Anais do V Simpósio
do Programa de
Pós-Graduação em
Biologia Molecular
02 a 04 de Dezembro de 2015
Instituto de Ciências Biológicas
Sumário
1
Apresentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1
O Simpósio
4
1.2
V Simpósio
5
1.2.1
Programação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3
Comissão Organizadora
9
1.4
Comissão Avaliadora
9
1.5
Apoio/Patrocínio
10
1.6
Palavra da Comissão Organizadora
11
2
Palestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1
O Código Glicômico e a busca do santo graal da bioenergia
2.2
Produção de Biocombustíveis e Bioprodutos a partir de CO2 utilizando
microrganismos fotossintéticos
13
2.3
Interações Químicas e Microbiológicas nas Interfaces - Aspectos Ambientais
13
2.4
Avaliação de Diversidade Genética e Modelagem de Interações Ecológicas
14
2.5
Mass Spectrometry Based Proteomics: Background, status and future
needs
15
2.6
Nanotecnologia Sustentável
15
2.7
Células-tronco e suas aplicações em medicina
16
2.8
Atividade analgésica do exercício físico e da acupuntura: efeitos neurobiológicos e estudo dos mecanismos de ação
16
12
3
2.9
A neurobiological approach to cancer: neurotrophins as novel biomarkers and therapeutic targets in oncology
17
2.10
O Estado da Blogosfera Científica Brasileira
17
2.11
Escrita Científica
18
3
Resumos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.1
Apresentação oral
20
3.2
Resumos premiados
25
3.3
Resumos
35
4
Conheça o Instituto de Biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
O Simpósio
V Simpósio
Programação
Comissão Organizadora
Comissão Avaliadora
Apoio/Patrocínio
Palavra da Comissão Organizadora
1. Apresentação
1.1
O Simpósio
O Simpósio Anual de Biologia Molecular é um evento idealizado e executado pelo corpo
discente em conjunto com os docentes do programa de pós-graduação. O objetivo principal dessa
atividade de extensão está voltado ao debate científico, envolvendo a comunidade acadêmica
da Universidade de Brasília e região. Esse caráter comunitário é aproveitado pelos alunos de
graduação e pós-graduação de diversos departamentos da UnB e outros universidades, que
participam da programação aberta. A inscrição de painéis é obrigatória para os alunos do
Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular e facultada para alunos de outros programas
e da graduação. O evento conta com palestras de professores e pesquisadores convidados
nacionais e internacionais, promovendo o intercâmbio entre alunos e docentes e estimulando
novas ações de pesquisa no âmbito do Programa.
Acreditamos que seja uma ótima oportunidade para aproximar e apreciar as diversas pesquisas
acadêmicas desenvolvidas na Universidade de Brasília e região.
O programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular (PPG BioMol) teve inicio em 1973,
1.2 V Simpósio
5
com a criação do curso de mestrado em Biologia Molecular, composto por orientadores do
Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, um grupo recém chegado à
então jovem Universidade, que trazia uma abordagem científica voltada às bases Moleculares e
Celulares dos processos biológicos.
Com o crescimento do corpo docente e a criação do curso de Doutorado em 1992, novas áreas
foram adicionadas, destacando-se Genética Molecular de Plantas e Controle Biológico. As
principais áreas de pesquisa do programa de Pós-Graduação hoje incluem: Biologia Molecular, Bioquímica, Microbiologia Molecular, Estrutura de Proteínas, Modelagem e Simulação
de Biomoléculas, Biologia Estrutural, Virologia Molecular, Genômica, Proteômica e Bioinformática.
1.2
V Simpósio
Em 2015, cada um dos três dias do V Simpósio do Programa de Pós-Graduação em Biologia
Molecular teve suas atividades norteadas por um tema. Os temas foram:
• Biologia Molecular Por Um Mundo Sustentável
• Biologia Molecular e o Desafio da Saúde Humana
• Divulgação Científica
O público total do V Simpósio foi de 267 inscritos, cuja origem é mostrada no gráfico abaixo:
Fig. 1.1: Distribuição da origem dos participantes do V Simpósio da Pós-Graduação em Biologia
Molecular da UnB.
Entre os 267 inscritos, 176 deles também inscreveram-se para os minicursos ofertados:
•
•
•
•
qPCR
Next Generation Sequencing
Testes Estatísticos para validação experimental
Introdução ao Latex
6
1.2.1
Programação
Capítulo 1. Apresentação
1.2 V Simpósio
7
8
Capítulo 1. Apresentação
1.3 Comissão Organizadora
1.3
Comissão Organizadora
Robert Neil Gerard Miller (Presidente)
Amanda Araújo
Antonielle Monclaro
Azadeh Mehdad
Clemente Batista Soares Neto
Gabriel Sérgio Costa Alves
Lorena da Silveira Derengowski
Luis Janssen Maia
Luiza Cesca Piva
Raquel Almeida
Simone Nardin Weis
Taisa Godoy
Waldeyr Mendes Cordeiro da Silva
– Social media - Michelle Guitton Cotta
1.4
Comissão Avaliadora
Aline Martins
Andréia Carvalho
Anelise Franco Orílio
Azadeh Mehdad
Cláudio Afonso Pinho Lopes
Eduardo Mendonça
Fernando Melo
Gabriel Sérgio Costa Alves
Juliana Franco
Maryane Andressa Bezerra
Simone Nardin Weis
Victoria Monge
Viviane Reis
9
10
1.5
Apoio/Patrocínio
Capítulo 1. Apresentação
1.6 Palavra da Comissão Organizadora
1.6
11
Palavra da Comissão Organizadora
A Comissão Organizadora trabalhou com afinco e dedicação para entregar um Simpósio à altura
da importância do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular para a ciência e para a
sociedade. Uma característica que destacou-se nesta Comissão, foi o verdadeiro trabalho em
equipe, que além de explorar as múltiplas habilidades e competências individuais, proporcionou
crescimento pessoal e um acréscimo nos relacionamentos interpessoais.
Sob a orientação do Prof. Robert Miller, trabalhamos com muito zêlo pelo sucesso do evento.
Foram três dias de intensas atividades norteadas por palestras, apresentações e minicursos muito
enriquecedores.
Agradecemos à todos que se envolveram: palestrantes, professores, avaliadores, participantes,
servidores da secretaria e demais setores e a todos que de alguma maneira contribuiram para o
sucesso do V Simpósio do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular.
O Código Glicômico e a busca do santo
graal da bioenergia
Produção de Biocombustíveis e Bioprodutos a partir de CO2 utilizando microrganismos fotossintéticos
Interações Químicas e Microbiológicas
nas Interfaces - Aspectos Ambientais
Avaliação de Diversidade Genética e
Modelagem de Interações Ecológicas
Mass Spectrometry Based Proteomics:
Background, status and future needs
Nanotecnologia Sustentável
Células-tronco e suas aplicações em
medicina
Atividade analgésica do exercício físico e
da acupuntura: efeitos neurobiológicos e
estudo dos mecanismos de ação
A neurobiological approach to cancer:
neurotrophins as novel biomarkers and
therapeutic targets in oncology
O Estado da Blogosfera Científica Brasileira
Escrita Científica
2. Palestras
2.1
O Código Glicômico e a busca do santo graal da bioenergia
Prof. Dr. Marcos Silveira Buckeridge (USP)
Quando, por volta de 2005, o mundo voltou a sua atenção às possiblidades de produção
de energia a partir de biomassa, o Brasil passou a ser usado como exemplo de sucesso. Isto
porque o potencial de produção de álcool de cana no Brasil era, e é, o maior do planeta. Mas
os processos desenvolvidos no Brasil são eficientes somente para extrair 1/3 da energia da
biomassa. Isto porque a maior parte da energia (os outros 2/3) está nas ligações entre os átomos
de carbono dos polímeros que as plantas guardam em suas paredes celulares. Com um forte foco
mundial em bioenergia no início do século XXI, uma parte significativa da comunidade científica
brasileira passou a se interessar pelo assunto. Surgiram projetos de âmbito nacional, como o
INCT do Bioetanol, e vários similares internacionais em diversos países. Com isto, centenas de
cientistas passaram a abordar o problema que pode ser considerado o santo graal da bioenergia:
a desmontagem precisa e completa da parede celular. Este problema formidável começou a
ser abordado prioritariamente através da busca de coquetéis de enzimas que fossem capazes
2.2 Produção de Biocombustíveis e Bioprodutos a partir de CO2 utilizando
microrganismos fotossintéticos
13
de digerir paredes celulares. A maioria dos pesquisadores acreditava que os microorganismos
seriam a chave do problema, afinal vemos a matéria orgânica ser degradada por eles todo o tempo.
Achava-se que somente com enzimas, o problema seria facilmente resolvido, pois degradaríamos
as paredes de gramíneas e produziríamos açúcares livres para fermentação por leveduras e a
produção de bioetanol. Então os problemas apareceram. Durante quase 10 anos, pesquisadores do
Brasil e do mundo descobriram e caracterizaram um sem-número de enzimas de fungos, bactérias,
animais e plantas, mas em nenhum caso a degradação precisa de qualquer parede celular foi
obtida com a eficiência necessária para ser incorporada pela indústria. Faltava ainda uma parte
importante do problema: conhecer a estrutura exata da parede celular. A importância deste lado
do problema foi minimizada porque a maioria dos pesquisadores acreditava que a parede celular
vegetal era composta somente de celulose e lignina. Mas a realidade é bem diferente. As paredes
são complexos arranjos de polímeros diferentes, cuja estrutura e interações são pouco conhecidos.
Nesta apresentação mostrarei como desvendamos estrutura fina de polímeros e a arquitetura da
parede de duas gramíneas bioenergéticas (cana e miscanto). Estes estudos nos levaram à teoria
de que paredes celulares abrigam o código glicômico (análogo ao código genético). Este código
permite saber quais enzimas devem ser usadas e quando têm que entrar em ação para que uma
desmontagem eficiente e precisa das paredes seja feita. A descoberta do código glicômico trouxe
novos desafios aos cientistas. Um deles é o de encontrar formas de alterar o código, nas próprias
plantas, usando engenharia biológica, de forma a produzir variedades geneticamente modificadas
que sejam atacadas mais facilmente. Outro desafio é o de como usar as enzimas para acessar o
código glicômico. Com o avanço nas descobertas de enzimas e o conhecimento sobre o código
glicômico da cana, o próximo desafio é testar estratégias mais sofisticadas, que usem consórcios
de enzimas que atuem precisamente em domínios específicos da parede celular.
2.2
Produção de Biocombustíveis e Bioprodutos a partir de CO2 utilizando
microrganismos fotossintéticos
Prof. Dr. Bruno Brasil (Embrapa-DF)
Microalgas são microrganismos fotossintetizantes tradicionalmente cultivados para produção
de suplementos para alimentação humana e animal, assim como intermediários para indústria
farmacêutica e cosmética. Não obstante, há um considerável e crescente interesse na utilização de
microalgas como fonte para biocombustíveis, uma vez que estes microrganismos estão entre os
sistemas biológicos mais produtivos para a geração de biomassa e captura de carbono. Além disso,
a biomassa de certas espécies é rica em substâncias de reserva, como lipídeos e/ou carboidratos, os
quais são passíveis de conversão em biocombustíveis como biodiesel, bioquerosene de aviação ou
etanol. Recentemente, avanços na área de biologia sintética e engenharia metabólica permitiram
a construção de microrganismos fotossintetizantes geneticamente modificados capazes de realizar
a síntese direta de biocombustíveis e moléculas de alta densidade energética a partir de luz e
CO2. Estudos reportam a construção de cianobactérias e microalgas capazes de funcionar como
biofábricas fotossintéticas vivas de moléculas como etanol, butanol, terpenóides e H2. Esta
abordagem desponta como uma estratégia promissora para a produção de energia e químicos
renováveis no século XXI e será discutida ao longo desta apresentação.
2.3
Interações Químicas e Microbiológicas nas Interfaces - Aspectos Ambientais
Profa. Dra. Mônica Cristina Teixeira (UFOP)
14
Capítulo 2. Palestras
A contaminação ambiental por metais tem sido objeto de diversas discussões e iniciativas.
As águas residuais das indústrias de mineração e metalurgia são consideradas como as principais
fontes de contaminação ambiental por metais e metaloides como o arsênio. Níveis de arsênio
relativamente altos são encontrados ocasionalmente em fontes de água de abastecimento municipais superficiais e subterrâneas, possivelmente devido à lixiviação de compostos associados aos
depósitos minerais. Em vista disso, torna-se necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes e economicamente viáveis para a remoção desse elemento. Garantir a qualidade da água
de consumo, no que diz respeito aos teores de arsênio e demais elementos tóxicos é, portanto,
condição necessária à manutenção da saúde das populações. Neste contexto, os métodos biológicos surgem como uma alternativa aos métodos convencionais de tratamento fundamentados,
sobretudo, em precipitação química. Tratamentos biológicos que utilizam bactérias redutoras de
sulfato (BRS) vêm se destacando por serem alternativas eficazes e relativamente baratas para a
remoção de sulfato e concomitante precipitação de metais. As BRS oxidam compostos orgânicos
simples (CH2O) produzindo sulfeto de hidrogênio e íons bicarbonato. Além da remoção de
sulfato, as BRS podem ser empregadas no tratamento de águas e efluentes contaminados com
metais, por meio da precipitação com o H2S gerado durante o processo de respiração anaeróbia.
Além desses organismos, bactérias e plantas bioacumuladoras de metais presentes em solos e
vários outros micro-organismos presentes nos ambientes aquáticos tem sido muito estudados
visando avaliar sua contribuição para a biorremediação de ambientes impactados. O estudo
destas comunidades, sobretudo a compreensão das inter-relações entre as diferentes espécies, à
luz da biologia molecular, é de extrema importância.
2.4
Avaliação de Diversidade Genética e Modelagem de Interações Ecológicas
Prof. Dr. Evandro Marsola de Moraes (UFSCar)
Um componente importante dos hábitats de vegetação aberta ou seca na América do Sul são
as espécies da família Cactaceae. As espécies dessa família mostram uma distribuição naturalmente fragmentada no bioma Cerrado, ocorrendo em manchas de solos arenosos ou afloramentos
rochosos em áreas montanhosas. Há uma grande variação morfológica regional entre essas populações, causando muitas incertezas taxonômicas. O mesmo padrão de distribuição e taxonomia
confusa são observadas em vários outros grupos vegetais e animais com a mesma distribuição.
Esses enclaves de vegetação xerófita (geralmente denominadas de campos rupestres) têm sido
interpretados como remanescentes de uma distribuição mais ampla no passado, a qual teria
sofrido fragmentação seguindo as mudanças paleoclimáticas. Nessa palestra serão apresentados
e discutidos os resultados sobre a história filogeográfica e análises coalescentes de delimitação
de espécies de um complexo de cactáceas do gênero Pilosocereus. O estudo envolveu a análise
de diferentes marcadores moleculares clássicos e também de dados de sequenciamento de nova
geração, além da modelagem da peleodistribuição dessas espécies. Os resultados mostraram
uma acentuada estrutura filogeográfica neste complexo, com a existência de linhagens evolutivas
que não são reconhecidas pelo arranjo taxonômico atual. O padrão filogeográfico é compatível
com a ocorrência de eventos históricos de fragmentação e posterior contato secundário entre
linhagens diferenciadas. Em conjunto, esses resultados apoiam a hipótese que os enclaves de
vegetação xerófita no Cerrado são microrefúgios interglaciais cuja dinâmica histórica promove a
diversificação de linhagens e especiação.
2.5 Mass Spectrometry Based Proteomics: Background, status and future needs
15
2.5
Mass Spectrometry Based Proteomics: Background, status and future
needs
Prof. Dr. Peter Roepstorff (Visitante UnB/U. Southern Denmark)
Mass spectrometric protein analysis has revolutionized the concepts for protein analysis
and resulted in the development of proteomics, the protein equivalent of genomics. Two main
strategise are used in proteomics, one based on 2D electrophoresis and the other on liquid
chromatography coupled to mass spectrometry. Over the past 2 decades proteomics has expanded
from being available in only few laboratories to be standard in most contemporary laboratories
involved in studies of proteins. The different strategies for use of mass spectrometry based
proteomics for studies of protein expression, studies of protein post trenslational modifications
will be described and discussed.
2.6
Nanotecnologia Sustentável
Dr. Luciano Paulino da Silva (Embrapa, DF)
A nanotecnologia é uma área do conhecimento que integra várias ciências como as engenharias, física, química e biologia. Os sistemas nanoestruturados, devido às suas dimensões em
nanoescala, apresentam propriedades novas ou aprimoradas baseadas nas suas características especificas (tamanho, distribuição, morfologia, composição, propriedades mecânicas, entre outras)
quando comparadas a estruturas de dimensões maiores provenientes do mesmo material. Diversas rotas químicas e físicas são utilizadas para a síntese de nanossistemas. No entanto, a maioria
destes métodos inclui a utilização de solventes tóxicos, geração de resíduos nocivos para saúde e
meio ambiente, ou resultam em um consumo de energia alto em rotas geralmente complexas e
com múltiplos passos. Nesse sentido, é necessário o desenvolvimento de procedimentos visando
à obtenção de nanossistemas com ampla aplicabilidade biotecnológica e superando diversos
desafios. Uma abordagem promissora para alcançar esse objetivo é explorar a vasta gama de
recursos biológicos disponíveis na natureza por meio da chamada nanotecnologia verde que
consiste nas estratégias nanotecnológicas que utilizam produtos químicos relativamente atóxicos,
biodegradáveis e de custo baixo para sintetizar nanomateriais, tendo como fonte primária ou
iniciador da rota de síntese um organismo biológico ou partes dele (órgãos, tecidos, células,
biomoléculas ou metabólitos). Dentre os recursos biológicos disponíveis, produtos vegetais
e animais, algas, fungos, bactérias e a ampla gama de subprodutos derivados de processos
agropecuários envolvendo alguns destes organismos possuem potencial elevado. Este conceito
oferece oportunidades quanto à utilização de biomoléculas ou metabólitos em rotas de síntese
biológica de nanossistemas devido ao fato que esses materiais, quando nanoestruturados, apresentam características novas que possibilitam uma vasta gama de aplicações inovadoras, além
de conferir, em geral, características almejáveis de biodegradabilidade e a biocompatibilidade.
Essa apresentação visa a escrutinizar os avanços e perspectivas realizados pelos membros do
Laboratório de Nanobiotecnologia da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e seus parceiros públicos e privados, na área de nanotecnologia verde. Esses avanços serão demonstrados
por meio de exemplos da aplicação de estratégias para síntese verde de nanossistemas utilizando
moléculas e organismos da Biodiversidade, muitos dos quais sendo constituintes das cadeias
produtivas microbiana, vegetal ou animal, incluindo: i) caracterização química, física e biológica;
ii) desenvolvimento de biossensores; iii) desenvolvimento de estratégias de imobilização de
enzimas e nanocatalisadores; iv) desenvolvimento de membranas seletivas e nanofiltros para
biorremediação; v) desenvolvimento de estratégias visando ao encapsulamento e liberação
16
Capítulo 2. Palestras
sustentada de moléculas; vi) criação de superfícies funcionais contendo moléculas bioativas.
A avaliação das propriedades dos materiais nas diversas atividades desenvolvidas com uma
abordagem de nanotecnologia verde têm fornecido os subsídios necessários ao desenvolvimento
de novos produtos e processos. Tais estudos têm permitido ainda a formação e capacitação
de recursos humanos de excelência em todos os níveis de formação acadêmica nas áreas de
fronteira propostas. Os resultados apresentados estão divulgados por meio de artigos científicos
e livros/capítulos de livros técnico-científicos publicados ou protegidos por meio de patentes
depositadas no Brasil e exterior.
2.7
Células-tronco e suas aplicações em medicina
Prof. Dr. Antonio Carlos Campos de Carvalho (UFRJ)
Abordaremos as principais características das células tronco, suas aplicações na modelagem
de doenças, na seleção de novas drogas e na medicina regenerativa. Faremos um breve resumo
dos estudos clínicos realizados no Brasil com terapias celulares. Apresentaremos os conceitos
da reprogramação celular e descreveremos o papel da Rede Nacional de Terapia Celular e dos
Centros de Tecnologia celular.
2.8
Atividade analgésica do exercício físico e da acupuntura: efeitos neurobiológicos e estudo dos mecanismos de ação
Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos (UFSC)
A dor é atualmente um grande problema de saúde global e os indivíduos podem experimentar
dor aguda, dor crônica ou intermitente, ou uma combinação dos três. Estima-se que 1 em cada 5
adultos sofrem de algum tipo de dor e por ano 1 em cada 10 são diagnosticados com dor crônica.
A média da população brasileira que se queixa ou sofre de dor, é de cerca de 30%. Dados
do Instituto Nacional do Seguro Social (INSS) apontam que 20% dos benefícios concedidos
por afastamento do trabalho foram destinados a pacientes com dores crônicas, tornando-a
um problema de saúde pública, com um impacto socioeconômico importante. A palavra dor
é multidimensional, porém, relaciona-se a sofrimento e sequelas graves, mas não limitado
à depressão, incapacidade para o trabalho, perturbações nas relações sociais e pensamentos
suicidas do paciente, não podendo ser subestimada. Contudo, os fármacos utilizados como
analgésicos (ex. opióides, anti-inflamatórios não esteroides) disponíveis não são ideais para
todos os pacientes ou tipos de dor. Evidências a partir de modelos animais e estudos em humanos
sugerem que os mesmos mecanismos podem estar envolvidos em diferentes condições de dor e
que uma única condição de dor pode ter vários mecanismos. Dentre os mediadores endógenos
que ativam os neurônios aferentes primários e transmitem o sinal nociceptivo para o sistema
nervoso central, destaco o glutamato, citocinas e fatores neurotróficos, os quais contribuem para o
desenvolvimento de estados de dor aguda e crônica. Atualmente, abordagens não farmacológicas
como a acupuntura e o exercício físico, utilizados como adjuvantes no tratamento da dor, são
efetivas em aliviar a dor aguda e crônica. Assim, o nosso grupo de pesquisa tem mostrado que
o exercício físico realizado em esteira e a acupuntura no acuponto SP6 promovem importante
efeito analgésico em camundongos. O exercício físico reduziu a dor neuropática induzida pela
lesão do nervo isquiático, o seu efeito foi dependente do aumento da concentração de serotonina
(5-HT) e seu metabólito, o ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA) no tronco encefálico, sendo
prevenido pelo PCPA (inibidor da síntese de 5-HT). O exercício também foi capaz de aumentar
a expressão gênica dos receptores 5-HT1AR, 5-HT1BR, 5-HT2AR, 5-HT2CR e 5-HT3AR
2.9 A neurobiological approach to cancer: neurotrophins as novel biomarkers
and therapeutic targets in oncology
17
no tronco encefálico. Por fim, o exercício físico reduziu a densidade dos transportadores de
serotonina (SERT) no núcleo da rafe, sendo este efeito dependente da redução da IL-1β e do
TNF-α, no tronco encefálico. Por outro lado, o efeito analgésico promovido pela estimulação do
acuponto SP6 na dor muscular induzida pela carragenina (3%) via intramuscular, foi dependente
do aumento da concentração da citocina anti-inflamatória IL-10 no músculo. A acupuntura
alterou o número de macrófagos anti-inflamatórios com fenótipo M2 em relação aos macrófagos
inflamatórios M1, sem promover aumento no número total de macrófagos no músculo dos
animais que receberam carragenina. Ainda, o efeito analgésico da acupuntura não foi observado
em animais nocautes para a citocina IL-10. Estes resultados fornecem subsídios neurobiológicos
para o efeito terapêutico do exercício físico e da acupuntura no controle da dor, em especial, do
envolvimento molecular do sistema serotonérgico e da citocina anti-inflamatória IL-10.
2.9
A neurobiological approach to cancer: neurotrophins as novel biomarkers and therapeutic targets in oncology
Prof. Dr. Rafael Roesler (UFRGS)
Neurotrophins (NTs) are signaling molecules importantly involved in the normal development
and function of the central nervous system. The NT family includes nerve growth factor (NGF)
and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which act by binding to their related tropomyosin
kinase receptors, TrkA and TrkB respectively. More recently, NTs and their receptors have
emerged as possible therapeutic targets in cancer. We have identified the mRNA expression and
increased protein content of BDNF and TrkB in tumors from patients with colorectal cancer
(CRC). Treating human CRC cells with anticancer agents led to a compensatory increase in
BDNF content which protected the cells from drug-induced antiproliferative effects. This
upregulation of BDNF is dependent on epidermal growth factor receptor (EGFR) activity. The
anticancer effect of anti-EGFR therapy in CRC cells is prevented by BDNF and potentiated by a
TrkB inhibitor. BDNF and TrkB are also expressed in Ewing sarcoma (ES) tumors, and inhibition
of TrkA and TrkB displays anticancer effects and potentiates the effects of chemotherapy in ES
cells. Blocking TrkB also inhibits the viability and survival of pediatric brain tumor cells. In
children with acute leukemia, reduced BDNF levels in the blood are associated with active phases
of the disease and probability of survival. Together, these findings suggest that BDNF/TrkB
signaling may play a role in cancer progression and resistance against anti-EGFR therapy, and
Trk inhibitors are novel candidate anticancer drugs. In addition, measuring blood BDNF levels
might provide a new marker of active disease and poor prognosis in pediatric leukemia.
2.10
O Estado da Blogosfera Científica Brasileira
Osame Knouchi
Apresentação e uma discussão sobre a blogosfera científica brasileira. Em particular, será
apresentado o Anel de Blogs Científicos, que contém links para cerca de 300 blogs de ciência.
São apresentadas também estatísticas sobre o crescimento dessa blogosfera, tempo de vida médio
do blog, tema principal do blog, região do país e sexo dos blogueiros. As discussões têm focono
sentido da atividade da blogosfera científica pode estar diminuindo devido ao efeito de outras
mídias sociais como Twitter e Facebook.
18
2.11
Capítulo 2. Palestras
Escrita Científica
Profa Dra. Élida Geralda Campos
A redação científica é o relato dos resultados obtidos e descobertas feitas por meio da
pesquisa científica e tem como objetivo final a divulgação das idéias dos cientistas. Tem como
característica principal o fornecimento de evidências para as informações contidas no texto, seja
por meio de resultados apresentados ou por meio de citações de trabalhos anteriores. Além disso,
utiliza linguagem técnica e concreta, que dispensa o uso de figuras de linguagem geralmente
usadas em textos literários não científicos. Os principais veículos de divulgação dos textos ou
artigos científicos são aos chamados “journals” ou “revistas” científicas. As revistas científicas
possuem um elemento de julgamento da informação científica, que corresponde ao processo de
revisão pelos pares ou “peer review”, o qual está ausente em outros veículos de divulgação da
ciência, como por exemplo, reportagens em jornais populares. Os artigos das revistas científicas
possuem um formato definido para cada revista e para cada tipo de artigo (por exemplo, pesquisa
original, revisão, relato de caso, comunicação rápida), e a maioria dos artigos de pesquisa original
segue um formato básico abreviado como IMRAD (introdução, material e métodos, resultados e
discussão). Três hábitos são pré-requisitos para se aprender a escrever um artigo científico: ler
e analisar artigos científicos regularmente, criar motivação para escrever, e finalmente revisar,
revisar e revisar. Em conclusão, a redação científica tem como alvo o leitor. Assim sendo, é
preciso ter consideração pelo leitor e escrever de modo honesto, claro, e conciso. Sem rodeios,
sem floreamento.
Apresentação oral
Resumos premiados
Resumos
3. Resumos
Foram 86 trabalhos submetidos1 , quatro dos quais mereceram destaque e foram escolhidos
pela Comissão Avaliadora para apresentação oral. Além disso, outros nove resumos receberam
prêmios pelo destaque na sua apresentação sob a forma de pôster. A variedade de assuntos
abordados nos resumos submetidos está representada na nuvem de tags abaixo:
Fig. 3.1: Nuvem de tags com as palavras mais frequêntes nos resumos.
1 Alguns
deles retirados dos Anais a pedido dos autores devido a processo de registro de patente.
20
3.1
Apresentação oral
Capítulo 3. Resumos
3.1 Apresentação oral
21
Microbial degradation of plastics: Brazilian Cerrado soil microbiome hosts novel and
effective polyethylene "eaters"
Julianna B. Peixoto
Palavras chave: biodegradation, polyethylene, plastic, Comamonas, Stenotrophomonas, Delftia
Polyethylene (PE) is the most produced and utilized synthetic polymer, with a global production
of over 299 million tons/year. As a result of its high molecular weight and hydrophobicity, as
well as its chemical composition, PE has been considered an inert non-biodegradable plastic,
taking up to 500 years to degrade under environmental conditions. However, the microbial
potential to degrade such recalcitrant polymers are increasingly rising on the literature, proving
itself to be much wider than previously believed. In this context, the aim of the present study
is to provide a viable and sustainable solution to the plastic disposal issue and its dramatic
consequences to the environment. Due to its outstanding microbial richness and diversity, we
collected plastic debris disposed at the savanna-like Brazilian Cerrado soil in order to isolate
the PE-degrading microorganisms colonizing these samples. Thus, we identified nine bacterial
strains comprised into three different genera - Delftia, Stenotrophomonas and Comamonas - that
are capable of utilizing PE as the sole carbon source. Over up to 3 months incubation periods of
the isolates with unpretreated low density PE (LDPE) films, dense and vast biofilms of viable
cells over the entire films were observed using fluorescence microscopy after staining with
live/dead fluorophores, differing from the controls with no PE which showed a great number
of dead cells within a rather sparse biofilm. Direct analyses of the PE films were carried out
using ATR-FTIR spectroscopy, scanning electron microscopy and atomic force microscopy
in order to evaluate possible physico-chemical changes in the PE structure. Therefore, it was
observed that this biotic treatment was remarkably effective since these analyses showed not
only substantial morphological surface changes - such as cracks and holes - but also evident and
significant chemical modifications on PE’s hydrophobic carbon chain - such as chain breakage,
oxidation and double bound formation. 16S rDNA analyses of the herein isolated microbes
revealed low similarities of 92 - 96% with other ribosomal sequences, suggesting that they
may represent novel species. In contrast to other PE-degrading microorganisms previously
described on the literature, these strains were never related to the PE biodegradation process
and, remarkably, they were able to degrade LDPE without any prior treatment. These findings
reinforce the concept that, despite PE’s molecular stability, microbial degradation is a powerful
tool for decontamination processes and its viability is intrinsically related to microbial diversity’s
mining and assessment. Hence, our perspective is to study the metabolism of PE attempting
to understand the molecular mechanisms behind this process and, ultimately, to propose an
alternative to substitute the harmful conventional waste management strategies with a promising,
sustainable and effective biodegrading system.
22
Capítulo 3. Resumos
Fragment Screening Based Drug Lead Discovery Against Schistosoma Mansoni Purine
Nucleotide Phosphorylase
Muhammad Faheem, Jose Brandao-neto, Patrick Collins, Nicholas Pearce, Louise Bird,
Humberto D. Pereira, João Alexandre R.g Barbosa, Frank V. Delft
Palavras chave: Schistosomiasis, Drug, Purine Nucleotide Phosphorylase, Fragment, Crystallographic
Screening
Schistosomiasis is a major health problem in the developing World. It is endemic in 78 countries
and ranked second amongst the parasitic disease after malaria in terms of its socio-economic
impact and human health importance. Schistosoma mansoni (S. mansoni) is one of the parasitic
species responsible for the disease schistosomiasis. The sole effective drug for the treatment of S.
mansoni is Praziquantel (PZQ). But there are concerns associated with PZQ, which are (i) lack of
information about its exact mechanism of action (ii) high price, (iii) effective only against adult
form of S. mansoni and (iv) reports of resistance to PZQ. It is known that S. mansoni is unable to
synthesize purine bases de novo, thus it is completely dependent on the host purine bases for
nucleic acids synthesis. For these reasons, S. mansoni purine salvage pathway is an attractive
target for the development of selective inhibitors for the design of a new drug. In this study, we
have selected two proteins Purine nucleotide phosphorylase II (PNP2) that is a new isoform of
previously reported PNP1. A high throughput fragment screening based drug lead discovery
strategy via crystallographic approach was adapted to search for new fragment leads for PNP2.
Both the proteins were crystallized and crystallization conditions were optimized for fragment
screening. Crystals for PNP2 were soaked with the fragment library composed of 830 fragments
from Maybridge Ro3 set of 1000 compounds (molecules < 350 Da). X-ray diffraction data was
collected and structures were solved. Out of 830 fragment screens we have obtained a total of 25
fragments that have shown binding to PNP2. PNP2 soaks were also performed with different
nucleotides and their bases to determine its active site. We have obtained a conserved binding
site in PNP2 where cytidine, adenine, hypoxanthine and purine analogue tubercidin have shown
binding. Considering this active site, out of 25 fragments 16 fragments have shown binding in
this site. Amongst the 16 fragments, five fragments have shown consistent hydrogen binding to
two residues Glu203 and Asn245, which were observed in case of adenine, hypoxanthine and
tubercidine and only Glu203 in case of cytidine. One of these fragments has shown 3 consistent
hydrogen bonds to Ser35, Glu203 and His259 as observed for cytidine. Thus, here we present 16
novel fragments for PNP2 that show binding in the active site of the protein. Follow-up chemical
synthesis of these fragments and binding assays to the protein will be important to evaluate the
efficacy of these fragments and drug design against S. mansoni in the long term.
3.1 Apresentação oral
23
The role of Type VI Secretion System (T6SS) of gram-negative bacteria in host cell
antigen presentation modulation
Raquel Das Neves Almeida, Dalila Juliana Silva Ribeiro , Rafael Corrêa, Luis Felipe Fonseca
Silva, José Raimundo Corrêa, Wanderley Dias Da Silveira, Tatiana Campos Amabile, Kelly
Grace Magalhães
Palavras chave: type VI secretion system; Antigen presentation; host immunity; gram-negative
bacteria
The type VI secretion system (T6SS) is a gram-negative export pathway that is considered
as a potential virulence factor that has the ability to translocate protein effectors into largest
cell types, both prokaryotic and eukaryotic cells. The T6SS is composed by proteins such as
IcmF, Hcp and ClvP. T6SS has been describe as an important cell machinery involved mainly
in competition among prokaryotic cells. However, the role of T6SS in eukaryotic host cell
immunity is poorly understood. Antigen presentation is in the center of the immune system
and is an important factor in host immunity. The CD1 and MHC molecules are involved in
this process and their action can be related to the increase in the expression for co-stimulatory
molecules (CD40, CD80. CD83 and CD83). Herein, we have evaluated the modulation of
antigen presentation molecules, CD1d and MHC II , as well as the expression of co-stimulatory
molecules during infection by Escherichia coli 362. We also analyzed the role of T6SS in this
process using E. coli knockouts strains for T6SS proteins: Icmf, Hcp and Clvp. In other to verify
if the host innate immunity is modulated by T6SS, C57BL/6 mice were infected i.p. with E. coli
wild type (SEPT362) and knockout strains for the proteins that comprises the T6SS (Icmf-/-,
Hcp-/- and Clvp-/-). Peritoneal macrophages were collected at 24 and 48h after infection and
the expression levels of MHC II, CD1d and co-stimulatory molecules were analyzed by flow
cytometry. IL-10 and IL-12 levels were measured in mice serum using ELISA assays. Lung, liver
and spleen were collected to perform histological analyses and bacterial burden was evaluated
by CFU. Our data showed that E. coli wild type inhibits the expression of MHC II and CD40
molecules in vivo, and consequently the peptide antigen presentation. In contrast, the knockouts
strains Icmf-/-, Hcp-/- and Clvp-/- triggered an up regulation of these molecules. However, there
was no significant difference on CD1d, CD80, CD83 and CD86 expression after infection by all
strains analyzed here. Moreover, E. coli SEPT362 triggered an up regulation in IL-10 secretion
and IL-12 suppression in infected mice compared to uninfected. Taken together, our data showed
that T6SS can be used by gram-negative bacteria as a mechanism to evade host immune response
by reducing the expression of peptide antigen presentation through down regulation of MHC II
molecules and consequently by the lymphocyte TCD4+ activation. Besides, the results suggested
that the wild type E. coli SEPT362 might be able to evade from immune system by IL-10
stimulation and IL-12 suppression and T6SS plays an important role in this process.
Capítulo 3. Resumos
24
Obtenção de proteínas de camada S de Archaea para avaliação do seu potencial na
estabilização de membranas lipídicas
Thiago Rodrigues De Oliveira, David Neves, Ricardo Henrique Krüger, Sonia Maria De Freitas,
Cynthia Maria Kyaw
Palavras
chave:
archaea,
camada
S,
membranas
lipidicas
Muitos organismos dos domínios Bacteria e Archaea apresentam uma camada proteica de superfície denominada camada S, do inglês Surface layer, composta por um alto número de cópias
de uma única proteína ou glicoproteína, que consiste em um dos polímeros mais abundantes da
biomassa terrestre. Essas proteínas apresentam a interessante capacidade de se auto-organizar em
arranjos simétricos cristalinos extremamente estáveis, característica que confere a estas proteínas
grande potencial biotecnológico. Diversos trabalhos relatam o uso de proteínas de camada S
bacterianas como estabilizadores de membranas lipídicas ou na obtenção de lipossomas. Apesar de quase todas as archaeas apresentarem camada S como parte do seu envoltório celular,
são escassos os estudos visando aplicações biotecnológicas de tais proteínas. Nesse sentido,
esse trabalho tem como objetivo o isolamento das proteínas de camada S da archaea halófila
Haloferax volcanii, e avaliação do potencial dessas proteínas na estabilização de membranas
lipídicas e lipossomas. Culturas de H. volcanii foram submetidas à extração de DNA, o qual foi
usado como molde para ensaios de PCR utilizando iniciadores desenhados para a amplificação
do gene da proteína de camada S. Os fragmentos amplificados foram clonados, sequenciados
e, após confirmação de sua identidade, clonados no vetor de expressão pET28a. Proteínas S
foram também isoladas diretamente a partir da cultura de células de H. volcanii e analisadas
por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida. Estas proteínas foram submetidas a ensaios
de ultracentrifugação analítica e os resultados sugerem a presença de oligômeros, confirmando
assim a provável formação dos arranjos bidimensionais típicos de proteínas de camada S. Nossos
resultados também revelam que o gene da proteína de camada S de H. volcanii obtido por PCR foi
efetivamente clonado e expresso por células de Escherichia coli. No momento, a proteína obtida
geneticamente está sendo purificada por cromatografia de afinidade e preparos de microscopia
eletrônica de transmissão estão sendo realizados para obtenção de imagens de seu arranjo. Serão
ainda realizados ensaios de dicroísmo circular e curvas de desnaturação das proteínas nativas
purificadas. Esse trabalho configura-se como um projeto de doutorado sanduíche, que visa
avaliar o potencial das proteínas obtidas na estabilização de membranas lipídicas. Tal etapa será
realizada em um dos centros de referência nessa área, a Universidade de Recursos Naturais e
Ciências da Vida em Viena, Áustria.
3.2 Resumos premiados
3.2
Resumos premiados
25
26
Capítulo 3. Resumos
Desenvolvimento de sistema baseado na produção de GFP dependente de densidade
celular para a detecção e triagem funcional de genes com atividade antibacteriana
Samuel Dias Araújo Júnior, Ricardo Henrique Kruger
Palavras chave: antibacteriano, biossensor, CEDDEX, GFP, HSL, metagenômica funcional
Vários estudos demonstram que a clonagem e expressão de enzimas e compostos bioativos
utilizando a abordagem metagenômica é uma alternativa para a exploração funcional de microrganismos ainda não cultiváveis. A detecção de clones ou isolados microbianos com atividade
antimicrobiana pode ser realizada atualmente por meio de visualização direta da alteração
fenotípica da colônia, como pigmentação e morfologia, ou da formação de halo de inibição
quando realizado ensaios de sobreposição contra microrganismos indicadores. Essas estratégias já identificaram clones metagenômicos com atividade antimicrobiana, mas demonstraram,
mesmo utilizando diversos hospedeiros, baixa resolução e sensibilidade, indicando a necessidade
de métodos de triagem mais robustos para limites inferiores de detecção. Assim, para melhorar
a possibilidade de detecção e triagem de genes com atividade antibacteriana a partir de clones
metagenômicos e isolados, ou até mesmo a partir de extratos e compostos de outras fontes,
foi desenvolvido um método de ensaio antibacteriano denominado “Cell-Density-Dependent
Expression” (CEDDEX). Esse método é baseado na produção de fluorescência, por meio da expressão do gene gfp (green fluorescent protein), decorrente à ativação por moléculas homoserina
lactonas (HSL), que estão diretamente relacionadas à densidade celular da bactéria produtora
utilizada no ensaio antibacteriano. Assim, o método CEDDEX foi fundamentado na capacidade
de um clone metagenômico (ou qualquer composto) com atividade antibacteriana em inibir ou
retardar o crescimento de uma célula bacteriana que produza um composto que esteja diretamente
relacionado à densidade celular e que esse fosse detectável e quantificável. O método CEDDEX
apresentou sensibilidade pelo menos 100x superior quando comparado aos métodos tradicionais
empregados para a detecção de clones e compostos com atividade antibacteriana. Essa nova
metodologia poderá ser utilizada como estratégia para aumentar a sensibilidade de triagem
de clones com atividade antibacteriana a partir de bibliotecas metagenômicas e/ou isolados,
expandindo, significativamente, o potencial de bioprospecção. Desta forma, a utilização do
sistema CEDDEX juntamente com a exploração funcional contínua da diversidade microbiana,
terá potencial para gerar novos compostos químicos e drogas bioativas assim como acelerar a
descoberta de novos genes com atividade antibacteriana de interesse biotecnológico.
3.2 Resumos premiados
27
Characterization and biotechnological applications of pectinolytic enzymes secreted
by Clonostachys byssicola grown on fruit residues.
Helder Andrey Rocha Gomes, Edivaldo Ximenes Ferreira Filho
Palavras chave:
Pectinase,
pectin lyase,
orange peel,
Clonostachys byssicola
Fruit juice production is an important economic activity in Brazil. In 2011, Brazil was the
biggest exporter of orange fruit juice. It was sold 1,5 million tons of ready-to-drink juice, and
440 thousand tons of concentrated juice. The yield of juice is estimated in 50%, so there is a
huge amount of orange waste that, when it is not well disposed, can produce environmental
pollution. Same can be applied to passion fruit juice production, where juice yield is between
35% and 40%. These residues can be used as inducers of the secretion of pectinolytic activity by
filamentous fungi. Fruit peels and residues contain significant amounts of pectins, since these
polysaccharides play important role on fruit development and ripening process. Additionally,
these residues are cheap carbon sources, and are abundant, since fruit processing is an important
economic activity in Brazil. Several fungi species are poorly studied for the characterization and
potential of application of lignocellulolytic enzymes. Clonostachys byssicola is a well known
mycoparasitic fungus, and its potential as biocontrol agent has been evaluated, but the characterization of the enzymes produced by this specie grown on lignocellulosic residues is still not
well studied. In this work, pectinolytic enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on
passion fruit and orange peels will be purified, characterized and evaluated for biotechnological
applications in fruit juice treatment for reduction of viscosity, as well as for cotton biopurge. So
far, crude extracts of C. byssicola grown on orange peel and passion fruit peel showed pectinase
and pectin lyase activities. These two lignocellulosic substrates were found to be good inducers
for the secretion of pectinolytic activity by the fungal strain. The growth curve for C. byssicola
grown on orange peel has been done, indicating that from the 4th day on, pectinase levels
remain almost constant. Crude extracts were concentrated through ultrafiltration, using a 50 kDa
cut-off nitrocellulose membrane, and concentrated fractions were subjected to Sephadex G75 gel
filtration followed by ion exchange cromathography using a Sepharose QFF column coupled to
Akta Purifier FPLC system. Two proteoforms could be identified, and one of them was brought
to a reasonable grade of purification. This enzyme will be further characterized, regarding effects
of pH, temperature, ions, phenolic compounds, thermal stability, and biophysical parameters.
28
Capítulo 3. Resumos
Positive allosteric modulation of Kv channels by sevoflurane: insights into the structural basis of inhaled anesthetic action
Caio Silva Souza, Juliana M. Hosoume, Manuel Covarrubias, Werner Treptow
Palavras chave: molecular dynamics, free energy, docking, ion channel, anesthesia, sevoflurane
Every year, millions of patients around the world undergo general anesthesia to perform major
surgeries. However, the mechanisms of general anesthesia are poorly understood. Thus, it
is necessary to understand anesthesia at all levels to help develop specific, effective and less
toxic general anesthetics. Diverse ion channels in the nervous system are likely to be major
targets of general anesthetics. Recent work continues to suggest that voltage-gated ion channels
are also important players in general anesthesia. Experimental results revealed that discrete
structural changes in the S4-S5 linker helix drastically affect the response of the Kv1.2 channels
to the anesthetic by altering its electromechanical coupling. Other results strongly suggest
additional novel sites, which are necessary to fully explain the modulation of Kv channels by
sevoflurane. Here, we employed computational techniques to investigate the structural basis
of the anesthetics positive modulation in the mammalian Kv1.2 channel. We applied docking
and molecular dynamics based free energy calculations to identify putative sevoflurane binding
sites with atomic resolution. Specifically, we docked sevoflurane against an ensemble of 120
membrane-equilibrated structures of the mutated and wild-type Kv1.2. Then, starting from
sevoflurane-bound channel structures, we carried out free energy calculations using the LIE
method to resolve site-specific affinities. Supporting a multisite model of general anesthetic
action, we found two significant classes of sevoflurane binding sites. One set in the pore domain
(including the C-terminal side of the S4-S5 linker) and another near the external selectivity filter
of the Kv1.2 channel. We propose that positive multisite allosteric modulation of Kv channel
gating by sevoflurane plays a significant role in general anesthesia.
3.2 Resumos premiados
29
Trichoderma harzianum produz uma nova proteína termoestavel bifuncional fosfatase
ácida/fitase, com potencial para apliacação biotecnológica
Amanda Araujo Souza, Vanessa Oliveira Leitão, Marcelo Henrique Soller Ramada, Viviane
Castelo Branco Reis, Azadeh Mehad, Fernando Araripe Gonçalves Torres, Raphaela De Castro
Georg, João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa, Cirano Jose Ulhoa, Sonia Maria De Freitas
Palavras chave: Trichoderma harziaum, fosfatase ácida, fitase, termoestabilidade, expressão heteróloga
Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, apresentando potencial como agente de controle
biológico, importante na liberação de carbono, nitrogênio e fósforo a partir de macromoléculas
insolúveis, favorecendo o crescimento de plantas. No solo, a obtenção de compostos fosfatados
é mediada por enzimas denominadas fosfatases. Fosfatase ácida (ACP) é uma enzima que libera
fosfato para forma solúvel por hidrolise de ligações monoéster. Estas enzimas já foram descritas
em plantas, microrganismos e mamíferos sendo aplicadas em processos de biorremediação,
reciclando fosfato. Neste trabalho uma nova fosfatase ácida bifuncional denominada ACP II
produzida pelo fungo T. harzianum foi purificada, sequenciada, caracterizada funcionalmente,
apresentando atividade de fitase. O gene e cDNA correspondentes foram clonados, sequenciados
e a proteína expressa em Pichia pastoris X-33. A enzima nativa foi purificada por cromatografia
de exclusão molecular e interação hidrofóbica e sequenciada por espectrometria de massa. A
produção enzimática foi de 14,33±0.10 U/mg, massa molecular estimada foi de 94 KDa, apresentando 30% de carboidrato, capacidade de hidrolisar glicose-1-fosfato, fenilfosfato de sódio
e ácido fítico. O pH ótimo e temperatura foram 4.0 e 65◦ C, respectivamente. Os parâmetros
cinéticos foram Km 0.027 µM e Vmáx 5.02 µM.min-1. A enzima foi parcialmente inibida por
Pi e altamente inibida por tungstato de sódio. As análises por DLS mostraram que a ACP II
é monodispersa, compatível com forma de trimero. As análises por fluorescência indicaram
que a variação de pH promove mudanças conformacionais na estrutura terciária da enzima. Por
dicroísmo circular poucas alterações na estrutura secundária, em pH 4.0, foram observadas,
apresentando termoestabilidade entre 25-95◦ C. ACPase é inibida por tungstato e fosfato em
função do pH, devido a inacessibilidade do substrato ao sítio ativo, e a contatos eletrostáticos
realizados entre inibidores e a enzima, promovendo mudanças conformacionais. Os peptídeos
obtidos no sequenciamento apresentaram alta similaridade com uma fitase de T. harzianum
e histidina fitase ácida de Trichoderma pleuroticola. O gene e cDNA foram analisados por
sequenciamento, apresentando 1.908 pb e 1.674 pb, respectivamente. Quatro íntrons foram
identificados e cDNA codificando uma enzima de 536 aminoácidos, massa molecular 58.6 KDa
e pI 5.31. A enzima apresenta sítio catalítico composto por histidinas conservadas e sítios de N e
O glicosilação. A comparação da sequência de aminoácidos predita contra o banco de dados
do NCBI mostrou que a mesma possui alta similaridade com fitases de T. harzianum e de T.
pleuroticola. A proteína apresentou estrutura secundária semelhante a uma fitase de Aspergillus
niger e característica da família de histidina fosfatase ácida. Os microensaios de expressão
apresentaram 18 clones positivos para produção de hACP após 72 horas de indução. A enzima
hACP foi purificada em coluna exclusão molecular e analisada em SDS-PAGE 12% e PAGE 8%,
apresentando perfil eletroforético semelhante à enzima nativa ( 90Kda). Esses resultados serão
explorados biotecnologicamente, considerando o potencial das enzimas ACPases em remover
fosfato do solo, uma importante estratégia no processo de biorremediação. A enzima heteróloga
será caracterizada funcionalmente e produzida em larga escala.
Capítulo 3. Resumos
30
Approaches for a Reverse Genetics System for Tospoviruses
André Gustavo Machado Bertran, Marina Ciuffo, Massimo Turina, Renato De Oliveira Resende
Palavras chave: Tospovirus; Reverse Genetics; Defective-Interfering RNAs; Reassortment
Tospoviruses are among the most important plant pathogens, responsible for consistent decreases in crop yield and plant survival. They are tri-segmented ssRNA (-) viruses of the
Bunyaviridae family, transmitted in nature by thrips. Different strategies for the development of
a reverse genetics system for Tospovirus have been made: 1) Construction of a mini-genome
replicon based on the sequence of defective interfering RNAs (DI-RNA); 2) Optimization of the
DI-RNA-based construction to a minimal replicon containing a GFP marker; 3) Development
of a co-infection assay with helper virus based on agroinfiltration of the replicons; 4) Development of a co-infection assay based on mechanical inoculation of RNAs; 5) Development of
a protoplast based assay for minimal GFP replicon activity; 6) Development of an NSs-based
reassortment system between mutant and wild-type strains; 7) Construction of an infectious
clone based on transfection of cDNA copies of the three viral segments and co-expression of
the capsid and polymerase proteins in insect (mosquito) and mammal cells. Results have shown
that none of the delivery strategies of the replicon based on co-infection with a helper virus
or on reassortment of strains have worked to increase the levels of the replicon molecule or to
promote NSs reassortment, respectively. The evidences collected in these experiments point to
the possibility that the replicon and NSs constructions ought to be associated to the viral capsid
protein prior to delivery for efficient recognition by the viral polymerase and RNP assembly.
In parallel to several of the experiments mentioned above, two isolates of TSWV (type species
of the Tospovirus genus) from Brazil (BR-20) and Italy (p105) were thrips-transmitted onto D.
stramonium plants and from there serially mechanically inoculated in N. benthamiana for at least
17 (p105) and 20 (BR-20) times at high inoculum pressure (1:10 dilution). Northern blot analysis
of samples from the 2nd and 16th passages of p105 and 2nd and 19th passages of BR-20 showed
low levels of a single species of DI-RNA for the former at both stages, while the latter had
high levels of two DIs as early as the 2nd passage that were succeeded by a single predominant
species of DI with a smaller size at the 19th passage. Unexpectedly, however, isolate p105
showed an extra viral RNA species that signaled strongly at a position higher than that of the
genomic S RNA. This new RNA species was only present in the samples from the 16th passage
in N. benthamiana, there being no sign of novel S RNA-derived molecules in the samples from
the 2nd passage or in different hosts, or at all for isolate BR-20. Western blot results from N.
benthamiana infected with isolate p105 showed a notable reduction in the levels of the NSm
protein both at the 16th, and in repetition, at the 17th passages. Taken together, these results
present different host adaptation strategies for two isolates of TSWV, and point out the different
roles of distinct plant host cellular environments in viral replication and gene expression.
3.2 Resumos premiados
31
Modulação de antioxidantes endógenos durante a estivação em duas espécies de anuros
da Caatinga - Glutationa e estado redox
Daniel Carneiro Moreira, Marcelo Hermes-lima
Palavras chave: Antioxidantes, espécies reativas de oxigênio, estivação, estresse oxidativo,
glutationa
Diversas espécies animais sincronizam suas atividades a condições ambientais favoráveis ao
entrar em estivação, um estado de depressão metabólica, quando se deparam com baixa disponibilidade de água e altas temperaturas. Em um grande número de espécies, foi observado que
a modulação dos níveis de antioxidantes endógenos está associada a fenômenos de depressão
metabólica, incluindo a estivação. Entretanto, estudos que analisaram antioxidantes em animais durante a depressão metabólica no campo são raros. Desta forma, nosso objetivo foi
determinar os níveis e o estado redox de glutationa, um importante antioxidante celular, no
músculo esquelético de duas espécies de anuros em dois estados metabólicos, estivando ou em
atividade no campo. Para tanto, coletamos anuros de duas espécies, Pleurodema diplolister e
Proceratophrys cristiceps, que se enterram e permanecem em estivação durante os períodos de
estiagem na Caatinga no município de Angicos, Rio Grande do Norte. Os níveis de glutationa
reduzida (GSH), glutationa dissulfeto (GSSG) e glutationa total (tGSH = GSH + 2GSSG) foram
determinados pelo método enzimático em músculo e divididos pela concentração de proteínas
no tecido. Os níveis de tGSH aumentaram 72% em P. cristiceps durante a estivação, enquanto
em P. diplolister não houve mudança significativa. De maneira similar, a concentração de GSH
aumentou 77% em P. cristiceps estivando comparado ao grupo ativo, mas não se alterou na outra
espécie. No caso da GSSG, os níveis não foram alterados pela estivação em P. cristiceps, mas
uma queda de 65% foi observada em P. diplolister quando animais estivando foram comparados
aos ativos. A razão entre GSSG e tGSH, que indica o estado redox celular, caiu 47% e 72%
durante a estivação em P. cristiceps e P. diplolister respectivamente. As duas espécies estudadas
apresentaram diferentes estratégias durante a estivação. Tal discrepância pode estar associadas as
diferentes condições ambientais nas quais os animais foram coletados, portanto, esses resultados
tem caráter preliminar e novas coletas serão feitas em dezembro de 2015. No caso de P. cristiceps,
o aumento de tGSH associado ao aumento de GSH indicam uma maior síntese de GSH durante
a estivação. O aumento da síntese de GSH indica a possibilidade de P. cristiceps apresentar o
preparo para o estresse oxidativo (i.e. aumento dos níveis de antioxidantes endógenos durante
depressão metabólica) como resposta à estivação na natureza, assim como outras dezenas de
espécies já estudadas em laboratório. A determinação da atividade de enzimas antioxidantes,
assim como novas coletas, assistirão a elucidação da modulação de antioxidantes durante a
estivação dessas espécies de anuros em seus ambientes naturais.
Capítulo 3. Resumos
32
Método in silico para análise de sequências de imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display
Heidi Muniz Silva, Rafael Trindade Burtet, Thais A. Costa, Tainá Raiol, Nalvo Franco Almeida,
Andrea Q. Maranhão, Marcelo Brígido
Palavras
chave:
phage
display,
NGS,
imunoglobulinas
A tecnologia de phage display possui diversas aplicações no contexto da imunologia molecular,
tais como o desenvolvimento de anticorpos recombinantes. Neste trabalho, associamos a técnica
de phage display ao uso de plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS), que permite
detectar o enriquecimento de sequências correspondente a clones selecionados. O uso de NGS,
no entanto, interfere no volume de dados, que impõe dificuldades para analisar a diversidade
das bibliotecas e para detectar as sequências selecionadas no experimento de phage display, que
potencialmente se ligam ao antígeno de interesse. Considerando tal desafio, desenvolvemos um
método in silico para a análise de sequências de imunoglobulinas de modo a encontrar clones selecionados por phage display, apartir de bibliotecas NGS. O método desenvolvido apoia-se em dois
critérios. O primeiro critério estabelece que uma sequência selecionada deva apresentar todas as
regiões canônicas de domínio variável de imunoglobulinas. O segundo critério exige que uma
sequência selecionada seja enriquecida entre a biblioteca original, antes dos ciclos de seleção, e
a biblioteca final, após os ciclos de seleção. O enriquecimento é estimado pela frequência de
clones, cujo cálculo é baseado na comparação das sequências por busca exata. Assim, sequências
cuja frequência relativa aumenta da biblioteca original para final são consideradas enriquecidas.
O método é composto por 5 etapas: filtragem de sequências, tradução, análise de enriquecimento,
numeração de resíduos e classificação de germlines. Para validar o método, foram analisados dois
conjuntos de dados NGS, biblioteca original e sub-biblioteca selecionada. A análise completa de
cada par de bibliotecas foi executada em menos de 4 horas. Os tempos de execução promissores
devem-se principalmente aos programas de tradução e cálculo de frequência dos clones, os quais
utilizam estratégias inteligentes para aplicar os critérios do método e analisar bibliotecas de
tamanho da ordem de 10e6 em menos de 5 minutos. Como saída final, é produzida uma lista de
sequências candidatas, enriquecidas e reconhecidas como domínio variável de imunoglobulina,
ordenadas por fold change de frequência e com sua respectiva classificação de germlines. O
método proposto é eficiente para detectar clones selecionados por phage display, a partir de
bibliotecas NGS. Além da eficiência do método no que diz respeito ao curto tempo necessário
para sua execução, a abordagem apresenta uma análise de imunoglobulinas que abrange não
somente a CDR3, mas todas as regiões framework bem como as três CDRs, permitindo assim
um olhar mais amplo sobre as sequências de domínio variável. Atualmente estamos trabalhando
na automatização do método a fim de liberar posteriormente um pacote para download, com uma
interface amigável e apresentação da saída mais concisa.
3.2 Resumos premiados
33
A graph database approach to reconstruct and visualize metabolic networks
Waldeyr Mendes Cordeiro Da Silva, Danilo Jose Vilar, Daniel Silva Souza, Marcelo Macedo
Brigido, Maria Emilia Machado Telles Walter, Maristela Terto Holanda
Palavras chave: metabolic network reconstruction; metabolic network visualization; NoSQL
databases; data storage; data modeling
A challenge in genome-scale reconstruction of metabolic networks is the storage of data, and a
modeling of data that properly represents the complexity of systems biology. Recent NoSQL
database paradigms have introduced new concepts of scalable storage and data recovery, in more
details, databases based on graphs, which are versatile enough to work with biological data. In
this work, we propose a database approach based on graphs to solve the problem of genomescale reconstruction and visualization of metabolic networks. Based on data of biochemical
reactions curated by the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB),
we modeled and built a graph database using Neo4J, which stores the set of known biochemical
reactions and related enzymes, from which we can infer biochemical reactions and the metabolic
pathways containing these reactions. A network visualization can be generated using HTML
and javascript libraries. We have created a core database, called Pathway Core Graph Database,
implemented in Neo4j, with data stored in a way that allows to generate useful information of
metabolic pathways in a target organism, which can be used to explore specific characteristics.
A graphical web interface enables the submission of annotated enzyme sequences of a given
organism. Once submitted, these sequences are related to the reactions already contained in the
graph database, which can reconstruct a metabolic network of the target organism. A visual
image is naturally derived from the Pathway Core Graph. Future work includes some aspects
of Pathway Core Graph Database not yet exploited, but included in the proposed model, as the
ability of performing Balanced Flux Analisys (FBA) using stoichiometric coefficient. More user
friendly interface and enriched information, is also of interest.
Support: CAPES
Capítulo 3. Resumos
34
Avaliação in vitro da inibição da atividade de proteínas RAS por derivados de quinolonas
em câncer pancreático humano.
Felipe Silva Redorat
Palavras chave: Quinolonas, Proteínas Ras, Câncer de Pâncreas, Farnesil Transferase, Quimioterapia.
No Brasil, o câncer de pâncreas representa 2% de todos os tipos de câncer, sendo responsável por 4% do total de mortes por câncer. Quando diagnosticado, na maior parte dos casos, é
em estágio avançado sendo assim tratado apenas para fins paliativos. O tratamento do câncer de
pâncreas, atualmente, pressupõe sempre que possível, uma cirurgia para a retirada completa do
tumor. Em caso da impossibilidade da cirurgia, a quimioterapia associada ou não à radioterapia é
um recurso terapêutico para evitar recidivas do tumor, controle da doença ou alívio dos sintomas.
Na maioria dos casos de câncer de pâncreas a descoberta já é tardia, normalmente com a existência de metástase, o que reduz acentuadamente a chance de cura tornando todos os métodos
de tratamentos existentes paliativos e não curativos. Atualmente o tratamento quimioterápico
de primeira linha para o câncer de pâncreas inclui um derivado de platina como a carboplatin
associado a 5-Fluorouracila e Gemcitabina. Todas estas drogas atuam promovendo danos no
DNA o que leva a inibição da mitose e indução de morte celular por apoptose. Devido a este
mecanismo de ação, estes fármacos são altamente inespecíficos com elevada citotoxicidade
tanto para células tumorais, quanto para células normais. Apesar dos avanços terapêuticos e em
técnicas de diagnóstico, o tratamento do câncer de pâncreas persiste como grande desafio. Neste
contexto, há uma necessidade urgente de busca por novos compostos cuja atividade possa trazer
melhores resultados para o tratamento do câncer no pâncreas, visando melhorar a qualidade de
vida dos doentes e principalmente ampliar a expectativa de vida destes pacientes. Nosso ponto
de partida foi a disfunção comum da regulação da proteína kRAS observada em mais de 40%
dos cânceres de pâncreas. Com base neste conhecimento prévio, nosso grupo sintetizou nove
derivados das quinolonas com potencial predito computacionalmente de interferência com a
enzima farnesil transferase, cuja atividade é indispensável para o funcionamento das proteínas
RAS. Nosso objeto neste trabalho é realizar uma prova de conceito para a inibição da farnesil
transferase com consequente inibição da atividade anormal de kRAS. Esta inibição levaria
à parada do estímulo mitótico e devido a grande instabilidade genética das células tumorais,
também à sua morte por apoptose. Esta abordagem poderá abrir um novo caminho para o desenvolvimento de novas drogas, menos citotóxicas para uso no tratamento do câncer de pâncreas.
Neste trabalho utilizaremos as linhagens celulares de adenocarcinoma pancreático Capan-2 e
carcinoma pancreático Panc-1, as quais serão empregadas para a prova de conceito com os nove
derivados das quinolonas. Fazem parte do painel de análises a determinação do IC50, viabilidade
celular tempo dependente, perfil de morte celular, proliferação celular, ciclo celular, angiogênese,
invasibilidade e populações de células tronco tumorais. Durante a síntese dos derivados nosso
grupo anexou uma etiqueta fluorescente aos derivados, de forma a facilitar o seu rastreamento
celular. Nossos resultados preliminares indicam que quatro dos oito compostos se acumulam na
periferia das células, junto à membrana plasmática, sítio esperado para a atividade da farnesil
transferase e das proteínas RAS.
3.3 Resumos
3.3
Resumos
35
36
Capítulo 3. Resumos
Diferentes isotipos IgG de região variável idêntica apresentam distintos padrões de
ligação a Cryptococcus neoformans
Diane Sthefany Lima De Oliveira, Diane Sthefany Lima De Oliveira, Verenice Paredes,
Ananésia Correa, André Nicola
Palavras chave: Antibody binding pattern, Recombinant antibody, Cryptococcus neoformans
Um paradigma importante na biologia de anticorpos diz que o sítio de ligação de anticorpos ao antígeno é formado pelos domínios variáveis. No entanto, evidências sugerem que
diferenças na cadeia constante (CH) relacionadas ao isotipo podem afetar a especificidade e
afinidade do anticorpo, mostrando que não apenas os domínios variáveis determinam a ligação
ao antígeno. Estudo com o anticorpo monoclonal (mAb) IgG 3E5 feito no laboratório do Dr.
Casadevall mostrou que o isotipo IgG1 se liga à cápsula de Cryptococcus neoformans resultando
em um padrão anular, enquanto anticorpo com domínios variáveis idênticos mas com isotipo
IgG3 se liga com padrão puntiforme. Para estudar o mecanismo pelo qual o domínio constante
altera o paratopo, IgG3 recombinante foi produzido usando domínio variável de mAb 2H1, um
IgG1 que se liga a C. neoformans em padrão anular. Fragmentos codificando VH e VL de 2H1
foram sintetizados e clonados nos vetores para expressão de anticorpos pFUSE-CHIg-mG3 e
pFUSE2-CLIg-mK, respectivamente. Os plasmídeos foram co-transfectados em células NSO e
IgG3 recombinante foi colhido do sobrenadante. A concentração foi determinada por ELISA
foi de 0.4 mg/ml. A ligação de 2H1-IgG3 foi examinada por microscopia de epifluorescência
com deconvolução e mostrou padrão puntiforme. No ensaio de fagocitose com macrófagos,
2H1-IgG3 promoveu internalização em 15% dos fagócitos em comparação a 2% do controle
nenhum anticorpo, sugerindo que o mAb produzido é funcional. Os mesmos experimentos foram
feitos com 2H1-IgG1 que resultou em padrão de ligação anular e funcionalidade considerável. O
anticorpo 2H1-IgG3 mostrou padrão de fluorescência puntiforme, diferente do padrão anular
observado com 2H1-IgG1 isolado de hibridomas. Esses resultados sugerem que a alteração
do paratopo quando o anticorpo muda de IgG1 para IgG3 não é exclusiva do mAb 3E5, mas
parece ser reprodutível com outro par de anticorpos. Anticorpos quiméricos contendo sequências
dos domínios CH1 e hinge de 2H1-IgG3 e 2H1-IgG1 embaralhadas serão produzidos a fim de
identificar qual região da cadeia constante interfere com a estrutura do domínio variável a ponto
de alterar o paratopo.
3.3 Resumos
37
The environmental diversity of antibiotic resistance genes indicated by the resistance
screening of two soil metagenomic libraries impact on microbial ecology and bioremediation
Debora Farage Knupp Dos Santos, Paula Istvan, Ricardo Henrique Kruger
Palavras
chave:
antibiotic
resistance,
metagenome,
dioxygenase,
soil
Antibiotic resistance is a major threat to human health, given the dissemination of multidrugresistant pathogens associated with the decreasing number of antibiotics released onto the market
over the years. Whilst considerable attention has been given to research on antibiotic resistance
genes (ARGs) in clinically important microorganisms, the environmental diversity of such genes
has been underestimated, despite the fact that the origin of ARGs are natural environments,
such as soil. Hence, accessing the collection of ARGs from environmental samples may enable identification of new genes and mechanisms for antibiotic resistance outside the clinical
setting. In this regard, metagenomics is a potentially useful tool, given that the majority of
microorganisms in environmental samples are not yet cultivable and, as a consequence, are
still unknown. Two Cerrado soil metagenomic libraries, small and large-insert, were screened
against nine beta-lactamic antibiotics. In this screening, 62 resistant clones were isolated and
some selected for sequencing and phenotypic analysis. From the small-insert library, a putative
dioxygenase ORF was subcloned and tested for antibiotic and aromatic resistance, as well for
enzymatic characterization.. For large-insert clones, annotated ORFs were characterized into
eight groups: resistance-related, dioxygenases, transporters, mobile elements, other modifying
enzymes, virulence, hypothetical and others. CRB2(1) subclone was alone able to confer resistance to carbenicillin and phenol in Escherichia coli. Additionally, further sequence analysis
suggests that the ORF is a gentisate 1,2-dioxygenase (GDO). As for large-insert clones, a dataset
of 0.27 Mb was obtained by ORF annotation from six metagenomic clones. From these, only
1.2% were resistance-related. Moreover, no betalactamases were identified. The initial characterization of CRB2(1) as a GDO is the first association of this enzyme to antibiotic resistance furthermore, is the first metagenomic GDO to be described. In large-insert resistome description,
a large diversity of genes is observed - within these, a small portion are genes previously related
to antibiotic resistance. In this regard, transporters were the most prominent category that may be
related to the resistant phenotype observed. Moreover, no beta-lactamases were identified, which
shows that the classical resistance mechanism for beta-lactamic antibiotics in clinical isolates
may not follow the same pattern in natural environments. These findings provide strong evidence
that environmental ARG diversity is much broader than it appears and that accessing these uncharted genes may reveal new mechanisms of antibiotic resistance, improving our understanding
of microbial ecology and aiding research in biotechnology industries such as in bioremediation.
Acknowledgments: FAP-DF and CNPq
Capítulo 3. Resumos
38
Cultivation of Thaumarchaeota from cerrado sensu strictu soil
Aline Bemok De Araújo Dias, Thiago Rodrigues De Oliveira, Heloísa Sinatora Miranda,
Ricardo Henrique Krüger, Cynthia Maria Kyaw
Palavras chave:
Archaea,
Thaumarchaeota,
in vitro Cultivation,
Cerrado soil
The difficulty in obtaining in vitro cultures of environmental microorganisms is a well-known
issue, and until now only a small fraction of their diversity has been represented by cultivated
species. The employment of molecular techniques with application in microbial ecology and
phylogenetic studies is allowing microbiologists to identify and analyze microbial diversity directly from environmental samples. However, obtaining laboratorial cultures of microorganisms
is still indispensable for understanding their biology and biotechnological potential. So far, few
Archaea species have been obtained in pure culture, with most corresponding only to those
species retrieved from extreme environments. As a consequence, the biology of mesophilic
archaea is still poorly understood, with only a few pure cultures available (with the exception
of methanogenic archaea). In this sense, the aim of this study was to characterize archaeal in
vitro cultures from Cerrado soils. Soil samples, collected in a Cerrado sensu stricto area of the
Ecological Reserve of IBGE, were used to prepare culture media and as the initial inoculum.
Different antimicrobial agents were added to the media in order to select archaea. All cultures
were maintained at 28oC, with periodic transfers to fresh media. After approximately six months,
different colonies were selected and submitted to DNA extraction and PCR assays with primers
directed do the 16S rRNA genes of Archaea and Bacteria. DNA fragments were obtained for both
primer sets, suggesting the occurrence of a co-culture of Archaea and Bacteria. Sequencing of
PCR amplicons revealed the presence of a bacterium of the genus Novosphingobium, known for
its broad resistance to antibiotics, and an archaeum affiliated to I.1c group of Thaumarchaeota,
a group that has been detected in acidic soils and that does not so far have any cultured representative described. These results offer potential insights into the metabolism, physiology and
ecology of I.1c thaumarchaeotes. Studies are ongoing to obtain a pure culture of this Archaea for
biological characterization.
3.3 Resumos
39
Detecção de presas consumidas por predadores generalistas através de metagenômica
Renata Velozo Timbó, David A. Andow, Lucas M. De Souza, Bruna L. Da Costa, Marcelo De M.
Brígido, Débora P. Paula
Palavras chave:
teias tróficas, bioinformática, sequenciamento de última geração.
O conhecimento das presas consumidas por predadores permite avaliar o potencial de predação
de cada espécie, servindo de orientação para o manejo e controle biológico de pragas. Esse
trabalho visa desenvolver um pipeline de Bioinformática para detecção de presas consumidas por
insetos predadores através de metagenômica, bem como avaliar a influência de alguns parâmetros
que afetam a detecção do DNA das presas. Os predadores utilizados são os coccinellídeos
Cycloneda sanguinea, Harmonia axyridis e Hippodamia convergens, e o neuroptera Chrysoperla
externa, importantes agentes de controle populacional de pragas. As presas são algumas das
principais pragas da agricultura: Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) e os hemipteros Myzus
persicae e Bemisia tabaci. Quatro bioensaios foram realizados para avaliar a detecção da presa
em função: A) do estágio do predador, espécies em interação de predador-presa e modo de
alimentação; B) do número de presa consumida; C) da predação indireta; D) da temperatura
ambiente (20, 25 e 30oC). Foram coletados 10 espécimes/predador/bioensaio, em diferentes
tempos pós-alimentação: em jejum (grupo-controle), imediatamente (0 h) e 3, 6 e 9 h após
alimentação. As amostras de um mesmo tratamento foram agrupadas, perfazendo um total de
96 bibliotecas de DNA, incluindo as para elucidação do DNA mitocondrial e scaffolds do DNA
nuclear das presas para compor um banco de dados de DNA para identificação das presas. O trato
gastrointestinal dos predadores foi dissecado e o DNA total extraído e purificado utilizando-se
o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen), e quantificado por fluorescência em Qubit (Invitrogen). O DNA total/amostra (1$$g) foi seco em centrífuga a vácuo e enviado para o Centro
Genômico da Universidade de Minnesota (EUA) para construção das 96 bibliotecas TruSeqNano
e sequenciamento HiSeq 2500 Radid Mode (paired-end, 2x250 pb, 250 ciclos). Os dados de
sequenciamento foram entregues e as análises de bioinformática se iniciaram.
40
Capítulo 3. Resumos
Detecção e identificação de complexos multienzimáticos de Trichoderma harzianum
cultivado com fontes definidas de carbono
Nicholas De Mojana Di Cologna, Carlos André Ornelas Ricart
Palavras chave: BN-PAGE, secretoma, complexo multienzimático, Trichoderma harzianum
O etanol, como fonte de energia renovável, tem ganhado destaque nas últimas décadas. Sua
produção através da fermentação de açúcares simples produzidos por vegetais, no entanto, não
garante o máximo aproveitamento energético possível, uma vez que os polissacarídeos presentes
nos resíduos lignocelulósicos ainda contém grande quantidade de energia armazenada. Esses
resíduos são considerados recalcitrantes, por serem de difícil acesso para degradação. Ao longo
da evolução, muitos micro-organismos adquiriram a capacidade de mobilizar a matéria e a
energia armazenadas nesse material, através de um diversificado arsenal de enzimas hidrolíticas.
Os fungos filamentosos se destacam dentre esses micro-organismos, como por exemplo os do
gênero Trichoderma. Estudos anteriores mostram que o fungo Trichoderma harzianum, quando
crescido em bagaço de cana, secreta complexos multienzimáticos. O presente estudo visou
verificar se fontes definidas de carbono presentes no bagaço de cana (celulose microcristalina e
xilana oat spelts) seriam capazes de induzir individualmente a produção de complexos multienzimáticos, e se sua composição seria a mesma dos observados em bagaço de cana. Conhecer
como o fungo responde ao estímulo da fonte de carbono é importante para avaliar possíveis usos
da espécie para a produção ode complexos multienzimáticos, na indústria. Os fungos foram
cultivados em meio sólido e posteriormente inoculados em meio líquido contendo bagaço de
cana, celulose microcristalina ou xilana oat spelts. Os secretomas foram filtrados, dialisados,
liofilizados e submetidos a 1D-SDS-PAGE e 1D-BN-PAGE. Os resultados das análises eletroforéticas mostraram alta similaridade nas replicatas biológicas e várias diferenças entre os tipos
de meio de cultivo. Também sugeriram a presença de complexos multiproteicos no secretoma
tanto crescido em meio com celulose microcristalina quanto crescido em meio com xilana oat
spelts. O trabalho prosseguirá com a decomposição dos complexos em 2D-SDS-PAGE, e com
análises de uPLC-MS/MS tanto dos complexos inteiros quanto de suas subunidades. Também
serão realizadas análises top down dos secretomas.
3.3 Resumos
41
CARACTERIZAÇÃO DAS TOXINAS QUE ATUAM EM CANAIS DE CÁLCIO (CAV1.2
E CAV1.3) ENCONTRADAS NA PEÇONHA DO ESCORPIÃO Tityus fasciolatus VISANDO
UMA ABORDAGEM TERAPÊUTICA CONTRA A DIABETES MELLITUS DO TIPO
2.
Beatriz Elena Sarmiento Certuche, Dra. Elisabeth Ferroni Schwartz
Palavras
chave:
Tityus
fasciolatus;
Canal
de
cálcio
;
Diabetes;
toxinas
Canais de cálcio voltagem-dependentes (CCVD) são proteínas com múltiplas subunidades
encontradas nas membranas plasmáticas das células excitáveis e nas células α e β do pâncreas.
A diabetes do tipo 2 (DT2) resulta da incapacidade das células β do pâncreas em produzir
insulina suficiente para manter os níveis de glicose normais na sangue. Uma das opções terapêuticas para o tratamento do DT2 tem como alvo aumentar a sensibilidade das células β
pancreáticas à insulina. O canal de Ca2+ do tipo L (CavL) desempenha um papel preponderante
sob outros tipos de CCVD na liberação da insulina por exocitose, sendo os subtipos de canal
Cav1.2 e Cav1.3 envolvidos nessa ação nas células β pancreáticas de camundongos. Alterações
na homeostase do Ca2+ nas células β pancreáticas estão associadas ao desenvolvimento da
DT2 contribuindo ao fenótipo diabético. Portanto agentes que reduzem o limiar de excitação
do CavL, aumentariam a despolarização e induziriam a secreção da insulina. As calcinas são
uma família de toxinas peptídicas isoladas do veneno de escorpiões com capacidade de reconhecer os CCVD; estabelecendo assim, as calcinas como candidatos atrativos para aplicação
farmacológica no tratamento de diversas patologias tendo em vista que as calcinas são peptídeos
extremamente básicos, propriedade que as tornam bons candidatos para permear a membrana.
Após a síntese química do peptídeo, será purificado (HPLC) e analisado por espectrometria de
massa (MALDI-TOF). A atividade moduladora sobre os subtipos de canal Cav1.2 e Cav1.3 será
avaliada nos ensaios eletrofisiológicos (patch-clamp). Esses experimentos estão previstos para o
segundo ano de doutorado. Após a apresentação da qualificação serão avaliados os efeitos dos
peptídeos na secreção da insulina in vitro nas células β pancreáticas mediante imunomarcação
e as alterações no cálcio intracelular mediante microscopia de fluorescência. O último ano
será reservado para a análise de dados, revisão do projeto e redação da tese. Ainda estamos no
processo de verificação e purificação da toxina com uma massa molecular teórica de 4.901,08
obtida pela biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do escorpião T. fasciolatus que poderia
interagir com o canal de cálcio. Tem-se realizado analises por homologia da sequência usando
Blast. HPLC e espectrometria de massa foram usados na procura da massa experimental da
toxina de interesse na peçonha bruta do escorpião T. fasciolatus para estabelecer se de fato o
animal esta produzindo aquela toxina encontrada na biblioteca. Até a data não se tem resultados
específicos do projeto.
Capítulo 3. Resumos
42
PRODUCTION OF ANTIBODIES FRAGMENTS BY DIFFERENT LINES OF EUKARYOTIC CELLS USING pValac VECTOR
Maria José Chiabai, Juliana Franco Almeida, Anderson Miyoshi, Andrea Queiroz MaranhÃo,
Anamelia Lorenzetti Bocca, Marcelo De Macedo BrÍgido
Palavras
chave:
antibodies
fragment,
pValac,
inflammatory
disease
Monoclonal antibodies therapy appears as an alternative for several pathologies, from inflammatory disease to cancer therapy. However, it‘s production is highly expensive and its usage is
associated to severe side effects. Thus, alternative methods to recombinant antibody production
and delivery may push forward its broader usage. This work aims to produce the expression
vectors for using Lactococcus lactis, for intestinal delivery of pValac vectors carrying fragments
of antibodies (anti-IL1β , anti-TNFα and anti-CD3) in the intestinal mucosa of mice. Genes for
antibodies fragment were synthetized using sequences from Genbank including restriction sites
for cloning in the pValac vector.These genes were subcloned using EcoRI and NheI enzymes in
the pValac (shuttle vector to eukaryotic expression) and transformed in Escherichia coli TGI.
Cloning was checked by restriction endonuclease digestion profile, PCR and sequencing of
DNA confirming the integrity of all sequences. Electrocompetent L. lactis (MG1363 FnBPA)
was prepared to receive pValac vector and antibiotic resistance and specific PCR for each one
of constructions confirmed transformation. In order to ensure the eukaryotic expression of
genes carried by pValac before animal tests using L. lactis delivery, we have transfected the
vector in HEK293, CHO-K1 and Caco-2 cell lines using Lipofectaminer LTX with PlusTM
using ELISA and Western Blot Reagent to detect specific proteins in supernatant cell cultures
after 24-72 hours post-transfection. SDS-PAGE confirmed the expected size for all antibodies
fragments produced. Quantification of anti-CD3 reveals that HEK293 is the best cell line for
pValac production,in a comparative basis. We have produced expression vector for recombinant
antibodies fragments production in the L. lactis, based on the pValac shuttle vector. Three
different antibodies fragments (an anti-IL1β , anti-TNFα and anti-CD3) in two different formats
(scFv and FvFc). All these fragments were efficiently produced in animal cell culture. The
human HEK293 cell lineage shown to be the best host for pValac expression. These results will
allow further mice tests of L. lactis to delivery plasmids at intestinal mucosa, inducing tolerance
and controlling anti-inflammatory processes.
3.3 Resumos
43
Desenvolvimento de um modelo estatístico para a avaliação de padrões de cross-talk
em proteínas com múltiplas modificações pós-traducionais e sua aplicação em larga escala
para análise de proteomas
Alan Ribeiro Mól, Veit Schwämmle, Wagner Fontes
Palavras chave: proteômica, bioinformática, modificações pós-traducionais, espectrometria de
massas
Modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas fornecem uma camada adicional de complexidade para o ajuste fino das interações proteína-proteína. Elas permitem que as células mudem
o seu comportamento bem como “memorizem” ações anteriores, e modificações múltiplas na
mesma proteína podem atuar em combinação, num processo chamado cross-talk. Métodos
modernos de espectrometria de massa fornecem quantidades enormes de dados contendo informações valiosas e ainda não pesquisadas sobre as PTMs. Os códigos combinatórios de PTMs
podem ser estudados por meio do cálculo de um Interplay Score entre as PTMs. O Interplay
Score é calculado em função das abundâncias das proteoformas sem, com apenas uma e com
ambas modificações, e indica se uma PTM influencia na outra, seja de forma positiva (uma
PTM favorece o surgimento da outra) ou negativa (uma PTM desfavorece o aparecimento da
outra). Esta estratégia já foi utilizada com sucesso com resultados de espectrometria de massas
middle-down, no entanto, esta abordagem experimental dificulta a obtenção de dados em larga
escala, para milhares de proteínas. No presente projeto pretende-se desenvolver um sistema que
possibilite o cálculo de Interplay Scores a partir de proteômica top-down bottom-up, de forma
que as informações possam ser obtidas por experimentos exploratórios ao invés de direcionados.
A ferramenta estatística está sendo desenvolvida utilizando o ambiente e a linguagem de programação R. A primeira etapa do projeto consistiu em desenvolver os algoritmos necessários
para a leitura e pré-tratamento dos dados de quantificação de peptídeos por espectrometria de
massas com marcação isobárica. As etapas de pré-tratamento incluem: junção de replicatas,
técnicas de extração de informações quanto às posições das PTMs encontradas e normalização
dos dados para correção de variações experimentais. Atualmente, o trabalho desenvolvido
envolve a avaliação das diferentes abordagens possíveis para os cálculos das razões estimadas
de cada proteoforma possível. Em virtude do número de replicatas biológicas e condições
experimentais existentes, que não são necessariamente fixos (considerando os mínimos de 3 e
4, respectivamente), diferentes métodos para o cálculo das razões existem. Além de considerar
as diferentes abordagens, deve-se obter, concomitantemente, um parâmetro que sirva como
indicador estatístico do resultado obtido, como p-valor, desvio padrão ou erro acumulado. O
cálculo dessa estatística é altamente dependente do tipo de distribuição dos dados de abundância.
No momento, estão sendo verificados os resultados obtidos quando o cálculo é realizado por
meio de um sistema linear, construído para cada condição na situação de controle. Pretende-se
utilizar a regra geral de propagação de incerteza para a obtenção do erro biológico.
44
Capítulo 3. Resumos
Perfil enzimático de Aspergillus terreus e Trichoderma reesei crescidos em bagaço de
cana pré-tratado
Raissa Pieroni Vaz, Edivaldo Ximenes Ferreira Filho
Palavras chave:
enzimas, Aspergillus terreus, Trichoderma reesei, pré-tratamento
A lignocelulose constitui cerca de metade da matéria produzida pela fotossíntese e representa a
fonte orgânica renovável mais disponível no planeta. Os resíduos agroindustriais se apresentam
como uma grande fonte de lignocelulose e são abundantes no Brasil, uma vez que o país é pioneiro no setor agroindustrial. Diante desse cenário, muitas abordagens têm sido propostas para se
agregar valor a esses resíduos, como por exemplo, a utilização dos mesmos na biorrefinaria para
produção de bioetanol, e como substratos de baixo custo para crescimento de microrganismos e
produção de enzimas lignocelulolíticas. O potencial dos resíduos agroindustriais na produção de
enzimas por fungos filamentosos tem sido amplamente estudado, e basicamente duas metodologias são utilizadas para produção de enzimas: a fermentação submersa (SmF) e a fermentação
em estado sólido (SSF). Há um consenso na literatura de que a SSF é a metodologia mais apropriada, pois gera maior produtividade volumétrica, enzimas com características bioquímicas mais
interessantes, possui menor taxa de contaminação e menor custo e complexidade de produção e
operação. O presente trabalho objetivou a produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas
pelos fungos Aspergillus terreus e Trichoderma reesei - isolados do cerrado brasileiro - e caracterização dos seus extratos brutos, visando uma futura elaboração de coquetéis multienzimáticos.
Para tal, o bagaço de cana foi utilizado como fonte de carbono para o crescimento dos fungos e
produção de enzimas. O bagaço de cana foi pré-tratado em reator de banho fluidizado sob alta
pressão e temperatura. Este pré-tratamento visa a solubilização da hemicelulose e diminuição
da recalcitrância do resíduo para um maior acesso das enzimas à celulose. Foram realizados
ensaios para caracterização do perfil enzimático dos extratos brutos, indicando prevalência de
xilanases, pectinases e carboximetilcelulases. Para estudo do efeito do pré-tratamento no resíduo,
foi feita microscopia eletrônica de varredura, onde, através das imagens, foi possível observar
abrasões e descamações na superfície da parede do bagaço, indicando uma possível solubilização
da hemicelulose. Esses estudos foram preliminares e, embora tenham esclarecido alguns pontos
acerca do perfil enzimático desses fungos, serão necessários estudos complementares para uma
melhor caracterização dos extratos para futura concepção de coquetéis multienzimáticos para
aplicação industrial.
3.3 Resumos
45
Identification, biophysical characterization and computational modeling based: an
insight into a novel cell wall modifying enzymes selected in a metagenomic approach
Muhammad Faheem, Diogo Martins De Sá, Julia Freitas Daltro Vidal, Alice Da Cunha Morales
Alvares, José Brandao-neto, Louise Elizabeth Bird, Robert P. Rambo, Betania Ferraz Quirino,
Sonia Maria De Freitas, João Alexandre R. Barbosa
Palavras
chave:
Metagenome,
Autoproteolysis,
Protease,
Domains,
Modelling
In the past decades, sophistication in sequencing and metagenomics technique has played
a significant role in the collection of huge amounts of microbial genomic data. One of the current
focuses of the scientific community is to interpret and transform the collected genomic data into
functional proteomics data. Combination of structural biology and genomic data is one way to
achieve such goal. In this study we have assessed a novel bacterial protein selected on a screen
for activity on carbohydrates in a microbial metagenomic library from the gut of Capra aegagrus
hircus. Initial sequence analysis led to an ORF that could be annotated as an uncharacterized
novel bacterial cell wall modifying enzyme. It carries four domains: an N-terminus, a cysteine
protease, a peptidoglycan-binding and an SH3 bacterial domain. We have successfully cloned,
expressed and purified this protein. Autoproteolytic activity has been observed for the purified
protein, which was inhibited with protease inhibitors cocktail. This protein binds ampicillin, a
characteristic of most of bacterial cell wall modifying enzymes. Binding was further evaluated
with fluorimetric analysis. Purified protein has also shown bacterial cell wall hydrolytic activity.
Homology modeling was statiscally valid and agreed with circular dichroism data. Homology
model was also assembled in SAXS generated density map, which gives information about the
overall architecture of the protein. Here we report a novel cell wall modifying autoproteolytic
cysteine protease with an insight into its biochemical, biophysical and structural information of
the protein and its domains.
Capítulo 3. Resumos
46
Engenharia metabólica em Pichia pastoris para produção de L-ácido lático utilizando
glicerol cru como fonte de carbono
Pollyne Borborema Almeida De Lima, Gisele S. Anastácio, Nadielle T. M. Melo, Lucas S.
Carvalho, Thaila F. Dos Reis, Gustavo H. Goldman, Beatriz S. Magalhães, Nádia S. Parachin
Palavras
chave:
Leveduras,
engenharia
metabólica,
fermentação.
Atualmente, os resíduos de plástico acumulados no mundo atingem 140 milhões de toneladas,
sendo que estes têm tempo de degradação completa estimado em 1000 anos. Além disso, os
custos de produção de plástico unicamente para a produção de garrafas de água atingiu 1,6
milhões de barris de petróleo em 2013. Uma alternativa é a produção de plásticos biodegradáveis,
tal como PLA (ácido poli-lático). Este apresenta vantagens tais como a redução do tempo de
degradação e utilização de fontes de energia renováveis na sua produção. Uma possibilidade de
reduzir o custo de produção de bioplásticos é a utilização de resíduos industriais como substrato.
Entre estes, um excelente candidato é o glicerol bruto, o principal resíduo gerado durante a
produção de biodiesel. A levedura Pichia pastoris é capaz de utilizar glicerol como fonte de
carbono atingindo densidades celulares elevadas, mas não é capaz de produzir ácido láctico.
Assim, o objetivo deste trabalho foi a construção de cepas de P. pastoris para a super produção
de L ácido lático. Para isso, o gene que codifica a enzima lactato desidrogenase (LDH), que
converte piruvato em ácido láctico, foi introduzido na cepa selvagem X-33. No entanto, esta
cepa recombinante apresentou rendimento muito abaixo do ideal, 1g/g. Assim, para aumentar
o rendimento total do processo, foram construídas cepas com os transportadores, JEN1P (Saccharomyces cerevisiae) e PAS (P. pastoris). Sendo o primeiro já descrito na literatura, porém o
segundo, citato como possível transportador de ácido lático. Apesar de a cepa recombinante PAS
apresentar diminuição da velocidade de transporte, houve aumento de 3 vezes da afinidade por
lactato em comparação com a cepa selvagem.
3.3 Resumos
47
EXPRESSÃO DE PEPTÍDIOS ANTIMICROBIANOS COM POTENCIAL PARA CONTROLE DE BACTERIOSES EM ALFACE (LACTUCA SATIVA).
Pedro Souza Berbert, José Francisco Lima Aragão
Palavras chave: Transformação genética, peptídios antimicrobianos, fitopatógenos, resistência
As doenças vegetais causadas por fitopatógenos estão entre os principais fatores responsáveis por
perdas na produção agrícola do país. Dentre as principais doenças que afetam a produtividade
podemos citar as bacterioses. Para a obtenção de plantas resistente à bactérias via transgenia, as
principais estratégias que vêm sendo utilizadas envolvem a introdução de genes que codificam
proteínas relacionadas à ativação dos sistemas de defesa local, ou pela ativação de uma resistência sistêmica. Genes como os que codificam para proteínas PRR S (proteínas receptoras de
reconhecimento do patógeno) e estimulam reconhecimento de padrões moleculares associados
ao patógeno (PAMP S) assim como genes exógenos codificando peptídeos antimicrobianos.
Em trabalho anterior o gene que codifica uma proteína com funções semelhantes aos peptídeos
antimicrobianos foi introduzido por nosso grupo em plantas de fumo e as linhagens expressando
esse gene se mostraram altamente resistentes a diversas espécies de bactérias patogênicas. Isso
indica que há um excelente potencial de uso desse gene em uma estratégia de geração de plantas
resistentes a múltiplas doenças bacterianas. Para a continuação deste trabalho foi proposto a
expressão de peptídeos antimicrobianos em plantas de alface para compararmos com a resposta
obtidas aos fitopatógenos. Após a construção e clonagem do cassete de expressão dos peptídeos
antimicrobianos no vetor pCAMBIA3300 sob controle do promotor constitutivo CaMV35S,
foi construído um vetor com um peptídeo de trânsito direcionando a proteína para o apoplasto.
Plantas de alface estão sendo exaustivamente transformadas via Agrobacterium tumefaciens
(cepa EHA-105). O vetor binário construído contém o gene BAR como marcador de seleção e o
teste de imunocromatografia de fluxo lateral mostrou duas linhagens expressando a proteína PAT.
As análises de PCR confirmaram a expressão heteróloga dos peptídeos nas linhagens aclimatadas
em casa de vegetação. Atualmente as plantas estão em processo de enraizamento in vitro e
assim que aclimatadas serão utilizadas nos bioensaios com os fungos Sclerotinia scletotiorum e
Fusarium oxysporum e as bactérias Pseudomonas syringae pv. tabaci, Xanthomonas campestri e
Erwinia carotovora para verificarmos o nível de resistência.
Capítulo 3. Resumos
48
Effects of rottlerin in Plasmodium falciparum erythrocytic schizogony
Thuany De Moura Cordeiro, Sébastien Charneau, Philippe Grellier, Izabela M. D. Bastos, Jaime
M. Santana, Cecília F. Favali, Rayner M. L. Queiroz, Carlos André O. Ricart
Palavras
chave:
Plasmodium
falciparum,
flow
cytometry,
autophagy
Malaria is an infectious disease caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium. The
P. falciparum is considered the most severe, since it is responsible for the majority of deaths
related to this disease. While the parasite life cycle is complex, malaria is only due to the
development and multiplication of the Plasmodium parasite inside human erythrocytes and the
repeated erythrocytic cycles, where it alters its host cell. However the molecules involved in
structural and regulatory levels are not well known. But it is clear that kinase-mediated signalling
mechanisms play a significant role. Our group observed that the rottlerin, an inhibitor of protein
kinase C, also described as a potential autophagy effector, causes specifically a rapid death of
P. falciparum schizonts in culture (IC50 = 0, 9 M). Thus, this inhibitor is a tool of choice to
address the molecular mechanisms that control the morphogenesis of merozoites. Therefore,
herein, a synchronized population in an 8-h window treated by rottlerin was harvested at several
times post-invasion and monitored by flow cytometry. The death occurred drastically at the
schizont stage and not at other stages. Then a preliminary comparative proteomic analysis by
two-dimensional electrophoresis was performed between rottlerin-treated and untreated schizonts (38-44 h post-invasion). Heat shock protein 90, 3-phosphoglycerate kinase and lactate
dehydrogenase, clearly down-regulated in treated parasites were identified. These proteins have
critic role in parasite growth, and were already studied as potential targets for antiplasmodial
drugs and their absence may be related to autophagy in erythrocytic schizogony.
Support: CAPES, FINEP, FAP-DF, COFECUB and CNPq
3.3 Resumos
49
Expressão diferencial de genes associados à degradação enzimática e destoxificação da
torta de pinhão-manso em Pleurotus pulmonarius
Taísa Godoy Gomes, Clemente Soares Batista Neto, Sámed Ibrahim Isa Abdel Hadi, Gláucia
Midorikawa, Gabriel Sergio Costa Alves, Félix Gonçalves De Siqueira, Robert Neil Gerard
Miller
Palavras chave: Pleurotus pulmonarius, RNAseq, expressão diferencial de genes, destoxificação
Jatropha curcas (pinhão-manso) é uma planta oleaginosa promissora para produção de biodiesel,
devido ao alto rendimento de óleo pela semente e adaptação a diversos tipos de solos e fatores
ambientais. O resíduo gerado após a extração mecânica do óleo, chamado de torta tem em
sua constituição fibras lignocelulósicas, proteínas (46-63%), lipídeos, carboidratos solúveis e
minerais. A composição da torta de pinhão-manso torna este co-produto um potencial candidato
para ser usado como suplementação animal, adubo orgânico e/ou insumo para produção de
etanol de segunda geração. Dentre estas possibilidades, seu uso como insumo para ração animal
é a mais atrativa; no entanto, faz-se necessária a inativação de compostos tóxicos e fatores
antinutricionais que estão presentes nesta biomassa vegetal. Os ésteres de forbol são os principais componentes tóxicos neste co-produto, cujos efeitos biológicos em animais dependem da
estrutura molecular, podendo induzir respostas inflamatórias agudas e a formação de tumores.
Diversas estratégias químicas ou biológicas tem sido abordadas na tentativa de destoxificação da
torta de pinhão-manso, com sucesso limitado em alguns casos. No cenário de bio-destoxificação,
o basidiomiceto Pleurotus pulmonarius consegue degradar com eficiência esse composto tóxico
e ainda produzir cogumelos comercialmente viáveis. Neste contexto, este projeto pretende
identificar genes envolvidos no processo de destoxificação a fim de compreender e estabelecer
o mecanismo de degradação do éster de forbol encontrados em tortas de pinhão-manso, assim
como realizar análises de expressão diferencial dos genes identificados nos pontos críticos do
crescimento do fungo. Quantificação das atividades enzimáticas de várias enzimas juntamente
com a degradação dos ésteres de forbol ao longo do cultivo semi-sólido foram usados como
parâmetros para determinar os pontos para RNA-seq, que foram os dias 3, 7 e 11 de cultivo. No
dia 3 já se tem expressão da maior parte das enzimas quantificadas: Lacase 1061,72 ± 53,08
U/mL; MnP 26,9± 1,34 U/mL; Protease 1318,75 ± 65,93; Xilanase 3,99 ± 0,11; FPase 0,781 ±
0,03 e CMCase 0,150 ± 0,02. Todas essas atividades foram crescentes em função do tempo. No
3◦ e 6◦ dias de cultivo os teores de ésteres de forbol eram de 1,05 ± 0,05 mg/mL e 0,95 ± 0,04
mg/mL, respectivamente. No entanto no 9◦ dia essa concentração decaiu significativamente 0,45
± 0,02 mg/mL, o que indica que a expressão dos genes que estão envolvidos nesse processo
de bio-destoxificação são expressos antes do 9◦ dia de cultivo, desta forma o dia 7 foi o ponto
escolhido. Extração do RNA é uma etapa crucial para RNA-seq, por isso diversos protocolos para
extração de RNA foram testados: TRIzolr , Brazolr , Concertr RNA Plant Reagent (Invitrogen)
e Método Fenol. A análise de pureza e quantificação de RNA total foi avaliado em gel de agarose
1% (m/v) e por espectrometria (NanoDrop), e mostraram que o método de extração por base de
Concertr foi o mais eficiente para extração do RNA dos pontos escolhidos.
50
Capítulo 3. Resumos
Genomic and pedigree-estimated breeding values in two specialty eucalypts germplasm
Bárbara Müller Salomão De Faria, Leandro Gomide Neves, Márcio F. R. Resende Junior,
Patricio R. Muñoz, Matias Kirst, Dario Grattapaglia
Palavras chave: Genome-Wide Selection (GWS), high-throughput genotyping, tree breeding,
Eucalyptus.
Genomic Selection (GS) has great potential to accelerate tree breeding by permitting early
selection of elite individuals, particularly for traits express late in the life cycle. Eucalyptus
benthamii (BEN) and Eucalyptus pellita (PEL) are species of increasing commercial interest
due to their cold and drought tolerance, respectively. GS is a promising approach to rapidly
develop elite clones for these non-model eucalypts. Here we report the estimates of Linkage
Disequilibrium (LD) decay and development of genomic prediction models for growth traits
in two breeding populations of BEN (Ne = 53, n = 505) and PEL (Ne = 35, n = 732), using
60,000 SNPs genotyped with a Eucalyptus Illumina Infinium chip. Pairwise estimates of LD
were measured by classical diallelic loci (r2) and correcting for bias due to relatedness and
population structure (r2VS) for each chromosome. A nonlinear regression model was fitted
for LD decay of r2 and r2VS with distance. Analyses were carried out using genomic BLUP
(GBLUP) and pedigree BLUP (PBLUP) with 10-fold cross-validation for growth traits such as
diameter at breast height (DBH), total height and volume. We tested the impact of the number
of SNPs on the accuracy of prediction of genomic breeding values using progressively smaller
datasets (10,000 to 100). Bayesian genome-wide regression models (BRR, BayesB, BayesA,
BayesCTT, BL) were applied to estimate the heritability and predictive ability (rgy). A total of
13,787 and 19,506 high-quality polymorphic SNPs were used in the analyses for BEN and PEL,
respectively. Averages genome-wide LD (r2) decayed to <0.2 within 15.6 and 70.6 Kbp, while
r2VS showed a slightly faster decay within 7.7 and 25.5 Kbp for BEN and PEL, respectively.
The faster LD decayed for r2VS confirms the strong effect of the genetic relationship expected in
these populations. This study demonstrated that GS can dramatically increase in more than 200%
the genetic gains per unit of time when compared by PBLUP. The results suggest that models
with 5,000 SNPs are equivalent in rgy to the full model for all traits and species. The rgy inferred
by Bayesian methods reached similar estimates, varying from 0.14 for volume in BEN to 0.44
for DBH in PEL. The lower values of rgy for BEN may be explained by the restricted occurrence
of this species in its natural range and the limited genetic diversity sampled by this breeding
population. For PEL the PBLUP could not be estimated due a detected inconsistency between
the expected pedigrees based on family information and the realized pedigree based on the
GRM (Genomic Relationship Matrix) built from SNP data. This result indicates that the original
seeds allegedly from maternal families in fact were most likely mixtures from several families
possibly due to seed collection errors in the original seed orchard. This observation revealed
an additional advantage of using SNP data not only for genomic prediction but also to bypass
pedigree information for conventional breeding. This study sets the stage for the application
of high-density SNPs and GS in two specialty eucalypts, to characterize their populations and
advance breeding.
3.3 Resumos
51
Construção de cepa recombinante de Hansenula polymorpha para super produção de
ácido hialurônico
Lucas Silva Carvalho, Lúcio Rezende Queiroz, Antonio Milton Vieira Gomes, Juliana Davies
De Oliveira, Beatriz Simas Magalhães, Nádia Skorupa Parachin
Palavras
chave:
ácido
hialurônico,
levedura,
engenharia
metabólica
Ácido Hialurônico é um polissacarídeo linear de unidades repetidas do dissacarídeo N-acetilD-glucosamina e ácido glicurônico. Atualmente este é produzido principalmente por bactérias
do gênero Streptococcus, ou é retirado de tecidos animais como crista galinácea e olho bovino.
Entretanto, estas fontes apresentam laboriosos processos de purificação por apresentarem endotoxinas ou restos de tecidos que podem desencadear respostas inflamatórias no usuário clínico.
Para evitar o uso de microrganismos patogênicos ou produção a partir de tecidos animais pode-se
desenvolver processos utilizando microrganismos que tenham o status GRAS (do inglês Generally Regarded as Safe). Nesse sentido, destaca-se o desenvolvimento de leveduras, em especial
da levedura Hansenula polymorpha conhecida por diversas aplicações na produção de insumos
na indústria farmacêutica e agropecuária. Este organismo satisfaz critérios de segurança, não contendo toxinas e inclusões virais, apresenta um alto rendimento no processo industrial, podendo
ser cultivado em grandes fermentadores com alta densidade celular. Do ponto de vista genético a
H. polymorpha possui cepas com genomas já sequenciados o que permite o estudo de modificações de rotas metabólicas para as mais variadas aplicações. Dessa forma foi possível observar
que a levedura Hansenula polymorpha já apresenta vias metabólicas para produção de alguns
intermediários da via de síntese de HA o que resulta em um menor número de modificações
genéticas requeridas. Assim o objetivo deste trabalho é a construção de cepas de Hansenula
polymorpha geneticamente modificadas para a superprodução de ácido hialurônico. Para isso,
está sendo feita a construção de um vetor de expressão funcional contendo três genes para a via
metabólica de produção de ácido hialurônico. Estes genes são responsáveis por completar a via
para a síntese deste polímero. Os genes correspondem a uma glicose-uridiltransferase (hasC):
converte glicose 1 fosfato em UDP-glicose, uma UDP-glicose dehidrogenase (hasB): sintetiza
o ácido glicurônico e, finalmente, a ácido hialurônico sintase (hasA): que é responsável pela
produção do ácido hialurônico. Até o momento os genes hasB e hasA estão clonados no vetor de
expressão próprio para a H. polymorpha. A presença destes genes no vetor foi confirmada por
PCR. Análises de restrição e sequenciamento serão necessárias para confirmar a presença dos
genes antes da inserção dos plasmídeos construídos em H. polymorpha.
Capítulo 3. Resumos
52
Caracterização de genes relacionados à síntese de fitohormônios no desenvolvimento
de ovários de plantas de reprodução sexual e apomíticas de Brachiaria brizantha
Luciana Gomes Ferreira, André S. T. Irsigler, Diva Maria De Alencar Dusi, Ana Cristina M. M.
Gomes2, Lilian H. Florentino, Júlio C. M. Rodrigues, Vera Tavares De Campos Carneio
Palavras
chave:
Bracharia
brizantha,
apomixia,
fitohormônios.
Brachiaria brizantha, forrageira da família Poaceae, possui genótipos de reprodução sexual ou
assexual por apomixia. Plantas apomíticas e sexuais apresentam estrutura diferenciada de saco
embrionário, tipo Panicum e Polygonum, respectivamente. Há evidências que fitohormônios
estejam envolvidos na estruturação de sacos embrionários em plantas sexuais de outras espécies,
mas não há estudos em plantas apomíticas. Resultados obtidos por RNA-seq indicaram genes
envolvidos na via de fitohormônios sendo diferencialmente expressos em ovários de B. brizantha
sexual e apomítica. Três destes genes estão sendo estudados: BbrizGID1, gene com similaridade ao receptor de giberelina GID1 (Gibberellin Insensitive Dwarf1), BbrizIPT9, similar ao
gene IPT9 (isopentenyltransferase), relacionado com a biossíntese de citocinina e BbrizLOG
com similaridade ao gene LOG (LONELY GUY), relacionado com a ativação da citocinina.
O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de BbrizGID1, BbrizIPT9 e BbrizLOG no
desenvolvimento de ovários de plantas apomíticas e sexuais. Dois acessos foram analisados,
BRA 002747, diplóide (2n=2x=18) sexual e BRA00591, tetraploide (2n=4x=36) apomítico
facultativo. RT-qPCR foi realizado em ovários nos diferentes estádios do desenvolvimento de
plantas sexuais e apomíticas para todos os genes. Para observar o padrão de expressão dos genes,
foi realizada hibridização in situ em secções semi-finas de ovários e anteras na megasporogênese.
Para análise por Southern blot foi usado DNA de ambos os genótipos e fragmentos de 300 pb de
BbrizGID1, 982 pb de BbrizIPT9 e de 606 pb de BbrizLOG. Os resultados obtidos por RT-qPCR
validaram os dados do RNA-seq para os genes BbrizIPT9 e BbrizLOG. BbrizGID1 apresentou
alta expressão no estádio inicial do desenvolvimento do saco embrionário de plantas apomíticas e
sexuais em relação aos estádios posteriores, no entanto, não foi verificada diferença significativa
de expressão entre plantas apomíticas e sexuais. O gene BbrizIPT9 possui maior expressão nas
plantas sexuais quando comparado com as plantas apomíticas. Já o gene BbrizLOG apresentou
maior expressão em plantas apomíticas em todos os estádios. Resultados de hibridização in situ
de BbrizGID1 revelaram um forte sinal nas células nucelares e na célula mãe do megásporo de
plantas apomíticas. BbrizIPT9 apresentou forte expressão na célula mãe do megásporo tanto
de plantas apomíticas como de sexuais. Resultados obtidos por Southern blot sugerem que
BbrizGID1 está presente em pelo menos duas cópias no genoma de ambas as plantas, para
BbrizIPT9 duas a quatro cópias foram sugeridas e BbrizLOG está presente em uma cópia no
genoma de ambas as plantas, apomíticas e sexuais. Estes resultados sugerem o envolvimento
destes genes durante o desenvolvimento reprodutivo de B. brizantha.
3.3 Resumos
53
Obtenção de proteínas recombinantes de Paracoccidioides brasiliensis em sistemas de
expressão heteróloga para aplicação em imunodiagnóstico
Luis Janssen Maia, Herick Sampaio Muller, Vicente De Paulo Martins, Maria Sueli Soares
Felipe
Palavras chave: Paracoccioidomicose, Paracoccidioides spp., imunodiagnóstico, glicosilações,
estrutura
primária,
"TCTP-family
like
protein"
A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides: Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A
PCM é considerada uma das principais micoses sistêmicas da América Latina, além de ser a
principal causa de morte dentre as micoses sistêmicas no Brasil. No entanto, estima-se que
seja uma doença subnotificada na rede de saúde nacional, o que se deve, em grande parte, às
limitações presentes do diagnóstico da doença. Atualmente, o diagnóstico da PCM é feito por
métodos sorológicos, nos quais o soro de pacientes suspeitos da doença é exposto a extratos de
antígenos totais, ou antígenos secretados, obtidos a partir da cultura de leveduras de Paracoccidioides. Essa forma de diagnóstico apresenta altos índices de reações cruzadas com outros fungos
patogênicos, como Histoplasma, uma vez que esses extratos apresentam em sua composição
elementos comuns a várias micoses sistêmicas, como proteínas conservadas e resíduos de manose
ligados às proteínas. A complexidade desses extratos também torna difícil a padronização destes
testes. Alternativamente, utiliza-se a glicoproteína gp43 como antígeno para testes sorológicos,
o que não é uma forma eficiente de se diagnosticar a presença de P.lutzii, uma vez que a proteína
ortóloga a gp43 em P.lutzii, plp43, possui estrutura primária aproximadamente 20diferente da
gp43 em P.brasiliensis, além de não possuir uma N-glicosilação característica da estrutura da
gp43. O presente trabalho objetiva avaliar a imunogenicidade de proteínas de alta similaridade
de estrutura primária entre as espécies de Paracoccidioides e o seu potencial para a aplicação no
diagnóstico sorológico da Paracoccidioidomicose. Para este fim, nos propusemos a identificar
proteínas de alta similaridade estrutural entre essas espécies em trabalhos de secretomas/subproteomas de superfície do fungo, já que essas proteínas seriam mais acessíveis ao hospedeiro e
à geração de respostas imunes, e expressar tais proteínas em sistemas heterólogos capazes de
glicosilar as proteínas de maneira diferencial, para então avaliar o seu potencial em diagnóstico
sorológico por ELISA e Western Blot. Assim, identificamos a proteína “TCTP-family protein”,
cuja estrutura primária é idêntica entre Paracoccidioides spp. e expressamos essa proteína em
E.coli. Atualmente, estamos desenvolvendo a expressão dessa proteína em Pichia pastoris e
Leishmania tarentolae, porque esses vetores de expressão possuem padrões de glicosilação similares ao de Paracoccidioides e de células mamíferas, respectivamente. A aplicação de proteínas
recombinantes comuns a Paracoccidioides spp. no diagnóstico sorológico pode contribuir para
o desenvolvimento de testes de detecção da PCM mais simples, precisos e reproduzíveis em
diferentes laboratórios de diagnóstico de referência no Brasil e na América Latina.
Capítulo 3. Resumos
54
ANALYSIS OF INTERACTION BETWEEN DESIGNED LIGANDS AND THE PROTEIN PPARγ USING in silico AND in vitro ASSAYS
Jônatas Cunha Barbosa Lima, Erika Pereira Sampaio, Kelly Grace Magalhães, Luiz Romeiro,
João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa
Palavras
chave:
PPARγ
ligands;
Docking;
Drug-design
The nuclear perixisome proliferator-activated receptors (PPARs) are active and important in
many tissues, such as the adipose and muscle tissue, due to their involvement in glucose and
lipid metabolism. For that reason, alterations in their gene expression can lead to diseases like
diabetes, artherosclerosis, hypertension, dyslipidemia and cancer, among others. There are a
variety of subtypes of PPAR proteins, e.g. PPARα, PPARβ /δ e PPARγ (PPARγ1 e PPARγ2),
and each type play a role in different tissues. These proteins form an heterodimer with retinoid
X receptors (RXRs) to interact with DNA and, as result, control the expression of gene sets
involved in glucose and lipid metabolism, as well as in the inflammation process. PPAR suffers
conformational change when binding to ligands derived from fat or lipid metabolites, which
modulate PPAR’s ability to bind with different co-factors. Therefore, the various functions of
these proteins can be related to the diversity of ligands with which they interact. Because of their
important role in metabolism, PPARs have been targeted with a variety of molecules in different
diseases. The prospection of candidate molecules capable of interacting with PPAR can provide
relevant alternatives to be applied in the treatment of such diseases. Thereby, the objective of this
job is test the interaction of job design ligands with PPARγ. In this respect, this was assessed
through Autodock Vina docking program and gromacs program of molecular dynamics (MD).
We observed in docking that ligands interact in two different regions (near residues ARG288 and
TYR473) and that most ligands can interact in both regions: LDT11, LDT13, LDT15, LDT208,
LDT380 and LDT383. On the other hand, three ligands (LDT28, LDT29 e LDT30) interact only
with region near ARG288 residue. In results of MD, we can observe LDT11 interacted in both
sites through all time in dynamic making hydrogen bonds with atoms of important residues in a
big percentage of time. in vitro experiments demonstrated LDT11, LDT13, LDT380 and LDT383
promote reduction of cellular viability and raise in apoptosis of breast adenocarcinoma cells
(MDA-MB-231). We concluded ligands LDT11, LDT13, LDT380 and LDT383 are possibles
candidates for drugs to breast adenocarcinoma treatment, but is necessary more analysis.
3.3 Resumos
55
Modificações Genéticas em Clostridium acetobutylicum Visando o Aumento da Produção de Butanol
Myrna Barbosa Gomes
Palavras
chave:
biocombustíveis,
Clostridium,
genética,
butanol
Fontes limitadas de combustíveis fósseis, instabilidade no preço do petróleo e a necessidade de
reduzir as emissões de dióxido de carbono na atmosfera estimulam a necessidade de se explorar
novas tecnologias na produção de combustíveis líquidos usando matéria-prima renovável. Entre
os biocombustíveis produzidos atualmente o butanol (1-butanol, n-butanol), desperta particular interesse, devido a características energéticas que o tornam um combustível promissor
para motores de combustão. A biossíntese desse álcool é restrita ao gênero Clostridium, cujo
metabolismo fermentativo é capaz de transformar acetona, butanol e etanol. Entretanto, a engenharia metabólica desses micro-organismos é particularmente difícil de ser realizada, uma vez
que as vias fermentativas são bastante ramificadas, possuem sistema de restrição diferenciado
e não há conhecimento detalhado dos seus circuitos regulatórios. O objetivo desse trabalho é
desenvolver um bioprocesso envolvendo modificações genéticas em cepas de C. acetobutylicum
para o aumento da produção de butanol. Para suplantar o sistema de restrição, linhagens de
E. coli, contendo o plasmídeo com o gene da metiltranferase (phi3T), foram utilizadas para
metilação no DNA que será transformado nos clostrídios. A otimização da produção de álcoois
será realizada através de modificações genéticas, para tanto, foram construídos vetores de deleção
dos genes associados à formação de ácidos (pta e buk), que influenciará significativamente na
concentração final dos produtos de interesse. A produção laboratorial dos álcoois será realizada
no fermentador com as cepas cuja produção de acetona esteja interrompida. Os resultados
mostram que o DNA metilado em E. coli é resistente a ação da enzima de restrição Cac284
do clostrídio. Os vetores de deleção foram metilados e os clostrídios transformados com o
plasmídeo pMTL-mazF-pta e a deleção confirmada pela PCR. Entre os resultados esperados
estão: o aumento da produção de butanol e etanol e a produção de álcoois em escala laboratorial.
Esta proposta é uma das primeiras inciativas do país voltadas para a manipulação genética de
clostrídios para a produção de biocombustíveis, os ganhos em termos de conhecimento serão
bastante amplos e poderá servir como base para inúmeros desenvolvimentos futuros.
Capítulo 3. Resumos
56
Desenvolvimento de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para fermentação de amido
Daniel Pereira De Paiva, Marciano Régis Rubini, Viviane Castelo Branco Reis, Lidia Maria
Pepe De Moraes
Palavras chave:
Saccharomyces cerevisiae,
etanol,
modificação genética,
amido
A levedura S. cerevisiae, tradicionalmente utilizada para produção de etanol é incapaz de
metabolizar o amido, sendo necessária a adição de enzimas que elevam o custo de produção. O
desenvolvimento de uma levedura industrial recombinante capaz de hidrolisar o amido e utilizar
o açúcar obtido para produção de etanol tornaria o processo economicamente viável. Além disso,
com a perspectiva de aplicação comercial da linhagem amilolítica, modificações genéticas são
necessárias para atender questões de biossegurança exigidas pela CTNBio. Primeiramente as
linhagens JP1 e JPU foram modificadas geneticamente para funcionarem como plataforma de
expressão heteróloga que atendem às exigências da CTNBio. Ensaios genotípicos e fenotípicos
foram realizados para confirmar a modificação dos genes e inativação de suas funções, respectivamente. Também foi averiguada a influência destas deleções no crescimento celular e análises
na alteração da capacidade fermentativa estão em andamento. A linhagens obtidas foram denominadas de JP1d e JPUd. As linhagens industriais são geneticamente e fisiologicamente mais
adaptadas ao processo estressante de fermentação, tendendo a dominar o processo. Ademais, é
sabido que alguns promotores de linhagens de laboratório não funcionam da mesma maneira
em linhagens industriais. Para determinar quais promotores serão utilizados para produção das
enzimas, foram construídos 16 plasmídeos usando eGFP como gene reporter sob controle de
oito diferentes promotores amplificados de linhagens laboratorial (S288c) e industrial (JPU). A
força dos promotores foi comparada em duas linhagens (CEN.PK2 e JPU). Resultados obtidos
demonstraram que os promotores TEF1, HXT7, PGI1 e ADH1 de diferentes origens possuem
diferença significativa quando expressos em JPU. Portanto selecionamos o promotor PGK1
por não apresentar diferença significativa e ADH1 oriundo de JPU para expressão dos genes
amilolíticos. A levedura amilolítica foi construída e denominada JPUd-AMY. Resultados preliminares demonstraram que a linhagem é capaz de crescer em amido como única fonte de carbono.
Também estão sendo realizados experimentos de caracterização das linhagens.
3.3 Resumos
57
Expressão de BMP-2 em cloroplastos de alface.
Lídia Nascimento Queiroz, Franciele Roberta Maldaner, Francisco José Lima Aragão
Palavras
chave:
rhbmp-2,
cloroplasto,
alface,
biofármaco
A produção de biofármacos pelos sistemas convencionais é onerosa, o que encarece e torna esses
produtos inacessíveis a grande parte da população mundial. A produção de proteínas biofarmacêuticas em plantas tem se consolidado como uma alternativa para otimizar a produtividade
e diminuir os custos, principalmente através da adoção de sistemas de expressão heteróloga
em plastídeos. A proteína morfogenética óssea tipo 2 (bone morphogenetic protein, BMP-2),
pertencente à super família TGF-Beta de fatores de crescimento humano, tem sido produzida
sinteticamente para aplicação médica. A BMP-2 é uma potente mediadora de proliferação celular
e diferenciação de células-tronco mesenquimais, sendo empregada clinicamente no tratamento de
fraturas ósseas. Os baixos níveis de expressão obtidos pelos sistemas de produção atuais tornam o
preço da proteína elevado, e dificultam o acesso ao tratamento por parte dos pacientes. Com isso,
o desenvolvimento de uma metodologia de síntese alternativa se justifica. O cloroplasto é uma
organela com características favoráveis a produção e ao armazenamento de proteínas, além de
garantir a não dispersão de transgenes pelo pólen, devido a sua característica de herança materna.
Características comerciais e alimentares da planta de alface, aliadas à grande concentração de
cloroplastos presentes nas células foliares, fazem desta planta um alvo biotecnológico para
produção de proteínas. Além disso, a metodologia de transformação cloroplasmática de alface
está bem estabelecida em nosso laboratório, tornando-a a nossa planta de escolha. O objetivo
do trabalho é expressar rhBMP2 em cloroplastos de alface e testar o potencial osteoindutor da
proteína recombinante produzida. Para isso, folhas de alface cultivadas in vitro foram usadas
como tecido alvo para biobalística, empregando vetor de transformação cloroplasmática específico com gene rhbmp2 regulado por sequências psbA endógenas, denominado pLSCloro-bmp2.
O vetor também contém sequência do gene aaDa, que codifica proteína que confere resistência à
espectinomicina, agente seletivo empregado em meio de cultura. Foi obtido um evento transgênico, denominado BMP 1.0. Os calos resultantes de regeneração in vitro foram submetidos
a quatro rounds de passagem em meio seletivo para eliminar cloroplastos não-transformados
e obter uma planta homoplásmica. Os experimentos estão sendo conduzidos e e futuramente
serão realizados ensaios de detecção protéica em plantas homoplásmicas, além de ensaios de
bioatividade in vitro e in vivo.
Capítulo 3. Resumos
58
STUDIES ON AFFINITY OF IMMUNOGLOBULIN VARIABLE HEAVY CHAIN
ASSOCIATED WITH A RECOMBINANT VPREB TOWARDS SSDNA
Ronny Petterson Dos Santos Araujo, Andrea Queiroz Maranhão, Marcelo De Macedo Brigido
Palavras
chave:
VH10;
anti-DNA;
B
cell;
HCDR2
B cell development in early stages is dependent of constant stimulus by the pre-BCR signaling
to become a functional B cell. It was suggested that the recognition of endogenous antigens by
the pre-BCR are responsible for signaling that promotes positive selection of these cells during
the first steps of the development process. Thus, self-recognition could be a mechanism used
by the pre-B cells to maturate properly. In a previous work, we had shown that particular VH
families have a substantial number of anti-DNA binding representatives. VH10 family calls
our attention by the fact of it be over-represented. This data suggests a possible role for this
intrinsic characteristic seen in Vh10 family antibodies. In this work, we explore different VH10
derived scFv using a recombinant VpreB as light chain partner to map for intrinsic DNA binding
site. We developed a recombinant expression cassette to study the in vitro affinity of anti-DNA
antibodies in an early B cell development context. The construct is an antibody fragment termed
single chain fragment variable (scFv), it is formed with a heavy chain (VH) attached by the
linker with the VpreB surrogate light chain (SLC). We selected murine sequences from VH10
and VH4 families. VH4 differently of VH10 family has no anti-DNA sequence annotated. The
VH10 and VH4 sequence were obtained from a phage display library from a previous work and
the SLC murine sequence was obtained in Genbank and Uniprot databases. Four constructions,
with changes in HCDR2, were designed to test our hypothesis. VH10 sequence was linked
with a recombinant VpreB from mice with lack of the unique regions of VpreB1 and lambda5
forming an Ig domain. A VH4 sequence was also select from phage display experiment that
shares the HCDR3. The other two constructions has a interchanged HCDR2. We have cloned
this constructs into a pIg16 plasmid for bacterial expression in BL21 (DE3) strain. We are now
working on the optimization of protein production. With these four constructions, we expect to
simulate the recognition of self-molecules (ssDNA) in a pre-B cell moment in vitro, showing
that some VH families have an intrinsic affinity for self-antigens and this characteristic can
be important for B cell development. Moreover, this will allow us to understanding about the
nature anti-DNA binding affinity and a possible role of this mechanism in triggering autoimmune
diseases.
3.3 Resumos
59
Desenvolvimento de potenciais estatísticos para simulação de enovelamentos proteicos.
Diogo César Ferreira
Palavras chave: enterramento; enterramentos atômicos; estrutura; predição de estrutura; enovelamento;
Desde a década de 1970, busca-se compreender os mecanismos subjacentes ao processo de
enovelamento proteico, uma vez que as proteínas normalmente necessitam de uma estrutura
tridimensional bem definida para exercer seu papel fisiológico.Nosso grupo tem trabalhado com
modelos estatísticos de predição de estrutura tridimensional e para tanto optou-se por utilizar um
algoritmo baseado em Modelo Oculto de Markov (HMM), e em um trabalho anterior foi proposta
uma equação que descreve a distribuição de probabilidades dos enterramentos atômicos dentro
do raio de giração das estruturas proteicas. Neste trabalho procuramos suplementar a informação
obtida pelo algoritmo baseado no HMM com a informação fornecida pela equação a fim de se
realizar uma transição de uma predição discreta (enterramentos agrupados em camadas) para uma
predição contínua dos enterramentos atômicos que melhor explore o espaço tridimensional da
estrutura predita. A partir de um banco de dados não redundante de cadeias proteicas globulares
e hidrossolúveis, utilizamos o algoritmo baseado em HMM para calcular, para cada átomo,
a sua distribuição de probabilidade em camadas concêntricas de enterramento dentro de sua
estrutura. Então, ajustamos os parâmetros da equação dos enterramentos atômicos de forma
que ela descreva, para cada átomo, seu respectivo conjunto de probabilidades. Estimativas da
qualidade do ajuste e da qualidade final da predição, realizadas pela divergência de informação
entre os enterramentos observados (nativos) e os preditos indicam que a utilização da equação aumenta consideravelmente a informação disponível na predição. Por fim, utilizamos as predições
em simulações de dinâmica molecular a fim de compararmos as trajetórias com aquelas que
já haviam sido obtidas anteriormente. Resultados preliminares indicam que o uso deste novo
potencial deve aumentar consideravelmente a taxa de sucesso nas simulações de enovelamento
proteico.
Capítulo 3. Resumos
60
DETECTION OF VIRAL SPECIES INFECTING FORAGE PLANTS IN BRASIL
Karina Nascimento Da Silva, Fernando Lucas Melo, Tatsuya Nagata, Marilia Santos Silva,
Celso Dornelas Fernandes, Renato De Oliveira Resende
Palavras
chave:
Virus,
NGS,
Panicum,
Brachiaria
Panicum sp. and Brachiaria sp. showing mosaic symptoms on leaves and growth reduction were
collected in the State of Mato Grosso do Sul in the experimental field of Embrapa Beef Cattle.
To obtain a viral enriched fraction, the leaves were ground in PBS buffer, filtred and centrifuged
through a sucrose cushion. Viral RNA was extracted using RNeasy Mini Kit following the manufacturer’s instructions. The RNA samples were pooled and sequenced at Macrogen INc. (Korea)
using Illumina HiSeq 2000 technology. We obtained approximately 20,299,626 of reads, which
were trimmed and assembled de novo using CLC Genomics Workbench 7.0. The assembled
contigs (3,254) were submitted to blastx against the RefSeq Viral database and the contigs related
to plant viruses were selected. We were able to identify complete genomes of viruses from some
plant virus families: Potyviridae and Secoviridae. Among Potyviridae, we identified contigs
related to Johnsongrass mosaic virus (Potyviridade) and this virus presented highest nucleotide
identities of 77% and 81% for its coat protein and complete genome with Johnsngrass mosaic
virus. Another very similar isolate of JGMV was isolated and fully characterized (biologically
and molecularly) in Penisetum sp. And the results were submitted for publication (in Archives
of Virology) Moreover, we found genomes related to Maize chlorotic dwarf virus (Seconviridae)
and this virus presented highest amino acid identities of 75% and 84% for its coat protein (CPs)
and polymerase (Pro-Pol), respectively, with Maize chlorotic dwarf virus (MDCV) isolates.
According to the Secoviridae and Potiviridae species demarcation criteria this isolates belongs to
the JGMV and MCDV species. We design specific primers to detect each virus in the surveyed
hosts Panicum sp. and Brachiaria sp. were already amplified back by RT-PCR. Host range and
phylogenetic analysis are being conducted for further characterization of these viruses. The
further steps of this project will be the generation of infectious clones for both viruses, aiming
the study of virus/host interactions and virus synergism and/or virus antagonism during mixed
infections. In addition, these infectious clones will be used for searching for genetic resistance
sources to help the Forage Breeding Program of Embrapa.
3.3 Resumos
61
Deleção do gene que codifica a enzima piruvato descarboxilase em Pichia pastoris
visando aumento na produção de ácido lático
Nadielle Tamires Moreira Melo
Palavras
chave:
Pichia
pastoris,
piruvato
descarboxilase,
ácido
lático.
Nas últimas décadas, houve um aumento crescente na demanda de produtos biotecnológicos.
Assim, inúmeros esforços estão sendo realizados no sentido de ampliar e aperfeiçoar os processos
de geração desses produtos, visando à obtenção de melhores rendimentos e produtividade. Os
microrganismos apresentam notável interesse biotecnológico por serem modelos naturalmente
relevantes para a aplicação em bioprocessos. A obtenção do ácido lático (precursor do PLA) por
meio de microrganismos é muito visada pela indústria, visto que esse produto tem um alto valor
agregado e diversas aplicações. A levedura Pichia pastoris apresenta vantagens para produção
do ácido lático, destacando-se o fato de que essa levedura ter um bom crescimento em glicerol,
resultando em altas densidades celulares. Entretanto, o rendimento de ácido lático em P. pastoris
não é satisfatório em nível comercial. Portanto, o objetivo do presente trabalho propõe direcionar
o fluxo de piruvato produzido na via glicolítica para aumento da produção de ácido lático, por
meio da deleção do gene codificador da enzima piruvato descarboxilase (PDC). Ocorreu a construção do cassete de deleção em E. coli, inserção do cassete construído em levedura, bem como
PCR das cepas geneticamente modificadas em comparação com a cepa controle, extração de
DNA genômico e PCR. Ocorreu as identificações do genoma de Komagataella pastoris GS115
para possíveis genes que codificam para PDC na plataforma do NCBI. O genoma recentemente
publicado de GS115 e DSMZ 70382, cepas de K. pastoris, confirmou a existência de um único
gene de PDC em K. pastoris. Foi clonado o cassete de deleção em bactéria em seguida a inserção
do mesmo em levedura. Os clones obtidos possuíam bandas deletadas e não deletadas. Ocorreu
também inserção do cassete de deleção de PDC em leveduras já modificadas com gene de LDH,
resultando em duas bandas do cassete deletado e não deletado. Após crescimento em placas de
colônias isoladas, todas as colônias transformadas são não deletadas para o gene de PDC.
Capítulo 3. Resumos
62
PROCESSOS FERMENTATIVOS COM LEVEDURAS NATURALMENTE CONSUMIDORAS DE XILOSE APLICADAS À PRODUÇÃO DE BIOETANOL
Henrique César Teixeira Veras, João Ricardo M. De Almeida, Gabriel R. Fernandes, Nádia S.
Parachin
Palavras
chave:
Biomassa;
Fermentação
Microaeróbica;
Xilose;
Bioetanol
A biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia renovável utilizada como substrato
para a produção de bioetanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae possui alta capacidade para
consumir carboidratos, como a glicose, presentes nesta matéria prima e convertê-los até etanol.
No entanto essa levedura não é capaz de consumir xilose, o segundo maior açúcar presente
em biomassa. A conversão de xilose até etanol realizada por microrganismos tem potencial
para aumentar em até 40% a produção de etanol de segunda geração. Assim, o objetivo deste
trabalho é investigar a capacidade fermentativa das leveduras Candida tenuis, Scheffersomyces
stipitis, Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum para produção de etanol a partir
de xilose. O metabolismo dessas leveduras naturalmente faz o catabolismo desse carboidrato.
Deste modo, o crescimento e a capacidade fermentativa dessas leveduras foram avaliados em
meio mínimo suplementado com 40g/L de xilose, em condições aeróbica e microaeróbica. As
fermentações foram realizadas em biorreator do tipo Multifors em triplicata. Amostras foram
coletadas para monitoramento do crescimento celular, consumo do substrato e formação de
produtos em intervalos regulares durante a fermentação. Em paralelo, um modelo descritivo das
vias de conversão de xilose a etanol dessas leveduras foi montado utilizando-se de ferramentas de bioinformática, como o banco de dados KEGG e o visualizador de mapas metabólicos
IPATH. Em condição microaeróbica S. stipitis, S. arborariae e S. passalidarum destacaram-se
por apresentar melhor taxa de consumo de xilose (38.234g/L.h ± 0.87, 39.910g/L.h ± 0.39 e
37.498g/L.h ± 0.75 respectivamente), o rendimento de etanol produzido por essas leveduras
também foi maior (0,181g/L.h ± 0.09, 0.440g/L.h ± 0.02 e 0.409g/L.h ± 0.04 respectivamente).
Na condição aeróbica, as leveduras avaliadas apresentaram crescimento duas vezes maior em
relação a condição microaeróbica e demandaram menos tempo (h) para alcançar o crescimento
máximo. Na fermentação em hidrolisado de bagaço de cana de açúcar, as leveduras S. stipitis e S.
passalidarum apresentaram melhor consumo de xilose, a taxa de crescimento e a concentração
de etanol foram semelhantes, no entanto, após o consumo de xilose essa leveduras consomem o
etanol como fonte de carbono. Em geral, observamos que os resultados das fermentações realizadas em hidrolisados são semelhantes aos resultados obtidos em meio mínimo, ressaltando S.
stipitis e S. passalidarum como as melhores fermentadoras de xilose. Baseando-se nos compostos
da via metabólica dessas leveduras, os “EC numbers” das enzimas foram obtidos e utilizados na
montagem da via de conversão de xilose até etanol. Esses resultados, permitiram a modelagem
do metabolismo de xilose nessas leveduras. Adicionalmente, novos alvos moleculares poderão
ser identificados, na tentativa de aperfeiçoar a fermentação de pentoses e aumentar o rendimento
e produtividade de bioetanol.
3.3 Resumos
63
Análise transcriptômica de genes de macrofungos durante a destoxificação em torta
de caroço de algodão
Clemente Batista Soares Neto, Taísa Godoy Gomes, Ana Paula Araújo, Alexandra De Souza,
Glaucia Emy Okida Midorikawa, Gabriel Sérgio Costa Alves, Félix Gonçalves De Siqueira,
Robert Neil Gerard Miller
Palavras chave: Fungos; Cogumelos;Gossipol; Algodão; Expressão de genes; Resíduos Agroindústriais
Fungos como os basidiomicetos podem crescer e frutificar em substratos lignocelulósicos em
função de sua capacidade de produzir enzimas hidrolíticas e oxidativas e as liberar para o meio
extracelular. Resultado disso é a degradação eficiente da lignocelulose. Para cultivá-los, é
possível utilizar diversos subprodutos agroindustriais, como um dos resultados do processamento de algodão, a torta do caroço de algodão. A produção de algodão, por sua vez ocupa a
terceira colocação, como matérias-primas mais usadas entre as cadeias produtoras de biodiesel
no Brasil. Esse resíduo (torta caroço de algodão) é rico em proteínas de qualidade, o que
poderia servir como fonte de alimentação animal. No entanto a presença de um composto
tóxico, o aldeído polifenólico, denominado gossipol, é um fator limitante de sua total utilização,
principalmente em animais monogástricos. De tal maneira, este trabalho objetiva através da
transcriptômica, a busca da identificação dos genes chaves para entendimento dos processos
utilizados por esses macrofungos durante a destoxificação desta biomassa, bem como realizar
análises de expressão diferencial dos genes identificados nos pontos críticos do crescimento do
fungo, entre os selecionados. Foram realizados, cultivo em estado semi-sólido, de diferentes
fungos em torta do caroço de algodão,e avaliados a sua capacidade de crescimento, bem como
atividades enzimáticas, e também diferentes métodos de extração de RNA micelial. Entre os
fungos considerados, a estirpe F-14, alcançou a maior média de crescimento, 8 cm/dia. Durante
a fase de crescimento (30 dias), quantificou-se as atividades enzimáticas, que serão úteis como
parâmetros para determinar os pontos para RNA-seq. No dia 3 já se tem expressão da maior
parte das enzimas quantificadas: MnP 66,46± 3,69 U/mL; Protease 943,08 ± 55,65; Xilanase
5,29 ± 0,11; FPase 0,017± 0,01UI/mL e CMCase 0,79 ± 0,01 UI/mL.Já no 6◦ dia há uma
redução da atividade de protease 701,06 ± 32,61 UI/mL CMCase 0,24 ± 0,005 UI/mL, e um
aumento significativo da expressão de Xilanase 13,15 ± 0,05 UI/mL, e uma maior quantidade de
FPase 0,26± 0,01 UI/mL, sendo que este ponto, com exceção da CMCase, todas alcançaram
os maiores níveis de expressão. Nesses pontos podem estar havendo a expressão de enzimas
envolvidas, tanto na degradação da parede celular vegetal, como na destoxificação do gossipol.
Há uma manutenção das atividades enzimáticas do 6◦ dia até o 30◦ dia, ponto final do cultivo,
com valores muito próximos, para as atividades de Xilanase. Constatou-se também que no 27◦
dia não há mais produção de MnP e CMCase.Foram feitos testes por meio do uso de diversos
protocolos para extração de RNA comerciais ou convencionais: TRIzolr , Brazolr , Concertr
RNA Plant Reagent (Invitrogen) e Método Fenol. A análise de pureza e quantificação de RNA
total foi avaliado em gel de agarose 1 (m/v) e por espectrometria (NanoDrop), e mostraram que o
método de extração por base de TRIzolr foi o mais eficiente para extração do RNA dos pontos
escolhidos, e pode ser útil em extrações de RNA micelial de fungos crescidos no substrato torta
do caroço de algodão.
Capítulo 3. Resumos
64
Interação de ligantes e proteínas de membrana e modulação de canais iônicos
Letícia Stock, Juliana Hosoume, Werner Treptow
Palavras
chave:
canais
iônicos,
ligantes,
anestésicos,
energia
livre
Canais iônicos (CIs) são proteínas transmembrânicas (TM) que delimitam poros hidratados,
conectando meios intra e extracelulares. Fundamentais a uma variedade de fenômenos biológicos,
CIs permitem o fluxo de íons segundo um gradiente eletroquímico e regulam sua condução
via mecanismos genericamente chamados de gating. Tal regulação pode se dar em resposta a
diferentes estímulos, como ligação de moléculas, diferenças de potencial eletrostático e estímulos mecânicos. Mecanismos de gating e condução de CIs podem ainda ser alostericamente
modulados por uma variedade de ligantes, como antidepressivos, anestésicos, neuroprotetores,
etc. O complexo mecanismo de regulação do funcinamento de CIs coaduna com o ajuste fino da
atividade dessas proteínas a sinais moleculares e demandas do organismo. Descrições quantitativas das transições moleculares envolvidas nos mecanismos de gating e condução, e como estas
são afetadas pela presença de ligantes, podem ser melhor compreendidas pela caracterização do
perfil de energia livre associado a tais transições. Dessa forma, em princípio torna-se possível
compreender como a ligação de determinadas moléculas afeta equilíbrios termodinâmicos e
finalmente a função proteica. No entanto, cada vez mais evidências sugerem que a modulação
de CIs é complexa, envolvendo diversos sítios, ocupados por um ou mais ligantes. Ligação
do modulador pode depender ainda do tipo de CI e da conformação em que ele se encontra.
Nesse sentido, um dos objetivos deste trabalho é reorganizar e generalizar o arcabouço teórico
necessário para tratar o problema da ligação de moléculas a CIs e demais proteínas transmembrânicas, bem como avaliar os efeitos funcionais dessa ligação. Dentre as moléculas capazes de
modular CIs, destacam-se os anestésicos. Apesar de seu uso relativamente seguro e bem estabelecido, ainda se desconhece o mecanismo molecular pelo qual a anestesia é produzida. Uma
hipótese bem aceita atualmente sugere que a anestesia é uma propriedade emergente, resultante
da modulação direta e/ou indireta de diferentes receptores proteicos por anestésicos. Diversas
famílias de canais iônicos são sensíveis a diferentes classes anestésicos, apresentando efeitos
como inibição, potencialização e ativação. Em particular, estudos recentes de eletrofisiologia
sugerem que canais iônicos dependentes de voltagem (CIDV), são sensíveis à modulação por
anestésicos gerais em concentrações fisiológicas. A segunda parte deste trabalho visa portanto
empregar o arcabouço teórico desenvolvido (acima) a fim de caracterizar os sítios de ligação
do anestésico geral sevoflurano no CIDV Kv1.2 nas conformações aberta-condutora e fechada.
Resultados preliminares recuperam, pelo menos parcialmente, efeitos de diminuição do limiar
de excitabilidade e aumento da condutância máxima observados em estudos eletrofisiológicos.
3.3 Resumos
65
STRUCTURE OF THE COMPLEX BETWEEN TRYPSIN AND THE PTRY PEPTIDE
João Paulo Campos Fernandes
Palavras
chave:
BTCI;
protease-inhibitor;
crystallographic-structure
Bowman-Birk inhibitors (BBI) are small proteins that have a great number of cysteines in
its sequence. Inhibitors of the BBI family have been described as carcinogenesis suppressing
agents in many organs and tissues. In this work we used peptides derived from a BBI extracted
from Vigna unguiculata called Black-eyed Pea Trypsin/Chymotrypsin Inhibitor (BTCI) for structural studies. The peptides correspond to the two reactive loops of BTCI. These reactive loops are
the regions responsible for blocking the active site of trypsin, mainly Lys26, and chymotrypsin,
primarily Phe53. Based on known PDB structures (2G81 and 3RU4) these loops were used
to define the peptides PTRY and PCHY in such a way as to have circular peptides joined by
disulfide bridges. After synthesis of peptides, crystallization trials have been performed to attain
the complex between PTRY and bovine trypsin and PCHY and chymotrypsin. Crystallization
trials were performed using the sitting drop vapor diffusion method and commercial screening
kits. Crystals were obtained in 8 of the 48 different conditions tested for PTRY9 complex. The
datasets of X-ray diffraction data were collected in MX2 beamline of Brazilian Synchrotron
Light Laboratory with λ = 1.2 Å. The dataset was indexed, integrated, merged and scaled using
iMosflm and HKL2000. The PTRY:trypsin structure solved by molecular replacement (MR)
using the crystallographic structure of trypsin (PDB-4I8H) as search model. The structure refinement was performed using the software CCP4, PHENIX and COOT. The crystals in space group
P212121 with unit cell parameters a=60.39, b=63.97 and c=69.63 Ågave rise to best diffractions,
with a resolution of 1.37 Å. Crystals of the complex between PCHY and chymotrypsin and
crystal between complex PTYP8 and trypsin are ready for data collection and we expect that the
structure will be available for the meeting where both structures shall be presented and discussed.
Capítulo 3. Resumos
66
Construção de cromossomo artificial de Pichia pastoris
Luiza Cesca Piva, Viviane Castelo Branco Reis, Fernando Araripe Gonçalves Torres
Palavras
chave:
Pichia
pastoris,
cromossomo
Recentes avanços na engenharia metabólica, biologia de sistemas e biologia sintética têm
permitido a construção e regulação de vias metabólicas em vários organismos. Estas construções
envolvem várias etapas de manipulação genética e exigem ferramentas avançadas de biologia
sintética. Uma das maiores dificuldades encontradas na manipulação de Pichia pastoris é o limite
de tamanho de DNA heterólogo, o que exige vários eventos de transformação quando se deseja
inserir grandes sequências no genoma. Dessa forma, a criação de novas ferramentas de biologia
sintética garantirá a estabilidade do DNA exógeno. Cromossomos artificiais de levedura (YACs)
são as ferramentas ideais para este objetivo. YACs são muito utilizados em Saccharomyces
cerevisiae, tanto na montagem de grandes fragmentos de DNA quanto na expressão de genes
heterólogos. Estas ferramentas são compostas por dois marcadores de seleção, uma sequência
de replicação autônoma (ARS), duas sequências teloméricas e uma sequência centromérica.
O objetivo deste estudo é a construção do primeiro cromossomo artificial de P. pastoris, o
que aumentaria o potencial de utilização desta levedura como uma plataforma biotecnológica.
Em primeiro lugar, foi construída uma linhagem duplamente auxotrófica para a utilização do
cromossomo artificial, através da deleção dos genes ADE2 e URA5 por meio de recombinação
homóloga. Esta linhagem foi chamada de linhagem LA3. Além disso, uma estirpe ade2 ade3
(LA4) foi construída: o gene ADE3 foi completamente deletado usando a mesma estratégia. Um
vetor replicativo derivado do plasmídeo pPICHOLI (MoBiTec) com o gene ADE3 será usado na
construção de uma biblioteca genômica de P. pastoris. Esta biblioteca permitirá a identificação
de uma sequência centromérica através de ensaios de estabilidade do plasmídeo na linhagem
LA4. Finalmente, o cromossomo artificial será construído com a sequência centromérica obtida
na biblioteca, a sequência ARS1 do plasmídeo pPICHOLI, telômeros e os marcadores de seleção
auxotrófica. A deleção do gene ADE2 foi feita através da substituição do gene pelo marcador de
seleção amdS, enquanto o gene URA5 foi substituído pelo marcador de seleção sh ble. Entre as
deleções, foi realizada a transformação com um plasmídeo contendo a recombinase CreA para
remover a marca de seleção, que foi flanqueada por sítios loxP. Esta linhagem LA3 foi construída
com a finalidade de permitir a utilização de dois marcadores de seleção simultâneos, ADE2 e
URA5. Cromossomos artificiais utillizam duas marcas de seleção pois são compostos por duas
partes (braços), separadas pela sequência exógena clonada. Enquanto isso, a linhagem LA4 (ade2
ade3) permite a identificação de colônias contendo plasmídeos estáveis quando o gene selvagem
ADE3 é utilizado como marca de seleção. Colônias contendo o plasmídeo serão vermelhas,
enquanto colônias que o perderam, serão brancas. Um plasmídeo replicativo contendo este gene
só será estável na levedura se contiver uma sequência centromérica, permitindo-nos identificar
as sequências centroméricas na biblioteca genômica da levedura. Telômeros de P. pastoris são
sequências repetidas que já foram identificadas no genoma da levedura, e serão amplificados e
clonados no plasmídeo replicativo contendo a sequência ARS1, o centrômero e as marcas de
seleção, assim compondo o cromossomo artificial.
3.3 Resumos
67
Produção de hemicelulases recombinantes e sua aplicação na hidrólise do bagaço de
cana-de-açúcar
Lorena Cardoso Cintra, Amanda Gregorim Fernandes, Francieli Colussi, Izadora C. M. De
Oliveira, Fabrícia Paula De Faria, Cirano José Ulhoa
Palavras
chave:
Hemicelulases,
Expressão
heteróloga,
Hidrólise
A lignocelulose é o principal componente da biomassa vegetal, sendo constituída por celulose,
hemicelulose e lignina. A xilana constitui o principal componente da hemicelulose e sua conversão em unidades de xilose requer a ação cooperativa de um complexo (sistema xilanolítico) composto por enzimas como: β -xilosidases (XYLs), endoxilanases (EXL), α-L-arabinofuranosidases
(ABFs), dentre outras. O objetivo do estudo foi a produção de hemicelulases recombinantes
(endoxilanase, β -xilosidase e α-L-arabinofuranosidase) para posterior utilização na hidrólise
da fração de hemicelulose de bagaço de cana de açúcar e de xilanas purificadas. Genes de
α-L-arabinofuranosidase de Penicilium purpurogenum (PpABF3) e β -xilosidase de Humicola
grisea var. thermoidea foram expressos na levedura Pichia pastoris. A enzima ABF3 apresentou
atividade de 0,49 U/mL ± 0,02 e também apresentou atividade de β -xilosidase sendo, portanto,
uma enzima bifuncional. A produção de XYLs e ABFs foi analisada quando o fungo por H.
grisea foi cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos. O melhor indutor da produção de
XYLs foi o bagaço de cana-de-açúcar (BCA) 3% após 120 h de cultivo com atividade total de
0,19 U/mL ± 0,015 seguido por farelo de trigo (FT) 3% após 72 h com 0,047 U/mL ± 0,002. O
melhor indutor de ABFs foi o FT a 3% após 24 h com 0,17 U/mL ± 0,006 seguido de BCA a 3%
com atividade de 0,05 U/mL ± 0,001. Dois genes de XYLs, hxylA e hxylB, foram identificados
no genoma de H. grisea, um com 984 pb e o outro com 1617 pb, respectivamente. Nenhum
íntron e peptídio de sinal foi encontrado e o domínio catalítico de GH43 estava presente em
ambos. A massa molecular predita foi de 37 kDa para HXYLA e 61 kDa para HXYLB. O
cDNA correspondente as duas enzimas foi obtido e utilizado para transformar a levedura Pichia
pastoris. Apenas a enzima HXYLA foi produzida com sucesso pela levedura P. pastoris. Foi
realizada a cinética dos transformantes produtores da enzima HXYLA pela linhagem SMD1168
e a maior atividade obtida por um dos transformantes foi de 0,16 U/mL ± 0,006 após 96 h de
cultivo em meio contendo metanol 1%. Os próximos passos serão a purificação e caracterização
enzimática e aplicação da enzima em testes de hidrólise do BCA pré-tratado por explosão a
vapor, juntamente com as enzimas ABF3 e HXYN2 (endoxilanase recombinante de H. grisea).
Capítulo 3. Resumos
68
PERFIL QUÍMICO DE PEPTÍDEOS BIOATIVOS DE Hypsiboas boans EM PERÍODOS REPRODUTIVOS E NÃO REPRODUTIVOS
Beatriz Blenda Pinheiro De Souza, José De Lima Cardozo Filho, Maura Vianna Prates, Carlos
Bloch Jr
Palavras
chave:
Peptídeos
bioativos,
Anuros,
Hypsiboas
boans
A história natural dos anfíbios é marcada por diversas adaptações comportamentais, fisiológicas
e morfológicas muito particulares se considerada a natureza ambivalente do grupo, transitando
por ambientes aquáticos e terrestres ao longo da evolução. Ante as hostilidades naturais dos
contextos biológicos nos quais estão inseridos, os anfíbios dispõem de um peculiar sistema
defensivo fomentado por um sistema glandular responsável pela elaboração e liberação de uma
complexa mistura química dotada de largo espectro farmacológico. Os peptídeos constituintes
da secreção de anuros foram, e ainda o são, objeto de exaustiva investigação devido às potenciais
atividades biológicas de que são dotados. Os peptídeos são considerados como um dos principais
fatores de sucesso evolutivo do grupo e podem funcionar como protetores iniciais na defesa dos
anfíbios, por exemplo, em virtude das suas características químico-sensoriais, sugerindo o papel
de alguns peptídeos nas estratégias defensivas dos anfíbios contra predadores. A vulnerabilidade
dos anuros aos seus predadores é reconhecidamente maior durante os períodos reprodutivos,
posto que a estratégia fundamental utilizada pelos machos para atrair uma fêmea para posterior
reprodução é a vocalização, mecanismo que não atrai somente as fêmeas, mas também seus
predadores. Sob essa perspectiva, o período não reprodutivo pode ser considerado menos adverso
aos espécimes. A literatura ao ilustrar os reduzidos níveis de expressão de um grande número de
peptídeos sob condições pouco estressantes. Elucubra-se, portanto, a existência de mecanismos
de regulação metabólica relacionados à reprodução que determinem as expensas energéticas
investidas em síntese protéica. As premissas apresentadas conduziram à hipótese tal como segue:
o perfil de peptídeos expressos na pele de Hypsiboas boans durante o período reprodutivo é
distinto daquele verificado na fase não reprodutiva. Segundo a literatura, o período reprodutivo se dá apenas na estação seca, a qual compreende, no Amazonas, o período entre julho e
dezembro. Contudo, conforme nossas observações durante as atividades de campo, espécimes
de H. boans podem ser flagrados em quaisquer das estações ao longo do ano. Considera-se,
portanto, viável a captura de animais ao longo de um ciclo anual completo para que, mediante as
devidas metodologias, o teste da hipótese seja exequível. Diante do exposto, o objetivo geral
desta pesquisa é isolar, identificar e caracterizar peptídeos da secreção cutânea de Hypsiboas
boans durante um ciclo anual, compreendendo períodos reprodutivos e não reprodutivos, para
fins comparativos. E para tal, serão realizadas as metodologias a seguir: i) Isolamento e caracterização dos peptídeos da secreção cutânea de H. boans, por meio de técnicas cromatográficas
e por espectrometria de massa. ii) Análise da distribuição dos peptídeos na pele dos animais
por imagem por espectrometria de massa (MALDI imaging); iii) Sequenciamento dos genes
codificadores dos peptídeos da secreção de H. boans por meio da construção de bibliotecas de
cDNA; iv) Avaliação dos níveis de transcrição dos precursores codificantes dos peptídeos da
secreção de H. boans por meio de PCR em tempo real. Para início destas atividades, estamos
aguardando o parecer da comissão de ética em uso animal, imprescindível para obtenção das
amostras deste estudo.
3.3 Resumos
69
Metabolic engineering of Kluyveromyces lactis for hyaluronic acid over-production
Antonio Milton Vieira Gomes
Palavras
chave:
Hyaluronic
acid;
Metabolic
Enginnering
Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan polymer found in every human body and is
especially abundant in the connective tissue. It is a polysaccharide formed of repeating units of
disaccharides N-acetyl-D-glucosamine and glucuronic acid linked by glycosidic bonds β -(14)
and β (13). Currently, this biopolymer is recognized as a compound of high added value and
has numerous applications in the biomedical and cosmetic areas. The current production of
hyaluronic acid is made by extraction of crest of the rooster, with little microbial production
almost all done by bacteria hosts. Only Pichia pastoris has been utilized as a yeast host for HA
production obtaining a productivity of 1.6 g/L and a molecule with a molecular weight of 2.5
MDa. However, the chains with high weight obtained low yield and low weight chains obtained
high yield. In order to obtain other sources of HA the present project aim at modifying the
metabolism of the yeast Kluyvermoyces lactis for the production of this polymer inserting into
the yeast genome two genes required for hyaluronic acid synthesis. Furthermore, another gene
will be integrated into the yeast genome to increase the expression levels of an enzyme already
existing in the metabolism of the yeast. K. lactis is a yeast well elucidated genetically, has a
status GRAS (Generally Recognized as Safe), is well utilized for genetic engineering and is one
of the main organisms grown in fermenter industry to produce molecules such as chymosin and
lactic acid.
Capítulo 3. Resumos
70
Variação natural de folato em sementes de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.]
e sua correlação com a expressão do gene Vugch1 (GTP ciclohydrolase I )
Cristina Pimentel Do Nascimento, Francisco José Lima Aragão
Palavras chave:
Folato,
Feijão Caupi,
gene Vugch1,
GTP ciclohydrolase I
O feijão caupi é uma leguminosa que pode ser consumida na forma de vagens, grãos secos,
grãos verdes ou frescos, farinha para acarajé, além de outras formas de preparo, sendo possível
produzir um cardápio variável. No Brasil é considerado uma das espécies alimentares mais
cultivadas no norte e nordeste, onde é também mais consumido, tendo uma grande importância
socioeconômica. Constituindo-se um dos mais importantes componentes da dieta alimentar
proteica e energética das populações rurais dessas regiões. Essa leguminosa é uma fonte de folato
uma vitamina pertencente ao grupo vitaminas hidrossolúveis do complexo B9. O termo folato é
usado para referir-se aos folatos naturais das plantas e ácidos fólicos a todas as formas sintéticas
ou suplementadas que não estão presentes naturalmente nos alimentos. É uma molécula formada
por três grupos funcionais: pterina, ácido para-aminobenzoico (pABA) e de um a oito resíduos
de gluatamato. Em plantas, o resíduo de pterina, hidroximetildihidropteroato (HMDP) é formado
a partir de GTP no citosol enquanto o precursor de pABA é sintetizado no cloroplasto, ambos
irão se unir na mitocôndria ocorrendo subsequentes condensação, glutamilação e redução para
a síntese de tetrahidrofolato. O objetivo do presente trabalho foi a quantificação do teor de
folato em 50 cultivares de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], tanto em variedades
tradicionais quanto em cultivares geradas nos programas de melhoramento. Para os experimentos
foi utilizado o kit da vita fast especifico para a quantificação do teor de folato. Com as analises
constatou-se que houve uma variação no teor de folato nas 50 cultivares entre 177 à 780 µg/100g.
Posteriormente mais análises serão realizadas.
3.3 Resumos
71
Characterization of scorpion-venom derived antimicrobial with antifungal activity against
Cryptococcus neoformans
Fernanda Guilhelmelli Costa, Nathália Vilela, Lorena S. Derengowski, Márcia R. Mortari,
Elisabeth F. Schwartz, Patrícia Albuquerque, Ildinete Silva-pereira
Palavras
chave:
antimicrobial,
peptides,
antifungal,
scorpion-venom
The rising number of immunocompromised individuals is leading to an increase in the incidence of systemic mycoses. This scenario is aggravated by the advent of resistant strains to
available antifungal agents. Thus, the search for new, more efficient and less toxic drugs is
of great urgency. In this sense, the study of antimicrobial peptides (AMPs), multifunctional
molecules with both microbicidal activity and immunomodulatory properties, is promising.
These peptides are evolutionarily conserved in diverse groups of organisms. In venomous animals, the expression of several AMPs has been described in the venom glands which are therefore
an interesting source in the search for new microbicide molecules. The present work aimed to
evaluate the antifungal activity of scorpion-venom derived AMPs against the human pathogenic
fungus Cryptococcus neoformans, an encapsulated yeast responsible for more than 600 thousand
deaths per year worldwide. Seven peptides inhibited the growth of C. neoformans H99 and C.
neoformans B3501 strains. B3501 strain showed lower inhibitory values when compared to the
H99 strain. Interestingly, yeast cells with larger capsule were more susceptible to the inhibitory
activity of the tested AMPs. Fungal melanized cells also showed higher susceptibility compared
to non-melanized cells. Capsule induction assays in the presence of AMP6, the most potent
peptide in our analyses, revealed a significant decrease in capsule size in the presence of this
molecule. Additionally, scanning and transmission electron microscopy of C. neoformans cells
incubated with AMP6 demonstrated severe deleterious defects in fungal structure in comparison
with untreated cells. Our results demonstrated that AMPs are promising antifungal compounds.
Further characterization of the molecular mechanisms involved in their antifungal activity as well
as in vivo studies are essential to establish their true potential in our search for better antifungal
therapy options.
Capítulo 3. Resumos
72
Caracterização do Curso de Estabelecimento da Fibrose Pulmonar em Modelo Murino
Induzida por Bleomicina
Karina Smidt Simon, Anamélia L. Bocca
Palavras chave: Fibrose pulmonar; Desenvolvimento e estabelecimento da doença; TNF−α;
reação
inflamatória
A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma sequela de um grupo heterogêneo de doenças pulmonares, estando fortemente relacionadas com pneumoconioses, drogas, infecções, doenças
auto-imunes e pneumonias de hipersensibilidade. Sua principal característica é a alteração
funcional pulmonar com a limitação progressiva da oxigenação do sangue. As manifestações
clínicas são proporcionais à extensão da fibrose e à sua evolução. Usualmente, os portadores
desta patologia apresentam dificuldade respiratória progressiva, além de uma série de outros
sintomas decorrentes da insuficiência respiratória. Do ponto de vista morfológico, observa-se a
substituição do padrão alveolar por depósitos de matriz de colágeno. Com isto, a barreira alveolar
perde a capacidade de proceder as trocas gasosas fundamentais para manter as necessidades de
oxigenação dos tecidos. O curso dessa doença é geralmente lento, possuindo, normalmente, uma
fase inicial silenciosa e, quando as manifestações clínicas determinam a procura de ajuda médica
e o diagnóstico estabelecido, verifica-se um quadro avançado que compromete a qualidade de
vida do paciente e determina uma baixa sobrevida (de 3 a 5 anos). Com esse caráter evolutivo, a
fibrose pulmonar determina uma importante alteração funcional, que a caracteriza como uma
doença grave, de evolução crônica, incapacitante e que, até o presente, não apresenta cura. O processo do estabelecimento da fibrose pulmonar está correlacionado com condições inflamatórias
pré-existentes. Biópsias e soro de pacientes com FPI mostram níveis elevados de TNF-α (uma
citocina pró-inflamatória), enquanto camundongos que tem a expressão dessa proteína aumentada
no pulmão desenvolvem fibrose pulmonar progressiva. É a inflamação juntamente com seus
mecanismos imunes que levam ao dano tecidual. Após o dano, inicia-se o processo de reparo.
Este permite a substituição ordenada de células danificadas ou mortas após a reação inflamatória.
Quando o processo de destruição ocorre em taxa superior àquela da substituição, o organismo
não mais empregará os mecanismos regenerativos e sim os reparativos, desenvolvendo uma
cicatriz fibrótica permanente. Macrófagos e muitos outros tipos celulares produzem TNF no
pulmão após exposição à sílica, amianto e bleomicina. Dessa forma, a bleomicina pode ser
utilizada para a indução de fibrose pulmonar em animais experimentais. Portanto, utilizou-se
dessa droga para a indução da doença em camundongos e observou-se por meio de análises
histopatológicas a progressão do processo que leva à fibrose pulmonar nesses animais, com o
intuito de caracterizar o tempo necessário para a cronicidade da doença. Os pontos considerados
de maior importância, em dias, para esse trabalho foram: 5 (observa-se vaso congestão), 10
(observa-se também edema intra-alveolar), 15 (quando já observa-se fibrose focal) e 30 dias após
o tratamento, quando já é possível caracterizar como uma fibrose pulmonar estabelecida. A partir
dessa caracterização, experimentos com o intuito de elucidar os mecanismos etiopatogenéticos
dessa doença podem ser realizados, uma vez que temos caracterizados os tempos de início do
desenvolvimento da doença e seu estabelecimento.
3.3 Resumos
73
Cultivo e Caracterização de membros do domínio Archaea a partir de sedimentos
lacustres do Cerrado
Deborah Vasconcellos Ambrósio, Thiago Rodrigues De Oliveira, Ricardo Henrique Kruger,
Cynthia Maria Kyaw
Palavras
chave:
Archaea
Cultivo
Cerrado
Sedimento
O avanço das técnicas de Biologia Molecular mostrou uma nova maneira de estudar os organismos, em especial os procariotos. A classificação dos três domínios, proposta por Woese e
colaboradores em 1990, revelou a importância do domínio Archaea e desde então, vários trabalhos têm sido realizados a fim de melhor entender este grupo. Os primeiros trabalhos descreveram
o domínio Archaea como organismos com fenótipos que viviam somente em ambientes extremos, hoje sabe-se que as archaeas possuem uma ampla diversidade e distribuição no nosso
planeta, sendo importantes para vários processos ecológicos incluindo a ciclagem do Carbono
e Nitrogênio. A maior parte do conhecimento deste domínio, incluindo a sua diversidade no
bioma Cerrado, está descrita apenas por métodos independentes de cultivo devido a grande
dificuldade de obtenção de culturas em laboratório. Tendo em vista um melhor entendimento
sobre o metabolismo e funções desses organismos, este trabalho propõe o cultivo em laboratório
e posterior caracterização de archaeas mesófilas do Cerrado a partir de sedimentos de um córrego
da reserva ecológica do IBGE localizada em Brasília-DF. Os micro-organismos foram cultivados
em meios sólido e líquido, confeccionados a partir da mistura de água e sedimentos deste córrego.
A mistura foi adicionada de cloreto de amônio, para favorecer o crescimento de oxidantes de
amônia, e de agentes antimicrobianos adequados. As amostras foram incubadas em estufa a
28 oC e analisadas semanalmente quanto ao crescimento, sendo realizados repiques quando
necessário. As colônias obtidas em meio sólido tiveram seu DNA extraído e submetidos a
ensaios de PCR com iniciadores específicos para o gene que codificam o rRNA 16S de Archaea
e Bacteria e o gene amoA de Archaea. Foram amplificados fragmentos com todos os iniciadores.
Os amplicons foram então sequenciados e o resultado revelou um co-cultivo entre archaeas
oxidantes de amônia pertencentes ao filo Thaumarqueota e bactérias de 4 gêneros diferentes,
pertencentes as famílias Brucellaceae e Burkholderiaceae. Um ano depois, uma nova extração de
DNA foi realizada a fim de se confirmar a existência do co-cultivo, foram realizados ensaios de
PCR com iniciadores que codificam o gene 16S de Archaea e Bacteria. Os amplicons de 16S
bactéria foram sequenciados diretamente e os resultados confirmaram os resultados anteriores,
não havendo mudanças nas sequências. Os amplicons de 16S de Archaea foram clonados e o
DNA plasmidial extraído e enviado para sequenciamento. Até o momento foi obtido apenas
sequências da amostra nomeada placa 4, que indicou a presença de uma archaea pertencente ao
grupo Miscelaneous Crenarcheotic Group (MCG). As análises das sequências obtidas das outras
amostras estão sendo realizadas, assim como análises morfológicas a fim de se caracterizar as
archaeas obitidas neste co-cultivo. Ainda não foi possível analisar as culturas em meio líquido
devido à dificuldade de se estabelecer o crescimento destes organismos neste modelo de cultivo.
74
Capítulo 3. Resumos
Tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-de-açúcar: uma ferramenta para produção de licores e sua utilização na produção de xilanases por Aspergillus foetidus
Caio De Oliveira Gorgulho Silva, Bárbara C. Newmann, Edivaldo Ximenes F. Filho
Palavras chave: Resíduos agroindustriais; tratamento hidrotérmico; fungos filamentosos; hemicelulases
Tratamentos hidrotérmicos de lignocelulose são capazes de solubilizar parte da porção hemicelulósica
presente na biomassa, gerando um sedimento sólido mais rico em celulose e lignina. O tratamento
hidrotérmico de bagaço de cana-de-açúcar (BCA) é estudado neste trabalho como uma forma
de gerar líquidos (licores) ricos em produtos de hidrólise de hemicelulose capazes de induzir
a produção de hemicelulases quando usados como fonte de carbono solúvel para cultivo de
Aspergillus foetidus. O efeito da temperatura, do tempo e da concentração de BCA empregados
no tratamento hidrotérmico sobre as atividades de xilanase e arabinofuranosidase produzidas por
A. foetidus foram investigados por meio de planejamento fatorial. O uso de baixa concentração
de biomassa (1% m/m) no tratamento foi suficiente para que o licor resultante induzisse alta produção de xilanases. Para uma alta produção de arabinofuranosidases, entretanto, concentrações
maiores de biomassa (9% m/m) foram necessárias. Licores obtidos em tratamentos de baixa
severidade (log Ro < 3,0) induziram menores níveis de atividade de xilanase e arabinofuranosidase, enquanto que altas severidades (log Ro > 4,11), principalmente quando foram utilizadas
altas concentrações de biomassa, geraram licores tóxicos ao crescimento de A. foetidus. Em
condições severas (temperatura e tempo maiores), a formação de produtos de degradação de
carboidratos (furfural, hidroximetilfurfural) e de lignina (compostos fenólicos), e a liberação de
ácidos orgânicos advindos da hemicelulose (principalmente ácido acético) provavelmente foram
os responsáveis pela inibição do crescimento microbiano. Licores gerados em tratamentos de
severidade intermediária (3,0 < log Ro < 3,87) foram os mais adequados para alta produção de
enzimas. Uma ampla caracterização dos licores quanto à concentração de açúcares redutores,
pentoses, glicose e compostos fenólicos, além da identificação de produtos da hidrotermólise
do BCA por abordagem de metabolômica untargeted (espectrometria de massas por infusão
direta), também foram realizados. O aumento na temperatura, no tempo e na concentração de
BCA empregados no tratamento levaram ao aumento na concentração de açúcares redutores,
pentoses e compostos fenólicos presentes nos licores. Sob altas severidades (Log Ro > 4,77),
entretanto, o rendimento de açúcares diminuiu, provavelmente devido à formação de furanos.
Diversos produtos de hidrólise de arabinoxilana e lignina foram identificados nos licores através
espectrometria de massas, incluindo xilose, xilooligômeros com diferentes graus de polimerização e acetilação, feruloil-arabinofuranosil, p-cumaroil-arabinofuranosil, além de diversos
compostos fenólicos advindos das ligninas do tipo guaiacil, siringil e p-hidroxifenil. Tratamentos
mais brandos foram caracterizados pela maior presença de sacarose e polióis (xilitol, sorbitol,
manitol), enquando tratamentos mais severos ficaram associados à presença de xilooligômeros
acetilados e compostos fenólicos.
3.3 Resumos
75
Avaliação do papel de microRNAs regulatórios na resposta imune inata à infecção por
Paracoccidioides brasiliensis
Marco Antônio De Oliveira, Lorena Da Silveira Derengowski, Daniel Paiva Agustinho, Ildinete
Silva Pereira
Palavras chave: microRNA, Paracoccidioides brasiliensis, imunidade inata, macrófagos
Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos envolvidos sofrem
uma ampla reprogramação genética, o que tem sido mostrado ser crucial para o estabelecimento
da patogenia. Dentre os inúmeros genes com expressão alterada no hospedeiro encontramse aqueles que codificam microRNAs (miRNAs), um grupo de pequenas moléculas de RNA
regulatórias atuante nos mais diversos processos celulares, incluindo a regulação de respostas
inflamatórias. Embora vários trabalhos venham mostrando a importância dos miRNAs na resposta imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do papel
desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar o papel de miRNAs
na resposta imune inata de hospedeiros murinos à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de
maior prevalência na América Latina. Os ensaios de infecção foram realizados utilizando-se
macrófagos peritoneais murinos da linhagem A/J, modelo estabelecido de resistência à PCM, e
leveduras do isolado Pb18 de P. brasiliensis. Células hospedeiras foram cultivadas por 6 horas
em presença ou ausência de leveduras na proporção 2:1 (macrófagos:leveduras). Após esse
período de interação, o sobrenadante das culturas foi coletado para dosagem de citocinas por
meio de ELISA e o RNA dos macrófagos foi extraído para avaliação da variação dos níveis de
transcritos de cinco miRNAs (125b, 132, 146a, 155 e 455) por RT-qPCR. Os níveis de pri-miR
155 e pre-miR 155, moléculas precursoras desse miRNA maduro, também foram avaliados com
o objetivo de analisar o efeito da infecção sobre diferentes etapas no processo de biogênese do
miRNA. Todos os miRNAs avaliados mostraram um aumento no acúmulo de transcritos em
resposta à infecção fúngica por P. brasiliensis, sugerindo assim, pela primeira vez, a participação
de miRNAs na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata à P. brasiliensis. Para
permitir o estudo das implicações funcionais de miRNAs na resposta imunológica estão sendo
realizados ensaios de perda de função por meio da utilização de inibidores de microRNAs (antimiRs). A validação e a padronização do modelo foram realizadas utilizando-se, para avaliação
de eficiência de transfecção, sondas inibidoras marcadas com fluoróforo e, para verificação da
atividade das sondas, RT-qPCR de um alvo do miRNA inibido. Dada a importância já descrita na
regulação da resposta imune a diferentes patógenos e com base nos resultados por nós obtidos,
será dado um enfoque no estudo do papel funcional do miRNA mir-155 na resposta imune inata
à Paracoccidiodomicose.
Capítulo 3. Resumos
76
Avaliação da atividade anti-inflamatória de derivados de derivados de imidazopiridinas em modelos murinos in vitro e in vivo
José Antonio Fagundes Assumpção
Palavras
chave:
inflamação,
imidazopiridinas,
tnf−α
Inflamação é o nome dado à resposta fisiológica a determinados estímulos, como infecções ou
dano celular. Geralmente tal resposta envolve células imunes e mediados moleculares conhecidos
como citocinas. Seu propósito é eliminar a causa inicial da resposta e dar início ao reparo tecidual. O balanço do processo inflamatório é de extrema importância na resposta. Uma resposta
inflamatória muito branda pode levar a danos progressivos e até mesmo comprometer o funcionamento normal de tecidos. Quadros inflamatórios prolongados, ou crônicos, porém, também
podem ser a causa de diversas doenças, como periodontites, aterosclerose, artrite reumatoide e
até mesmo câncer. Uma das principais citocinas envolvidas no processo inflamatório é a TNF−α.
Sua principal função é a regulação de células imunes, geralmente atuando como imunoestimulante. TNF−α promove a resposta inflamatória e, quando desregulada pode ser responsável
por diversas condições patológicas, como as descritas acima. Um dos principais tratamentos à
resposta inflamatória exacerbada é feito com o uso de inibidores de TNF−α. Para tal, geralmente
são utilizados anticorpos monoclonais, cuja relação custo/benefício não é favorável. Tal fato
gera uma grande demanda por novos métodos de tratamento, especialmente utilizando moléculas
ou compostos com menor custo e maior eficiência. Diante de tal quadro, derivados de imidazopiridinas (IMPs) têm sido identificados como potenciais agentes anti-inflamatórios, atuando
principalmente na inibição de TNF−α e, consequentemente, reduzindo a atividade inflamatória
de células imunes. Assim sendo, foram sintetizados 15 derivados de IMPs com o objetivo de
serem testados in vitro e in vivo para atividade inibitória de TNF−α. O objetivo do trabalho é
verificar a ação de tais derivados quanto à resposta inflamatória, juntamente com a elucidação de
quais vias intracelulares da produção de TNF−α são alteradas pela ação de imidazopiridinas.
Alguns compostos sintetizados também apresentam características fluorescentes, permitindo
o acompanhamento da metabolização dos mesmos, por exemplo, por microscopia confocal,
fornecendo pistas sobre sua ação. Ao fim do trabalho, espera-se que os resultados obtidos
forneçam a compreensão de como derivados de IMPs influenciam na resposta inflamatória,
abrindo horizontes ainda maiores para estudos sobre a arquitetura de tais moléculas e para o
desenvolvimento de compostos promissores para o tratamento de patologias envolvendo quadros
de inflamação crônica.
3.3 Resumos
77
SELEÇÃO E ANÁLISE MOLECULAR DE ESTIRPES DE Bacillus thuringiensis
PARA CONTROLE DO BICUDO DO ALGODOEIRO
Fernanda Guimarães Bernardes, Rayane Cecília Ramalho Rodrigues, Raul Azevedo Holanda ,
Érica Soares Martins, Paulo Roberto Queiroz, Barbara Eckstein, Rose Gomes Monnerat
Palavras chave:
Bicudo do algodoeiro,
Bacillus thuringiensis,
genes cry.
O bicudo do algodoeiro [Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae)] é a principal praga
do algodão no Brasil, sendo responsável por elevados prejuízos a essa cultura. Alguns hábitos
do inseto como a oviposição e o desenvolvimento larvário dentro dos botões florais o tornam
uma praga de difícil controle, o qual é feito basicamente por inseticidas em grandes quantidades.
Uma alternativa para o controle do bicudo é a transgenia utilizando toxinas produzidas pela
bactéria Bacillus thuringiensis, conhecidas como δ -endotoxinas ou proteínas Cry e Cyt que são
produzidas durante a fase de esporulação bacteriana. O objetivo deste trabalho foi selecionar
estirpes de B. thuringiensis tóxicas ao bicudo do algodoeiro e fazer a análise molecular destas estirpes através da identificação da sua composição gênica e da avaliação da atividade das proteínas
expressas pelos genes encontrados. Primeiramente, cem estirpes de B. thuringiensis provenientes
da Coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia foram
testadas contra o bicudo do algodoeiro por meio de bioensaio seletivo. Dentre as estirpes testadas,
duas foram as que apresentaram toxicidade acima de 80% para o bicudo. Essas duas estirpes
são também tóxicas a insetos da ordem Lepidoptera e, assim, já tinham a sua caracterização
molecular descrita, sendo ambas compostas por genes cry. Devido à importância de tais estirpes
para o controle de mais de uma ordem de insetos praga, o sequenciamento total do genoma
bacteriano das mesmas está sendo realizado, visando identificar genes candidatos para uso
futuro no controle de A. grandis. O controle do bicudo exige o emprego de diversas estratégias
em conjunto para reduzir os danos causados por este inseto, portanto, é muito importante a
identificação e a caracterização de estirpes de B. thuringiensis que possam vir a contribuir no
manejo desta praga.
Capítulo 3. Resumos
78
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MITOCONDRIAL EM RESPOSTA AOS ESTÍMULOS
PIROGÊNICOS LPS E PGE2
Marina Firmino Lima De Oliveira, Simone N. Weis, Letícia F. Pettenuzzo, Camila Lazzaretti,
Wlyana R. Praça, Carlos Alexandre Netto, Fabiane H. Veiga De Souza, Marcelo Valle De Sousa
Palavras
chave:
febre,
mitocôndrias,
UCPs
Introdução: A febre é um dos componentes da resposta de fase aguda que ocorre durante
processos infecciosos e inflamatórios. A área pré-óptica do hipotálamo anterior (APOHA) é
responsável pela regulação da temperatura corporal e comunica-se com áreas efetoras, desencadeando os mecanismos termorregulatórios apropriados para aumentar ou diminuir a temperatura
corporal. Objetivo: Uma vez que as mitocôndrias são as organelas responsáveis pela produção
de calor no organismo, o objetivo do estudo foi investigar se as mitocôndrias estariam envolvidas nos processos de sinalização da resposta febril induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e
Prostaglandina E2 (PGE2) no hipotálamo e hipocampo. Metodologia: Foram utilizados ratos
Wistar machos (180 a 200g/peso corporal), com aproximadamente 60 dias de vida (CEUA,
UnBDoc no 30652/2014). Os animais (n=6/grupo) foram submetidos ao procedimento cirúrgico
para implantação de transmissores de temperatura na cavidade peritoneal e de cânulas no ventrículo lateral direito. Após uma semana de recuperação, os animais receberam injeções i.c.v.
de PGE2 (100 ng/rato) ou i.v. de LPS (5 µg/Kg). Os animais controle foram submetidos aos
mesmos procedimentos cirúrgicos e receberam injeções i.v. e i.c.v. de solução salina (0,9%)
ou veículo, respectivamente. No tempo correspondente ao pico da resposta febril induzida por
cada estímulo (30 min para PGE2 e 150 min para LPS), os animais foram eutanasiados para
obtenção dos hipotálamos e hipocampos. As amostras foram marcadas com MitoTracker Red
(MTR) para inferir a integridade do potencial de membrana mitocondrial (∆ψ) e MitoTracker
Green (MTG) para avaliar a massa mitocondrial e analisados por citometria de fluxo. Resultados:
A PGE2 reduziu tanto a massa (PGE2: 74,08±25,85 versus veículo: 91,92±24,76) quanto o
∆ψ mitocondrial (PGE2: 87,62±30,91 versus veículo:111,88±31,83) no hipotálamo. Nenhuma
alteração foi observada no hipocampo. Diferentemente, o LPS no hipotálamo aumentou o ∆ψ
(16,12±3,62) comparado ao controle (11,06±1,59) sem alterar a massa mitocondrial (Salina:
10,60±1,67 versus LPS: 13,13±2,85). Não houve alteração mitocondrial no hipocampo pelo
LPS. Conclusão: A diminuição tanto da massa quanto do ∆ψ pela PGE2 no hipotálamo indica
uma diminuição geral do número de mitocôndrias intracelulares sugerindo um possível efeito
tóxico direto sobre as mitocôndrias. O aumento do ∆ψ induzido pelo LPS no hipotálamo pode
ser explicado por um possível desacoplamento parcial entre a cadeia transportadora de elétrons e
a síntese de adenosina trifosfato (ATP). As proteínas desacopladoras (UCPs) presentes na matriz
mitocondrial poderiam estar desviando parte da energia da oxidação para a conservação de
calor, induzindo um aumento no fluxo através dos complexos mitocondriais, aumentando assim
o ∆ψ a fim de manter tanto a produção de ATP quanto de calor, contribuindo para gênese da
resposta febril. Estes dados demonstram o envolvimento direto das mitocôndrias do hipotálamo
na resposta febril. Mais experimentos estão em curso para elucidar os mecanismos moleculares
envolvidos nesta resposta fisiológica.
3.3 Resumos
79
Análise do Transcritoma de Helicoverpa armigera (lepidoptera: noctuidae): avaliação
de genes potenciais para o controle do inseto por silenciamento gênico
Hudson Fernando Nunes Moura , José Dijair Antonino De Souza Júnior, Fabrício Barbosa
Monteiro Arraes, Roberta Ramos Coelho, Maria Fátima Grossi-de-sá
Palavras
chave:
Transcritoma;
H.
armigera;
silenciamento
gênico
O inseto H. armigera tem se alastrado amplamente atacando diversas culturas no Brasil, causando danos principalmente em lavouras de soja, algodão e feijão, podendo se alimentar tanto
das partes vegetativas quanto das estruturas reprodutivas das plantas. Esse contexto ressalta a
importância do desenvolvimento de estratégias de controle que atuem em longo prazo, embasadas
em conhecimentos relacionados à biologia molecular do inseto-alvo que podem ser obtidos, por
exemplo, utilizando a abordagem transcritômica. Este trabalho tem como objetivo a análise do
transcritoma do inseto H. armigera em busca de genes essenciais que possam ser usados como
estratégias promissoras no controle deste inseto utilizando RNA interferente. Para a obtenção
do transcritoma, insetos em fase larval (na fase de ovos pré-eclosão) foram alimentados com
folhas de soja (Glycine max), algodão (Gossypium hirsutum) e tabaco (Nicotianna benthamiana).
O RNA total de larvas de terceiro ínstar de desenvolvimento foi extraído utilizando o reagente
TRIZOL . Após etapa de limpeza em coluna do kit RNeasy Micro Kit (QIAGEN) e verificação
da qualidade em gel de agarose, a concentração de RNA foi determinada em um fluorômetro
Qubit, utilizando o kit Quant-iT RNA assay (Invitrogen Life Technologies). Em seguida, os
RNAs de cada tratamento, separadamente e em pool equimolar, foram enviados para síntese
de cDNA e sequenciamento para a empresa Eurofins MWG Operon, em Huntsville, AL, USA.
Uma análise prévia da biblioteca referência do transcritoma de H. armigera grandis revelou
mais de 112.000.000 reads e um conjunto de 129.687 contigs de alta qualidade. Atualmente, o
trabalho prossegue com a anotação dos contigs e escolha dos genes alvos para silenciamento. A
análise do transcritoma deste inseto, aliada à validação funcional de moléculas essenciais para a
sobrevivência do inseto, por meio de estratégias de silenciamento, são alternativas promissoras
para o estudo dos mecanismos fisiológicos relacionados ao desenvolvimento do organismo-alvo,
além de fornecer informações visando o desenvolvimento de métodos de controle biotecnológico.
Capítulo 3. Resumos
80
Produção e Caracterização de coquetéis enzimáticos de fungos filamentosos
Andreza De Mello Lopes, Leonora Rios De Souza Moreira, Edivaldo Ximenes Ferreira Filho
Palavras
chave:
hidrólise,
enzimas,
biodiversidade
O uso de enzimas vem se tornando cada vez mais frequente nas indústrias, sendo empregadas
para os mais diversos fins. Os resíduos agrícolas representam uma importante fonte para o
crescimento microbiano, produção de enzimas, além de ser matéria prima para a produção de
etanol de segunda geração. Indubitavelmente, a aplicação das enzimas holocelulolíticas na
bioconversão de biomassa lignocelulósica tem elevado o mercado de enzimas, principalmente
se o etanol lignocelulósico tornar-se economicamente viável. Fungos filamentosos do gênero
Aspergillus e Trichoderma já tem suas enzimas utilizadas em preparados comerciais. Mas,
o estudo e aprimoramento são extremamente importantes na tentativa de produzir coquetéis
multi-enzimáticos que atuem sinergicamente, auxiliando na redução dos custos e na otimização
dos bioprocessos. Diante disso, o objetivo deste trabalho é definir quais as enzimas e suas
proporções, bem como a otimização de coquetéis enzimáticos que resultem em misturas mais
eficientes e menos onerosas. Na tentativa de avaliar o potencial de enzimas fúngicas foram
selecionados 4 fungos (Aspergillus terreus, Aspergillus orizae, Acrophiaphora nainiana, Trichoderma reesei) e 4 fontes de carbono (Palha de milho, palha de cana, bagaço de cana e casca de
soja). Após fermentação submersa por 7 dias em meio mínimo, o sobrenadante foi caracterizado
quanto a capacidade de degradar substratos bem como as amostras foram caracterizadas quanto
ao pH e temperatura ótima e termoestabilidade. Teve destaque as enzimas apresentadas por
Trichoderma reesei em casca de soja (beta-manosidase e pectinase), Aspergillus terreus em
palha de cana (beta-xilosidase e beta-glucosidase) e em bagaço de cana (endoglucanase, FPase,
xilanase). Ambos apresentaram pH ótimo variando de 4,5 a 6; temperatura ótima entre 40 a 60oC
e apresentarem-se termoestáveis. Esses extratos serão selecionados para formulação de coquetéis
enzimáticos através de método estatístico de mistura simplex. Espera-se obter um coquetel
otimizado com alto grau de sinergismo enzimático que possa ser futuramente empregado na
obtenção de novos produtos, como para conversão eficiente da biomassa lignocelulolítica para
fins energéticos.
3.3 Resumos
81
ESTUDO DAS IMPLICAÇÕES DO REPARO DE DNA NA VIRULÊNCIA E ADAPTAÇÃO DE Cryptococcus neoformans.
Rayssa Karla De Medeiros Oliveira, Larissa Fernandes, Ildinete Silva-pereira
Palavras
chave:
Cryptococcus
neoformans;
reparo
de
DNA;
virulência
O fungo Cryptococcus neoformans (Cn) é um basidiomiceto de distribuição mundial que pode
infectar humanos e desencadear quadros clínicos graves, principalmente em pacientes imunossuprimidos. Uma característica de Cn é a sua capacidade de adaptação a diferentes ambientes.
O processo de adaptação, no geral, envolve alterações fenotípicas e genotípicas que são selecionadas evolutivamente. Dentre os mecanismos adaptativos, o sistema de reparo de DNA possui
papel importante na regulação da geração de mutações e alterações gênicas, já relacionadas
com a modulação da virulência em outros patógenos. Contudo, pouco é conhecido acerca dos
mecanismos de reparo de DNA de Cn. Diante disso, este trabalho tem como objetivo geral avaliar
a correlação entre as vias de reparo de DNA por excisão de bases (BER) e de nucleotídeos (NER)
e a virulência e adaptação de Cn em resposta a diferentes condições experimentais. Os genes
Apn1 e Apn2/EXOIII da via BER e XPC/Rad4 e ERCC4/Rad1 da via NER foram identificados
e selecionados a partir de análise de sequencias no banco de dados do BROAD INSTITUTE. As
sequencias foram submetidas à análises bioinformáticas para predição de estruturas proteicas secundárias e suas funções. Os resultados mostraram alta similaridade estrutural da proteína Apn1
com proteínas da família endonuclease IV. A análise estrutural da Apn2/EXOIII demonstrou a
presença de uma estrutura globular com relativa similaridade com proteínas endonucleases de
outros patógenos, como Neisseria minigitidis e uma estrutura linear (cauda) de aproximadamente
350 aminoácidos, cuja função não pôde ser confirmada estruturalmente. A análise da sequencia
genômica de EXOIII revelou a presença de um RNA não codante na fita antisensse do gene, cuja
função pode, ou não, estar relacionada com a regulação da expressão e/ou da função de ExoIII.
Até o presente momento, foi realizada o silenciamento gênico de Apn1 (∆Apn1), comprovado
por Southern Blot. Não foi possível confirmar mutantes para o gene Apn2/ExoIII, mesmo após
duplicata biológica, o que pode indicar a necessidade do gene para a sobrevivência do fungo. Os
resultados preliminares mostram que os fungos ∆Apn1 da via BER de reparo de DNA foram mais
sensíveis aos tratamentos com estressores salinos (NaCl e KCl 1,5M), à cafeína (0,5 e 1 mg/mL)
e ao peróxido de hidrogênio (H2O2 1mM e 5mM), o que sugere alterações na membrana celular
e no controle osmótico do fungo. Não foram observadas diferenças na produção de fosfolipase
entre o selvagem e o mutante ∆Apn1. Em paralelo foi testada a importância do estresse oxidativo
para a virulência de Cn, através da produção de melanina após exposição seriada ao H2O2. Os
resultados mostraram que a exposição dos fungos selvagem e ∆Apn1 à 5 mM de H2O2 por 2h
induziu produção diferenciada de melanina entre selvagem e mutante, sendo o Apn1 responsável
pela maior produção observada. Os resultados são preliminares mas indicam a importância da
atividade de reparo de DNA para a sobrevivência e virulência de Cn.
Capítulo 3. Resumos
82
METABOLISMO DA GLUTATIONA NO MEXILHÃO Brachidontes solisianus (MYTILIDAE) DURANTE UM CICLO NATURAL DE MARÉS NO SUL DO BRASIL
Marcus Aurelio Da Costa Tavares Sabino
Palavras
chave:
Entre
marés,
antioxidantes,
glutationa,
exposição
aérea.
Apesar de diversos estudos apontarem à modulação de antioxidantes endógenos na resposta
a exposição aérea em animais de respiração aquática, poucos têm investigado isto no campo,
usando a pesquisa de bioquímica ecológica. Por exemplo, no ambiente entre marés, animais
sesseis marinhos tem que lidar com estresse de emersão aérea durante a maré baixa, no qual
expõem os animais a privação de oxigênio e alimento, assim como mudanças de temperatura
ambiental e estresse por dessecação. Neste cenário, a privação de oxigênio e sua reintrodução
(durante os primeiros momentos de reimersão) são potencialmente danosos devido a esperada
superprodução de radicais livres. Tem sido observado em muitos casos que animais quando
submetidos à hipóxia, aumentam suas defesas antioxidantes endógenas. Deste modo, o nosso
objetivo foi identificar ajustes de antioxidantes endógenos na espécie de mexilhão de região entre
marés, Brachidontes solisianus, durante um ciclo natural de exposição aérea e reimersão. Foram
medidos os níveis de glutationa total (Eq-GSH=GSH + 2GSSG), glutationa reduzida (GSH) e
dissulfeto (GSSG), em homogeneizado de corpo inteiro durante um ciclo de marés. Os animais
foram coletados desde 6:30h até 21:10h em um rochedo de Penha, Santa Catarina. Os grupos
experimentais foram (N=6-7): 1, 3 e 7 horas de reimersão, 30 minutos e 4 horas de exposição
aérea. Durante a coleta, as temperaturas do ar e água eram registrados, variando entre 22.5 a
26◦ C. As concentrações de ambos Eq-GSH e GSH aumentaram 51% após 4 horas de exposição
aérea quando comparado com animais imersos por 3 horas (P = 0.0079 e 0.0233, respectivamente). Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos para os níveis de GSSG e
GSSG/Eq-GSH (um indicador de balanço redox). Nossos achados indicam que os mexilhões
aumentaram a síntese de GSH em resposta à exposição aérea. A análise de outros componentes
do sistema antioxidante pode mostrar se outros antioxidantes, além de GSH, seguem a mesma
tendência, como observado em outras espécies dentro da privação de oxigênio.
3.3 Resumos
83
THE ROLE OF LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE IN INFLAMMASOME ACTIVATION AND LIPID DROPLET BIOGENESIS IN HUMAN MONOCYTES AND ENDOTHELIAL CELLS
Rafael Corrêa, LuÍs Felipe Fonseca Silva, Dalila Juliana Silva Ribeiro, Raquel Das Neves
Almeida, PatrÍcia Torres Bozza, Kelly Grace Magalhães
Palavras chave:
Lysophosphatidylcholine, lipid droplets and inflammasome activation
Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has an
important role in cell signaling. LPC is a major phospholipid component of oxidized low density
lipoprotein (oxLDL) and is thus directly implicated as a critical factor in atherogenic activity of
oxLDL. Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam macrophages, which
are the key cell components for the establishment of atherosclerosis, and leukocyte recruitment
on the site of the pathology. Therefore, LPC plays an important role in atherosclerosis, as
well as in acute and chronic inflammation. One important pro-inflammatory cytokine is the
Interleukin-1beta (IL-1β ) which is regulated by the inflammasome activation. Our group has
previously demonstrated that LPC is a TLR2 ligand and may be involved in modulation of
inflammatory responses. However, the role of LPC in modulating inflammasome activation and
lipid droplets biogenesis in this process is poorly understood. This study is aimed to investigate
if LPC is capable of inducing inflammasome dependent IL-1β secretion, verify the foam cell formation by analyzing lipid droplet biogenesis and characterize the signaling pathway. THP-1 cells
were pre-treated or not with inhibitors of (I) ROS release (NAC), (II) potassium efflux (Glybenclamide), (III) lysosomal damage (CA-074), (IV) Caspase-1 Inhibitor (Z-YVAD-FMK) and (V)
blocking TLR2 antibody (Anti-TLR2) for one hour and stimulated with different concentrations
of LPC. After 24 hours of interaction, the supernatants were collected; IL-1β secretion levels
were analyzed by ELISA, and biogenesis of lipid droplets was analyzed by flow cytometry and
confocal microscopy. One microgram of LPC induced significant secretion of IL-1β , which was
dependent on potassium efflux, lysosomal damage and TLR-2 in human monocytes. Moreover,
LPC induced lipid droplet biogenesis in a process dependent on ROS release and lysosomal
damage, which mediate the inflammasome activation in monocyte. In addition, LPC induced
ROS release and lipid droplets biogenesis in human endothelial cells (HUVEC). Taken together
our data suggests that LPC triggers IL-1 secretion and induces lipid droplet biogenesis in an
inflammasome-mediated pathway in monocytes. Further studies are undergoing to better identify
these mechanisms in endothelial cells.
Capítulo 3. Resumos
84
Estudo do efeito da Metilação do DNA na produção de enzimas lignocelulóticas pelo
fungo Humicola grisea var. thermoidea cultivado em diferentes substratos
João Heitor Colombelli Manfrão Netto, Marcio José Poças Fonseca, Cássia Oliveira Fagury
Videira, Fernanda Fonsêca Ferreira
Palavras
chave:
Epigenética
,
metilação
do
DNA,
fungos
filamentosos
Humicola grisea var. thermoidea é um ascomiceto termofílico com boa capacidade de produzir enzimas lignocelulolíticas, principalmente celulases e xilanases. Esta característica faz
deste fungo um excelente candidato para utilização na bioconversão de resíduos agrícolas. Estas
enzimas têm a capacidade de degradar a biomassa, liberando os monômeros de glicose e xilose
que podem posteriormente ser utilizados em processos fermentativos por outros microrganismos
para produção de etanol de 2◦ geração. A metilação de DNA é um mecanismo epigenético de
regulação gênica que tem sido amplamente estudado, sendo geralmente associado à repressão
transcricional. A enzima DNA metiltransferase (DNMT) é responsável por realizar a metilação
do DNA. Drogas que afetam as DNMTs são frequentemente utilizadas em estudos com células
de mamíferos e fungos patogênicos, porém pouco se sabe sobre seu efeito na produção de
enzimas lignocelulolíticas por fungos filamentosos. No presente trabalho nós utilizamos a droga
5-aza-2’-deoxicitidina (5-aza), um inibidor da ação da DNMT, para avaliar seu efeito na produção
enzimática do fungo H.grisea cultivado em diferentes substratos. 106 esporos/mL do fungo
foram pré-inoculados em 250 mL de meio completo de Pontecorvo suplementado com 1% de
glicose e cultivados por 18-24h a 42◦ C 200 rpm. Os micélios crescidos foram filtrados, lavados
com água estéril para remoção completa da glicose. Em seguida, 3 gramas do micélio foram
transferidos para 50 mL de meio mínimo suplementado com 1% (m/v) de farelo de trigo (FT),
feno, glicose (GLI) ou 0,1% de bagaço de cana de açúcar explodido a vapor (BCA) e contendo
5-AZA na concentração de 25 ou de 50 µM; controles sem droga foram realizados. Seguiu-se
incubação a 42◦ C 200 rpm por 2, 12 e 96 h. Após esses períodos, o sobrenadante e micélio foram
coletados para as análises posteriores. A atividade hidrolítica dos sobrenadantes foi determinada
por ensaio enzimático utilizando o reagente DNS. RT-qPCR tem sido utilizada para determinar
o acúmulo dos transcritos de genes de xilanases e celulases. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata biológica e os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA)
seguida do pós-teste de Tukey (p<0,05). Resultados: Nossos resultados demonstram que esta
droga atua diferentemente em cada substrato, sendo que em alguns ocorre uma diminuição da
atividade enzimática de CMCase e para outros há um aumento desta atividade em relação ao
controle. Para farelo de trigo houve um aumento na atividade de CMCase em 2h(60,52% em 25
µM e 103,02% em 50 µM), 12h (57,45% em 25 µM) e 96h(28,60% em 50 µM). Já em bagaço
de cana de açúcar explodido a vapor foi verificada uma diminuição na atividade enzimática em
2h(15,35% em 50 µM), 12h(21,23% em 50 µM) e 96h(28% em 25 µM e 31,17% em 50 µM).
Perspectivas: Avaliar o acúmulo de transcritos de genes de celulases e xilanases pelo método de
RT-qPCR, para assim avaliar se a utilização da droga altera a expressão destes genes no fungo
Humicola grisea var. thermoidea.
3.3 Resumos
85
Optimization of culture medium for production of holocellulose-degrading enzymes
from Aspergillus oryzae
Antonielle Vieira Monclaro, Pedro Ribeiro Fontes, Guilherme Lima Recalde, Edivaldo Ximenes
Ferreira Filho
Palavras chave: xylanase; cellulase; textile wastes; pulp cellulose wastes; sugarcane bagasse
Plant cell walls of agro-industrial wastes are complex structures formed mainly by three components: cellulose, hemicellulose and lignin. Aspergillus oryzae is a filamentous fungi recognized
for their great potential in enzyme production and as an effective decomposer of lignocellulosic
biomass. This work will discuss some results of screenings using A. oryzae Blu37, a new
strain isolated from natural composting of textile residues. The first screening evaluated the
fungus ability to produce lignocellulolytic enzymes using different agro-industrial wastes as a
carbon source: sugarcane bagasse, delignified pulp, bleached pulp, dirty cotton residue, filter
powder and clean cotton residue. It was noted that xylanase was the most active enzyme in
all residues. It is known that the induction effect of the biomass will cause microorganism
to produce enzymes according to the substrate present, in order to hydrolyze efficiently the
cellulose and hemicellulose contents of plant cell wall. Based on this, a second screening was
conducted, varying the medium composition. The medium used as control was composed of
(w/v) 0.7% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.05% MgSO4.7H2O, 0.1% (NH4)2SO4 and 0.06% yeast
extract; the second medium used tryptone as nitrogen source in place of (NH4)2SO4; the third
medium was supplemented with 12 µM CuSO4. It was noted that the presence of tryptone and
CuSO4 increased cellulolytic activity of medium containing bleached pulp (175% and 170%,
respectively), dirty cotton residue (183% and 233%, respectively) and clean cotton residue (134%
and 173%, respectively). For sugarcane bagasse and filter powder there was a strong inhibition of cellulolytic activity (21% and 0% for sugarcane bagasse/50% and 0% for filter powder,
respectively). To optimize the levels range for each medium component, a central composite
design of 22 factorial was performed to the described culture medium. The range of tryptone
was 0,05-0,1-0,2% (w/v) and of CuSO4 was 0-12-24 µM; and they served as critical variables F1
and F2, respectively. Enzymatic activity (IU.mL-1) was the response evaluated. For delignified
pulp, supplementation with CuSO4 and tryptone were significant to cellulases and xylanase.
For bleached pulp and bagasse, supplementation with CuSO4 and tryptone were significant to
cellulases and for xylanase only CuSO4 was significant. For filter powder, clean cotton residue
and dirty cotton residue, supplementation with CuSO4 was significant to cellulases, and, for
xylanase, supplementation with tryptone was significant. It is known that tryptone is a rich
source of amino acids nitrogen, especially tryptophan, and this amino acid residue is important
for its localization near by the catalytic domain. Probably this source of nitrogen favored the
enzymes to initiate cellulose degradation. The supplementation with CuSO4 may have activated
the copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenases presents and boosted the cellulases
through synergism. These data suggest that modifications in minimal mediums are essential to
optimize the production of lignocellulolytic enzymes for the conversion of biomass.
Capítulo 3. Resumos
86
Caracterização do papel anti-tumoral e imunomodulador de novas drogas que tem
como alvo PPAR e HDAC
Adrielle Veloso Caixeta, Luíz Antônio Soares Romeiro, Kelly Grace Magalhães
Palavras
chave:
HDAC,
PPAR
e
Imunoterapia
Introdução: A quimioterapia ainda continua sendo o tratamento de primeira escolha na clínica.
Contudo sua toxicidade e efeitos colaterais são fatores limitantes ao seu uso. A imunoterapia
também costuma ser utilizada em combinação com outras drogas anticancerígenas. Atualmente
existe uma dificuldade na obtenção de drogas que exerçam simultaneamente efeitos antitumorais
e imunomodulares. Os inibidores das histonas desacetilases (HDACi) representam uma nova
classe de alvo de drogas na qual a acetilação de histonas associadas à cromatina é alterada,
modulando assim sua transcrição de gene e fatores envolvidos na proliferação, migração e
morte celular. As HDACs parecem ter um papel na imunidade inata e na imunidade adaptativa.
Um outro mecanismo de atuação são os PPARs, que são fatores de transcrição pertencentes á
classe de receptores nucleares, que também desempenham diversas funções na tumorigênese,
modulando angiogênese, proliferação, apoptose, além de modular a inflamação. Dessa forma,
novas drogas que tem como alvo a HDAC (LDT 536, LDT 537 e LDT80) ou PPAR (LDT486
e LDT487) foram sintetizadas a fim de serem verificadas as suas propriedades antitumorais e
imunomoduladoras. Métodos e Resultados: Macrófagos murinos, monócitos humanos (THP-1),
célula de linhagem de câncer de mama humano (MCF-7) e murino (4T1) e leucemia K562
primadas ou não com LPS, foram estimuladas in vitro com diferentes concentrações das drogas
LDT 486, 487, 536, 537 e 80. Depois de 24 horas foi analisada a viabilidade celular pelo ensaio
de MTT. As drogas LDT 486, 536 e 537 induziram significativa diminuição da viabilidade das
células de câncer de mama não invasiva humana(MCF-7). A LDT 536 diminuiu a viabilidade
celular da THP-1 em apenas uma concentração. Já a LDT 537 diminuiu a viabilidade da K562.
Conclusão: Os dados mostram que as drogas LDT 486, 536 e 537 parecem ser promissoras para
o tratamento do câncer de mama e leucemia. Experimentos adicionais estão em andamento para
melhor caracterização de suas propriedades.
Suporte Financeiro: Capes/CNPq
3.3 Resumos
87
INVESTIGATING THE IMPACT OF AUTOGRAPHA CALIFORNICA MULTIPLE
NUCLEOPOLYHEDROVIRUS AC134 GENE ON MULTIPLE NUCLEOCAPSID FORMATION
Miguel De Souza Andrade, Daniel Mendes Pereira Ardisson Araújo, Bergmann Morais Ribeiro,
Fernando Lucas De Melo
Palavras
chave:
Baculovirus,
MNPV,
Ac134,
p94
The baculoviruses are a group of insect viruses with large dsDNA genomes, and their primary infection is triggered by rod-shaped enveloped virions embedded in a crystalline protein
matrix. Each virion may contain one (single phenotype, SNPV) or more nucleocapsid (multiple
phenotype, MNPV) within an envelope, depending on the viral species. The genetic basis of this
phenotype has not been identified and it does not seems to be correlated with larger phylogenetic
groups. However, some closely related baculoviruses, such as Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), Bombyx mandarina nucleopolyhedrovirus (BomaNPV) and Autographa
californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), have discordant phenotypes and may help to
identify candidates genes. Therefore, we compared the genome of these viruses and found a
unique gene (Ac134) that was present in BomaNPV and in the majority of MNPVs (including
AcMNPV) and was absent in BmNPV, suggesting that the presence of this gene could be related
to the appearance of multiple nucleocapsid virions. This gene was the most significant difference
among the BmNPV and the BomaNPV genomes. To analyze whether this gene was related to the
MNPV phenotype we constructed three recombinant baculoviruses: AcMNPV-134-del (Ac134
disrupted), AcMNPV-134-HA (Ac134 repaired with HA tag) and AcMNPV-WT (wild-type). We
transfected the recombinant DNA of those constructs into insect cells and infective budded virus
(BVs) were produced. We have shown by transmission electron microscopy that the disruption
of Ac134 does not change the multiple capsid occlusion, thus, this gene is not responsible for the
MNPV phenotype. By confocal microscopy, Ac134 was found in the cytoplasm of the infected
cells at 6 and 12 hpi, with a peak at 24 hpi, and decrease of signal at 48 and 72 hpi. The in vitro
growth rate of AcMNPV-134-del was reduced compared to WT and repaired mutants. The same
reduction was observed for in vivo experiments with neonate larvae. The impact of this deletion
on DNA replication and protein production are now being analyzed by qPCR and western blot.
Together, these results contribute to understanding of multiple capsids formation process in
baculovirus and the impact of Ac134 on viral replication.
88
Capítulo 3. Resumos
EFEITOS FOTODINÂMICO E FOTOTÉRMICO COMBINADOS MEDIADOS POR
AZUL DE METILENO ASSOCIADO À NANOFOLHA DE ÓXIDO DE GRAFENO NO
TRATAMENTO DE CARCINOMA MAMÁRIO MURINO ORTOTÓPICO IN VIVO
Mayara Simonelly Costa Dos Santos, Ana Luisa GouvÊa Da Silva, Ludmilla David De Moura,
Leonardo Giordano Paterno, Paulo Eduardo De Souza, Ricardo Bentes De Azevedo, SÔnia Nair
BÁo
Palavras chave: FOTOTERAPIAS, AZUL DE METILENO, LASER 808 NM, HIPERTERMIA,
LED
660,
NANOFOLHAS
DE
CARBONO
E
CARCINOMA.
As fototerapias têm se destacado como alternativas terapêuticas aos métodos convencionais para
o tratamento de carcinomas. A terapia fotodinâmica (TFD) produz espécies reativas de oxigênio
e, consequentemente, dano celular a partir de um fotossensibilizante (FS), oxigênio e luz de
comprimento de onda específico. A terapia fototérmica (TFT) envolve um agente fototérmico
que ao absorver luz de comprimento de onda específico, induz o aumento da temperatura localmente causando morte celular, além de coagulação do tecido. Um nanodispositivo de efeito
sinérgico, a combinação de um agente fotossensibilizante (azul de metileno, AM) com um agente
fototérmico (nanofolha de óxido de grafeno, NanoGO), possibilitaria um tratamento combinado
com as duas terapias para o tratamento de carcinomas. O FS azul de metileno (AM) possui
forte absorção de luz de comprimento de 660 nm e NanoGO possui alta eficiência fototérmica e
absorção em 808 nm. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os eventuais efeitos antitumorais
e colaterais oriundos das terapias fotodinâmica e fototérmica combinadas no tratamento do
carcinoma mamário murino ortotópico em camundongos fêmeas BALB/c por meio da associação
do fotossensibilizante azul de metileno às nanofolhas de óxido de grafeno (NanoGO-AM). Foram
utilizados 40 camundongos fêmeas BALB/c (12 semanas de vida), sob aprovação da Comissão
de Ética no Uso Animal da Universidade de Brasília - CEUA/UnB, divididos aleatoriamente
em 8 grupos com n=5. Os animais foram separados nos seguintes grupos: (1) controle sadio,
(2) tumor + PBS, (3) tumor + NanoGO-AM, (4) tumor + laser, (5) tumor + LED, (6) tumor+
NanoGO + Laser, (7) tumor+ NanoGO + LED e (8) tumor+ NanoGO + Laser/LED. Os animais
foram anestesiados e o tumor induzido a partir de 2 x 104 células 4T1-Luc (células de carcinoma
mamário murino modificadas para expressar luciferase) injetadas no ducto mamário da quarta
mama direita dos animais. Após 15 dias da indução tumoral, os animais foram anestesiados e
tratados intratumoralmente com 25 µL de NanoGO-AM (concentração de 10 mg/kg de NanoGO
e concentração de 2mg/kg de AM por animal) e irradiados com laser 808 nm (potência de 2,4
W, 15 minutos) e/ou LED 660 nm (potência de 150 mW, 10 minutos). Durante a irradiação de
NanoGO-AM com o laser 808 nm, houve um aumento de temperatura na região irradiada de 30
◦ C para 42,2 ◦ C mostrando assim, o potencial da NanoGO-AM em produzir dano celular por
hipertermia. O volume tumoral foi avaliado em equipamento para captação de bioluminescência
IVIS Lumina XR (Caliper LifeSciences). Os animais foram anestesiados e intraperitonealmente
injetados 100 µL de luciferina [15 mg/ml] antes da indução do tumor, no 14◦ dia da indução
tumoral, no 16◦ dia (1 dia após tratamento/irradiação) e, por último, no 21◦ dia após a indução
tumoral. As imagens de bioluminescência obtidas mostram que a indução tumoral foi obtida
com sucesso e que após os tratamentos houve uma pequena diminuição da captação do sinal da
bioluminescência nos animais, o que indica um sinal de remissão tumoral após os tratamentos
com as fototerapias combinadas.
3.3 Resumos
89
PRODUCTION OF ANTIBODY FRAGMENTS BY DIFFERENT LINES OF EUKARYOTIC CELLS USING THE VECTOR pValac
Layssa Miranda De Oliveira
Palavras
chave:
Norovirus;
replication;replicon
Monoclonal antibody therapy is an alternative for several pathologies, from inflammatory disease
to cancer therapy. Production is, however, highly expensive and usage is associated with severe
side effects. Given this, alternative methods for recombinant antibody production and delivery
may advance broader usage. The aim of this work is to develop expression vectors for use in
Lactococcus lactis, for intestinal delivery of pValac vectors carrying fragments of antibodies
(anti-IL1β , anti-TNFα and anti-CD3) in the intestinal mucosa of mice. Genes for antibody
fragments were synthetized using sequences from Genbank that include restriction sites for
cloning into the pValac vector.These genes were subcloned using EcoRI and NheI enzymes in
the pValac (shuttle vector to eukaryotic expression) and transformed in Escherichia coli TGI.
Successful cloning was verified based on restriction endonuclease digestion profile and PCR,
with sequencing of DNA conducted to confirm the integrity of all sequences. Electrocompetent
L. lactis (MG1363 FnBPA) was prepared to receive the pValac vector and antibiotic resistance
and specific PCR conducted for each construct to confirm transformation. In order to ensure the
eukaryotic expression of genes carrying pValac using L. lactis delivery prior to animal testing,
we transfected the vector in HEK293, CHO-K1 and Caco-2 cell lines using Lipofectaminer LTX
with PlusT M using ELISA and Western Blot Reagent to detect specific proteins in supernatant
cell cultures after 24 - 72 hours post-transfection. SDS-PAGE confirmed the expected size
for all antibody fragments produced. Quantification of anti-CD3 revealed that HEK293 is the
best cell line for pValac production, based on a comparative analysis. An expression vector for
recombinant antibody fragment production was prepared for use in L. lactis, based on the pValac
shuttle vector. Included were three different antibody fragments (an anti-IL1β , anti-TNFα and
anti-CD3), in two different formats (scFv and FvFc). All fragments were efficiently produced in
animal cell culture. The human HEK293 cell lineage was shown to be the best host for pValac
expression. Further tests on mice using L. lactis for plasmid delivery at intestinal mucosa will be
conducted, to enable induction of tolerance and control of anti-inflammatory processes.
Capítulo 3. Resumos
90
Homology Modeling of tospovirus nucleoprotein: structure and function
Rayane Nunes, Faheem, M., Barbosa, Jarg, Melo, Fl, Resende, Ro
Palavras
chave:
Tospovirus,
Homology
modeling
The rapid progress in the understanding of protein folding mechanisms and the advances in
the bioinformatics field have provided reliable tools to modeling and predict three dimensional
structures of plant virus proteins. Recently, the Nucleoprotein (NP) crystal structures of related RNA virus families (Arena/Orthomyxo/Bunyaviridae) were elucidated and despite having
different sizes and distinct NP-folding structures, these proteins share common features and
architectural principles when forming NP-NP multimers and NP-RNA complexes. Therefore,
due to their genetic relationship, the La crosse virus (LACV-Orthobunyavirus) crystal structure
in complex with ssRNA (PDB ID 4BHH) was selected as template for a Homology modeling
approach to predict a three dimensional model for the NP of the Tospovirus Groundnut ringspot
virus (GRSV). The GRSV NP monomer was predicted to possess thirteen helical segments
and two small beta-sheets organized in a globular core domain (33-223 aa) containing a deep
positively charged groove with the two terminal chains forming a N-terminus arm (1-32 aa) and
a C-terminus arm (224-258 aa). Both N- and C-arms extend outwards from the globular core
domain and they interact with the globular core domain of neighboring monomers to mediate
the multimerization, supporting the “head-to-tail” model. The RNA is primarily bound at the
central RNA-binding groove and the key residues for this interaction are mainly located in this
groove. RNA is strongly bent at each NP-NP interface and is largely solvent-inaccessible in the
tetramer structure. The dimensions of the groove allow accommodation of ssRNA and further
analysis showed that the majority of residue-nucleotide interactions occur with the ribose and
the phosphate moiety, suggesting a non-sequence-specific ssRNA interaction. Importantly, most
of the key residues are highly conserved among all tospoviruses. Multiple copies of the NP
form oligomers that interact with the viral RNAs to build ribonucleoprotein complexes (RNPS)
that are proposed to be transported via plasmodesmata and are functional templates for RNA
replication and transcription. Thus, the proposed model may shed light on the mechanisms of
RNP shaping and could allow the identification of essential amino acid residues as potential
targets for tospovirus control strategies.
3.3 Resumos
91
A multi-agent system looking for new RNA molecules by using RNA-Seq data
Julien Jourde, Taina Raiol, Maria Emilia Machado Telles Walter, Marcelo De Macedo Brigido
Palavras chave: RNA-Seq, multi-agent system, graphical online interface, RNA isoforms
New high throughput sequencing (HTS) technologies coupled with statistical analysis are now
used on a daily basis on RNA sequences obtained by HTS (RNA-Seq) to study differential
expression of genes, isoforms variation, discovery of new splicing events, etc. But a brief
observation of published results shows that bioinformaticians, who have now access to a great
variety of tools and options, rely on a multiplicity of strategies and pipelines. Biologists for their
part, who must have confidence in the achieved results, have to deal with a large quantity of data
and to be able to integrate a greater number of parameters, even with reduced possibilities due to
statistical filtering. In these conditions, it is reasonable to think that the full potential of insight
extraction can’t be achieved without the help of more computing resources. An effective way to
implement that such a system, is to create a multi-agent system (MAS). A MAS contains several
independent entities with the following mandatory characteristics: communication, the ability
to work autonomously, wether together or in competition. Beside those, other capacities draw
a gradient of intelligence among the agents we design : the ability to map their environment,
to make their own decisions and to perform complex tasks. The capabilities themselves have
different level of development. We are now achieving our first prototype of MAS. It is composed
of simple reactive agents, each one able to perform only one tasks of an RNA-Seq analysis
pipeline. They achieve the whole analysis only as a group, that will resemble what is already
done by humans. With the evolution of the agents, we need a tool to control their work and to
compare it with a baseline. To that end, we started to develop a simple graphical online interface
allowing us to compare results from different pipelines, tools and datasets. The aim of that
interface is to be integrated to the MAS and help to find new informations on the RNA isoforms
discovered by different analysis. In conclusion, the proposed MAS will let us compare results
from the MAS and two different pipelines for two different existing biological data of human T
cells, provided either by our lab’s data or published data.
Supported by: CNPq and CAPES
Capítulo 3. Resumos
92
Molecular coevolution between neurotoxins and ion channels
Camila Ferreira Thé Pontes
Palavras
chave:
coevolution,
neurotoxins,
ion
channels
Due to their importance in many cellular processes and specially in signal transduction, voltagegated ion channels (VGICs) serve as molecular targets to a variety of toxins, some of which have
an effect on the activation/inactivation kinetics of the channel, known as gating modifier toxins.
The gating modifiers α- and β -scorpion toxins (α- and β -ScTxs) act on voltage-gated sodium
channel (Nav) extracellular sites altering the movement of the voltage sensor through a voltagesensor trapping mechanism. This study is an attempt to elucidate the molecular mechanisms that
determine toxin specificity through the investigation of molecular coevolution between these
toxins and their respective Nav binding sites using computational methods. Results concerning
the analysis of the entropic patterns present in each toxin group are shown here. A multiple
sequence alignment (MSA) of α- and β -ScTxs obtained from UniProtKB was created with
HMMER tools and analyzed using information theory. Position-dependent entropic analyses
were carried out for different subsets of this alignment, using both a reduced and a complete
amino acids alphabet. The coupling between each position pair was also calculated within each
subset. Although, it was possible to identify some important positions that characterize each
toxin group, it is likely that the primary sequence alone is not sufficient to fully characterize the
different ScTxs subgroups. As a result of the coupling analysis, it became clear that different
subgroups have distinct patterns of intra-molecular coupling, which may also contribute to the
subgroups characterization. Further analysis showed that alpha- and beta-toxins clustered in
well-defined groups based on a hamming distance criterion. With the purpose of creating a toxin
structure bank, sequences from the alignment that showed at least 80% sequence similarity with
a toxin structure on PDB were modeled based on the PDB references. The result was a bank
containing 78 alpha-toxins (19 from PDB and 59 modeled) and 73 beta-toxins (13 from PDB
and 60 modeled) that is currently been simulated and equilibrated in water (50% concluded). A
genetic algorithm was developed to minimize the energy of this bank based on matching surface
properties, such as topology and polarity. The main objective of this approach is to redefine
the information channels used in the entropic analysis: instead of using a primary sequence
alignment, a surface alignment will be used and the resulting entropies will be compared. With
the information channels redefined, it will be possible to run an analysis to determine the evolutionary coupling between different ScTxs and different voltage-sensor domains (VSDs) of
Nav channels. To define the best coevolution model, the developed genetic algorithm will be
used to minimize the energy of a population of coevolution models based on an energy-coupling
criterion. The objective is to find the best evolutionary solution for ScTxs-Nav interaction.
3.3 Resumos
93
X-Ray Crystallographic Structure Analysis Of GII.19 And GII.21 Norovirus Protrude
(P) Domain From Viral Capsid
Karoline Dos Anjos, Bishal K Singh , Mila Leuthold , Tatsuya Nagata , Grant S Hansman
Palavras
chave:
X-ray
Chrystallographic,
Norovirus,
Capsid,
P
domain
Noroviruses (NoV) are the most epidemical viruses that cause gastroenteritis in children worldwide. It belongs to Caliciviridae family and it is a single strand RNA virus of approximately
8kpb, it is divided into three or four ORFs. Despite recently efforts to establish a cell culture it is
still not known the role of cell infection of these viruses. One usual approach is the study of the
capsid protein and its interaction with cells and also it’s structure. Based on previous studies it’s
known that the most variable domain of this protein is the protrude domain but the mechanism of
entrance into the cell based on that remains unknown. Structural studies such as crystallographic
ones reveal the knowledge and the proof of some interactions between these viruses structures
and cells components such as carbohydrates present on the cell surface. In this work, two rare
genotypes of NoV were studied and your native protrude structure were described despite the
unsuccessful attempt on demonstrating the interaction with histo-blood group antingens (HBGA).
NoV GII.19 and GII.21 were expressed using E. coli system and then purified using Ni column
and size exclusion chromatography. After that the conditions of 0.1 M sodium acetate for GII.19,
and 20 w/v PEG600 plus 0.1 M citric acid pH 5 for GII.21 for crystallization. The data were
obtained through X-ray diffraction collected at the European Synchrotron Radiation Facility,
France, at beamline BM30A, and were processed with XDS. To solve the structure molecular
replacement in PHASER was used. Both structures formed crystals in space group P212121.
Refinements were done using COOT and Phenix. The structures GII.19 and GII.21 were obtained
in a resolution of 1.3Åand 2.1Å, respectively. They are similar to others NoV GII P domains
that are subdivided in P1 and P2. P2 subdomain contains six antiparallel β -strands that form a
barrel-like structure previously observed, but after a sequence alignment, over 50% of amino
acids changes were observed in this region. These results corroborate with the affirmative of
P2 being the most variable region from capsid. Co-crystallization of these proteins with HBGA
were done, but GII.19 presented very compressed crystal packing occluding the possible binding
pocket, and GII.21 presented a possible flexible loop in the same region between 344 and 375aa.
In both cases, further studies concerning carbohydrates co-crystallization need to be done.
Capítulo 3. Resumos
94
Produção de virus like particles (VLP) “GP64 free” do Vírus da Imunodeficiência
Humana (HIV) utilizando sistema baculovírus de expressão
Lorena Carvalho De Souza Chaves, Miguel De Souza Andrade, Bergmann Morais Ribeiro, Gary
W. Blissard
Palavras
chave:
VLP,
HIV,
GP64,
Baculovírus.
Virus like particles (VLPs) são compostas de proteínas do capsídeo viral que se auto-montam em
partículas que lembram os vírions naturais de que derivam. As VLPs não possuem o genoma
viral e portanto não se replicam nem causam infecção. No caso de VLPs de HIV-1, a expressão
da proteína GAG é suficiente para a montagem de VLPs. A fase de leitura aberta de GAG de
HIV codifica uma poliproteína de 55 kDa que é subsequentemente processada em uma proteína
madura, não glicosilada de matrix p17 (MA), proteína do capsídeo (CA), nucleoproteína p9 (NP)
e uma proteína de ligação p6. A miristoilação do precursor da poliproteína p55 GAG é essencial
para sua localização membranar e montagem da proteína do capsídeo em discretas partículas na
membrana plasmática. Um dos sistemas utilizado na produção de VLP de HIV é o de expressão
em células de insetos mediada por baculovírus recombinantes. Entretanto, a proteína GP64
essencial de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células
infectadas (local de montagem de VLPs de HIV), e normalmente está presente na superfície do
VLP. Portanto, a deleção de GP64 é muito importante para que as VLPs sejam puras e livres de
proteínas provenientes do vetor de expressão. Além do mais, essas VLPs “GP64 free” devem
desencadear uma resposta imune muito mais específica, aumentando a especificidade contra as
proteínas estruturais de HIV-I, contribuindo para uma melhor eficiência na produção de uma
vacina recombinante. Durante este trabalho, foi construído um baculovírus recombinante que
expressa GAG de HIV-I. Esse baculovírus recombinante foi utilizado na infecção de células
de inseto. Foi demonstrado que através de gradiente de sacarose é impossível separar BVs
(Budded virus) e VLPs provenientes de células de inseto infectadas com esse vírus recombinante,
mesmo percebendo que as duas partículas apresentam coeficientes de sedimentação diferentes no
gradiente de sacarose. Utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes
GP64 defectivo, o vírus vGagHIV-I GP64 defectivo foi produzido e utilizado na infecção de
células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no
extrato de células infectadas com esse vírus recombinante quando comparado com os controles.
Essas mesmas células foram visualizadas no MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão),
mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (significando que BVs também não
estarão presentes e a amplificação do vírus comprometida), o brotamento de VLPs continua
a acontecer. Essa técnica tem se mostrando eficiente para a produção de VLPs mesmo com a
deleção de um gene essencial do baculovírus (GP64). Novos experimentos estão sendo feitos, a
fim de demonstrar que uma nova técnica para produção de VLPs mais puras e mais semelhantes
as partículas virais de origem, está sendo desenvolvida.
3.3 Resumos
95
HDACs play different roles in the regulation of Cryptococcus neoformans virulence
traits
Fabiana Brandao, Andrew Alspaugh , Lorena Derengowski , Marcio Poças
Palavras chave: Cryptococcus neoformans, Histone Deacetylases, Epigenetics, Virulence
Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, and direct
one the most important epigenetic processes regulating gene expression - chromatin remodeling.
However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly
explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes
to promote persistence and survival inside hosts or specific ecological niches. Very likely, these
changes are associated with epigenetic regulation. In this context, initially we evaluated the
effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut)
and Trichostatin A (TSA). Our results showed that both were able to impair the expression of
main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight
genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we
would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence train
expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control
non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. These processes
include thermotolerance (growth at 37◦ -39◦ C), capsule and melanin formation, and cell wall
integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed to varying
degrees in the HDAC mutants. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival
when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence
in vivo. Together, these results indicate that the cellular alterations induced by chemical HDAC
inhibitors likely reflect a composite effect on multiple, individual class I/II HDAC proteins.
This work describe for the first time six HDAC genes and their relation to correct expression
of virulence traits in C. neoformans. One of them, named for our group as CLR3 due to its
similarity in Schizosaccharomyces pombe, is required for different traits and it has shown hypo
virulent in vivo. Ours results link CLR3 as the main target for HDACi, and we followed with
RNA sequence from clr3 and we hope to define the specific genes whose expression is regulated.
96
Capítulo 3. Resumos
Caracterização biológica e estrutural de um polipeptídeo inibidor de serinoprotease
isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus
Caroline Barbosa Farias Mourão, Guilherme D. Brand, Maura V. Prates, Carlos Bloch Jr, Sônia
Freitas, Elisabeth F. Schwartz
Palavras chave: Tityus obscurus, inibidor de serinoprotease, tripsina, Surface Plasmon Resonance,
dicroismo
circular.
O interesse na identificação de novos inibidores de protease (PIs) tem aumentado nas últimas décadas devido a seu potencial uso na prevenção de doenças humanas, tais como câncer,
artrite, inflamação, hemorragia, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Nesse estudo
apresentamos a caracterização biológica e estrutural de um polipeptídeo inibidor de serinoprotease isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus (família Buthidae), um escorpião
responsável por muitos casos de envenenamento na região Amazônica. Denominado ToPI1,
ele foi purificado por RP-HPLC da peçonha bruta do escorpião, e sua sequência parcial foi
determinada por MALDI-ISD. A sequência completa foi identificada com base no precursor,
obtido pela análise da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do T. obscurus. Com 33
resíduos de aminoácidos, três pontes dissulfeto e uma amidação C-terminal, o ToPI1 apresenta
menos de 45% de similaridade com toxinas descritas em bancos de dados, sendo o peptídeo
sinal de seu precursor o principal responsável por essa similaridade. Ainda assim, todas elas são
bloqueadores ou possíveis bloqueadores de canais de potássio, como a BmKK4, não havendo
similaridade com nenhum inibidor de protease descrito até o momento. O ToPI1 foi sintetizado usando a estratégia Fmoc/t-butila em suporte sólido e oxidado em tampão na presença
de glutationa, com a formação efetiva das três pontes dissulfeto. O peptídeo oxidado foi ativo
contra tripsina em ensaios cromogênicos e também por Ressonância Plasmônica de Superfície
(SPR), em um biossensor Biacore 3000. Nesse experimento, apresentou afinidade picomolar
para tripsina imobilizada (KD de 530 pM a 25◦ C). A temperatura mostrou pouca influência
na constante de dissociação, que variou de 658 a 472 pM, de 15-35◦ C, respectivamente. A
interação ToPI1:tripsina mostrou-se espontânea (∆G = -12,60 kcal.mol-1), endotérmica (∆H =
2,28 +- 0,84 kcal.mol-1) e dirigida pela entropia (∆S = 49,92 +- 2,82 cal.mol-1.K-1). O peptídeo
linear apresentou apenas cerca de 10-30% de inibição à tripsina, mostrando que a estrutura
tridimensional é essencial para a atividade. Em camundongos, mesmo na dose de 200 µg/animal
via i.p., o ToPI1 não causou alterações comportamentais. Análises por dicroísmo circular na
região distante do UV (190-260 nm) sugerem predominância de estruturas do tipo β (folhas-β
e voltas-β ) e desordenadas, e menor quantidade de α-hélice (aproximadamente 45, 42 e 14%,
respectivamente, a 25◦ C e pH 7). O ToPI1 mostrou-se um composto bastante estável, uma vez
que na faixa de pH 3,0-9,0 não houve desnaturação mesmo a 95◦ C. Experimentos adicionais
estão em andamento para a caracterização da superfície de interação do complexo ToPI1:tripsina.
3.3 Resumos
97
Genômica Comparativa de Aspergillus terreus aplicada a produção de metabólitos secundários
Rodrigo Theodoro Rocha
Palavras chave: genômica, comparativa, Aspergillus terreus, lovastatina, metabólito secundário
O fungo Aspergillus terreus há décadas é estudado devido sua característica de produzir metabólitos secundários de interesse biotecnológico destacando-se entre eles, a lovastatina composto
pertencente classe das estatinas, drogas mundialmente utilizadas na redução de níveis de colesterol. O objetivo do presente trabalho é estudar o genoma de oito isolados de A. terreus produtores
de lovastatina através das novas tecnologias de sequenciamento de DNA (NGS) com a finalidade
de comparar, identificar e elucidar os mecanismos moleculares atuantes na produção de metabólitos secundários, bem como a importância dos blocos de biossíntese de metabólitos secundários
(BMS) no fenótipo dos fungos. A metodologia empregada foi sequenciamento genômico dos
isolados utilizando a tecnologia Illumina de leituras curtas. O processamento das milhões de
sequências geradas foi feito em duas etapas: mapeamento das sequências contra o genoma de
referência A. terreus NIH (Broad Institute) e montagem "de novo" dos genomas de cada indivíduo. O emprego de diversas abordagens computacionais para reconstrução dos genomas permitiu
cobrir mais de 75% da extensão do genoma de referência (30 Mpb), sendo que cinco das cepas
tiveram 100% de cobertura. A análise genômica comparativa permitiu identificar a incidência
de grandes blocos sintênicos, e ao mesmo tempo a identificação de diversos polimorfismos de
base única (SNPs) entre as cepas possibilitando o desenvolvimento de marcadores moleculares
e predição de variantes funcionais. Foram observados também grandes blocos contíguos de
inserções e deleções (variantes estruturais) ao longo dos genomas, inclusive no região (cluster)
dos genes produtores de lovastatina. Ressaltando a plasticidade desses genomas. Entre uma das
cepas produtoras de lovastatina o gene chave LovB não foi identificado, sugerindo a ação de
outra dinâmica gênica na síntese desse composto. Um algoritmo baseado no alinhamento das
sequências foi desenvolvido para sanar as limitações no desenho de tradicional de primers para
diversos indivíduos e, com isso, validar resultados entre as cepas.
98
Capítulo 3. Resumos
Interação Molecular entre Anestésico Geral e Canal de Potássio Dependente de Voltagem
Juliana Mayumi Hosoume, Caio Silva Souza, Letícia Stock Vieira , Manuel Covarrubias, Werner
Treptow
Palavras chave: Anestésico, Canal Iônico, Dinâmica Molecular, Sevoflurano, Kv1.2, Constante de
Ligação
Há mais de 165 anos anestésicos gerais têm sido amplamente utilizados em milhões de cirurgias,
todavia os detalhes dos seus mecanismos anestésicos permanecem desconhecidos. A hipótese
mais creditada sugere uma ação de anestésicos em diferentes canais iônicos de tecidos neurais por interação em múltiplos sítios de ligação nessas proteínas de membrana. Estudos in
vitro recentes mostram alteração na condução dos canais de potássio dependentes de voltagem
pela ligação de anestésicos halogenados em múltiplas cavidades com distintas afinidades em
diferentes conformações. Nesse contexto, a investigação da interação envolve não somente a
descoberta de regiões putativas de ligação, como também de que forma essa interação poderia
alterar o equilíbrio entre as diferentes conformações do canal iônico. Contudo, a ligação do
anestésico pode ser uma condição necessária, mas não suficiente para atingir o efeito funcional.
Sabe-se que o sevoflurano, um anestésico inalável, potencializa o canal Kv1.2, um canal iônico
de potássio dependente de voltagem, deslocando a curva de condutância-voltagem para voltagens
mais negativas e aumentando a condutância máxima. Para tanto, foram realizadas trajetórias de
dinâmica molecular do canal Kv1.2 em bicamada lipídica com águas explícitas, a fim de amostrar
as flutuações de sua estrutura tanto na conformação aberta quanto na fechada. Dessa simulação,
foram escolhidos ao acaso 120 frames para a realização de docking molecular por meio do
Autodock Vina, assim obtidos aproximadamente 2400 modos de interação. Após o agrupamento
e análise das soluções, foram eleitos os centros das nuvens de soluções de quatro potenciais
sítios distintos para estruturar o complexo anestésico-canal e, então, avaliar a afinidade do ligante
sítio-específica por cálculos de energia livre baseados em simulações de dinâmica molecular. Pela
utilização do método LIE (Linear Interaction Energy), percebeu-se grande afinidade pelo sítio
próximo ao filtro de seletividade, de tal forma que este pode estar favorecendo a estabilização
da conformação condutiva, logo aumentando a condutância do canal. Ao considerar apenas
as conformações aberta e fechada do canal, além das afinidades obtidas para múltiplos sítios,
foi possível calcular as densidades de probabilidades para os estados ligados e, dessa forma,
encontrar um deslocamento da curva condutância-voltagem semelhante ao experimental. Os
presentes dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína e propõe formas
de análise do intricado mecanismo de modulação por ligantes, favorece, assim, futuros estudos
experimentais dos mecanismos de ação na anestesia.
3.3 Resumos
99
EDIÇÃO DE GENES ASSOCIADOS A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS EM
SOJA.
Débora Torres Alves Figueiredo , Marly Catarina Felipe Coelho, André Melro Murad, Nicolau
Brito Da Cunha, Giovanni Rodrigues Vianna, Cintia Marques Coelho, Elibio Leopoldo Rech
Filho
Palavras chave: TALEN, edição de genoma, ácidos graxos, ácido oleico, ácido linoleico
A soja é uma das principais commodity agrícola do mundo, sendo utilizada com diversas
finalidades desde fonte de alimento à aplicações industriais. Atualmente o Brasil é o maior exportador de soja e o segundo maior produtor de soja no mundo. O oleo de soja vem frequentemente
sendo utilizado como fonte de biodiesel, visto que a soja se destaca pelo alto teor e qualidade do
óleo de suas sementes, domínio do sistema de produção em larga escala e custo reduzido quando
comparado a qualquer outro óleo. Sementes de soja apresentam um perfil de ácidos graxos
composto principalmente de 13% de ácido palmítico (16:0), 4% de ácido esteárico (18:0), oléico
18% ácido (18:1), ácido linoléico 55% (18:2) e 10% de ácido linolênico (18:3), sendo rico em
ácidos graxos poliinsaturados e frequentemente é parcialmente hidrogenado para aumentar a sua
estabilidade oxidativa, o que gera quantidades significativas de gorduras trans que estão ligadas a
doenças cardiovasculares. Para melhorar as características do óleo de soja, tem-se sugerido o
desenvolvimento de um óleo rico em ácido oléico e com baixo teor de ácidos graxos saturados.
Durante a síntese dos ácidos graxos sabe-se que os genes FAD2-1A e FAD2-1B são importantes
na conversão do óleo monoinsaturado (oléico) em óleo poliinsaturado (linoléico). Neste trabalho
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) foram desenhadas a fim de se obter
mutações nos genes FAD2-1A e FAD2-1B utilizando um sitio alvo conservado em ambos os
genes. Também foram analisados possíveis off tagets demonstrando que o fenótipo observado
era devido a apenas indels do alvo do TALEN. Plantas T0, T1 foram analisadas quantos ao
perfil de óleos, mostrando concentrações variando de 31-66% de oleico. As regiões alvos do
TALEN foram sequenciadas e apresentaram pequenas deleções. Genes da família FAD2 foram
analisados como possíveis off targets, já que os genes FAD2-1, FAD2-2, e FAD2-3 compartilham
alta similaridade de sequencias. Os candidatos a off target foram amplificados por PCR e seus
produtos foram sequenciados, não mostrando nenhuma mutação.
Apoio: CENARGEN e CNPq/UnB
100
Capítulo 3. Resumos
Desenvolvimento de sistema de genotipagem de alto desempenho de SNPs para Araucaria
Pedro Italo Tanno Silva, Orzenil Bonfim Da Silva Junior, Dario Grattapaglia
Palavras chave: SNPs, RNAseq, RADseq, marcadores moleculares, genotipagem, diversidade
genética,
araucária
Araucaria angustifolia (Bert.) Kuntze, comumente chamada de pinheiro-do-Paraná, é uma
conífera endêmica e dominante com ocorrência majoritariamente na região Sul do Brasil mas
também sendo encontrada no estado de São Paulo e sul do estado de Minas Gerais. É a árvore
mais importante em sua região de ocorrência devido a seu papel ecológico, econômico e social alta qualidade da madeira permite com que seja usada para diversos fins (construção, movelaria
e celulose), a coleta e comercialização de suas sementes constituem uma importante fonte de
renda para famílias dessa região, além de alimentar pássaros e pequenos roedores. A exploração
desordenada principalmente durante o século 20 fez com que a espécie fosse incluída na Lista
Vermelha de espécies ameaçadas de extinção da IUCN e tivesse sua área de ocorrência natural
reduzida a aproximadamente 3% do total inicial. Informação sobre a diversidade genética e o
conhecimento da estrutura genética das populações naturais ajuda a definir estratégias não apenas
visando o melhoramento, mas também a conservação e gerenciamento responsável da espécie.
Nos últimos anos alguns estudos de diversidade e estrutura genética de A. angustifolia foram
feitos utilizando, entretanto, poucos marcadores moleculares e alguns deles com baixo conteúdo
informativo tais como isoenzimas, microssatélites, AFLP e RAPD. Em vista disso, os objetivos
desse projeto são (1) desenvolver um sistema de genotipagem de alto desempenho de SNPs para
araucária - tornando a genotipagem de um grande número de amostras mais eficiente e (2) analisar a estrutura genética bem como diversos parâmetros populacionais de diferentes populações
naturais e populações de melhoramento de araucária. A primeira parte do projeto compreende a
descoberta dos SNPs e fabricação de um chip de SNPs com cerca de 3.000 SNPs distribuídos
pelo genoma. Para essa etapa de descoberta dos SNPs foram utilizados dados de (1) RNA-seq
disponibilizados no GenBank em 2014 (dados referentes ao artigo: doi:10.1007/s11240-0140523-3) e (2) RADseq. Os dados foram analisados separadamente e usando pipelines específicos
para cada tipo de ensaio. A descoberta de SNPs a partir de dados de RADseq resultou em
aproximadamente 3.200 SNPs, e a partir de dados de RNA-seq resultou em aproximadamente 12
mil SNPs que passaram em todos os critérios de seleção utilizados. A genotipagem das amostras
será realizada utilizando-se um array Axiomr myDesignT M comercializado pela Affymetrix e
serão genotipadas 991 amostras de araucária vindas de diferentes populações.
3.3 Resumos
101
"OMICS" aplicada à identificação de genes envolvidos em resposta a estresses biótico
e abiótico em Arachis sp.
Andressa Da Cunha Quintana Martins, T. N. Oliveira, C. C. C. Martins, L. A. Guimarães, L . S .
T. Carmo, R. M. D. G. Carneiro, L. P. Silva, A. N. G. Araújo, A. C. M. Brasileiro, A. M. Reis, P.
M. Guimarães, R. N. G. Miller
Palavras
chave:
omics,
estresse,
Arachis
sp.
O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma cultura alimentar importante, que apresenta estreita base genética e alta suscetibilidade aos estresses bióticos (ataque de fitopatógenos) e
abióticos (como a seca). Por outro lado, seus parentes silvestres diploides, expostos naturalmente
a condições ambientais adversas e ao estresse biótico, têm sido selecionados durante a evolução
e apresentam maior variabilidade genética, sendo uma potencial fonte de alelos de resistência
a doenças e à adaptação a diversos ambientes. Dentre os parentes silvestres do amendoim
do genoma AA, A. stenosperma apresenta resistência a várias pragas, incluindo o nematoide
das galhas (Meloidogyne arenaria raça 1), por meio de reação de hipersensibilidade, enquanto
que A. duranensis, originária de regiões com poucas chuvas, apresenta maior tolerância a seca,
apresentando um perfil de transpiração mais conservativo que a espécie cultivada. Desta forma,
ambos os genótipos são interessantes para a descoberta de genes relacionados à resistência
ao nematoide e tolerância a seca. A aplicação de tecnologias conhecidas como “omics”, que
incluem o sequenciamento massal do transcritoma, para estudo da expressão gênica, assim como
a análise do proteoma da interação planta-estresse, seja por 2-DE (de proteínas diferencialmente
abundantes) ou por tecnologias gel free (para identificação de proteínas totais), tem auxiliado
no entendimento dos processos biológicos envolvidos na defesa da planta, e possibilitado a
descoberta, identificação e seleção de candidatos à resistência/tolerância ao nematoide e a seca
em seus respectivos genótipos, os quais serão alvos de estudos posteriores sobre a sua função
biológica, por meio de produção de plantas transgênicas, utilizando Agrobacterium sp., assim
como a elucidação das vias metabólicas envolvidas na resposta de defesa. O transcritoma de A.
duranensis submetido à seca e de A. stenosperma inoculado com o nematoide foram sequenciados
(Roche 454 Titanium e Illumina Hi-Seq 2000) gerando 12.792 e 44.132 contigs, respectivamente.
Para cada experimento, o número de genes diferencialmente expressos, considerando pelo menos
4 fold change (log2FC >2,0 ou 6-2,0) e com P-value <0,05, foi de 1514 contigs nas bibliotecas
de A. duranensis e de 958 nas de A. stenosperma. Já a análise proteômica por 2-DE revelou
um total de 59 proteínas diferencialmente abundantes, incluindo 19 diminuídas, 15 aumentadas
e três exclusivas em plantas de A. duranensis submetida à seca. A partir das proteínas identificadas neste estudo (14 até o momento), quatro (Ascorbato Peroxidase, Precursor de Lectina,
Proteína ligada a fosfolipídeo e Enolase) mostraram um perfil de expressão compatível entre
os dados proteômicos e transcritômicos. Em outros casos, modificações pós-transcricionais ou
pós-traducionais podem ter alterados os níveis reais de proteínas. Esta mesma análise (ainda sem
resultados) está sendo realizada para amostras de A. stenosperma inoculadas com nematoide. Algumas dessas proteínas serão selecionadas para análise de expressão dos genes correspondentes
por RT-qPCR e sua função biológica será avaliada por meio de plantas transgênicas. Os dados
aqui obtidos contribuirão para um melhor entendimento da resposta das plantas ao deficit hídrico
e ao ataque do nematoide das galhas, destacando genes candidatos que possam estar envolvidos
no aumento da tolerância à seca e na resistência ao patógeno.
102
Capítulo 3. Resumos
Clonagem e expressão de duas β -glicosidases fúngicas em Pichia pastoris e suas aplicações na hidrólise da celulose de bagaço de cana de açúcar
Amanda Gregorim Fernandes, Lorena Cardoso Cintra, Rosália Santos Amorim Jesuíno, Fabrícia
Paula De Faria, Márcio José Poças Fonseca
Palavras chave: Humicola grisea, Penicillium echinulatum, β -glicosidases, glicosil hidrolases,
Pichia
pastoris
Lignocelulose é o principal componente estrutural da parede celular de plantas. Ela é composta
por três principais componentes: celulose, hemicelulose e lignina. A bioconversão de celulose a
glicose requer três enzimas: endoglucanases (EGs), celobiohidrolases (CBHs) e β -glicosidases
(BGLs). O custo elevado na produção dessas enzimas é um obstáculo para que o processo de
produção de bioetanol se torne economicamente viável. Uma das enzimas produzidas pelo fungo
Humicola grisea var. thermoidea, a BGL4, além de ser termoestável, não é reprimida por seu
produto no meio reacional, a glicose. Essa enzima possui 1431pb, massa molecular predita
de 54 kDa e 476 aminoácidos. Pertence a família GH1 das glicosil hidrolases. A linhagem
9A02S1 de Penicillium echinulatum produz altos níveis de β -glicosidases com potencial uso
na transformação da celulose a glicose. Possui 2535pb, massa molecular predita de 94 kDa e
863 aminoácidos. Essa enzima possui domínios pertencentes à família GH3. As β -glicosidases
geralmente estão classificadas dentro dessas duas famílias e o uso de duas enzimas de diferentes
famílias no mesmo meio reacional podem levar a um melhor rendimento na degradação das
cadeias de celulose. Este trabalho tem como objetivo produzir, expressar e purificar as enzimas
recombinantes HgBGL4 e PeBGL1 na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para o isolamento
do gene HgBGL4 foi realizado uma indução da produção de celulases pelo fungo em diferentes
fontes de carbono e coletados os micélios para uma posterior extração de RNA totais e amplificação do cDNA por RT-PCR com primers específicos utilizando farelo de trigo a 2% (FT 2%)
como indutor, e em seguida, clonado em vetores de expressão de P. pastoris. Enquanto isso, o
cDNA PeBGL1 foi sintetizado quimicamente de acordo com os dados obtidos na biblioteca em
situação de indução de celulases desse fungo e posteriormente clonado em vetor de expressão de
P. pastoris. Os vetores produzidos foram transformados nas linhagens GS115 e SMD1168 de P.
pastoris gerando linhagens Mut+ e Muts. Os transformantes foram analisados alterando-se meios
de culturas, pHs, temperaturas, estabilidade genética, curva de crescimento e concentração de
metanol, foram, ainda, analisadas as atividades de sobrenadantes de culturas, extrato intracelular
e pellet. Novas estratégias de construção dos vetores de clonagem estão sendo avaliados. Após
análises das características bioquímicas iremos propor a viabilidade de comporem misturas
enzimáticas para hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar.
3.3 Resumos
103
Avaliação de um novo isolado de fungo filamentoso (SFU01) do bioma cerrado com
potencial xilanolítico
Sadia Fida Ullah, Eliane Ferreira Noronha
Palavras
chave:
Xilanase,
resíduos
agrícolas,
etanol
de
segunda
geração
A atual demanda por fontes alternativas de combustíveis que apresentam menor impacto ambiental está sendo impulsionada não apenas por pressões ambientais, mas também por questões de
cunho econômico. Dentre as alternativas de maior possibilidade de escalonamento industrial
encontra-se o etanol de segunda geração, estratégia em que fontes lignocelulósicas renováveis
como resíduos agrícolas e industriais são aproveitados para geração de açucares fermentescíveis
e então aplicados para fermentação alcoólica realizada por linhagens industriais de leveduras.
Alternativamente ao uso de apenas açúcares de seis carbonos para fermentação alcoólica na
indústria do etanol de segunda geração, existe uma demanda para o aproveitamento de açúcares
de cinco carbonos como a xilose presente na hemicelulose. Tendo em vista a necessidade do
desenvolvimento de novas misturas enzimáticas que possam de forma eficiente hidrolisar a fração
rica em açúcares de cinco carbonos da parede celular vegetal, o isolado SFU01 foi obtido de
solo do bioma cerrado e então avaliado quanto a capacidade de produção de xilanases em meio
sólido e líquido. Após a identificação de tal isolado como um bom produtor de xilanases, o
crescimento em meio líquido contendo 1% (p/v) de bagaço de cana não tratado foi realizado.
A curva de produção de enzimas xilanolíticas com meio suplementado com bagaço de cana
indicou uma maior produção durante o quinto e sexto dia de cultivo atingindo valor acima de
1 UI/mL. Com base na capacidade de produção de xilanases obtidas durante a degradação de
bagaço de cana em meio líquido e almejando um melhor entendimento nas enzimas envolvidas
em tal processo, o sobrenadante da cultura crescido por 12 dias foi concentrado 10x por meio de
ultrafiltração utilizando uma membrana de corte de 10 kDa. Após obtenção do concentrado o
mesmo foi submetido a um processo cromatográfico de exclusão molecular em uma coluna G-75
(Sefarose) (80 x 3 cm) em um fluxo de 0,30mL/min e frações de 3 mL foram coletadas, o perfil
cromatográfico gerado mostrou um pico de proteínas ( Absorbância 280 nm) entre as frações 60 e
70 e o pico de atividade xilanolítica foi observado entre as frações 40 e 50, mostrando que foi possível realizar uma separação parcial das enzimas com atividade hidrolítica das demais proteínas
contidas no sobrenadante. A análise do perfil cromatográfico por meio de gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) juntamente com o zimograma mostraram a presença de uma banda proteica entre
40 e 30 kDa contendo atividade catalítica, sendo essa a única isoforma de xilanase observada no
gel de atividade. A avaliação preliminar da produção de xilanases por esse novo isolado de fungo
mostrou-se promissora, o processo de purificação por meio de exclusão molecular foi eficiente,
porém a única isoforma de xilanase observada não foi obtida em sua forma purificada sendo
necessário a aplicações de mais processos cromatográficos. Paralelamente a análise enzimática,
extrações de DNA genômico estão sendo realizadas para a correta identificação molecular desse
novo isolado.
4. Conheça o Instituto de Biologia
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