JOSÉ AUGUSTO ZOREL
IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS MICROBIANAS PRODUZIDAS DURANTE A
DIGESTÃO ANAERÓBIA DE MATÉRIA ORGÂNICA
Ouro Preto – MG, setembro de 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS MICROBIANAS PRODUZIDAS DURANTE A
DIGESTÃO ANAERÓBIA DE MATÉRIA ORGÂNICA
AUTOR: José Augusto Zorel
ORIENTADOR: Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. William de Castro-Borges
Dissertação submetida ao programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Biotecnologia, área de
concentração: Genômica e Proteômica.
Ouro Preto – MG, setembro de 2013
Zorel, J. A.
Catalogação
ii
Zorel, J. A.
Laboratório/Auxílio
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos – NUPEB/
ICEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
ii
Zorel, J. A.
Dedicatória
À
minha
razão para tudo.
iii
família,
motivo
e
Zorel, J. A.
Epígrafe
"Aprender é descobrir progressivamente sua própria ignorância."
Voltaire
iv
Zorel, J. A.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
À minha esposa, Cyntia, a quem eu dedico essa e toda e qualquer realização, pelo amor e
pela ajuda em todos os momentos. E ao meu filho, João Renato, meu grilo falante. Duas
pessoas sem as quais eu não seria nada.
Ao meu pai, Edmilson, por tudo que fez por mim, por ser um pai de verdade.
À Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva, pela orientação, pela confiança depositada e por ter
literalmente me adotado durante o mestrado.
Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela co-orientação, por todas as dúvidas sanadas e,
principalmente, pelo exemplo de comprometimento e dedicação ao ensino e a pesquisa.
Ao Prof. Sérgio Aquino, pelo auxílio na concepção do projeto, pelo apoio e colaboração.
Ao Prof. Leandro Moreira, pela orientação – não-acadêmica – indispensável à conclusão
desse trabalho.
Ao Prof. Robson José de Cássia Afonso, por ceder parte importante da estrutura necessária à
realização do trabalho e por toda a atenção prestada.
Ao casal Bruno e Ananda, por terem me ensinado muito e me ajudado ainda mais.
Aos amigos, por tudo.
Aos laboratórios do NUPEB e DEQUI, pela permissão e ajuda no uso de diversos
equipamentos.
À CAPES pelo auxílio financeiro.
A todos aqueles que, de alguma forma, auxiliaram no processo produtivo para o
desenvolvimento e conclusão da pesquisa.
v
Zorel, J. A.
Índice
ÍNDICE
Resumo......................................................................................................................................ix
Abstract......................................................................................................................................x
Lista de abreviaturas...............................................................................................................xi
Lista de figuras........................................................................................................................xii
Lista de tabelas.......................................................................................................................xiii
1. Introdução..............................................................................................................................2
1.1. Biotecnologia ambiental e tratamento biológico de resíduos..................................2
1.2. Bioquímica e microbiologia da digestão anaeróbia.................................................4
1.3. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e produtos microbianos solúveis
(SMP)..........................................................................................................................................7
1.3.1. Substâncias poliméricas extracelulares........................................................7
1.3.2. Produtos microbianos solúveis (SMP).........................................................9
1.3.3. Fatores que afetam a produção de SMP.....................................................10
1.3.4. Funções dos SMP.......................................................................................12
1.3.5. Consequências da produção de SMP.........................................................14
1.3.6. Caracterização dos EPS e SMP..................................................................16
1.4. Caracterização molecular de comunidades naturais...............................................18
1.5. Metaproteômica......................................................................................................20
1.6. Proteômica do tratamento biológico de efluentes..................................................24
2. Justificativa..........................................................................................................................31
3. Objetivos..............................................................................................................................33
3.1. Objetivo geral.........................................................................................................33
3.2. Objetivos específicos..............................................................................................33
4. Materiais e métodos............................................................................................................35
4.1.Fluxograma de análises...........................................................................................35
4.2. Extração de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e precipitação da fração
proteica......................................................................................................................................35
4.2.1. Centrifugação (D´Abzac et al., 2010).....................................................36
4.2.2. Aquecimento (Li e Yang, 2007)..............................................................36
vi
Zorel, J. A.
Índice
4.2.3. Formaldeído (D´Abzac et al., 2010)........................................................36
4.2.4. Formaldeído e Aquecimento (D´Abzac et al., 2010)..............................37
4.2.5. EDTA (D´Abzac et al., 2010)………………………………………….37
4.2.6. Hidróxido de sódio (Park et al., 2008)....................................................37
4.2.7. Resina de troca catiônica (CER; Frolund et al., 1995)............................37
4.2.8. Sulfeto de sódio (Nielsen e Keidin, 1998)...............................................38
4.3. Quantificação de EPS.............................................................................................38
4.3.1. Quantificação de proteínas EPS..............................................................38
4.3.2. Quantificação de carboidratos EPS.........................................................39
4.3.3. Determinação de sólidos suspensos voláteis (SSV)..............................39
4.4. Cromatografia de exclusão molecular dos EPS....................................................40
4.5. Obtenção de SMP...................................................................................................40
4.5.1. Reator UASB...........................................................................................40
4.5.2. Coleta dos SMP do reator UASB............................................................42
4.5.3. Reatores em batelada alimentada..........................................................42
4.5.3.1. Determinação do consumo de glicose.................................................43
4.6. Extração de proteínas intracelulares (Hanreich et al., 2012).................................43
4.7. Eletroforese SDS-PAGE........................................................................................44
4.8. Coloração por Coomassie Coloidal G-250.............................................................44
4.9. Digestão das proteínas em gel para sequenciamento...........................................45
4.10. Digestão das proteínas em solução.......................................................................46
4.11. Espectrometria de massa por ionização do tipo Electrospray – LC-MS-ITTOF...............................................................................................................................46
5. Resultados e discussão........................................................................................................49
5.1. Extração de EPS.....................................................................................................49
5.1.1. Avaliação dos métodos de extração........................................................49
5.1.2. Caracterização dos extratos por cromatografia de exclusão molecular...52
5.1.3. Análise proteômica dos EPS...................................................................55
5.2. Proteínas SMP........................................................................................................60
5.2.1. Origem de proteínas SMP: comparação dos perfis proteicos de lise
celular, EPS e SMP.......................................................................................................60
vii
Zorel, J. A.
Índice
5.2.2. Variações no perfil proteico dos SMP relacionadas a alterações no
substrato........................................................................................................................63
5.3. Caracterização proteômica da comunidade microbiana do reator UASB tratando
glicerol...........................................................................................................................66
6. Conclusões...........................................................................................................................74
7. Perspectivas.........................................................................................................................76
8. Referências bibliográficas..................................................................................................78
viii
Zorel, J. A.
Resumo
RESUMO
No decorrer do tratamento biológico de efluentes, junto à degradação de poluentes os microorganismos produzem diferentes biomacromoléculas (BMM) que diminuem a qualidade do
efluente. Dentre eles, destacam-se as substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e os
produtos microbianos solúveis (SMP). Apesar da importância desses compostos no
desempenho do tratamento, sua caracterização molecular (origem e composição) é ainda
incipiente. Nesse sentido, esse trabalho tem como objetivo analisar proteínas envolvidas na
degradação anaeróbia de matéria orgânica. Para a análise de proteínas SMP produzidas
durante o crescimento microbiano (associadas à utilização do substrato - UAP), foram
testadas seis diferentes condições operacionais variando substrato, razão alimento/microorganismo e temperatura. Quanto à fração dos SMP associada à fase endógena (BAP), o
substrato foi omitido. O sobrenadante dos ensaios foi coletado e suas proteínas caracterizadas.
Com o intuito de identificar a origem das proteínas encontradas em solução (se provenientes
de lise celular ou hidrólise de EPS), foram extraídas proteínas intracelulares e da matriz
extracelular. Todas as amostras foram submetidas à separação por SDS-PAGE e/ou
identificação por LC-MS/MS. Os perfis de bandas apresentados pelas amostras de EPS
mostram que a grande maioria é comum a todos os extratos e que essas apresentam, em geral,
alta massa molecular. Entre as proteínas SMP, apesar de existirem proteínas comuns a todos
os ensaios, nota-se as proteínas liberadas parecem ser relacionadas com as condições externas.
A comparação das amostras supracitadas com proteínas oriundas de lise celular permitiu
sugerir que proteínas SMP de baixa massa molecular seriam possivelmente originadas da
hidrólise de EPS. Quanto às proteínas identificadas, entre os SMP, foram encontrados
indicativos da presença de proteínas originadas de lise celular (proteína de camada S,
proteíno-quinase e proteína ribossomal). Quanto às amostras de extratos celulares, foram
identificadas proteínas relacionadas à aderência celular (MrkA, OmpA), responsáveis pela
mobilidade celular (flagelina) e envolvidas na degradação de substratos (gliceroldesidrogenase). Muitos dos espectros obtidos, apesar de apresentarem perfil típico de
fragmentação de peptídeos, não retornaram resultados positivos, evidenciando a necessidade
da construção de bancos de dados genômicos para amostras naturais. Dentro de nosso
conhecimento, esse é o primeiro trabalho a identificar proteínas SMP, mostrando
ix
Zorel, J. A.
Resumo
aplicabilidade de técnicas proteômicas para o entendimento da microbiologia de sistemas de
tratamento biológico.
x
Zorel, J. A.
Abstract
ABSTRACT
During wastewater biological treatment, in addition to degradation of pollutants,
microorganisms produce different biomacromolecules (BMM) which decrease effluent
quality. Among these polymers, there are extracellular polymeric substances (EPS) and the
soluble microbial products (SMP). Although the importance of these compounds to treatment
performance, their molecular characterization (origin and composition) is still incipient. The
goal of this work is to analyze proteins produced in anaerobic degradation of organic
compounds. To analyze the SMP proteins produced during the microbial growth (associated
with the substrate – UAP) six different operational conditions were tested, varying the
substrate, food/microorganism ratio and temperature. To obtain endogenous fase-associated
SMP (BAP), substrate was omitted. The supernatant was collected and the proteins
characterized. To identificate the source of solution proteins (whether from cellular lysis or
EPS hydrolysis), intracellular and extracellular matrix proteins were extracted. All samples
were submitted to SDS-PAGE separation and/or identification by LC-MS/MS. EPS band
pattern show that the great majority is common to all extracts and have, in general, high
molecular weight. To SMP proteins, despite the ocurrence of common proteins to all assays,
we can note that proteins released seen to be related with external conditions. The SMP, EPS
and cellular lysis protein comparison lead us to suppose that low molecular weight SMP
proteins were possible originated from EPS hydrolysis. Among identified proteins, were
found clues of presence of proteins from cellular lysis (S-layer protein, protein kinase, and
ribosomal protein). To cell extracts, proteins related with cellular adherence (MrkA, OmpA),
mobility (flagellin) and substrate degradation (glycerol-dehydrogenase) were identified.
Despite the identifiable peptide fragmentation patterns, several spectra did not return any
positive results, showing the necessity of construction of genomic data base to natural
samples. To our knowledge, this is the first work to identified SMP proteins, showing the
suitability of proteomics techniques to understanding biological treatment systems
microbiology.
xi
Zorel, J. A.
Lista de abreviaturas
LISTA DE ABREVIATURAS
BAP - Biomass associated products
MALDI – Matrix Assisted Laser
CSTR – Continuous Stirred Tank Reactor
Desorption and Ionization
DQO – Demanda química de oxigênio
m/z – Razão massa/carga
DTT - Ditiotreitol
MBR – Membrane bioreactors
EBPR – Enhanced Biological Phosphorus
PAN – poliacrilonitrila
Removal
PTFE – politetrafluoroeteno
EDTA – Ácido di-aminotetra-acético
PVDF – fluoreto de poilivinilideno
ESI – Electrospray Ionization
pI – Ponto isoelétrico
EPS – Extracellular polimeric substances
SAnMBR – Submerged Anaerobic
FISH – Fluorescence In Situ Hibridization
Membrane BioReactor
GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada
SDS - Dodecil sulfato de sódio
a espectrometria de massas
SDS-PAGE - Eletroforese em gel de
HPLC - High Performance Liquid
poliacrilamida na presença de SDS
Chromatography
SMP – Soluble microbial products
HRT - Hydraulic Retention Time
SRT – Solids Retention Time
kDa – quilo Daltons
THM – Trialometano
LTAD – Low temperature anaerobic
UAP – Substrate utilization associated
digestion
products
LCMS-IT-TOF - Liquid Chromatography
UASB – Upflow Anaerobic Sludge Blanket
Ion Trap Time Of Flight
UV – Ultravioleta
xii
Zorel, J. A.
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Balanço de carbono para a degradação aeróbia (esquerda) e anaeróbia (direita) de
compostos orgânicos...................................................................................................................3
Figura 2: Esquema do processo de digestão anaeróbia.............................................................4
Figura 3: Metabolismo da formação de EPS e SMP em sistemas microbiológicos................10
Figura 4: Diferenciação entre o potencial e a atividade de uma microbiota e abordagem
sistemática para a caracterização de ecossistemas microbianos...............................................19
Figura 5: Fluxograma de análises metaproteômicas................................................................21
Figura 6: Fluxograma das análises proteômicas......................................................................35
Figura
7:
Diagrama
esquemático
do
reator
UASB
em
escala
de
bancada......................................................................................................................................41
Figura 8: Concentração de proteínas e carboidratos para cada método de extração...............50
Figura 9: Cromatogramas dos extratos de EPS e dos padrões de massa molecular................53
Figura 10: SDS-PAGE dos extratos de EPS liofilizados.........................................................56
Figura 11: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de
amônio.......................................................................................................................................57
Figura 12: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de
amônio e centrifugados sem remoção da fração superior.........................................................59
Figura
13:
SDS-PAGE
das
amostras
de
lise
celular,
BAP,
EPS
e
SMP...........................................................................................................................................61
Figura 14: SDS-PAGE dos SMP dos reatores em batelada.....................................................64
Figura 15: SDS dos extratos de proteínas celulares.................................................................66
xiii
Zorel, J. A.
Lista de tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Micro-organismos representativos em reatores anaeróbios empregados na digestão
de lodo...........................................................................................................................................6
Tabela 2: Produção de SMP em função das condições ambientais.........................................13
Tabela 3: Resumo dos trabalhos de metaprotêomica do tratamento biológico de resíduos....29
Tabela 4: Solução nutricional utilizada para alimentação dos reatores e ensaios de degradação
anaeróbia...................................................................................................................................37
Tabela 5: Condições dos ensaios em reatores em batelada.....................................................42
Tabela 6: Parâmetros do equipamento LC-MS-IT-TOF.........................................................46
Tabela 7: Proteínas SMP identificadas por LC-MS/MS.........................................................62
Tabela 8: Proteínas identificadas para os extratos celulares separados por SDS-PAGE........67
Tabela 9: Proteínas identificadas para os extratos celulares submetidos à digestão em
solução......................................................................................................................................70
xiv
1. Introdução
Zorel, J. A.
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1. Biotecnologia ambiental e tratamento biológico de resíduos
Praticamente todo tipo de atividade humana está associado à produção de resíduos, no
entanto, o interesse pela diminuição dos níveis de poluentes e dos impactos causados por
esses é relativamente recente. Devido ao aumento gradativo de atividades industriais e à
diminuição de recursos naturais, é crescente a busca por tecnologias limpas e por técnicas que
reduzam a toxicidade de resíduos industriais ou domésticos. Nesse âmbito, a biotecnologia
ambiental – aplicação de micro-organismos para proteger, melhorar ou restaurar a qualidade
ambiental – visto a versatilidade do metabolismo microbiano, apresenta-se como uma
alternativa promissora para modificar esse quadro. Esse campo da biotecnologia abrange as
áreas de biorremediação, produção de compostos químicos biocompatíveis, prevenção do
espalhamento de patógenos, redução de resíduos industriais e tratamento biológico de águas
residuárias (EVANS e FURLONG, 2003; AGATHOS, 2011).
O tratamento biológico consiste na degradação dos poluentes presentes em águas
residuárias por meio da ação de micro-organismos que se utilizam da energia contida nos
contaminantes orgânicos ou inorgânicos para a manutenção dos processos celulares. Ao final
do tratamento, o substrato é convertido em biomassa e subprodutos que variam em
dependência do tipo de resíduo e do biorreator empregado, se aeróbio ou anaeróbio
(RITTMAN e MCCARTY, 2001).
A presença/ausência de oxigênio propicia o crescimento de grupos microbianos
distintos, os quais apresentam características próprias que favorecem seu uso em diferentes
situações. As diferenças no metabolismo dos dois grupos fazem com que a energia e os
elementos químicos (ex.: carbono) que compõem os substratos sejam direcionados
preferencialmente para a formação de novas células, no caso dos aeróbios, ou para os
produtos finais da degradação, no caso dos anaeróbios (Figura 1; AIVASIDIS e
DIAMANTIS, 2005).
Para os micro-organismos aeróbios, aproximadamente metade dos compostos
consumidos (sejam solúveis, coloidais ou em suspensão) é convertida em biomassa. Como a
biomassa produzida em excesso ao final do processo de tratamento acarreta em gastos e
etapas adicionais para seu descarte, considera-se que na degradação aeróbia ocorre a
transferência da matéria orgânica da fase líquida para a fase sólida (KHANAL, 2008). Por
2
Zorel, J. A.
Introdução
outro lado, em ambientes anaeróbios, apenas uma pequena parte do carbono e da energia
contidos nos contaminantes é destinada à produção de células (Figura 1).
Figura 1: Balanço de carbono para a degradação aeróbia (esquerda) e anaeróbia (direita) de compostos
orgânicos. Adaptado de Aivasidis e Diamantis, 2005.
Desta forma, a baixa produção de biomassa dos micro-organismos anaeróbios mostrase como uma das vantagens frente ao tratamento aeróbio. Como o mínimo de energia é
empregado para o suporte do metabolismo microbiano, o biogás – principalmente o metano –
liberado ao final da digestão anaeróbia contém a maior parte da energia presente nos
substratos primários (MCCARTY e BAE, 2011).
A queima do biogás pode ser usada para a geração de energia elétrica e para o
aquecimento de água. Estima-se que sejam produzidos em média 0,5 m3 de biogás para cada
quilo de demanda química de oxigênio (DQO) removido e que a energia contida nesse
produto seja de 6,5 kWh/m3 – o equivalente a 0,6 litros de óleo (TEZEL et al., 2011). Entre
outras vantagens do tratamento anaeróbio podem ser citados o menor investimento para sua
implantação, visto o tamanho reduzido dos reatores e maiores taxas volumétricas de
conversão em comparação aos reatores aeróbios e o gasto operacional praticamente nulo, pois
não é necessário o uso de energia para a aeração do reator (SPEECE, 1983). Além disso, a
biotecnologia anaeróbia apresenta o potencial de produção de combustíveis renováveis
(metano, hidrogênio, butanol e biodiesel) e a recuperação de produtos com valor agregado
(ácido acético, ácido lático e enxofre; KHANAL, 2008).
Com vista nesses benefícios, os reatores anaeróbios são empregados para o tratamento
de águas residuárias de indústrias produtoras de alimentos, bebidas, açúcar, derivados do leite,
celulose, papel, petroquímicos, fármacos bem como efluentes domésticos (JANSSEN et al.,
2009; SINGH et al., 1998).
3
Zorel, J. A.
Introdução
1.2. Bioquímica e microbiologia da digestão anaeróbia
Apesar de ainda pobremente caracterizada, sabe-se que a digestão anaeróbia de
efluentes complexos é realizada por um consórcio microbiano (bactérias fermentativas e
acetogênicas e arquéias metanogênicas), o qual converte moléculas orgânicas indesejáveis a
biogás, uma fonte renovável de energia (ABRAM et al., 2011). Na ausência de oxigênio e de
outros aceptores de elétrons inorgânicos tais como NO3-, NO2-, SO42-), é realizada a
fermentação dos substratos orgânicos presentes nesses resíduos, os quais são utilizados tanto
como doadores quanto como aceptores de elétrons (WIESMANN et al., 2007). A figura 2
ilustra as etapas da bioconversão anaeróbia de substratos complexos.
Figura 2: Esquema do processo de digestão anaeróbia. Adaptado de Lin e Lay, 2011.
O processo de degradação do substrato é iniciado por bactérias fermentativas
(hidrolíticas acidogênicas) as quais, por meio da liberação de enzimas extracelulares,
hidrolisam polímeros complexos em açúcares, ácidos carbônicos de cadeia longa e
aminoácidos. Nesse grupo bacteriano são encontrados, entre outros, os gêneros Bacteroides,
Clostridium e Butyrivibrio. O mesmo grupo, durante o processo de acidogênese, converte
4
Zorel, J. A.
Introdução
esses monômeros a H2, CO2 e ácidos graxos de cadeia curta, além de metanol e outros álcoois
simples, sendo que os produtos finais do metabolismo dependem do tipo de substrato e das
condições ambientais. Esses compostos mais simples são utilizados por bactérias acetogênicas
(Clostridium sp. e Acetobacterium sp.) para a produção de acetato, o qual pode ser obtido a
partir de H2 e CO2 ou pela oxidação de álcoois e ácidos orgânicos com mais de dois carbonos.
A última etapa da digestão anaeróbia – a produção de metano – é executada por arquéias
metanogênicas
acetoclásticas
(ex.
gêneros
Methanosaeta
e
Methanosarcina)
e
hidrogenotróficas (ex. gênero Methanospirillum), de modo que o primeiro grupo produz CH4
e CO2 por meio da quebra da molécula de acetato, enquanto que os metanogênicos
hidrogenotróficos se utilizam da oxidação do H2 na respiração do CO2 (GUJER e ZEHNDER,
1983; EVANS e FURLONG, 2003).
Na tabela 1 são mostrados os principais filos e gêneros microbianos presentes em
reatores anaeróbios e sua contribuição para o processo de digestão. A microbiota responsável
pela bioconversão dos contaminantes pode sofrer mudanças relacionadas a alterações das
condições ambientais, no entanto, existe grande similaridade entre os grupos microbianos
predominantes em diferentes reatores (GUJER e ZEHNDER, 1983; TEZEL et al., 2011).
5
Zorel, J. A.
Introdução
Tabela 1: Micro-organismos representativos em reatores anaeróbios empregados na digestão
de lodo. Adaptado de Tezel et al., 2011.
Microorganismos
Processo metabólico
Domínio Bacteria
Firmicutes
Acetobacterium e Eubacterium
Hidrólise, acidogênese e acetogênese
Lactobacillus,
Hidrólise e acidogênese
Sporobacterium, Clostridium e
Ruminococcus
Paenibacillus e Acidaminococcus
Acidogênese
Syntrophomonas
Acetogênese
Bacteroidetes
Bacteroides
Hidrólise e acidogênese
Cytophaga e Flavobacterium
Acidogênese
Proteobacteria
Desulfovibrio, Thauera e
Acetogênese
Syntrophobacter
Actinobacteria
Propionibacterium e
Hidrólise e acidogênese
Bifidobacterium
Synergistetes
Aminobacterium
Acetogênese
Domínio Archaea
Methanomicrobia
Methanosarcinales
Metanogênese acetoclástica e
hidrogenotrófica
Methanomicrobiales
Metanogênese hidrogenotrófica
Methanobacteria
Methanobacteriales
Metanogênese acetoclástica e
hidrogenotrófica
6
Zorel, J. A.
Introdução
1.3. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e produtos microbianos
solúveis (SMP)
No decorrer do tratamento biológico de efluentes, apesar do metabolismo microbiano
reduzir a concentração dos poluentes, durante as fases de crescimento e morte dos microorganismos ocorre a produção de biomacromoléculas (BMM) que podem comprometer o
desempenho do processo devido ao seu caráter recalcitrante. Dentre eles, destacam-se as
substâncias poliméricas extracelulares (EPS – extracellular polimeric substances) e os
produtos microbianos solúveis (SMP – soluble microbial products), sendo ambas as classes
compostas por uma mistura complexa de biopolímeros (NI et al., 2011, ZHOU et al., 2012).
Devido à influência desses compostos nos processos de tratamento biológico, é crescente o
número de trabalhos acerca de suas características. A atenção crescente dedicada ao estudo
desses produtos microbianos tem trazido avanços para a compreensão dos fenômenos
associados aos sistemas de tratamento biológico de resíduos, preenchendo lacunas de modelos
experimentais e matemáticos do processo (AZAMI et al., 2012; NG e KIM, 2007).
1.3.1. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS)
Wingender e Neu (1999) definiram como EPS as diferentes classes de
macromoléculas presentes no interior de agregados microbianos. Tais substâncias podem ser
divididas em ligadas e solúveis, de modo que o primeiro grupo constitui a matriz responsável
pela formação dos agregados microbianos (SHENG et al., 2010). Essa matriz, além de
propiciar a união física e a cooperação entre os diferentes micro-organismos presentes em
biorreatores, exerce as funções de adesão a superfícies, acúmulo de água e nutrientes,
agregação de células bacterianas em flocos/grânulos ou biofilmes e adsorção de compostos
orgânicos exógenos (FLEMMING e WINGENDER, 2010; LASPIDOU e RITTMANN,
2002). Ao passo que as funções dessa matriz são bem estabelecidas, a caracterização de seus
componentes limita-se, na grande maioria dos trabalhos, à quantificação das classes químicas
desses. Entre esses, são encontrados lipídeos, ácidos nucléicos, ácidos húmicos, matéria
inorgânica, substâncias húmicas e – como polímeros principais – carboidratos e proteínas
(D’ABZAC et al., 2010). No entanto, mesmo para a simples quantificação dessas moléculas,
variações são encontradas na literatura quanto à composição dos EPS. Essas variações são
atribuídas a diversos fatores como tipo de cultura, fase de crescimento, parâmetros do
7
Zorel, J. A.
Introdução
processo, tipo de biorreator, método analítico empregado e, sobretudo, ao método de extração
utilizado (NIELSEN e JAHN, 1999; PARK e NOVAK, 2007).
Enquanto existe um consenso sobre a classificação dos EPS ligados, as definições
sobre a parte solúvel mostram-se um tanto quanto controversas visto que, para alguns autores,
essa fração dos EPS compreende tanto os polímeros fracamente ligados às células quanto
aqueles que se encontram dissolvidos em solução, para os quais são encontradas na literatura
tanto a definição de EPS solúvel quanto de SMP (JANG et al., 2007; PARK e NOVAK,
2007; SHENG et al., 2010).
Como citado acima, o uso de diferentes métodos de extração seria a principal causa
dessas divergências, visto que vários são os tipos de interações físico-químicas que mantém
os EPS unidos (FLEMMING e WINGENDER, 2010). Como exemplo, Ramesh e
colaboradores (2006), analisando espectros de fluorescência de excitação/emissão e
infravermelho sugeriram que EPS solúveis (fracamente ligados) e SMP seriam misturas
diferentes, com base em suas propriedades físico-químicas distintas. Todavia, enquanto os
autores do trabalho consideram que a sonicação (método empregado na extração dos EPS)
liberaria apenas os EPS solúveis, outros autores empregam tal técnica para a extração dos EPS
de maneira geral, sem distinção entre fração ligada e solúvel (COMTE et al., 2006). Em
trabalho posterior, Ramesh e colaboradores (2007) mostraram que a extração sequencial de
EPS (por meio de sonicação e posterior aquecimento), solubiliza compostos diferentes da
matriz em cada etapa. Os autores classificaram os polímeros liberados na primeira etapa como
EPS fracamente ligados e os advindos da segunda como EPS fortemente ligados, e
ressaltaram as diferenças na composição química desses. Entretanto, os trabalhos de D´Abzac
e colaboradores (2010) e Park e Novak (2007) mostram a seletividade de diferentes métodos
de extração por diferentes frações de EPS e que extrações sequenciais por métodos distintos
podem aumentar a eficiência de extração da segunda etapa. Em resumo, diferentes métodos de
extração podem favorecer a solubilização de diferentes frações de EPS. Essa solubilização
seletiva estaria relacionada mais ao tipo de interação polímero-matriz que é desfeita do que à
magnitude dessa interação. Quanto ao rendimento dos métodos de extração, trabalhos
analíticos que comparam métodos físicos e químicos apontam um maior rendimento para os
métodos químicos, no entanto, alguns estudos revelam a interferência dos agentes de extração
na quantificação dos componentes do EPS, levando à superestimação desses (D’ABZAC et
al., 2010; SHENG et al., 2010).
8
Zorel, J. A.
Introdução
A despeito das divergências na classificação e caracterização das substâncias
poliméricas extracelulares, os produtos da hidrólise dessa matriz representam uma das
principais fontes dos produtos microbianos solúveis presentes em efluentes do tratamento
biológico (AQUINO e STUCKEY, 2008; LASPIDOU e RITTMANN, 2002).
1.3.2. Produtos microbianos solúveis (SMP)
Na definição de Noguera e colaboradores (1994), os SMP são ‘a mistura de compostos
orgânicos resultantes do metabolismo do substrato e da morte das células, durante a
mineralização do substrato’. De acordo com essa definição, os componentes do afluente (água
residuária) ou os intermediários da degradação desses não podem ser incluídos entre os SMP.
Numa visão mais abrangente e simplificada, os SMP podem ser classificados como qualquer
tipo de matéria orgânica presente no efluente que não estava presente no afluente (AQUINO,
2004; AZAMI et al., 2012).
Laspidou e Rittman (2002), num trabalho de revisão e modelagem, desenvolveram
uma “teoria unificada” onde os processos de produção e degradação dos SMP e EPS estariam
acoplados. Não obstante a teoria ter sido baseada em resultados provenientes de sistemas
aeróbios, trabalhos posteriores mostraram sua aplicação também para sistemas anaeróbios.
Nessa teoria, os SMP são subdivididos de acordo com a fase de crescimento microbiano da
qual são derivados em: UAP (substrate utilization associated products) e BAP (biomass
associated products).
Os UAP são produtos associados diretamente ao crescimento e metabolismo
microbiano e sua taxa de produção é proporcional à taxa de utilização de substrato. Por outro
lado, a liberação dos BAP na solução ocorre durante a fase endógena dos microrganismos
(fase de decaimento), e sua origem é relacionada, no modelo de Laspidou e Rittman (2002),
estritamente à hidrólise dos EPS ligados ou, segundo Aquino e Stuckey (2008) também à
liberação de compostos intracelulares. A Figura 3 resume a dinâmica de produção dos SMP
durante o tratamento biológico.
As principais diferenças entre os UAP e os BAP estão relacionadas principalmente à
sua massa molecular e biodegradabilidade. Enquanto os UAP, de baixa massa molecular, são
consumidos logo após o término do substrato, a degradação dos BAP, polímeros maiores e
menos susceptíveis à degradação, ocorre de maneira lenta de modo que, muitas vezes, esses
permanecem ao final do processo (JARUSUTTHIRAK e AMY, 2007; NI et al., 2011).
9
Zorel, J. A.
Introdução
Figura 3: Metabolismo da formação de EPS e SMP em sistemas microbiológicos de acordo com Laspidou e
Rittman, 2002 e Aquino e Stuckey, 2008. Adaptado de Ni et al., 2011.
1.3.3. Fatores que afetam a produção de SMP
A produção de SMP está diretamente relacionada com as condições operacionais dos
biorreatores. Além disso, dependendo do tipo de sistema empregado, as alterações de
parâmetros operacionais exercem efeitos distintos sobre a composição final dos produtos
microbianos solúveis (NI et al., 2011).
A composição do afluente – tipo e concentração do substrato, presença de cátions e
outros elementos traço – é um parâmetro que deve ser levado em consideração para o projeto
de biorreatores por influenciar o desempenho do tratamento, principalmente no que diz
respeito à produção de SMP (NI et al., 2011; SPEECE, 1983). Como exemplo, substratos que
apresentam altas razões proteína/carboidrato propiciam a liberação de maiores quantidades de
SMP bem como o aumento de sua massa molecular (ARABI e NAKHLA, 2008). Boero e
colaboradores (1991), ao compararem reatores CSTR (Continuous Stirred Tank Reactor)
aeróbios alimentados com fenol ou glicose, mostraram que o consumo de fenol acarretou na
maior produção de SMP e que esses teriam maior biodegradabilidade do que os originários da
degradação de glicose. Em trabalho similar, Magbanua e Bowers (2006) reportaram que
10
Zorel, J. A.
Introdução
aproximadamente 15% do fenol consumido foram convertidos em polímeros solúveis,
enquanto que para a glicose esse valor foi de 3%. No entanto, ao final do processo, os autores
notaram o acúmulo de SMP derivados de glicose, ao passo que os polímeros derivados de
fenol, possivelmente por serem empregados como substratos secundários, foram reduzidos a
0,5%.
Em uma série de trabalhos com reatores de membrana (MBR), Arabi e Nakhla (2008,
2009, 2010) mostraram como diferentes razões entre íons metálicos e componentes orgânicos
do substrato podem influir na composição e no tamanho dos SMP. Os autores demonstraram
que íons monovalentes (sódio), quando em concentrações superiores aos divalentes (cálcio e
magnésio), podem diminuir a quantidade de EPS componentes do lodo e aumentar a liberação
de biopolímeros em solução. Essa solubilização de polímeros devido à presença de sódio
também foi notada por Murthy e colaboradores (1998) e é empregada em processos de
extração de EPS, nos quais o íon assume a posição ocupada por íons divalentes e desestabiliza
as cargas negativas da matriz extracelular (PARK e NOVAK, 2007).
Trussel e colaboradores (2006) mostraram que variações da carga orgânica afluente de
reatores aeróbios de membrana resultam no aumento da concentração de SMP totais,
influenciando principalmente a quantidade de carboidratos solúveis e o fluxo da membrana.
Por outro lado, o aumento da razão alimento/micro-organismo (F/M, Food/Microorganism)
aumenta a liberação de proteínas SMP em reatores anaeróbios de membrana e alteram
significativamente a quantidade de EPS como mostrado por Liu e colaboradores (2012).
Como discutido pelos autores, maiores cargas orgânicas podem estimular a excreção de SMP
empregados para a adaptação – como enzimas extracelulares – e posterior crescimento
microbiano. Apesar das divergências citadas, ambos os trabalhos relatam a correlação positiva
entre a quantidade de SMP produzidos e a colmatação da membrana.
Além de variações relacionadas ao substrato, a produção de SMP mostra-se
dependente do tempo que a biomassa permanece no processo de tratamento. O trabalho de
Malamis e Andreadakis (2009) indicou a maior ocorrência de SMP em sistemas que operam
com tempos de retenção de sólidos (SRT, Solids Retention Time) curtos. O aumento do SRT
pode diminuir a concentração de produtos microbianos solúveis até certo ponto, de modo que
tempos de retenção de sólidos muito elevados não reduzem significativamente – ou mesmo
aumentam – sua produção (HUANG et al., 2011). Esse fato pode estar correlacionado à
diferente resposta dos UAP e BAP às variações nesse parâmetro operacional. Ni e
colaboradores (2011) e Jarussuthirak e Amy (2006) mostraram que maiores SRT levam ao
11
Zorel, J. A.
Introdução
acúmulo de biomassa no sistema com consequente aumento da produção de UAP e EPS. A
grande concentração de células acarreta em altas taxas de degradação dos UAP, enquanto que
o decaimento da biomassa leva à liberação de BAP (BARKER et al., 2000; NI et al., 2011).
Devido ao grande número de células com baixa atividade e à menor biodegradabilidade dos
BAP, esses tendem a se acumular no efluente do tratamento (AQUINO e STUCKEY, 2008;
HUANG et al., 2011).
Outro parâmetro que controla a geração de produtos microbianos é o tempo médio de
residência de líquidos no interior do reator (HRT, Hydraulic Retention Time; LIU et al.,
2012). Em reatores SAnMBR (Submerged Anaerobic Membrane BioReactor), tempos de
detenção hidráulica menores promovem a multiplicação da biomassa, com consequente
aumento da liberação de SMP, principalmente de proteínas solúveis (HUANG et al., 2011).
Segundo Mesquita e colaboradores (2010), ao trabalhar com reatores CSTR, as variações na
concentração de produtos microbianos solúveis decorrentes de alterações do HRT parecem ser
mais pronunciadas para sistemas aeróbios do que para anaeróbios.
Com vista no descrito acima, os SMP gerados durante o tratamento biológico parecem
ser produzidos em decorrência de adaptações metabólicas dos micro-organismos em resposta
às alterações ambientais. Em virtude desse comportamento, diversos são os estudos que
levantam hipóteses sobre as funções biológicas dos produtos microbianos.
1.3.4. Funções dos SMP
A formação dos SMP é fortemente relacionada aos mecanismos de defesa microbiana,
aclimatação e estratégias de sobrevivência (WANG e ZHANG, 2010). Algumas
circunstâncias em que os SMP são produzidos como resposta aos estímulos externos são
mostradas na Tabela 2.
Devido à complexidade da comunidade microbiana presente em estações de
tratamento, muitos dos dados sobre a produção de SMP encontrados na literatura foram
obtidos de estudos com culturas puras. No entanto, Wang e Zhang (2010), mostraram que
parte dos polímeros produzidos por três micro-organismos isolados de lodo ativado
apresentam diferenças de composição química quando comparados àqueles provenientes da
comunidade original e mesmo entre as próprias culturas. Essa liberação diferenciada de SMP
foi observada tanto durante o crescimento normal dos micro-organismos quanto após a
exposição à diferentes condições de estresse.
12
Zorel, J. A.
Introdução
Tabela 2: Produção de SMP em função das condições ambientais.
Função
Referência
Concentraçãode
Liberação de SMP para estabelecer a concentração
(PARKIN e
equilíbrio
de equilíbrio através da membrana
MCCARTY, 1981)
Deficiência Nutricional
SMPs são produzidos para adsorver nutrientes
RITTMAN e
(principalmente metais) em baixas concentrações
MCCARTY, 2001
Mitigação da toxicidade causada por metais
AQUINO e
pesados. Os SMP também podem ser liberados
STUCKEY, 2004;
devido à lise celular causada por substâncias
KUO e PARKIN,
tóxicas.
1996
Enzimas extracelulares são produzidas para a
HEJZLAR e
hidrólise de biopolímeros. Outros polímeros
CHUDOBA, 1986;
extracelulares auxiliam na granulação/floculação
LASPIDOU e
da biomassa e, quando hidrolisados, são liberados
RITTMANN, 2002
Toxicidade
Crescimento Biomassa
como SMP. Além disso, algumas estruturas
celulares, ao serem renovadas, são excretadas em
solução.
Quorum Sensing
A excreção de moléculas orgânicas pode servir
HASTINGS e
como mecanismo de comunicação celular.
GREENBERG,
1999
Decaimento Endógeno
A
lise
celular
acarreta
na
liberação
de
macromoléculas intracelulares e componentes da
membrana celular.
13
BARKER e
STUCKEY, 1999
Zorel, J. A.
Introdução
Os biopolímeros produzidos mostraram diferenças de hidrofobicidade, massa
molecular e grupos químicos predominantes, reforçando a hipótese da produção seletiva de
SMP para contornar situações desfavoráveis. Por exemplo, a exposição ao NaCl e ao pH
ácido levam ao acúmulo de proteínas, enquanto que altas temperaturas induzem a produção de
ácidos húmicos e carboidratos. Entre as condições estudadas, a ausência de substrato e a
adição de CrCl3 em baixas concentrações causaram os menores impactos sobre a
concentração e a composição dos SMP. No entanto, a concentração de produtos microbianos
liberados em solução parece ter correlação direta com a quantidade de agentes tóxicos
presentes e pode variar dependendo do tipo de substância que chega ao reator. Como
mostrado por Aquino e Stuckey (2004), a adição de metais pesados (cromo) e organoclorados
(clorofórmio) a reatores anaeróbios gera diferentes efeitos de inibição da atividade
microbiana, causando o acúmulo de ácidos graxos voláteis e SMP. Para ambos os compostos
foi notado o aumento da produção de EPS bem como a presença de polímeros derivados
desses em solução. No entanto, uma fração dos compostos solúveis de alta massa molecular
teria origem intracelular, devido à lise causada principalmente pelo cromo. Além de
compostos oriundos da morte celular, os autores reportam a produção de biomoléculas
capazes de mitigar a toxicidade de metais pesados por meio da ligação a esses.
1.3.5. Consequências da produção de SMP
Vários trabalhos mostram que os produtos microbianos solúveis (especialmente BAP)
constituem a maioria da matéria orgânica presente no efluente de sistemas de tratamento
biológico de modo que o substrato que chega aos biorreatores é completamente degradado e
não é detectado após o tratamento (AQUINO e STUCKEY, 2004; NI et al., 2010).
Jarussuthirak e Amy (2007), por meio de análises de cromatografia de exclusão molecular,
mostram a rápida degradação de glicose em um reator de bancada, com a produção simultânea
de compostos de baixa massa molecular – correspondentes aos UAP – e o aparecimento de
compostos maiores (BAP) após o consumo do substrato. A comparação dos efluentes do
reator estudado e de estações de tratamento reais indica que os BAP permanecem ao término
do processo, constituindo a maioria dos compostos presentes na matéria orgânica efluente.
Em reatores anaeróbios do tipo SAMBR e CSTR, os SMP representam mais de 80%
da demanda química de oxigênio residual, sendo que em outros sistemas esse valor pode
chegar aos 98% (AQUINO e STUCKEY, 2004; AQUINO et al., 2006). Jang e colaboradores
14
Zorel, J. A.
Introdução
(2007), ao estudarem a conversão da demanda química de oxigênio em reatores de membrana
aeróbios, mostram que 91% da DQO do permeado é composta por proteínas e carboidratos
produzidos durante a operação do reator.
A alta concentração desses polímeros pode também influenciar as propriedades
reológicas do efluente, principalmente em reatores que operam com concentrações elevadas
de biomassa, como é o caso dos reatores de membrana. A maior liberação desses compostos
nesses sistemas eleva a viscosidade do efluente, aumentando a deposição de partículas e,
consequentemente,
diminuindo
o
desempenho
de
reatores
de
membrana
(KORNBOONRAKSA e LEE, 2009).
Além disso, somados aos problemas causados em outros sistemas, nos biorreatores de
membrana (MBR, Membrane bioreactors) a produção de SMP e EPS causa a colmatação
(fouling) da membrana, problema que influencia o desempenho, a estabilidade e o custo desse
tipo de reator (ARABI e NAKHLA, 2010; HUANG et al., 2012). Entre os demais elementos
responsáveis pelo fouling, essas macromoléculas mostram-se como a principal causa da
diminuição do fluxo e consequente lavagem ou troca do módulo de membrana. Meng e
colaboradores (2009), em um trabalho de revisão, apresentaram um levantamento dos fatores
causadores da colmatação, entre os quais os que recebem maior destaque são os polímeros de
origem bacteriana. Além de estudos focados na relação direta biomacromoléculas/fouling,
alguns trabalhos relacionam parâmetros operacionais com a geração e/ou composição de
produtos microbianos e seu impacto no comportamento dos reatores de membrana. Como
exemplo, o trabalho de Liang e colaboradores (2007), mostra que tempos de retenção de
sólidos menores acarretam não só no aumento da concentração de SMP, mas também na
intensificação do seu potencial de colmatação. A despeito do fenômeno de fouling mostrar-se
altamente dependente das características dos biopolímeros e das propriedades da membrana, o
mesmo comportamento também foi encontrado em outros trabalhos analisando diferentes
SRT, independentemente do resíduo tratado ou do material do módulo de membrana
(AHMED et al., 2007; MALAMIS e ANDREADAKIS, 2009; TIAN e SU, 2012).
Os SMP também podem causar problemas nas etapas posteriores ao tratamento
biológico, tanto em sistemas de distribuição de água – onde podem servir como substrato para
o crescimento microbiano ou aumentar os níveis de toxicidade – quanto em processos de
desinfecção (FURUMAI e RITTMANN, 1992; MAGBANUA e BOWERS, 2006). Fort e
colaboradores (1983) reportaram o surgimento de substâncias mutagênicas após a cloração do
efluente de estações de tratamento. Como tais substâncias não estavam presentes no afluente
15
Zorel, J. A.
Introdução
ou mesmo no interior dos reatores, Namkung e Rittman (1988) supuseram que compostos
como o trialometano (THM) seriam derivados da reação entre os SMP e o hipoclorito
empregado no tratamento. Uma evidência experimental para esta suposição foi apresentada
recentemente por Wei e colaboradores (2011) ao compararem cromatogramas dos produtos
resultantes da cloração de SMPs e de biopolímeros padrão (DNA, ácido húmico, carboidratos
e proteínas). Os resultados obtidos sugerem não apenas a formação de THM como também de
ácidos halo-acéticos (mono, di e tri-clorados) como subprodutos da desinfecção.
Visto sua importância biológica e sua influência no desempenho de estações de
tratamento biológico, a caracterização dos produtos microbianos é o primeiro passo para o
entendimento das razões pelas quais esses seriam produzidos e para o estabelecimento de
tecnologias para sua remoção do efluente final.
1.3.6. Caracterização dos EPS e SMP
Os EPS e SMP são encontrados em uma ampla faixa de massas moleculares, variando
desde os menores que 1 kDa até alguns com mais de 100 kDa. Esse parâmetro é estimado por
meio de ultrafiltração em membranas de diferentes porosidades ou por cromatografia de
exclusão (MAGBANUA e BOWERS, 2006; MALAMIS e ANDREADAKIS, 2009). O
estudo da massa molecular desses compostos pode servir como indicador da solubilidade,
biodegradabilidade
e
toxicidade
dos
produtos
microbianos.
O
tamanho
dessas
biomacromoléculas é influenciado por parâmetros operacionais como tempo de retenção de
sólidos e tempo de detenção hidráulica além de ser dependente do tipo de substrato, mas não
da concentração inicial desse (BARKER e STUCKEY, 1999; MAGBANUA e BOWERS,
2006).
Além da massa molecular, até o momento, a grande maioria dos trabalhos encontrados
na literatura classificam os produtos microbianos com base em análises de cromatografia de
exclusão molecular e espectroscopias de infravermelho e de excitação/emissão. Por meio do
uso dessas técnicas, Tian e colaboradores (2011) caracterizaram os SMP liberados durante o
consumo de substratos (UAP) tanto para micro-organismos autotróficos como para
heterotróficos bem como aqueles liberados na ausência de substrato (BAP). Os autores
reportaram maior diversidade de compostos solúveis – entre eles, proteínas, carboidratos,
substâncias húmicas e lipídeos – advindos da fase endógena quando comparados aos UAP,
representados principalmente por carboidratos e proteínas. Além disso, os SMP de maior
16
Zorel, J. A.
Introdução
massa molecular encontrados foram os BAP, seguidos dos UAP produzidos por microorganismos heterotróficos e autotróficos. Ni e colaboradores (2010) reportam que substâncias
húmicas também estariam presentes entre os UAP, e que compostos de massa molecular
comparável ao dos BAP seriam produzidos durante a fase de crescimento microbiano.
Análises desse tipo também podem ser úteis na caracterização dos polímeros envolvidos na
colmatação de membranas. Zhou e colaboradores (2012), baseados em dados experimentais e
modelos matemáticos mostraram que, entre os produtos microbianos responsáveis pelo
fouling, os carboidratos e proteínas seriam oriundos dos SMP e EPS, respectivamente.
Wu e Zhou (2010) estudaram os SMP presentes em reatores anaeróbios de fluxo
ascendente utilizados no tratamento de três resíduos diferentes (águas residuárias de destilaria,
ácido tetrafitálico purificado e meio sintético suplementado com glicose). Além da
quantificação de polissacarídeos e proteínas, as amostras foram analisadas por meio de
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), para identificação de
compostos orgânicos voláteis. Com base na quantificação dos SMP e na predominância de
determinadas populações microbianas ao longo das diferentes alturas dos reatores, foi
levantada a hipótese de que os micro-organismos acidogênicos (encontrados em maior
número nas partes mais baixas do reator) seriam os maiores produtores de SMP, enquanto que
os metanogênicos (predominantes nas partes altas) contribuiriam para o consumo desses
compostos, visto que a concentração de SMP totais diminuiu nas regiões mais altas dos
biorreatores. Ao que tange à identificação dos compostos, foi observado que os principais
componentes dos SMP de baixa massa molecular foram alcanos de cadeia longa, ácidos e
ésteres, independentemente dos resíduos tratados.
Vários trabalhos sobre a composição química dos EPS e SMP mostram que esses são
formados principalmente por proteínas e carboidratos, sendo que a razão entre essas classes é,
geralmente, maior do que um. Frente a esses dados, nos últimos anos, muitos estudos têm se
voltado para a análise das principais proteínas que constituem a mistura complexa de produtos
microbianos de reatores, principalmente no que diz respeito à sua participação nos processos
de floculação da biomassa e colmatação de membranas, situações nas quais as proteínas
representam grande parte dos compostos encontrados (AQUINO et al., 2006; HUANG et al.,
2012; JI e ZHOU, 2006; PARK et al., 2008).
Como visto, a maioria dos trabalhos citados têm seu foco na caracterização química
dos produtos microbianos. No entanto, para a caracterização completa dos SMP é
imprescindível a combinação de dados químicos e biológicos, os quais podem fornecer
17
Zorel, J. A.
Introdução
informações sobre seus mecanismos de produção, natureza e propriedades (AZAMI et al.,
2012).
A presença de proteínas entre os SMP levanta a possibilidade do uso de técnicas de
proteômica para a identificação desses compostos. Com base no que ocorre para demais
sistemas biológicos, informações advindas de análises desse tipo, unidas a outras técnicas de
caracterização molecular, podem indicar quais são as principais proteínas presentes no
efluente bem como os micro-organismos responsáveis por sua produção (SIGGINS et al.,
2012).
1.4. Caracterização molecular de comunidades naturais
Além da degradação de resíduos antropogênicos, os micro-organismos garantem as
condições habitáveis ao planeta, participando dos ciclos de nutrientes e da manutenção
biogeoquímica da biosfera. No entanto, apesar de sua importância, a contribuição da maioria
das espécies microbianas dentro de seus ambientes permanece desconhecida, principalmente
pelo fato de que grande parte dos micro-organismos não é cultivável (RODRÍGUEZVALERA, 2004; KELLER e HETTICH, 2009). Essa limitação restringia, até as últimas
décadas, nosso conhecimento sobre capacidades metabólicas tais como redução de sulfato,
remoção de fosfato, desnitrificação, desalogenação e metanogênese, habilidades importantes
no âmbito da biotecnologia ambiental. Além das capacidades individuais, micro-organismos
em ambientes naturais ou em biorreatores existem, na maioria das vezes, em forma de
comunidades, situação onde são imprescindíveis à sobrevivência os fenômenos de
sintrofismo, transferência horizontal de genes e comunicação celular, para os quais as
informações ainda são escassas. Nesse sentido, como ferramentas para a prospecção de dados
relativos ao potencial das comunidades microbianas e à sua atividade em diferentes
ecossistemas foram desenvolvidas as áreas de metagenômica, metatranscriptômica,
metametabolômica e metaproteômica (MARON et al., 2007; LACERDA e REARDON,
2009). Siggins e colaboradores (2012) ressaltam a complementariedade dos dados obtidos
nesses quatro níveis de investigações biológicas e também que o entendimento da
funcionalidade de ecossistemas naturais pode ser obtido confrontando-se essas informações
(Figura 4).
18
Zorel, J. A.
Introdução
Figura 4: Diferenciação entre o potencial e a atividade de uma microbiota e abordagem sistemática para a
caracterização de ecossistemas microbianos. Adaptado de Maron et al., 2007 e Siggins et al., 2012.
Das quatro áreas supracitadas, a metagenômica foi a primeira a ser desenvolvida e
pode ser definida como a análise cultura-independente do genoma de comunidades
microbianas, na qual grandes fragmentos de DNA são clonados de um determinado ambiente.
A nomenclatura une o termo ‘meta’ deriva do conceito estatístico de meta-análise, processo
de combinação de análises separadas, e ‘genômica’, análise do material genético de
determinado organismo. A análise de sequências gênicas conservadas (16S rRNA, nif e recA)
fornece informações sobre a diversidade, a filogenia e a evolução dos micro-organismos
dominantes em um ambiente, ao passo que a construção de bibliotecas genômicas possibilita a
captura de operons e grupos de genes que codificam para rotas metabólicas envolvidas na
síntese de moléculas de interesse comercial (SCHLOSS e HANDELSMAN, 2003). Além
disso, a abordagem shotgun acoplada ao piro-sequenciamento permite detectar procariotos
raros presentes em culturas mistas, independentemente de primers específicos (PETROSINO
et al., 2009). Em contraste à proficiência para a geração de dados sobre a potencialidade do
genoma, estratégias focadas apenas no sequenciamento do DNA não fornecem informações
sobre a funcionalidade desse. Como alternativa, a metatranscriptômica (análise do RNA de
todos os micro-organismos presentes em um ecossistema) possibilita inferir sobre o que, de
toda a carga genética microbiana, está sendo expresso. No entanto, a limitada meia-vida do
RNA, a dificuldade em eliminar contaminantes do processo de extração e a baixa correlação
19
Zorel, J. A.
Introdução
entre os níveis de mRNA e a síntese das proteínas correspondentes estimulam a caracterização
metaproteômica de comunidades complexas (MARON et al., 2007).
1.5. Metaproteômica
O termo proteômica abrange estudos em larga escala das proteínas expressas por um
organismo. Já a área da metaproteômica (ou proteômica ambiental) é definida como a
“caracterização em larga-escala de todas as proteínas de uma microbiota ambiental em um
determinado ponto no tempo”, visto que leva em consideração as interações bióticas (entre os
micro-organismos) e abióticas (entre micro-organismos e seu ambiente natural), as quais
governam a ecologia das comunidades microbianas in situ (MARON et al., 2007; WILMES e
BOND, 2004). A complexidade dessas comunidades faz com que alguns autores as
classifiquem como um ‘metaorganismo’, pois a diversidade do seu proteoma se compara à de
um eucarioto pluricelular (LACERDA e REARDON, 2009). Além disso, devido à matriz da
qual as amostras são retiradas, um dos grandes desafios da proteômica ambiental é o
estabelecimento de protocolos efetivos de extração de proteínas que sejam compatíveis com
as técnicas de identificação empregadas atualmente (SCHULZE et al., 2005). Apesar dessa
dificuldade, nos últimos anos alguns trabalhos mostram o potencial da aplicação da
proteômica para o entendimento da funcionalidade e da dinâmica microbiana em diferentes
ambientes, como solo, sedimentos, ecossistemas aquáticos, trato intestinal humano e reatores
de tratamento biológico de efluentes (SIGGINS et al., 2012). Para isso, dentro das limitações
para cada ecossistema, o tratamento da amostra consiste das etapas de: coleta e separação da
fração de interesse, extração de proteínas, separação e fracionamento, análise por
espectrometria de massas e busca em bancos de dados ou síntese de novo de peptídeos (Figura
5; STEEN e MANN, 2004; SIGGINS et al., 2012).
O fluxograma e os protocolos escolhidos para cada fase são extremamente
dependentes do tipo de ionização empregada na fase de análise por espectrometria de massas.
Essa ionização pode ser conseguida pelas técnicas de MALDI (Matrix Assisted Laser
Desorption and Ionization) ou ESI (Electrospray Ionization), sendo que as fontes de
ionização ESI são amplamente empregadas devido à possibilidade de seu uso on-line com a
separação dos peptídeos por cromatografia, servindo de interface entre o cromatográfo e o
espectrômetro de massas (STEEN e MANN, 2004; KELLER e HETTICH, 2009). Desse
modo, as etapas do tratamento da amostra citadas abaixo são focadas nas análises proteômicas
20
Zorel, J. A.
Introdução
realizadas por sistemas de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LCMS; Figura 5).
Figura 5: Fluxograma de análises metaproteômicas (A). Cromatograma de separação dos peptídeos, espectro de
massas de uma fração dos peptídeos e MS/MS de um determinado íon (B).
Amostras de proteínas microbianas coletadas em ambientes naturais, especialmente
em ecossistemas aquáticos, são encontradas em concentrações muito baixas, sendo necessário,
portanto, etapas de concentração – usualmente por filtração ou liofilização – mais severas do
que as empregadas para materiais obtidos de culturas em laboratório (SCHULZE et al., 2005;
MORRIS et al., 2010; WANG et al., 2011). Nos casos em que se deseja estudar uma parte
específica do proteoma (intra ou extracelular), simultaneamente à coleta é realizada a
separação da fração de interesse. Geralmente, antes da lise das células, a biomassa passa por
procedimentos de lavagem, para a remoção de polímeros e demais contaminantes da matriz
extracelular (WILMES e BOND, 2004). Por outro lado, quando o objeto de estudo são as
proteínas que compõem a matriz, diferentes métodos de extração são empregados, sendo que
cada um deles solubiliza preferencialmente uma fração do proteoma dos EPS (PARK et al.,
2008).
21
Zorel, J. A.
Introdução
Após a obtenção das amostras, os métodos empregados para a extração proteica
variam de acordo com a complexidade da amostra. Em ambientes de composição conhecida, a
extração pode ser realizada por protocolos simples, que compreendem um menor número de
etapas e que consistem basicamente, no caso do proteoma intracelular, da lise (por french
press ou ultrassonicação), seguida da concentração do material desejado (WILMES e BOND,
2004; ABRAM et al., 2009). Para proteínas componentes dos EPS ou encontradas ligadas à
membrana de MBR, os polipeptídeos são separados de carboidratos e outros biopolímeros por
meio de sua precipitação com sulfato de amônio e posterior diálise, para a remoção do sal
(PARK et al., 2008; HUANG et al., 2012). Amostras mais complexas, tanto no que diz
respeito à variedade da microbiota quanto à composição do ambiente de origem, exigem
procedimentos com um maior número de passos para a obtenção de pools proteicos
representativos e passíveis de análise. Esses procedimentos são comumente encontrados em
estudos sobre o proteoma de solos ou biorreatores que tratam resíduos compostos
(BENNDORF et al., 2007; HANREICH et al., 2012). Mesmo para reatores de bancada
alimentados com água residuária sintética (de composição conhecida e com baixo número de
contaminantes), a presença de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas requer a
combinação de métodos físicos e químicos distintos para alcançar a lise completa dos microorganismos (LACERDA et al., 2007). Apesar das inúmeras fases de lavagem e precipitação
das amostras proteicas de comunidades naturais, ao final do processo de preparação ainda
existe a contaminação dessas por ácidos húmicos, como pode ser notado pela coloração
escura do extrato e pelo background elevado em géis SDS-PAGE (BASTIDA et al., 2009;
HANREICH et al., 2012). Além da co-purificação desse contaminante, sua presença em
grandes concentrações parece ser um problema específico da proteômica ambiental, visto a
ausência de protocolos específicos para a sua remoção (BODZON-KULAKOWSKA et al.,
2007; CAÑAS et al., 2007).
A separação e o fracionamento dos extratos proteicos são procedimentos úteis para
aumentar a resolução da identificação por espectrometria de massas e, para os protocolos que
fazem uso de géis 2D, servem também para verificar o nível de expressão de proteínas
específicas (KHALSA-MOYERS e MCDONALD, 2006). Essa etapa da análise mostra-se de
especial importância para a metaproteômica, visto o grande número de proteínas presentes em
amostras ambientais, e é realizada por métodos cromatográficos ou eletroforéticos
(SCHNEIDER e RIEDEL, 2010). O uso de géis SDS-PAGE diminui a concentração de
contaminantes que podem interferir nas etapas posteriores e, no caso dos géis 2-D, possibilita
22
Zorel, J. A.
Introdução
a comparação dos perfis de expressão proteicos em diferentes situações. Apesar do alto poder
de resolução dos géis 2-D PAGE, proteínas que possuem valores extremos de ponto
isoelétrico (pI, muito básico ou muito ácido), alta hidrofobicidade (como proteínas de
membrana), baixa solubilidade, baixa massa molecular ou aquelas menos abundantes são subrepresentadas nos géis (WILKINS et al., 1998; GYGI et al., 2000; TOMANEK, 2011).
Como alternativa aos métodos eletroforéticos, é empregada a separação por colunas
cromatográficas, as quais podem ser utilizadas tanto para a separação das misturas proteicas
(previamente à proteólise enzimática) quanto para os peptídeos digeridos. O fracionamento da
amostra é realizado por HPLC (High Performance Liquid Chromathography), é baseado na
afinidade dos analitos pelas fases móvel e estacionária e depende, para cada tipo de coluna, de
características como tamanho, carga, especificidade e hidrofobicidade. A resolução das
amostras pode ser aumentada pela separação multi-dimensional das proteínas por meio da
combinação de colunas de diferentes tipos, como troca catiônica/fase reversa, troca
aniônica/fase reversa e interação hidrofílica/fase reversa (BODZON-KULAKOWSKA et al.,
2007; SCHNEIDER e RIEDEL, 2010). As amostras fracionadas são então submetidas à
análise em espectrômetro de massas para a identificação das proteínas. Para isso, as proteínas
são digeridas enzimaticamente, os peptídeos gerados são separados e ionizados e é realizada a
análise de suas relações massa/carga (m/z; KARPIEVITCH et al., 2010). O primeiro passo do
processo, a digestão proteica, gera uma mistura de peptídeos de manuseio e identificação mais
simples do que as proteínas de origem (RAPPSILBER e MANN, 2002). A digestão pode ser
realizada in-gel (para bandas ou spots advindos de géis) ou para amostras em solução (insolution digestion; CAÑAS et al., 2007). Na maioria dos trabalhos, a protease tripsina é
empregada para a conversão de proteínas em peptídeos. Devido sua alta estabilidade e
especificidade, a clivagem ocorre sempre nos resíduos de lisina e arginina, gerando peptídeos
dentro de uma faixa de massas adequada para seu sequenciamento (STEEN e MANN, 2004).
Para análises pela metodologia LC-MS, os peptídeos trípticos são então introduzidos no
cromatógrafo e separados em colunas C-18 (fase reversa) ou em combinações de colunas de
troca catiônica e fase reversa (AEBERSOLD e MANN, 2003).
Essa separação diminui o número de peptídeos que alcança a fonte de ionização ao
mesmo tempo, aumentando a sensibilidade da espectrometria. No caso da ionização por
fontes ESI, diferentes cargas são atribuídas aos peptídeos através da aplicação de uma
diferença de potencial elétrico entre a saída da coluna cromatográfica e a entrada do
analisador de massas (MANN et al., 2001). Atualmente, existem cerca de 20 tipos diferentes
23
Zorel, J. A.
Introdução
de analisadores os quais, por meio de princípios distintos, realizam a análise das relações m/z
dos peptídeos. Por fim, o sequenciamento dos peptídeos é obtido por meio da fragmentação
dos íons analisados (denominados precursores) e nova obtenção das relações massa/carga,
metodologia denominada de espectrometria de massas em tandem ou MS/MS. Como cada
resíduo de aminoácido possui uma massa única, com exceção da leucina e da isoleucina, é
possível indicar qual a sequência dos peptídeos analisados (DOMON e AEBERSOLD, 2006;
KARPIEVITCH et al., 2010).
Os espectros obtidos são confrontados com bancos de dados através de softwares de
busca, como SEQUEST, X!TANDEM ou MASCOT. Tais programas identificam as proteínas
correspondentes aos peptídeos sequenciados por meio da comparação dos dados
experimentais com proteínas traduzidas in silico a partir de bancos de dados genômicos.
Desse modo, o rendimento dos trabalhos de proteômica ambiental depende fortemente de
estudos metagenômicos. Além da comparação dos espectros, a identificação dos peptídeos
pode ser feita por meio do sequenciamento de novo, que consiste na análise das diferenças das
massas entre o íons gerados à partir da fragmentação de um íon precursor. Ao final da
identificação proteômica, os resultados obtidos são confrontados com demais dados sobre a
microbiota estudada e fornecem informações relevantes quanto à comunidade presente bem
como quanto à funcionalidade dessa (Figura 5; KARPIEVITCH et al., 2010; MARON et al.,
2007).
1.6. Proteômica do tratamento biológico de efluentes
Wilmes e Bond (2004), visando à caracterização dos micro-organismos envolvidos na
remoção de fosfato inorgânico em reatores EBPR (Enhanced Biological Phosphorus
Removal), realizaram os primeiros trabalhos de proteômica em comunidades de reatores de
tratamento biológico. Devido aos problemas enfrentados com amostras desse tipo, o
mapeamento do proteoma dessas comunidades por 2D-PAGE foi conseguido por meio da
otimização de protocolos de extração e do fracionamento das proteínas com diferentes
tampões. Entre as proteínas identificadas por espectrometria de massas, algumas
corroboraram com os grupos microbianos encontrados no mesmo trabalho por FISH
(Fluorescence In Situ Hibridization), no entanto, devido à escassez de dados metagenômicos
para os micro-organismos em questão, essa identificação só foi conseguida através do
24
Zorel, J. A.
Introdução
sequenciamento de novo dos espectros de massa encontrados, limitando o número de
identificações.
Trabalhos posteriores do mesmo grupo (WILMES et al., 2008a,b) evidenciaram a
interdependência das áreas de metagenômica e metaproteômica, de modo que após o
sequenciamento shotgun do genoma do lodo envolvido na remoção de fosfato (GARCÍA
MARTÍN et al., 2006), o número de proteínas identificadas e de suposições acerca de suas
funções aumentaram significativamente. A comparação dos dados proteogenômicos permitiu
inferências sobre a expressão de proteínas homólogas por diferentes linhagens e a construção
de novas rotas metabólicas relacionadas ao acúmulo de fosfato. Além disso, a quantificação
relativa de algumas dessas enzimas forneceu evidências de que essas exerceriam papéis
bifuncionais, atuando nas fases de consumo/acúmulo de fosfato, sendo reguladas pela
expressão ou modificação pós-traducional de enzimas-chave, a exemplo do que ocorre para
vias como a glicólise e a gliconeogênese.
Além das vias metabólicas ligadas à homeostase celular, mudanças rápidas na
fisiologia de comunidades mistas em resposta às perturbações ambientais podem ser
detectadas por análises proteômicas, como mostrado por Lacerda e colaboradores (2007).
Nesse trabalho, alterações do perfil de expressão de proteínas em decorrência da presença de
cádmio puderam ser reveladas – por meio de 2D-PAGE – após 15 minutos do estresse
causado pela adição do metal ao meio, um intervalo curto para ser detectado pela análise
filogenética comumente empregada para comunidades naturais. Em concordância com
trabalhos anteriores realizados com culturas puras, que mostram a ação do cádmio sobre
vários alvos celulares, foi observada a expressão diferencial de proteínas de diferentes
funções, entre as quais: metabolismo energético (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenas e
enolase), transporte e secreção de íons (ATPases), síntese proteica (proteínas ribossomais) e
reparo do DNA (metilases). Através da análise temporal da expressão dessas proteínas após o
choque, os autores observaram a regulação proteica envolvida nas três etapas de resposta ao
estresse: resistência (expressão aumentada logo após o choque e diminuída ao final do
ensaio), adaptação (expressas ao final do ensaio) e tolerância (expressas após o choque e
mantidas até o final do ensaio).
Somadas às enzimas responsáveis pela conversão de poluentes ou manutenção dos
processos celulares, as proteínas que compõem a matriz extracelular (EPS) da biomassa
podem influenciar no desempenho de estações de tratamento biológico. As proteínas são os
componentes orgânicos predominantes entre os biopolímeros que constituem os EPS, sendo
25
Zorel, J. A.
Introdução
importantes para a granulação/floculação e sedimentação do lodo (FROLUND et al., 1996;
PARK et al., 2008). Como essas proteínas se mantêm unidas aos demais compostos que
compõem a matriz através de interações distintas, diferentes frações proteicas podem ser
liberadas dependendo do protocolo empregado para sua extração. Como exemplo, Park e
colaboradores (2008), ao empregarem três métodos distintos de extração de EPS para lodo
ativado de estações de tratamento reais, mostraram que as proteínas obtidas por cada um dos
métodos apresentam diferenças de massa molecular e hidrofobicidade. Além disso, os perfis
de SDS-PAGE distintos para cada um dos extratos mostra a existência do que os autores
denominaram “subproteomas” do EPS. A posterior identificação de algumas das bandas por
LC-MS/MS indica que proteínas relacionadas à defesa bacteriana, apêndices celulares,
membrana externa, materiais intracelulares e até mesmo proteínas do afluente seriam
componentes importantes para a formação dos flocos e sedimentação da biomassa. Em um
trabalho paralelo, o mesmo grupo demonstrou que essas proteínas apresentam níveis de
digestibilidade variados e que diferentes frações proteicas são degradadas dependendo do tipo
de tratamento – se aeróbio ou anaeróbio – empregado para a digestão do lodo. Tais dados
mostram-se de grande importância em estações de escala industrial, visto que o conhecimento
dos fatores que levam a produção de proteínas com menor biodegradabilidade e o uso de
processos de digestão aeróbio-anaeróbio em série pode aumentar a eficiência da digestão da
biomassa previamente ao seu descarte (PARK e HELM, 2008).
Contribuições para o aperfeiçoamento de biorreatores de membrana também podem
ser obtidas através de análises proteômicas. Huang e colaboradores (2012), com o uso de
SDS-PAGE e LC-MS/MS, determinaram as principais proteínas responsáveis pelo fouling de
módulos de membrana compostos por três materiais diferentes (PAN, PVDF e PTFE)
inseridos no mesmo reator aeróbio. Foram identificadas proteínas ubíquas e também proteínas
aderidas especificamente a cada uma das três membranas. Essa seletividade de ligação estaria
relacionada principalmente com a similaridade de hidrofobicidade entre proteínas e
membranas. Em sua maioria, o material ligado aos módulos seria proveniente do decaimento
da biomassa, visto que foram encontradas diversas proteínas intracelulares como a malato
desidrogenase, a subunidade alfa da RNA polimerase e fatores de elongação. Além disso,
grande parte dos peptídeos identificados corresponderam à proteína groL, uma chaperonina
que tem como função a estabilização e a renaturação de proteínas danificadas e que serviria
também como indicador de condições de estresse no interior do reator. O estudo das
propriedades das proteínas encontradas em maior abundância pode auxiliar no projeto de
26
Zorel, J. A.
Introdução
membranas que apresentem menor afinidade por esses biopolímeros e que sejam, portanto,
menos susceptíveis à colmatação.
Abram e colaboradores (2009 e 2011) realizaram os primeiros estudos de
metaproteômica em reatores anaeróbios tratando água residuária sintética com glicose. No
primeiro dos trabalhos, os autores mostram a necessidade do desenvolvimento de técnicas
específicas para a extração de proteínas de lodo anaeróbio, demonstrando que protocolos de
lise celular que fazem uso da sonicação apresentam qualidade superior àqueles baseados em
french press, comumente aplicados para lodo aeróbio. Posteriormente, a aplicação dessa
técnica de extração para células oriundas de reatores LTAD (low temperature anaerobic
digestion, operados a 15 °C) propiciou a identificação de vias metabólicas bem como dos
micro-organismos presentes. Curiosamente, diferenças foram encontradas quanto à filogenia
dos grupos microbianos predominantes quando comparados os dados de proteômica e de
sequenciamento do gene 16S rRNA, também realizado no trabalho. Como a metodologia
empregada baseou-se na seleção das proteínas mais abundantes, devido a separação e seleção
dessas por 2D-PAGE, as análises por proteômica identificaram a fração metabolicamente
ativa e mais abundante do genoma microbiano. Entre as proteínas identificadas, figuram
enzimas pertencentes à via das pentoses (transcetolase) e à glicólise (gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase e enolase), rotas metabólicas envolvidas na degradação do substrato usado na
alimentação do reator. Além disso, foram encontradas enzimas envolvidas na metanogênese
hidrogenotrófica (tetrahidrometanopterina-S-metiltransferase) e acetoclástica (acetil-CoA
descarbonilase), de modo que arquéias dos gêneros Methanothermobacter, Methanosaeta e
Methanosarcina,
seriam
suas
principais
produtoras.
Interessantemente,
o
gênero
Methanosarcina também foi encontrado por Hanreich e colaboradores (2012) ao analisarem o
proteoma intracelular de um consórcio microbiano anaeróbio termofílico alimentado com
resíduos da produção de beterraba e arroz. Por outro lado, nenhum representante do gênero
Methanosaeta parece atuar em reatores operados a 55 °C. Esses dados mostram que a
proteômica é uma ferramenta útil para a análise da dinâmica microbiana em reatores
anaeróbios, visto que corroboram com resultados de estudos genômicos, os quais também
demonstraram a maior adaptabilidade térmica do gênero Methanosarcina em comparação ao
gênero Methanosaeta (KRAKAT et al., 2010). Além disso, a identificação e o monitoramento
dos níveis de expressão de enzimas chave para a produção de metano, como a metil-CoM
redutase, podem ser correlacionados à taxa de produção de biogás, servindo como um
indicador das condições operacionais (HANREICH et al., 2012).
27
Zorel, J. A.
Introdução
A união de dados genômicos e proteômicos também possibilitou a identificação dos
micro-organismos responsáveis pela degradação anaeróbia de tolueno, revelando a
persistência de diferentes grupos microbianos, mesmo após a cultura ser alimentada com uma
única fonte de carbono por aproximadamente dez anos (JEHMLICH et al., 2010). A
homeostase do processo, ou seja, a completa mineralização do substrato – e sua consequente
oxidação a dióxido de carbono – seria mantida por meio de fenômenos de sintrofia e
mutualismo entre as bactérias que oxidam tolueno e bactérias fermentativas que fazem uso
dos metabólitos liberados durante a degradação desse. Por fim, debris celulares seriam
consumidos por bactérias predadoras. Um resumo dos trabalhos de metaproteômica do
tratamento anaeróbio pode ser encontrado na tabela 3.
Apesar do crescente número de trabalhos acerca do proteoma de comunidades naturais
presentes em biorreatores, os dados encontrados na literatura referem-se às proteínas
intracelulares ou àquelas presentes na matriz polimérica extracelular (ABRAM et al., 2011;
PARK et al., 2008; SIGGINS et al., 2012), de modo que as proteínas solúveis liberadas
durante o metabolismo microbiano permanecem desconhecidas.
28
AL., 2008A,B
metabolismo de nitrogênio e carbono; estrutura ribossomal;
29
JEMLICH ET
AL., 2010
ABRAM ET
AL. 2011
Redução de sulfato; metabolismo de tolueno; metabolismo
de carbono
Via das pentoses; glicólise, metanogênese acetoclástica e
hidrogenotrófica; trasncrição
Digestão anaerobia de
tolueno/Intracelular
LTAD/Intracelular
de membrana
CSTR anaeróbio
MBR aeróbio/Módulo
metanogênese acetoclástica e hidrogenotrófica
Metabolismo energético; resposta ao estresse;
fatores de elongação; síntese de ATP
ET AL., 2012
HANREICH
AL., 2012
HUANG ET
2008A,B
do afluente
Resposta ao estresse; proteínas de membrana;
PARK ET AL.,
Lodo Ativado/EPS
desconhecida
Defesa; apêndices celulares; membrana externa; proteínas
ciclo de Krebs; mecanismos de defesa; proteínas de função
WILMES ET
Transporte e metabolismo de fosfato; transdução de sinal;
EBPR/Intracelular
BOND, 2004
WILMES E
Referência
Transporte; síntese proteica, metabolismo energético
Funções das proteínas encontradas
EBPR/Intracelular
Ambiente/Amostra
Tabela 3: Resumo dos trabalhos de metaprotêomica do tratamento biológico de resíduos.
Zorel, J. A.
Introdução
2. Justificativa
Zorel, J. A.
Justificativa
Justificativa
2. JUSTIFICATIVA
A exploração de bens naturais e a geração de resíduos são fatores intrínsecos de
praticamente todas as atividades humanas. Nesse sentido, é crescente a busca de fontes
renováveis e de meios para diminuir a produção de poluentes. A digestão anaeróbia apresentase como uma vertente biotecnológica que alia a degradação de subprodutos indesejáveis à
produção de bens com valor agregado, entre eles compostos químicos de interesse comercial e
produtos com alto conteúdo energético. Não obstante essa conversão ser realizada por microorganismos, o conhecimento e os avanços na área estão relacionados principalmente à
engenharia do processo, de modo que as informações sobre os componentes biológicos são
ainda incipientes.
A complexidade da comunidade microbiana e o fato de que muitos dos microorganismos que a compõem não são cultiváveis eram, até as últimas décadas, as razões para a
escassez de estudos sobre esses. Mudanças nesse quadro surgiram após o desenvolvimento de
análises cultivo-independentes e a adequação dessas aos ambientes naturais, oferecendo
oportunidades de investigação molecular de diferentes ecossistemas.
Nesse sentido, esse trabalho busca analisar o proteoma de processos de digestão
anaeróbia. Nesses sistemas, além de suas funções celulares, as proteínas exercem papéis que
influenciam no sucesso do tratamento tanto positivamente, como na formação do biofilme e
hidrólise extracelular de resíduos, quanto negativamente, como nos casos em que fazem parte
do material recalcitrante no efluente de reatores. Apesar dessa importância, informações
acerca de proteínas extracelulares – sejam componentes da matriz extracelular ou liberadas
em solução – ainda são escassas.
31
3. Objetivos
Zorel, J. A.
Objetivos
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Identificar as proteínas produzidas por microrganismos durante a degradação
anaeróbia da matéria orgânica.
3.2. Objetivos específicos
1. Analisar a influência de métodos de extração distintos no estudo de proteínas EPS
presentes em lodo anaeróbio e caracterizar essas proteínas.
2. Identificar a origem de proteínas SMP, se provenientes de lise celular ou hidrólise
de EPS em reator UASB alimentado com glicose.
3. Caracterizar proteínas SMP em sistemas anaeróbios operados sob diferentes
condições de alimentação e temperatura.
4. Identificar, por meio de técnicas proteômicas, micro-organismos envolvidos na
degradação de glicerol em reator UASB.
33
4. Materiais e Métodos
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Fluxograma de análises
As metodologias empregadas nesse trabalho visaram à extração de proteínas oriundas
de diferentes frações de lodo anaeróbio, envolvido na degradação de diferentes fontes de
matéria orgânica, com posterior tentativa de caracterização e identificação dessas proteínas.
Um resumo das amostras coletadas e da sequência de atividades pode ser visto na figura 6.
Figura 6: Fluxograma de análises das amostras proteicas.
4.2. Extração de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e precipitação da
fração proteica
A extração de EPS foi realizada empregando-se oito diferentes métodos encontrados
na literatura. Previamente a cada extração, 100 mL (2,2 gramas de sólidos suspensos voláteis)
35
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
de lodo foram centrifugados (5800 g por 25 minutos) e, com exceção das extrações por resina
de troca catiônica e sulfeto de sódio, foram ressuspendidos em 100 mL de solução de NaCl
0,05% (m/v) com auxílio de vórtex. Após a extração, as amostras foram novamente
centrifugadas e o sobrenadante coletado. Para a precipitação das proteínas, a 30 mL do
sobrenadante foram adicionados 18,04 g de sulfato de amônio (Sigma) (para uma saturação de
90% de sulfato de amônio) e os tubos foram incubados em gelo por 16 horas. A precipitação
foi completada pela centrifugação das amostras a 20.000 g por 30 minutos (centrífuga Sorvall
5C). Para a remoção do sal, as amostras foram ressupendidas e dializadas contra água
deionizada por 72 horas a 4 °C, em membranas de diálise de 3,5 kDa (Thermo). Para a
concentração das amostras, essas foram congeladas e liofilizadas.
4.2.1. Centrifugação (D’ABZAC et al., 2010)
A extração por centrifugação foi escolhida como um método controle, visto que é
comum a todos os métodos empregados e foi realizada como descrito acima, sendo coletado
apenas o sobrenadante resultante da segunda etapa de centrifugação.
4.2.2. Aquecimento (LI e YANG, 2007)
Aos tubos contendo o lodo foram adicionados 50 mL de solução de NaCl 0,05%
previamente aquecida a 70 °C. As amostras foram agitadas por 1 minuto em vórtex e
mantidas em banho-maria a 70 °C por 30 minutos.
4.2.3. Formaldeído (D´ABZAC et al., 2010)
Foi adicionado formaldeído (37%) às amostras na proporção de 60 µL para cada 10
mL de lodo. Para a extração, as amostras foram incubadas a 4 oC por 1 hora, com agitação
manual periódica a cada 30 minutos.
Apesar do emprego de formaldeído ser comum para protocolos de extração de EPS, é
importante ressaltar que esse composto pode realizar ligações cruzadas com biopolímeros
(FOX et al., 1985). Esse fato deve ser levado em consideração durante a análise de proteínas
por espectrometria de massas, pois pode alterar a massa de alguns peptídeos e, dessa forma,
36
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
impedir ou invalidar a identificação proteica. A despeito da baixa concentração empregada
nesse trabalho, a ocorrência de cross-linkinkg não pode ser descartada, visto que não foram
encontrados na literatura relatos sobre um valor de concentração mínimo de formaldeído que
não acarrete nesse fenômeno.
4.2.4. Formaldeído e Aquecimento (D´ABZAC et al., 2010)
Para essa extração, as duas metodologias descritas acima foram empregadas em
sequência, sendo primeiramente realizada a extração por formaldeído.
4.2.5. EDTA (D´ABZAC et al., 2010)
Ao lodo ressuspendido em solução salina, foram adicionados 100 mL de solução de
EDTA 2% (m/v) pH 7,5 e os frascos foram incubados à 4 °C por 3 horas, com agitação
manual periódica a cada 1 hora.
4.2.6. Hidróxido de sódio (PARK et al., 2008)
Com auxílio de uma solução de NaOH 1M, o pH da solução foi ajustado para 10. Em
seguida, o frasco de extração foi lacrado e purgado com nitrogênio gasoso por 15 minutos. A
extração foi realizada por meio de agitação em gelo, com uso de agitador magnético, por 1
hora.
4.2.7. Resina de troca catiônica (CER; FRØLUND et al., 1995)
A extração por meio de CER foi realizada de acordo com o proposto por Frolund e
colaboradores (1995) empregando-se a resina Dowex® Marathon® C, Na+-Form (SigmaAldrich). Previamente à extração, a resina foi pesada na proporção de 65 g/g SSV e mantida
sob agitação, com auxílio de agitador magnético, por 1 hora, em gelo e ao abrigo da luz, em
solução salina tamponada (PBS) pH 7,8 (KH2PO4 2mM, Na2PO4 6 mM e NaCl 10mM ), para
remoção de impurezas. Após a lavagem, a resina foi adicionada ao lodo, também
37
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
ressuspendido em PBS, e os frascos de extração foram mantidos sob agitação por 1 hora, em
gelo ao abrigo da luz.
4.2.8. Sulfeto de sódio (NIELSEN e KEIDING, 1998)
O lodo foi ressuspendido em solução de Na2S 6 mM pH 7,5. Em seguida, o frasco de
extração foi lacrado e purgado com nitrogênio gasoso por 15 minutos. A extração foi
realizada por meio de agitação, com uso de agitador magnético, em gelo por 6 horas.
4.3. Quantificação de EPS
O rendimento das extrações de EPS foi verificado por meio da quantifcação de
proteínas e carboidratos. A concentração dos polímeros foi corrigida pela quantidade de
biomassa empregada e os resultados expressos na forma de mg/g sólidos suspensos voláteis
(SSV). A determinação de SSV foi realizada como descrito no item 4.3.3.
4.3.1. Quantificação de proteínas EPS
A quantificação de proteínas nos extratos de EPS foi realizada pelo método de Frolund
(FROLUND et al., 1995). Essa análise é derivada do método de Lowry (LOWRY et al., 1951)
com variações que levam em consideração a interferência de substâncias húmicas na
intensidade da cor apresentada pelas amostras ao final do ensaio. Para isso, a absorbância é
medida na presença e na ausência de sulfato de cobre, sendo que a coloração apresentada
pelas amostras na ausência de Cu2SO4 é devida principalmente as substâncias húmicas. Desse
modo, a absorbância relativa à quantidade de proteínas presente na amostra pode ser obtida
pela equação:
Aprot = 1,25 (A comCu2SO4 – A semCu2SO4)
Para a análise, a 500 µL de amostra foram adicionados 5 mL da solução de
complexação (98 mL de carbonato de sódio 2% (m/v) em NaOH 1M, 1 mL de tartarato de
sódio e potássio 2% (m/v) e, para uma das medidas, 1 mL de Cu2SO4 1% (m/v)). Após 10
minutos de incubação a temperatura ambiente, foram adicionados 500 µL do reagente de
38
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
Folin 1N, os tubos foram agitados e as amostras mantidas em repouso à temperatura ambiente
por 30 minutos. As leituras de absorbância foram realizadas a 575 nm e os valores de
concentração foram determinados com base em uma curva de calibração na faixa de 0 a 700
mg/L, tendo BSA como padrão. Todas as medidas foram realizadas em triplicata.
4.3.2. Quantificação de carboidratos EPS
O conteúdo de polissacarídeos das amostras de EPS foi aferido pelo método de Dubois
(DUBOIS et al., 1956). Para a quantificação, a 500 µL das amostras foram adicionados 500
µL de formol 5% (m/v) e 2,5 mL de H2SO4. Após 10 minutos de repouso a temperatura
ambiente, os tubos foram agitados e incubados em banho-maria a 30 °C por 15 minutos. A
absorbância foi lida a 488 nm e a concentração de carboidratos foi determinada pela
comparação com uma curva padrão de glicose, na faixa de 0 a 200 mg/L. Todas as medidas
foram realizadas em triplicata.
4.3.3. Determinação de sólidos suspensos voláteis (SSV)
A análise de SSV foi realizada para estimar a concentração de biomassa empregada
nos ensaios de digestão anaeróbia. Para isso, os cadinhos de porcelana empregados foram
previamente levados à mufla a 550
o
C por 1 hora e mantidos em estufa a 105
o
C por 15
minutos. Após intervalo de 15 minutos de resfriamento em dessecador, os cadinhos foram
pesados. Amostras em triplicata de lodo anaeróbio (20 mL) foram centrifugadas a 1850 g por
20 minutos, ressuspendidas em água destilada e adicionadas aos cadinhos. Os mesmos foram
incubados a 105 oC por 24 horas. Em seguida, os cadinhos contendo as amostras secas foram
novamente pesados e submetidos à combustão e evaporação da fração orgânica em mufla
(550 oC por 2 horas). Após incubação por 15 minutos a 105 oC e resfriamento em dessecador,
a massa dos cadinhos foi aferida. A diferença entre o peso seco e o peso após a etapa de
evaporação, corrigidos pelo volume, corresponde à concentração de sólidos suspensos
voláteis (APHA, 1998).
39
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
4.4. Cromatografia de exclusão molecular dos EPS
O tamanho dos compostos presentes nos EPS extraídos foi avaliado por meio de
cromatografia de exclusão (SEC – Size Exclusion Chromatography). Para isso, uma alíquota
de 100 µL dos extratos, previamente filtrados em membranas de 0,45 µm, foi injetada em um
sistema HPLC (Shimadzu 20 A) equipado com uma coluna Biosep SEC-S 2000 (300 mm x
7,8 mm). A separação foi realizada durante 20 minutos, na temperatura de 25 °C e
empregando-se como fase móvel tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 na vazão de 1,0 mL/min. A
leitura das amostras foi realizada com auxílio de um detector UV/VIS SPD-20A (Shimadzu)
no comprimento de onda de 254 nm. Padrões de uridina (0,25 kDa), ovalbumina (44 kDa),
álcool-desidrogenase (150 kDa) e tiroglobulina (669 kDa) foram usados para calibrar o
sistema e a massa molecular dos compostos extraídos foi estimado por meio da relação com
esses padrões.
4.5. Obtenção de SMP
Para a análise de SMP foram estudadas soluções provenientes de diferentes sistemas
de digestão anaeróbia, os quais são detalhados nos itens 4.5.1, 4.5.2 e 4.5.3.
4.5.1. Reator UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket)
Amostras de lodo e SMP foram coletadas de um reator UASB (Upflow Anaerobic
Sludge Blanket) construído em PVC, com volume de trabalho de 3,5 L (Figura 7). O reator foi
inoculado com 0,8 litros de lodo anaeróbio (10 g/L de SSV) coletado de um reator UASB
operado em escala de demonstração e alimentado com esgoto sanitário bruto, em operação no
Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) UFMG/COPASA (Belo
Horizonte, Minas Gerais, Brasil).
40
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
Figura 7: Diagrama esquemático do reator UASB em escala de bancada.
O reator foi alimentado continuamente por meio de bomba peristáltica e a temperatura
mantida constante a 35 °C com auxílio de um termostato. O pH no interior do reator foi
mantido na faixa entre 6,8 a 7,2 pela adição de NaHCO3 na solução de alimentação. A tabela
4 mostra a composição nutricional do afluente do reator.
Tabela 4: Solução nutricional (5X) utilizada para alimentação dos reatores e ensaios de
degradação anaeróbia.
Macro
Nutrientes
NH4Cl
(NH4)H2PO4
(NH4)2HPO4
MgCl2
CaCl2.H2O
NaHCO3
-
Concentração
(mg/L)
1.112,00
132,50
44,50
250,00
189,00
2.500,00
-
Micro
Nutrientes
FeCl3.6H2O
ZnCl2
MnCl2.4H2O
(NH4)6Mo7O24.4H2O
AlCl3.6H2O
CoCl2.6H2O
NiCl2.6H2O
H3BO3
CuCl2.2H2O
HCl
Concentração
(mg/L)
5,00
0,13
1,25
1,60
0,13
5,00
13,00
3,00
8,00
1 mL/L
Em uma primeira fase, o reator foi empregado para o tratamento de água residuária
sintética contendo glicose. Após coleta de amostras de SMP, o reator foi re-inoculado e
direcionado para o tratamento de água residuária sintética contendo glicerol. Nesta segunda
fase, o reator foi alimentado primeiramente com glicerol puro e, num segundo momento,
alimentado com resíduo bruto da produção de biodiesel. É importante ressaltar que, nessa
fase, foram coletadas tanto amostras de SMP quanto amostras de lodo.
41
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
4.5.2. Coleta dos SMP do reator UASB
Aproximadamente 200 mL da solução do interior do reator alimentado com glicose e
300 mL do reator tratando glicerol foram filtrados em membranas de acetato de celulose com
poro de 0,45 µm (Sartorius-Stedim), congelados e liofilizados. Devido à alta concentração de
bicarbonato de sódio, as amostras dos reatores UASB tratando glicerol foram ressuspendidas
em 10 mL de água deionizada e submetidas à diálise contra água em membranas de 3,5 kDa
(Thermo). Após nova etapa de liofilização, as amostras foram ressuspendidas em 100 µL de
água deionizada e estocadas a -20 °C até o momento do uso.
4.5.3. Reatores em batelada alimentada
Os ensaios em batelada foram realizados com o intuito de verificar a produção
diferencial de proteínas SMP em função de alterações operacionais. Para a obtenção de SMP
relacionados à fase de consumo do substrato foram testadas seis diferentes condições (Tabela
5):
Tabela 5: Condições dos ensaios em reatores em batelada.
Substrato
Glicose
Glicose
Glicose
Glicose
Glicose/Peptona
Peptona
A/M
0,2
0,2
0,2
0,02
0,2
0,2
Temperatura
25 °C
25 °C
35 °C
35 °C
25 °C
25 °C
Carvão Ativado
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
O lodo anaeróbio foi inoculado na concentração final de sólidos voláteis de 5 g/L
(determinados como descrito no item 4.3.3) em um meio contendo solução nutriente 1X
(Tabela 4). Os frascos foram selados, purgados com nitrogênio gasoso por 3 minutos e
incubados por 108 horas a 120 rpm. Com o intuito de garantir a razão F/M constante, o
substrato de cada um dos ensaios foi adicionado a cada 8 horas, de acordo com a taxa de
consumo de glicose determinada por HPLC (item 4.5.3.1).
Para a obtenção de SMP correspondentes à fase endógena (BAP), outro conjunto de
frascos foi inoculado com a mesma concentração inicial de sólidos e mantido por 10 dias a 25
42
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
°C e 120 rpm sem a adição de substrato. Todas as amostras foram centrifugadas, filtradas e
liofilizadas. Ao final, as amostras foram submetidas a fracionamento em fenol e precipitação
como descrito no item 4.6.
4.5.3.1. Determinação do consumo de glicose
O tempo necessário para o consumo total de glicose nos reatores em batelada foi
determinado pelo acompanhamento da degradação do substrato por cromatografia líquida de
alta eficiência (HPLC – High Performance Liquid Chromatography, Shimadzu 20 A). As
cromatografias foram realizadas na coluna de troca catiônica HPX-87P (BioRad). Como fase
móvel, foi utilizada água deionizada na vazão de 0,6 mL por minuto, a temperatura da coluna
foi mantida a 80
o
C, o volume de injeção foi de 20 µL e foi empregado o detector por
espalhamento de luz ELSD-LT II (Shimadzu). Foram construídas duas curvas analíticas,
abrangendo a faixa de concentração de 0 a 500 mg/L. Com o intuito de simular os
interferentes presentes nos ensaios, o sobrenadante do reator UASB tratando glicerol foi
utilizado como matriz para a diluição dos padrões de glicose.
4.6. Extração de proteínas intracelulares (HANREICH et al., 2012)
Para a extração das proteínas intracelulares, 10 mL de lodo foram coletados e
congelados a -20 ºC até o momento do uso. Após descongelamento, as amostras foram
centrifugadas (20 min, 6300 g a 4 ºC), ressuspendidas em tampão fosfato e sonicadas duas
vezes em gelo por 2 minutos (50% duty cycle, 20% power, Sonifier Branson). Em seguida, os
tubos foram novamente centrifugados e ao sobrenadante foram adicionados 15 mL de fenol
líquido (10 g de fenol e 1 mL de água deionizada). Os tubos foram mantidos sob agitação
(300 rpm) por 90 minutos a 20 °C ao abrigo da luz. Após centrifugação, a fase orgânica foi
coletada e lavada pela adição de 5 mL de água deionizada e novamente mantida sob agitação
(300 rpm, 20 °C, 10 min) ao abrigo da luz. Os tubos foram mais uma vez centrifugados e à
fase orgânica foram adicionados 4 volumes de acetato de amônio 0,1 M em metanol gelado. A
precipitação das proteínas foi realizada a -20 ºC por 16 horas e completada por centrifugação
a 6300 g por 95 min. O precipitado foi ressuspendido, com auxílio de banho de ultrassom, em
43
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
2 mL da mesma solução, incubado a -20 ºC por 15 minutos e centrifugado a 12000 g por 10
minutos a 4 ºC. As amostras foram lavadas por duas vezes em acetona 80% e uma vez em
etanol 70%. Entre cada etapa de lavagem as amostras foram incubadas a -20 ºC por pelo
menos 15 minutos. Os extratos foram estocados em etanol 70% a -20 °C e, no momento das
análises, novamente centrifugados e ressuspendidos em 25 µL de água deionizada.
4.7. Eletroforese SDS-PAGE
As amostras proteicas foram analisadas por meio de eletroforese em gel de
poliacrilamida em presença de SDS. Para isso, 10 µL das amostras juntamente com 10 µL de
tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, SDS 4% (m/v), glicerol 20%, DTT 200 mM) foram
incubados por 5 minutos a 100 o C e, em seguida, foram aplicados em gel de poliacrilamida
(gel de concentração 4% e gel de separação 12 %). As corridas foram realizadas a 200 V e 20
mA por aproximadamente 2 horas. Para posterior análise, os géis foram corados por Comassie
Brilliant Blue R-250 0,025% em solução de etanol 40% contendo 7% de Ácido Acético, por 2
horas. Após esse período, os géis foram descorados em solução de etanol 10% contendo 7%
de ácido acético, durante o tempo necessário para a resolução das bandas. Para melhorar a
visualização, alguns dos géis foram processados no programa BioNumerics (versão 6.6.8,
Applied Maths).
Para o gel mostrado na figura 13, adotou-se o método de coloração por Comassie
coloidal, como descrito no item seguinte.
4.8. Coloração por Coomassie Coloidal G-250
Após a eletroforese, o gel a ser corado com Coomassie Coloidal G-250 foi incubado,
sob agitação, overnight em 100 mL de solução de ácido ortofosfórico 2% (v/v) e etanol 30%
(v/v). Foram realizadas mais duas etapas de incubação, por 30 minutos, com a mesma
solução. Em seguida, o gel foi lavado por três vezes com 50 mL de ácido fosfórico 2% (v/v)
por 10 minutos. A coloração foi realizada pela adição de 100 mL de uma solução de ácido
ortofosfórico 2% (v/v), etanol 18% (v/v) e sulfato de amônio 15% (m/v) e 1 mL de
44
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
Coomassie Coloidal G-250 2% (m/v). Após 72 horas de coloração, o gel foi lavado por 5
minutos em etanol 20% para a retirada do excesso de Coomassie. O gel foi conservado até o
momento de excisão das bandas a 4 °C em solução de sulfato de amônio 25% (m/v).
4.9. Digestão das proteínas em gel para sequenciamento
As bandas foram excisadas e os fragmentos do gel depositados em tubos de
microcentrífuga com 1,3 mL de solução descorante (etanol 40%, 7% de Ácido Acético), os
quais foram incubados, sob agitação, a 37 oC por 24 horas, com sucessivas trocas do
descorante. Após esse período, os fragmentos do gel foram lavados duas vezes com 1 mL de
H2O deionizada. Para a redução das proteínas, 200 µL de ditiotreitol (DTT) 50 mM foram
adicionados às amostras e os tubos incubados por 30 minutos a 65 °C. A solução de redução
foi removida e, para a alquilação dos grupos sulfidrila, foram adicionados 200 µL de
iodoacetamida (IAA) 100 mM, seguida a incubação dos tubos por 45 minutos a temperatura
ambiente e ao abrigo da luz. Após a remoção da solução de IAA, os fragmentos do gel foram
lavados três vezes com 500 µL de solução de desidratação (bicarbonato de amônio 20
mM/acetonitrila 50%, pH 8,0), com incubação de 20 minutos a cada lavagem. Ao final da
etapa de desidratação, as amostras foram secas em Speed Vac por aproximadamente 3 horas.
A digestão das proteínas foi realizada, então, pela reidratação dos fragmentos do gel em 15
µL de solução de tripsina 30 ng/µL em bicarbonato de amônio 20 mM. Após 20 minutos de
incubação a temperatura ambiente, o excesso de tripsina foi removido e foram adicionados 35
µL de NH4HCO3 20 mM e os tubos foram incubados a 37 °C por 24 horas. Ao término da
digestão, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de microcentrífuga. Para a
recuperação dos peptídeos presentes no gel, 50 µL de TFA 0,1%/ACN 50% foram
adicionados aos fragmentos restantes, os quais foram mantidos a temperatura ambiente por 30
minutos. O sobrenadante foi coletado, combinado com o anterior, seco em centrífuga de
vácuo (Speed Vac, ThermoSavant) e ressupenso em 15 µL de ácido fórmico.
45
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
4.10. Digestão das proteínas em solução
Para a digestão em solução, 75 µL de uma solução de bicarbonato de amônio 50 mM
foram adicionados à 25 µL das amostras. A redução das proteínas foi realizada pela adição de
5 µL de DTT 200 mM (em NH4HCO3 100 mM) e incubação a 100 °C por 10 minutos. As
amostras foram mantidas a temperatura ambiente por 1 hora e, em seguida, 4 µL de IAA 1M
(em NH4HCO3 100 mM) foram adicionados aos tubos e estes foram incubados ao abrigo da
luz por 1 hora. A alquilação foi interrompida pela adição de 20 µL da mesma solução de DTT
e as amostras foram novamente mantidas a temperatura ambiente por 60 minutos. Para a
digestão das proteínas, 10 µL de tripsina 0,1 µg/µL foram adicionados aos tubos e esses
foram incubados a 37 °C por 24 horas. A limpeza das amostras foi realizada em coluna de
fase reversa (Strata C18-E, Phenomenex).
4.11. Espectrometria de massa por ionização do tipo Electrospray – LC-MS-ITTOF
Uma alíquota de 5 µL dos peptídeos (acidificados com TFA na concentração final de
0,1%) foram injetados em sistema de cromatografia liquida acoplada a espectrômetro de
massas, em equipamento LC-MS-IT-TOF. Os detalhes da separação cromatográfica e da
configuração do espectrômetro de massas são dados na tabela 6:
46
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
Tabela 6: Parâmetros do equipamento LC-MS-IT-TOF.
Cromatografia
HPLC
Shimadzu 20 A
Coluna
Kinetex C18 (150 mm x 3 mm x 2,6 µm; Phenomenex)
Programação
Fase A: 0,1% ácido fórmico em água deionizada
Fase B: 0,1% ácido fórmico em acetonitrila
0 min: 5% B, 30 µL/min
40 min: 20% B, 30 µL/min
150 min: 70% B, 30 µL/min
155 min: 100% B, 300 µL/min
158 min: 5% B, 30 µL/min
Espectrometria de Massas
Espectrômetro de Massas
Shimadzu IT-TOF
Fonte de ionização
Padrão ESI
Modo de ionização
Positivo
Aquisição MS
100 – 2000 m/z
Aquisição MS/MS
50 – 2000 m/z
Tempo de acumulação
100 ms
Voltagem do capilar
4,5 kV
Nebulisador
150 kPa
Gás de secagem
1,5 L/min
Temperatura de secagem
200 °C
Isolamento de precursores
Automático
Fragmentação
CID – energia a 70%, gás de colisão a 80%
Os espectros MS e MS/MS foram submetidos à busca no programa Mascot (versão
2.1.1.0, MatrixScience). Os critérios de busca foram enzima: tripsina; modificações variáveis:
carbamidometilação de cisteínas e oxidação de metioninas; tolerância para íons precursores:
47
Zorel, J. A.
Materiais e Métodos
0,05 Da; tolerância para íons fragmentados: 0,05 Da; banco de dados: NCBInr; taxonomia
(quando requerida): eubactérias ou arqueias.
48
5. Resultados e Discussão
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Extração de EPS
5.1.1. Avaliação dos métodos de extração
Os oito métodos empregados para a extração de EPS foram avaliados quanto a
diferenças na quantidade de polímeros extraídos. Para isso foram quantificados carboidratos e
proteínas, os quais constituem a grande maioria dos biopolímeros formadores da matriz
extracelular de biofilmes, tanto aeróbios quanto anaeróbios. Para a quantificação de
carboidratos foi empregado o método de Dubois (DUBOIS et al., 1956), o qual mostra-se
efetivo para a quantificação de EPS e SMP de reatores e amostras naturais (AQUINO e
STUCKEY, 2004; COMTE et al., 2007; D’ABZAC et al., 2010).
Por outro lado, para a quantificação de proteínas existem grandes divergências acerca
do uso de protocolos de quantificação de uso já consolidado em outras áreas, como o método
de Lowry (LOWRY et al., 1951; FRØLUND et al., 1995). A principal razão para isso é a
interação entre outros compostos e o reagente de Folin-Ciocalciteau, usado na reação de
Lowry. Entre os principais compostos interferentes, estão as substâncias húmicas presentes
em grandes quantidades em amostras de solo e grânulos anaeróbios (BASTIDA et al., 2009;
D’ABZAC et al., 2010). Frolund e colaboradores (1995) reportaram que a concentração
proteica em amostras desse tipo pode ser superestimada em até 40%, quando usado o método
de Lowry convencional. Para contornar o problema, os autores desenvolveram um método
baseado em duas medições, uma delas feita sem alterações e outra sem a adição de Cu2SO4.
Como o sulfato de cobre é o responsável por intensificar a coloração apresentada por
proteínas no método de Lowry, aferições feitas na ausência do sal servem como medida da
quantidade de ácidos húmicos presentes na amostra. Após correção matemática das
absorbâncias tomadas em ambas as medições, tem-se um valor mais aproximado da
concentração proteica das amostras. Desse modo, nesse trabalho adotou-se o método de
Frolund (FRØLUND et al., 1995) para a quantificação proteica.
Como pode ser visto na figura 8, cada método de extração solubilizou quantidades
distintas de polímeros. Apesar de alguns autores levarem em conta apenas variações
quantitativas para a escolha de um método de extração (FROLUND et al., 1996;
50
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
DOMÍNGUEZ et al., 2010), é importante ressaltar que a escolha de um único método não
fornece informações representativas de todo o complexo de polímeros que forma os EPS
(PARK e NOVAK, 2007).
Figura 8: Concentração de proteínas (barras pretas) e carboidratos (barras cinzas) para cada método de extração.
Os números acima das barras indicam a razão proteína/carboidratos.
No presente estudo, o método que solubilizou maiores quantidades de polímeros totais
foi o que fez uso de hidróxido de sódio (base e formol+base, figura 8). Segundo Sheng e
colaboradores (2010) a adição de NaOH causa o desprendimento dos EPS devido à remoção
dos hidrogênios ionizáveis de grupos carboxílicos, aumentando a força de repulsão entre
células e EPS. Somada a essa capacidade, a elevação do pH aumenta a solubilidade do
alumínio em água. Como mostrado por Park e Novak (2007), esse metal auxilia na
estruturação da matriz extracelular e, com sua solubilização ocorreria a simultânea liberação
de EPS. A união desses dois mecanismos resulta na alta eficiência apresentada pelo método.
De maneira interessante, o tratamento prévio das amostras com formaldeído reduziu o
rendimento das extrações por NaOH. Esse fenômeno foi observado também para a extração
por aquecimento. Liu e Fang (2002) supõem que o HCOH, devido sua capacidade de fixação
das células, tenha ação protetora sobre a membrana celular dos micro-organismos, diminuindo
51
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
a lise causada durante as extrações. Apesar de os métodos não causarem danos às células, pelo
menos nas condições em que foram realizados, a ocorrência de lise celular não pode ser
descartada (GARCÍA BECERRA et al., 2010; LI e YANG, 2007). Em contrapartida, alguns
trabalhos mostram que, por si só, a adição de formaldeído pode solubilizar exopolímeros
(ZHANG et al., 1999). Possivelmente, a complexação com formaldeído, tornou parte dos
carboidratos e proteínas menos susceptíveis a ação dos outros agentes de extração (FOX et
al., 1985).
Dois dos métodos, CER e EDTA, são baseados na desestabilização dos EPS por meio
da remoção de cátions estabilizadores da matriz. Enquanto a resina de troca catiônica
sequestra íons Mg2+ e Ca2+, o EDTA, além desses, pode quelar também íons Fe2+/3+ (WU e
XI, 2009). A despeito dessa maior abrangência do EDTA, a resina de troca catiônica
apresentou melhores resultados, principalmente em relação à quantidade de proteínas
liberadas. Possivelmente, isso se deve ao fato de que a resina, além de suas propriedades
quelantes, substitui os cátions divalentes por íons Na+. Como mostrado por Arabi e Nakhla
(2009a), altas concentrações de sódio estão relacionadas à diminuição da quantidade total de
EPS com consequente aumento dos polímeros solúveis em reatores de membrana.
Outro método baseado na remoção de cátions estabilizadores é o que faz uso de Na2S.
Segundo Nielsen e Keiding (1998), em ensaios com lodo ativado, a adição de sulfeto de sódio
remove íons Fe2+/3+ pela formação de FeS, resultando na desintegração dos flocos. Em nosso
trabalho, a adição de Na2S solubilizou aproximadamente a mesma quantidade de polímeros
obtida com a CER. Segundo Park e Novak (2007), os polímeros extraídos por cada um desses
dois métodos podem ser considerados como diferentes frações de EPS. Portanto, levando em
conta a soma dessas frações, nossos dados indicam que grande parte dos EPS de grânulos
anaeróbios é estabilizada pela interação com cátions di e trivalentes. Visto que tanto a
concentração quanto a razão entre esses íons podem alterar características do lodo, como
tamanho e hidrofobicidade, o monitoramento desses em águas residuárias que chegam a
estações de tratamento pode auxiliar no desempenho de reatores anaeróbios (ARABI e
NAKHLA, 2009a,b).
Entre os métodos físicos de extração, o aquecimento foi mais eficiente do que a
centrifugação. Essa diferença era esperada, visto que o desprendimento de polímeros devido à
força centrífuga é pequeno, em razão da baixa agressividade da técnica (ADAV e LEE, 2011).
A aceleração do movimento das partículas gerada pelo aumento da temperatura (SHENG et
52
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
al., 2010), por outro lado, liberou uma quantidade de polímeros comparável ao método
químico mais eficiente (NaOH).
Nesse trabalho, a razão proteínas/carboidratos foi na maioria das vezes, exceto para os
métodos formaldeído + aquecimento e EDTA, maior do que um. A prevalência de proteínas e
peptídeos sobre demais polímeros dos EPS já foi demonstrada em outros trabalhos com
culturas mistas (SHENG et al., 2006). Por outro lado, em culturas microbianas puras o
biofilme seria formado quase que em sua totalidade por carboidratos (FLEMMING e
WINGENDER, 2010). Essas discrepâncias fizeram com que, nos primeiros trabalhos sobre a
composição dos EPS de comunidades mistas, a presença de proteínas em extratos fosse usada
como um indicador da lise de células durante o processo de extração. Posteriormente, análises
da atividade de enzimas intracelulares ou da quantidade de DNA liberado em solução
mostraram que extratos de EPS contendo grande quantidade de proteínas, não
necessariamente estão relacionados à lise celular, atribuindo um importante papel das
proteínas na composição de biofilmes naturais (NIELSEN e JAHN, 1999). Desta forma é
possível que, assim como em biofilmes naturais, as proteínas desempenhem papel importante
na agregação e formação de lodo anaeróbio aplicado ao tratamento de esgoto doméstico, tal
como o utilizado neste trabalho.
5.1.2. Caracterização dos extratos por cromatografia de exclusão molecular
Visto que os métodos de extração apresentaram diferenças na quantidade de polímeros
extraídos e que esses podem representar diferentes frações dos EPS, o tamanho dos
compostos de cada extrato foi analisado por meio de cromatografia de exclusão molecular.
Nesse tipo de separação, o tamanho das moléculas pode ser estimado pelo seu tempo de
eluição, sendo que quanto menor a molécula, maior o volume da coluna ao qual essa tem
acesso e, consequentemente, maior é o seu tempo de retenção.
Os cromatogramas referentes aos EPS e aos padrões são mostrados na figura 9. Como
visto, em comparação com os padrões, os compostos extraídos podem ser agrupados em duas
regiões principais: maiores que 669 kDa e menores que 44 kDa, sendo que os últimos
aproximam-se bastante do tempo de eluição do padrão de uridina (com 0,25 kDa). Essa
distribuição bimodal já havia sido demonstrada para os EPS de lodo ativado extraídos por
diferentes métodos (ADAV e LEE, 2011; MENNITI et al., 2009). Desse modo, nossos dados
53
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
sugerem que, também para o lodo anaeróbio, independentemente das interações que são
quebradas em cada método e dos respectivos polímeros liberados, os EPS são formados tanto
por complexos de alta massa molecular quanto por compostos menores e produtos de
degradação.
Figura 9: Cromatogramas dos extratos de EPS e dos padrões de massa molecular (669 kDa- tiroglobulina; 150
kDa- álcool-desidrogenase; 44 kDa- ovoalbumina; 0,25 kDa- uridina).
54
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Figura 9: Continuação.
Na região do cromatograma que corresponde aos compostos menores (próximo ao
tempo de retenção de 10 min), todos os métodos, com exceção de formol + base e
centrifugação, apresentaram picos relativamente intensos. De maneira interessante, um pico
de grande intensidade nessa região foi obtido mesmo para os EPS extraídos com EDTA,
método de menor eficiência. Ao confrontar esses dados com os resultados de quantificação
para esse extrato, pode-se supor que ácidos húmicos sejam os responsáveis pela ocorrência
desse pico, visto que esses apresentam tamanho médio de até 10 kDa e absorvem luz UV no
comprimento de onda usado no ensaio (PEURAVUORI e PIHLAJA, 1997). Como discutido
acima, substâncias húmicas podem interagir com o reagente de Folin e, desse modo, a alta
concentração dessas resultou no valor praticamente nulo de proteínas encontrado para o
extrato. Além disso, complexos do tipo EDTA/Fe3+ podem ter contribuído para a
intensificação do pico encontrado, visto que apresentam absorção máxima no comprimento de
onda de 258 nm (BHATTACHARYA e KUNDU, 1971). Também pode ser notada a
55
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
ocorrência de um pico ainda mais intenso, com tempo de retenção próximo de 15 minutos,
somente para os compostos extraídos com EDTA, sugerindo que esse método libere grande
quantidade de monômeros dos EPS.
Quanto aos compostos maiores que 669 kDa, o método que apresentou o pico mais
intenso foi o que fez uso de hidróxido de sódio. Essa capacidade de extração de compostos de
alta massa molecular por NaOH havia sido demonstrada por García Becerra e colaboradores
(2010) e, segundo os autores, esses picos correspondem à moléculas que se encontram na
forma de aglomerados. A exemplo do ocorrido nos ensaios de quantificação, a adição de
formaldeído previamente às extrações por NaOH e aquecimento reduziu a intensidade dos
picos. Além disso, o pico correspondente aos compostos de baixa massa molecular (com
tempo de eluição em torno de 11 minutos), para a extração com aquecimento, foi o que teve a
diminuição mais expressiva. Esse fato corrobora a hipótese de que complexos formados entre
esses polímeros e o formaldeído sejam mais difíceis de serem extraídos e tenham diminuído o
rendimento das extrações em questão, principalmente para os compostos menores.
5.1.3. Análise proteômica dos EPS
Para analisar o perfil proteico dos extratos de EPS, esses, após concentração das
amostras, foram aplicados em géis SDS-PAGE. Como primeiro método de escolha para
diminuir o volume dos extratos, foi escolhida a técnica de liofilização. Como visto na figura
10, o procedimento não foi eficaz para a obtenção de amostras com a concentração necessária
para que as bandas pudessem ser visualizadas através do método de coloração por Coomassie.
Uma razão para esse fato pode ter sido a degradação das amostras durante o processo,
o que seria pouco provável, levando em consideração as características da técnica
(Ó´FÁGÁIN, 2011). Uma razão mais plausível seria que ao final da liofilização, o volume das
amostras pode não ter sido reduzido o bastante. Devido à grande quantidade de matéria
presente, o volume mínimo em que os extratos liofilizados puderam ser ressuspendidos variou
entre 0,5 mL e 1,5 mL. Levando em conta a concentração de proteínas encontrada e que
apenas uma pequena fração é aplicada no gel, a quantidade total de cada proteína não
alcançou o valor mínimo para detecção.
56
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Figura 10: SDS-PAGE dos extratos de EPS liofilizados. 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6- formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S.
Sendo assim, as proteínas foram concentradas por meio de precipitação com sulfato de
amônio. A escolha desse método foi baseada nos resultados de Park e colaboradores (2008),
os quais, ao trabalharem com extração de EPS de lodo aeróbio, reportaram que entre outros
métodos de precipitação – incluindo, acetona ou ácido tricloroacético – o uso de (NH4)2SO2
mostrou os melhores resultados. Para o nosso propósito, uma vantagem desse método sobre o
de liofilização é que, ao mesmo tempo em que o volume das amostras é reduzido, ocorre um
processo de concentração mais seletivo para moléculas com características hidrofóbicas do
que para as demais – como carboidratos e ácidos húmicos, por exemplo. Esse procedimento,
seguido de diálise e liofilização, permitiu que as amostras fossem ressuspendidas em volumes
muito menores (em média 70 µL) e que bandas fossem visualizadas para todos os extratos
(Figura 11).
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Figura 11: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio. M- marcador de
massa molecular; 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4- formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S. A seta indica a banda identificada por LC-MS/MS.
Não obstante as variações na eficiência de extração e no perfil dos cromatogramas
apresentados anteriormente, visualmente não são notadas diferenças significativas na
quantidade de proteínas entre os métodos. Além disso, muitas bandas são comuns a todos os
extratos, inclusive ao método de centrifugação empregado como controle, o qual, segundo
outros estudos é o método mais brando de extração de EPS e não ocasionaria o rompimento
das células durante o processo (SHENG et al., 2010). Portanto, as proteínas visualizadas na
figura 11 podem ser consideradas de fato como constituintes da matriz extracelular. Dessas
observações, pode-se supor que mesmo para métodos mais severos e eficientes de extração,
como os que fazem uso de NaOH ou aquecimento, os danos ocasionados às células foram
mínimos. Por outro lado, os dados indicam que, para estudos sobre o proteoma dos EPS de
lodo anaeróbio, métodos menos agressivos possam ser usados. Isso evitaria possíveis
modificações nas cadeias laterais de aminoácidos causadas por agentes químicos, como as que
ocorrem quando do uso do formaldeído (FOX et al., 1985). Tais modificações, por alterarem
a massa dos resíduos, podem dificultar a posterior identificação das proteínas por
espectrometria de massas.
Em sua maioria, as proteínas precipitadas apresentaram alta massa molecular e
encontram-se acima de 20 kDa, sendo muitas com aproximadamente 100 kDa. Curiosamente,
esses resultados diferem do encontrado nas separações por cromatografia de exclusão, nas
58
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
quais não são notados picos de alta intensidade nessa região. Essa discrepância pode ser
explicada pelo fato de que nas análises por SEC, os polímeros encontram-se em um estado
mais aproximado de seu estado natural. Por outro lado, o tratamento das amostras que precede
sua aplicação nos géis SDS-PAGE propicia o rompimento de interações e a completa
desnaturação proteica (RABILLOUD et al., 2009). Essa diferença também foi mostrada por
Park e colaboradores (2008), os quais, ao avaliarem o tamanho de moléculas EPS por meio de
fracionamento por ultrafiltração, encontraram alta porcentagem de proteínas maiores que 500
kDa e menores que 3 kDa, enquanto que as análises por SDS-PAGE revelaram a ocorrência
de proteínas com tamanhos intermediários.
A ausência de proteínas de baixa massa molecular pode ser explicada como um viés da
técnica de precipitação por sulfato de amônio, visto que o sucesso do método depende de
características das moléculas a serem precipitadas. Proteínas maiores ou mais hidrofóbicas
são desnaturadas mais facilmente quando da adição do sal, sendo mais propícias a interagirem
e tornarem-se insolúveis (BURGESS, 2009). Outra explicação seria a escolha da fração
encaminhada para centrifugação. Imediatamente após a adição do sal, parte dos compostos se
aglomerou na superfície da solução, o que pode ser notado pela formação de um halo de
coloração mais escura, diminuindo a turbidez do restante da solução. Visto que essa coloração
é uma característica de substâncias húmicas (HANREICH et al., 2012) e que essas interagem
com corantes usados em géis SDS-PAGE (AOYAMA, 2006), o halo em questão foi removido
antes da etapa de centrifugação, com o intuito de diminuir o background das amostras. Para
testar essa suposição, três dos protocolos de extração (aquecimento, EDTA e formaldeído +
aquecimento) foram repetidos e, dessa vez, todo o material presente nos tubos foi
centrifugado. Na figura 12, ao analisar as canaletas 1, 2 e 3, correspondentes aos extratos
submetidos a uma outra eletroforese em SDS-PAGE, nota-se a presença de um grupo de
proteínas de baixa massa molecular (menores que 29 kDa), indicando que essas também
fazem parte do aglomerado removido na precipitação anterior. Além disso, dessa vez podem
ser notadas diferenças maiores entre os extratos, como a ocorrência da banda ‘s1’, presente
em alta concentração apenas para o método de extração com EDTA.
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Figura 12: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio e centrifugados
sem remoção da fração superior. M- marcador de massa molecular; 1- aquecimento; 2- EDTA; 3formaldeído+aquecimento.
Como visto acima, e de acordo com Bastida e colaboradores (2009) entre as
dificuldades encontradas para o estudo de proteínas oriundas de comunidades naturais a
principal delas seria o desenvolvimento de protocolos que conciliem a eliminação de
interferentes com a obtenção de amostras representativas do proteoma extracelular.
Das bandas submetidas à identificação, apenas a banda indicada pela seta (Figura 11)
retornou resultado positivo. Mesmo assim, essa foi identificada como uma proteína hipotética
de bactérias da família Acetobacteriaceae. A sequência fornecida pelo software MASCOT foi
submetida à busca de homologia pelo algoritmo BLAST. A única sequência não hipotética
encontrada apresentou apenas 34 % de identidade e refere-se à proteína CelD, uma das
constituintes do celulossomo – complexo bacteriano de degradação de material celulósico
(DOI et al., 2003) – e apesar de não apresentarem relação direta com a formação de biofilmes
podem ser importantes para a degradação extracelular de carboidratos complexos, ou mesmo
para a estruturação da matriz, sem função enzimática. Em um trabalho recente, Albertsen e
colaboradores (2013) reportaram que proteínas diretamente envolvidas no desenvolvimento
dos EPS, apesar de serem detectadas em culturas puras, não foram encontradas em EPS de
lodo ativado, principalmente devido ao baixo rendimento das extrações para esse tipo de
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
amostra. Por outro lado, os autores encontraram proteínas intracelulares, provavelmente
liberadas após morte celular, entre os componentes dos EPS.
5.2. Proteínas SMP
Proteínas e polipeptídeos constituem uma importante fração dos produtos microbianos
solúveis. Além de dados quantitativos, os estudos disponíveis sobre esses biopolímeros
fornecem dados sobre suas características físico-químicas (WANG e ZHANG, 2010). No
entanto, até o presente momento, não são encontradas na literatura informações sobre a
identidade dessas proteínas. Desse modo, nessa etapa do trabalho foram empregadas técnicas
para a análise mais aprofundada do conteúdo proteico dos SMP.
5.2.1. Origem de proteínas SMP: comparação dos perfis proteicos de lise celular,
EPS e SMP
Os SMP são liberados em solução como consequência do metabolismo microbiano e
podem ser produzidos tanto durante a fase de consumo de substrato (UAP) quanto na fase
endógena (BAP; NI et al., 2011). Nos modelos acerca da dinâmica dos SMP existem
divergências entre a origem dos BAP: se estritamente relacionada à hidrólise de EPS
(LASPIDOU e RITTMANN, 2002) ou também à lise celular (AQUINO e STUCKEY, 2008).
Com o intuito de encontrar relações entre SMP, EPS e células, foi proposta a comparação
entre seus proteomas, visto que proteínas são constituintes importantes às três partes. Sendo
assim, amostras de SMP (reator UASB), EPS, BAP (ensaio de decaimento) e lise celular
foram comparadas por meio de SDS-PAGE (Figura 13).
O interesse na caracterização dos BAP é devido principalmente à sua recalcitrância, a
qual afeta a qualidade de efluentes de reatore de tratamento biológico (JARUSUTTHIRAK e
AMY, 2007). Tian e colaboradores (2011), em ensaios de decaimento celular, observaram o
aumento da concentração de polímeros em função do tempo, entre eles carboidratos e
proteínas. Em nossas análises sobre a fração proteica dos BAP, foram encontradas proteínas
em uma ampla faixa de massa molecular (Figura 13, canaleta 2). Essas proteínas, não foram
degradadas após dez dias de incubação, representando, portanto, a parte recalcitrante das
proteínas BAP.
61
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Figura 13: SDS-PAGE das amostras de lise celular, BAP, EPS e SMP. M- marcador de massa molecular; 1extrato celular; 2- BAP; 3- EPS extraídos por aquecimento; 4- EPS extraídos por EDTA; 5- EPS extraídos por
formaldeído+aquecimento; 6- SMP do reator UASB alimentado com glicose.
Entre essas proteínas, um grupo de baixa massa molecular aparece também nos
extratos de EPS (Figura 13, canaletas 3, 4 e 5). Interessantemente, o mesmo grupo de
proteínas não foi encontrado nos extratos celulares. Isso indica que, provavelmente, proteínas
de baixa massa molecular seriam liberadas em solução como consequência da hidrólise de
EPS durante a fase endógena dos micro-organismos. A solubilização de polímeros da matriz
extracelular em situações de limitação de substrato pode ser decorrente do consumo de outros
constituintes de maior biodegradabilidade. Como discutido por Wingender e Neu (1999), uma
das funções dos EPS é o acúmulo de nutrientes, os quais podem ser posteriormente usados em
condições de escassez. É importante ressaltar que essas proteínas de baixa massa molecular
estão presentes também no interior do reator UASB operando em sistema contínuo (Figura
13, canaleta 6), no qual o lodo é alimentado em fluxo constante e não há falta de substrato.
Desse modo, considerando que essas proteínas sejam mesmo constituintes dos EPS, o
processo de renovação da biomassa também resultaria na liberação dessas.
Além do grupo proteico discutido acima, muitas outras bandas correspondentes à
proteínas SMP (Figura 13, canaleta 6) podem ser visualizadas. Esperava-se que a
concentração encontrada fosse maior, levando em consideração o fator de concentração das
amostras. A diferença entre os valores de concentração encontrados em outros trabalhos e a
62
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
intensidade das bandas visualizadas no gel pode ser explicada por dois fatores.
Primeiramente, como discutido para os EPS, métodos de quantificação que não levam em
conta a interferência de substâncias húmicas podem superestimar o valor real de proteínas.
Em segundo lugar, alguns trabalhos mostram que a quantidade de proteínas SMP menores que
1 kDa pode totalizar até 50 % do conteúdo proteico em efluentes de reatores (MALAMIS e
ANDREADAKIS, 2009). Proteínas ou peptídeos desse tamanho podem ser quantificados por
métodos colorimétricos, visto que a maioria requer apenas a presença de tripeptídeos para a
geração de cor. No entanto, tais oligopeptídeos não são passíveis de serem encontrados na
técnica empregada em nosso trabalho, ao menos nas condições em que foi realizada
(RABILLOUD et al., 2009). Por outro lado, no presente estudo, bandas com alta intensidade
apareceram na região superior do gel, indicando que proteínas de alta massa molecular
também contribuem consideravelmente para a concentração final de SMP. Em seu estado
natural, a exemplo do que ocorre para os EPS, muitas dessas proteínas seriam encontradas na
forma de complexos.
As bandas ‘s1-5’ assim como a solução de SMP, foram submetidas ao processo de
identificação por LC-MS/MS, e as proteínas encontradas estão na tabela 7. É importante
ressaltar que, analisando os parâmetros fornecidos pelo software de identificação, os
resultados referentes a essas proteínas podem ser usados apenas como indicativos da presença
dessas.
Tabela 7: Proteínas SMP identificadas por LC-MS/MS.
Fonte
Identidade
Origem
Bandas s2, s4 e s5
Proteína de camada S
Methanosaeta concilii
Banda s3
Proteíno-quinase
Clostridium beijerinckii
SMP digeridos em solução
Proteína ribossomal
Halogranum salarium
Nossas análises sugerem a contribuição tanto de arqueias quanto de bactérias para as
proteínas liberadas em solução. Interessantemente, as bandas ‘s2’, ‘s4’ e ‘s5’ foram
identificadas como proteínas da camada S de Methanosaeta concilii. A presença do mesmo
tipo de proteína em três bandas diferentes pode ser explicada pela degradação durante o
processo de digestão anaeróbia ou pela ocorrência natural de proteínas da camada S dentro de
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
uma faixa ampla de massas moleculares. Segundo Sleytr e Beveridge (1999), essas proteínas
compõem a parede celular de arqueias e são expressas na faixa de 40 a 170 kDa.
A banda ‘s3’ foi identificada como uma proteíno-quinase de Clostridium beijerinckii.
Sendo uma proteína intracelular envolvida na transdução de sinal (LEONARD et al., 1998),
essa seria liberada em solução devido à lise celular.
O resultado da digestão em solução da amostra de SMP indica a presença de uma
proteína ribossomal de Halogranum salarium. Proteínas desse tipo estão envolvidas na síntese
proteica e são altamente conservadas entre arqueias (YUTIN et al., 2012). Levando em conta
as condições de baixa salinidade do reator, a presença de um micro-organismo halofílico
extremo no sistema é pouco provável. Como o número de sequências genômicas depositadas
para micro-organismos de reatores ainda é baixo (BARBER et al., 2011) e a busca é baseada
nesses dados, muito provavelmente o peptídeo encontrado corresponde a uma proteína
ribossomal de alguma arqueia metanogênica.
A presença de proteínas da parede celular de arqueias e do citoplasma de arqueias e
bactérias sugere que produtos oriundos de lise celular constituem uma porção importante dos
SMP, corroborando o modelo proposto por Aquino e Stuckey (2008).
5.2.2. Variações no perfil proteico dos SMP relacionadas a alterações no
substrato
A produção de SMP é fortemente modulada por condições ambientais. Os diferentes
SMP liberados exercem funções adaptativas, servem como resposta aos estímulos externos ou
podem ser resultado da morte celular em condições de estresse (BARKER e STUCKEY,
1999).
As informações supracitadas, somadas aos resultados obtidos com as amostras do
reator UASB, nos levaram a avaliar possíveis alterações nas proteínas liberadas pelos microorganismos quando da digestão anaeróbia de substratos simples em diferentes condições.
Assim, foram avaliadas as proteínas solúveis encontradas após a degradação de glicose e/ou
peptona em diferentes temperaturas e razões alimento/micro-organismo, totalizando seis
ensaios em reatores em batelada, como descrito no item 4.5.3.
Após filtração das amostras, essas foram submetidas à concentração por liofilização,
visto que a técnica mostrou-se eficaz para a solução do reator. No entanto, nenhuma banda
64
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
pôde ser visualizada. A exemplo do que ocorreu com os extratos de EPS, além da grande
quantidade de interferentes, o volume das amostras não foi reduzido o bastante. Dessa vez, as
proteínas foram separadas dos ácidos húmicos e demais interferentes pela adição de fenol e
precipitadas em múltiplas etapas com diferentes solventes orgânicos, seguindo o mesmo
protocolo empregado para a obtenção de proteínas intracelulares, com a diferença que ambas
as fases (orgânica e aquosa) foram submetidas às etapas de precipitação. O método foi
escolhido com base no trabalho de Benndorf e colaboradores (2007), os quais mostraram a
compatibilidade desse com amostras de volume reduzido.
Mesmo que ainda de baixa intensidade, bandas foram observadas em grande parte das
canaletas do gel na figura 14. Para algumas das amostras, é possível notar diferença entre suas
frações orgânica e aquosa, indicando que proteínas com diferentes graus de hidrofobicidade
foram encontradas entre os SMP.
Figura 14: SDS-PAGE dos SMP dos reatores em batelada. M- marcador de massa molecular; A- peptona, 25
°C; A/M=0,2; B- glicose-peptona, 25 °C, A/M=0,2; C- glicose, 25 °C, A/M=0,2; D- glicose, 35 °C, A/M=0,02;
E - glicose, 25 °C, A/M=0,2, com carvão ativado. 1- fração orgânica; 2- fração aquosa.
As bandas de maior intensidade são encontradas na parte superior do gel, acima de 20
kDa. Esse fato descarta a possibilidade de que traços da peptona usada como substrato em
dois dos ensaios seja responsável pelas proteínas encontradas nas canaletas referentes a esses,
visto que essa é composta principalmente por hidrolisados proteicos menores que 2 kDa.
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Entre os ensaios realizados a 25 °C, nota-se que a adição de carvão ativado (canaleta
E1) reduziu o número de bandas, sendo visível apenas uma com tamanho aproximado de 70
kDa, comum a outros três ensaios (A, B, C). O menor número de bandas pode estar
relacionado à capacidade do carvão ativado de adsorver diferentes compostos, inclusive
proteínas, já demonstrada em outros trabalhos (AQUINO et al., 2006).
A mesma banda não foi notada em nenhuma das duas frações do ensaio realizado com
glicose, A/M = 0,02 e 35 °C. Essa proteína pode ter sido degradada mais facilmente nessas
condições em decorrência do aumento do metabolismo microbiano em função da maior
temperatura. Por outro lado, Barker e Stuckey (1999) ressaltam que a adição repentina de
altas quantidades de fontes de carbono pode acelerar a morte de algumas bactérias. Desse,
modo a adição de menores quantidades de substrato pode também ter contribuído para a
menor liberação de proteínas SMP. Para esclarecer qual dos dois fatores seria o responsável
pelo resultado encontrado, foi realizado um ensaio variando apenas a temperatura e mantendo
a razão A/M = 0,2. Todavia, o background intenso das amostras impossibilitou a análise das
bandas em SDS-PAGE (resultados não mostrados).
Com o intuito de identificar as proteínas liberadas em cada situação, 18 bandas
visualizadas na figura 14 foram conduzidas ao processo de identificação por LC-MS/MS.
Infelizmente, nenhuma retornou resultado positivo. Provavelmente, a baixa concentração das
amostras tenha sido a principal causa da ausência de identificações. Em algumas delas foram
encontrados peptídeos autolíticos de tripsina e a maioria das amostras não gerou espectros
com qualidade e intensidade suficientes para serem submetidos à busca em banco de dados.
A amostra referente ao ensaio glicose, A/M = 0,02 e 35 °C foi submetida também à
digestão enzimática em solução, para a qual foi encontrada a lipoproteína da membrana
externa de Tolumonas auensis. Dessa vez, os parâmetros da busca indicaram com
confiabilidade a presença dessa proteína e, novamente, os resultados sugerem a presença de
proteínas de membrana entre os SMP. As lipoproteínas são os principais constituintes da
membrana externa de bactérias gram-negativas (HUSSAIN e ICHIHARA, 1980) e sua
presença no meio, visto que essa não é uma proteína secretada, indica mais uma vez a
influência de produtos de lise celular no conteúdo final dos SMP. A bactéria T. auensis,
isolada de sedimentos, apresenta a capacidade de produzir tolueno em condições anóxicas e
possui seu genoma completamente sequenciado, justificando o resultado encontrado
(CHERTKOV et al., 2011).
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
5.3. Caracterização proteômica da comunidade microbiana do reator UASB
tratando glicerol
Após o redirecionamento do reator para o tratamento de glicerol, foi proposta a análise
dos SMP produzidos durante o consumo desse substrato, visando à comparação entre esses e
os liberados na degradação de glicose.
Para a análise de SMP, a solução do interior do reator UASB tratando glicerol puro foi
filtrada e concentrada por liofilização. No entanto, após a sublimação da água, a amostra
ainda apresentava grande quantidade de bicarbonato de sódio. Devido à acidificação do meio
durante a degradação de glicerol, o sal era adicionado como medida de controle do pH. Para a
eliminação do bicarbonato, foram testados dois protocolos: diálise ou precipitação seguida de
diálise. Todavia, nenhuma das alternativas mostrou-se efetiva para a recuperação de proteínas
passíveis de serem visualizadas com a coloração por Coomassie.
Desse modo, apenas amostras de proteínas celulares foram analisadas, com o intuito
de avaliar mudanças na comunidade microbiana relacionadas a alterações de substrato. Assim,
foram preparados extratos do lodo usado como inóculo, alimentado apenas com glicose, e do
lodo do reator em duas fases: uma tratando glicerol puro ou outra resíduo de biodiesel. Os
perfis proteicos das preparações podem ser vistos na figura 15 e as bandas identificadas são
mostradas na tabela 8. Infelizmente, nenhuma proteína foi identificada para o extrato do
inóculo.
Figura 15: SDS dos extratos de proteínas celulares. M- marcador de massa molecular; In- inóculo; RA- reator
tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.
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Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
Das 6 proteínas (Tabela 8) identificadas nessa etapa, 4 delas correspondem a proteínas
de membrana. Hanreich e colaboradores (2013), ao buscarem proteínas responsáveis pela
degradação de carboidratos em lodo anaeróbio, encontraram grande número de proteínas
membranares e periplasmáticas. Segundo os autores, a elevada taxa de identificação de
proteínas desse tipo deve-se ao fato de que essas compreendem aproximadamente 30% do
total de proteínas celulares. Além disso, o método de extração empregado – o qual foi usado
também em nosso trabalho – pode favorecer a presença de proteínas mais hidrofóbicas (como
as de membrana) em detrimento a proteínas citoplasmáticas, de maior hidrofilicidade.
Tabela 8: Proteínas identificadas para os extratos celulares separados por SDS-PAGE. RAreator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.
Lodo
RA
RP
Amostra
Identificação
Micro-organismo
r1
Proteína hipotética
Clostridium sp.
Beta-glicosidase
Aspergillus aculeatus
r2
Flagelina
Escherichia coli
r3
FlaB3
Treponema pallidum
r4
Proteína ligante de soluto extracelular
Enterobacter sp.
r5
Proteína fimbrial MrKA
Klebsiella oxytoca
O elevado número de proteínas, junto ao background intenso, torna difícil o
levantamento de suposições acerca de mudanças relacionadas às diferentes condições
ambientais a que o lodo foi exposto. Apenas na região inferior a 30 kDa nota-se com clareza
algumas bandas que apresentam maior intensidade para os extratos das células envolvidas no
tratamento de glicerol. Isso indica a expressão aumentada dessas proteínas ou o
enriquecimento de um determinado grupo de micro-organismos que teria o crescimento
favorecido nessas condições. Das bandas excisadas nessa região, as bandas ‘r5’ e ‘r4’, foram
classificadas como proteína fimbrial MrkA de Klebsiella oxytoca e proteína ligante de soluto
extracelular de Enterobacter sp., respectivamente.
A proteína MrkA é codificada por um dos cinco genes do cluster mrkABCDF, sendo a
principal componente estrutural da fimbria tipo 3 (STAHLHUT et al., 2012). Segundo
Schurtz e colaboradores (SCHURTZ et al., 1994), o gene mrkA, diferentemente de outros
68
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
componentes do cluster, é altamente conservado entre espécies do gênero Klebsiella. Além de
seu papel estrutural, a alta hidrofobicidade dessa proteína facilita interações bacterianas,
propiciando a formação do biofilme. Essa característica mostra-se fundamental para a adesão
e o crescimento de células de Klebsiella sp., visto que essas não possuem flagelos, outro
apêndice extracelular importante para o desenvolvimento de aglomerados bacterianos
(LANGSTRAAT et al., 2001). A ocorrência dessa proteína na microbiota do reator tratando
glicerol, principalmente naquele alimentado com glicerol bruto, indica que espécies de
Klebsiella podem ser importantes para a degradação desse resíduo. Esse achado corrobora
com os dados de Homann e colaboradores (1990), os quais, com uso de meios seletivos para
micro-organismos consumidores de glicerol, isolaram espécies dos gêneros Citrobacter e
Klebsiella, entre elas K. oxytoca. Os autores destacaram o rápido consumo de glicerol e a alta
taxa de crescimento dos isolados de Klebsiella nessa fonte de carbono. Somado a esse fato, o
metabolismo desses micro-organismos possibilita a conversão pH dependente de glicerol em
ácido acético e 2,3-butanodiol. A produção desses compostos serve como um sistema de
tamponamento do meio em uma faixa de pH em torno de 5,4 e pode ser considerada como
uma estratégia de sobrevivência microbiana (PETROV e PETROVA, 2009). Esse fato
explicaria tanto a vantagem desses micro-organismos em ambientes contendo glicerol quanto
a acidificação da solução no interior do reator UASB usado em nosso estudo.
De maneira similar, bactérias do gênero Enterobacter, usadas na produção de
hidrogênio a partir de glicerol, apresentam pH ótimo de crescimento entre 5,8 e 7,0. Essas
bactérias possuem diferentes rotas metabólicas que possibilitam o uso de glicerol como fonte
de energia bem como sua conversão em metabólitos de interesse comercial. Devido a essa
característica, muitas espécies de Enterobacter são isoladas em meios de cultura contendo
glicerol visando à conversão de resíduos de biodiesel em combustíveis renováveis como:
hidrogênio e etanol (REUNGSANG et al., 2013). A proteína encontrada, identificada como
uma transportadora ABC (ATP Binding Casset) de cisteína, apesar de não estar diretamente
relacionada à degradação de glicerol, pode ter relação com o aumento da população de
Enterobacter sp.no reator. Essa proteína pertence à família de ligantes de soluto extracelular a
qual, em bactérias gram-negativas, é composta de proteínas periplasmáticas envolvidas nos
fenômenos de quimiorrecepção e transporte transmembrana (TAM e SAIER, 1993). Em
condições de disponibilidade de nutrientes no meio, o uso de transportadores ABC mostra-se
energeticamente mais favorável do que a síntese desses nutrientes, acarretando no aumento da
69
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
taxa de crescimento microbiana. É importante ressaltar a grande similaridade entre
transportadores desse tipo, e que essa não significa necessariamente similaridade entre
substratos (HIGGINS, 1992). No reator em estudo, esses não estariam envolvidos no
transporte de glicerol, já que esse é o único carboidrato conhecido que é transportado via
difusão facilitada em bactérias (DILLS et al., 1980).
Para a banda ‘r1’ duas proteínas foram identificadas: uma delas como sendo uma
proteína hipotética de Clostridium sp. e outra como uma β-glicosidase de Aspergillus
aculeatus. A presença do gênero Clostridium é descrita não apenas para biorreatores tratando
glicerol como também para outros resíduos (YAZDANI e GONZALEZ, 2007). Por outro
lado, a ocorrência de fungos não é comum nesses ambientes e, portanto, esse resultado pode
ser explicado pela similaridade entre essa classe de enzimas microbianas. Gräbnitz e
colaboradores (1989) reportaram a alta homologia entre as sequências de nucleotídeos do
gene que codifica para β-glicosidase de Clostridium thermocellum e genes de leveduras e
fungos filamentosos. Por outro lado, no sistema em estudo, essa enzima não apresenta função
evidente, visto sua atividade sobre material celulósico de cadeia curta (BHATIA et al., 2002).
Proteínas
atribuídas
a
micro-organismos
potencialmente
patogênicos
foram
encontradas nas bandas ‘r2’ e ‘r3’. A primeira delas foi identificada como uma flagelina de
Escherichia coli. Como o lodo usado para inóculo do reator é originado de uma estação que
trata esgoto doméstico é provável que esse micro-organismo esteja presente. No entanto cabe
informar que membros da família Enterobacteriaceae, dentre eles a espécie Escherichia coli,
são membros freqüentes em processos de digestão anaeróbia e também foram relatados como
fermentadores de glicerol a diversos produtos orgânicos além de biogás (H2 e CO2;
ALMEIDA et al., 2012). Considerando tais informações, a identificação de uma proteína
específica de E. coli sugere seu envolvimento na biodegradação do glicerol. A outra proteína
referente a um patógeno foi identificada como a proteína FlaB3, uma das componentes do
flagelo, de Treponema pallidum. Não foram encontrados relatos sobre o monitoramento e a
sobrevivência desse micro-organismo em reatores anaeróbios, porém observações
microscópicas do lodo de inóculo frequentemente revelavam morfologia celular semelhante a
de Treponema (SILVA, comunicação pessoal) sugerindo sua presença nos reatores anaeróbios
aplicados ao tratamento de esgoto doméstico. Uma vez que, um dos parâmetros a serem
avaliados em estações de tratamento é a capacidade de eliminação de patógenos, inclusive
daqueles não cultiváveis (JIANG et al., 2012), encontrar proteínas referentes a esses micro70
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
organismos mostra a funcionalidade da técnica também no monitoramento de microorganismos indesejáveis.
Com o intuito de identificar um maior número de proteínas, as três preparações
(Inóculo, RA e RP) foram submetidas à digestão em solução. As proteínas identificadas são
mostradas na tabela 9.
Tabela 9: Proteínas identificadas para os extratos celulares submetidos à digestão em
solução. In- inóculo; RA- reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de
biodiesel.
Lodo
Identificação
Micro-organismo
In
Elastase III A
Homo sapiens
Proteína putativa fimbrial-símile
Klebsiella pneumoniae
Proteína fimbrial MrKA
Klebsiella oxytoca
Proteína A de membrana externa
Citrobacter freundii
Proteína fimbrial MrKA
Klebsiella oxytoca
Proteína putativa fimbrial-símile
Klebsiella pneumoniae
Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase
Escherichia vulneris
Proteína hipotética
Citrobacter koseri
Flagelina
Clostridium trobutyricum
RA
RP
Mais uma vez, nenhuma proteína microbiana foi identificada para o extrato do
inóculo. Curiosamente, foi encontrada a enzima elastase III A de Homo sapiens, uma das
isoformas das elastases pancreáticas humanas responsáveis pela hidrólise de proteínas
fibrosas, como a elastina. Em um estudo sobre proteínas EPS de lodo ativado de estações de
tratamento reais, Park e colaboradores (2008) reportaram a ocorrência da elastase III A em
três bandas analisadas por LC-MS/MS. Os autores discutiram que a enzima não sofre
degradação no trato digestivo humano e que ficaria adsorvida na matriz extracelular dos
flocos. Em nosso trabalho, a identificação dessa enzima indica que essa é extremamente
resistente aos dois tipos de tratamento biológico (aeróbio e anaeróbio), pois o lodo analisado,
após sua coleta, foi alimentado por aproximadamente doze meses apenas com glicose. Além
71
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
disso, esse achado indica que o método escolhido para a análise de proteínas intracelulares
não é isento de contaminações por proteínas EPS.
Para o reator tratando glicerol, a proteína MrKA de K. oxytoca, já identificada na
banda ‘r5’, foi detectada em ambas as fases, assim como uma proteína putativa fimbrialsímile de Klebsiella pneumoniae. A recorrência dessa identificação reforça a hipótese de
enriquecimento desse gênero no reator.
Citrobacter sp. também foram detectados nas duas fases, sendo que na primeira foi
identificada a proteína A da membrana externa (OmpA) de C. freundii. Representantes dessa
espécie também foram encontrados por Homman e colaboradores (1990) entre os isolados
obtidos em meio seletivo para micro-organismos consumidores de glicerol. Segundo os
mesmos autores, a espécie mostra-se atrativa para a bioconversão de glicerol em 1,3propanodiol (composto empregado industrialmente para a produção de polímeros), visto que a
geração de subprodutos é mínima. Quanto a OmpA, Torres e colaboradores (2006) reportam
seu alto nível de expressão em E. coli e sua ocorrência em outras bactérias gram-negativas.
Além de sua função estrutural, a OmpA exerce papel na aderência bacteriana. Outra proteína
de membrana externa encontrada, dessa vez na segunda fase do reator, foi uma flagelina de
Clostridium tyrobutyricum, micro-organismo também envolvido na degradação de glicerol
(YAZDANI e GONZALEZ, 2007).
Também na segunda fase, foi encontrada uma proteína hipotética de Citrobacter
koseri, espécie patogênica ainda não reportada para processos de tratamento de resíduos. A
busca de homologia pelo algoritmo BLAST, revelou identidade de 94% da sequência da
proteína detectada com a glicerol-desidrogenase de Citrobacter sp. Essa enzima é a primeira a
atuar na via oxidativa de degradação do glicerol, convertendo-o a di-hidroxiacetona, sendo de
extrema importância para a obtenção de energia pela comunidade microbiana do reator. Após
outras conversões, a di-hidroxiacetona é encaminhada à glicólise, via para a qual foi
encontrada a enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Escherichia vulneris, outra
espécie não reportada para reatores anaeróbios. A sequência encontrada apresenta alta
similaridade com a sequência da mesma enzima de K. pneumoniae, espécie com maior
probabilidade de estar presente no reator.
A indicação da abundância de micro-organismos fermentativos condiz com a condição
do reator no momento da coleta. Dados de monitoramento indicam alta produção de ácidos
orgânicos com consequente queda do pH e diminuição da atividade dos micro-organismos
72
Zorel, J. A.
Resultados e Discussão
metanogênicos, verificada pela baixa produção de CH4. Tais condições também explicariam a
ausência de identificação de proteínas de arqueias metanogênicas, verificadas em grande
número em outros trabalhos (ABRAM et al., 2011; HANREICH et al., 2013).
A baixa porcentagem de identificação de proteínas em nosso trabalho pode estar
relacionada à escassez de sequências genômicas depositadas para micro-organismos de lodo
anaeróbio, visto que, através da análise manual de muitos espectros MS e MS2 o sucesso da
digestão enzimática e da fragmentação dos peptídeos pôde ser verificada. Em trabalhos
recentes é comum a aplicação de técnicas metagenômicas para a geração de banco de dados,
contra os quais os resultados de espectrometria de massas possam ser comparados
(ALBERTSEN et al., 2013; HANREICH et al., 2013). Outra alternativa para a identificação
de proteínas referentes a esses espectros é o sequenciamento de novo desses e posterior busca
em banco de dados.
73
6. Conclusões
Zorel, J. A.
Conclusões
6. CONCLUSÕES

Os métodos de extração de EPS apresentaram grande variação na quantidade de
polímeros extraídos, sendo que aqueles que fizeram uso de NaOH e de aquecimento
mostraram-se mais eficientes. Além dessas diferenças quantitativas, os extratos de
EPS de lodo anaeróbio diferem nas proteínas solubilizadas, quando precipitado o
extrato completo.

Proteínas BAP de baixa massa molecular são, provavelmente, oriundas da hidrólise de
EPS, porém produtos de lise celular (como proteínas de membrana e intracelulares)
também foram identificadas entre os SMP.

A liberação/permanência de proteínas SMP em solução parece depender levemente
das condições ambientais investigadas (temperatura, substrato, razão alimento/microorganismo).

As técnicas proteômicas mostraram-se como uma ferramenta poderosa para a
investigação de comunidades microbianas envolvidas no tratamento anaeróbio de
resíduos, detectando gêneros bacterianos envolvidos na fermentação do glicerol.
74
7. Perspectivas
Zorel, J. A.
Perspectivas
7. PERSPECTIVAS

Submeter os espectros não identificados à síntese de novo e posterior busca em banco
de dados.

Aperfeiçoar as técnicas de extração e concentração das amostras proteicas, com vista
ao aumento do número de espectros de qualidade.

Combinar o uso de proteômica com técnicas de biologia molecular para a
identificação de comunidades microbianas aplicadas ao tratamento de resíduos.
76
8. Referências Bibliográficas
Zorel, J. A.
Referências
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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