BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
Proteomas e Espectrometria de Massa
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Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
Componentes
H2 O
Proteínas
Ac. Nucléico
Carbohidratos
Lipídeos
Outros
Nº de moléculas diferentes
1
3.000
1 - DNA e 1000-RNA
50
40
Íons - 12
Mol. Monoméricas - 500
% peso total
70
15
7
3
2
3
A tabela mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes
em um célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o
grupo mais diverso de moléculas.
Antes das técnicas de proteômica, para se obter informações sobre uma proteína em
particular, era necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma
fonte biológica.
Atualmente, é possível analisar-se um grande conjunto de proteínas ao mesmo
tempo, e obter informações de uma proteína em particular sem separá-la das demais,
graças às técnicas de espectrometria de massa acoplada com eletroforese 2D e/ou
cromatografia líquida.
Atualmente, a capacidade de processamento de grandes volumes de
informações e técnicas analíticas de alta resolução, entre as quais se
destaca a espectometria de massas, permitem o estudo de células e
organismos inteiros – são os “OMAS.
Homo sapiens
• GENOMA – DNA – 3,4 bilhões de nt
• TRANSCRIPTOMA – mRNA – 30 mil genes
• PROTEOMA – Proteínas – 0,3-1,2 milhão proteínas
• INTERACTOMA – interações entre proteínas
• SIGNALOSOMA – interações entre proteínas
de uma via de sinalização
• METABOLOMA - metabólitos
Estratégias experimentais
• Do geral para o particular
– Analisar diversos proteomas em
condições diferentes e identificar
as diferenças
• Do particular para o geral
– Analisar uma única proteína e
inferir suas funções no contexto
do todo
Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional
Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Determinação de massas para identificação
Peptide mass fingerprint
Sequenciamento de novo
Proteínas com a
mesma massa
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL:
• análise simultânea de até 5.000 proteínas
• permite comparação de todas as proteínas
expressas por uma célula em dois momentos
diferentes:
• análise do efeito de hormônios,
• análise do efeito de drogas;
• estados fisiológicos (desenvolvimento);
• condições patológicas diversas (vírus,
bactérias,etc.)
Proteínas com mesmo pI
Eletroforese 2D de proteínas
totais (proteoma) de células de
Escherichia coli
Proteoma Comparativo ou Diferencial
condição
condição
Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas
Sobreposição para análise das proteínas
diferentemente expressas
Proteínas de cada condição são marcadas com tags fluorescentes
diferentes para facilitar a visualização das diferenças
Interatoma de C. elegans
- proteínas individuais, representadas por círculos, agrupam-se
(indicado por linhas) conforme suas interações, formando uma rede que
permite entender detalhes do controle das funções vitais do organismo.
Identificação de Proteínas por MS: 10 passos
(1)
(2)
Banda removida
do gel
(3)
Obter espectro
de massas dos
fragmentos
Fragmentar
com tripsina
(8)
Banco de espectros
(4)
(9)
comparação
Identificação
(10)
Espectro de massas
Espectro de massas
dos fragmentos
virtuais
Tripsinização
virtual
(7)
(6)
Banco de
seqüências
(i.e. SwissProt)
(5)
Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos:
proteínas são identificadas com base no tamanho dos
peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina,
comparando-se o espectro de massa real com o teórico,
obtido a partir dos bancos de dados de proteínas.
Massa/carga
Mass Tolerance (Da)
# Hits in Database
1529
1
478
1529.7
1529.73
1529.734
1529.7348
0.1
0.01
0.001
0.0001
164
25
4
2
Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na
identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos.
Impressão digital de peptídeos: efeito de peptídeos múltiplos
Massa/carga m/z
1529.73
Mass Tolerance
0.1
# Hits Database
204
1529.73
0.1
2 peptídeos
1252.70
7
1529.73
0.1
1252.70 3 peptídeos
1833.88
1
A identificação de mais de um peptídeo triptíco de uma mesma proteína
aumenta a confiabilidade da identificação dessa proteína por
espectrometria de massa.
Espectrometria de Massas
Thomson, 1897 – fez descoberta do elétron e inventou a espectrometria de
massa, com a primeira medida da razão massa/carga de uma partícula.
Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os inventores de métodos de
ionização branda em espectrometria de massa, que permitiu análise de
macromoléculas como proteínas
John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI)
Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption (SLD).
Espectrômetros de massas usam diferenças na razão massa-carga (m/z) de átomos ou
moléculas ionizadas para separá-los, e/ou para determinar a composição e a estrutura
química. Moléculas fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a análise MS dos
fragmentos permite sua caracterização estrutural.
O poder de separação de íons de um MS é descrito por sua resolução, que é definida
como:
R = m /D m
sendo m, a massa do íon
Dm, a diferença de massa entre dois picos no
espectro de massa
Ex: um MS com resolução de 1000 consegue separar íons com m/z de 100.0 e 100.1
A massa de uma molécula pode
ser determinada a partir dos m/z
de quaisquer dois picos vizinhos,
que diferem por 1 carga (+) ou 1
próton:
(m/z)1 = M + n2x
n2
M é a massa da molécula
n2 é o número de cargas
X é a diferença entre dois picos
(m/z)2 = M + (n2x +1)X
n2 + 1
O espectro de massas de uma molécula
consiste de uma família de picos, correspondendo
a espécies carregadas que diferem de 1 unidade
de massa e carga.
A “deconvolução” desses picos, gerando o
gráfico acima, dá a massa de uma molécula com
precisão de 0,01%
Temos duas equações e dois
desconhecidos, M e n2, que podem
ser calculados resolvendo-se esse
sistema de equação:
n2 =
(m/z)2 – X
(m/z)2 – (m/z)1
M = n2 [(m/z)2 – X]
Analisadores de massa
MS de setor magnético:
Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron de
uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o íon
molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores.
Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são
acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo
com as massas dos íons.
Analisadores de massa
Quadrupolo
- consiste de quatro eletrodos (tubos metálicos), dois positivos e dois negtivos. A
voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através aos eletrodos. Para
uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma dada razão
massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para
fora do quadrupolo. Obtem-se um espectro de massas variando-se gradualmente a
corrente e voltagem para detectar-se todos os íons presentes.
MS quadrupolo de transmissão:
consiste de um ionizador, lentes para
acelerar e focalizar os íons para a
entrada no quadrupolo, o quadrupolo
com controles de V e A, um detector
de íons. Todo o sistema necesssita
de alto vácuo.
Resolução: separa íons com
diferenças de 0.3 m/z
Analisadores de massa
A energia cinética de um íon é
0.5mv2, assim ions mais leves
têm velocidade maior que os
pesados e atingem o detector
em menos tempo.
A equação que governa a separação de íons por TOF é:
MS-TOF
m/z
E
s
d
t
razão massa/carga do íon
potencial do pulso de extração
comprimento do setor em que E é aplicado
comprimento do tubo de vôo
tempo de vôo do íon
MS tempo de vôo: íons são acelerados a partir do ionizador até um tubo de vôo, sem campo
elétrico ou magnético, onde se movem na direção do detector com uma velocidade proporcional a
m/z. Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z. O TOF-MS é afetado
pela energia inicial dos íons antes de serem acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto de
campos elétricos, o reflectron, que refocalizam os íons de mesma m/z com velocidades diferentes.
É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até 100 espectros
por segundo. Originalmente desenvolvido na década 1950, foi obscurecido pelos MS quadrupolos
até o desenvolvimento do MALDI nos anos 1980.
Espectrômetro de massa por tempo de vôo
Analisadores de massa
MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional
Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps” e um anel. Pode ser
bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos. A face interna de cada eletrodo
tem uma superfície hiperbólica. Uma corrente e voltagem são aplicadas ao eletrodo em forma de
anel, enquanto os “end caps” ficam aterrados.
De maneira análogo ao MS quadrupolo linear, variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões
na direção do campo, com os íons sendo alternadamente acelerados e desacelerados na direção
axial e vice versa na direção radial, aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os íons assumem
trajetórias instáveis e saem do trap, numa ordem de m/z crescente. Ainda que a resolução do
MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração do íon de interesse
antes da análise.
Técnicas de Ionização
Ionização por impacto de eléctrons (EI)
As moléculas são vaporizadas e bombardeadas
com elétrons de alta energia (70 eV), formando
de íons moleculares (+) quando esses elétrons
colidem com a molecula e deslocam eléctrons
mais externas. Alguns desses íons são instáveis
e de fragmentam em íons menores. Adequada
para compostos não termolábeis.
Dessorpção por Laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption)
(MALDI):
Técnica desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para ionização de
peptídeos e proteínas, oligossacarídeos, glicolipídeos, nucleotídeos, etc.
As amostras são co-cristalizadas com uma matriz (substância que absorve luz
ultravioleta). Para proteínas, utiliza-se o ácido sinapínico, que absorve a radiação
de 337 nm do laser de nitrogênio. A energia absorvida pela matriz é transferida para
as moléculas, evitando sua decomposição por calor. Após a incidência do pulso de
laser, uma grande quantidade de energia é absorvida pela matriz e há uma
"explosão" com emissão de um gás com íons moleculares com uma carga.
Técnicas de Ionização
Mass Spectrometry
Matrix-assisted laser desorption ionizaton – time of flight
Maldi-Tof
Técnicas de Ionização
Ionização por electronspray (ESI)
Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas.
O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas
(nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas
altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de
simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o
campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos
(protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados.
Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas
é preciso obter o espectro
MS/MS de seus peptídeos.
hélio ou argônio
Isso significa 2 etapas de
MS acopladas.
Depois de fazer o MS da
molécula inteira, esta é
fragmentada dentro do
aparelho por colisão com
gases.
Os fragmentos são então
separados e analisados por
MS.
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y
mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical
R de cada aminoácido.
Sequenciamento de novo de proteínas
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de
fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que
correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.
Sequenciamento de novo de proteínas
A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela
determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do
exemplo, os íons y.
Espectro MS/MS do peptídeo
tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
AA Codes
Mono.
AA Codes
Mono.
Gly
G
57.021464
Asp
D
115.02694
Ala
A
71.037114
Gln
Q
128.05858
Ser
S
87.032029
Lys
K
128.09496
Pro
P
97.052764
Glu
E
129.04259
Val
V
99.068414
Met
M
131.04048
Thr
T
101.04768
His
H
137.05891
Cys
C
103.00919
Phe
F
147.06841
Leu
L
113.08406
Arg
R
156.10111
Ile
I
113.08406
CMC
Asn
N
114.04293
Tyr
Y
163.06333
-
-
-
Trp
W
186.07931
161.01467
Analiza-se o espectro
buscando diferenças de
m/z equivalentes a um
resíduo de aminoácido,
que permitem conhecer
a seqüência do
peptídeos
perda de H2O = 18 u.m.
perda de CO2= 28 u.m.
Sequenciamento de novo
Íons y
perda de amônia = 17 u.m.
Íons b e a
Espectro MS/MS do peptídeo
GLSDGEWQQVLNVWGK.
http://prospector.ucsf.edu/
http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html
http://www.ionsource.com/