Aplicação de alta pressão para
produção de proteínas biofuncionais a
partir de agregados produzidos em
bactérias Escherichia coli
geneticamente modificadas
Centro de Biotecnologia
IPEN
Objetivo:
Obtenção de proteínas bioativas a partir de agregados
insolúveis e inativos (corpos de inclusão) de proteínas
recombinantes produzidas em bactérias Escherichia
coli.
Renaturação de proteínas difíceis que não haviam sido
obtidas utilizando-se os métodos convencionais.
Exemplos de importância da produção de proteínas
recombinantes
•
Indústria

Indústria farmacêutica humana e veterinária

Produção de celulases para bioetanol 2ª geração

Pesquisa

Projetos genoma/proteoma

Caracterização de novas proteínas. Utilização como alvo para
desenvolvimento de fármacos. Novas proteínas com atividade
terapêutica potencializadas.

Desenvolvimento de antígenos para vacinas (exemplos: dengue,
Schistosoma mansoni, Leptospira)

Bactérias E. coli geneticamente modificadas:
hospedeiros mais utilizados para a produção
de proteínas recombinantes.

Sistema muito bem estudado

Meios de cultura baratos

Produção extremamente rápida: duplicação
celular em 30-40 minutos.

Altos níveis de expressão de proteínas
recombinantes
Produção de proteínas heterólogas em E. coli:

1) Forma solúvel no periplasma

2) Forma solúvel no citoplasma

3) Agregados insolúveis acumulados no citoplasma
bacteriano, (corpos de inclusão).
Produção de proteínas recombinantes como
corpos de inclusão:
Vantagens:
Expressão elevada
Facilidade de separação física entre as proteínas do hospedeiro e
as proteínas heterólogas
Menor grau de contaminação dos CI por proteínas e
lipopolisacarídeos do hospedeiro
Desvantagem
Necessidade de um processo eficiente de renaturação com altos
rendimentos (solubilização dos agregados e enovelamento para
aquisição da estrutura nativa e biologicamente ativa).
GFP
Endostatina
Região globular da
Fibra de Adenovirus
Toxina B da cólera
EndostatinaBAX
Renaturação de proteínas:
método convencional x alta
pressão
Os
CI são proteínas insolúveis e sem atividade, mas que possuem
estruturas (secundárias e até terciárias) semelhantes às das proteínas
nativas.
Renaturação de proteínas utilizando os métodos convencionais:
Solubilização dos CI na presença de agentes desnaturantes em alta
concentração (ureia e guanidina).
Reagregação quando da retirada dos agentes utilizados para solubilização.
Utilização de alta pressão para solubilização dos CI:
As proteínas são solubilizadas pela ação da alta pressão sem sofrer
desnaturação: conformação nativa favorecida.
Apoios de agência de fomento para o projeto (Auxílios à
Pesquisa):

FAPESP 2010/13353-0 (2010 a 2012): Caracterização dos
estados intermediários do enovelamento e obtenção de
proteínas biofuncionais pela aplicação de altas pressões
hidrostáticas a agregados protéicos.

CNPq (Edital Universal, 2008 a 2010): Estudos de renaturação
de proteínas agregadas em corpos de inclusão citoplasmáticos
produzidos em E. coli utilizando altas pressões hidrostáticas.

FAPESP 2007/54624-4 (2008 a 2010): Estudos de renaturação
em alta pressão de proteínas agregadas em corpos de
inclusão citoplasmáticos produzidos em E. coli.

Bolsas de mestrado, doutorado e pós doutorado: FAPESP,
CNPq e CAPES.
Projeto atual: FAPESP 2015/02574-0 (2015 a 2017):
Renaturação de antígenos sintetizados como corpos de
inclusão em E. coli para preparação de vacinas
•Inicialmente as vacinas utilizavam patógenos inativados ou
atenuados.
•Atualmente: utilização de uma ou mais proteínas dos patógenos,
em substituição aos patógenos inteiros.
•Importância de domínios antigênicos contendo epítopos com a
conformação nativa para a geração de anticorpos neutralizantes.
•Necessidade de produção de proteínas recombinantes que
mantenham as propriedades conformacionais das proteínas alvo dos
patógenos preservadas.
Pesquisadores colaboradores:
-Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira (ICB-USP): dengue, HPV
-Dra. Luciana Cezar de Cerqueira Leite (Instituto Butantan): S. mansoni
-Dr. Paulo Lee Ho (Instituto Butantan): Leptospira
-Dra. Silvia Boscardim (ICB-USP): dengue
1. Chura-Chambi, R. M., Genova, L. A., Affonso, R. and Morganti, L. (2008) Refolding of endostatin from
inclusion bodies using high hydrostatic pressure. Anal Biochem 379, 32-39.
2. Balduino, K. N., Spencer, P. J., Malavasi, N. V., Chura-Chambi, R. M., Lemke, L. S. and Morganti, L.
(2011) Refolding by High Pressure of a Toxin Containing Seven Disulfide Bonds: Bothropstoxin-1 from
Bothrops jararacussu. Molecular Biotechnology 48, 228-234.
3. Malavasi, N. V., Foguel, D., Bonafe, C. F. S., Braga, C. A. C. A., Chura-Chambi, R. M., Vieira, J. M. and
Morganti, L. (2011) Protein refolding at high pressure: Optimization using eGFP as a model. Process
Biochemistry 46, 512-518.
4. Chura-Chambi, R. M., Cordeiro, Y., Malavasi, N. V., Lemke, L. S., Rodrigues, D. and Morganti, L. (2013)
An analysis of the factors that affect the dissociation of inclusion bodies and the refolding of endostatin under
high pressure. Proc Biochem 48, 250-259.
5. Chura-Chambi, R. M., Nakajima, E., de Carvalho, R. R., Miyasato, P. A., Oliveira, S. C., Morganti, L. and
Martins, E. A. (2013) Refolding of the recombinant protein Sm29, a step toward the production of the vaccine
candidate against schistosomiasis. J Biotechnol 168, 511-519.
6. Malavasi, N. V., Cordeiro, Y., Rodrigues, D., Chura-Chambi, R. M., Lemke, L. S. and Morganti, L. (2014)
The effect of temperature on protein refolding at high pressure: Enhanced green fluorescent protein as a
model. Proc Biochem 49, 54-60.
7. Rodrigues, D., Farinha-Arcieri, L. E., Ventura, A. M., Chura-Chambi, R. M., Malavasi, N. V., Lemke, L. S.,
Guimaraes, J. S., Ho, P. L. and Morganti, L. (2014) Effect of pressure on refolding of recombinant pentameric
cholera toxin B. J Biotechnol 173, 98-105.
8. Lopes, A. P., Lopes, L. M., Fraga, T. R., Chura-Chambi, R. M., Sanson, A. L., Cheng, E., Nakajima, E.,
Morganti, L. and Martins, E. A. (2014) VapC from the leptospiral VapBC toxin-antitoxin module displays
ribonuclease activity on the initiator tRNA. PLoS One 9, e101678.
9. Lemke, L. S., Chura-Chambi, R. M., Rodrigues, D., Cussiol, J. R., Malavasi, N. V., Alegria, T. G., Netto, L.
E. and Morganti, L. (2015) Investigation on solubilization protocols in the refolding of the thioredoxin TsnC
from Xylella fastidiosa by high hydrostatic pressure approach. Prot Expr Purif 106, 72-77.
Colaboradores:
Dra. Rosa Maria Chura-Chambi
Dra. Natalia M. Vallejo
Msc. Daniella Rodrigues
Msc. Laura S. Lemke
Msc. Keli N. Balduino
Cleide Mara Rosa da Silva
Natan Versatti da Silva