gráfico das médias das intensidades e desvio-padrão dos seis primeiros scores PCs
utilizados nos modelos discriminnates. * Indica os pares de PC com diferenças estatisticamente
significantes (p <0,05, ANOVA).
Para o modelo discriminante PCA/DA foi utilizando a função classify.m ®(The
MathWorks, Inc., MA, EUA), e para o modelo PLS/DA foi utilizado a função pls.m®
(Cleiton A. Nunes, UFLA, MG, Brasil), ambas utilizadas no software Matlab (The
MathWorks, Inc., MA, EUA), com os seis primeiros scores (PCA/DA) e as seis
primeiras variáveis latentes (PLS/DA) em ambos os modelos. Para o modelo
PCA/DA, utilizamos três funções para discriminação dos grupos: distâncias
Euclidiana, Quadráticas e de Mahalanobis, utilizando as amostras agrupadas da
seguinte forma:
64
• Agrupamento 1: discriminação das lesões separadamente - NT X CBC X CEC
X KER;
• Agrupamento 2: discriminação das neoplasias agrupadas - NT X (CBC +
CEC) X KER;
• Agrupamento 3: discriminação da neoplasia e displasia pré-maligna
correspondente agrupadas - NT X CBC X (CEC + KER);
• Agrupamento 4: discriminação das neoplasias e displasias agrupadas - NT X
(CBC + CEC + KER).
O número correto de classificações para cada combinação de grupo
histopatológico,
para
cada
modelo,
e
a
sensibilidade
e
especificidade
correspondentes, são apresentados na Tabela 2. Para os modelos de discriminação
utilizados, o melhor índice de classificação foi encontrado quando todas as lesões
estavam agrupadas em um único grupo (agrupamento 4), dando uma precisão total
de 91,9% para o modelo PLS/DA; neste arranjo de grupos foi possível uma
sensibilidade e especificidade de 90,9% e 93,2%, respectivamente. Ainda para este
mesmo agrupamento, o segundo melhor índice de classificação foi o modelo
PCA/DA utilizando a distância quadrática, com 82,8% de precisão geral, e com uma
sensibilidade e especificidade de 83,3% e 82,2%, respectivamente. Em seguida,
com uma precisão geral de 81,8%, o modelo PCA/DA utilizando a distância
euclidiana, com uma sensibilidade e especificidade de 78,7% e 86,8%,
respectivamente.
65
Tabela 2: Resultados da discriminação: classificação correta por grupo; e precisão global dos diferentes arranjos dos grupos histopatológicos.
Agrupamento 1
PCA/DA- Euclidiana
Tipos de tecidos
NT
NT∆ (n = 53)
CBC (n = 28)
PCA/DA-Quadrática
†
CBC
CEC
KER
Indef .
NT
46
3
0
0
4
6
12
4
2
4
CEC (n = 7)
0
1
3
2
KER (n = 11)
2
0
1
7
Precisão geral
CBC
CEC
KER
45
4
0
6
12
4
1
0
1
1
2
0
68.7%
Agrupamento 2
†
NT
0
4
2
4
3
2
1
7
PLS/DA
†
CBC
CEC
KER
Indef .
NT
43
7
0
2
1
3
21
0
1
3
1
0
1
1
2
1
1
0
0
10
67.7%
PCA/DA-Euclidiana
Tipos de tecidos
PCA/DA-Mahalanobis
Indef.
CBC
CEC
KER
Indef
532
0
0
0
0
10
17
0
0
1
3
1
4
0
1
1
0
3
1
0
7
0
75.8%
PCA/DA-Quadrática
†
78.6%
PCA/DA-Mahalanobis
PLS/DA
NT
CBC + CEC
KER
Indef.
NT
CBC + CEC
KER
Indef.
NT
CBC + CEC
KER
Indef.
NT
CBC + CEC
KER
Indef.
NT (n = 53)
47
3
0
3
42
4
0
7
40
7
3
3
51
2
0
0
CBC + CEC (n = 35)
5
20
6
4
3
21
4
7
4
25
4
2
9
24
0
2
KER (n = 11)
2
2
7
0
1
0
10
0
1
1
9
0
2
3
6
0
∆
Precisão geral
Agrupamento 3
Tipos de tecidos
74.7%
73.7%
74.7%
82.7%
PCA/DA-Euclidiana
PCA/DA-Quadrática
PCA/DA-Mahalanobis
PLS/DA
NT
CBC
CEC + KER
Indef.
NT
CBC
CEC + KER
Indef.
NT
CBC
CEC + KER
Indef.
NT
CBC
CEC + KER
Indef.
NT (n = 53)
46
4
0
3
46
4
0
3
44
6
1
2
53
0
0
0
CBC (n = 28)
6
15
1
6
4
15
1
8
4
17
3
4
9
16
0
3
CEC + KER (n = 18)
2
2
12
2
2
2
12
2
1
3
14
0
3
3
10
2
∆
Precisão geral
73.7%
Agrupamento 4
73.7%
PCA/DA Euclidiana
Tipos de tecidos
∆
NT (n = 53)
CBC + CEC + KER
(n = 46)
Precisão geral
PCA/DA Quadrática
80.6%
PCA/DA Mahalanobis
PLS/DA
NT
CBC + CEC + KER
NT
CBC + CEC + KER
NT
CBC + CEC + KER
NT
CBC + CEC + KER
48
5
45
8
36
17
50
3
13
33
9
37
5
41
5
41
81.8%
∆
75.8%
82.8%
77.8%
†
91.9%
Nota: Número de sitios normais (n = 50) somado ao número de lesões benignas (n = 3). Indef: significa grupo indefinido, onde o algoritmo de
discriminação não foi capaz de discriminar um grupo.
66
5. DISCUSSÃO
Os pacientes que participaram deste projeto eram provenientes da região Sul do
Brasil, onde vive um maior número de imigrantes e descendentes da Europa
(principalmente Alemanha), e nestes, é encontrado uma alta incidência de câncer de
pele, cerca de 6.100 casos de cânceres de pele não melanoma estimados em 2012
(INCA, 2012).
Neste trabalho, os espectros Raman de pele in vivo foram obtidos no local
da lesão e os espectros de tecidos normais nas regiões circunjacentes à lesão, com
a utilização de uma Probe. Os modelos para discriminação das displasias e
neoplasias foram realizados com base na análise multivariada PCA e PLS, e
realizadas de modo “offline”. Com o comprimento de onda e potência do laser
utilizados neste trabalho (infravermelho próximo e baixa potência), não foi relatado
queixas de queimadura e dores entre os pacientes. Todas as lesões foram retiradas
após as irradiações a laser, e não foi obervado nenhum possível efeito colateral
causado pela bioestimulação do laser.
Para testar os modelos de discriminação entre os tecidos, fizemos os
agrupamentos das lesões de pele conforme suas caracterisitcas histológicas. As
lesões benignas, devido à suas características histológicas (nevo melanocítico
intradérmico e dermatite) apresentadas no exame histopatológico, foram agrupadas
com o tecido normal, formando o grupo não tumor - NT. A displasia queratose
actínica foi analisada separadamente, por se tratar de uma anomalia provocada
durante o desenvolvimento e/ou proliferação da pele, mas a queratose actinica
também foi analisada em conjunto com o carcinoma espinocelular, em um
agrupamento CEC + KER, porque segundo a literatura, esta é considerada uma
lesão pré-maligna precursora de CEC (ALLEN, 2010; SPENCER et al., 1995). Por
conta de sua malignidade, as neoplasias CEC e CBC foram agrupadas em um único
grupo, compreendo os carcinomas não melanoma. Porém as neoplasias CEC e
CBC também foram analisadas em grupos separados, a fim de verificar se o modelo
discriminante teria a capacidade de diferenciar as neoplasias. Os modelos
discriminantes também foram testados para tentar discriminar os tecidos em um
agrupamento contendo apenas dois grupos, o grupo dos não tumores e o grupo com
tumor não melanoma.
67
Em
trabalhos
anteriores
realizados
por
nosso
grupo
de
pesquisa
(BODANESE et al., 2012; BODANESE et al., 2010; SILVEIRA JR. et al., 2012),
modelos discriminantes entre CBC e tecidos normais foram realizados in vitro,
utilizando fragmentos de biópsia. As características espectrais de CBC e de tecidos
normais foram suficientemente diferentes a fim de permitir a discriminação das
lesões de CBC utilizando PCA e modelo espectral, com base nas diferenças
bioquímicas do tecido, e com uma precisão maior que 90% em ambos os trabalhos.
No presente trabalho, as diferenças nas características espectrais do tecido de não
tumor em comparação com tumores não melanoma, não foram tão intensas. No
entanto, foi possível a discriminação de lesões da pele usando os seis primeiros
scores dos componentes principais (modelo PCA/DA) e as seis primeiras variáveis
latentes (modelo PLS/DA). A melhor discriminação foi possível de ser obtida no
modelo PLS/DA no agrupamento 4 da Tabela 2, onde a displasia e as neoplasias
foram agrupadas (tumores não melanoma), comparado com tecido não tumoral (NT).
O modelo de discriminação utilizando PLS pode classificar corretamente
aproximadamente 91,9% das amostras. O modelo PLS/DA mostrou melhor
desempenho quando comparado ao modelo PCA/DA em todos os agrupamentos de
lesões, versus tecido não tumores, com uma precisão para a discriminação que
varia de 78,6 % a 82,7%.
Métodos multivariados, tais como PCA e PLS, aplicados aos espectros
Raman, têm sido usados para a discriminação de tecidos patológicos e não
patológicos, com elevada sensibilidade e especificidade, tanto in vitro como in vivo
(BODANESE et al., 2012; BODANESE et al., 2010; CHRIT et al., 2005;
DURAIPANDIAN et al., 2013; GNIADECKA et al., 2004; HU et al., 2013; HUANG et
al., 2010; LIEBER et al., 2008b; LUI et al., 2012; LUO et al., 2013; MALINI et al.,
2006; MOTZ et al., 2006; NOGUEIRA et al., 2005; PHILIPSEN et al., 2013;
SIGURDSSON et al., 2004). Uma vantagem destes modelos estatísticos
multivariados é que nenhum conhecimento sobre a constituição da amostra é
necessário para desenvolver um modelo discriminante da mesma. PCA é uma
técnica reconhecida por revelar diferenças nas características espectrais de
diferentes grupos histopatológicos com base na variância espectral total entre os
grupos (BARKER; RAYENS, 2003). Malini et al. (2006), por exemplo, mostraram que
uma sensibilidade e especificidade de 100% pode ser alcançada em um modelo
discriminante, utilizando PCA e a distância de Mahalanobis para um diagnóstico
68
bucal (inflamação, pré-malignas e malignas do tecido normal). Duraipandian et al.
(2013) compararam o desempenho de um modelo de PCA-LDA para o diagnóstico
de pré-câncer cervical in vivo por colposcopia, obtendo uma exatidão de cerca de
84%. Hu et al. (2013) diagnosticaram tecidos normais, benignos e malignos de
mama baseados em PCA e support vector machine-recursive feature elimination
(SVM-RFE), com uma sensibilidade e especificidade de mais de 91%. Luo et al.
(2013) utilizaram PCA-LDA e a técnica naive Bayesian classifier (NBC) para
detecção de lesões pré-malignas e malignas em tecidos gástricos, com sensibilidade
e especificidade maior que 93%.
PCA tem mostrado ser um bom algoritmo para discriminar lesões de pele.
Gniadecka et al. (2004) alcançaram uma sensibilidade e uma especificidade de 85%
e 99%, respectivamente, para o diagnóstico de melanoma. Sigurdsson et al. (2004)
obtiveram uma classificação de mais de 80% para a detecção de CBC, melanoma
maligno, nevus pigmentado, queratose seborreica e pele normal in vitro. Choi et al.
(2005) mostraram haver diferenças espectrais em biópsias de pele normal e CBC,
através de espectroscopia Raman confocal, e conseguiram um nível de confiança de
95%. Bonadese et al. (2010) realizaram a diferenciação de fragmentos de tecido
normais e de CBC, com uma sensibilidade e uma especificidade de 96% e 92%.
Bonadese et al. (2012) discriminaram espectralmente, CBC e MEL de tecido normal
a partir de fragmentos de pele in vitro, com sensibilidade, especificidade e uma
precisão de 99,1% , 93,3 % e 92,4%, respectivamente. Modelo em PLS foi aplicado
por Lui et al. (2012) para discriminar câncer de pele e queratoses actínicas de lesões
benignas da pele.
Em nossos resultados, as diferenças espectrais entre os tecidos não
tumorais, pré- malignos e lesões cutâneas malignas, não foram tão evidentes. Todas
as lesões apresentavam diagnóstico histopatológico de lesões in situ, sendo
localizado na epiderme (camada basal e espinhosa). A pele humana tem sua
espessura variando dependendo do local do corpo, a epiderme, um tecido epitelial
estratificado queratinizado, tem uma espessura variando de 0,04 mm nas pálpebras
a 1,6 mm na palma da mão e dos pés; a derme (tecido conjuntivo - estroma
fibroelástico) tem uma espessura que varia de 0,3 mm nas pálpebras e 3,0 a 4,0 mm
na região das costas (SAMPAIO; RIVITTI, 2001). A absorção e o coeficiente de
espalhamento da radiação no infravermelho próximo (750nm) na pele são estimados
em 0,01 mm-1 e 1,5 mm-1, respectivamente, a profundidade de penetração do laser
69
no infravermelho na pele é estimado de 4 a 5 mm (JACQUES; POGUE, 2008).
Como as lesões de pele foram classificadas histologicamente como in situ, com isso
poderia haver uma contribuição espectral proveniente das camadas mais profundas
da derme normal, devido à utilização de um espectrômetro Raman, com uma
excitação de infravermelho próximo.
Em geral, as lesões localizadas na pele, se desenvolvem in situ, com exceção
do melanoma altamente invasivo. Melhores resultados podem ser obtidos com o a
utilização de um sistema Raman confocal (CHOI et al., 2005) ou uma Probe confocal
(CHRIT et al., 2005; DURAIPANDIAN et al., 2013; LIEBER et al., 2008a), em que se
pode controlar a profundidade de foco e limitar a camada medida pelo sistema
óptico. Greve, Andersen e Nielsen (2008) verificaram que os sinais em espectro de
pele por FT-Raman são predominantemente proveniente das camadas mais
profundas da pele, e algumas das diferenças espectrais poderiam ser reflexo da
diferença de espessura da pele. Chrit et al. (2005) descobriram que características
Raman relacionadas com proteínas e lipídios variavam, dependendo da localização
anatômica e do tipo de pele do paciente, e estas variações seriam resultados de
alterações nos componentes do estrato córneo, como um fator de hidratação natural,
lipídios e água. Assim, melhores resultados seriam atingidos com utilização de uma
Probe confocal. No entanto, em nosso modelo de discriminação espectral, não foi
utilizando uma Probe confocal, porém, conseguimos mostrar resultados de
discriminação de tecido neoplásico de tecidno normal comparável ao trabalho de Lui
et al. (2012).
Mesmo não expressivas as diferenças espectrais entre CBC, CEC e KER,
quando comparado ao NT, foi possível verificar diferenças nas bandas Raman
referentes a presença de proteína e lipídio de acordo com a literatura (BODANESE
et al., 2010; CHOI et al., 2005; GNIADECKA et al., 2004; LARRAONA-PUY et al.,
2009; LIEBER et al., 2008b; NIJSSEN et al., 2002; SPENCER et al., 1995). As
variáveis espectrais que mostram as variações estimadas pelos modelos PCA e PLS
(PCs e VLs, respectivamente), revelaram características espectrais de alguns
componentes bioquímicos principais do tecido de pele, como colágeno, elastina,
actina, e ácido oléico (trioleina), como demonstrado em trabalho anterior por
Bodanese et al. (2012). A característica espectral apresentada no PC4,
particularmente o perfil “N” na região de 1200 - 1350 cm-1 e de prolina/hidroxiprolina
nas bandas de 850 - 950 cm-1, foram observados em nossos trabalhos anteriores de
70
pele in vitro semelhante à PC2 (invertida) nos trabalhos de Bodanese et al. (2010) e
semelhante ao PC3 em outro trabalho de Bodanese et al. (2012). No presente
estudo, estas características espectrais foram responsáveis pela discriminação dos
tecidos normais e malignos, e têm sido atribuídas a diferenças de proteínas e lipídios
nos tecidos normais e BCC.
Visando a avaliação de tecidos de pele para o diagnóstico do câncer, por
meio da espectroscopia Raman in vivo, Huang et al. (2001) desenvolveram um
sistema de espectroscopia Raman no infravermelho próximo para as medições da
pele humana em tempo real, de forma não invasiva, com uma boa relação sinal ruído, com um tempo de coleta do espectro em menos de 1 s. Lui et al. (2012)
avaliaram um grande número de pacientes (518), submetidos a diagnóstico do
câncer de pele (avaliação clínica ou biópsias), utilizando o instrumento apresentado
por Huang et al. (2001). Neste estudo, o algoritmo de diagnóstico “offline”, para a
discriminação de câncer de pele e queratoses actínicas de lesões benignas foi
baseado em PCA, com uma análise discriminante generalizada (PCA-GDA), e
também foi aplicada aos espectros uma análise de discriminação com base em
partial least-squares (PLS). O algoritmo PLS indicou uma curva ROC (receiver
operating characteristic) de 0,896 (com uma sensibilidade de 90% e uma
especificidade de 66%). Segundo esses autores, os resultados da espectroscopia
Raman deveriam, portanto, ser vistos como um meio para auxiliar na avaliação de
suspeitas de lesões de pele, em vez de ser um método final e definitivo para o
diagnóstico da lesão (LUI et al., 2012).
No presente estudo, a melhor discriminação foi alcançada para o
agrupamento 4, discriminação do tecido normal e benigno (NT) das neoplasias e
displasias agrupadas (CBC + CEC + KER), sendo capaz a diferenciação entre
tecidos neoplásicos de tecido normal, utilizando o modelo PLS/DA. Nossos
resultaodos se mostraram análogos com os resultados apresentados pela literatura
para resultados de análise in vivo (CHOI et al., 2005; LIEBER et al., 2008b; LUI et
al., 2012), e mesmo não utilizando um sistema de espectroscopia confocal, os
resultados se mostraram animadores. Portanto, a espectroscopia Raman poderia ser
utilizada para discriminar lesões de pele, em que as diferenças na bioquímica dos
tecidos podem ser vistas por meio de métodos de decomposição espectral baseado
em variações espectrais. Para o PCA, funções discriminantes como as distâncias
Eucliana, Quadrática e de Mahalanobis, poderiam trazer a classificação dos grupos
71
histopatológicos com uma boa precisão. Considerando as baixas diferenças
espectrais entre tecidos normais, displasias e neoplasias malignas, que são na sua
maior parte, devido à elevada profundidade de penetração do laser em 830 nm, o
uso de uma Probe confocal (CHRIT et al., 2005; DURAIPANDIAN et al., 2013;
LIEBER et al., 2008a), poderia trazer um melhor controle da profundidade de
penetração do laser, fazendo com que a radiação que fora espalhada pelo tecido e
coletada pelo equipamento de espectroscopia Raman seja respectivamente da
camada da pele que está analizando, aumentando assim a precisão e melhorando a
capacidade de diagnóstico da técnica Raman.
A
espectroscpia
Raman
mostrou
ser
uma
ótima
ferramenta
para
discriminação de lesões de pele, podendo tornando-se uma valiosa ferramenta para
o auxílio ao dermatologista em um diagóstico precose de câncer de pele.
72
6. CONCLUSÃO
Neste trabalho, as suspeitas de lesões de pele humana in vivo foram avaliadas por
meio de espectroscopia Raman, pré-biópisia excisional, e modelos de diagnóstico
“offline” foram desenvolvidos, com base em PCA e PLS, a fim de discriminar tecidos
não
tumorais
de
tecidos
malignos
(carcinoma
basocelular
e
carcinoma
espinocelular), e pré-malignas (queratose actinica). A maior precisão obtida foi de
91,9% pelo modelo PLS/DA, com uma sensibilidade de 90,9% e uma especificidade
de 93,2%, para a discriminação de lesões não melanoma e prémaligno (CBC, CEC e
KER) de lesão benigna e tecido normal (NT). O modelo PCA/DA apresentou
precisão alta, cerca de 82,8% para o mesmo agrupamento histopatológico. Os
resultados de especificadade se mostraram maior que os resultados de
sensibilidade, mostrando que os modelos discrimnates estudados conseguem
excluir os pacientes que não possuem a neoplasia. Vetores de variância espectral
de PCA e PLS revelaram informações úteis quanto as diferenças bioquímicas entre
os tecidos relacionados com a neoplasia. O modelo PLS/DA apresentou uma
viabilidade para um algoritmo de discriminação in vivo e um diagnóstico em tempo
real. A profundidade de penetração do laser no infravermelho é um ponto chave para
aumentar a precisão do modelo, e deve ser levada em consideração para análise e
diagnóstico de câncer em pele em trabalhos futuros.
73
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ANEXO A
Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa