INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA-INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA
IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE BACTÉRIAS
PATOGÊNICAS ASSOCIADAS À CRIAÇÃO DE PEIXES AMAZÔNICOS
ELIANE CARDOSO CARVALHO
Manaus, Amazonas
Junho, 2012
ELIANE CARDOSO CARVALHO
IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE BACTÉRIAS
PATOGÊNICAS ASSOCIADAS À CRIAÇÃO DE PEIXES AMAZÔNICOS
ORIENTADOR: JORGE IVAN REBELO PORTO
CO-ORIENTADORA: ANDRÉA BELÉM COSTA
Dissertação
apresentada
ao
Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia como parte dos
requisitos para obtenção do título
de
Mestre
em
Genética
Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
Junho, 2012
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
C331
Carvalho, Eliane Cardoso
Identificação fenotípica e molecular de bactérias patogênicas associadas à
criação de peixes amazônicos / Eliane Cardoso Carvalho.--- Manaus : [s.n.],
2012.
xiii, 134 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2012
Orientador : Jorge Ivan Rebelo Porto
Coorientador : Andréa Belém Costa
Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
Sinopse:
1. Peixes – Amazõnia. 2. Bacterias. 3. Colossoma macropomum.
4. Arapaima gigas. 5. Brycon amazonicus. 6. Criação de animais. 7. 16SrRNA.
A identificação bacteriana foi realizada em isolados de Colossoma macropomum,
Arapaima gigasI. eTítulo.
Brycon amazonicus, cultivados em estações de piscicultura do Estado do
Amazonas. Foram realizadas caracterização bacteriana fenotípica clássica e molecular, com
sequenciamento da região parcial do gene 16S rRNA, e análise filogenética por Neighborjoining. As análises evidenciaram a ocorrência de 35 espécies bacterianas agrupadas em 17
gêneros e nove famílias. Registra-se nesta dissertação
CDDa 19.
ocorrência
ed. 597.5042
de espécies bacterianas
com primeiro relato da ocorrência em peixes de cultivo do Amazonas.
Palavras-chave: 16S rRNA, bacteriana, Colossoma macropomum, Arapaima gigas, Brycon
amazonicus.
iii
Dedico este trabalho,
Ao meu marido Alex Maia
Minha mãe Helinay Carvalho
Minha tia Joveci Carvalho
iv
Agradecimentos
Em primeiro lugar, agradeço meu maravilho Deus, que ao longo de toda minha jornada esteve
comigo guiando meus caminhos e me concedendo forças em todos os obstáculos, permitindo a
realização de mais um sonho. A Caminhada foi longa, mas, uma vida sem desafios não vale a pena ser
vivida.
Ao meu marido Alex Maia, por todo seu amor, amizade, dedicação e companheirismo. Por ter
entendido todos os momentos que fiquei ausente e por sempre ter me ajudado em tudo que precisei.
Tenho certeza que sem todo seu amor eu não teria conseguido!
À minha mãe Helinay Carvalho, que mesmo longe me deu todo seu amor, conselhos sempre,
não me deixando ficar triste por nada.
À minha querida tia Joveci Carvalho, que sempre foi meu anjo da guarda e inspiração que
sempre me deu forças e me fez trilhar esse caminho.
Aos meus amados irmãos Alberto Jr. e Andreza Carvalho e ao meu primo Felipe, que me
fazem querer seguir em frente sempre, e torcem por mim em tudo.
À minha amada avó Helena Carvalho, por todo seu amor e conselhos, me ensinando a nunca
desistir dos meus sonhos.
À minha tia Leila Carvalho e minha prima Aline, por estarem comigo sempre oferecendo suas
mãos amigas.
À minha melhor e mais companheira amiga Suélen Dias que passou tudo isso junto comigo,
me fazendo rir, aconselhando, ajudando nos momentos mais tensos das análises no laboratório,
estando comigo desde o ínicio da vida científica em Santarém, torcendo e oferencendo sua amizade
nos momentos mais tristes. Susu valeu por tudo!
Ao meu orientador Jorge Porto, que me abriu as portas do INPA oferecendo o primeiro
estágio em genética molecular, estendeu a mão quando eu precisei, tirou minhas dúvidas e me ensinou
a base de Biologia Molecular. Que não só foi um orientador de mestrado, mas também de vida, em
muitos conselhos que deu em vários momentos difíceis ao longo desta jornada.
À minha co-orientadora Andréa Belém, que me ensinou muito sobre microbiologia, me
ensinando toda base da maneira mais metódica possível. Me oferecendo todas os ferramentas
possíveis para conclusão da parte fenotípica deste trabalho. Por todos os seus conselhos e por toda
confiança que depositou em mim, me dando a oportunidade de aprender muito mais.
À Dra. Eliana Feldberg, pelo seu axílio na compra de materiais, por todos os conselhos e por
toda sua solicitude em inúmeras vezes que precisei.
v
Ao Dr. Spartaco Astolfi, por ter permitido realizar a parte molecular no Laboratório de DNA,
e por todas minhas dúvidas que tirou.
À Dina que sempre esteve disposta a me ajudar, tirando minhas dúvidas e cedendo seu tempo
pra me ajudar quando por muitas vezes fiquei altas horas no laboratório finalizando experimentos.
Ao Edson, que sempre que podia tirava minhas dúvidas me ensinando muito sobre biologia
molecular e me fazendo rir, discondraindo os dias corridos.
Ao Dheims Araújo, que me ajudou muito no ínicio das análises fenotípicas bacterianas, no
preparo dos meios de cultivo que não foram poucos.
A Mirna Myamoto, por ter me ajudado nos momentos de correria no Laboratório,
principalmente nas PCRs que não funcioram.
Ao Elson, Henriette, Luciana, Hugo, Hélber, Anita e Júnior, pelas boas horas de discontração,
ao Thiago pelas todas as dúvidas tiradas, à Ivanete e a dona Elza pelo auxílio no preparo reagentes.
À equipe do Laboratório de Genética Animal do Inpa. Ao Carlos e a Leandra, que muitas
vezes me ajudaram tirando minhas dúvidas, principalmente me ensinando o preparo de reagentes. À
Denise, que em inúmeras vezes me ajudou no laboratório.
Aos amigos do LTBM, Giselle, que muitas vezes me ajudou no que precisei, e ao Saulo por
ter me ajudado no sequenciamento e a Dra Jackeline Batista por cedido permitido a realização do
sequenciamento no laboratório.
À Gisele Torres, por toda sua amizade e conselhos.
À Dra Luciana Leomil por ter me ajudado a interpretar os dados da identificação molecular
bacteriana.
Dr. Edmar Vaz, que me por muitas vezes tirou minhas dúvidas me ensinando os processos de
biologia molecular.
Ao Dr. Daniel Saito, por ter cedido seu tempo em me ensinar a usar os programas de
bioinformática e me ajudar a interpretar análises filogenéticas.
Ao PPG GCBEV e seu corpo administrativo (Alessandra, Tamara, Elci) pelo apoio
incondicional.
À Capes e a Fapeam pela bolsa concedida.
vi
"Confia no Senhor de todo o seu coração e não se
apóie na sua própria inteligência. Lembre-se de Deus
em tudo o que fizer, e ele lhe mostrará o caminho
certo" (Prov. 3:5-6).
vii
Resumo
Com a intensificação do cultivo de peixes em condições artificiais são observadas
mortalidades causadas por bactérias patogênicas oportunistas, o que pode levar a grandes
perdas econômicas. Essas mortalidades podem ser observadas em cultivos de espécies
regionais como o pirarucu, o tambaqui e a matrinxã. Os principais objetivos desta dissertação
foram realizar análises fenotípicas e moleculares para identificar bactérias patogênicas nas
espécies Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon
amazonicus (matrinxã), bem como estabelecer relações evolutivas entre as espécies. Foram
analisados 72 isolados bacterianos da coleção de cultura de bactérias patogênicas em peixes
(Universidade Federal do Amazonas - UFAM), provenientes de pirarucu, tambaqui e matrinxã
oriundos de pisciculturas. As identificações fenotípicas foram feitas utilizando 19 testes
bioquímicos (Gram, teste KOH, oxidase, catalase, oxidação, fermentação, motilidade, H2S,
indol, gás, glucose, uréase, lactose, citrato, arabinose, dulcitol, inositol, rafinose, trealose). As
identificações moleculares foram realizadas por meio do sequenciamento parcial do gene 16S
rRNA. Nas abordagens fenotípicas e moleculares foram identificadas 35 espécies agrupadas
em 17 gêneros e nove famílias bacterianas: Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae,
Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moroxellaceae, Paenibacillaceae, Staphylococcaceae,
Streptococcaceae. Os maiores grupos foram formados pelas famílias (Enterobacteriaceae e
Bacillaceae) as quais mostraram-se claramente polifiléticos, tendo em vista que os gêneros e
as espécies dentro destas famílias agruparam-se com gêneros e espécies distintas. Pode-se
concluir que as abordagens utilizadas permitiram a identificação, classificação e reconstrução
filogenética dos isolados bacterianos estudados.
viii
Abstract
The intensification of fish breeding in artificial conditions has led to mortalities caused by
opportunistic pathogenic bacteria, leading to huge economic losses. These mortalities can be
observed in cultures of regional species such as: pirarucu, tambaqui and matrinxã. The main
objectives of this dissertation was to conduct molecular and phenotypic analyzes to identify
pathogenic bacteria in Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) and
Brycon amazonicus (matrinxã), and to establish evolutionary relationships between bacteria
species. We analyzed 72 bacterial isolates from the culture collection of pathogenic bacteria
in fish (Universidade Federal do Amazonas- UFAM), from pirarucu, tambaqui and matrinxã
from fish farms. The phenotypic identifications were made using 19 biochemical tests (Gram
staining, KOH test, oxidase, catalase, oxidation, fermentation, motility, H2S, indole, gas,
glucose, urease, lactose, citrate, arabinose, dulcitol, inositol, raffinose, trehalose). The
molecular identifications were performed using partial sequencing of 16S rRNA. Phenotypic
and molecular approaches identified 35 bacteria species grouped in 17 genera and nine
families:
Bacillaceae,
Microbacteriaceae,
Enterobacteriaceae,
Moroxellaceae,
Enterococcaceae,
Paenibacillaceae,
Flavobacteriaceae,
Staphylococcaceae
and
Streptococcaceae. The largest groups were formed by the families (Enterobacteriaceae and
Bacillaceae) which were clearly polyphyletic since genera and species within these families
were grouped with different genus and species. It can be concluded that the approaches used
allow the identification, classification and phylogenetic reconstruction of bacterial isolates
studied.
ix
Sumário
1- Introdução ....................................................................................................................................... 14
2-Revisão Bibliográfica ....................................................................................................................... 15
2.1-Aquicultura no Brasil ................................................................................................................. 15
2.2-Piscicultura na Amazônia .......................................................................................................... 16
2.3-Espécies de peixes de interesse comercial na Amazônia ........................................................... 17
2.4-Bacteriose em Peixes ................................................................................................................. 19
2.5-Métodos de identificação fenotípica e molecular de microrganismos ....................................... 21
2.6-Taxonomia e Filogenia Molecular Bacteriana ........................................................................... 23
2.7-RNA ribossômico 16S ............................................................................................................... 25
3-Objetivos ........................................................................................................................................... 27
3.1-Geral .......................................................................................................................................... 27
3.2-Específicos ................................................................................................................................. 27
4-Material e Métodos .......................................................................................................................... 28
4.1-Coleta ......................................................................................................................................... 28
4.1-Reativação e purificação de Bactérias ....................................................................................... 31
4.2-Identificação fenotípica bacteriana ............................................................................................ 31
4.3-Coloração Gram ......................................................................................................................... 31
4.4-Teste KOH ................................................................................................................................. 32
4.5-Teste de catalase e oxidase ........................................................................................................ 32
4.6-Teste em meio ágar MacConkey ............................................................................................... 33
4.7-Teste em ágar citrato de Simmons ............................................................................................. 33
4.8-Teste em meio SIM (sulfato/indol/motilidade ágar) .................................................................. 34
4.9-Teste em meio OF (oxidação e fermentação) ............................................................................ 34
4.10-Teste de Urease ........................................................................................................................ 35
4.11-Produção de gás e fermentação de carboidratos ...................................................................... 35
4.12-Hemólise bacteriana................................................................................................................. 36
4.13-Identificação molecular bacteriana .......................................................................................... 37
x
4.14-Extração do DNA genômico bacteriano .................................................................................. 37
4.15-Reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação do gene 16S rRNA ..................... 38
4.16-Purificação das amostras .......................................................................................................... 39
4.17-Sequenciamento e análise das sequências................................................................................ 39
4.18-Análises por Bioinformática .................................................................................................... 40
4.19-Análises filogenéticas das sequências...................................................................................... 40
5-Resultados ......................................................................................................................................... 42
5.1-Caracterização fenotípica bacteriana ......................................................................................... 42
5.2-Coloração Gram e teste KOH .................................................................................................... 42
5.3-Testes bioquímicos .................................................................................................................... 43
5.4-Extração de DNA genômico e amplificação do 16S rRNA ....................................................... 47
5.5-Identificação molecular das bactérias ........................................................................................ 48
5.6-Análises Filogenéticas ............................................................................................................... 57
6-Discussão ........................................................................................................................................... 60
6.1-Identificações das espécies bacterianas ..................................................................................... 60
6.1.1- Identificações fenotípicas das famílias e espécies bacterianas .............................................. 60
6.1.2- Identificações moleculares de famílias e espécies bacterianas.............................................. 66
6.1.3- Análises filogenéticas dos isolados bacterianos .................................................................... 75
6.1.4- Identificações gerais dos isolados bacterianos ...................................................................... 78
6.1.5- Espécies identificadas patogênicas em peixes....................................................................... 81
7-Conclusões ........................................................................................................................................ 84
8-Referências ....................................................................................................................................... 85
Anexo .................................................................................................................................................. 104
xi
Lista de Tabelas
Tabela 01-Isolados bacterianos de tambaqui......................................................................... 28
Tabela 02-Isolados bacterianos de matrinxã.......................................................................... 29
Tabela 03-Isolados bacterianos de pirarucu........................................................................... 30
Tabela 04-Resultado do teste Gram para cada isolado bacteriano........................................ 42
Tabela 05-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de tambaqui................ 44
Tabela 06-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de matrinxã................... 45
Tabela 07-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de pirarucu.................... 46
Tabela 08- Taxonomia molecular dos isolados PPUFAM..................................................... 52
xii
Lista de Figuras
Figura 01- Esquema da localização aproximada do anelamento dos iniciadores 530F e
1492R (Borneman e Triplett 1997), de acordo com o tamanho do gene 16S rRNA
(Clarridge,
2004).
V3-V9:
regiões
conservadas
de
anelamento
dos
iniciadores...............................................................................................................................
39
Figura 02: Método de coloração de Gram................................................................................. 42
Figura 03- Beta () hemólise em isolados PPUFAM 54 (a) e PPUFAM 63(b). Placas em
ágar sangue de carneiro desfibrinado a 7%................................................................................. 44
Figura 04- Foto da extração de DNA genômico bacteriano em gel de agarose 0,8%. (M)Marcador de peso molecular lâmbida (λ).................................................................................... 47
Figura 05- Foto da amplificação do gene 16S rRNA por PCR em gel de agarose
0,8%.Marcador molecular (M) Ladder de 1Kb (Promega).(C-) controle negativo da
reação.......................................................................................................................................... 47
Figura 06- Famílias bacterianas identificadas e o percentual de amostras
encontradas....................................................................................................................................49
Figura 07- Dendograma filogenético (Neighbor-Joining) do 16S rRNA de isolados
bacterianos amazônicos (PPUFAM) e de estirpes de referência (ATCC).................................. 59
xiii
1- Introdução
O conhecimento sobre a variedade de espécies bacterianas patogênicas em peixes de
interesse comercial é de extrema importância uma vez que as infecções bacterianas são
responsáveis por grandes perdas em criações intensivas as quais podem apresentar índice
elevado de mortalidade, apesar de não haver dados oficiais sobre os prejuízos econômicos
causados em pisciculturas brasileiras. A identificação dos pátogenos causadores de doenças
em peixes é de extrema importância, pricipalmente para determinar medidas profiláticas que
reduzam os índices de mortalidade em cultivos de peixes bem como para classificar espécies
bacterianas (Costa, 2004).
As técnicas de biologia molecular, juntamente com os métodos clássicos empregados
para identificação de espécies patogênicas, têm propiciado um importante desenvolvimento na
eficiência e na qualidade do diagnóstico das enfermidades bacterianas (Vandamme et al.
1996; Ludwig e Klenk, 2001, Figueiredo e Leal, 2008), principalmente para doenças em
peixes causadas por bactérias de difícil isolamento e cultivo em laboratório (Figueiredo e
Leal, 2008).
Novas espécies têm sido reconhecidas e reclassificadas pelo sequenciamento do gene
16S rRNA propiciando uma alternativa rápida e eficiente na identificação de bactérias e sendo
importante para obtenção de informações sobre a filogenia e a sistemática bacteriana (Tanner
et al., 2000; Ludwig e Klenk, 2001; Ahmed et al., 2007).
Sabe-se que a biodiversidade microbiana da região Amazônica é muito grande, porém
poucos são os trabalhos para investigar a complexa microbiota (Benner et al. 1995; Borneman
e Triplett, 1997), principalmente dos microrganismos causadores de patogenias em peixes.
Nesse trabalho foram utilizadas abordagens fenotípicas e moleculares as quais
propiciaram uma alternativa rápida e eficiente na identificação de bactérias patogênicas em
peixes. Este trabalho é pioneiro na determinação fenotípica e molecular de bactérias
causadoras de epizootias em peixes de cultivo do Amazonas.
14
2- Revisão Bibliográfica
2.1- Aquicultura no Brasil
O Brasil é um país que possui 12% das reservas disponíveis de água doce do mundo,
com mais de dois milhões de hectares de zonas úmidas, estuários e reservatórios adequados
para a aquicultura (FAO, 2010). Possui a maior fauna de peixes de água doce do mundo, com
cerca de 2590 espécies, existindo muitas ainda desconhecidas (Buckup et al., 2007; Godinho
2007). Por apresentar um imenso complexo hidrográfico e clima favorável o Brasil possui
dentre estas, inúmeras vantagens para o desenvolvimento de organismos aquáticos cultivados
(Ferreira, 2007).
Com o cultivo de espécies aquáticas surgiu à prática de aquicultura que é o cultivo ou
criação de organismos aquáticos cujo ciclo de vida se desenvolve em condições naturais, total
ou parcialmente em meio aquático (Eler e Milani 2007; Oliveira 2009; FAO, 2012). De
acordo com Figueiredo et al. (2008) a aquicultura é o setor da agropecuária brasileira com
maior expansão nos últimos anos, o crescimento da atividade no Brasil superou a média
mundial. Sua atividade vem crescendo sensivelmente em relação à pesca, tornando-se uma
importante alternativa para a produção de pescado, tanto em área continental como marinha
(Santos, 2009). O aumento da exploração indiscriminada dos estoques pesqueiros naturais
tornou a aquicultura uma alternativa importante para regularizar a oferta de matéria-prima e
com este desenvolvimento a atividade entrou em franca expansão (Camargo e Pouey, 2005).
A partir de 1990, ocorreu a expansão da aquicultura comercial brasileira, inluindo a
piscicultura, como uma atividade econômica no cenário nacional da produção de alimentos
(Ferreira, 2007).
Entre 1994 e 2003 a piscicultura brasileira teve um aumento significativo pulando de
4,3% para 28,1% de toda a produção pesqueira do país (FAO, 2012). Cabendo destacar que
dentre as principais espécies nativas cultivadas foram: tambaqui (Colossoma macropomum),
pacu (Mylossoma spp.) e matrinxã (Brycon amazonicus) (Castagnolli, 2004).
Segundo Ostrensky et al. (2008), o Brasil é o segundo país em importância na
produção aquícola na América do Sul, ficando abaixo do Chile. A maior parte da produção da
aquicultura brasileira é proveniente da produção em território continental alcançando cerca de
70%. Essa preferência é decorrente da disponibilidade de grandes extensões de terra passíveis
de serem destinadas ao cultivo; a abundância de água doce e limpa e a boa adaptabilidade das
espécies destinadas à criação (Oliveira, 2009). Atualmente, a aquicultura é praticada em todos
15
os Estados brasileiros e abrange, principalmente, as modalidades de piscicultura,
carcinicultura, ranicultura e malacocultura (Santos, 2009).
Na região Norte várias espécies de peixes são cultivadas, porém apenas 14 espécies
são espécies nativas, o que em relação à diversidade ictiológica da região é um número
extremamente reduzido (Santos, 2009).
2.2- Piscicultura na Amazônia
A bacia amazônica configura-se como um imenso complexo de rios, igarapés, lagos,
canais e furos (Santos e Santos, 2005) e possui cerca de 20% dos recursos de água doce dos
rios do planeta, que encerram cerca de 2.500 espécies de peixes (Valois, 2003) e detém a
maior biodiversidade sendo considerado um dos ecossistemas mais íntegros e produtivos do
mundo (Santos e Santos, 2005). Essa complexa diversidade dos estoques pesqueiros na
Amazônia é explicada devido a fatores tão diversos como a idade e tamanho do sistema de
drenagem, habitat e diversidade de nichos disponibilizados pelos rios, lagos e áreas alagadas,
a alta proporção de terras baixas com condições ambientais estáveis, capazes de suportar uma
grande abundância de peixes, e a incorporação de outros rios e bacias, através de uma
diversidade de eventos geológicos, provocando uma mistura de faunas de peixe de diferentes
origens (Carvalho et al., 2007).
A grande diversidade ictiológica torna a Amazônia uma importante fonte de recursos
pesqueiros, e a piscicultura é como uma importante atividade para regular o abastecimento do
pescado regional, especialmente no período de defeso e nos períodos de “cheia e seca”
amazônica, períodos em que os valores do pescado oscilam, propiciando melhor equilíbrio
entre oferta e demanda no mercado regional e estabilizando os valores do pescado ao longo do
ano. Essa crescente atividade na Amazônia Ocidental vem sendo testada de diferentes
maneiras, incluindo uso de tanques artificiais, represamento de nascentes, fechamento de
trechos de igarapés, gaiolas flutuantes e até repovoamento de lagos e lagoas (EMBRAPA,
2003; Santos e Santos, 2005).
A prática de piscicultura é o empreendimento do setor primário que mais gera lucros
para os produtores da Amazônia (Valois, 2003). Na periferia Amazônica, a piscicultura
progrediu bastante nos últimos vinte anos, principalmente nos Estados de Roraima, Mato
Grosso e Tocantins (Barthem e Goulding, 2007). No Amazonas é uma área do agronegócio
que vem crescendo em ritmo acelerado nos últimos cinco anos (Cavero et al., 2009). Segundo
Lima (2005), o Amazonas dispõe de todos os recursos necessários para o desenvolvimento
16
dessa atividade devido aos parâmetros ecológicos e biológicos altamente favoráveis para essa
prática, abrangendo as condições climáticas e a biodiversidade necessária para criação de
peixes. A piscicultura é considerada de grande importância para o desenvolvimento
econômico do Estado, assim como de toda região amazônica (Santos et al., 2006). No
Amazonas, em 2005 estimou-se a existência de 800 piscicultores, e uma produção anual de
pescado em torno de 1.000 a 1.500 toneladas particularmente devido às quatro estações de
piscicultura em produção, destacando-se a estação de Balbina, no município de Presidente
Figueiredo, Manaus, Manacapuru e Itacoatiara (SUFRAMA, 2003; Lima, 2005).
2.3- Espécies de peixes de interesse comercial na Amazônia
A Região Norte do país e a Amazônia Ocidental, em particular, têm no consumo do
peixe uma das suas principais fontes de abastecimento alimentar (Santos et al., 2006). Sendo
procedente do pescado a principal fonte de proteína na alimentação das populações
amazônicas (Ferreira et al.,1998).
Apesar da diversidade da ictiofauna amazônica, estimada entre 1500 e 3000 espécies,
apenas uma parcela muito reduzida dessa diversidade é explorada comercialmente (Santos et
al., 2006). Existem aproximadamente 200 espécies de peixes explorados para o consumo e
os principais grupos incluem os caracídeos, bagres e ciclídeos (Barthem e Goulding, 2007).
Seis famílias agrupam os caracídeos mais importantes, como o tambaqui. Os bagres para
consumos são a dourada, piramutaba e acari, e dos grupos de peixes estritamente de água
doce, estão inseridos o pirarucu e os aruanãs. As espécies que mais se destacam para o
comércio na Amazônia Central são: tambaqui (Colossoma macropomum), matrinxã (Brycon
amazonicus), curimatá (Prochilodus nigricans), jaraqui (Semaprochilodus insignis),
pirarucu (Arapaima gigas), pirapitinga (Piaractus brachyponuis), acará-açu (Astronotus
ocellatus) e aracu (Leporinus spp) (Barthem e Gouding, 2007). As espécies C.
macropomum, B. amazonicus e A. gigas destacam-se no comércio de peixes da cidade de
Manaus (Santos et al., 2006; Santos, 2009) e também na alimentação das populações
amazônicas (Santos et al., 2006).
O tambaqui, C. macropomum é um caracídeo onívoro nativo da bacia Amazônica e
Orinoco é o segundo maior peixe de escamas do rio Solimões (Ferreira et al., 1998). Esta
espécie de grande porte chega 100 cm de comprimento e pesando mais de 30 quilos,
consome principalmente frutos e sementes. É a espécie com maior importância comercial na
pesca e na piscicultura da região amazônica e devido a isso é o peixe mais cultivado no
17
Estado do Amazonas (Castagnolli e Cyrino 1986; Cantelmo, 1989; Santos et al., 2006), com
produções oriundas de piscicultura de 3.000 e 3.500 toneladas anuais (Santos et al., 2006). O
potencial de produção do tambaqui foi estimado em 15.500 toneladas e sua produção
concentra-se na Amazônia Central, que representa 91% do total (Barthem e Goulding,
2007). Um dos principais problemas relacionados à criação dessa espécie é a ocorrência de
doenças parasitárias e bacterianas (Araújo-Lima e Golding, 1998).
A espécie B. amazonicus (matrinxã) é integrante da subfamília Bryconinae, que inclui
40 espécies, está distribuída na América do sul na bacia do rio Amazonas no Peru e na Bolívia
(Reis et al., 2003), caracteriza-se por ser de grande porte, alcançando cerca de 40 cm, é
onívoro e consome basicamente frutos, sementes, insetos e outros invertebrados, é um dos
peixes mais utilizados na aquicultura comercial (Santos et al., 2006). O potencial da produção
de seu cultivo foi estimado em 6.040 toneladas e a região da Amazônia Central é responsável
por 74% do total (Barthem e Goulding, 2007), vem se destacando na exploração comercial na
região amazônica por ser uma das espécies mais promissoras para a piscicultura por
apresentar enorme potencial de crescimento e carne nobre (Frascá-Scorvo et al., 2001).
O pirarucu (A.gigas) peixe da família Arapaimatidae, com características
plesiomórficas e confinadas a água doce da América do sul, é caracterizado pela língua óssea
e espinhosa, escamas grandes e imbicadas em forma de mosaico, nadadeiras dorsal e anal
muito alongadas. É uma espécie de grande porte chegando a mais de 2 metros e pesando
aproximadamente 200 quilos, é carnívoro e consome basicamente peixes, camarões,
caranguejos e insetos. Tem preferência por lagos e não realiza migrações consideráveis
(Santos et al., 2006), o que é de grande importância para seu cultivo. O potencial de sua
produção foi estimado em 1800 toneladas e três importantes regiões pesqueiras são
responsáveis por 93% de seu potencial: Amazônia Peruana, Fronteira Brasil-Peru-Colômbia e
Amazônia Central (Barthem e Goulding, 2007).
Devido ao aumento da demanda dessas espécies para abastecer o comércio regional à
medida que ocorre o crescimento da produção intensiva de espécies de peixes em cativeiro,
muitas vezes em condições de superpopulação segundo Shama, et al. (2000) acarretam
variações na qualidade da água, aumentando o número de doenças nos animais causadas
muitas vezes principalmente por bactérias oportunistas.
18
2.4- Bacteriose em Peixes
O Domínio Bacteria contém uma enorme variedade de procariotos e todas as espécies
conhecidas causadoras de enfermidades (patógenos) pertencem a esse domínio (Madigan et
al., 2004). As bactérias são microrganismos classificadas quanto a sua forma, estruturas e
tamanho, podendo ser variado ou não, devido a sua estrutura química as bactérias são
classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, essa determinação é feita através do
método Gram de coloração bacteriana (Junqueira e Carneiro, 2005; Trabulsi e Alterthum,
2008).
Bactérias patogênicas podem causar doenças em humanos, plantas e animais. Em
peixes, todas as espécies são suscetíveis às infecções causadas por esses microrganismos
(Frerichs e Millar, 1993; Costa, 2003). No meio aquático as bactérias fazem parte da
microbiota normal da água, podendo ser encontradas na superfície corporal e nas brânquias
dos peixes em seu habitat natural (Pavanelli et al., 2002) e são consideradas como patógenos
oportunistas, visto que só se manifestam provocando infecções bacterianas quando os animais
estão em condições ambientais adversas (Boijink e Brandão, 2004).
As enfermidades bacterianas em peixes ocorrem muitas vezes devido ao manejo não
adequado excessivo, que leva a perda do muco e danos na superfície corporal do animal,
deixando a pele suscetível às invasões bacterianas (Harvey e Hoar, 1979). A pele e as
brânquias são a primeira linha de defesa dos peixes contra agentes infecciosos, atuam como
barreira física e química, e o muco presente nessas estruturas contêm mucopolissacarídeos e
enzimas bacteriolíticas que imobilizam e destróem patógenos invasores (Urbinate e Carneiro,
2004).
Vários fatores são considerados para determinar as enfermidades bacterianas em
peixes, e na maioria das vezes são causadas por situações de estresse dos animais, as quais
podem não provocar mortalidade ou manifestação de doenças, representando uma ameaça
sanitária para a saúde humana (Boijink e Brandão, 2004). O estresse é um conjunto de
respostas não específicas do organismo a situações que ameaçam desequilibrar sua
homeostase (Guelhardo e Oliveira, 2006) e essas respostas impostas por um sistema intensivo
de criação são determinantes para desequilibrar o sistema imunológico animal. Os agentes de
estresse ou estressores em peixes podem ser de inúmeros tipos, biológicos, como
microrganismos patogênicos e não patogênicos, os de natureza física, como o transporte, o
confinamento ou o manuseio e os de natureza química, como os contaminantes e o baixo teor
de oxigênio ou o pH reduzido (Val et al., 2004; Oba et al., 2009). O entendimento básico da
19
fisiologia da resposta ao estresse e das alterações ambientais a que o peixe pode se adaptar por
meio dessa resposta, possibilita a identificação de condições de estresse e favorece o
desenvolvimento de métodos que mitiguem os seus efeitos adversos na saúde de peixes
cultivados (Lima et al., 2006).
Algumas
bactérias,
como
espécies
dos
gêneros:
Aeromonas,
Cytophaga,
Mycobacterium e Pseudomonas estão sempre presentes nos tanques, sendo que a presença de
fatores estressantes pode desencadear o aparecimento de doenças (Shama et al., 2000). Os
patógenos mais frequentes envolvidos em doenças de peixes brasileiros são as espécies
Flavobacterium spp., Yersinia spp., Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Edwardsiella spp. e
Streptococcus spp. (Barja e Esteves, 1988; Brown, 1993; Pavanelli et al., 1998). A espécie
Yersenia ruckeri, nunca antes citada em peixes do Brasil, foi relata pela primeira vez em
jundiás (Ramdhia quelen) (Shama et al., 2000). Bactérias da espécie Aeromonas hydrophila
embora faça parte da microbiota dos peixes (Barja e Esteves, 1988; Brown, 1993; Costa,
2003; Klinger et al., 2003) produz a toxina acetilcolinesterase que, em grande quantidade, é
letal para estes organismos (Boijink e Brandão, 1992; Rodriguez et al., 1992). O gênero
Aeromonas faz parte do complexo de Aeromonas móveis, e tem sido a causa de doenças em
peixes como a hemorragia septicêmica (Austin e Austin, 2007) e a doença ulcerativa dos
peixes (Karunasagar et al., 1995). Bactérias podem estar associadas a diversos fenômenos
patogênicos em peixes, segundo Pavanelli et al., (2002), esses fenômenos costumam ser
divididos em três principais aspectos: respostas septicêmicas, necroses dos tegumentos e
músculos, provocando ulcerações, e resposta crônica proliferativa.
Na Amazônia, particularmente no estado do Amazonas, alguns trabalhos foram
realizados com estudos de doenças bacterianas em tambaqui (Silva, 2001; Costa, 2004).
Segundo Costa (2004) foram feitos isolamentos e a identificações primárias de bactérias
Gram-negativas das famílias Enterobacteriaceae, Vibrionaceae e Pseudomonadaceae. Dentro
dessas famílias identificou-se as espécies de Enterobacter sp., Escherichia sp., Aeromonas
sp., e Pseudomonas sp., esta é uma bactéria Gram negativa encontrada na água e microbiota
bacteriana de peixes, algumas espécies desse gênero como P. fluorescens causam septicemias,
hemorragias na pele, nadadeiras e na boca de peixes (Frerichs e Millar, 1993; Costa, 2004).
Dentre as bactérias Gram-positivas foram identificadas Streptococcus sp., Aerococcus sp. e
Nocardia sp. Desse gênero a espécie N. asteróides é identificada como principal agente
causador de doenças crônicas e condições granulomatosas em peixes tropicais de água doce
(Frerichs e Millar, 1993).
20
Silva (2001) isolou e identificou, por métodos fenotípicos, 22 bactérias em tambaqui
de piscicultura do Amazonas sendo que as principais espécies foram: E. coli, Flavobacterium
sp., Yersinia sp., Chromobacterium violaceum e Aeromonas spp.
Flavobacterium sp. é a principal causadora de surtos de doença bacteriana branquial
(Frerichs e Millar, 1993). Yersinia rukeri é o patógeno causador da doença enterite da boca
vermelha (ERM-enterich redmouth) (Frerichs & Millar, 1993; Costa, 2004). As espécies do
gênero Aeromonas são responsáveis pela maioria das enfermidades em peixes e perdas em
piscicultura intensiva (Costa, 2004) e um dos patógenos causadores de infecções alimentares
nos seres humanos (Austin e Austin, 2007).
Bactérias podem causar elevada taxa de mortalidade, tanto em peixes da natureza,
quanto aqueles mantidos em cultivo. Os surtos de doenças estão sendo cada vez mais
reconhecidos como uma restrição significativa na produção de aquicultura e comércio, que
afetam o desenvolvimento econômico do setor em muitos países (Verschuere et al., 2000). As
infecções em peixes são responsáveis por grandes perdas em criações intensivas as quais
muitas vezes apresentam índice elevado de mortalidade, que podem em certos casos chegar a
100%. A correta caracterização e identificação dos problemas de enfermidades e seus agentes
causais é necessária para que se possa conhecer adequadamente seu comportamento,
estabelecer o ciclo epidemiológico e definir os métodos de controle e profilaxia de doenças
em peixes de cultivo, pois muitos problemas ainda não foram identificados e os processos
mórbidos que causam são poucos estudados (Costa, 2004).
No Brasil as autoridades estaduais e DFAs (Delegacia Federal de Agricultura), são
responsáveis pela saúde animal. Em nível federal, o DDA (Departamento de Defesa Animal),
é responsável pela coordenação, padronização e implantação do programa de saúde animal.
Todos os estabelecimentos de aquicultura estão sujeitas à supervisão do Serviço Veterinário
Oficial e a notificação obrigatória é necessária em caso de suspeita de surto de doença
exótica, ou quando a doença é uma ameaça à economia pública, saúde pública ou o meio
ambiente (FAO, 2012).
2.5- Métodos de identificação fenotípica e molecular de microrganismos
As identificações fenotípicas bacterianas são baseadas em uma série de testes
bioquímicos (Bando, 2008), verificação de reações metabólicas, características de colônias e
morfologia celular em esfregaços corados pelo método de Gram. Inicialmente é necessário
fazer exame direto das amostras isoladas, com principal objetivo de revelar e enumerar
21
microrganismos (Martinez e Taddei, 2008). Porém, as provas bioquímicas são importantes
para verificação de enzimas estruturais, pesquisas de produtos metabólicos e catabólicos
(acetoína, indol, ácidos orgânicos) e verificação da sensibilidade dos microrganismos em
diferentes compostos (Martinez e Taddei, 2008).
Os meios empregados na identificação bioquímica microbiana: EPM, MILi
(motilidades, indol e lisina) e citrato fornecem sete reações bioquímicas, que possibilitam
identificar a maioria das enterobactérias (Franzolin, 2008). Essas técnicas juntamente com as
técnicas moleculares são de fundamental importância para contribuir com a identificação de
espécies bacterianas.
A utilização de diversas técnicas moleculares entre elas a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), tem permitido grande evolução nas análises de rotina de laboratórios
clínicos e industriais. Organismos não adaptados ao cultivo tornaram-se passíveis de ser
analisados (Nilsson e Strom, 2002).
Em poucos anos, o diagnóstico molecular evoluiu de uma mera curiosidade
tecnológica para um campo vasto e complexo, com o potencial para revolucionar a ciência e a
prática da medicina e áreas correlatas. O método mais utilizado para fazer a identificação de
sequências de bases do DNA de um organismo é o método de terminação em cadeia, também
conhecido como método de Sanger (Sanger et al., 1977). Esse método é baseado na
capacidade da enzima DNA Polimerase estender a cadeia polinucleotídica a partir de um
iniciador, ancorado por complementaridade em uma das fitas (fita molde). Como as fitas de
DNA são complementares (A=T e C≡G), a partir do molde, a enzima adiciona nucleotídeos
complementares necessitando do grupo hidroxila livre (OH) na posição 3’ da fita de DNA
componente do desoxinucleotídeo anterior (dNTP) (Carraro e Kitajima, 2002).
Os métodos moleculares tornaram-se aceitos para a detecção de agentes causadores de
infecções (vírus, bactérias, fungos e protozoários). Em particular, o uso de uma combinação
de genes rRNA de microganismos tornou-se popular para essa detecção (Millar et al., 2002).
Os rRNAs são os mais úteis e mais precisos cronômetros moleculares, mostrando um elevado
grau de regularidade funcional, o que determina relativamente um corportamento de relógio
molecular. Ocorrem em todos os organismos e posições diferentes de suas sequências mudam
em taxas muito diferentes, permitindo a medida da maioria das relações filogenéticas. Os
rRNAs são moléculas grandes e consistem de muitos domínios. Há aproximadamente 50
hélices na estrutura secundária do 16S rRNA e aproximadamente o dobro na estrutura
22
secundária do 23S rRNA, fazendo destas moléculas relógios moleculares precisos (Woese,
1987).
O gene 16S rRNA é universal em bactérias e a partir deste é possível distinguir
linhagens bacterianas, por permitir identificações mais robustas, reprodutíveis e precisas do
que as obtidas por meio de testes fenotípicos tornando-o como principal objeto de estudo para
inferências taxonômicas e filogenéticas em bactérias (Clarridge, 2004).
2.6- Taxonomia e Filogenia Molecular Bacteriana
A taxonomia molecular, também chamada de quimiotaxonomia, utiliza as análises
moleculares de várias biomoléculas da célula. Entre os principais métodos taxonômicos estão
a hibridação DNA-DNA, as análises proteicas e o sequenciamento de ácidos nucleicos
(Madigam et al., 2004; Bando 2008).
Na hibridação DNA-DNA (DDH), a relação de bases GC descreve a porcentagem de
cada nucleotídeo presente no DNA genômico de uma espécie bacteriana determinada, mas
não fornece dados sobre o arranjo linear das bases no DNA. É o arranjo de bases que
determina as características de um organismo, se dois organismos compartilham muitas
sequências nucleotídicas em seus DNAs é provável que possuam muitos genes altamente
similares ou idênticos (Madigam et al., 2004, Bando, 2008). Nessa técnica é possível verificar
o grau de similaridades entre sequências, geralmente uma das moléculas comparadas é
marcada com radioisótopo e hibridada, os fragmentos de fitas simples que não sofrem
hibridação são removidos, a radiação é medida e comparada com uma reação-controle na qual
a quantidade de reaçã é considerada 100% (Bando, 2008). Se o percentual de hibridação
verificado for maior ou igual a 70% representam a mesma espécie (Stackebrandt e Goebel,
1994; Bando, 2008; Kämpfer e Glaeser, 2012).
Nas análises proteicas é possível fazer a comparação de proteínas de diferentes
microrganismos, pois a sequência de aminoácidos de uma proteína reflete a sequência de
ácidos nucleicos do gene. Dessa forma as análises proteicas tornam-se úteis em taxonomia
(Madigam et al., 2004, Bando, 2008).
O sequenciamento do gene 16S RNA é o método mais direto para comparar a estrutura
genômica de diferentes microrganismos, moléculas como RNA ribossômico ou proteínas que
sofreram pouca variabilidade no curso evolutivo, são utilizados como marcadores
taxonômicos. O gene 16S rRNA é considerado o mais adequado para definição de espécies
bacterianas, o nível de identidade da sequência gênica entre duas cepas deve ser superior a
23
96% para chegar a um valor de similaridade de DDH superior a 70%, definindo assim um
grau de identidade confiável (Stackebrandt e Goebel, 1994; Madigam et al., 2004, Bando,
2008; Stackebrandt, 2011).
A taxonomia bacteriana compreende as áreas inter-relacionadas de classificação,
nomenclatura e identificação e é a base para gerar hipóteses filogenéticas e evolutivas (Gillis
et al., 2001; Kampfer e Glaeser, 2012). A classificação taxonômica dos organismos é baseada
nas características similares e seguindo diferentes níveis hierárquicos (grupos pequenos que
compartilham propriedades comuns que, por sua vez, fazem parte de grupos maiores). As
bactérias seguem uma nomenclatura regulamentada pelo “Código Internacional de
Nomenclatura de Procariontes”, e compreendem as regras, os princípios e as recomendações
para a descrição de uma nova unidade de classificação de espécie, gênero ou família (Bando,
2008).
Tradicionalmente, a taxonomia bacteriana é baseada em análises fenotípicas que
incluem o aspecto de um organismo, seu metabolismo energético bem como suas enzimas
(Madigam et al., 2004). Porém, esta abordagem, que fornece informações úteis para
diferenciar táxons, nem sempre permite uma visão abrangente sobre as relações genéticas e
filogenéticas dos organismos (Ludwig e Klen, 2001).
A taxonomia bacteriana pode ser determinada por métodos genotípicos. Com o
surgimento das técnicas moleculares a partir da década de 70, tornou-se possível sua
utilização, na reconstrução da filogenia dos maiores grupos bacterianos. Ao nível molecular,
similaridades gênicas de sequências indicam uma origem comum, pois táxons com sequências
similares podem ser filogeneticamente relacionadas (Madigam et al., 2004; Bando, 2008).
A partir da década de 1980, os estudos com genes ribossomais passaram a ser
desenvolvidos como um novo método de identificação bacteriana. Foi mostrado que todas as
relações filogenéticas e todas as formas de vida podem ser determinadas comparando partes
estáveis do código genético. Regiões codificantes como 5S, 16S e 23S rRNA, e os espaços
intergênicos foram usados para determinações filogenéticas. Porém, o gene 16S rRNA,
também designado de 16S rDNA, tornou-se a região mais utilizada para propósitos
taxonômicos em bactérias. O gene 16S rRNA pode ser comparado não só entre todas as
bactérias, mas também com o gene 16S rRNA de Archea e o gene 18S rRNA de eucariotos
(Clarridge, 2004).
A pequena subunidade ribossomal 16S rRNA, é atualmente a molécula de escolha
para a identificação de bactérias e outros microrganismos ao nível de espécie. As informações
24
obtidas a partir da comparação de sequências do 16S rRNA podem ser usadas para deduzir as
relações filogenéticas detalhadas baseadas em evolução. Um mapa de distância evolutiva
gerada a partir de dados de sequências do 16S rRNA realça as linhagens principais de
Bacteria e Archaea. As porções altamente conservadas nos genes de rRNA são ideais para
desenhar primers que amplificam as subunidades dos genes 16S rRNA de Bacteria e Archaea
e de 18S RNA em Eucarya (Tanner et al., 2000). Com base nas informações das análises do
gene 16S rRNA atualmente são reconhecidos pelo menos 12 grupos filogenéticos diferentes
de bactérias, cada um deles contém regiões ou sequências específicas dentro do ribossomo.
Essa região que distingue cada grupo é designada “sequência assinatura”, as quais são
utilizadas como um código de barras bacteriano (Bando, 2008).
2.7- RNA ribossômico 16S
Os ribossomos são as maquinarias onde as proteínas são sintetizadas, possuindo sua
estrutura altamente conservada em todas as espécies. Em bactérias são compostos de duas
subunidades: uma subunidade grande 50S e uma subunidade pequena 30S. A subunidade 50S
contém o rRNA 23S, um RNA 5S e mais de 30 proteínas. A subunidade 30S contém o rRNA
16S e mais 20 proteínas (Pei et al., 2009). As bactérias possuem os três genes de rRNA
organizados em um agrupamento de genes que são expressos como único operon, que pode
estar presente em múltiplas cópias no genoma (Pei et al., 2010).
Sabe-se no entanto que os genes de rRNA são essenciais para a sobrevivência de todos
os organismos e são altamente conservadas entre todas espécies. Consequentemente a
caracterização do gene 16S rRNA está bem estabelecida como um método padrão para a
identificação de espécies, gêneros e famílias de bactérias (Woose, 1987; Gurtler e Stanisich,
1996).
A sequência do gene 16S rRNA tem tamanho de 1550 pares de bases (pb) de extensão
e é composta de regiões variáveis e conservadas (Clarridge, 2004; Chakravorty et al., 2007)
pois limitações funcionais sobre a estrutura de sequências gênicas do rRNA fazem com que
certas regiões no gene sejam conservadas, enquanto as sequências entre estas
regiões
conservadas mutam em taxas mais rápidas, sendo assim denominadas regiões variáveis. As
regiões conservadas são úteis para determinar as relações de distância, enquanto que as
regiões variáveis que mutam mais rapidamente são úteis para distinguir organismos
estreitamente relacionados (Pei et al., 2009).
25
Em geral, o 16S rRNA contém nove "regiões hipervariáveis" que demonstram a
diversidade de sequências entre diferentes espécies bacterianas e pode ser usado para sua
identificação (Chakravorty et al., 2007). Gray (1984) demonstrou que o 16S rRNA possui
tanto regiões com alta quanto com baixa variabilidade, as quais são denominadas de regiões
universais (U) e regiões variáveis (V), totalizando 8 regiões universais (U1-U8) e 9 regiões
variáveis (V1-V9). Essas regiões hipervariáveis por serem ladeadas por trechos conservados
na maioria das bactérias, permitem a amplificação de sequências-alvo utilizando primers
universais (Chakravorty et al., 2007).
A estrutura primária do 16S rRNA é altamente conservada, e espécies com mais de
70% de similaridade de DNA na hibridação têm geralmente mais de 97% de seus
nucleotídeos idênticos. Os 3% diferentes não estão uniformemente espalhados ao longo da
estrutura primária da molécula, mas concentram-se principalmente em certas regiões
hipervariáveis. Pode-se argumentar que essas diferenças poderiam ser usadas como uma
medida de distância filogenética entre estirpes, e que para a determinação deste nível de
parentesco análise de sequência podem ser restritas a estas regiões,
nas quais pode-se
verificar este nível estreito de relacionamentos. Porém, existem pelo menos dois argumentos
contra esta conclusão: 1) a quantidade de diferença não concentrada nas regiões
hipervariáveis é substancial, e por omissão ocorreriam perdas de informações que já são
baixas em quantidade a partir de um ponto de vista estatístico; 2) as posições das regiões
hipervariáveis parecem ser táxons específicos mas necessitam ser determinadas para novos
organismos por análise da sequência completa da molécula (Stackebrandt e Goebel, 1994;
Kampfer e Glaeser, 2012).
26
3- Objetivos
3.1- Geral
 Identificar bactérias patogênicas isoladas de três espécies de peixes amazônicos,
Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus
(matrinxã), utilizando métodos fenotípicos e moleculares.
3.2- Específicos
 Determinar o perfil fenotípico dos isolados bacterianos utilizando métodos
microbiológicos convencionais.
 Sequenciar a região parcial dos gene 16S para determinação das sequências
nucleotídicas dos isolados bacterianos.
 Comparar os resultados das identificações bioquímicas e molecular.
 Utilizar os dados obtidos com o sequenciamento em análises que permitam a
identificação, classificação e reconstrução filogenética dos isolados bacterianos.
27
4- Material e Métodos
4.1- Coleta
No presente trabalho foram analisados 72 isolados bacterianos de peixes. Estas
amostras estavam armazenadas na Coleção de Culturas de Bactérias Patogênicas de Peixes,
depositada no Centro de Apoio Multidisciplinar - CAM, da Universidade Federal do
Amazonas - UFAM em Manaus e cedidas pela Dra. Andréa Belém Costa. O material coletado
de peixes cultivados em pisciculturas comerciais no estado do Amazonas foi isolado nos anos
de 2006, 2008 e 2009. A cultura das amostras foi feita a partir de fígado, rim e baço dos
animais que apresentavam sinais característicos de bacteriose. Foram analisados 18 isolados
bacterianos de tambaqui (Tabela 01), 26 de matrinxã (Tabela 02) e 28 de pirarucu (Tabela
03).
Tabela 01- Isolados bacterianos de tambaqui.
Isolado PPUFAM*
Local
Órgão
25
26
27
28
72
74
228
229
232
233
234
236
238
239
246
250
251
252
Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am
Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am
Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am
Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Setor de Aquicultura do INPA- AM
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Fazenda UFAM/Manaus- AM
fígado
Rim
Fígado
Rim
Fígado
Fígado
n/d
n/d
n/d
n/d
n/d
n/d
n/d
n/d
Fígado
Fígado
Fígado
Rim
*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.
28
Tabela 02- Isolados bacterianos de matrinxã.
Isolado PPUFAM*
255
256
258
260
262
263
264
265
266
267
268
269
271
272
273
274
275
276
277
278
279
282
284
285
286
288
Local
Órgão
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Fígado
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Fígado
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Rim
Fazenda UFAM/Manaus- AM
Rim
Fazenda UFAM/Manaus- AM
n/d
Fazenda UFAM/Manaus- AM
n/d
Fazenda UFAM/Manaus- AM
n/d
Fazenda UFAM/Manaus- AM
n/d
Fazenda UFAM/Manaus- AM
n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d
*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.
29
Tabela 03- Isolados bacterianos de pirarucu.
Isolado PPUFAM*
Local
Órgão
01
03
05
07
12
13
16
22
34
37
38
40
43
44
45
46
51
52
53
54
55
57
58
59
63
64
70
71
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM
Fígado
Fígado
Fígado
Fígado
Rim
Fígado
Rim
Rim
Baço
Baço
Fígado
Baço
Baço
Fígado
Rim
Baço
Rim
Baço
Fígado
Rim
Baço
Rim
Baço
Fígado
Fígado
Fígado
Fígado
Fígado
*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.
30
4.1- Reativação e purificação de Bactérias
Os isolados bacterianos estavam estocados em palhetas plásticas, contendo caldo de
crescimento, extrato de levedura (Caldo YE) (Costa et al., 1998), suplementado com glicerol
10% mantidos à temperatura de -20º C para preservação das células bacterianas.
A reativação dessas amostras foi realizada por semeadura do material em tubos de
ensaio contendo caldo Nutriente comercial padrão. O material foi deixado para crescimento
em estufa bacteriológica a 30oC durante 24 horas. Para purificação das colônias bacterianas,
após o crescimento, foi feita semeadura por esgotamento em placas de Petri contendo meio
ágar Nutriente e o material foi incubado mantendo-se nas mesmas condições anteriores e
período de crescimento.
4.2- Identificação fenotípica bacteriana
A identificação fenotípica bacteriana presuntiva foi realizada de acordo com o Manual
de Identificação de Bactérias Patogênicas em Peixes (Frericks e Millar, 2003), Manual
Bergey de Sistemática Bacteriológica (Vos et al., 2009), Bacterial fish diseases (Austin e
Austin, 2007) e o V Manual de Microbiologia Clínica para Controle de Infecções de Serviços
de Saúde, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Levy, 2004). Foram realizados 20
testes para caracterização dos isolados bacterianos, como descritos a seguir:
4.3- Coloração Gram
Inicialmente às colônias crescidas e purificadas foram submetidas à coloração pelo
método Gram.
Através da coloração de Gram as bactérias podem ser classificadas em dois grandes
grupos, Gram-positivas ou Gram-negativas. Os microrganismos Gram-positivos são aqueles
que retêm o corante cristal violeta devido ao aumento na quantidade de ácido teicóico e a
diminuição da permeabilidade da parede celular aos solventes orgânicos, por conterem menos
lipídeos na parede celular. A parede celular de bactérias Gram-negativas possui grande
quantidade de lipídeos (Althertum, 2008; Martinez e Tadei, 2008), que aumenta a
permeabilidade aos solventes orgânicos permitindo a descoloração. Perdem, portanto, o cristal
violeta, corando-se com o corante de fundo, safranina ou fucsina (Martinez e Tadei, 2008).
Para realização do método Gram foi adicionada uma gota de 10µL de água deionizada
em lâminas de vidro, com auxílio de uma alça bacteriológica foi retirada uma colônia
bacteriana de culturas crescidas em placa de Petri e em seguida cada colônia foi friccionada
31
para homogeneização sobre uma lâmina com água. Posteriormente foi feita a fixação por
aquecimento do material em bico de Bunsen.
Após a fixação do material em lâmina foi feito o procedimento de coloração de Gram,
inicialmente cada lâmina foi coberta por 1 minuto com o reagente cristal violeta de genciana
sendo imersas rapidamente em água corrente, na segunda etapa do processo as lâminas foram
novamente cobertas por 1 minuto com o reagente lugol, o qual foi removido adicionando
sobre a lâmina um descolorante de solução álcool-acetona por aproximadamente 15 segundo
seguido de lavagens em água corrente. Após o processo de descoloração, foi adicionada
solução de fuccina sobre as lâminas durante 30 segundos, novamente as lâminas foram
lavadas em água corrente e deixadas para secar em posição vertical em temperatura ambiente.
Após secas as lâminas foram visualizadas em microscópio óptico.
4.4- Teste KOH
Além do teste de Gram para verificação de características bacterianas também é
utilizado o teste KOH para confirmação do método Gram, de acordo com a metodologia de
Buck (1982). Esse método foi feito adicionando 10µL de KOH 40% em lâmina com uma
colônia bacteriana.
O resultado positivo para KOH foi visualizado quando ocorreu formação de
viscosidade na colônia com as gotículas de KOH, assim o resultado é confirmado Gramnegativo, quando não verificada a viscosidade o resultado é Gram-positivo.
4.5- Teste de catalase e oxidase
O teste de catalase é verificado observando a reação da enzima catalase, que
decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em oxigênio e água. Excluindo o gênero
Streptococcus, a maioria das bactérias aeróbias e as facultativas possuem essa enzima
(Franzolin, 2008). Para realização deste teste, com auxílio de uma alça de platina foram
coletadas colônias isoladas de culturas bacterianas crescidas em placas de Petri. Em seguida
foi feita fricção do material em lâminas de vidro e sobre o esfregaço foi adicionada uma gota
de peróxido de hidrogênio a 3%, o resultado foi considerado positivo ao ser imediatamente
observado formação de bolhas na reação.
32
O teste de oxidase verifica as hemoproteínas que contém ferro e funcionam como a
última molécula na ligação da cadeia respiratória aeróbica, transferindo elétrons (hidrogênio)
ao oxigênio com a formação de água. Esse sistema é encontrado em aeróbios e anaeróbios
facultativos, este teste é importante na identificação de organismos que não possuem a enzima
ou são anaeróbios obrigatórios é útil na identificação de colônias da família
Enterobacteriaceae (todas negativas) e identificação de outros gêneros não fermentadores,
como Aeromonas, Pseudomonas e Pasteurella (positiva) (Franzolin, 2008). Para este
procedimento foi feito um esfregaço de colônias bacterianas em papel filtro com auxílio de
um bastão de vidro e posteriormente foi adicionada uma gota de reagente Kovacs para
verificação da reação de oxidase. Colônias positivas indicam uma coloração rosada neste
teste.
4.6- Teste em meio ágar MacConkey
O meio ágar MacConkey é um meio de cultura seletivo e diferencial, que possibilita
diferenciar bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose, selecionando também
bacilos Gram-negativos. Pela presença de sais biliares e cristal violeta inibe o crescimento da
maioria das bactérias Gram-positivas, contém vermelho neutro que cora bactérias
fermentadoras de lactose, bactérias não fermentadoras de lactose não são coradas, ficando
transparentes ou incolores no meio (Flournoy et al., 1990). Neste teste células bacterianas
purificadas e crescidas em meio líquido, foram inoculadas em placas de Petri contendo meio
ágar MacConkey, preparado de acordo com as instruções do fabricante, em seguida o material
foi incubado em estufa bacteriológica com temperatura de 30o C por 24 horas.
4.7- Teste em ágar citrato de Simmons
Para o teste bacteriológico em citrato de Simmons, culturas bacterianas foram
repicadas, com o auxílio de alça de platina, para tubos contendo meio ágar citrato de
Simmons. Após a inoculação os tubos foram deixados em estufa bacteriológica durante 24
horas em temperatura de 30oC. Em seguida foi observado se ocorreu crescimento bacteriano.
Como resultado positivo para bactérias que utilizam citrato como única fonte de carbono foi
seguido o protocolo padrão do fabricante, o qual determina que os tubos contendo bactérias
citrato positivo, mudam a coloração normal do meio de verde para a tonalidade azul.
33
Bactérias produtoras da enzima citratase conseguem utilizar o citrato como única fonte
de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o
meio. O indicador utilizado é o azul de bromotinol, que em pH ácido é amarelo e em pH
alcalino é azul (Franzolin 2008).
4.8- Teste em meio SIM (sulfato/indol/motilidade ágar)
Este teste é utilizado para verificação de motilidade bacteriana, por ser um meio semisólido que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, produção de sulfato de
hidrogênio (H2S) e reação de indol. O indol é verificado se a enzima triptofanase liberada
pelas bactérias agir sobre o triptofano contido no meio de cultura. É possível verificar a
reação de indol quando adicionado um reativo (Kovacs ou Ehrlish) ao tubo com o inóculo
bacteriano, o resultado é positivo se visível coloração vermelha no tubo (Franzolin, 2008).
Para verificação destas três importantes características bacterianas foram preparados
meios de cultivo Sim em tubos de ensaio, de acordo com as recomendações do fabricante.
Com a utilização de agulha bacteriológica foi feito inóculo por punção central de colônias
bacterianas crescidas em meio líquido, em seguida esse material foi armazenado em estufa
bacteriológica durante 24 horas com temperatura de 30oC. A produção de H2S foi positiva nos
tubos onde houve a formação de um precipitado de coloração preta e a motilidade bacteriana
foi positiva nos tubos com aspecto turvo, negativa, nos quais foi observado crescimento
bacteriano somente na linha de inoculação. Para a reação de indol, foram adicionadas
vagarosamente cinco gotas do reativo Kovacs sob a parede dos tubos contendo crescimento
bacteriano, os tubos foram então agitados suavemente para observação da reação, para provas
positivas foi observada a formação de um anel vermelho na superfície da cultura nos tubos.
4.9- Teste em meio OF (oxidação e fermentação)
Para verificação de oxidação e fermentação bacteriana, é necessário que a reação possa
ser feita em meio Hugh e Leifson (meio OF), o qual verifica se uma bactéria pode utilizar
determinado carboidrato na forma fermentativa ou oxidativa.
O teste foi feito adicionando-se em meio OF autoclavado a quantidade de 5-10 gramas
de glicose, filtrada em filtros millipore 0,45 µm, posteriormente o meio de cultura foi
distribuído em tubos de ensaio com rosca e deixados secar em fluxo laminar. Utilizando-se
34
culturas bacterianas com crescimento de 24 horas em meio sólido, foi realizada a inoculação
do material até o fundo dos tubos com auxílio de agulha bacteriológica.
Para verificação das reações de oxidação e fermentação é necessário que sejam feitas
duplicatas do material. Cada reação é verificada separadamente, nos tubos para verificação de
fermentação foi adicionado óleo mineral sobre a superfície do meio. Em seguida os tubos
foram incubados em estufa bacteriológica durante 48 horas em 30oC. Para as bactérias que
foram positivas na reação de oxidação ocorreu alteração na coloração do meio de cultivo nos
tubos, de verde escuro passou a ser amarelo, e para bactérias fermentativas, os tubos contendo
meio de cultivo com óleo mineral na superfície também mudaram a coloração de verde escuro
para amarelo.
4.10- Teste de Urease
Em 1946, Christensen introduziu um meio que detecta a presença da enzima urease em
espécies bacterianas. Utilizando esse meio é possível determinar a habilidade do
microrganismos em degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima
urease, resultando na alcalinização do meio e em conseqüência disto ocorre à mudança da
coloração do meio (Christensen, 1946; Franzolin, 2008). A partir desta reação é possível
verificar a coloração rosa nas colônias crescidas no meio, indicando resultado positivo para
urease.
A preparação do meio ágar urea Christensen se deu através da adição de urea 40% no
meio ágar urea base autoclavado, de acordo com as recomendações do fabricante, o meio foi
distribuído em tubos com rosca, na quantidade de 3mL em cada tubo. Em seguida os tubos
foram inclinados em um suporte dentro de fluxo, aproximadamente com ângulo de 45°, até a
solidificação do meio.
4.11- Produção de gás e fermentação de carboidratos
Para a verificação da produção de gases bacterianos, o método utilizado foi através da
adição de tubos de Durhan invertidos em meio líquido vermelho de fenol. O material foi
autoclavado durante 15 minutos a 121oC. A partir de colônias puras crescidas em 24 horas
foram feitas inoculações nos tubos, utilizando-se alça de platina. A produção de gás foi
evidenciada através das formações de bolhas no interior dos tubos de Durhan invertidos.
35
A fermentação de carboidratos é observada através do processo metabólico de
oxidação-redução que ocorre em anaerobiose, e em vez do oxigênio. Um substrato orgânico
serve como aceptor final de hidrogênio. Na reação de fermentação de açúcares, ocorre a
formação de ácidos orgânicos como metabólitos. A produção desses ácidos provoca uma
diminuição do pH do meio. O teste consiste na detecção da acidificação do meio de cultura,
utilizando um indicador de pH, o vermelho fenol, que em pH ácido se torna amarelo. As
bactérias são diferenciadas pelos carboidratos que metabolizam, devido a diferenças de
atividades enzimáticas, e através dos tipos e quantidades de ácidos produzidos (Franzolin,
2008).
Para a caracterização bacteriana na fermentação de carboidratos foram utilizadas seis
diferentes fontes: glicose, arabinose, dulcitol, inositol, rafinose e trealose. O meio de cultivo
utilizado nesta prova bioquímica foi o indicador vermelho de fenol, preparado de acordo com
as especificações do fabricante. Como cada reação é verificada separadamente, foram
preparados seis diferentes reações, adicionando separadamente cada carboidrato no meio de
cultivo vermelho de fenol, na proporção de cinco gramas de carboidrato para cada litro de
meio, após a preparação os tubos foram autoclavados durante 15 minutos a 121oC. As
colônias bacterianas purificadas e crescidas durante 24 horas foram inoculadas em cada tubo
com auxílio da alça de platina, ao término do processo o material foi incubado em estufa
bacteriológica durante 24 horas a 30oC.
4.12- Hemólise bacteriana
Vários patógenos sintetizam proteínas que atuam na membrana citoplasmática das
células animais provocando lise celular, conseqüentemente a morte celular. É fácil detectar a
ação destas toxinas, hemolisinas, com glóbulos vermelhos (eritrócitos e hemácias), esta
verificação de hemólise pode ser observada através do inóculo bacteriano em placa de ágar
sangue. Durante o crescimento das colônias certas quantidades de hemolisina são produzidas
a partir da lise dos eritrócitos próximos, originando assim uma zona clara (halo) típica de
hemólise, de acordo com o tipo de halo formado é possível distinguir os diferentes tipos de
hemólises: alfa hemólise ()- halo de hemólise parcial, observa-se a coloração esverdeada ao
redor das colônias em decorrência da perda massiva de potássio por parte do heritrócitos do
ágar sangue, beta hemólise ()- halo de hemólise completo, observa-se a zona transparente
36
formada ao redor das colônias. Bactérias não hemolíticas são denominadas gama hemolíticas
() (Madigan et al., 2004).
A atividade hemolítica foi verificada através da reação bacteriana após inoculação de
colônias no meio ágar sangue. Algumas culturas bacterianas puras, crescidas em meio líquido,
foram semeadas, por esgotamento, em placas contendo meio ágar sangue de carneiro
desfibrinado a 7% (pronto para uso), o material foi incubado durante 24 horas à 30oC. A
leitura da reação foi realizada através da observação do tipo de hemólise visível no meio de
cultura, através da observação da formação de halo ao redor das colônias bacterianas.
4.13- Identificação molecular bacteriana
Para identificação molecular bacteriana foi realizada as etapas de extração de DNA
genômico, amplificação por PCR do gene 16S rRNA, sequenciamento do gene 16S rRNA
dos isolados bacterianos e comparação das sequências obtidas com banco de dados públicos,
realizados como descrito a seguir:
4.14- Extração do DNA genômico bacteriano
A partir das amostras previamente isoladas e identificadas, foi realizada extração de
DNA genômico, utilizando o método de extração por fenol/clorofórmio (Sambrook e Russel,
2001) com algumas modificações. Seguindo o protocolo, células bacterianas foram inoculadas
em 3mL de caldo Luria-Bertani (LB), e deixadas para crescimento, em incubador com
agitação durante 24 horas a 30oC e 150 rpm. Após crescimento celular o material foi
centrifugado a 12.000g durante 2 minutos, para concentração de células em sedimento (esta
etapa foi realizada duas vezes para concentração de 3mL de cultivo).
Para a etapa de lise celular o sedimento foi ressuspendido em 1mL de tampão de
extração (NaCl 100mM; EDTA 50nM; Tris-HCl 50mM com pH 8,0), e centrifugado por
12.000g durante 2 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido em 300µL de tampão de
extração, 30 µL de enzima lisozima (10mg/mL), e 10µL de RNAse (10mg/mL), para remoção
de RNAs da reação, incubado durante 10 minutos em temperatura ambiente, foi adicionado 50
µL de Triton X-100 10% e 30µL de NaCl 3M e incubado em banho seco a 60oC por 5
minutos.
37
Após a incubação, foi acrescentado 20µL de SDS 10% e 3mL proteinase K
(10mg/mL), para remoção proteica, o material o qual foi homogeneizado e incubado durante
30 minutos a 37oC. Para o procedimento de lavagens das amostras, foi adicionado 450µL de
fenol, visando à desnaturação de proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa, onde se
encontram os ácidos nucleicos. O material foi agitado manualmente por 5 minutos e
centrifugado em 12.000g por 2 minutos. Neste processo formou-se duas fases, sendo que
apenas a fase aquosa foi recuperada onde foi adicionado 450µL de clorofórmio, para remoção
de resíduos fenólicos, e novamente centrifugado por 12.000g por 2 minutos. A fase aquosa
formada na lavagem com clorofórmio foi recuperada para a etapa de precipitação do DNA, na
qual foi adicionada 30µL de NaCl 3M e vagarosamente 1mL de etanol absoluto a -20oC,
novamente centrifugado a 12.000g durante 2 minutos. O precipitado foi hidratado com 1mL
de etanol 70%, novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores e foi deixado em
repouso em fluxo laminar para secagem final por aproximadamente 15 minutos.
Após
secagem, foi ressuspendido com 100µL de tampão TE (Tris-HCl 10mM pH 7.5; EDTA
1mM), incubado a 56 oC por 15 minutos e logo em seguida armazenado por 24 horas a -20oC.
Para visualização do DNA foi feita eletroforese em gel de agarose 0,8% em seguida o gel foi
corado com brometo de etídio (0,5µg/mL).
4.15- Reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação do gene 16S rRNA
Para amplificação do gene 16S rRNA, foram utilizados os oligonucleotídeos
iniciadores: 530 F (5ʹ-TGA CTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG -3´ e 1492R (5´TGA CTG ACT GAG AGC TCT ACC TTG TTA CGM YTT-3´) recomendados por
Borneman e Triplett (1997), e destacados esquematicamente na figura 01 para visualização
das regiões aproximadas de anelamento dos iniciadores. A reação de PCR foi feita com
volume de 25µL (dNTPs de 2,5mM; tampão 10x com MgCl2; iniciadores (5pmoles/µL, Taq
DNA polimerase 5U/µL) e DNA bacteriano na concentração entre (10-30ng). O sistema de
amplificação foi realizado em aparelho termociclador Biocycle, com perfil de desnaturação a
95oC por 2 minutos, seguido por 35 ciclos com desnaturação do template a 95oC por 1:40
segundos; anelamento dos iniciadores a 58oC por 40segundos e extensão a 72 oC por 2
minutos, seguido de extensão final de 72 oC por 5 minutos. Após a reação de amplificação, as
amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% (por aproximadamente 40
min.), coradas com 0,5 μg/ mL de brometo de etídeo e fotografadas sob luz UV em
38
fotodocumentador (Bio Agency 302 nm UV) para verificação dos fragmentos 16S rRNA
amplificados, tamanho e concentração aproximada.
Figura 01- Esquema da localização aproximada do anelamento dos iniciadores 530F e 1492R (Borneman e
Triplett 1997), de acordo com o tamanho do gene 16S rRNA (Clarridge, 2004). V3-V9: regiões conservadas de
anelamento dos iniciadores.
4.16- Purificação das amostras
Os fragmentos de DNA amplificados na reação de PCR, foram purificados utilizando
kit GFX PCR DNA Kit (GE HealthCare), de acordo com as recomendações do fabricante.
Foram utilizados para purificação 50 µL de produto de PCR e, ao final da purificação o
precipitado foi ressuspendido em 20 μL de água. O material obtido neste experimento foi
utilizado na reação de sequenciamento.
4.17- Sequenciamento e análise das sequências
Na reação de sequenciamento foram utilizados 2 μL de DNA purificado (50ng), em
seguida para preparação do master mix da reação, adicionou-se 2μL de cada oligonucleotídeo
iniciador, 2 μL de tampão 5X (Tris-HCl 1M; MgCl2 1M) e 0,3μL de ABI BigDye (do kit de
reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Applied Biosystems). O volume final da
reação de seqüenciamento foi de 10μL. A reação de sequenciamento foi realizada em
termociclador (Applied Biosystems, 96 Well) com o seguinte perfil de temperatura: 25 ciclos
de desnaturação a 96oC por 10 segundos; anelamento a 50 oC por 15 segundos e extensão a
60 oC por 1:20 segundos.
Após a reação de sequenciamento foi feita a precipitação dos produtos seguindo o
protocolo de etanol/EDTA, adicionando-se sobre este 32,5 μL de mix Etanol/EDTA (2.5 μL
EDTA 125mM; 30μL de Etanol 100%), em seguida o material foi agitado gentilmente por
39
inversão e centrifugado durante 25 minutos em 2500 rcf a 4oC, em seguida foi secado para
retirada do etanol e posteriormente foi adicionado 30μL de etanol 70%, novamente o material
foi centrifugado por 15 minutos em 1450 rcf a 4oC em seguida foi deixado em estufa para
incubação de 15 minutos a 37oC após a incubação foi ressuspendido em 10 μL de formamida
e foi gentimente vortexado, em seguida o DNA foi desnaturado em termociclador a 95oC
durante 1 minuto. Ao final as amostras foram submetidas à eletroforese capilar em
seqüenciador (ABI 3130- Applied Byosistems DNA sequence).
4.18- Análises por Bioinformática
As sequências obtidas na reação de sequenciamento (Anexo) foram trimadas, para
atribuição de qualidade, utilizando o programa PHRED disponível no endereço
(http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html). O consenso das sequências 5´-3´ de cada
isolado bacteriano foi feito utilizando a ferramenta CAP3, este programa realiza a montagem
de sequência contíguas a partir dos arquivos.fasta.screen., está disponível no programa
Bioedit 7.0.5. Após a obtenção do consenso das seqências foi feita uma busca comparativa
com no banco de genomas bacterianos depositados no “GeneBank” utilizando a ferramenta
BLASTn do “National Center for Biotecnology Information”(NCBI) e também foram
comparadas com o banco de dados do “Ribossomal Database Project”(RDP).
Para avaliar a proximidade dos isolados deste trabalho com outros grupos bacterianos,
foi feito um alinhamento em conjunto das sequências dos isolados obtidos juntamente com
sequências de estirpes de referência obtidas no site RDP. O alinhamento destas sequências foi
realizado utilizando o programa BioEdit 7.0.5.3 (Hall, 1999) através da ferramenta ClustalW.
4.19- Análises filogenéticas das sequências
Inicialmente as sequências alinhadas foram utilizadas para as análises filogenéticas. A
árvore filogenética dos isolados bacterianos foi montada através do programa Mega 5.05
(Tamura et al. 2011), utilizando-se o método de distância Neighbor-joining, o qual gera uma
árvore a partir de matrizes de distâncias, agrupando sequências vizinhas, este é um método
próprio para avaliar grandes quantidades de dados, e as montagens de árvores são
relativamente precisas em comparações com outros métodos heurísticos de agrupamentos, e é
mais robusto contra pequenos erros na matriz de distância entre as sequências (Hoyle e Higgs,
2003). Para a análise dos dados obtidos foi utilizado o modelo de substituição nucleotídica
40
Jukes-Cantor, o qual gera uma matriz de distância com o número de diferenças entre os pares
de sequências alinhadas.
O teste de confiaça da topologia da ávore foi com um mínimo de 500 amostras
bootstrap. Este é um método estatístico para estimar limites de confiança em análises
filogenéticas, o qual basea-se na construção de subamostras a partir de uma amostra inicial da
população calculando-se as estatísticas, o programa de inicialização gera inumeras copias da
amostra original para criar uma pseudopopulação, o que gera várias árvores-réplicas, após
gerar todas as réplicas a árvore consenso final é obtida. Os valores presente na árvore indicam
a topologia de consenso das árvores-réplicas (Hillis e Bull, 2003).
41
5- Resultados
5.1- Caracterização fenotípica bacteriana
Todos os isolados estudados foram classificados de acordo com a morfologia celular e
as características bioquímicas apresentadas. As características celulares de cada isolado foram
observadas após a coloração pelo método Gram de colônias bacterianas com crescimento de
24/48horas, esse método também foi confirmado pelo teste de KOH das colônias.
5.2- Coloração Gram e teste KOH
Para visualização da morfologia bacteriana foi realizada a técnica de coloração de
Gram (Figura). Foram analisadas no total 72 amostras bacterianas, sendo identificados: 41
bacilos Gram-negativos, 23 bacilos Gram-positivos e 7 cocos Gram-positivos, na (Tabela 04)
são mostrados os resultados do teste Gram para cada isolado bacteriano. A reação de KOH
confirmou a reação de Gram para todas as amostras estudas.
Figura 02: Método de coloração de Gram. Fotos: Eliane Carvalho
Tabela 04- Resultado do teste Gram para cada isolado bacteriano
Isolados bacterianos
Bacilos Gram
positivo
Bacilos Gram
negativos
Cocos Gram
positivos
Total de amostras
bacterianas
Pirarucu
13
12
3
28
Tambaqui
7
9
2
18
Matrinxã
3
20
3
26
42
5.3- Testes bioquímicos
Foram realizados 19 testes para os 72 isolados bacterianos, os resultados obtidos nas
provas bioquímicas estão caracterizados nas (Tabelas 05; 06 e 07), em duas amostras de
bacilos Gram-positivos foi realizado o teste de reação de hemólise, para confirmação
fenotípica das espécies bacterianas. Através das caracterizações bioquímicas dos isolados
foram identificadas espécies pertencentes a sete famílias bacterianas.
Da família Enterobacteriacea foram encontrados 31 isolados (43%), sendo
identificados: 7 (10%) em tambaqui; 19 (26%) em matrinxã e 5 (7%) em pirarucu. Os
gêneros e as espécies bacterianas encontradas foram: Citrobacter sp. (4), Enterobacter sp. (7),
Escherichia coli (1), Hafnia alvei (1), Plesiomonas shigelloides (2), Salmonella sp. (5) e
Shigella sp. (1). Desta família não foi possível à identificação em (10) isolados PPUFAM
239; PPUFAM 255; PPUFAM 256; PPUFAM 264; PPUFAM267; PPUFAM 268; PPUFAM
269; PUFAM 271; PPUFAM 272; PPUFAM 276.
Os isolados identificados como bacilos Gram positivos foram caracterizados como
pertencentes à família Bacillaceae sendo identificados 23 (32%) isolados de Bacillus sp.
Pertencente à família Flavobacteriaceae foi obtido apenas 1 (2%) isolado, não sendo
possível a identificação do gênero. Compondo à família Moraxellaceae, foram identificados 3
(4%) isolados de Acinetobacter sp.
Da família Vibrionaceae foram identificadas 5 (7%) espécies do gênero Aeromonas.
No
grupo
de
cocos
Gram-positivos
foram
identificadas
duas
famílias,
Staphylococcaceae e Streptococcaceae, com 6 (8%) isolados de Staphylococcus spp. e 3 (4%)
isolados de Streptococcus spp, respectivamente.
Na determinação da identidade fenotípica dos isolados bacterianos foram identificadas
6 espécies bacterianas, 11 gêneros e sete famílias, as espécies foram: Acinetobacter sp.,
Bacillus cereus, E. coli, Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides, Salmonella sp.
Nos isolados bacterianos identificados como PPUFAM 54 e PPUFAM 63 foi realizado
o teste de hemólise em meio de cultivo ágar sangue, no qual foi evidenciada hemólise do tipo
beta () (Figura 03). Esta característica juntamente com as com as reações observadas nos 19
testes bioquímicos realizados foi possível caracterizar estes isolados pertencentes à espécie
Bacillus cereus.
43
a
b
Figura 03- Beta () hemólise em isolados PPUFAM 54 (a) e PPUFAM 63(b).
Placas em ágar sangue de carneiro desfibrinado a 7%. Fotos: Eliane Carvalho
+R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco
44
Plesiomonas
shigelloides
Streptococcus
spp.
Streptococcus
spp.
Acinetobacter
spp.
Bacillus spp.
Enterobacteri
ace
Citrobacter
spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp.
Citrobacter
spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp.
Citrobacter
spp.
espécies
Staphylococc
us spp.
arabinose
dulcitol
inositol
rafinose
trealose
27
B
+
+
+
+
-
Salmonella
spp.
Gás
glucose
urease
lactose
citrato
Enterobacter
spp.
forma celular
col. Gram
teste KOH
oxidase
catalase
oxidação
fermentação
motilidade
H2S
indol
25 26
B B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- +R
+
+
+
+
+
+
Bacillus spp.
TESTES
ISOLADOS BACTERIANOS DE TAMBAQUI- PPUFAM
28 72 74 228 229 232 233 234 236 238 239 246 250 251 252
B
B
B
B B B B B B B B B C C
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R - +R +R - +R +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Staphylococ
cus spp
Tabela 05- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de tambaqui.
Tabela 06- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de matrinxã.
B
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B B
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+
+
+
+R +R
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
-
Salmonella
spp.
Citrobacter
spp.
Bacillus spp.
Enterobacter
spp.
Bacillus spp.
Staphylococ
cus spp.
Staphylococ
cus spp.
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Salmonella
spp.
C
+
+
+
+
+
+
+
-
Klebsiella
spp.
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Salmonella
spp.
B
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Enterobacter
spp.
B
+
+
+
-
Enterobacter
spp.
C
+
+
+
+
+
-
Enterobacteri
aceae
Enterobacteri
aceae
B
+
+
+
+
+
-
Citrobacter
spp.
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Enterobacteri
aceae
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Plesiomonas
shigelloides
288
Staphylococ
cus spp.
268 269 271 272 273 274 275 276 277 278 279 282 284 285 286
Enterobacteri
aceae
267
Acinetobacte
spp.
264 265 266
Acinetobacte
spp.
espécies
263
Acinetobacter
spp.
arabinose
dulcitol
inositol
rafinose
trealose
262
Shigella spp.
gás
glucose
urease
lactose
citrato
260
Edwardsiella
tarda
forma celular
col. Gram
teste KOH
oxidase
catalase
oxidação
fermentação
motilidade
H2S
indol
255 256 258
Edwardsiella
tarda
TESTES
Enterobacteri
aceae
ISOLADOS BACTERIANOS DE MATRINXÃ- PPUFAM
+R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco
45
Tabela 07- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de pirarucu.
ISOLADOS BACTERIANOS DE PIRARUCU- PPUFAM
07
12
13
16
22
34
37 38 40 43 44 45
46
51
52 53 54
55
57
58 59
63
64
70
71
forma celular
Col. Gram
teste KOH
oxidase
catalase
oxidação
fermentação
motilidade
H2S
indol
gás
glicose
urease
lactose
citrato
arabinose
dulcitol
inositol
rafinose
trealose
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+R
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+R
+
+
B
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
-
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
espécie
Aeromonas
spp.
Aeromonas
spp.
Aeromonas
spp.
Aeromonas
spp.
Enterobacter
spp.
Enterobacter
spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp.
Hafnia alvei
Salmonella
spp.
Bacillus spp.
Streptococcus
spp.
Bacillus spp.
Bacillus
ereus
Staphylococ
cu spp.
Flavobacte
rium
Bacillus spp.
Bacillus spp.
Bacillus
cereus
Bacillus spp.
Staphylococ
cus spp.
Bacillus spp.
Bacillus spp.
B B
+ +
- + - + +
+ +
+ - - - - +
- - +R
- + +
- +
+ +
+ +
+ +
Staphylococ
cus spp.
05
Escherichia
coli
03
Bacillus spp.
01
Aeromonas
spp.
TESTES
+R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco
46
5.4- Extração de DNA genômico e amplificação do 16S rRNA
A extração de DNA para as amostras foi realizada via fenol/ clorofórmio como
descrito no item 3.15, as amostras foram visualizadas em gel de agarose 0,8% e coradas com
brometo de etídio (Figura 04). Para comparação na identificação dos fragmentos de DNA
extraídos foi utilizado marcador de peso molecular lâmbida (λ).
Figura 04- Foto da extração de DNA genômico bacteriano em gel de agarose 0,8%.
(M)- Marcador de peso molecular lâmbida (λ). Foto: Eliane Carvalho
O DNA genômico bacteriano extraído foi amplificado por PCR para amplificação do
gene 16S rRNA, o fragmento molecular de 1000pb (pares de bases) (Figura 05) foi
comparado com marcador de peso molecular Ladder de 1Kb (Promega). Após, as amostras
foram purificadas e utilizadas na a reação de sequenciamento.
1000pb
1000pb
Figura 05- Foto da amplificação do gene 16S rRNA por PCR em gel de agarose 0,8%.
Marcador molecular (M) Ladder de 1Kb (Promega).( C-) controle negativo da reação.
Foto: Eliane Carvalho.
47
5.5- Identificação molecular das bactérias
A partir de 28 isolados de pirarucu, 17 isolados de tambaqui e 26 isolados de matrinxã
foram identificadas 35 espécies bacterianas (das quais 11 ainda não foram descritas)
representativas de 18 gêneros e nove famílias (Quadro 01 e 02, Tabela 08). A taxonomia
molecular bacteriana foi realizada nos 72 isolados do Banco de Bactérias Patogênicas em
Peixes – UFAM. O parâmetro de decisão para proceder com a identificação molecular
derivou do alinhamento comparativo entre espécies obtidos no BLAST e no RDP assumindose o percentual de confiança para identidade bacteriana (ID) a partir de 97% (Tabela 08).
Na identificação molecular foi possível caracterizar nove famílias bacterianas:
Bacillaceae; Enterobacteriaceae; Enterococcaceae; Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae,
Moraxellaceae, Paenibacillaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae (Figura 06).
Bacillaceae foi a mais representativa dentre todas as famílias, uma vez que foram
identificadas 13 espécies correspondendo a 37,14% do total. Em matrinxã ocorreram duas
espécies não descritas de Bacillus (Bacillus sp.1 e Bacillus sp.2). Em pirarucu ocorreram oito
espécies (Bacillus cereus, Bacillus sp.3, Bacillus sp.4, Bacillus sp.5, Bacillus sp.6, Bacillus
sp.7, Bacillus sp.8 e Lysinibacillus fusiformes). Em tambaqui foram encontradas quatro
espécies (B. aquimaris, B. pumillus, Bacillus sp.9, Lysinibacillus fusiformes).
Pertecentes
à
família
Enterobacteriaceae
foram
identificadas
12
espécies,
correspondendo 34,29% do total. Em pirarucu ocorreram cinco espécies (Enterobacter
aerogenes, Escherichia coli, Hafnia alvei, Kluyvera georgiana e Pantoea sp.). Em tambaqui
foram encontradas cinco espécies (Citrobacter sp.1, Edwardsiella tarda, Enterobacter
asburiae, Plesiomonas shigelloides e Salmonella sp. enterica). Em matrinxã sete espécies
(Edwardsiella tarda, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp.1, Klebsiella pneumoniae; K.
georgiana, Plesiomonas shigelloides e Salmonella enterica).
Compondo
a família
Staphylococcaceae foram
identificadas
três
espécies,
correspondendo a 8,57% do total. Em pirarucu foram encontrados Staphylococcus
saprophyticus e S. aureus. Em matrinxã, S. pasteuri e S. saprophyticus.
Na família Streptococcaceae foram identificadas duas espécies, correspondendo à
5,71% do total, onde
Lactococcus garviae foi encontrada em tambaqui e L. lactis em
pirarucu.
As famílias Enterococacceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae,
Paenibacillaceae foram as menos representativas, correspondendo a 2,86% do total,
respectivamente. Em cada uma dessas famílias foi identificada apenas uma espécie
48
(Enterococcus raffinosus, Myroides odoratimus, Microbacterium terrae, Acinetobacter
calcoaceticus e Paenibacillus sp., respectivamente).
Figura 06- Representação das famílias com base nas espécies bacterianas identificadas
49
Quadro 01- Espécies identificadas nos isolados de pirarucu, tambaqui e matrinxã. O
número entre parênteses corresponde ao total de isolados encontrados.
Espécies isoladas
de pirarucu
Espécies isoladas
de tambaqui
Espécies isoladas
de matrinxã
Bacillus cereus
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter calcoaceticus (2)
Bacillus sp. 3
B. pumillus
Bacillus sp. 1
Bacillus sp. 4
Bacillus aquimaris
Bacillus sp. 2
Bacillus sp. 5
Bacillus sp.9
Edwardsiella tarda (8)
Bacillus sp. 6
Citrobacter sp. (3)
Enterobacter asburiae (2)
Bacillus sp. 7
Edwardsiella tarda
Enterobacter sp. 1
Bacillus sp. 8
Enterobacter asburiae
Klebsiella pneumoniae (2)
Enterobacter aerogenes (2)
Lactococcus garviae (2)
Kluyvera georgiana (2)
Enterococcus raffinosus.
Lysinibacillus fusiformis (3)
Plesiomonas shigelloides
Escherichia coli
Microbacterium terrae
S. saprophyticus
Hafnia alvei
Paenibacillus sp.
Salmonella enterica (3)
Kluyvera georgiana (5)
Plesiomonas shigelloides
Staphylococcus pausteuri (2)
Lactococcus lactis
Salmonella entérica
Lysinibacillus fusiformes (4)
Microbacterium terrae
Myroides odoratimus
Pantoea sp.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus (2)
Quadro 2- Espécies bacterianas identificadas nos isolados PPUFAM. O número entre
parênteses corresponde ao total de isolados encontrados.
50
Acinetobacter calcoaceticus (3)
Enterococcus raffinosus
B. pumillus
Escherichia coli
Bacillus aquimaris
Hafnia alvei
Bacillus cereus
Klebsiella pneumoniae (2)
Bacillus sp. 1
Kluyvera georgiana (7)
Bacillus sp.2
Lactococcus garviae (2)
Bacillus sp.3
Lactococcus lactis
Bacillus sp.4
Lysinibacillus fusiformis (7)
Bacillus sp.5
Microbacterium terrae (2)
Bacillus sp.6
Myroides odoratimus
Bacillus sp.7
Paenibacillus sp.
Bacillus sp.8
Pantoea agglomerans
Bacillus sp. 9
Plesiomonas shigelloides (2)
Citrobacter sp. 1 (3)
Salmonella entérica (4)
Edwardsiella tarda (9)
Staphylococcus aureus
Enterobacter aerogenes (2)
Staphylococcus pausteuri (2)
Enterobacter asburiae (3)
Staphylococcus saprophyticus (3)
Enterobacter sp.1
51
Tabela 08- Taxonomia molecular dos isolados PPUFAM.
ORIGEM
ISOLADOS
FAMÍLIA
GÊNERO
ESPÉCIE
% de cobertura % de ID
Tambaqui PPUFAM 238
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus aquimaris
97
99
Pirarucu
PPUFAM 51
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus cereus
97
97
Tambaqui
PPUFAM 27
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus pumilus
97
98
Matrinxã
PPUFAM 282
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 1
97
98
Matrinxã
PPUFAM 285
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 2
99
95
Pirarucu
PPUFAM 43
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 3
97
98
Pirarucu
PPUFAM 54
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 4
99
89
Pirarucu
PPUFAM 58
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 5
98
91
Pirarucu
PPUFAM 59
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 6
99
88
Pirarucu
PPUFAM 63
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 7
99
90
Pirarucu
PPUFAM 64
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 8
98
87
Tambaqui PPUFAM 233
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus sp. 9
97
87
Pirarucu
PPUFAM 37
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformes
97
97
Pirarucu
PPUFAM 38
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformes
97
97
Tambaqui PPUFAM 228
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformes
98
97
52
Tambaqui
PPUFAM 25
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformis
99
98
Tambaqui
PPUFAM 72
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformis
98
98
Pirarucu
PPUFAM 40
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformis
100
98
Pirarucu
PPUFAM 53
Bacillaceae
Lysinibacillus
Lysinibacillus fusiformis
98
99
Tambaqui
PPUFAM 74 Enterobacteriaceae
Citrobacter
Citrobacter sp.1
97
99
Tambaqui PPUFAM 232 Enterobacteriaceae
Citrobacter
Citrobacter sp.1
99
95
Tambaqui PPUFAM 236 Enterobacteriaceae
Citrobacter
Citrobacter sp.1
98
91
Matrinxã
PPUFAM 269 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardisiella tarda
95
97
Matrinxã
PPUFAM 267 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
99
98
Matrinxã
PPUFAM 255 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
94
99
Matrinxã
PPUFAM 256 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
97
99
Matrinxã
PPUFAM 258 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
97
99
Matrinxã
PPUFAM 268 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
100
99
Matrinxã
PPUFAM 272 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
98
98
Matrinxã
PPUFAM 271 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
98
98
Tambaqui PPUFAM 239 Enterobacteriaceae
Edwardsiella
Edwardsiella tarda
97
99
Tambaqui
Enterobacter
Enterobacter asburiae
98
98
PPUFAM 26 Enterobacteriaceae
53
Matrinxã
PPUFAM 274 Enterobacteriaceae
Enterobacter
Enterobacter sp.1
98
99
Matrinxã
PPUFAM 284 Enterobacteriaceae
Enterobacter
Enterobacter asburiae
98
98
Matrinxã
PPUFAM 288 Enterobacteriaceae
Enterobacter
Enterobacter asburiae
97
97
Pirarucu
PPUFAM 13 Enterobacteriaceae
Enterobacter
Enterobacter aerogenes
99
97
Pirarucu
PPUFAM 16 Enterobacteriaceae
Enterobacter
Enterobacter aerogenes
99
96
Pirarucu
PPUFAM 34 Enterobacteriaceae
Escherichia
Escherichia coli
97
98
Pirarucu
PPUFAM 45 Enterobacteriaceae
Hafnia
Hafnia alvei
98
98
Matrinxã
PPUFAM 276 Enterobacteriaceae
Klebsiella
Klebsiella pneumoniae
98
97
Matrinxã
PPUFAM 279 Enterobacteriaceae
Klebsiella
Klebsiella pneumoniae
95
97
Matrinxã
PPUFAM 273 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
98
98
Pirarucu
PPUFAM 01 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
97
98
Pirarucu
PPUFAM 05 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
97
99
Matrinxã
PPUFAM 264 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
97
98
Pirarucu
PPUFAM 03 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
99
93
Pirarucu
PPUFAM 07 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
97
95
Pirarucu
PPUFAM 12 Enterobacteriaceae
Kluyvera
Kluyvera georgiana
96
95
Pirarucu
PPUFAM 46 Enterobacteriaceae
Pantoea
Pantoea agglomerans
94
93
54
Matrinxã
PPUFAM 266 Enterobacteriaceae
Plesiomonas
Plesiomonas shigelloides
98
98
Tambaqui PPUFAM 252 Enterobacteriaceae
Plesiomonas
Plesiomonas shigelloides
99
97
Matrinxã
PPUFAM 275 Enterobacteriaceae
Salmonella
Salmonella entérica
98
99
Matrinxã
PPUFAM 277 Enterobacteriaceae
Salmonella
Salmonella entérica
99
99
Matrinxã
PPUFAM 278 Enterobacteriaceae
Salmonella
Salmonella entérica
96
99
Tambaqui
PPUFAM 28 Enterobacteriaceae
Salmonella
Salmonella entérica
98
99
Pirarucu
PPUFAM 44
Enterococcaceae
Enterococcus
Enterococcus raffinosus
98
97
Pirarucu
PPUFAM 57
Flavobacteriaceae
Myroides
Myroides odoratimus
97
97
Pirarucu
PPUFAM 22 Microbacteriaceae Microbacterium
Microbacterium terrae
97
97
Tambaqui PPUFAM 229 Microbacteriaceae Microbacterium
Microbacterium terrae
99
97
Matrinxã
PPUFAM 263
Moraxellaceae
Acinetobacter
Acinetobacter calcoaceticus
98
97
Tambaqui PPUFAM 246
Moraxellaceae
Acinetobacter
Acinetobacter calcoaceticus
98
98
Matrinxã
Moraxellaceae
Acinetobacter
Acinetobacter calcoaceticus.
98
98
Paenibacillaceae
Paenibacillus
Paenibacillus sp.
98
99
Staphylococcus pasteuri
100
99
PPUFAM 262
Tambaqui PPUFAM 234
Matrinxã
PPUFAM 286 Staphylococcaceae Staphylococcus
Matrinxã
PPUFAM 265 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus
100
99
Pirarucu
PPUFAM 55 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus
97
99
55
Pirarucu
PPUFAM 70 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus
99
98
Matrinxã
PPUFAM 260 Staphylococcaceae Staphylococcus
Staphylococcus pasteuri
98
98
Pirarucu
PPUFAM 71 Staphylococcaceae Staphylococcus
Staphylococcus aureus
99
97
Tambaqui PPUFAM 250 Streptococcaceae
Lactococcus
Lactococcus garvieae
99
98
Tambaqui PPUFAM 251 Streptococcaceae
Lactococcus
Lactococcus garvieae
97
98
Pirarucu
Lactococcus
Lactococcus lactis
97
98
PPUFAM 52
Streptococcaceae
% de cobertura- valor percentual da cobertura de consulta de sequências no banco de dados BLAST.
% de ID- valor percentual da identidade de sequências.
56
5.6- Análises Filogenéticas
Nas análises filogenéticas a proximidade de parentesco dos isolados utilizados neste
trabalho foi avaliada com outros grupos bacterianos, sendo utilizadas para esta comparação
sequências obtidas no RDP a partir de estirpes de referência (ATCC) de cada grupo
bacteriano identificado.
Alguns isolados identificados apresentaram sequências com similaridades próximas de
100%, indicando que todos são representantes da mesma espécie. Para estes isolados
altamente similares foi utilizada apenas uma sequência representativa para a construção da
árvore filogenética.
A montagem da árvore filogenética foi feita utilizando-se somente sequências reversas,
pois em alguns isolados não foi possível obter sequências consenso e através da verificação
qualitativa, utilizando programa PHRED, foi observado que as sequências reversas
apresentaram melhores resoluções, os níveis mínimos de exigências estimados foram de 250
bases, com qualidade PHRED acima de 20.
No dendograma filogenético (Figura-07) é possível verificar as espécies identificadas
ou unidades taxonômicas (Operational Taxonomic Units - OTUs) juntamente com os
rerspectivos grupos de famílias nas quais pertencem. Os grupos bacterianos ou clusters estão
representados pela ordem numérica de I-IX, onde I é Enterobacteriaceae; II- Moraxellaceae;
III- Flavobacteriaceae; IV- Microbacteriaceae; V- Staphylococcaceae; VI- Enterococcaceae;
VII- Streptococcaceae; VIII- Bacillaceae e IX- Paenibacillaceae
A árvore filogenética apresentada corresponde ao agrupamento filogenético de 35
espécies de bactérias isoladas de pirarucu, tambaqui e matrinxã. Com base no alinhamento das
sequências nucleotídicas foi gerada uma árvore de Neighbor-Joining a qual revelou a
existência de pelo menos nove agrupamentos correspondentes às famílias: Bacillaceae,
Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae,
Paenibacillaceae, Staphylococcaceae e Streptococcaceae.
As duas famílias mais representativas (Enterobacteriaceae e Bacillaceae) mostraram-se
claramente polifiléticas, tendo em vista que os gêneros e as espécies dentro destas famílias
agruparam-se com gêneros e espécies distintas.
No caso da família Enterobacteriaceae observa-se que os gêneros Escherichia e
Salmonella são grupos irmãos. Porém, na nossa filogenia, PPUFAM 275 (S. entérica) não se
agrupou com as estirpes de referência de E. coli + S. enterica + PPUFAM 34 (E. coli).
Enterobacter mostrou-se polifilético, uma vez que a espécie Enterobacter asburiae ficou mais
57
próxima de Pantoea agglomerans enquanto Enterobacter aerogenes agrupou-se mais
proximamente de Kluyvera georgiana. Citrobacter freundii agrupou-se com Edwardsiella
tarda. Os gêneros Hafnia e Plesiomonas mostraram-se monofiléticos.
No grupamento formado pela família Bacillaceae, observa-se que Lysinibacillus
fusiformis agrupou-se mais proximamente da família Paenibacillaceae, formando um clado
irmão. Bacillus pumillus, Bacillus aquimaris e PPUFAM 282 (Bacillus sp.1), formaram um
grupamento monofilético. Bacillus cereus formou clado monofilético com PPUFAM 285
(Bacillus sp.2). Bacillus sp. 4, Bacillus sp. 5, Bacillus sp. 3, Bacillus sp. 9, Bacillus sp. 7,
Bacillus sp. 6 e Bacillus sp. 8, formaram um grupo monofilético separado. Porém próximo à
Bacillus cereus.
A família Staphylococcaceae (grupo V) formou um grupamento monofilético. E
observou-se neste grupo que as espécies S. saprophyticus e S. pasteuri, formaram um clado
monofilético separado de S. aureus.
Os grupos VI e VII representados pelas famílias Enterococcaceae e Streptococcaceae
são monofilético e formam um grupo irmão.
58
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
VIII
Figura 07- Dendograma filogenético (Neighbor-Joining) do 16S rRNA de isolados bacterianos amazônicos
(PPUFAM) e de estirpes de referência (ATCC). As famílias bacterianas são representadas de I-IX, onde: IEnterobacteriaceae; II-Moraxellaceae; III- Flavobacteriaceae; IV- Microbacteriaceae; V-Staphylococcaceae; VIEnterococcaceae; VII- Streptococcaceae; VIII- Bacillaceae e IX- Paenibacillaceae. A matriz de distância foi
calculada pelo algoritmo Jukes-Cantor, com bootstrap de 500 repetições.
59
6- Discussão
6.1- Identificações das espécies bacterianas
Todos os tipos de peixes são propensos à infecções bacterianas, as quais podem ser
responsáveis por surtos graves de doenças e mortalidade em espécies selvagens e cultivadas.
Embora os sinais de doenças e a história clínica forneçam informações valiosas sobre os
prováveis agentes etiológicos, a caracterização taxonômica é geralmente necessária para
identificar um patógeno específico (Frerichs e Millar, 2003). A interação entre o conjunto de
dados genéticos e fenotípicos fornecem uma base sólida para a descrição da diversidade em
procariotos (Kampfer e Glaeser, 2011; Kampfer e Glaeser, 2012).
As identificações das espécies bacterianas foram feitas utilizando-se três abordagens
distintas, através de testes bioquímicos, análises das sequências parciais do gene 16S rRNA e
perfil filogenético. Utilizando estas metodologias, foi possível identificar gêneros e espécies
bacterianas. Nos isolados em que ocorreram divergências de resultados entre os testes
bioquímicos e testes moleculares foram utilizados os resultados da análise molecular, devido
o maior percentual de confiança.
6.1.1-Identificações fenotípicas das famílias e espécies bacterianas
As identificações bacterianas classicamente são baseadas nas similaridades das
características fenotípicas observadas. Através da observação destas características todas as
amostras obtidas na coleção de cultura de bactérias patogênicas em peixes, foram
identificadas seguindo padrões citados na literatura. Os resultados obtidos na identificação
fenotípica dos 72 isolados analisados nesse estudo, evidenciaram características similares com
sete famílias bacterianas Enterobacteriaceae; Bacillaceae; Flavobacteriaceae; Moraxelaceae;
Vibrionaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae, sendo possível a identificação de seis
(06) espécies.
Enterobacteriaceae
Pertencendo a maior e mais abrangente família bacteriana, Enterobacteriaceae, foram
encontrados 31 isolados. A classificação bacteriana seguiu o padrão das principais
características que distinguem essa família, as quais determinam que todas as bactérias desse
grupo são pequenos bacilos Gram-negativos e oxidase negativos, exceto a espécie
Plesiomonas shigelloides que possui oxidade positiva, todas as espécies crescem em meio
60
seletivo ágar MacConkey, são anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose),
fermentam glicose com ou sem produção de gás e todos são catalase positivos (Ewing et al.,
1980; Paradis et al., 2005). Estes fatores foram determinantes na classificação dos isolados
desse grupo, sendo possível a caracterização fenotípica de 07 espécies, Citrobacter sp.;
Enterobacter spp.; Escherichia coli; Klebsiella sp.; Plesiomonas shigelloides; Salmonella spp
e Shigella spp.
O gênero Citrobacter identificado nos isolados PPUFAM 74; PPUFAM 232;
PPUFAM 236 e PPUFAM 279, foi um gênero bastante complexo em sua identificação
primária devido algumas semelhanças fenotípicas com E. coli, Klebsiella e Enterobacter,
porém algumas características únicas determinaram sua identificação. São estabelecidas nas
literaturas algumas características que permitem distinguir, Citrobacter dos demais grupos.
Dentre estas podem ser destacadas que este é um gênero bacteriano com reação de H2S
positivo (Booth e McDonald, 1971); exceto em C. koseri, e são bactérias
móveis,
distinguindo de Klebsiella que é um gênero não móvel (Martinez e Trabulsi, 2008). Segundo
o Levy (2004) genêros como Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter apresentam baixo poder
de discriminação, neste caso a identificação segue o maior percentual de probabilidade das
chaves utilizadas. Em decorrência das principais características observadas compatíveis com
Citrobacter, determinamos os isolados estudados como Citrobacter spp.
Enterobacter foi identificado nos isolados PPUFAM 13; PPUFAM 16; PPUFAM 26;
PPUFAM 273, PPUFAM 274, PPUFAM 284 e PPUFAM 288. De acordo com as reações
metabólicas evidenciadas estes isolados foram nomeados como Enterobacter sp., sendo que
as principais características que definiram esta espécie foram evidenciadas nas reações de
indol, citrato de Simmons, ureaese e motilidade. Estas reações possibitam separar
Enterobacter das espécie de E. coli e Klebsiella. Na reação de indol Enterobacter é sempre
negativo (Levy, 2004), enquanto E. coli é positiva. Em meio citrato de Simmons, E. coli tem
reação negativa enquanto que na maioria das espécies em Enterobacter observa-se reação
positiva. A prova de urease também foi determinante, pois, em E. coli é negativa, enquanto
Enterobacter tem reação positiva. A distinção de Enterobacter para Klebsiella, é verificada
principalmente na prova de motilidade, pois Klebsiella é uma bactéria não móvel e todas as
espécies de Enterobacter são móveis (Levy, 2004; Martinez e Trabulsi, 2008).
A espécie E. coli foi identificada somente no isolado, PPUFAM 34, segundo Breed et
al. (1957), as principais reações típicas desta espécies são: as reações de indol positiva, urease
negativa, reação negativa em citrato de Simmons e lactose positiva em meio seletivo ágar
61
MacConkey. Através observação destas características, produção de gás e fermentação de
carboidratos confirmamos a identificação do isolado PPUFAM 34 pertencendo a esta espécie.
PPUFAM 276 foi identificado como Klebsiella spp., de acordo com o Levy (2004),
bactérias deste gênero são bacilos Gram-negativos não móveis e fermentadores de lactose em
meio MacConkey. Apesar de características semelhantes com E.coli e Enterobacter esta
espécie difere por não ser móvel.
Os isolados PPUFAM 252, 266 e PPUFAM 267 foram identificados como
Plesiomonas shigelloides, esta bactéria é a única da família Enterobacteriacea a apresentar
oxidase positiva (Falcão et al., 2007), esta característica é extremamente importante na
distinção desta espécie com outras da família de enterobactérias, o nome da espécie foi
definido devido esta ser a única pertencente ao gênero Plesiomonas (Falcão et al., 2007). Para
confirmação da taxonomia foi observado nos isolados as reações de oxidase positiva, indol e
motilidade, confirmando os padrões nas chaves taxônomica para a espécie Plesiomonas
shigelloides.
Os isolados PPUFAM 28, PPUFAM 46, PPUFAM 275, PPUFAM 277 e PPFAM 278,
foram identificados como Salmonella spp.. Ao contrário de muitas espécies da família
Enterobacteriaceae, as salmonelas clinicamente importantes não fermentam lactose, fator que
contribui na identificação das espécies (Ferreira e Campos, 2008). Além desta prova, as
evidências observadas indicando esta espécie, foram através das reações positivas em citrato
de Simmons, confirmação de motilidade e a produção de H2S, estas características são as
principais que definem este gênero excluindo possíveis gêneros, como Shigella, o qual
observou-se, de acordo com as chaves utilizadas, que apresenta algumas reações com os
resultados semelhantes à Salmonella.
Apesar da semelhança com Salmonella, o gênero Shigella foi identificado no isolado
PPUFAM 258. Para diferenciação dos gêneros semelhantes fenotipicamente com Shigella, os
principais testes observados foram as reações em citrato de Simmons, urease, e motilidade.
Bactérias do gênero Shigella não utilizam citrato como única fonte de carbono, no entando a
reação em citrato de Simmons é negativa, não produzem a enzima urease, e são espécies não
móveis, enquanto que a maior parte das espécies da família Enterobacteriaceae são bactérias
móveis (Campos et al., 2008). Em contrapartida os resultados para o teste de indol nos
isolados estudados foi negativo, divergindo das chaves de identificação utilizadas que
determinam resultado positivo para esta gênero, porém de acordo com Martinez e Trabulsi
(2008), o teste de indol é variável neste gênero. Seguindo os padrões dos manuais de
62
identificações e as comparações por similaridades de reações com o gênero Shigella,
confirmamos os isolados pertencendo a espécie Shigella spp.
É notório que na família Enterobacteriaceae existam centenas de espécies. Esta família
é uma das mais importantes famílias bacterianas, incluindo muitos patógenos isolados de
homens e animais, existem aproximadamente 30 gêneros e mais de 100 espécies (Martinez e
Trabulsi, 2008), com base nas reações metabólicas, conseguimos distinguir diferentes
espécies que compõem esta família, incluindo patógenos não associados às infecções em
peixes.
Bacillaceae
A identificação da família Bacillaceae foi realizada de acordo com os padrões
descritos por Vos et al. (2009), os quais definem que os membros desta família são
geralmente células em forma de bastonetes, capazes de produzirem endósporos, cilíndricos,
elipsoidais ou esféricos, podendo ocorrer em células únicas, em pares ou em cadeias (que
podem ser grandes comprimentos). Bactérias desta família podem ser móveis e imóveis,
podendo ser tanto aeróbias quanto anaeróbias facultativas. Geralmente são Gram-positivas,
podendo haver algumas espécies Gram-variáveis ou Gram-negativas, fermentam geralmente
todos os tipos de carboidratos, em algumas espécies as produções de gases são visíveis, na
maior parte são bactérias saprófitas, comumente encontradas no solo. Desta família foram
identificados 23 isolados das espécies Bacillus spp. e Bacillus cereus.
O gênero Bacillus compreende cerca de 50 espécies de bacilos anaeróbios facultativos
que podem exibir a forma esporulada, todos são móveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides
(Levy, 2004). Os isolados PPUFAM 54 e 63 apresentaram resultado negativo para o teste de
motilidade e resultados similares com B. cereus e B. anthracis. Devido estas características
foi realizado teste para verificação de hemólise em meio ágar sangue de carneiro para
confirmação da espécie, os resultados neste teste foram positivos, com verificação de
hemólise do tipo β (figura), confirmando a espécies B. cereus e descartando a possibilidade de
B. anthracis por ser não hemolítico. A reação negativa para motilidade pode ter ocorrido
devido exposição bacteriana no meio de cultivo utilizado, possivelmente ocorrendo à
formação de endósporos, os quais ocorrem como resposta a uma situação desfavorável no
meio no qual a bactéria foi exposta como a carência de água ou de algum nutriente essencial
(Alterthum, 2008). Nos demais isolados identificados no gênero Bacillus não foi possível
caracterizar fenotipicamente as espécies, sendo estes classificados como Bacillus spp.
63
Flavobacteriaceae
Pentencente à família Flavobacteriaceae foi identificado o isolado PPUFAM 57,
através da identificação fenotípica o isolado foi identificado como Flavobacterium, neste
gênero estão incluídas bactérias não móveis com formato de curtos bacilos Gram-negativos,
aeróbios estritos, com reação positiva de oxidase e crescimento com reação oxidativa no meio
O-F com glicose (Frerichs e Millar, 2003), estas características observadas no isolado
analisado corroboraram para identificação somente do gênero bacteriano, não sendo possível
a identificação de espécies em decorrência das poucas descrições nas chaves taxonômicas
utilizadas.
Moraxelaceae
Da família Moraxelaceae foram identificados três isolados, PPUFAM 246, PPUFAM
262 e PPUFAM 263, a identificação primária seguiu a chave de identificação proposta por
Frerichs e Millar (2003), a diferenciação dos demais gêneros bacterianos ocorreu devido
verificação de reações negativas para o teste de oxidase e teste em meio O-F com glicose,
somente o gênero Acinetobacter possui reação negativa nestes ensaios, possibilitando a
confirmação dos isolados como Acinetobacter spp.
Vibrionaceae
Vibrionaceae foi identificada em cinco isolados, PPUFAM 01; PPUFAM 03;
PPUFAM 05; PPUFAM 07; PPUFAM 12. Esta família inclui dois gêneros, Aeromonas e
Vibrio, distribuídos mundialmente, sendo as espécies destes gêneros consideradas as mais
importantes espécies patogênicas em peixes (Frerichs e Millar, 2003). Através da verificação
de bacilos Gram-negativos oxidase positiva e fermentadores, foram feitas as identificações
primárias da família bacteriana Vibrionaceae seguindo as chaves taxonômicas utilizadas
(Frerichs e Millar, 2003; Levy, 2004). De acordo com as características observadas na
fermentação de carboidratos, utilização de citrato e produção de H2S, foram feitas as
separações entre gêneros bacterianos desta família, algumas reações foram observadas para
exclusão do gênero Vibrio, espécies bacterianas pertencentes a este gênero não são capazes de
fermentar o carboidrato arabinose, não utilizam citrato de Simmons como única fonte de
carbono, exceto a espécie V. cholerae, e não produzem H2S, estas características típicas de
Aeromonas foram observadas nos isolados estudados.
64
O gênero Aeromonas inclui espécies móveis, exceto A. salmonicida, oxidase e catalase
positivas (Frerichs e Millar, 2003). Apesar da maioria das reações evidenciadas nos isolados
corresponderem em grande parte com características similares com Aeromonas, algumas
reações observadas não foram compatíveis com nenhuma espécie descrita neste gênero, como
por exemplo, a reação positiva de urease, exceto em PPUFAM 03, e fermentação de lactose
em meio MacConkey, devido a estas distinções da maioria das espécies do gênero
Aeromonas, para identificação fenotípica os isolados bacterianos foram identificados como
Aeromonas spp. O gênero Aeromonas é dividido em bactérias móveis e não-móveis, todas as
espécies móveis são isoladas de peixes, a espécie A. hydrophila é a mais frequentemente
isolada (Frerichs e Millar, 2003) e considerada como um significante agente patogênico em
peixes de água doce (Austin e Austin, 2007).
Staphylococcaceae
Espécies da família Staphylococcaceae (Schleifer e Bell 2010) foram evidenciadas nos
isolados PPUFAM 55; PPUFAM 70; PPUFAM 71; PPUFAM 260; PPUFAM 265 e
PPUFAM 286. De acordo com as características moleculares evidenciadas por 16S rRNA esta
família agrupa cinco gêneros, Staphylococcus, Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus
(Vos et al., 2009). Baseando-se em caracteres fenotípicos primários para identificação do
gênero, os isolados estudados foram identificados como Staphylococcus spp, somente o
gênero Staphylococcus agrupa bactérias Gram-positivas em cocos formando clusters,
características que permitiram distinguir Staphylococcus dos demais gêneros.
Staphylococcus é um gênero que compõe 32 espécies e 14 subespécies, sendo que
somente 15 espécies são encontradas em amostras humanas, são bactérias Gram-positivas não
móveis em forma de cocos em cachos, anaeróbios facultativos, com exceção de S. aureus
subsp. anaerobius e S. saccharolyticus que crescem mais rápido e abundante em condições
aeróbias, são geralmente catalase positivos e oxidase negativas, não esporulados que mais
resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são
relativamente resistentes ao calor e podem tolerar altas concentrações de sais (Levy, 2004;
Vos et al., 2009). Este gênero é geralmente considerado como potencial patógeno em peixes,
embora existam poucos relatos publicados de surtos de doenças (Frerichs e Millar, 2003). Em
1998, foram descritas várias epizootias por S. epidermidis em tilápias cultivadas em Taiwan
(Huang et al., 1999), o primeiro relato evidenciando patogenias em peixes causadas por esta
65
bactéria foi descrita por Kusuda and Sugiyama em 1981 em culturas de truta amarela
(Frerichs e Millar, 2003; Huang et al., 1999).
Streptococcaceae
Na família Streptococcaceae identificada em três isolados, PPUFAM 52; PPUFAM
250 e PPUFAM 251 estão incluídos três gêneros bacterianos, todas as espécies desta família
são bacilos Gram-positivos em formato de cocos em cadeias (Frerichs e Millar, 2003; Vos et
al., 2009), a principal característica que diferencia esta família de Micrococcacea, é a reação
negativa na prova de catalase (Vos et al.,2009). De acordo com estes critérios fenotípicos, os
isolados foram identificados como Streptococcus spp. Nesta família espécies de Streptococcus
iniae e Lactococcus garvie, são importantes patógenos em peixes (Austin e Austin, 2007).
6.1.2- Identificações moleculares de famílias e espécies bacterianas
As identificações moleculares de espécies bacterianas são importantes ferramentas que
corroboram com métodos fenotípicos clássicos para caracterização de microrganismos, que
geralmente não são tão precisos quanto à identificação com base em métodos genotípicos
(Clarrige, 2004).
Pelo sequenciamento da região gênica 16S rRNA foi possível obter a identidade
genotípica dos 72 isolados bacterianos estudados, como demostrado na (Tabela 08), o
percentual de identidade para as espécies foi considerado confiável entre sequências similares
com valor ≥97% de identidade quando comparadas com o banco de dados BLASTN,
similaridades inferiores indicam que representam diferentes espécies (Brenner et al., 2005).
Alguns autores sugerem estes valores acima de 97% para definição de gênero e 99% para
definição de espécies, porém não é possível atribuir um valor definitivo para definição de
gênero ou espécies bacterianas utilizando o gene 16S rRNA, devido a variação dos valores
percentuais gerados, essa diferença pode variar se calculada somente as primeiras 500 pb ou
todo o fragmento de 1500 pb, e também ocorrem variações no porcentual de acordo com o
programa de cálculo utilizado (Clarrige, 2004).
As análises parciais do gene 16S rRNA permitiram a identicação de 35 espécies
bacterianas, como destacado no Quadro 02, distribuídas em nove famílias: Bacillaceae;
Enterobacteriaceae; Enterococcacea; Flavobacteriaceae; Microbacteriaceae; Moraxelaceae;
Paenibacillaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae (Figura 06), segue abaixo a
caracterização cada família, bem como das espécies identificadas:
66
Família Bacillaceae
Bactérias da família Bacillaceae foram identificadas em grande número nos isolados
bacterianos estudados, com ocorrência de 37,14% (Figura 06), totalizando 13 espécies
identificadas. Esta família inclui 19 gêneros bacterianos, com mais de 142 espécies. Bacillus é
o gênero em que ocorrem o maior número de espécies (Logan e Vos, 2009). Neste gênero
foram identificadas 12 espécies: B. aquimaris, B. cereus, B.pumillus e Bacillus sp. 1, Bacillus
sp. 2, Bacillus sp. 3, Bacillus sp. 4, Bacillus sp. 5, Bacillus sp. 6, Bacillus sp. 7, Bacillus sp. 8
e Bacillus sp.9. No gênero Lysinibacillus, somente a espécie L. fusiformes foi identificada, em
isolados de piraru e tambaqui.
Bacillus é um gênero extremamente heterogêneo, as bactérias deste grupo possuem
capacidade de formação de esporos inertes ambientalmente e metabolicamente resistentes, a
maioria das espécies são isoladas principalmente a partir do solo, ou de ambientes que podem
ter sido contaminados diretamente ou indiretamente por solo, também são encontrados na
água, alimentos e amostras clínicas (Logan e Vos, 2009; Schmidt et al., 2011), Baciilus spp.
estão associados à patogenias em peixes, algumas espécies como B. mycoides foram
registradas como causa de infeções em bagres cultivados (Goodwin et al., 1994; Austin e
Austin, 2007).
B. cereus identificado no isolado PPUFAM 51, é uma bactéria que produz endosporos
que podem ser disseminados no solo, leite e outros alimentos, bem como em diversos
ambientes. Esta espécie pode multiplicar-se rapidamente em diversos alimentos causando
intoxicação alimentar, ocasionalmente causa infecções oportunistas em homens e animais
(Logan e Vos, 2009), em peixes exitem alguns registros de sua associação causando necrose
de brânquias em carpa comum e robalo listrado, porém não há registros de patogênias
impactantes causados por esta espécie em cutivo de peixes (Austin e Austin, 2007).
Outras espécies de Bacillus foram identificadas nas análises moleculares: B. pumillus
isolado em PPUFAM 27 e B. aquimaris em PPUFAM 238. Várias espécies de Bacillus
habitam zonas costeiras e ambientes marinhos, porém B. pumilus é considerado como o mais
importante componente da comunidade bacteriana marinha, é uma bactéria altamente
resistente à condições ambientais extremas, tais como baixo nutrientes ou nenhuma
disponibilidade, UV, dessecação, irradiação, H2O2, e desinfecção química. O papel ecológico
de B. pumilus é enfatizada pelo fato de que eles produzem compostos antagônicos de agentes
patogênicos fúngicos e bacterianos, estas características tornam esta espécie de grande
interesse para pesquisas (Gioia et al., 2007; Parvathi et al., 2009). O isolado PPUFAM 238
67
apresentou similaridade de 99% com a espécies B. aquimaris, esta espécies é isolada
principalmente de ambientes marinhos, foi identificada por Yoon et al. (2003) este utilizou
combinações de dados fenotípicos, análise filogenética do gene completo 16S rRNA e
relacionamento genômico diferenciou e propôs esta espécies para integrar o grupo Bacillus.
No gênero Lysinibacillus ocorreu a espécie Lysinibacillus fusiformis, com percentual
de identidade entre sequências ≥ 97% nos isolados analisados. O gênero inclui três espécies
Lysinibacillus boronitolerans; Lysinibacillus fusiformis e Lysinibacillus sphaericus (Ahmed
et al. 2007; Miwa et al., 2009), comuns no solo e ambientes aquáticos (Ahmed et al., 2007).
L. fusiformis faz parte do grupo de bactérias descritas como potencial para degradação do
biodiesel (Vaz, 2010). Espécies componentes do gênero Lysinibacillus foram isoladas pela
primeira vez de solo no Japão, e devido à observação da presença de lisina e aspartato no
peptidoglicano da parede celular, receberam essa denominação (Ahmed et al., 2007).
As espécies de Bacillus identificadas como Baccilus sp., agruparam-se com
similaridade próxima com a espécies Bacillus cereus, porém com percentual baixo de
identidade por isso não receberam nomeação de B. cereus, possivelmente o sequenciamento
completo do gene 16S rRNA destas espécies, pode permitir a identificação e reconstrução
filogenética destas espécies.
Família Enterobacteriaceae
A família Enterobacteriaceae representou total de 44,29% com 12 espécies bacterianas
identificadas, sendo que três espécies foram evidenciadas somente em pirarucu, E. coli;
Hafnia alvei e Pantoea agglomerans A espécie de Citrobacter sp.1 foi isolada somente em
tambaqui. E somente em matrinxã ocorreu a espécie Klebsiella pneumoniae (Quadro 1).
As espécies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Pantoea agglomerans são
descritas como bactérias causadoras de patogênias em peixes cultivados (Austin e Austin,
2007).
Os gêneros Escherichia; Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella são considerados de
maior importância na contaminação alimentar, pertencem ao grupo denominado coliformes
(Hobbs e Roberts, 1999). Na contagem de coliformes pode-se diferenciar dois grupos: os
coliformes totais, utilizados para avaliar as condições higiênicas, limpeza e sanificação, e os
coliformes termotolerantes que são indicadores de contaminação fecal (Siqueira, 1995). Em
países de clima tropical bactérias do grupo coliforme mesmo que introduzidas na água por
poluição fecal, podem adaptar-se ao meio aquático (Lopez-Torrez et al., 1977).
68
A espécie E. coli ainda que presente em pirarucu não é considerada como patógeno em
peixes, sua ocorrência reflete os níveis de poluição causados por outros animais na água.
Cepas de E. coli que contem enterotoxinas ou fatores virulentos estão entre as principais
responsáveis por infecções do trato urinário humano, podendo ainda provocar diarréias, e
ainda estar relacionadas com sepse e meningite (Muratori, 2007), esta ocorrência é de grande
importância uma vez que E. coli pode revelar-se como a principal causa de surtos de
intoxicação ou infecção alimentar após ficar em condições favoráveis para seu crescimento e
produção de toxinas.
K. pneumoniae tem sido isolada de solo, vegetais e ambientes aquáticos, é um
patógeno oportunista e está associada várias infecções em humanos, dentre estas, diarréia e
intoxicação alimentar (Brisse et al., 2006). Em peixes
K. pneumoniae foi isolada pela
primeira vez a partir de truta arco-íris na Escócia em 1998, os peixes apresentavam sinais de
podridão na cauda e nadadeiras (Austin e Austin, 2007). As evidencias da presença de K.
pneumoniae isoladas a partir de peixes de água doce, já são descritas na literatura (Kumari et
al., 2001; Sharma et al., 2006), porém a causa de patogenias associadas a esta espécie ainda
são incipientes.
A espécie de Citrobacter
é um patógeno emergente em peixes, é Citrobacter
freundii, existem vários relatos do surto de doenças causados por esta bactéria, principalmente
da causa de doenças em salmão e truta na Espanha e nos E.U.A respectivamente (Austin e
Austin, 2007).
As espécies Hafnia alvei e Pantoea agglomerans são descritos como causadores de
patogenias em peixes (Austin e Autin, 2007). P. agglomerans é uma bactéria que habita
plantas, solo, água, essa espécie é relatada como comensal e patógena de homens e animais, é
claramente um patógeno oportunista e raramente causam doença em indivíduos saudáveis
(Liberto et al., 2009). Em peixes infectados com a espécie P. agglomerans foram observadas
hemorragias acentuadas nos olhos de animais mortos e moribundos, as hemorragias também
foram registrados na musculatura (Austin e Autin, 2007).
Assim como P. agglomerans a espécie Hafnia alvei tem ocorrência principalmente no
solo e na água, é considerada como patógeno causador de hemorragia septicêmica em truta
arco-íris, esta espécie não é considerada como patógeno emergente em sistemas de cultivo
(Austin e Austin, 2007).
A espécie com maior ocorrência foi Edwardsiella tarda com registro de 9 isolados,
esta bactéria é um importante patógeno em peixes e a principal causa de surtos em sistemas de
69
cultivos, pode acometer cultivos tanto em água marinha quanto em água doce (Abbott e
Janda, 2006; Alexandrino et al., 2009). No Brasil, as espécies mais acometidas são o dourado
(Salminus sp.), a carpa comum (Cyprinus carpio) e a tilápia (Oreochromis niloticus), quando
mantidos em cultivo intensivo (Albinati et al. 2006; Pavanelli et al., 2008; Alexandrino et al.,
1999). Embora seja comumente classificada como oportunista, E. tarda é considerada um
agente patogênico grave de peixe. Este bactéria também é importante devido a sua aspectos
zoonóticos (Lima el at., 2008). E. tarda pode provocar doenças em muitos outros hospedeiros
como répteis, mamíferos e aves, no homem pode causar gastroenterite e meningite (Pavanelli
et al., 2008). No estado do Amazonas esta ocorrência é pioneira em espécies de matrinxã
cultivados. E possivelmente deve-se ao fato dessa espécie fazer parte do ambiente aquático e
acometer animais de sangue frio, quando os animais estão principalmente em situações de
estresse (Pavanelli et al., 2008). A ocorrência de doenças é observada principalmente em
temperaturas altas e está associada à poluição orgânica (Albinati et al. 2006).
As espécies de Enterobacter, têm habitat em diversos ambientes, incluindo solo,
plantas e água. As espécies E. asburiae e E. aerogenes são isoladas principalmente de
amostras clínicas, causam principalmente infecções no trato respiratório de humanos, a
significancia clínica desses patógenos ainda não é bem conhecida (Grimont e Grimont, 2005).
As ocorrências de patogenias espécies em peixes por estas espécies ainda são pouco
conhecidas, porém por serem bactérias com ambiente aquático podem ser patógenos
oportunistas de espécies cultivadas.
A espécie Kluyvera georgiana ocorreu em isolados de pirarucu e matrinxã, foram 7
isolados pertencentes a esta espécie. Sabe-se que K. georgiana assim como grande parte da
família Enterobacteriaceae, é distribuida em diversos ambientes, incluindo solo e água
(Farmer, 2006), também tem sido isolada de materiais clínicos, os primeiros relatos de
infecções foram em 1980, mas apesar de causar infecções foi considerada como um
organismo saprófita benigno que predominantemente colonizava principalmente o trato
respiratório, urinário, ou trato gastrintestinal, atualmente raramente está associada com
infecções clinicamente significativas em humanos (Sarria et al., 2001; Carter e Evans, 2005).
Em peixes não há descrição de infecções significativas, por ter habitat típicamente aquático
está presente em intestinos de caracóis, lesmas e outros moluscos (Muller et al., 1996).
Registra neste trabalho o primeiro registro desta espécie acometendo peixes cultivados de
água doce.
70
Foram identificados quatro isolados de Salmonella enterica com 99% de identidade.
Bactérias do gênero Salmonella são causas de doenças em humanos e animais, através do
consumo e da ingestão de alimentos contaminados (Shinohara et al., 2008). Em peixes, a
descrição de mortes causadas pela espécie S. entérica sp.arizonae foram relatas pela primeira
vez em culturas de pirarucus no Japão em 1982. Porém apesar desse fato, espécies de
Salmonella não são consideradas como patógenos importantes em peixes (Austin e Austin,
2007).
As espécies de Enterobacteriaceae identificadas: Enterobacter, Citrobacter, Hafnia
alvei, Pantoea agglomerans, Citrobacter, K. pneumoniae, Edwardsiella tarda e Kluyvera
georgiana, como verificado fazem parte do ambiente aquático, e geralmente entram no
hospedeiro através do sistema digestivo ou lesões na pele e brânquias. Entretanto,
quando ocorre algum desequilíbrio ambiental e os peixes são submetidos a alguma
situação de estresse, estes microrganismos podem ocasionar infecções oportunistas,
ocasionando a mortalidade em peixes e trazendo prejuízos consideráveis em sistemas de
cultivos (Sarria et al., 2001; Austin e Austin 2007; Pavanelli et al., 2008). As espécies de
Salmonella têm habitat limitado ao trato digestivo dos seres humanos e animais como aves.
Assim, é determinante que a presença de Salmonella em outros habitats (água, alimentação,
ambiente natural) possa ser explicado devido a contaminação fecal principalmente por aves
(Wray e Wray, 2000).
Família Streptococcaceae
O percentual de ocorrência da família Streptococcaceae foi de 5,71%, com ocorrência
de duas espécies de Lactococcus garvie e uma de Lactococcus lactis, em tambaqui e pirarucu
respectivamente.
Durante a última década, cocos Gram-positivos tornam-se importantes patógenos
causadores de doenças em peixes. Isto inclui espécies de estreptococos, lactococcos e
vagococcos (Bekker et al., 2011). O gênero Lactococcus é um grupo heterogênero de
bactérias ácido lacticas (BAL) que têm a capacidade de converter carboidratos em ácido
láctico (Teuber e Geis, 2006). É composto por sete espécies, porém L. lactis tem sido
intensamente estudada, principalmente devido ao seu interesse na indústria de laticínios por:
atuar na fermentação inicial do queijo, rápido crescimento e produção rápida de ácido láctico
no leite, tornando-se um modelo excelente para pesquisas sobre metabolismo, fisiologia e
genética. O nicho desta espécie inclui, plantas e superfícies e trato gastrointestinal de animais,
71
acredita-se que na superficie de plantas permanecem em estado de latência e multiplica-se no
trato gastrointestinal de ruminantes após ser engolida (Teuber e Geis, 2006; Bolotin et al.,
2001). A ocorrência de patogenias incluindo espécies da família Streptococcoceae foram
descritas pela primeira vez em peixes no Japão, quando Kusuda et al. (1991), tentaram
esclarecer o status taxonômico dos agentes causadores de streptococcicosis com 12 isolados a
partir de truta-amarela (Austin e Austin, 2007). O gênero Lactococcus foi criado em 1985
para acomodar microrganismos que eram incluídos no gênero Streptococcus conhecidos como
“estreptococos do grupo do ácido lático”, devido à capacidade de produzirem tal ácido a partir
da fermentação de carboidratos (Teixeira et al., 2009). L. garvie é um agente patogênico
zoonótico emergente, podendo ser isolado a partir de gado, várias espécies de peixes e seres
humanos (Zlotkin et al., 1998).
Família Staphylococcaceae
A família Staphylococcacea teve ocorrência de 8,57%, foram identificadas três
espécies, Staphylococcus aureus, S. pausteri e S. saprophyticus. O gênero Staphylococcus
inclui 37 espécies. As populações naturais do gênero Staphylococcus são encontradas
principalmente nas glândulas da pele e membranas mucosas de animais de sangue quente,
podem ter uma gama de hospedeiros ou de nichos sendo de estreita ou ampla distribuição,
dependendo particularmente da espécie ou das subespécies deste gênero, alguns organismos
podem ser isolados de uma variedade de produtos animais ou de fontes ambientais como solo,
água, poeira e ar, algumas espécies podem ser patógenos oportunistas de humanos e animais
(Schleifer e Bell, 2009).
S. aureus embora encontrado como relativa frequência como membro da microbiota
normal do corpo humano (Gava et al., 2008; Teixeira et al., 2008), S. aureus é uma das mais
importantes bactérias patogênicas, uma vez que atua como agente de uma gama de infecções.
Pode ser encontrado em várias partes do corpo humano, como fossas nasais, garganta, trato
intestinal e pele, produz várias toxinas que atuam através de diferentes mecanismos. Pode
causar intoxições alimentares, uma vez que são causadas pela ingestão de alimentos
contaminados, essas contaminações são provenientes de manuseio inadequado nos alimentos
(Teixeira et al., 2008). Em peixes os primeiros relatos de infecções causadas pelo gênero
Staphylococcus foram em 1982 e 1983, quando ocorreram mortalidades em culturas de carpa
prateada, (Hypophthalmichthys molitrix) na Índia. Essas mortalidades foram associadas com
72
doença ocular, e verificados que a doença era causada por cocos Gram-positivos identificadas
como S. aureus (Austin & Austin, 2007).
A espécie S. pausteri é uma bactéria principalmente isolada de humanos, animais e
alimentos, foi primeiramente descrita em Chesneau et al. (1993) (Schleifer e Bell, 2009), não
é causadora de patogênias em peixes, em humanos é considerado um patógeno
oportunista(Schleifer e Bell, 2009). S. saprophyticus assim como diversos membros de
Staphylococcus, é um habitante comum da flora normal da pele e da região periuretral de
homens e mulheres, depois de E. coli é o agente mais comum de infecções urinárias em
mulheres. A patogenicidade está relacionada à sua capacidade de aderir às células do epitélio
urinário (Milagres e Melles, 1992; Bueris et al., 2008).
Espécies de Staphylococcus podem surgir em peixes como conseqüência direta da
manipulação inadequada, uma vez que a maioria das espécies representam bactérias de
origem humana (Galvão et al., 2006).
Famílias Enterococcacea, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae e
Paenibacillaceae.
Estas famílias apresentaram percentual de 2,86% do total de famílias identificadas
respectivamente, com ocorrência de uma espécie representante de cada família.
A espécie indetificada em PPUFAM 44 representante da família Enterococcaceae foi
Enterococcus raffinosus. Fazem parte de Enterococcaceae quatro gêneros bacterianos
incluindo Enterococcus. Este gênero anteriormente nomeado de Streptococcus, foi
reclassificado a partir de resultados observados em hibridação DNA-DNA mostrando a
diferença entre gêneros. Subsequentemente estudos com 16S rRNA não só confirmaram esta
afirmação como também demonstraram a diferença entre Enterococcus e o gênero
Lactococcus e também outros cocos Gram-positivos (Hardie e Whiley, 1997; Svec e Dvriese,
2009). E. raffinosus é uma bactéria Gram-positiva, com formato celular de coco ovóide
ocorrendo em cadeias, muitas espécies do gênero Enterococcus são comensais do aparelho
aparelho digestivo (intestino) e urinário de mamíferos e pássaros, outras são isoladas de
plantas e de água como E. raffinosus, são bactérias tolerantes em condições ambientais
diversas, incluindo temperaturas extremas e altas concentrações salinas (Hardie e Whiley,
1997; Svec e Devriese, 2009). A ocorrência do gênero em ambientes aquáticos e trato
intestinal de aves explica a ocorrência desta Enterococcus raffinosus em pirarucu cultivado.
73
A família Flavobacteriaceae inclui muitas espécies marinhas que se agrupam em uma
árvore filogenética da sequência gênica 16S rRNA formando um "clado marinho" bem
definido (Bowman e Nichols, 2005). A espécie Myroides odoratimus anteriormente conhecida
como Flavobacterium odoratum, é uma bactéria Gram-negativa que tem sido comumente
isolada a partir de urina humana, fezes e sangue (Motwani et al., 2004). Gêneros da família
Flavobacteriaceae como Flavobacterium são organismos amplamente distribuídas no solo e
habitats de água doce, e alguns são considerados patogênicos para peixes. Por sequeciamento
do gene 16S rRNA foi verificado que Myroides odoratimus agrupa-se independentemente
das demais espécies, não possuindo estas características típicas do gênero por isso ocorreu a
reclassificação deste grupo (Vancanneyt et al., 1996). Atualmente não há registros desta
espécie causadora de patogenias em peixes. Nesta dissertação destaca-se o primeiro registro
desta espécie ocorrendo em sistemas de cultivo de pirarucu no estado do Amazonas.
Da família Microbacteriaceae foram identificadas duas espécies de Microbacterium
terrae, as sequências dos isolados apresentaram 97% de similaridade com esta espécie. Esta
espécie foi redefinida em 1998, anteriormente nomeada Aureobacterium terrae, passou a ser
Microbacterium terrae (Takeuchi e Hatano, 1998a).
A família Microbacteriaceae foi criada baseada em sequências de 5S rRNA para
agrupar bactérias com alto padrão de G+C. As bactérias deste grupo variam em morfologia
celular, estendendo de formas cocoides, pequenas bacilos irregulares para fragmentar em hifas
ramificadas. Estão distribuídos em vários ecossistemas terrestres e aquáticos e pode ser
associada com plantas, fungos, animais e amostras clínicas (Evtushenko e Takeuchi, 2006;
Stackebrandt et al., 2007). A espécie M. terrae está comumente associada ao solo e ambientes
aquáticos (Takeuchi e Hatano, 1998b). Não há qualquer evidência desta bactéria causadora de
doenças em peixes, uma vez que presente na água podem ocasionalmente tornar-se hospedeira
em peixes.
Na família Moraxellaceae os isolados PPUFAM 246; 262 e 263 foram identificados
como Acinetobacter calcoaceticus, esta bactéria foi originalmente isolada a partir de águas
residuais industriais na China sendo evidenciada sua capacidade para usar fenol como a única
fonte de carbono, teve seu genoma sequenciado devido sua importância para biorremediação
de águas com poluentes fenólicos e também pela suas relações filogenéticas com a espécies
patogenica humana A. baumannii (Zahn et al., 2011). Os membros de Acinetobacter são
comumente encontrados no solo, água e isolados de materia clínicos (Zahn et al.,2011). A.
calcoaceticus é comum da microbiota normal da pele e da garganta de seres humanos.
74
Juntamente com outros saprófitas, é considerada uma bactéria não patogênica em seres
humanos e em animais (Pal e Kale, 1981). Porém sabe-se que as bactérias saprófitas são
responsáveis por infecções secundárias ou oportunistas, quando os peixes estão debilitados
pelo estresse ou por alguma enfermidade prévia, especialmente quando há solução de
continuidade (Albinati et al. 2006). Acinetobacter spp. estão associadas à doenças ulcerativas
e hemorragias em peixes (Austin e Austin, 2007).
Paenibacillus sp. foi identificada nos isolado PPUFAM 234 presente em tambaqui. As
espécies da família Paeniacillaceae são comumentes isoladas do solo, raizes, sangue e outras
fontes (Vos et al., 2009), o gênero Paenibacillus, é amplamente distribuído no ambiente,
sendo encontrado em diferentes tipos de solos, rizosfera, tecidos internos de diversas plantas,
água, sedimentos marinhos (Maheshawari, 2010). Esta bactéria não está associada com
doenças em peixes.
6.1.3-Análises filogenéticas dos isolados bacterianos
As análises filogenéticas foram realizadas para auxiliar na correta identificação e
posicionamento dos isolados bacterianos estudados nas respectivas famílias e foram feitas a
partir das sequências parciais de regiões conservadas e variáveis do 16S rRNA, como
recomendado por vários autores (Woese 1987; Weisburg et al.,1991; Clarrige, 2004)
A árvore filogenética das espécies e os grupos das famílias bacterianas identificadas
com as respectivas sequências padrões obtidas no banco de dados RDP demonstra que os
isolados PPUFAM 34, 275, 46, 284, 239, 74, 276, 13, 273, 274, 45 e 252 fazem parte da
família Enterobacteriaceae, constituída por gêneros claramente polifiléticos. Neste grupo, os
isolados
PPUFAM 34, 284, 239, 13, 273, 45 e 252 agruparam-se com as estirpes de
referência classificadas como E. coli, Enterobacter asburiae, Edwardisiella tarda,
Enterobacter aerogenes, Kluyvera georgiana, Hafnia alvei e Plesiomonas shigelloides,
respectivamente. Os valores de bootstrap representados em cada nó da árvore indicam que o
valor de confiança dos agrupamentos é significativo, (Hillis e Bull, 1993), exceto nos isolados
PPUFAM 13, 239, 273, 276, que ficaram abaixo de 60.
Na família Enterobacteriaceae o gênero mais complexo é Enterobacter visto que sua
taxonomia gera muitas controvérsias e está constantemente em revisão (Janda e Abbott,
2006). Deste gênero foram identificadas três espécies:
E. asburiae (PPUFAM 284), E.
aerogenes (PPUFAM 13) e Enterobacter sp. (PPUFAM 274).
75
E. asburiae formou um clado com Pantoea agglomerans. Esta espécie anteriormente
era denominada E. agglomerans. Este agrupamento entre estes gêneros já são esperados, visto
que possuem parentesco próximo (Gavini et al., 1989;Grimont e Grimont, 2005; Janda e
Abbott, 2006). E. aerogenes e Enterobacter sp. agrupou-se com Kluyvera georgiana. A
espécie E. aerogenes ainda tem uma posição taxonômica incerta (Grimont e Grimont, 2005).
A ocorrência de membros do gênero Enterobacter associados com outros gêneros da família
Enterobacteriaceae são comuns (Parvan et al., 2005). O gênero Enterobacter forma um grupo
claramente polifilético, ou
seja, consiste de espécies que descendem de dois ou mais
ancestrais (Francino e Ochman, 2006), o que indica que Enterobacter precisa passar por uma
extensiva revisão taxonômica para classificação de espécies deste gênero (Parvan et al.,
2005). Isto pode ser observado na topologia de nossa árvore e é reforçado com a observação
de agrupamentos polifiléticos que incluem espécies de Enterobacter, Klebsiella e Kluyvera
(Paradis et al., 2005; Grimont e Grimont, 2005, Parvan et al., 2005; Francino e Ochman,
2006; Janda e Abbott, 2006). A abordagem filogenética usando sequência do gene 16S rRNA
não fornecem resoluções suficientes quando espécies estreitamente relacionadas da família
Enterobacteriaceae são estudadas, as ramificação são muitas vezes pouco confiáveis (Grimont
e Grimont, 2005).
Na família Bacillaceae a observação do grupamento irmão entre a espécie
Lysinibacillus fusiformis (PPUAM 25) e a família Paenibacillaceae demostra a relativa
semelhança genética entre estas famílias. O gênero Paenibacillus anteriormente estava
classificado na família Bacillaceae. Em 1993, Ash et al. com base em análises filogenéticas
do gene 16SrRNA, verificaram a formação monofilética desse gênero, quando agrupado com
outras espécies de Bacillus, devido a isto propuseram a criação do gênero Paenibacillus para
agrupar espécies até então classificadas como Bacillus (Fergust, 2009; Vos et al., 2009).
Apesar da verificação da formação de grupo irmão com Lysinibacillus, o grupo
formado por Paenibacillus (PPUFAM 234 e Paenibacillus cookii (T)), mostra-se claramente
um grupo monofilético como proposto por Ash et al. (1993).
A formação de um grupamento monofilético envolvendo amostras de espécie Bacillus
pumilus já são descritas. B. pumillus faz parte do grupo 1 de B.subtilis (B. subitilis, B. pumilus
e B. amyloliquefaciens) agrupando-se separadamente das demais espécies de Bacillus
(Parvathi et al.,2009; Porwal et al., 2009; Vos et al.,2009) apenas formando grupamento
irmão com Bacillus aquimaris (Yoon, 2003), esta concordância também foi evidenciada pela
análise topológica da árvore filogenética descrita nesse trabalho (Figura 07).
76
A formação de grupamento monofilético também foi verificada entre B. aquimaris e
Bacillus sp.1 (PPUFAM 282), cabendo destacar que Bacillus sp.1 (PPUFAM 282), possui
característcas filogenéticas semelhantes à B. aquimaris, porém sendo de diferente espécie, não
sendo possível sua definição por análises fenotípicas, moleculares e filogenéticas.
O grupo formado por Bacillus cereus formou clado monofilético com PPUFAM 285
(Bacillus sp.2) e formou grupo irmão com todas as espécies não definidas de Bacillus sp.
Podemos destacar que o gênero Bacillus é um grupo muito complexo e que consequentemente
espécies deste grupo estão sendo redefinidas, muitas vezes a caracterização de Bacillus
através do gene 16S rRNA são incertas (Xu e Cotè, 2003; Porwal et al., 2009; Logan e Vos,
2009; Schmidt et al., 2011). Apesar da diferenciação de espécies através do gene 16S rRNA
muitas vezes ser rápida e informativa para definir espécies, espécies estreitamente
relacionadas como B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis que possuem altos níveis de
similaridade entre sequências do gene 16SrRNA, com até 99% identidade entre estas
espécies, são complexas nesta identicação (Mohamed et al., 2007). O gênero Bacillus é
classificado em seis grupos filogenéticos (Freitas et al., 2008; Vos et al., 2009). O grupo
formado por B. cereus inclui as espécies (B. anthracis, B. cereus, Bacillus thuringiensis,
Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e Bacillus weihenstephanensis) (Freitas et al.,
2008; Logan e Vos, 2009; Schmidt et al., 2011). Podemos destacar que os isolados
bacterianos definidos como Bacillus sp., podem fazer parte do grupo de B. cereus, e que
possivelmente através do sequenciamento total do gene 16SrRNA estas espécies podem ser
definidas.
Na família Staphylococcaceae a observação do grupamento monofilético e a separação
das espécies S. saprophyticus e S. pasteuri, de S. aureus já são estabelecidas
filogenéticamente (Schleifer e Bell, 2009).
No grupo de famílias VI e VII de Enterococcaceae e Streptococcaceae,
respectivamente, a observação de um clado monofilético, demostra como estas famílias estão
relacionandas geneticamente. Embora muitos trabalhos demonstrem a formação de um
grupamento monofilético para estas famílias, suas espécies são bem separadas
filogenéticamente (Hardie e Whiley, 1997; Svec e Devriese, 2009).
Através da análise filogenética conseguimos determinar com maior clareza o
agrupamento filogenético dos isolados bacterianos e com isto determinamos que o
sequenciamento mesmo que parcial do gene 16S rRNA foi uma importante ferramenta para
construção da filogenia da maior parte dos grupos bacterianos identificados.
77
6.1.4-Identificações gerais dos isolados bacterianos
As abordagens fenotípicas e moleculares permitiram definir a taxonomia dos 72
isolados estudados. A partir das caracterizações fenotípicas os isolados bacterianos estudados
foram classificados em 12 espécies bacterianas distribuídas em cinco famílias. Nas análises
moleculares foram classificados em 31 espécies em nove famílias bacterianas, na árvore
filogenética (Figura 07) podem ser observados estes táxons e o agrupamento das famílias
bacterianas estudadas.
O sequenciamento e a classificação filogenética bacteriana a partir do gene 16S rRNA
permitiu definir a taxonomia definitiva dos isolados, auxiliando dessa forma, a identificação
fenotípica. Com isto podemos observar que os testes moleculares e as construções evolutivas
são importantes para corroborar com análises fenotípicas que por vezes não são suficientes
para determinação de espécies bacterianas, sendo, no entanto mais confiáveis para essa
determinação (Young, 2001; Kampfer e Glaeser, 2012). Utilizando estas abordagens foram
obtidos resultados para definição de espécies que não foram obtidos por métodos fenotípicos.
A partir de caracteríticas fenotípicas alguns resultados obtidos foram divergentes das
análises moleculares. As espécies da família Vibrionaceae identificadas no gênero Aeromonas
por testes fenotípicos, foram identificadas, por análises moleculares do sequenciamento da
região parcial do gene 16S rRNA como pertencente à família Enterobacteriaceae da espécie
Kluyvera georgina, com 97 e 98%, as características bioquímicas observadas para
determinação do gênero Aeromonas nos isolados estudados não foram compatíveis com as
descrições literárias para o gênero Kluyvera, principalmente pelo isolado apresentar reação
oxidase positiva, esta reação é negativa em todas as espécies descritas de Kluyvera e em todos
os membros da família Enterobacteriaceae (Müller et al., 1996; Janda e Abbott, 2006;
Martinez e Trabulsi, 2008). De acordo com este resultado observado pode-se definir duas
hipóteses: 1- o resultado obtido no teste de oxidase pode ser falso positivo; 2- o isolado
bacteriano pode apresentar metabolismo distinto das demais espécies de Kluyvera georgiana
descritas.
O gênero Kluyvera foi descrito por Kluver e van Niel em 1936 e Asai et al.(1956),
porém estudos moleculares com esta espécie só foram realizados por Farmer et al. em 1981
(Farmer et al., 1981; Carter e Evans, 2005; Janda e Abbott, 2006) as principais espécies
conhecidas são K. ascorbata, K. cryocrescens, K. cochleae e K. georgiana (Farmer et al.,
1981, Müller et al., 1996). São geralmente encontradas no solo, água, amostras clínicas e
frequente e abundantemente nos intestinos de caracóis, lesmas, e outros moluscos (Müller et
78
al., 1996; Janda e Abbott, 2006). Devido a algumas características comuns com Aeromonas,
Kluyvera foi primeiramente classificada
no gênero Aeromonas, e em 1956 Asai et al.
propuseram o gênero Kluyvera, mas por apresentar reação fermentativa como Aeromonas
ambos gêneros permaneceram classificados na mesma tribo (Farmer et al., 1981). Em 1981
Farmer et al., classificaram o gênero Kluyvera na família Enterobacteriaceae. Kluyvera tem
habitat em diversos ambientes como solo e ambiente aquáticos. Porém, apesar de presente em
ambientes aquáticos, não há descrições de impactos causados como pátogenos emergentes em
peixes.
Alguns resultados obtidos nos testes fenotípicos também foram divergentes dos dados
moleculares no grupo de Enterobacteriaceae tais diferenças ocorreram, nos isolado PPUFAM
46 e PPUFAM 258.
O isolado PPUFAM 46 embora similar fenotipicamente com Salmonella, obteve 93%
de similaridade com a espécie Pantoea agglomerans; apesar do percentual de identidade ser
considerado baixo para definição de espécies (Brenner et al., 2005).
Em PPUFAM 258 identificado como Shigella, obteve identidade de 99% com
Edwardisiella tarda, PPUFAM 271 identificado como Citrobacter sp., obteve 98% de
similaridade com a espécies E. tarda e o isolado PPUFAM 273 fenotipicamente Enterobacter
sp. obteve identidade de 98% com Kluyvera georgiana, as relações entre algumas espécies de
Kluyvera e Enterobacter já foram descritas (Pavan et al., 2005), isto no entanto pode justificar
tais semelhanças fenotípicas.
Nas abordagens fenotípicas, moleculares e filogenéticas a família Bacillaceae
mostrou-se mais heterogenea das famílias identificadas. Devido a verificação desta
complexidade vários autores sugerem que determinação taxonômica atual de muitos membros
da Bacillaceae devem ser reconsideradas (Schmidt et al., 2011; Logan e Vos, 2009)
Nos testes fenotípicos foram observadas variações nos resultados obtidos e baixa
resolução para distinguir espécies do gênero Bacillus e diferenciar este gênero de espécies das
famílias Paenibacillaceae e Microbacteriaceae, as quais apresentam reações fenotípicas
semelhantes com as principais características que definem espécies do grupo Bacillus.
O gênero Bacillus é considerado um grupo altamente heterogêneo de bactérias Grampositivas o que gera muita complexidade em sua classificação taxonômica, com recentes
estudos da sistemática bacteriana muitas espécies desse grupo foram reclassificadas,
principalmente com uso do gene completo 16S rRNA (Yoon et al., 2003; Logan e Vos, 2009;
79
Schmidt et al., 2011), porém devido a elevada variabilidade genética muitas espécies de
Bacillus continuam sem classificações (Logan e Vos, 2009).
Nos testes fenotípicos o gênero Lysinibacillus, foi classificado como Bacillus sp. por
apresentar características comuns à Bacillus. Lysinibacillus inclui espécies de pequenos
bacilos Gram-positivos que apresentam oxidase e catalase positivos (Ahmed et al., 2007). O
gênero Lysinibacillus inicialmente nomeado como Bacillus, foi criado para agrupar bactérias
que apresentavam características distintas de outras espécies do grupo Bacillus, classificado
por Ahmed et al. em 2007 (Ahmed et al. 2007; Josic et al., 2008). A espécie L. fusiformis
identificada nos isolados analisados neste trabalho, apesar de pertencer ao ambiente aquático
não há registro como causadoras de patogenias em peixes.
Os isolados PPUFAM 54 e PPUFAm 63 embora fenotipicamente semelhante à B.
cereus, não obtiveram percentual de identidade compatível com B. cereus sendo agrupados no
grupo de Bacillus sp. Somente o isolado PPUFAM 51, identificado como Bacillus sp. nos
testes fenotípicos, apresentou 97% de identidade com B. cereus.
O isolado PPUFAM 234 também foi fenotipicamente identificado com Bacillus sp.,
porém por caracterização molecular foi 99% semelhante com a espécie Paenibacillus sp. O
gênero Paenibacillus foi transferido de Bacillus por Ash et al.(1994), formando um novo
gênero com mais de 80 espécies, alguns membros deste gênero estão associados com
patogenicidade em humanos, animais e tamém em insetos, o habitat natural inclui o solo com
ocorrência de algumas espécies fixadoras de nitrogênio (Priest, 2009).
No sequenciamento da região parcial do 16S rRNA os isolados PPUFAM 58, 59, 63,
64, 233, 282 e 285 foram identificados como Bacillus sp. e através de comparações na
ferramenta Blast com várias espécies do gênero, os isolados obtiveram baixa identidade com
espécies de Bacillus conhecidas, alguns com maior proxidade a Bacillus cereus, porém com
percentual abaixo de 95%, isto já é esperado em decorrência da complexidade do gênero
(Logan e Vos, 2009).
A espécie Microbacterium terrae identificada em PPFAM 22 e PPUFAM 229 também
foram similares em reações fenotípicas com Bacillus como, por exemplo, por agrupar
pequenos bacilos Gram-positivos. O gênero Microbacterium foi descrito em 1919 por OrlaJensen, e corrigido por Collins et al. em 1983, agrupa seis espécies (Takeuchi e Hatano,
1998a) que estão dispersas em ecossistemas aquáticos e terrestres e podem estar associados
com plantas, fungos, animais e espécimes clínicas (Evtushenko e Takeuchi, 2006).
80
Na família Streptococcaceae, as caracterizações fenotípicas também não foram
suficientes para definição de espécies. Isto pode ser verficado nos isolados PPUFAM 52, 250
e 251, caracterizados fenotipicamente como Streptococcus spp., foram identificados nas
análises moleculares nas espécies L. lactis e L. garviae, respectivamente, com 98% de
identidade.
O gênero Lactococcus foi criado em 1985 para acomodar microrganismos até então
incluídos no gênero Streptococcus e que eram conhecidos como “estreptococos do grupo do
ácido lático”, devido à capacidade de produzirem tal ácido a partir da fermentação de
carboidratos (Teixeira et al., 2009). PPUFAM 250 e 251 foram identicados como L. garviae,
esta espécie um dos principais cocos Gram-positivos patogênicos para peixes (Eldar et al.,
1999).
As classificações fenotípicas realizados foram suficientes para caracterização da maior
parte das famílias bacterianas, no entanto algumas contradições foram evidenciadas, devido a
reclassificações de gêneros e espécies bacterianas. Por isso as abordagens moleculares e
filogenéticas foram importantes para corroborarem na definição final de espécies bacterianas
que não foram confirmadas por testes fenotípicos.
Esse conjunto de abordagens fenotípicas, moleculares de filogenéticas, cada vez mais
estão sendo consideradas para classificação de microrganismos. Muitos autores sugerem que
os métodos de taxonomia bacteriana devem passar intensas reformulações, substituindo a
taxonomia monofásica (baseada em uma ou poucas características) pela taxonomia polifásica,
em que vários critérios fenotípicos, genéticos e evolutivos são combinados para melhor
classificação de espécies (Vandamme, 1996; Young, 2001).
Dentre os isolados identificados foi possível identificar e inferir filogenia em muitas
espécies causadoras de patogênias em peixes, sendo algumas importantes patógenos
emergentes em cultivos em todo o mundo.
6.1.5-Espécies identificadas patogênicas em peixes
Peixes cultivados em sistemas de aquicultura são continuamente expostos aos agentes
patogênicos presentes na água, solo, ar. Os peixes são enfraquecidos por condições de
estresse, incluindo aumento da densidade de peixes e água de má qualidade, ferimentos
durante o manuseio, alimentação inadequada, falta de saneamento e aumento da temperatura
da água (Bekker et al., 2011). Muitas espécies identificadas nos isolados estudados são
descritas por Austin e Austin (2007) como causadoras de patogenias em peixes, como:
81
Citrobacter
freundii,
Klebsiella
pneumoniae,
Pantoea
agglomerans,
Plesiomonas
shigelloides, Salmonella entérica e espécies da família Enterococcaceae, como Enterococcus
sp. Porém os principais patógenos causadores de perdas em sistemas de cultivo são
Edwardsiella tarda, Hafnia alvei e Lactococcus garviae.
A espécie Edwardsiella tarda foi descrita por Erwin et al. (1965) (Erwin et al., 1965;
Evans et al., 2006), é caracterizada por ser um curto bacilo Gram-negativo, móvel da família
Enterobacteriaceae, E.tarda é comumente isolada de uma variedade de espécies de peixes,
répteis, anfíbios, pássaros e mamíferos, habita também em invertebrados aquáticos, como o
caracol de água doce e ouriço do mar, podendo qualquer um destes hospedeiros servir como
um reservatório para infecções em peixes (Evans et al., 2006; Austin e Austin, 2007; Castro et
al., 2012).
Em anos recentes tem sido a causa de sérios impactos na cultura de peixes em muitos
países (Castro et al., 2012). Os sinais clínicos de infecções por E. tarda, pode diferir nos
peixes de espécie para espécie (Lima et al., 2008), porém os principais sinais provocados por
esta espécie são: septicemia com lesões cutâneas extensas, afeta órgãos internos e leva a
perdas extensas tanto na aquicultura de água doce quanto na marinha. Tem sido relatada em
seres humanos como a causa de infecções como gastroenterite, principalmente entre os
indivíduos com comprometimento do sistema imune (Austin e Austin, 2007; Lan et al.,
2008).
Em peixes algumas descrições sugerem que as infecções ocorrem principalmente em
águas com temperaturas quentes (Pavanelli et al., 2002; Castro et al., 2012), especialmente
quando há grande quantidade de matéria orgânica na água e os hospedeiros estão em situação
de estresse, considera-se que pode atingir todos os peixes de água quente, provoca septicemias
em peixes, causando pequenas lesões cutâneas que podem originar abscessos de maiores
dimensões nos músculos laterais e na cauda (Pavanelli et al., 2002). No entanto, não está claro
se E. tarda é um patógeno primário ou oportunista em peixes (Austin e Austin, 2007).
A espécie Hafnia alvei faz parte dos mais de 40 gêneros componentes da família
Enterobacteriaceae, com formato de pequena célula cocóides ou bacilos ligeiramente
alongados (Janda e Abbott, 2006; Austin e Austin, 2007). Esta bactéria é comumente isolada
de solo, água, esgoto, mamíferos, aves, répteis e peixes (Austin e Austin, 2007). Está
associada a uma série de patogenias em animais, em peixes foi descrita como causa de
septicemias hemorrágica em truta arco-íris na Bulgaria. A doença apareceu em peixes após o
transporte ou durante o cultivo em condições inadequadas, e salmão em fazendas de cultivo
82
japonesas. Os principais sintomas foram melanose, abdômen inchado e nadeiras lentas (Janda
e Abbott, 2006; Austin e Austin, 2007).
Lactococcus garviae é considerado um problema sério na cultura de espécies de peixes
marinhos e de água doce, tais como a truta amarela (Seriola quinqueradiata) no Japão e truta
arco-íris (Onchorynchus mykiss) na Europa e Austrália (Eldar et al., 1999). Na Espanha, esta
doença tem aparecido em fazendas de truta arco-íris desde 1991 e atualmente é considerado
um dos fatores de risco mais importante na indústria de trutas durante os meses de verão.
No Brasil a primeira identificação e caracterização de L. garvieae, foi feita por Evans
et al. em 2009, isoladas a partir de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e pintado
(Pseudoplathystoma corruscans). Cepas de L. garvieae também já foram isolados de seres
humanos, e recentemente de camarões doentes de água doce (Macrobrachium rosembergii),
em Taiwan. Todos esses fatos indicam a importância crescente de L. garvieae no cultivo de
peixes (Eldar et al., 1999).
A utilização a região gênica 16S rRNA, permitiu a identificação de bactérias
patogênicas em peixes ainda não descritas nesse ambiente e a presença de bactérias não
conhecidas. Os resultados obtidos neste trabalho ampliaram o conhecimento sobre a variedade
de microrganismos amazônicos e deverá guiar futuros estudos acerca dos microrganismos
causadores de patogenias em peixes.
83
7-Conclusões
1- As análises fenotípicas proporcionaram a caracterização de 7 famílias, 11 gêneros e 06
espécies isoladas do fígado, baço e rim de Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma
macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus (matrinxã), acometidos de patologia
em estações de piscicultura. Contudo dos 72 isolados não foi possível identificar até o
nível de espécie 92% dos isolados.
2- As análises moleculares proporcionaram a caracterização de 9 famílias, 18 gêneros e
24 espécies isoladas do fígado, baço e rim de Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma
macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus (matrinxã), acometidos de patologia
em estações de piscicultura. Contudo dos 72 isolados não foi possível identificar até o
nível de espécie 15% dos isolados.
3- As análises fenotípicas e moleculares mostraram-se totalmente divergentes quanto a
eficiência na identificação taxonômica do patógeno bacteriano, pois, a primeira
identificou 8% e a segunda 85% dos isolados.
4- A reconstrução filogenética obtida com o gene 16S rRNA proporcionou um resultado
similar com a literatura disponível corroborando em alguns casos polifilia (ex.,
Bacillaceae) e uma riqueza específica bacteriana ainda não descrita até o nível de
espécie.
5- Além do ineditismo da abordagem conjunta (fenotípica e molecular) de epizootias em
peixes de cultivo do Amazonas destaca-se o registro de espécies bacterianas até então
não isoladas em peixes (p. ex., Kluyvera georgiana, Acinetobacter calcoacetucus,
Myroides odoratus).
84
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Anexo
>PPUFAM 01
TCCCTGGGGAGGGGAAATACCCGTTGCGAAACGCCGCCCCTTGACGGAGACTGACCGTTC
AGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
ATGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAG
ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA
AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACAT
CCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATG
GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA
TCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG
GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTAC
AATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCG
TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGA
TCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG
AGTTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTTAACCTTCGGGAGGGCCCTTACCCAACTTTG
TGAATTCAATTTAACT
>PPUFAM 03
GATAGAGCGGTGAATTGCGTAAGAATCGAGATACGTGGCAAGCGACCCTGACGAAGACTG
ACGTCCAGTGCGAAAGCTGGGGAGCAACAGATAGATACTGTAGTCAACGCCGTAAACGAT
GTCTATTTGGAGTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGACCGC
TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT
GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAG
AACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTC
GTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTT
GTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGT
GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
ATATATACAAAGAGAAGGGACCTTCGGAGCACGCGGGCGCCTTTCATAGTTTTGGTAGTC
CGGATTGGAGTTTGGAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGA
ATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGG
GTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAAACCTTCGGGAGGGCGCCTTACCCAACTTTTGTGAA
>PPUFAM 05
ATCATCGGAGGGGAAATACCTGTGTGGCGAATGGCCGGCCCCCTGACGGAGGACTGACGT
CAAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA
TGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGAC
CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG
CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCC
AGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGC
TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATC
CTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGA
AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAA
TGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA
GTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATC
AGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAG
TGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGGACTT
CCAGAACT
>PPUFAM 07
GCCCTTGCAGAAGTACTCAGCTCATTAGGGTGGGGGCAACGGATAGATCCTGGTAGTTCA
CACGCGTAGAAGTTATTGAGGGTTGTGCCTTGAGGCGTGGCCTCCGAACTAACGGGTTAA
ATAAGACCCGCCTGGGGGAGTACGCCGCATGTTAAACTCAAATGAAATGGACGGGGCCCG
CACAAGCGGTGGGAGCATGTGTTTTATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTTACTCTG
GACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCT
GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC
CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC
TGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGT
GCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTA
TGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC
GTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC
ATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTT
GTGATTCATGACC
104
>PPUFAM 12
CGTGCCCAAGCTCGCCCTTGACGAGACCTGAGCTCAGTCGAAGCTGGGGAGCATCGGATC
AGATACTGTAGTCAGCGGTACCGAAGTCTATTTGAGTTGTGCCTGAGCGTGGCTCGAGCT
AACGCGTTAAATAGACGCTGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACC
TACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGAC
AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT
GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTA
CACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCA
TAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT
AGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTA
CCACCTTTGTGATTTCAATTAGCT
>PPUFAM 13
ACACCGCGTGTGGGCGCGAAGGGCGGTCCCCCTTGGACCAAGATCTGACGGTCAGTTGCG
CGATGGCTGTGGGGAGGTCAACATGAATAGGATACCTTGGTAGTCACCGCGTAACGATGT
CGACTTGGAGGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAAACGCGTTAAAGTCGA
CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATC
CAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGG
CTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAT
CCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGG
AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACA
ATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGT
AGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGAT
CAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA
GTGGGTTGCAAAAGAAGTTAGGTAGCTTTAACCTTCGGGAAGGGCGCTTACCAACTTTTT
TGATTTTCCATTTGACCC
>PPUFAM 16
TTAACGCGTTAAAGTTGGACCGCCCTTGGGGAGTTTCGGCCCGCAAGGTTTAAAACTCAA
AATGATTTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG
CGAAGAACCTTTCCTTACTCTTGACATCTAGAGAAATTAGCAGAGATGTTTTGGTGCCTT
CGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCA
AAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC
TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAG
AGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT
GAAGTCGGAATCGCTAGTAATTGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCT
TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAATGGGTTTCAAAAGAAGTAGGTAGTTAACCTT
CGGGAGGGCGCTTACCCACTTGTGATTTCATGACCG
>PPUFAM 22
TCAGGATCGGGAGACGACAGTATTGCCGTAGGCAGATCTGTTCGCCGTAACTGACGTGAA
GTACCGAAAAGGGATGGGAGGCGAACCAGACTTAGATACATAGCTAGTGCAGTCAGTACA
CGATAGGGAAGTAGTTGTGGGGTTCTTTCCACGGATTCTGTGATGCAGATAACGCATTAA
GTTCCGCGCGCGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTATAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCG
CACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTTGATGCAACGCGAAGAACCCTACCAAGGCTTG
ACATACACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGTACACTAGTGAACAGGTGGTGC
ATGGTGGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAAGATGGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCC
TCGTTATATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTC
GGAGGAAGGTGGGGAGGAGGTCAAATCATCATGCCCCCTATGTCTTGGGCTTCACGCATG
CTACAATGGCCGGTACAAAGGGATGCAATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCG
GTCCCAGTTTGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCG
CAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTC
ACGAAAGACGGGGACACCAAAGCCGGGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCCGTAGAAGGTGG
ATTGGAAAAAA
>PPUFAM 25
CACCCCCAGGTGGGGCGAATGGCGAACTATCTGTCCTGTACTGACATTGAGGCGGCGAAA
105
GCGTGGAGCAACAGGATAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTT
AGGGGGTTTCCGCCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA
CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT
GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGT
AGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT
CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCA
TCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA
CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAA
ACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTA
GGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGG
TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCC
GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGGTGGGATAGGATGAAG
>PPUFAM 26
ATTCTGGAGGAATACCGTTGGCGATGCCGGCCCCCTGACCAAGACTGACGCTCAGTGCGA
AAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCGTAACGATGTCGACTT
GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGG
AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC
ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAATTT
AGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG
CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGC
CAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGA
TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATA
CAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT
GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCA
CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCA
AAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGGATTTCCATGAACT
>PPUFAM 27
GTGTGATGGGAACCACCAGGTTGGCGAAAGGCGGAACTTCTCTGATCGTACCTGACGCTG
AGGAGGCGAAAGCGTTGGGGAGGCGACAGGATTTAGATACCTTGGTAGTCCACGCCGTAA
ACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG
CACTCCGCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA
CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC
ATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCA
TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT
TGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA
GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA
CAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTC
TCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGG
ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGA
GAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGG
GGCAAGAATGAAT
>PPUFAM 28
AGGAAATTATCCGGGTTGGCGAAGGCGGTCCCCCTTGACAAGGACTGACGCTCAGGTGGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGATTAGATACCTTGGTAGTCACGCAGTAAACGATGTCTAC
TTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG
GGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGG
AGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAA
CTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT
CAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGT
TGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGG
GGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGC
ATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGG
ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG
CCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTT
GCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCCAATAA
CT
>PPUFAM 34
CGCAAGGGAATACCCGGGTGGGGAACGTCGCCCCCTGACCGAGACTGACGGTCAGGTGCG
AAAGCGTGGGAGCAACAAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGTCGACTT
GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGG
106
AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC
ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAGTT
TTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG
CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGC
CAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGA
TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATA
CAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT
GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCA
CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCA
AAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGGGATTTTCAAAGGA
CG
>PPUFAM 37
ATGATTTTGGGAAGGGAAACACCAGTGGCGAGTCGACTATTCTGTCCTGTACCTGACCAT
TGAGCGCGAAGGCGTGGGGAGCAAACAGGGATTAGATACCTGGTAGTCACGCGTAAACGA
TGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACT
CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACA
AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT
CCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCA
TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT
TGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA
GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA
CAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTC
TCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGG
ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGA
GAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTTAACCTTTTGGAGCCCAGCCCGCCCGGAAGG
GGTGGGGAAT
>PPUFAM 38
ACATCACCCCGATCGCGAAAGAGAGGGACATATTTTTGATCTGAGATCGCCTCCTCTCAA
GGCGTGGAAAAGCCCGGGTGTGTGCTAAGTCCGATTTTAATACCCTGGGTAGTACCCCCG
CCGTAAAACGATGGAGTACTAATTTGTTAAGGGGGTTTTCCCCCCCCCTTACGGCTGTAG
CACACGCAATTAAGCATTCAGCTCCCCGAGTAAAGTCGCCAGCTTGAATCTCAAGTTACT
CTCGTGGGGGGCTCAACCCGGCATCTCAAGGTTGAACTGAAGGCAACCATGAGACACCTG
TCAGCGTTTCCCCCCAAGTGGACACTATATGTAGAACAGTGGTCCCACCCTAGGCAACAC
TGGTTAAAGGTTGGTGCATTGTTGTCGTATTCTCGTGTGGGGAGACGGTGTTTGAAGTCC
CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTATAAGGTGAC
TGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC
TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCT
AATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGG
AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA
CCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGC
CAGCCGCCGAAGGTGGGATAGATGATG
>PPUFAM 40
AGATTTTGGAAGGAAACACCCCAGTGGCGAAAGGCGACTATCTGTCTGTACTGACACTGA
GCGCGAAAGCGTGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG
TGCTAAGTGTTAGGGGGTTCCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC
CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG
TGGAGCATGTGGTTTAATTAGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGT
TGACCACTGCACACATACGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATC
TTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG
GTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATG
GACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGT
TCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG
CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTT
TGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGATAGGA
TGAT
>PPUFAM 43
TGATGTAAACACCCCATGTTGGCGAAGCCGACCTTTCTGTTCTGTTAACTTGACACTGAG
GCTCGGAAAGCGTGGGAGCCAAACAGGATTTAGATATCCTTGTTAGTTCCAACGCCCGTA
AACCGATGAGATGCTAAAGTGTTTAGAAGGGGTTTCCCGCCCTTTAGTGGCTGGAAGCTA
107
AACGCCATAAAGCAATTCCGCCCTGGGGAGTTACGGCCGGCAAGGTTGAAAATCTAAAAG
AATTGACGGGGGCCCCGCACCAGCGGTTGAGCCTGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAG
AACCTTACCAGGTTTTGACATCCTTTGACCACCCTAGAGATAGGGGTTTCCCTTTGGGGG
CAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTTGTCAGCTTGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAATC
CCGCAACGAGGGCAACCCTTTATTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTTTAAGGGGA
CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGGGGGGAAGAAGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC
CTGGGGTACCCACGTGGTACAATGGGAAGTACAAAGAGGTGCCAAGTCGGGAGGGTGAGG
TAATTTCCTAAAACCTTTTTCAGTTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCTGAAACCG
GAATCGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
CCCCCCCGTCACCCCCCGAGAATTTGGAACCCCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGA
GCCAGCCGCCTAAGGTGGACAGATGAAT
>PPUFAM 44
TGATAAAACTGAGACTGCGGAAGGGCTCTGGAAAAGCGTTGGGAAGCCAAACAGGAACTA
AGATACCTGGTAAGTTCCATGCCGTAACGAATGAAGTAGCTTAAGTGTTGGAGGGTTTGC
GGCCCTTCAGTGCTGCAAGCTAACGGCAATAAAGCACTCCGCCTTGGGAAGTTACGAACG
CAAGGTTGAAAACTCAAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAAGCGGTGGAGCATGTGGT
TTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAG
ATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT
CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT
TAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA
AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGT
CGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTG
CAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAAT
ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGT
CGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATTAGGAATGAATT
>PPUFAM 45
CTCGGGACGAAATACCCGGTTGCGCACGCGGCACCTGGACAAGGATCTGACGTTCAGTGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAACTTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCG
ACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCT
GGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
GAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGA
ATTTGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG
TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTG
TTGCCAGCAAGTAATGGTGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT
GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
ATATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCC
GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAA
TGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGG
TTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGGCTTTACCACTTTGGGGAC
>PPUFAM 46
GGGGGGGGTCTGGGGAGACTCGTATAGTGACCGCCGGGGATTCGGCCGCATGTTAATTTA
AATTATTTAGGGGCCCCCAACGGTTGGAGCATGGGTATAATGTGTGCAACGCGAAGAACC
TTACCAACTTTTGCCTCCGAGAAATTGTTAGAAAAAGCTTAGTCCTTCGGGGACTTTGAG
ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAAGTTGGTTAAAGTCCCGCAACG
AGCGCCAACCTTATTCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAG
TGATAAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGC
TACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCT
CATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCG
CTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC
CGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCT
TACCACCTTGGTGATTCCAAGAACG
>PPUFAM 51
GTACTGGACACCTGAGGGCGCGAAGCGTGGGAGCAACAGGATAGATACTGTAGTCAGCGG
TAACGATGAGTGCTAGTGTAGAGGGTTCCGCCTTAGTGCTGAGGTACGCATTAAGCACTC
CGCTGGGGGAGTACGGCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG
CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC
TCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGT
TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT
CTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA
GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
108
GGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAG
TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA
GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT
TTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAG
AAGAT
>PPUFAM 52
TGACATAATACTGCTGAGGAGGCGTCCTCAGAAGAAGACGTGCTGAGGCAGAGCACACAC
CATATGTATAGAGTATCCCCCCTCTGTGATGTCCCCCTCCGCTCTAATAACATGGAGAGA
TTCATAATATAGAGAGGGGTATTATATATTTTTTTTTGATTATGCGCAAAAAACACAAAA
ACCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGCCCCCCCCAAGGGTTAAAAACTAAAAAAAAATTGGGGG
GGGGCCCCCCCCACAAGGGGGGGGGCCCTGGGTTTTTTTTTTTTGAAAAAAAACGGAAAA
AACCCCTTTCCCGGTTTTTAAAAAAATTCTGGTTTTTTTTCAAAAAAAAAGGGAAATTTC
CTTTGGGGGCCCGGGGGAAAACGGGGGGGGCCAGGGGTTTTTCTTCAGGCTCGGTTTCGG
AAAAATTTTGGGGTTAAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTTTGTTAGTTGCCATCAT
TAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC
AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAG
TCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT
GCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAA
TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAG
TAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGGTAAGGACCCGAATGAACT
>PPUFAM 53
ATTTGACATTGGAGGGGGCGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGGATTAGATACCTGGTAGT
CCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGGTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGC
TAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAAGACTGAAACTCAAAGGGAAT
TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC
TTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAA
CGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC
GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACT
GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT
GGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTA
ATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC
CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCC
AGCCGCCGAAGGTGGGATAAGAAGGATT
>PPUFAM 54
GTAGAGAAACCACCCAAGGTGGCGAGGCGGACTTTCTGGTCTGTAACTGACCTTGAAGCG
CGAAAGCCGTGGAAGCAAACAGGATTTAGATACCTTGGTAAGTCCCACGCCGTAACCGAT
GAGTGCTAAGTTGTAGGAGGGTTTCCCGCCCCTTTAGGTGCTGAAAGTTAACGCATTAAG
CACTCCCCTGGGGAAGTCGGCCGCCAAGGCTGAAATTCAAAGAATTTGCGGGGGCCCCGC
CCAAGCGGTGGAGCATTGGTTAAATTGGAAGCAACCGAAAGAACTTACCCAGTTCTGGAC
TCCTTCGACCAACCCAGAGGAAAGGGTTTCTCTTTGGGGACCAGAGTGCAAGGTGGGCCA
TGGTGTTGTTCAGTTGGTTTCGTGAGATGTTGGGTTAATTCCGGCAAGGAGCCCAACCCT
TGTTTTTAGTTGCCTCCATTCAGTTGGCCATTTTAAGGTGACTGCCGGGGACAAACCGGA
GGAAGGTGGGGAGGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGCCTTGGGCTACACACGTGTTC
CAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGCCCGCGAGGGGGAGTTATTTCCATAAACCCGTTT
TCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAATTCGCCTCCAGGAAGCGGGAATCGTTAGTAATCGGGG
ATCACCATGCCGCGGGGAATAGGTTCCCGGCCCTTGTACACCCCCCCCGTCCCACCACGA
AAGTTGGAACCACCGGAAGTCGGTGGGGTACCCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGGGGGAC
AAGAGTAT
>PPUFAM 55
AGTAAACACCCCAGGTGGGCGAATGCCGACTTTCTGTTCCTGTACTGACGCTGATGTGCG
AAAGCGTGGGGATCAACAAGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCT
AAGTGTTAGGGGGTTCCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG
GGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAA
ACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAG
TTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG
GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACA
ATACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGG
109
ATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATG
CTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA
ACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAAGGTGGGACAAAAA
TAAC
>PPUFAM 57
TTCACGATGAGCTTGGATATAATATGGAGTACTAGAAATTATGTAGTGTAGCGGTGGAAT
GCTAGATATTACATTGAATCCAATTGCGAAGGCAGGTTACTACGTATTTATGACGCTGAT
GAACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTTAGATACCCTTGGTAGTCACGCGTAAACGAT
GGATACTAGCTGTTCGGTTTTTCGGTCTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCAC
CTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG
TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGAT
TGACAGATTTGGAAACAGATTTTTCTTCGGACAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGT
CAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGT
TACCATCGCGTAGTGGCGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTG
GGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCA
AGTACAGAAAGCAGCTACCTGGCAACAGGATGCGAATCTCCAAAGCTTGTCTCAGTTCGG
ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCCAT
GATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCTGTTCTAAAAAATTGGAAT
>PPUFAM 58
TTGGCGTGATAGAGAATATTGAGGGAAACACCAGGTGGCGAGCGACTTCTGGTCTGTAAA
CTGAACATTGAAGGCGCGAAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTTGGTAGTTCA
ACGCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTAGAAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGTTGAAGTTAAC
GCATTAAGCATTCGCCTGGGGGAGTACGCCGGCAAGGCTGAAATTCAAAGGATTTGACGG
GGGCCCGAACAAGGGGTGAAGCATGTGTTTTATTTGGAAGCAAGCGGAAGACCCTTACCA
GTTCTGAACTTCTTCGGACAACCTTAGAGATAGGGTTCTTCTTTCGGGAGCAGAGTGCAA
GGTGGGGCATGGTGGTCTTCAGTTGGGTTCGTGAGATGTTGGGTTAATTCCCGCAACGAG
CGCAACCCTTGTTTTTAGTTGCCTTCATTCAGTTGGCCATTTTAAGGGGACTGCCGGTGC
CAACCCGGAGGAAGGTGGGGAGGAGGTCAATTCTTCATCCCCCTTATGCCCTGGGTTCCA
CACGTGTTCCAATGGACGGTACAAAGAGTTGCAAGACCGGGAGGGGGAGTTATTTTCATA
AACCCGTTTTCAGTTGGGATGGTAGGTTGCAATTGGCTTCCAGGAAGCGGGAATCGTTGG
TAATCGGGGATCACCATGCCGCGGTGAATAGGTTCCCGGCCCTTGTACACCCCCCCCGTC
CCACCACGAAAGTTGGGACCACCGGAAGTCGGTGGGGTACCCTTTTGGAGCCAGCCGCCT
TAAGGGTGGG
>PPUFAM 59
TGGAAGGAAACCACCCAGTGCGAAGCCGACTTTCTGTCGTACTGACATTGAGGCGCGGAA
AGCGGTGGGAGCAACAGATTTAGGATTACCCTGGTAGTTCCACGCCGTTAACGATGAGGT
GCTAAGTGTTAAGAAGGGGTTTTCCCGCCCCTTTAGTTGCTGAAAGTAACGCCATTAAGC
ACTCCGCCTTGGGAGTAAGGCCGCAAGGCTGGAAATCAAAAGAAATGACGGGGGCCCCCA
CCAGCCGGTGAGCCAGTTGTTTAATTCGGAACCAACCGAAGAAACCTACCCAGTTCTTAC
ATCCTTCGACCACCCTAAAGATAAGGCTTTTCCCTTCGGAACCGAATGACCGGTGGGGCC
AGGTTGTTGTTCAGTTGGTTTGTGAGAAGGTGGGGTAAATTCCGCAAAGAGGGCCACCCC
TGATTCTAGTTGCCCTCCATTAATTGGGCCATTTAAGGGGAACGCCGGGGGCCAACCGGA
GGAAGGGGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTTCCCCTTATGACCTGGGGTACCCCCCTGGTT
CAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGAAGTAATTTTATAAAACCCTTT
TCCATTTGGAATGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAGCGGAATTGGTTGTAATTGGGG
ATCAGCCAGCCGCGGGGAAAAAGTTTCCCGGCCTTGGACCCCCCCCCCGTCCCCCCCCGA
GAAATTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGA
CAAGATGGAT
>PPUFAM 63
AAGAGAAGATATATTGGGAGGAAACACCCAAGTGGCGAGCCGACCTTTCTGGTCGTAACT
GACAACTGAGGCGCGGAAAGCGTGGGAGCCAAACAAGGATTAGAATAACCTTGTAGTCCA
CGCCGTTAAACGATGAAGTGGCTAAAGTGGTAGAGGGTTTCCGCCCTTTTAGTGGCTGAA
AGTTAAACGCAATAAAGCAACTCCGCCTGGGGAGGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTTCAA
GGAAATGACGGGGGGCCCGCACCAAGGGGGGGACATGGGGTTTTATTCGGAGGCAACCGG
AAGAACTTACCCGGTTCTTACATCCTTCTGCAACCCCAGAGATAGGGGTTCTTCTTTGGG
AGCAGAATGACCGGTGGGGCAAGGTTGTTGTCAGGTTGGGTTGTGAGATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGGGCCACCCTTGATTTTAGTTGCCCTCCTTAAATTGGGCCATTTAAGGT
GAACGCCGGTGACCAACCGGAGGAAGGTGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTGCCCCTTATG
ACCTGGGGTACCCCCCTGGTTCAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGA
GGTAATTTTATAAAACCGTTTTCCATTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAG
110
CGGAATTGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGTGAATAAGTTTCCGGGCCTTGTAC
CCCCCCCCCGTCCCCCCCCGGGAATTTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTTG
GAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT
>PPUFAM 64
TCATGGAGGGAAAACACCCAGTGGCGAAAGCGACCTTTCTGGTCGTAACTGACACTGAGG
CGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAATAATCCCTTGGTTAGTCCCACGGCCGT
TAAACCGAATGAGGTGGCTTAAGTGGTTAGAAGGGTTTCCCGCCCCTTTAGTGCTTGAAA
GTTAACGCCAATAAAGCATTCCGCCCGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAATCAAAGGA
ATTGACGGGGGCCCGCACCAGCGGTTGAACCAGTGGTTTAAATCCAAACAACGGGAAGAA
CCTTACCCGGTCTTGACCTTCTTCGACAACCCTAGAGAAAAGGGTTTTCCTTTGGGAACA
GAATGACCGGTGGGGCAAGGTTGTTGTCAGGTTGGGTTGTGAGAAGGTGGGTTAAGTTCC
GCAACGAGGGCCACCCCTGATTTTAGTTGCCCTCCATAAATTGGGCCATTTAAGGTGACT
GCCGGGGACCAACCGGAGGAAGGTGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTGCCCCTTATGACCT
GGGGTACCCCCGTGGTACAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGAAGTA
ATTTTATAAAACCGTTTTCCATTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAGCGGA
ATTGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGGGAATAAGTTCCCGGGCCTTGTACCCCC
CCCCCGTCCCCCCCCGAGAATTTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGC
CAGCCGCCTAAGGTGGACAGATGAAT
>PPUFAM 70
TCTACCGCCGTGGTTAAAATGGGCGCGAGAGAGGAATATTGGAAGGAAACACCCAGTGGG
CGAATGGCGACTTTCTGTTCTTTAACTGACGCTGATGTGGCGAAAGCGGGGGATCAAACA
GGGATTAGATACCTGGTAGTCACGCAGTAAACCGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC
CGCCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAG
GTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC
GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAAACTCTAGAGATAGAGC
CTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTT
GGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
TCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCTA
AACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACT
CGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTT
CCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTG
GAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGACTG
>PPUFAM 71
TGTCGCAAAAGGGCCGACTTTCTGTTCTGTAACCTTGACGCTTGAATGTGCGAAGCGTGG
GAATCCAAACAGAATTAGGATACCCTGGGTAGTTCACGCCCGTAACGATGAGTGCTAAGT
GTTTAGGGGGGTTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG
GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACACAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACA
ACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAG
TTGCCATCATTAAGTTGGGCACTTTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG
GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACA
ATACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTTTCAGTTCGG
ATTGTAGTGTGCAACTTGACTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATTGTAGATCAGCATG
CTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAATTTGGA
ACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGGAAAGGGTGGGAAA
>PPUFAM 72
CGACGTAGGATCGTCGTTGAAGATCACTACAGAGATAGTGTATCCCTGCGTATCCACGCC
TAAAAGAGTAGTGTTAAAGTGTGTTAGGGGGTTCGCCCCTTAATCGTGTGCAGTAAAGCC
TCTAACCACTCTCGCCGGGGGGATACGGTGCCAAGACGAAACTAAAAGGAATTACCGGGG
GGCCGCACAAAGGGGTGGGCACAGTGGGTTAATTTGGAAGCAACGGGAAAAACCTTACCA
AGTTTTGACTTCCCGTTGAACCACTGAGAAAATATGGTTTCCCCTTTGGGGGAAACGGGA
CCGGTGGGGCCAGGGTGTTGGTCAGCTGGTTTGTAAATGTTGGGTAAAGTCCCCGCAAAG
AGGCGCACCCCTTGATTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGG
TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT
ACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCG
ATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGC
TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
GTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCG
111
CCGAAGGTGGGAATAAGATGAAT
>PPUFAM 74
CGTCATGCATCATAATATTCCCCGGTGTGGGCGAAAGGACGGTCCCCCTGGAACCAAAGG
ACTGACGCTCCCAGGGTGCGGAAATGCGTGGGGGAGCAATACAGGAATTAGAATACCCCT
GGTAGTTCAACGCGTAAACGATGTCGGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCC
GGAGCTAACGCGTTAAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAT
GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAG
AACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAA
CTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTC
CCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAG
ACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGA
GTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAG
CGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTC
GGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGGTTTTGAGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTGGGGA
GGGCGCTTACCCACTTTGGGGACTCCAAGGAGG
>PPUFAM 228
AGTGTGGAACTTTTAGGTTCGTACTGACCTTAGGCGAAGCTTGGAGCAACTGATCAGTAC
CTGCTAAGTTCAGCGTAACGAATGAGTGCTAAGTGTTTAGGGGGGTTTTCGCCCCTTTAG
TGCTGCAGCTAACGCAATTAAGCACTCCGGCTGGGAGTACGGTCGCAAAGACTGAAACTC
AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC
GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATAGTTTCCCCTTC
GGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTA
AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT
TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGA
GGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATG
AAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT
GTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTT
TTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAATAGGAGGAAA
>PPUFAM 229
GGAATGGCGCAAGTATCATGAAGAACACCTGATTGCGATGCAGATCTCGGCGTAACTGAA
CGCTGAGGAGCGAAAGGGTGCGTAGCCAACAAGCTTAGATACCCTGGTAGTCACCCCGTA
AACGTTGGGAAACTAGTTGTGGGTCCATTCCACGGATTCCCGTGACGCAGCTAACGCATT
AAGTTCCCCGCGTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACC
CGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCT
TGACATATACGAGAACGCTGCAGAAATGTAGAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGT
GCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC
CCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAAC
TCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCA
TGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGC
CGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAAT
CGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAG
TCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAA
GGGGGGCATCCGGAAATTTT
>PPUFAM 232
TCGAGAATATCCGTGGCAGCGCCTGACAAGCTGACTCAGTGGGAGCTGGAGCACAGGATT
AGATACTTGTAGTCAGCGTACGAAGTCGACTGAGTTGTGCCTGAGCGTTGCTCCGAGCTA
ACGCGTTAAGTCGACGCTGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG
GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA
CTCTTGACATCCAGGGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAG
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC
GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA
TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGGGTAC
ACCACCTGCTTCAATGGCATATACAAAAAGGAAAGGCCCCCCCGGGGGGCCCAGGGGCCT
TCTTAAAGTAGGTGTTGTTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATC
GCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC
CCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC
TTACCACCTTTTTGAATTCAATAACC
112
>PPUFAM 233
CAACGGCGTCGAGCTCTCTCCGTGTGCATGAATACTGATCACTTGAGGCGTCGAAAGCTG
TGGGAGAGCCAAACCAGGATAGATACCTTGGTAAGTCACAGCCCGTAAACGATGATGGTA
AGGGTTTATGGGCTTCCGGCCCTTTAGTGCTGAAGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGGTGAAAATTCAAAGAAATGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG
CATGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGAAAA
CCCCAGAGATAGGGGTTTTCCTTTGGGAACAGAAGACAGGGGGTGCATGGTTGTTGTCAG
CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTTGTTGC
CATCATTTAGTTGGGCAATTTAAAGGGGACGCCCGGGGCAAACCGGGAGGAAGGGGGGGA
GGAGTCAAATTCTTCATCCCCCTTTGGCCTGGGGTACCCCACGTGTTCCATGGGCGGTTA
AAAAAAGGGGGCAAACCCCCGGGGGGGAAGTAATCTTCTTAAACCGTTTTCAATTCGGGA
TGTAGGTTGCCAATTGCCCTCCAGGAAGTGGAAATGGTTGTAATCGCGGGTTCGCAATCC
CCGGTGAAATAGTTTCCCGGCCTTGGACCCCCCCCCCGTCACACCACGGGAATTTGGACC
CCCGAAGTTGGGGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAAGAGGAAT
>PPUFAM 234
AACGCGAAGAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCCTCTGACCGGTACAGAGATGTACCTT
TCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCTAGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT
TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTCGGATGGGC
ACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT
GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGCCGCGAAGCC
GCGAGGTGGAGCTAATCCTAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCC
TGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG
GGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTATAACACCCGAAGTCGGTGGGGT
AACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGGGGAAAAGAGAT
>PPUFAM 236
GCGTTTAAGTCGCTCGCCTTGGGGGGAGTTCGTCCCTCAAGCTTTAAAATTCAAAATGAA
TTGATGGGGGCCCGCCACAAGTGGGGAAAAAAAGAGGTTTAAAATAAGATGCAACGCGAA
GAACTTTACCTTCTTTTGACATCCAGGGAATTTTGGCAGAGATGTTTTAGTGCCTTTGGG
AACTGTAAGACAGGTGCTGCAGGGCTGTCGTCAGCCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAGTC
CCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGTGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAG
ACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGA
GTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAG
CGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTGGACTCCCGAAGTCG
GAATCGTTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACAGTAAATACTTTCCCGGCCCTTGTACAC
ACCCCCCGTCACCCCATGGGAAGGGGTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGG
GGCCCTTCCCCACTTTGTGGTTTCAAGGGGC
>PPUFAM 238
GAGCATGTGGTTTAATTTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG
ACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT
TAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGATGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG
TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG
ACGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCGTTCTCAGTT
CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC
ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGATT
TGTAACACCCGAAGTCCGTGTGGAGGTTAAAACCCCTTT
>PPUFAM 239
TAATTGGCGGTTAAGAGAAGATTCTGGAGGAAATACCCGGTGGCGAGCCGCTTCTGGACG
AAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCA
CGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGAAGCTAACG
CGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG
GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA
CTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAG
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC
GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA
TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACA
CACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATA
AAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAG
TAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
113
ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACC
ACTTTGTGATCATGAC
>PPUFAM 246
GAAATTACCGATGGCGAAGGGCAGTCAATCTGCTTATTACCTGACACTGAGGTGCGAAAG
CATGGGGAGCAACAGATTAGATACCTGGTAGTCCATGCGTAAACGATGTCTACTAGCCGT
TGGGGCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTAC
GGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAG
AGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCA
CTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACG
TCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAG
GGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT
CTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTG
AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGA
AGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACGCTTACCACGGTGTGGCCGGATGAACCT
>PPUFAM 250
GAAGCACCCGAGGGCGAAAGCGGCTCTTCTGCCTGTACCTGACACTGAGGCTCGAAAGCG
TGGGAGCAACAAGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTA
GGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG
ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG
TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATCCTTAG
AGATAAGGAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG
TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCATCAT
TAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC
AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAG
TCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCT
GCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAA
TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAG
TAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGGTAAGACCGATTGACCT
>PPUFAM 251
TGACGTCAAATCCACCTGGGAGGCGGAAAGCTGCTCTCTTGTCTGTACTGACATTGAGGC
TCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCTGTAAACCGATGA
GTGCTAGCTGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC
TGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT
GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGT
GCTATCCTTAGAGATAAGGAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTC
GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTA
GTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTG
GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT
GGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCG
GATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAC
GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGG
AGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTCCTAAAGGTAAGGACCCGAT
GAACC
>PPUFAM 252
GATGTAGTACATCTCGCAAGGAGTGAGTCGGTGGAATTGCGTAGAGCATTCTGCAGGATG
ACGGCTGGCGAACGGCTGGCACCTGGTACAAAGTACTGACGCTCAGGTGGCGGAAGGCGT
GAGGAGCATATCAGGATCCGATATCTCGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGA
GGTCGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGT
ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG
TGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCC
AGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTC
GTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAG
CGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA
CGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAA
AGGGCGGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGA
GTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGG
TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAA
GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTTACCCACTT
114
>PPUFAM 255
AGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT
TACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGA
GCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATG
AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT
GTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTT
TCGGGGGAGGGGCCGGCTTTAACT
>PPUFAM 256
GTAAGCGCGCGTGGAATTGCGTAAGAGAATCTGAGATATGTGGCGATGCGCTCTTGACGA
AGACTGACGCTCAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTGCAC
GCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCCTGAGGCGTGGCTTCCGAAGCTAACGC
GTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC
TCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAT
AAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACAC
ACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAA
AGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGT
AATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCA
CTTTGTGATCATGCCG
>PPUFAM 258
GGGGAGGACGGCCCGCAAGGTTAATATTTAAATGAAATGGACGGGGGCCCGCACAAGCGG
TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACCTACTTCTTGACATCCA
GCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCT
GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCC
TTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAA
GGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAAT
GGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAG
TCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCA
GAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT
GGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTTACTTACTTTTGTTGA
T
>PPUFAM 260
TGGAGAGATAGATTCTTTCCGTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGTTTATGGTTGTAGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTG
CCATCATTAAGTTGGGCACTATAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGA
TGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATA
CAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATT
GTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTA
CGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA
CCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGACAAATGACTG
>PPUFAM 262
AGCAAACCATGATTAGATACCCCTGTTGTCCTTGCGTAACGATGTCTAATTAGCCGTTGG
GGCCCTGAGGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGG
TCGCAAGACTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG
TTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAG
AGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCA
CTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACG
TCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAG
GGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT
CTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTG
AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGA
AGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACGCTTTGCCCACCGG
>PPUFAM 263
115
ATTGTTGCGTGATGAGGATCTGAGATTACCCGATTGCGAATGGCCAGCCATCGGCCTAAT
ACTGACATTGAGGTGCGAAGCATGGGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTACATGC
CAGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCG
ATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG
CCTTGACATACAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGAC
AAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACAC
ACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAA
AGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGT
AATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACCGCTTAAC
CCCCAC
>PPUFAM 264
AAAGCGTGGGGAGCAAACATGGATTAGATACCCTTGTTAGTTCACCCCGTAACGAAGTTC
GACTGAGGTTGGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTAAGTCGACCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAC
TTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC
AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTT
GCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATA
TACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGA
TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGC
TACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGTTTAGAAAGG
GGGGTTTG
>PPUFAM 265
TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAAACTCTAGAGATAGA
GCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT
GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAG
TTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT
CATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGC
TAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAA
CTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACG
TTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGG
TGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAAAGGGGGG
>PPUFAM 266
CTCGAGGTCGTGGCTTCCGGGAGGTAACGTTTAAATGGACCGCTTGGGTGATACGGGCTG
CATGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATG
GATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT
GAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCG
GTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG
TCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGGGCGG
CAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCA
ACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATAC
GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAG
GTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCCAACG
>PPUFAM 267
ACGATTTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTTGGCTTCCGAAGTTAAACGCTTAA
AATCGACCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAAGGTTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGG
CCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTTTAATTTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACC
TACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGAC
AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT
GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTA
CACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCA
TAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT
116
AGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTAC
CACTTTGGATTCAGAAT
>PPUFAM 268
TGCAACGCGAAGAACCTGTACTTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGA
GTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAAT
GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGG
GAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATC
ATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACC
TCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCG
ACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCC
CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGC
TTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACCTTTGTGAT
>PPUFAM 269
CCATCATGCTGCCAGAAGAATTCTCGAGACGGAATTCCGGTGGGCGCAGGGCGCTTCTGG
ACGAAGACCTGACCGCTCAAGTTGTGAAAGCGTGGGAGCAAACCAGGATTAGATAACCTT
GGTAGTCACGCTGTAAACGATGTGGATTGGAGGGTTGTGCCCTGAGGCGTGGCTTCCGAA
GCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAA
TTGACGGGGGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA
CCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACG
CTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC
GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGAC
TGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGT
AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCG
GACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGG
AATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA
CCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGG
GCGCTACCACTTGGATTCAAGACT
>PPUFAM 271
CCCACACACAGTTGTAAGCGGTGAATTGCGTAGAGATTCCGGAGGAATACGTTGCGATGC
GCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATAGATACC
TGGTAGTGCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCC
GAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG
AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGA
ACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAAC
GCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCC
CGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGA
CTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAG
TAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGC
GGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCG
GAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAG
GGCGCTTACCACTTTGTGATCATGACG
>PPUFAM 272
ACAAGGGTGTATAAGCGGGTGGAAATGGCGTAGGAAGATTCTGAGAATACGGTGGCGATG
CGCCTTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG
ATACCTGGTAGTGCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGG
CTTCCGAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTC
AAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGC
GAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCG
GGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTA
AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAA
GGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT
ACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAG
CAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA
AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG
TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTC
GGGAGGGCGCTACCACTTTGTGATCATGACG
117
>PPUFAM 273
AAAGGGTGTGTAAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAGATACGTTGCGATCGCACCTGGA
CAAAGACTGACGCTCAGTGCGAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATAGATACCTGGTAGTCCA
CGCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGC
GTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC
TCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAT
AAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACAC
ACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAA
AGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGT
AATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTGAGGTGAGCTTACACGCTTGCGGGAGGGAGCG
CACCACTTTGTGATCATAC
>PPUFAM 274
TGTACGGCCGCAAGGTAAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG
CATGTGGTTTAATTTGGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAC
TTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC
AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTT
GCCAGCGGTTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATA
TACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGA
TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGC
TACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTG
CAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATACAAGAATG
>PPUFAM 275
GCTTTCCGGAGTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAAC
TCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTTGGAGCATGTGGTTTAATTTCGATGCA
ACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCC
TTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGG
GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACT
CAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC
CCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCG
AGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCC
ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGC
CTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAAC
CTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGTGATTTCAGAATT
>PPUFAM 276
TAAGGCCGCGTGAAATGGCGTAGGAGATCTGAGAATACGGTGGCGAATGCGCTCTGAACA
AATGACTGACGTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTC
ACGCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACG
CGTTAAATCGACCGCGTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG
GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG
GTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAG
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC
GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA
TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACA
CACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATA
AAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAG
TAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACC
ACTTTGTGAATTCCATGAACA
>PPUFAM 277
AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGTTGGAG
CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACT
TTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATAGCTGTCGTCA
GCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTG
CCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGG
118
ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCAT
ACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGAT
TGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCC
ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGC
AAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATCATAAT
>PPUFAM 278
AATTTGTGCAACGGAAGAACCTTACTTGGTCTTTACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGG
ATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTG
AAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGG
TCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGT
CATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGC
GACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAA
CTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACG
TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGTTGTAAATAAAAAAGGTTT
>PPUFAM 279
GAGTTATGAGTTTCTCGTAAGGAGGGGGGGTAGATTCCAGGTTAGCGGTGAATTGGTAGA
GATCCGAGATACGTGGCGATGCGGCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAGCGT
GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGG
TTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAG
AGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCG
GTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACG
TCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAG
AGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGT
CTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTG
AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGTAGATGGGTTTGCAAA
AAAAAAGAG
>PPUFAM 282
GTCCTCTGAGGGCGTCGAAAGGCGTGGGGGAGGCAAACCAGGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCACGCCGTAAACGATGAGTGTAAGTGTAGAGGGTTTCCGCCCTTAGTGCTGCAGCTAA
CGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC
AGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTG
ACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC
GAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGG
TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT
ACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCC
ATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGC
TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
GTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCG
CCTTAAGGGGGGAACAAGAATGTATT
>PPUFAM 284
GGTTTTTAGGCGGTTGAAATGCGTAGGAAGATCTGAGATACGTTGGCGTGCGCGCTGGAC
AAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGT
CACGCAGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAA
CGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACC
TACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGAC
AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT
GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTA
CACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCA
TAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT
AGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTAC
CACTTTGTGATTCATGACG
119
>PPUFAM 285
TTGTGTGTAGGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGACGATACAGTGCGATGCGACTCTGTTC
TGTTACTGACACTGAGCGCGAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCAC
GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTCCGCCCTTTAGTTGTGAAGTTAACGC
ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
GCCCGCACCAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGAAGCAACGGGAAGAACCTTACCAGG
TCTTGACATCCTTTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTTCCTTTGGGAGCAGAGTGACAGG
TGGTGCATGGTTGTTGTCAGCTTGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCTTGATTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGGTGACA
AACCGGAGGAAGGTGGGGAAGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACA
CGTGGTACAAAGGACGGTACAAAGAAGTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATTTTATAAA
ACCGTTTTCAGTTTGGATTGTAGGGTGCAACTTGCCTACAAGAAGCTGGAATCGCTAGTA
ATCGCGGATCAGCAAGCCGCGGGGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCCCGCCCGTCAC
CCCCCGAGAGTTTGTAACCCCCGAAGTCGGGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAA
GGTGGACAGATGATG
>PPUFAM 286
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCATAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACT
CTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC
CCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCTAAACCGCG
AGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTAC
ATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGT
CTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAAC
CATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAAATGATTG
>PPUFAM 288
AATCTTCCCAGGATGGTAGCGTGAATGGTAAGAGATTCTGAGATACGTGCGACTCGCCCC
CTGACAAAAGACTGACGCTCAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACTGGT
AGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAG
CTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATT
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT
TACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTG
AGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA
ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGC
CAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGG
GCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAC
CTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAAT
CGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG
CCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTTGGAGAGGGG
TGGGCGTGTCCCC
120