pDCs play off scratch
Gustavo Garcia
Luiz Gustavo Gardinassi
Thais Herrero
Modelo de desenvolvimento das células dendríticas
Função das células dendríticas
Subpopulações de Células Dendríticas
CD45+
LC- células de Langerhans
IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas.
PDC- células dendríticas plasmocitóides
CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3
J. Exp. Med- September 17, 2001
RT-PCR
Importância da produção dos IFNs do tipo 1
Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)
•pDC são população de células circulantes
• Ausentes na pele normal, porém migram
para pele inflamada
•Expressam TLR7 e TLR9
•Produz grande quantidade de interferons tipo 1
LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina
Controle da
infecção/lesão
Autoimunidade
Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides (pDCs)
durante a lesão da pele e no processo de cicatrização
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação
das pDCs?
Derme
Quantificação das
células dérmicas
Digestão com 1mg/ml
de colagenase por 2h
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação
das pDCs?
Assim, lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de pDCs paralela
à infiltração por neutrófilos no local da lesão.
Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para
produzir IFNs do tipo I?
Pele total (0, 6,
24, 48 e 72h)
Análise da expressão
gênica por Real-time
PCR
As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas
inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as
pDCs.
Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para
produzir IFNs do tipo I?
2 Acs (PDCA1
e mAb 927) ou
IgG como
24hs
controle antes
da lesão
48hs
Acs (antiLy6C) ou IgG
24hs como controle
antes da lesão
48hs
24h
Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de
pDCs.
Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção
de INF-α/β?
MyD88
-/-
Pele total (24h)
Lesão
IRS 954 (0, 1,
10 ou 100μg)
Lesão
Pele total (24h)
Análise da
expressão gênica
por Real-time
PCR
Análise da
expressão gênica
por real-time
PCR
As catelicidinas são induzidas neste modelo de
injúria de pele?
Pele total (0, 6,
24, 48 e 72h)
Análise da expressão
de catelecidina
(CRAMP) por Realtime PCR
• DNA
pDCs do baço
Overnight
• CRAMP
• CRAMP+DNA
ELISA
• scCRAMP+DNA
• scCRAMP
Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos
nucléicos próprios.
As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da
tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo?
CRAMP
scCRAMP
Salina
Pele total (0, 24
e 48h)
• FACs
• Real-time PCR
Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de
pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.
As catelicidinas são necessárias para a ativação
das pDCs na pele danificada?
CRAMP -/Com ou sem lesão
Pele total (24h)
Análise da
expressão gênica
por Real-time PCR
Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da
tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs
na pele danificada.
As pDCs induzem uma resposta inflamatória
na pele danificada?
2 Acs (PDCA1
e mAb 927) ou
IgG como
controle antes
da lesão
Com ou sem lesão
Pele total (24h)
Citocinas
inflamatórias por
Real-time PCR
Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel
importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em
particular a indução de IL-6 e citocinas Th17
As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele
danificada?
Pele com lesão
Análise da expressão
de Keratina 6 (K6)
Imunofluorescência
Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada
desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida
reepitelização da lesão.
Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo?
IFNAR -/Pele com lesão
Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das
citocinas inflamatórias por Real-time PCR
Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta
inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada
por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.
E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma
capacidade?
7 voluntários
• Fita adesiva
Biópsias antes e 24h
depois da lesão
Imunoistoquímica para
BDCA2 (marcador
específico de pDCs
humana) e Real-time
PCR
Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e
produziram IFN-α na pele danificada.
E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma
capacidade?
7 voluntários
• Lauril sulfato
de sódio (SLS)
Biópsias antes e 24h
depois da lesão
Imunoistoquímica para
BDCA2 (marcador
específico de pDCs
humana)
Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu
uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA
de IFN-α na pele danificada.
Conclusão
Controle da infecção/reparo tecidual
Objetivo:
Investigar o papel das pDCs na inflamção da pele
de indivíduos suscetíveis a doença autoimune
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação
das pDCs e Neutrófilos?
Linhagem 129
Tape stripping
24h
Citometria de fluxo
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação
das pDCs e Neutrófilos?
Linhagem 129
Tape stripping
24h
Imunomarcação
Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde
pDCs produzem IFN- e neutrófilos produzem NETs.
Os IFN tipo I atuam na indução de genes próinflamatórios na pele lesionada?
INFAR-/- ou WT
Naive/Tape
stripping
24h
Real Time PCR
A indução de genes pró-inflamatórios na pele
lesionada envolve a sinalização via TLR?
MyD88-/- ou WT
Naive/Tape
stripping
24h
Real Time PCR
O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios
demonstra um importante papel da sinalização via TLR.
Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de
genes pró-inflamatórios na pele lesionada?
IRS 954
Naive/Tape
stripping
24h
Real Time PCR
Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças
na expressão de genes pró-inflamatórios na pele danificada.
pDC e Neutrófilos são necessários para a indução
de genes pró-inflamatórios na pele lesionada?
Anti-120G8
Anti-GR1-Ly-6G
WT
Naive/Tape
stripping
24h
Real Time PCR
pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes próinflamatórios, porém promovem respostas inflamatórias diferentes.
Quais as características da resposta inflamatória
de (NZBXNZW)F1 na pele lesionada?
(NZBxNZW)F1
C57/BL6
129
1, 4, 20d Real Time PCR
Tape
Quant. Lesão aberta
stripping
Histologia
Quais as características da resposta inflamatória
de (NZBXNZW)F1 na pele lesionada?
Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvem lesões crônicas na
pele, semelhantes a lesões observadas em CLE de humanos.
pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são
requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas?
(NZBxNZW)F1
Anti-120G8 ou
IRS 954
Tape
stripping
15-23d
Quant. Lesão
aberta
pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são
requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas?
(NZBxNZW)F1
Tape
stripping
4d
IRS 954
15-23d
Quant. Lesão aberta
Histologia
As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a
depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto
durante a inflamação, resultam em uma melhora da cicatrização.
Conclusão
Controle da
infecção/reparo
tecidual
?
Autoimunidade
Exacerbação da lesão
Doença