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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO
JEQUITINHONHA E MUCURI - UFVJM
POLIANA RIBEIRO BARROSO
FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC.
(Melastomataceae)
DIAMANTINA - MG
2015
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POLIANA RIBEIRO BARROSO
FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC.
(Melastomataceae)
Dissertação apresentada à Universidade Federal
dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como
parte das exigências do Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, área de
concentração em Ciências Farmacêuticas para
obtenção do título de “Mestre” em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Elídio Gregório - UNIFESP
Coorientadora: Profa. Dra. Helen Rodrigues Martins - UFVJM
DIAMANTINA - MG
2015
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POLIANA RIBEIRO BARROSO
FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC.
(Melastomataceae)
Dissertação a ser apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas Stricto Sensu da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e
Mucuri – UFVJM, como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Aprovada em: 24/04/2015
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________________
Dr. Luiz Elídio Gregório – UNIFESP.
(Orientador)
__________________________________________________
Dra. Helen Rodrigues Martins –UFVJM.
(Co-orientadora)
__________________________________________________
Dr. Marcos Aurélio Santana – UFOP.
(Membro externo)
__________________________________________________
Dra. Cristiane Fernanda Fuzer Grael – UFVJM.
(Membro interno)
5
Dedico esta conquista, aos meus pais
Ailton e Siane que me criaram com
muito amor e que me ensinaram a
sempre buscar os meus sonhos sem ter
medo das dificuldades e frustrações que
possa ter pela frente.
6
Agradecimentos
À Deus, primeiramente pelo dom da vida, e a graça de sempre me dar força em todos os
momentos da minha vida pessoal e profissional.
À minha querida FAMÍLIA que sempre esteve ao meu lado em todas as etapas do meu
crescimento, além do incentivo e amor incondicional.
Ao meu namorado, Dyego que sempre me ouviu sem reclamar. Além de todo apoio e
amor em todos os momentos fácies e difíceis que passei.
Aos meus amigos pessoais e de pesquisa, Kelly, Fabrício, Bethânia, Mica e Valéria,
sempre me dando força e ajuda (principalmente) em todas as etapas experimentais deste
trabalho.
Aos meus orientadores, Luiz Elídio e Helen, que sempre me receberam de braços
abertos e me guiaram no meu crescimento pessoal, ético e profissional.
E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que este sonho se tornasse
realidade.
Em especial, as instituições de fomento (CAPES, CNP-q e FAPEMIG) e a Universidade
(UFVJM) por tornarem possível a realização deste trabalho.
Com vocês, meus queridos, divido minha alegria, em poder dizer: Mais uma etapa
vencida e, que venha o Doutorado!!
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“A menos que modifiquemos a nossa
maneira de pensar, não seremos capazes
de resolver os problemas causados pela
forma como nos acostumamos a ver o
mundo”.
(Albert Einstein)
8
RESUMO
As plantas medicinais são fontes promissoras de novas drogas, em que a região do
Cerrado se destaca pela sua vasta biodiversidade. Dentre as plantas medicinais
utilizadas nesta região se encontra a espécie Miconia ferruginata DC. que é conhecida
como pixirica-do-campo ou babatenão. Esta espécie é utilizada no tratamento de
doenças de pele, e outras de origens inflamatórias, parasitárias e infecciosas, porém os
estudos químicos são escassos. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar o perfil
químico e o potencial biológico da M. ferruginata (Melastomataceae). A espécie foi
coletada no município de Diamantina, MG do qual foram preparados os extratos
aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule. Por meio da triagem fitoquímica e das
análises de CLAE-DAD-EM obteve-se um perfil químico rico em compostos fenólicos.
Foi possível a identificação da presença de taninos, ácidos fenólicos, flavonoides, e
derivados glicosilados da quercetina. Pela análise dos constituintes voláteis por CG-EM
foi possível identificar a presença de quatorze compostos, sendo eles pertencentes as
classes dos sesquiterpenos, hidrocarbonetos, monoterpenos, fenilpropanoides e alcoóis.
No qual os sesquiterpenos β-cariofileno e α-humuleno foram os compostos majoritários,
os quais são associados na literatura a diversas atividades biológicas, em especial a
ações anti-inflamatórias, antifúngicas e antitumorais. A análise das frações por CG-EM
e CLAE-DAD foi possível identificar catequinas, ácido gálico e flavonóis nos extratos
aquosos e ésteres graxos e as subclasses das flavonas e flavonóis nos extratos etanólicos.
Nas avaliações biológicas os extratos etanólicos e aquosos apresentaram baixa
toxicidade em células de mamíferos, em que a concentração selecionada para a
avaliação das demais atividades biológicas foi de até 500 µg/mL. Para a atividade
antitumoral, os extratos apresentaram um grande potencial concentração dependente,
com valores de IC50 variando de 56,44 a 180,4 µg/mL. Bem como o tempo de exposição
aumentou a potência de todos os extratos. Também foi observado que os extratos
aquosos promoveram a inibição da proliferação de linfócitos estimulados por mitógenos,
apresentando uma eficácia em relação à dexametasona, de 39,94% para o extrato das
folhas a 45 µg/mL, e de 57,3%, 137,4% e 251,8% para os extratos do caule a 15, 20 e
30 µg/mL, respectivamente. Este efeito proliferativo pode estar relacionado ao potencial
anti-inflamatório da M. ferruginata, relatada na medicina popular. Possivelmente, as
atividades biológicas estão relacionadas ao rico perfil químico desta espécie,
principalmente em compostos fenólicos. Para as atividades antimicrobianas, tripanocida
9
e leishmanicida não foram observadas a inibição do crescimento ou toxicidade frentes
as cepas avaliadas. Desta forma este trabalho contribuiu para o conhecimento químico e
biológico da M. ferruginata. Porém ensaios futuros utilizando as frações e substâncias
isoladas, se fazem necessários para fortalecer os dados aqui apresentados e para
demonstrar quais os mecanismos moleculares envolvidos nas atividades biológicas
investigadas.
Palavras-chaves: Miconia ferruginata DC., Melastomataceae, plantas medicinais,
fitoquímica, atividades biológicas
10
Abstract
Medicinal plants are reassuring sources of new drugs, in which the Cerrado region
stands out for its broad biodiversity. Among the medicinal plants used in this same
region is the species Miconia ferruginata DC. which is also known as pixirica-docampo or babatenão. This species is used in the treatment of skin diseases, and other
inflammatory, infectious and parasitic sources, despite the chemical studies about it are
lacking. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the chemical profile and
biological potential of the M. ferruginata (Melastomataceae).The species was collected
in Diamantina, MG, in which it was prepared for water and ethanol extraction of the
leaves/flowers and stem. Through phytochemical screening and analysis of HPLC-MSDAD, we obtained a rich chemical profile in phenolic compounds. The identification of
tannins, phenolic acids, flavonoids, glycosides of quercetin and derivativeshas been
detected. For the analysis of volatile constituents by GC-MS, it was possible to identify
the presence of fourteen compounds, namely belonging classes of sesquiterpenes,
hydrocarbons, monoterpenes, phenylpropanoids and alcohols. For that,α andβcaryophyllene, humulenesesquiterpenes were the main components, which are
associated in the literature several biological activities, especially anti-inflammatory,
antifungal and antitumor activities.In the analysis of the fractions by GC-MS and
HPLC-DAD, we identified catechins, gallic acid and flavonols in aqueous
extracts,including fatty esters and subclass of flavones and flavonols in ethanol extracts.
Within the biological evaluations, aqueous and ethanolic extracts showed low toxicity
to mammalian cells, wherein the concentration selected for analysis of other biological
activities was up to 500 µg/mL. For antitumor activity, the extracts showed a great
potential concentration-dependent, with IC50 values ranging from 56.44 to 180.4 µg/mL.
Just as the exposure time increased the potency of all extracts, it was also observed that
aqueous extracts promoted inhibition of the proliferation of mitogen-stimulated
lymphocytes, showing a efficacy when compared to dexamethasone, 39.94% for the
extract from the leaves of 45 µg/mL, and 57.3%, 137.4% and 251.8% for the extracts of
stem of 15.20 and 30 µg/mL, respectively. This proliferative effect may be related to the
anti-inflammatory potential of M. ferruginata, reported in folk medicine. Possibly, the
biological activities are related to the rich chemical profile of this species, mainly in
phenolic compounds. For the antimicrobial, trypanocidal and leishmanicidal activities,
we have not observed growth inhibition or toxicity fronts of the evaluated strains. Thus
11
this work contributed to the chemical and biological knowledge of M. ferruginata.
Nevertheless, future trials using isolated fractions and substances are needed to
strengthen the data presented here and to demonstrate the molecular mechanisms
involved in the biological activities investigated. It is likely that the biological activities
are related to the rich chemical profile of this species, mainly regarding phenolic
compounds. For antimicrobial activity, trypanocidal and leishmanicidal, it was not
observed growth inhibition or toxicity regarding the evaluated strains. Thus, this work
contributed to the chemical and biological knowledge of the M. ferruginata. However,
future trials using isolated fractions and substances are needed to strengthen the data
presented here and to demonstrate the molecular mechanisms involved in the biological
activities hereby investigated.
Keywords:
Miconia
ferruginata
phytochemistry, biological activities.
DC.,
Melastomataceae,
medicinal
plants,
12
Lista de Ilustrações
Figura 1 – Localização do Bioma Cerrado na América do Sul. Extraída de
49
BRASIL, 2009b.
Figura 2 – Mapa com as áreas de ocorrência das espécies da família
51
Melastomataceae com destaque os países de maior ocorrência em preto.
Fonte:
Trópicos
(2015).
Disponível
em:
http://www.tropicos.org/NamePage.aspx?nameid=42000202&tab=maps.
Figura 3 - Distribuição geográfica do gênero Miconia no Brasil e
54
determinação atual do número de espécies por estado. Extraída de
GOLDENBERG; CADDAH (2015).
Figura 4 – Espécie Miconia ferruginata. Botanical Garden, Brasília, DF,
63
Brasil; 4/2005. Disponível em: http://www.virboga.de/Miconia_ferruginata
DC.htm.
Figura 5 - Exsicatas e figura sistemática de Miconia ferruginta coletadas
77
na região de Cerrado em Minas Gerais. A - voucher depositado no HDJF;
B - voucher depositado no DIAM; C -
Figura sistemática da espécie
Miconia ferruginta.
Figura 6 – Representação esquemática das análises realizadas para triagem
79
fitoquímica com a droga vegetal e com os extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
Figura 7 – Representação da estrutura do alcaloide verdadeiro, atropina.
81
ChemDraw Ultra (2004).
Figura 8 – Representação da estrutura química básica das antraquinonas.
82
ChemDraw Ultra (2004).
Figura 9 – Representação da estrutura dos terpenoides e esteroides. A -
84
Monoterpeno, limoneno; B - Sesquiterpeno, α-humuleno; C - Diterpeno,
cafestol; D - Triterpeno, betulina; E - Esteroide, β-sitosterol. ChemDraw
Ultra (2004).
Figura 10 – Representação da estrutura química básica dos flavonoides.
86
ChemDraw Ultra (2004).
Figura 11 – Representação da estrutura da saponina, glicirrizina. ChemDraw
Ultra (2004).
89
13
Figura 12 – Representação da estrutura química básica dos taninos. A -
91
Taninos hidrolisáveis; B - Taninos condensados. ChemDraw Ultra (2004).
Figura 13 – Representação esquemática para calculo do fator de retenção
93
(Rf).
Figura 14 – Reação do ácido gálico com o reagente Folin-Ciocaulteu,
96
durante quantificação do teor de compostos fenólicos. ChemDraw Ultra
(2004).
Figura 15 – Representação do dispositivo de microextração em fase
98
sólida (SPME). A - Posição com a fibra retraída na agulha; B - Posição com
a fibra exposta. Extraído de VALENTE; AUGUSTO (2000).
Figura 16 – Representação esquemática do procedimento de partição
103
líquido/líquido realizada com os extratos etanólicos das folhas/flores e do
caule de Miconia ferruginata.
Figura 17 – Reação de oxi-redução do 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-
106
difeniltetrazólio (MTT) em formazano após a conversão pela enzima
succinato desidrogenase. ChemDraw Ultra (2004).
Figura 18 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na
108
avaliação da citotoxicidade em células de mamíferos L929 e atividade
antitumoral (MDA-MB-231) dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. A mesma placa foi realizada
tendo como poços testes os demais grupos: E3, E4 e Cloreto de cádmio.
Figura 19 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na
110
avaliação da atividade antibacteriana e determinação da concentração
inibitória mínima (CIM), utilizando os extratos etanólicos das folhas/flores e
do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Figura 20 - Reação de oxi-redução da resazurina em resofurina após
conversão pelas enzimas do sistema de transporte do metabolismo celular.
ChemDraw Ultra (2004).
111
14
Figura 21 - Estratégia de análise da viabilidade celular por citometria de
118
fluxo. A e C - Gráfico de distribuição pontual para a seleção da população
linfocitária utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e
granulosidade celular (SSC), das culturas CON e E3, respectivamente. B –
Histograma de FL-3 representando o percentual de células fluorescentes
positivas nas culturas CON. D – Histograma de FL-3 representando o
percentual de células positivas após incubação com extrato E3 de Miconia
ferruginata. E3: Extrato aquoso das folhas/flores.
Figura 22 – Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do
121
CFSE. A e C- Gráfico de distribuição pontual para a seleção das populações
de linfócitos utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e
granulosidade celular (SSC) das culturas CON e PHA, respectivamente. B Histogramas de FL-1, utilizados para definir as regiões M1 do grupo CON. D
– Histograma de FL-1 utilizado para definir as regiões M1 a M8 do grupo
PHA, com as quais foi obtido o índice de proliferação (IP) para a população
de linfócitos.
Figura 23 – Pesquisa de alcaloides nas folhas/flores e caule de Miconia
124
ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Peumus boldus Molina); B –
Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule; M: Reagente de Mayer; B:
Reagente de Bouchardat; H: Reagente de Hager; e D: Reagente de
Dragendorff.
Figura 24 – Pesquisa de antraquinonas nas folhas/flores e caule de
125
Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Senna alexandrina
Mill.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. BD: Bornträger
direta; BI: Bornträger indireta.
Figura 25 – Pesquisa de esteroides/triterpenos nas folhas/flores e caule de
Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Ginkgo biloba L.); B
– Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. LB: Reação de LibermannBurchard; S: reação de Salkowisk.
125
15
Figura 26 – Pesquisa de flavonoides nas folhas/flores e caule de Miconia
126
ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.)
DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. S: Reação de
Shinoda; CF: Reação com cloreto férrico; P: Reação de Pew; e CN: controle
negativo.
Figura 27 – Pesquisa de saponinas nas folhas/flores e caule de Miconia
127
ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.)
DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule.
Figura 28 – Pesquisa de taninos nas folhas/flores e caule de Miconia
127
ferruginata. A – Controle positivo (Folhas de Hamamelis virginiana L.); B –
Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. G: Reação com gelatina; AC:
Reação com acetato de chumbo; CF: Reação com cloreto férrico; CN:
controle negativo.
Figura 29 – Cromatograma dos extratos etanólicos das folhas/flores e do
129
caule de Miconia ferruginata para pesquisa de flavonoides após revelação
com vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10
minutos. P: padrão (quercetina); E1: extrato etanólico das folhas/flores; E2:
extrato etanólico do caule; E3: extrato aquoso das folhas/flores; E4: extrato
aquoso do caule.
Figura 30 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa
132
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia
ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HSSPME).
Figura 31 – Representação estrutural das substâncias identificadas (1 a 14)
135
por análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de
microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME). ChemDraw Ultra
(2004).
Figura 32 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
136
16
Figura 33 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia
136
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
Figura 34 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia
137
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
Figura 35 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia
137
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
do extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
Figura 36 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas
139
identificadas (15 a 20) pela análise em cromatografia líquida de alta
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) para os extratos
etanólicos e aquosos das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Figura 37 – Cromatograma de íons totais (vermelho) e cromatograma na
142
região do ultravioleta (verde) obtidos a partir da análise em cromatografia
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à
espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Figura 38 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas
143
identificadas (21 a 25) pela análise em cromatografia líquida de alta
eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de
massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de
Miconia ferruginata.
Figura 39 – Curva de calibração do padrão ácido gálico traçada pelo método
145
colorimétrico de Folin-Ciocalteu.
Figura 40 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta
147
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3
obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 254nm).
Figura 41 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18
obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
148
17
Figura 42 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa
150
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a
partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores
de Miconia ferruginata.
Figura 43 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa
151
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a
partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule de
Miconia ferruginata.
Figura 44 – Espectro de massas da substância palmitato de etila (27) obtido
151
para o pico com tempo de retenção de 45.950 minutos da análise em
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
da fração n-hexânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.
(A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de
93% (B).
Figura 45 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa
152
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica
obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Figura 46 – Espectro de massas da substância ciclopropil metil cetona (28)
152
obtido para o pico com tempo de retenção de 9.930 minutos da análise em
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata. (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de
similaridade de 90% (B).
Figura 47 – Espectro de massas da substância 2,3-hexanodiol (29) obtido
para o pico com tempo de retenção de 13.010 minutos da análise em
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata. (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de
similaridade de 100% (B).
153
18
Figura 48 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa
153
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica
obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule
de Miconia ferruginata.
Figura 49 – Espectro de massas da substância isobutirato de etila (30) obtido
154
para o pico com tempo de retenção de 6.315 minutos da análise em
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
da fração diclorometânica do extrato etanólico do caule de Miconia
ferruginata. (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de
similaridade de 91% (B).
Figuras 50 – Representação estrutural dos compostos identificados (27 a 30)
155
por meio da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica
dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
ChemDraw Ultra (2004).
Figura 51 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta
156
eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato
de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Figura 52 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta
156
eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato
de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do
caule de Miconia ferruginata.
Figura 53 – Porcentagem da viabilidade de fibroblastos L929 expostos a
diferentes concentrações dos extratos de Miconia ferruginata. A – Extrato
etanólico das folhas/flores; B- Extrato etanólico do caule; C – Extrato aquoso
das folhas/flores; D – Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando
como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001
ANOVA seguida do pós-teste de Bonferroni. CON: grupo controle de
viabilidade; CM: grupo controle de morte com cloreto de cádmio.
159
19
Figura 54 – Microplaca teste com os extratos etanólicos das folhas/flores e
162
do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata, após
revelação com a resazurina, para as bactérias Staphylococcus aureus (linhas
1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas 4, 5, 6 e 8).
Figura 55 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-
165
231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após
48 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das
folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os
dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9).* p<0,05; **
p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni.CON:
grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT:
grupo com fármaco padrão Paclitaxel.
Figura 56 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-
166
231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após
72 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das
folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os
dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05;
** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni. CON:
grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT:
grupo com fármaco padrão Paclitaxel.
Figura 57 – Porcentagem da viabilidade das formas epimastigotas das
cepas de Tryanosoma cruzi expostas ao extrato etanólico das folhas/flores
de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa Y de T. cruzi; B – Cepa
Colombiana de T. cruzi. Os dados foram representando como média e o
desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do
pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de viabilidade; BEN: Fármaco
padrão benznidazol a 75 µg/mL.
169
20
Figura 58 – Porcentagem da viabilidade das cepas de Leishmania sp.
171
expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata,
após 72 horas. A – Cepa BH46 - Leishmania (leishmania) infantum; B –
Cepa M2269 -L. (leishmania) amazonensis. Os dados foram representando
como média e o desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de
viabilidade; ANF: Fármaco padrão anfotericida B a 1 µg/mL.
Figura 59 – Percentual de viabilidade das PBMC em culturas de 24
175
horas e 5 dias submetidas aos extratos aquosos de Miconia ferruginata. A
– Extrato aquoso das folhas/flores em 24 horas; B – Extrato aquoso do caule
em 24 horas; C – Extrato aquoso das folhas/flores em 5 dias; D – Extrato
aquoso do caule em 5 dias. Os dados foram representando como média e o
desvio padrão (n=5). *p<0,05; **p<0,01 ANOVA seguido pós-teste de
Dunns. CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do
solvente; CdCl2: grupo controle de morte.
Figura 60 - Índice de proliferação de linfócitos expostos aos extratos
177
aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. Os dados
foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p< 0,05;
**p<0,01; ***p<0,001. ANOVA seguido de Tukey em relação ao grupo
PHA. DEXA: grupo controle positivo com a dexametasona 8 µg/mL; E3:
Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.
Figura 61 – Histogramas representativos da análise sobre a proliferação
dos linfócitos expostos aos extratos aquosos das folhas/flores e do caule
de Miconia ferruginata. A – Histograma das culturas estimuladas com PHA;
B – Histograma das culturas estimuladas com PHA e Dexametasona; C, D e
E – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E3 nas concentrações
de 45, 30 e 15 µg/mL, respectivamente; F, G e H – Histograma das culturas
estimuladas com PHA e E4 nas concentrações de 30 20 e 15 µg/mL,
respectivamente. E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do
caule.
178
21
Lista de Quadros
Quadro 1- Características e aplicações das técnicas hifenadas na
47
análise de produtos naturais.
Quadro 2 – Metabólitos secundários e uso medicinal e/ou estudos
53
biológicos de espécies da família Melastomataceae.
Quadro 3- Indicação etnofarmacológica de espécies do gênero
56
Miconia.
Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos
58
vegetais de espécies do gênero Miconia.
Quadro 5 – Taxonomia de Miconia ferruginata
64
Quadro 6 – Relação das reações cromogênicas e de precipitação
80
aplicada para cada classe química analisada na caracterização do perfil
fitoquímico da Miconia ferruginata.
Quadro 7 - Reagentes gerais para pesquisa de alcaloides.
82
Quadro 8 – Resultados da fitoquímica preliminar por meio das reações
128
cromogênicas e de precipitação das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata.
Quadro 9 – Características das cepas bacterianas utilizadas para
determinação da atividade antibacteriana dos extratos brutos de
Miconia ferruginata.
160
22
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Diluição dos extratos na determinação do índice de espuma
90
para pesquisa de saponinas na Miconia ferruginata.
Tabela 2 – Gradiente utilizado nas análises em cromatografia líquida
101
de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD)
para análise dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do
caule de Miconia ferruginata.
Tabela 3 - Rendimento dos extratos etanólicos e aquosos brutos das
122
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
Tabela 4- Rendimento das frações obtidas do extrato etanólico bruto
123
das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata por meio de
partição líquido-líquido com solventes de polaridades crescentes
Tabela 5 – Triagem por meio de cromatografia em camada delgada
131
comparativa (CCDC) dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
Tabela 6 – Dados obtidos na análise em cromatografia em fase gasosa
133
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de
Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida com
headspace (HS-SPME)
Tabela 7 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta
138
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos
extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata
Tabela 8 – Dados obtidos a partir da análise em cromatografia líquida
de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à
espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata
142
23
Tabela 9 – Média e desvio padrão do teor de compostos fenólicos
145
totais dos extratos aquosos de folha/flores e do caule de Miconia
ferruginata
Tabela 10 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta
149
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) das
frações 3 e 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex
LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
Tabela 11 - Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta
157
eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações
acetado de etila do extrato etanólico das folhas/flores e do caule de
Miconia ferruginata.
Tabela 12 – Determinação da atividade antibacteriana e da
161
concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos brutos de Miconia
ferruginata pela técnica de microdiluição em placa utilizando a
resazurina como revelador.
Tabela 13 – Valores de Concentração inibitória 50% (IC50) da
167
viabilidade celular de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231)
exposto aos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule
de Miconia ferruginata nos tempos de 48 e 72 horas de cultura.
Tabela 14 – Leucograma dos voluntários saudáveis participantes do
173
estudo de viabilidade e proliferação de celular.
Tabela 15 - Percentual do índice de proliferação de culturas não
estimuladas com PHA e tratadas com os extratos aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
176
24
Lista de Abreviações
A2780
AIDS
ANFB
BEL-7402
Cell Line human ovarian carcinoma – Linhagem celular de
carcinoma ovariana humana
Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida
Grupo controle com fármaco padrão anfotericina B
Human Hepatocellular Carcinoma Cells – Linhagem celular
de carcinoma hepatocelular humano
BEN
Grupo controle com fármaco padrão Benzonidazol
BH46
Cepa de Leishmania (leishmania) infantum
BHI
Brain Heart Infusion Broth
B. O. D
Incubadora com demanda bioquímica de oxigênio
CAT
Enzima catalase
CC50
Concentração citotóxica a 50%
CCD
Cromatografia em camada delgada
CCDC
Cromatografia em camada delgada comparativa
CFSE
CG-EM
CG-EM-EM
Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl Ester - Diacetato
carboxifluoresceína succinimidil éster
Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas
Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas sequencial
CIM
Concentração inibitória mínima
CLAE
Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-DAD
CLAE-DAD-EM
CLAE-EM-EM
CLAE-EM-RMN
Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por
arranjo de diodos
Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por
arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas sequencial
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear
25
CLAE-RNM
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
ressonância magnética nuclear
CLC
Cromatografia líquida clássica
CL-DAD
Cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos
CL-EM
Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
CM
Grupo controle de mortalidade
CMH
Caldo Mueller Hinton
CON
Grupo controle
CT26
DLD-1
Murine colon carcinoma cells- Células de carcinoma do
cólon de camundongos
Colon cancer cell line – Linhagem celular de câncer de
cólon
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO
dimetilsulfóxido
DNA
ácido desoxirribonucléico
E1
Extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata
E2
Extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata
E3
Extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
E4
Extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata
EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid - Ácido etilenodiamino
tetra-acético
EI
Electron ionization - Ionização por elétrons
ESI
Electrospray ionization - Ionização por Eletrospray
EUA
Estados Unidos da América
Gpx
Glutationa peroxidase
FSC
Forward side scatter - Dispersão da luz frontal
HeLa
Adenocarcinoma do colo uterino humano
HIV-1
HPLC
HS-SPME
Human Immunodeficiency Virus serotype 1 – Vírus da
Imunodeficiência humana sorotipo 2
High Performance Liquid Chromatography – Cromatografia
líquida de alta eficiência
Solid Phase Micro Extration by headspace - Microextração
em fase sólida por headspace
26
HSV-2
HT29
Herpes genital do tipo 2
Human
colon
adenocarcinoma
cells
–
Células
de
adenocarcinoma de cólon humana
IC50
Concentração inibitória de 50%
IE
Índice de espuma
IL-1
Interleucina 1
IL-1b
Interleucina 1 b
IL-2
Interleucina 2
iNOS
Inducible nitric oxide synthase
IP
Índice de Proliferação
IRR
Índice de Retenção Relativa
L929
Fibroblastos de mamíferos clone 929 da linhagem L de
camundongos
LDL
Low Density Lipoproteins – Lipoproteínas de baixa
densidade
LIT
Liver Infusion Triptose
M109
Carcinoma de Madison Lung
M2269
Cepa de L. (leishmania) amazonenses
M4BEU
Weakly metastatic melanoma cells
MALDI
Matrix-assisted
laser
desorption/ionization
-
Dessorção/Ionização com Laser assistida por matriz
MDA-MB-231
Células de adenocarcinoma de mama
MDA-MB-468
Células de adenocarcinoma de mama
MG
Minas Gerais
MTT
3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NK2
Receptors neurokinin type 2 - Receptores de neuroquina tipo
2
NMDA
N-methyl-D-aspartate receptors - Receptores de N-metil-Daspartato
PA
PBMC
PBS
Padrão analítico
Peripheral
Blood
Mononuclear
Cell
-
Mononucleares do Sangue Periférico
Phosphate buffered saline - Tampão Fosfato Salino
Células
27
PBS/BSA
Phosphate buffered saline/Bovine serum albumin - Tampão
Fosfato salina/Soro Albumina Bovina
PHA
Phytohemagglutinin - Fitohemaglutinina
LA2
Phospholipase A2 – Fosfolipase A2
PXT
Grupo controle com fármaco padrão Paclitaxel
R
Coeficiente de correlação
RDC
Resolução da Diretoria Colegiada
Rf
Fator de retenção
RMN-H
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RPMI
Roswell Park Memorial Institute 1640
SDS
Sodium dodecyl sulfate - Dodecil sulfato de sódio
SFB
Soro bovino fetal inativado a 56 ºC
SOD
Superóxido dismutase
TIC
Total ion chromatogram - Cromatogramas de íons totais
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
sp.
Espécie
SSC
Side ligth Scatter – Dispersão da luz lateral
UV
Ultravioleta
UV- vis
Região do Ultravioleta e visível
Y
Cepa do protozoário Trypanosoma cruzi II
28
Lista de Siglas
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC
American Type Culture Collection
CDB
Convenção Sobre Diversidade Biológica
CEP
Comitê de Ética e Pesquisa
CGEN
Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
CIPq-Saúde
Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde
CLSI
Manual Clinical and Laboratory Standards Institute
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
FIOCUZ
Fundação Oswaldo Cruz
FCFRP-USP
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo
HDJF
Herbário Dendrológico Jeanine Felfili
INCA
Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
LEFB
Lista de Espécies da Flora do Brasil
LIMP
Laboratório de Imunopatologia
NATEP
Núcleo de Apoio Técnico de Ensino e Pesquisa
NEPRONAT
Laboratório Núcleo de Estudos de Produtos Naturais
NCTC
National Collection of Type Cultures
NPPNS
Núcleo de Pesquisas em produtos Naturais e Sintéticos
OMS
Organização Mundial da Saúde
SBFgnosia
Sociedade Brasileira de Farmacognosia
SUS
Sistema Único de Saúde
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
UFOP
Universidade Federal de Ouro Preto
UFVJM
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
UNIFESP
Universidade Federal de São Paulo
UNU-IAS
United Nations University - Institute of Advanced Studies
WHO
World Health Organization
29
Lista de Símbolos
°C/min
Grau Celsius por minuto
CdCl2
cloreto de cádmio
células/mL
células por mililitro
cm
centímetro
cm2
centímetros quadrados
CO2
dióxido de carbono
Da
daltons
eV
eletron-volt
+3
Fe
íons férrico
FeCl3
cloreto férrico
g
grama - unidade de medida de massa
g
unidade de gravidade
g/mL
gramas por mililitro
°GL
Grau °Gay Lussac
H2O2
peróxido de hidrogênio
H3PMo12O40
ácido fosfomolibídico
H3PW12O40
ácido fosfotúngstico
KCl
cloreto de potássio
KPa
quilopascal
L
litros
M
molar
mg
miligrama
mg/mL
miligrama por mililitro
mg EAG/g
miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama
min
minutos
mL
mililitro
mL/min
mililitro por minuto
mm
milímetro
mm3
milímetro cúbico
mM
milimolar
30
no
número
NaCl
cloreto de sódio
NaH2PO4
fosfato monossódico
Na2CO3
carbonato de sódio
Na2MoO4.2H2O
molibdato de sódio bihidratado
NaOH
hidróxido de sódio
ng
nanograma
ng/mL
nanograma por mililitro
Nm
nanômetro
NO
óxido nítrico
pH
potencial hidrogeniônico
4-
[(PMoW11O4) ]
complexos de molibdênio-tungstênio
rpm
rotações por minuto
V
volume
v/v
volume por volume
UI/mL
unidade internacional por mililitro
UFC/mL
unidade formadora de colônias por mililitro
u.m.a
unidade de massa atômica
US$
dólar americano
µL
microlitro
µM
micromolar
µm
micrômetro
%
porcentagem
31
Sumario
1. INTRODUÇÃO
39
2. OBJETIVOS
40
2. 1 Objetivo Geral
40
2. 2 Objetivos Específicos
40
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
42
3. 1 As plantas medicinais e fitoterápicos
42
3. 2 Bioprospecção e análise fitoquímica
45
3. 3 Cerrado: biodiversidade e importância
48
3. 4 Familia Melastomataceae
50
3. 5 Gênero Miconia
54
3. 5. 1 Distribuição e aspectos botânicos
54
3. 5. 2 Etnofarmacologia
55
3. 5. 3 Fitoquímica
57
3. 5. 4 Estudos biológicos com espécies do Gênero Miconia
57
3. 6 Miconia ferruginata DC.
63
4 METODOLOGIA
65
4. 1 Equipamentos
65
4. 2 Preparo de reagentes e soluções
66
4. 2. 1 Azul de Tripan
66
4. 2. 2 Caldo Muller Hinton (CMH)
66
4. 2. 3 Caldo e meio sólido Brain Heart Infusion Broth (BHI)
67
4. 2. 4 Carbonato de sódio
67
4. 2. 5 Cloreto de cádmio 2 µM
67
32
4. 2. 6 Meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
67
suplementado
4. 2. 7 Meio de cultura Live Infusion Tryptose (LIT) suplementado
68
4. 2.8 Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado
68
4. 2. 9 Reagente de Bouchardat/Wagner
69
4. 2. 10 Reagente de Dragendorff
69
4. 2. 11 Reagente de Hager
70
4. 2. 12 Reagente de Mayer
70
4. 2. 13 Solução de acetato de chumbo 10%
70
4. 2. 14 Solução de ácido acético 10%
70
4. 2. 15 Solução de ácido clorídrico 10%
70
4. 2. 16 Solução de ácido gálico 100 mg/mL
70
4. 2. 17 Solução de ácido sulfúrico
71
4. 2. 18 Solução de alfa-bisabolol 0,1 g/mL
71
4. 2. 19 Solução de anfotericina B 1 µg/mL
71
4. 2. 20 Solução de antibióticos e antibiótico/antimitótico
71
4. 2. 21 Solução de benznidazol 75 µg/mL
72
4. 2. 22 Solução de butilbrometo de escopolamina 0,08 mg/mL
72
4. 2. 23 Solução de cloranfenicol 30 µg/mL
72
4. 2. 24 Solução de cloreto de alumínio 5%
72
4. 2. 25 Solução de cloreto férrico 2%
73
4. 2. 26 Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%
73
4. 2. 27 Solução de etanol
73
4. 2. 28 Solução de gelatina 2,5%
73
4. 2. 29 Solução de hemina 10 mg/mL
73
4. 2. 30 Solução de hidróxido de amônia
74
33
4. 2. 31 Solução de hidróxido de potássio 5%
74
4. 2. 32 Solução de hidróxido de sódio 1M
74
4. 2. 33 Solução de iodeto de potássio
74
4. 2. 34 Solução de metanol 80%
74
4. 2. 35 Solução de paclitaxel 6 µM
74
4. 2. 36 Solução de quercetina 0,5 mg/mL
75
4. 2. 37 Solução de resazurina 0,01%
75
4. 2. 38 Solução de saponina 0,3 g/mL
75
4. 2. 39 Solução de vanilina sulfúrica 1%
75
4. 2. 40 Solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de
75
tetrazolina (MTT)
4. 2. 41 Solução salina 0,09%
76
4. 2. 42 Tampão fosfato salino (PBS)
76
4. 2. 40 Tampão Fosfato Salino/Albumina sérica bovina (PBS/BSA) 0,1%
76
4. 3 Coleta e identificação taxonômica
77
4. 4 Preparo dos extratos brutos
78
4. 5 Análises fitoquímicas preliminares
79
4. 5.1 Teste para alcaloides
80
4. 5. 2 Teste para antraquinonas
82
a) Reação de Bornträger direta
82
b) Reação de Bornträger indireta com hidrólise ácida
83
4. 5. 3 Teste de esteroides/triterpenoides
83
a) Reação com vanilina sulfúrica
85
b) Reação de Libermann-Burchard
85
c) Reação de Salkowisk
85
4. 5. 4 Teste de flavonoides
85
34
a) Reação de Shinoda
87
b) Reação com cloreto de alumínio
87
c) Reação com cloreto férrico
87
d) Reação com hidróxidos alcalinos
88
e) Reação de Wilson-Taubock
88
f) Reação de Pew
88
4. 5. 5 Teste de saponinas
89
a) Propriedade afrogênica
90
b) Determinação do índice de espuma
90
4. 5. 6 Teste de taninos
90
a) Reação com gelatina
91
b) Reação com cloreto férrico
91
c) Reação com acetato de chumbo
92
4. 6 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
92
4. 6. 1 Analise de alcaloides
94
4. 6. 2 Analise de antraquinonas
94
4. 6. 3 Analise de terpenoides
94
4. 6. 4 Analise de flavonoides
94
4. 6. 5 Analise de saponinas
95
4. 6. 6 Analise de taninos
95
4. 7 Teor de compostos fenólicos
95
4. 8 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
97
massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de
microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME).
4. 9 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
arranjo de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
99
35
4. 10 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
101
arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do
extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
4. 11 Fracionamento dos extratos brutos e análise das frações
102
4. 11. 1 Extratos aquosos
102
4. 11. 2 Extratos etanólicos
102
4. 12 Atividades Biológicas dos extratos etanólicos e aquosos das
104
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
4. 12. 1 Preparo dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule
104
de Miconia ferruginata
4. 12. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata
104
4. 12. 2. 1 Linhagem celular
104
4. 12. 2. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata
105
sobre células de mamífero L929
4. 12. 3 Avaliação de atividade antibacteriana
108
4. 12. 3. 1 Micro-organismos
108
4. 12. 3. 2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
109
4. 12. 4 Atividade antitumoral
111
4. 12. 4. 1 Linhagem celular
111
4. 12. 4. 2 Avaliação da atividade antitumoral dos extratos de Miconia
112
ferruginata sobre células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231
4. 12. 5 Avaliação da atividade tripanocida
113
4. 12. 5. 1 Cepas
113
4. 12. 5. 2 Avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das
113
folhas/flores de M. ferruginata sobre diferentes cepas de T. cruzi
4. 12. 6 Avaliação da atividade leishmanicida
114
4. 12. 6. 1 Cepas
114
36
4. 12. 6. 2 Avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das
115
folhas/flores de Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de Leishmania sp.
4. 12. 7 Avaliação da viabilidade e proliferação celular
115
4. 12. 7. 1 Amostra biológica
115
4. 12. 7. 2 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico
116
(PBMC)
4. 11. 7. 3 Avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de
117
Miconia ferruginata sobre a viabilidade das PBMC humanas, in vitro
4. 12. 3. 4 Análise dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de
119
Miconia ferruginata sobre a proliferação de linfócitos humanos, in vitro
4. 13 Análises estatísticas
121
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
122
5. 1 Perfil químico da Miconia ferruginata
122
5. 1.1 Preparo e rendimento dos extratos e frações
122
5. 1. 2 Fitoquímica preliminar
123
5. 1. 2. 1 Reações cromogênicas e de precipitação
123
5. 1. 2. 2 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
128
5. 2 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
131
massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de
microextração em fase sólida por headspace
5. 3 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
136
arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
5. 4 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
141
arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do
extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata
5. 5 Teor de compostos fenólicos
144
37
5. 6 Fracionamento em coluna Sephadex LH-20 e análise por cromatografia
146
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
5. 7 Análise das frações dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de
150
Miconia ferruginata por cromatografia em fase gasosa acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
5. 7. 1 Análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
150
massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica provenientes do
fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata
5. 7. 2 - Análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
155
arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetato de etila provenientes do
fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata
5. 8 Ensaios Biológicos
158
5. 8. 1 Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre fibroblastos
158
5. 8. 2 Atividade antibacteriana de Miconia ferruginata
159
5. 8. 3 Efeito citotóxico de Miconia ferruginata sobre células tumorais de
164
adenocarcinoma
5. 8. 4 Atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
169
ferruginata
5. 8. 5 Atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de
171
Miconia ferruginata
5. 8. 6 Ação do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a viabilidade de
173
PBMC humana, in vitro
5. 8. 7 Efeito do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a proliferação
175
de linfócitos humanos
6 CONCLUSÕES
180
7 PERSPECTIVAS
182
8 REFERENCIAS
183
38
ANEXO A - Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa
226
ANEXO B – Termo de consentimento livre e esclarecido
227
ANEXO C – Autorização para coleta da espécie Miconia ferruginata DC.
230
ANEXO D - Autorização para acesso ao patrimônio genético
231
APÊNDICE A – Espectros de Massas dos compostos identificados por meio
233
análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta
APÊNDICE B – Espectros de massa obtidos da análise em cromatografia
238
líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à
espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
APÊNDICE C - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise
244
em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna
Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
APÊNDICE D - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise
246
em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em
coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia
ferruginata
APÊNDICE E - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da
249
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos
de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
APÊNDICE F - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos
de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato do extrato etanólico do caule de
Miconia ferruginata.
253
39
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são comumente utilizadas pela humanidade por milhares
de anos para tratamento de diversas doenças e controle de pragas, além de serem
utilizadas como matéria-prima bruta e modelo para a síntese de substâncias bioativas
(MACIEL et al., 2002; SIMÕES et al., 2007). Nos países em desenvolvimento as
plantas muitas vezes são o único recurso terapêutico disponível para tratar doenças das
populações cujo acesso a medicamentos industrializados é limitado, além da tradição do
uso de plantas medicinais. Entretanto, somente o uso tradicional não é suficiente para
comprovar a eficácia e segurança dos produtos naturais e, estudos científicos que
comprovem estas características se fazem necessários (MACIEL et al., 2002; HIGUCHI,
2007).
Assim, com base nos dados etnobotânicos, a exploração dos recursos biológicos
naturais por meio da bioprospecção tem sido foco de vários estudos atualmente
(FONTANA et al., 2000; BARREIRO, 2009). A bioprospecção propicia a exploração
da biodiversidade e conhecimento do potencial químico e farmacológico do patrimônio
genético vegetal e animal. Isso pode fornecer substâncias importantes ao ser humano,
permitir a seleção de princípios ativos com potencial econômico e contribuir para
melhorar a pesquisa no país (HIGUCHI, 2007; SACCARO JR, 2011; PALMA;
PALMA, 2012).
A partir de 2009 aumentou expressivamente o interesse dos setores
governamentais e privados em tentar associar o avanço tecnológico ao conhecimento
popular e ao desenvolvimento sustentável. Neste contexto, a Política Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos tem como objetivo promover a pesquisa,
desenvolvimento de tecnologias e inovações em plantas medicinais e fitoterápicos, com
base na biodiversidade brasileira, abrangendo espécies vegetais nativas e exóticas
adaptadas, priorizando as necessidades epidemiológicas da população nas diversas fases
da cadeia produtiva (BRASIL, 2009a).
Segundo a Associação Brasileira de Empresas do Setor Fitoterápico, não existem
dados oficiais desse mercado e, as estimativas variam entre US$ 350 milhões a US$ 550
milhões, correspondendo a 10,5% do mercado farmacêutico. De acordo com a ANVISA,
em 2013, o Brasil contava com cerca de 400 medicamentos fitoterápicos registrados.
Assim em decorrência da busca de novas substâncias biologicamente ativas, o
interesse sobre a diversidade dos biomas brasileiros vem crescendo em ritmo acelerado,
no qual o bioma que mais se destaca é Cerrado, por apresentar a segunda maior
40
biodiversidade e extensão (DIAS, 1996; BRASIL, 2007). A família Melastomataceae é
a sexta família em importância neste bioma, contendo cerca de 518 espécies
(MENDONÇA; LINS, 2000), entre elas a espécie Miconia ferruginata DC. Esta espécie
é conhecida popularmente como pixirica-do-campo ou babatenão, utilizada em forma de
banhos ou infuso para tratamento de dores, doenças de pele, além de doenças de origens
inflamatórias, parasitárias e infecciosas (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010). Contudo,
apesar desta ser uma espécie com utilização popular no Cerrado, os estudos científicos
são escassos e, por isso, há necessidade em aprofundá-los tanto sobre a composição
química quanto atividades biológicas desta espécie.
2 OBJETIVOS
2. 1 Objetivo Geral
Realizar estudo fitoquímico e avaliar atividades biológicas da espécie Miconia
ferruginata.
2. 2 Objetivos Específicos
a) Obter extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata;
b) Realizar análises fitoquímicas preliminares, por meio de reações cromogênicas, de
precipitação e cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC);
c) Realizar análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e
do caule de M. ferruginata;
d) Realizar análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato
etanólico das folhas/flores de M. ferruginata;
e) Particionar os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule com solventes de
diferentes polaridades e posterior análise das frações obtidas por meio de cromatografia
em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida
de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD);
f) Realizar o fracionamento dos extratos aquosos das folhas/flores e caule por
cromatografia por exclusão utilizando coluna Sephadex LH-20 e, posterior análise das
frações obtidas por CLAE-DAD;
41
g) Avaliar constituintes voláteis das folhas, flores e caules presentes na M. ferruginata,
através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) e posterior análise
em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM);
h) Avaliar a citotoxidade dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule
de M. ferruginata em modelos, in vitro, sobre fibroblastos de camundongo da linhagem
L929;
g) Avaliar a atividade antibacteriana, in vitro, dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata;
h) Avaliar, in vitro, a atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de M.
ferruginata;
i) Avaliar, in vitro, a atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de M.
ferruginata;
j) Avaliar, in vitro, a atividade antitumoral dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre células de adenocarcinoma de mama,
MDA-MB-231;
k) Avaliar o efeito dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata
sobre a viabilidade e proliferação de leucócitos mononucleares do sangue periférico
humano.
42
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3. 1 As plantas medicinais e fitoterápicos
O uso de plantas com fins medicinais pelo homem é uma das mais antigas práticas
terapêuticas da humanidade. Existem relatos da utilização de plantas pelas comunidades
egípcias, asiáticas e chinesas desde 1.600 anos antes de Cristo (a.c), incluindo, por
exemplo, a mirra, o cânhamo e o ópio (SCHWAMBACH, 2007). De acordo com a
Organização Mundial da Saúde (OMS) define-se como planta medicinal "todo e
qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser
utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos"
(OMS, 1998). Assim toda planta que contém um ou mais princípios ativos em sua
composição que são úteis à saúde humana e animal, são consideradas plantas medicinais
(MORGAN, 1994).
O conhecimento popular sobre plantas medicinais foi acumulado e transmitido
verbalmente por sucessivas gerações (CUNHA, 2003), gerando uma rica cultura. Esta
prática representa muitas vezes o único recurso terapêutico de várias comunidades e
grupos étnicos, principalmente, nos países em desenvolvimento (MACIEL et al., 2002).
Estima-se que entre 70 a 90% da população mundial já utilizou ou utiliza algum tipo de
planta para tratar alguma sintomatologia (WINSLOW; KROLL, 1998; OMS, 2011). A
OMS afirma que a medicina tradicional está contida em um conjunto de conhecimentos,
técnicas e procedimentos baseados em teorias, crenças e experiências. Este conjunto de
informações é empregado na manutenção da saúde, prevenção, diagnóstico e tratamento
de enfermidades físicas e mentais (OMS, 2002).
O Brasil apresenta uma grande biodiversidade e possui vasta variedade cultural e
étnica, o que torna comum o uso de plantas medicinais pela sua população (BRASIL,
2006a; ALBUQUERQUE et al., 2007; FREITAS et al., 2012). Na maioria das vezes as
plantas são utilizadas na forma de extratos brutos, decoctos, infusos, macerados,
“garrafadas”, xaropes ou emplastros para o tratamento de diversas doenças (GURIBFAKIM, 2006). No país o comércio de plantas medicinais é comum tanto nas regiões
mais pobres como também nas grandes cidades, em feiras livres, mercados populares
como também são frequentemente plantadas nos quintais das casas (MACIEL et al.,
2002; HOEFFEL et al., 2011).
Embora o conhecimento do potencial curativo e a utilização das plantas sejam
antigos, os estudos relacionados à avaliação de suas propriedades medicinais são
43
recentes. Entre as 500 mil espécies de plantas catalogadas no mundo, apenas 1% foi
estudada cientificamente quanto ao seu potencial químico-farmacológico (MELENDÉZ;
CAPRILES, 2006). Por isso, muitas espécies vegetais têm sido utilizadas
empiricamente, sem respaldo científico quanto a sua eficácia e segurança (HOLETZ et
al., 2002; AGRA et al., 2008; TACHJIAN et al., 2010).
O processo de descoberta e desenvolvimento de um novo fármaco ou fitoterápico é
longo, complexo, caro e de alto risco, sendo dividido em duas fases: 1) a fase de
descoberta denominada fase pré-clínica ou pesquisa básica que ocorre por meio de
testes in vitro e in vivo e 2) a fase de desenvolvimento ou clínica, a qual se subdivide em
quatro etapas experimentais em humanos (LOMBARDINO; LOWE, 2004). Contudo,
após cumpridas essas fases de avaliação são poucas as moléculas ou fitoterápicos que se
enquadram em todos os requisitos exigidos e são aprovados para comercialização
(YUNES et al., 2001). Neste contexto, apesar da disponibilidade de tecnologia e
estratégia suficiente para a obtenção de fármacos derivados exclusivamente da síntese
química, em geral, os produtos naturais e, principalmente, as plantas medicinais,
continuam a ser a fonte mais promissora de novos fármacos e constituintes químicos.
Seus princípios ativos servem como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e
matéria prima farmacêutica, bem como para a exploração no mercado fitoterápico
(BALUNAS; KINGHORN, 2005; SCHMIDT et al., 2008). Estima-se que 25% dos
medicamentos atualmente utilizados na clínica médica são derivados diretamente ou
indiretamente de plantas medicinais (PHILLIPSON, 2001; BRASIL, 2012).
A partir da aprovação e validade das plantas medicinais e fitoterápicos com
finalidade profilática e terapêutica pela OMS, o Brasil começou a valorizar e validar
essas práticas por meio de programas e políticas de saúde. Essas medidas foram
inicialmente implantadas por meio da Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares no SUS, que é uma diretriz e linha de ação para o programa de
“Plantas Medicinais e Fitoterapia no SUS”. Esta política envolve também outras formas
alternativas de terapêutica, tais como a homeopatia e acupuntura (BRASIL, 2006b;
BRASIL, 2008a).
No que se refere às plantas medicinais e fitoterápicos, esta política fornece como
objetivo geral a inclusão destes recursos terapêuticos no SUS e caracteriza fitoterápico
como um produto obtido de planta medicinal ou seus derivados, com exceção de
substâncias isoladas, para aplicação profilática, curativa ou paliativa, em que seu uso foi
validado e comprovado cientificamente (BRASIL, 2006a). Além disso, o programa
44
recomenda medidas secundárias que buscam qualificar os profissionais de saúde para o
conhecimento da fitoterapia, a realização de estudos epidemiológicos que identifiquem
doenças passíveis de utilização da fitoterapia e, de estudos de eficácia e segurança que
forneçam critérios para a inclusão e/ou exclusão de espécies vegetais em uma futura
relação nacional de plantas medicinais (BRASIL, 2006b; BRASIL, 2008a).
Com o intuito de fortalecer o desenvolvimento da cadeia produtiva de plantas
medicinais e fitoterápicos e de sua inserção na rede pública, em 2009, o governo
brasileiro aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
(RODRIGUES et al., 2006a; BRASIL, 2009a). Esta política busca garantir o acesso
seguro e racional de plantas medicinais e fitoterápicos, a promoção do uso sustentável
da biodiversidade e o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional
(BRASIL, 2009a).
Em 2010, a ANVISA fundamentada nas diretrizes destas políticas nacionais,
promoveu ampla revisão das legislações para o setor fitoterápico e elaborou novas
normas, como a RDC nº 10/2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais.
Promoveu também, por meio da Farmacopeia Brasileira a revisão das monografias de
plantas medicinais (BRASIL, 2010b). Porém, apenas em 2014, foi que entrou em vigor
a Resolução n° 26/2014, que define as categorias de medicamento fitoterápico e produto
tradicional fitoterápico, bem como estabelece os requisitos mínimos para o registro e
renovação de registro de medicamento fitoterápico e, para o registro, renovação de
registro e notificação de produto tradicional fitoterápico. Neste mesmo ano, pela
Instrução Normativa n° 2, foram publicados os 27 medicamentos fitoterápicos e os 16
produtos tradicionais fitoterápicos, ambos com registro simplificado (BRASIL, 2014 b e
c).
Em virtude da importância destes programas no contexto da fitoterapia na rede
pública, o Ministério da Saúde, por meio da Portaria GM nº 886, de 20 de abril de 2010,
instituiu a Farmácia Viva no âmbito do SUS. Esta portaria estabelece que este centro
deve participar de todas as etapas da cadeia produtiva, desde cultivo até a dispensação
de preparações magistrais e oficinais de plantas medicinais e fitoterápicos na rede
pública (BRASIL, 2010c).
45
3. 2 Bioprospecção e análise fitoquímica
O Brasil é detentor da maior biodiversidade do planeta, concentrando
aproximadamente 13% de todas as espécies existentes (LEWINSOHN; PRADO, 2006).
Uma das maneiras de tentar extrair o valor econômico da biodiversidade é por meio da
bioprospecção. SACCARO JR (2011) a define como a busca sistemática por
organismos, genes, enzimas, compostos, processos de partes provenientes de seres vivos
de modo geral, com potencial econômico e, que possam ser usados para o
desenvolvimento de um produto comercializável. O conjunto dos alvos levantados pela
bioprospecção forma o patrimônio genético nacional.
Uma das primeiras ações para a preservação da diversidade biológica foi a
Convenção Sobre Diversidade Biológica (CDB), que reconheceu a soberania de cada
país sobre os recursos genéticos em seu território (CDB, 2015). Esta primeira reunião
ocorreu em 1992 e contou com a participação de 168 países, teve como base a
conservação e a utilização sustentável da biodiversidade como preocupação comum da
humanidade (BRASIL, 1992). Posteriormente, em 2001, foi criado o Conselho de
Gestão do Patrimônio Genético (CGEN), o qual tem como atribuição deliberar sobre o
credenciamento de instituições públicas responsáveis por analisar as solicitações de
acesso aos recursos genéticos e emitir as autorizações, tanto para o acesso ao patrimônio
genético e ao conhecimento tradicional quanto para sua remessa para o exterior
(BRASIL, 2003; AZEVEDO, 2005).
Os incentivos às ações de bioprospecção são necessários com objetivo de impedir a
apropriação indevida do patrimônio genético, promover o desenvolvimento interno da
pesquisa, obtenção de patentes, produção e exportação de produtos provenientes da
biodiversidade e do fortalecimento tecnológico e econômico. Nesse contexto, o Brasil
apresenta uma imensa vantagem, pois conta atualmente com um desenvolvido setor
acadêmico e tecnológico (NEGRAES; EGLER, 2002). Estes investimentos resultam em
muitos benefícios quando associados também a bioprospecção, principalmente, nos
setores da saúde. Cerca de 50% dos fármacos mundiais foram desenvolvidos com base
em moléculas biológicas obtidas de estudos com produtos naturais (SACCARO JR,
2011), especialmente, drogas antitumorais e antibióticos (UNU-IAS, 2005). Porém, o
Brasil ainda tem pequena contribuição científica e precisa avançar ainda mais nesta área.
A bioprospecção na área de plantas medicinais é realizada por meio de análises
fitoquímicas e ensaios biológicos in vitro e in vivo de extratos brutos e de moléculas
bioativas isoladas. A fitoquímica envolve o conhecimento sobre os constituintes
46
químicos produzidos pelo metabolismo secundário dos vegetais em seu processo de
adaptação ao meio ambiente, por meio de isolamento e elucidação estrutural desses
metabólitos (SIMÕES et al., 2007). Assim, os estudos fitoquímicos fornecem dados
para obtenção e/ou desenvolvimento de novas moléculas terapêuticas, que podem ser
usadas como base de matéria-prima farmacêutica, protótipos moleculares de fármacos, e
no desenvolvimento de fitoterápicos (BRAZ FILHO, 2010).
Os estudos fitoquímicos se dividem em duas grandes áreas: a fitoquímica clássica e
a fitoquímica moderna. A primeira, envolve ensaios preliminares por meio de reações
cromogênicas, de precipitação e isolamento de moléculas por métodos cromatográficos
clássicos, tais como cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em
camada delgada comparativa (CCDC), cromatografia líquida clássica (CLC) e outros
(BARBOSA, 2004). A fitoquímica moderna abrange os ensaios de separação
anteriormente citados, porém emprega técnicas hifenadas de detecção e análise como
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM),
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (CL-EM), cromatografia
líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos acoplada à espectrometria
de massas (CLAE-DAD-EM), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
ressonância magnética nuclear (CLAE-RNM) e outras (CROTTI et al., 2006;
RODRIGUES et al., 2006b).
O termo técnica hifenada refere-se ao acoplamento de duas ou mais técnicas
analíticas com o objetivo de obter uma ferramenta de análise mais eficiente e rápida que
as técnicas convencionais (PINTO, 2002; RODRIGUES et al., 2006b). No Quadro 1 foi
apresentado resumidamente a aplicação das diferentes técnicas hifenadas na área de
produtos naturais.
47
Quadro 1- Características e aplicações das técnicas hifenadas na análise de
produtos naturais.
Técnicas
Características
CG-EM
Identificação de
compostos voláteis ou
volatilizáveis.
Fornece informação
estrutural da molécula.
Permite comparação com
bibliotecas espectrais.
CG-EM-EM
.
Identificação de
compostos voláteis ou
volatilizáveis.
Confirmação estrutural de
moléculas.
Identificação de
compostos
através da comparação do
tempo de retenção e
espectro UV com o
padrão analítico. Fornece
pouca ou nenhuma
informação estrutural.
Raramente resulta na
identificação definitiva.
Muitas vezes acoplado
com CLAE-DAD para
fornecer informações
estruturais
complementares.
Empregado na
quantificação de
compostos.
Determinação de novos e
de compostos já
conhecidos com a incrível
vantagem da simplicidade
no preparo da amostra e
rapidez na obtenção dos
resultados.
Constitui-se a técnica
mais poderosa na
determinação estrutural
de substâncias inéditas
com novos esqueletos e
em misturas
biologicamente ativas.
CLAE-DAD
CLAE-EM
CLAE-EMEM
CLAE-RMN
Exemplos de aplicação na
área de produtos
naturais
Estudo da sazonalidade de
algumas classes de
metabólitos secundários,
caracterização de aromas e
identificação de
terpenoides. Análise de
flavonoides após
derivatizações.
Análise de fragrâncias e
essências.
Referências
Análise de flavonoides.
Controle de qualidade de
plantas medicinais, busca
de metabólitos ativos,
estudos de ecologia
química e
quimiossistemáticos.
BRANCO;
PIZZOLATTI,
2002
Análise de antocianinas
Quando acoplados ao
ionizador tipo ESI ou
MALDI permite análise de
moléculas termolábeis,
complexos organometálicos
e moléculas de elevada
massa molecular incluindo
polímeros e proteínas.
Determinação de
flavonoides e saponinas.
SMITH et al.,
1991; COSTA et
al., 2000; PINTO,
2002
Determinação de
alcaloides, flavonoides
lactonas sesquiterpênicas,
esteroides, saponinas,
iridoides e metabólitos
secundários aromáticos.
WOLFENDER et
al., 1998;
FERRARI et al.,
2000; BRANCO;
PIZZOLATTI,
2002; PINTO,
2002; ZANOLARI
et al., 2003
BRANCO;
PIZZOLATTI,
2002; FIAMEGOS
et al., 2004
GRANERO et al.,
2004
WOLFENDER et
al., 1998
48
A maior vantagem das técnicas hifenadas é a facilidade e rapidez na caracterização
de compostos e/ou moléculas presentes em extratos brutos ou misturas complexas de
produtos naturais (HOSTETTMANN et al., 2001; EISENREICH; BACHER, 2007). A
partir de uma triagem química por meio de técnicas como CL-EM, CLAE-EM, CLAEDAD-EM e CLAE-EM-RMN obtêm-se uma gama de informações sobre a constituição
metabólica e estrutural de diferentes tipos de produtos naturais (WILSON;
BRINKMAN, 2003; PATEL et al., 2010). Esta praticidade fornece uma racionalização
de estudos químicos, de tempo e de custos. Essas técnicas são mais sensíveis, mesmo
em baixas concentrações (na ordem de picogramas), necessitam de menores quantidades
de amostra e, apresentam alta confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados. Além
disso, apresenta a vantagem de gerar menor quantidade de resíduos e menor gasto de
solvente quando comparado com as técnicas clássicas (COLLINS et al., 2006).
Com o desenvolvimento destas técnicas para caracterização química de produtos
naturais, a produção científica nesta área vem crescendo em ritmo acelerado. Um
levantamento entre 1998 a 2009 em todo mundo, registrou 32.960 publicações
científicas na área de fitoquímica, de acordo com o banco de dados da Web of Scienc. O
Brasil ocupa a sexta posição, com 1.762 publicações. Este reflexo é visto no aumento do
número de novos medicamentos de origem vegetal, no qual das 119 drogas produzidas
75% foram extraídas de plantas superiores (PIMENTEL; ALMEIDA, 2010).
Além disso, a contribuição da medicina popular na fundamentação e ponto de
partida para a investigação pré-clínica não pode ser desprezada. Entre os fitoterápicos
e/ou fitofármacos produzidos, 74% foram descobertos por meio de orientações baseadas
na medicina popular. Assim, concomitantemente com o desenvolvimento científico da
química de produtos naturais contribui-se para o avanço de outras atividades científicas
e tecnológicas no país, além de fortalecer o conhecimento popular (LEMOS et al., 2007).
3. 3 Cerrado: biodiversidade e importância
O Brasil apresenta a maior diversidade biológica do mundo, distribuídas em áreas
vegetais de plantas nativas como a Caatinga, a Mata Atlântica, o Pantanal, os Campos, a
Amazônia e o Cerrado. Este último se destaca por ser um dos principais biomas, tanto
em área quanto em biodiversidade (BIZERRIL, 2003) ocupando 25% do território
brasileiro (BRASIL, 2007).
O Cerrado é a maior região de savana tropical da América do Sul e ocorre
predominantemente no Planalto Central (Figura 1) (BRASIL, 2007). Este bioma é
49
encontrado no Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins,
Maranhão,
Bahia,
Piauí,
Minas
Gerais,
São
Paulo
e Paraná,
abrangendo
aproximadamente 1.500 municípios. Pode ser encontrado ainda em encraves isolados
em quase todos os estados, nos quais se destacam: Campos de Humaitá e Campos do
Puciarí (Amazonas), Serra dos Pacaás Novos (Rondônia), Serra do Cachimbo (Pará) e
Chapada Diamantina (Bahia) (BRASIL, 2009b).
Bioma Cerrado
Figura 1 – Localização do Bioma Cerrado na América do Sul. Extraída de BRASIL, 2009b.
Com grande riqueza de espécies e elevada variedade, no Cerrado são observadas
desde plantas herbáceas, arbustivas, arbóreas até cipós, totalizando cerca de 12.187
espécies nativas distribuídas em 181 famílias (REZENDE et al., 2008; LEFB, 2015), na
qual 4.440 são endêmicas (KLINK; MACHADO, 2005). Entre as famílias que se
destacam estão a Malpighiaceae, Vochysiaceae, Leguminosae e Melastomataceae
(MENDONÇA et al., 1998).
Apesar da diversidade biológica, o Cerrado vem sendo devastado num ritmo
bastante acelerado, devido às queimadas descontroladas, a expansão não sustentável da
agricultura, a caça predatória e a poluição (NEPSTAD et al., 1997; DUARTE; BRAGA,
1998). Isso ocasionou a sua inclusão na lista dos 25 hotspots de biodiversidade do
mundo (SILVA; BATES, 2002). Os hotspots são áreas críticas para a conservação,
50
definidas com base na existência de espécies endêmicas, particularmente, as de
distribuição geográfica restrita, e no grau de ameaça ambiental (MYERS et al., 2000).
Também na tentativa de conservação das espécies foi elaborada a Portaria no 443, de 17
de dezembro de 2014. Esta norma dispõe sobre a “Lista Nacional Oficial das Espécies
da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção”, na qual das 4617 espécies ameaçadas,
2118 se encontram na Mata Atlântica e no Cerrado (BRASIL, 2014a).
A grande biodiversidade vista no Cerrado ocorre devido à variedade de ambientes,
observadas em sua extensão, onde se destacam os diferentes tipos de solos, relevo e
fitofisionomias. Estas fitofisionomias estão representadas por formações florestais,
savânicas e campestres (BRASIL, 2009b). De acordo com RIBEIRO e WALTER
(2008), neste bioma são descritos onze tipos principais de vegetação distribuídos em
três formações: 1) florestais (Mata Ciliar, Mata de Galeria, Mata Seca e Cerradão), 2)
savânicas (Cerrado sentido restrito, Parque de Cerrado, Palmeiral e Vereda) e 3)
campestres (Campo sujo, Campo limpo e Campo rupestre).
Em consequência da sua elevada biodiversidade, o uso da flora e fauna do Cerrado é
bastante diversificado. A população regional utiliza a riqueza vegetal para gerar
alternativas sustentáveis de renda, envolvendo atividades de diferentes naturezas, tais
como alimentícias, madeireiras, forrageiras, artesanais e, em especial, medicinais. Entre
as espécies, se destacam o baru, a cagaita, o araticum, a guariroba, o pequi, a arnica, o
barbatimão, o velame, os frutos de sucupira, a mangaba e as sempre-vivas (AGUIAR;
CAMARGO, 2004; OLIVEIRA et al., 2008).
No Estado de Minas Gerais o Cerrado concentra cerca de 8.155 espécies distribuídas
em 175 famílias (LEFB, 2015). Entre essas regiões, o município de Diamantina
localizado na região nordeste de Minas, apresenta como fitofisionomia marcante e com
maior extensão o campo rupestre. De acordo com DRUMMOND et al. (2005) esta
região, apresenta importância biológica e farmacológica especial, ainda pouco
explorado.
3. 4 Família Melastomataceae
Melastomataceae representa uma das mais importantes famílias botânicas da flora
neotropical, constituída de 4.200 a 5.000 espécies distribuídas em 11 tribos e 185
gêneros (RENNER, 1993; RENNER et al., 2015) de distribuição pantropical (Figura 2)
(MARCON; COSTA, 2000). Esta família tem sido reconhecida por ser característica e
de grande importância, quanto ao número de espécies, ambientes ocupados, aspectos
51
reprodutivos, biodiversidade, e aplicações pelo homem (BORGES, 1991; ROMERO;
MARTINS, 2002; SANTOS, 2003). Em geral, as suas espécies são bastante utilizadas
para o reflorestamento de áreas degradadas, retirada da madeira, uso ornamental,
confecção de artesanatos e aplicações medicinais (CRUZ; KAPLAN, 2004; GILSANTANA; MARQUES, 2008; ALMEIDA; BANDEIRA, 2010; ALBUQUERQUE et
al., 2013).
Figura 2 – Mapa com as áreas de ocorrência das espécies da família Melastomataceae com destaque os
países
de
maior
ocorrência
em
preto.
Fonte:
Trópicos
(2015).
Disponível
em:
http://www.tropicos.org/NamePage.aspx?nameid=42000202&tab=maps.
Esta família é representada por árvores e arbustos, em sua maioria, e em menor parte
por lianas, epífitas, ervas anuais e perenes (ROMERO; MARTINS, 2002; JUDD et al.,
2010). As espécies são facilmente reconhecidas, por apresentarem características
específicas, tais como folhas opostas, simples, geralmente curvinérvias, flores vistosas
bissexuadas, dialipétalas, períginas ou epíginas com estames em número duplo ao de
pétalas (SOUZA; LORENZI, 2005). As flores, geralmente, localizadas nas
inflorescências terminais ou axilares são polinizadas por abelhas coletoras de pólen
(JUDD et al., 2010). Os estames são frequentemente longos, exsertos e vistosos, anteras
poricidas, normalmente falciformes, frutos capsulares ou baciformes com grande
quantidade de sementes (SOUZA; LORENZI, 2008). Apresentam facilidade em
adaptações, devido à grande produção de sementes, eficiente dispersão dos propágulos,
altas taxas de germinação e crescimento rápido (ALBUQUERQUE et al., 2013).
52
No Brasil essa família é a sexta maior entre as Angiospermas, distribuídas desde a
Amazônia até o Rio Grande do Sul, ocorrendo em quase todas as formações
vegetacionais (ROMERO; MARTINS, 2002). Dos 185 gêneros, 17 deles são
considerados endêmicos, no qual os gêneros Miconia Ruiz & Pav., Leandra Raddi e
Tibouchina Aubl. são os mais representativos (BAUMGRATZ et al., 2014). O gênero
Miconia representa aproximadamente 30% das espécies desta família (GOLDENBERG;
CADDAH, 2013 e 2015; REZENDE, 2012) e a maioria é encontrada nas regiões
tropicais e subtropicais (RENNER et al., 2015). Em Minas Gerais são encontrados
aproximadamente 29 gêneros e 342 espécies desta família, com 86 espécies
pertencentes ao gênero Miconia (REZENDE, 2012; BAUMGRATZ et al., 2014).
Por causa da sua ampla distribuição e biodiversidade no território brasileiro, a
família Melastomataceae tem proporcionado a realização de vários estudos, porém,
ainda não refletem sua diversidade taxonômica no país (GOLDENBERG et al., 2012).
O seu perfil químico ainda é pouco conhecido (RODRIGUES, 2007), dentre os estudos
químicos, têm sido verificado a presença comum de ácidos graxos, flavonoides, taninos,
triterpenoides e quinonas (CELOTTO, et al., 2003; RODRIGUES, 2007).
Na medicina popular, as espécies desta família já foram relacionadas a ações
antiparasitárias, antihelminticas, antivirais, antitumorais, anti-inflamatórias, cicatrizante
e anti-séptica. Também já foi registrado seu uso no tratamento da escabiose, dispepsia,
hipertensão, erisipela, leucorreia, dermatoses, eupepsia, reumatismo, resfriado, febre,
hematúria, insônia, dores de cabeça e diversas infecções (CALDERÓN et al., 2002;
DÉVÉHAT et al., 2002; CELOTTO, et al., 2003; CUNHA et al., 2003a e b; NETO;
MORAIS, 2003; CRUZ; KAPLAN, 2004; KALA, 2005; BRASILEIRO et al., 2006;
FENNER et al., 2006; PINTO et al., 2006; BARDÒN et al., 2007). No Quadro 2 são
descritas algumas espécies de Melastomataceae estudadas quanto ao seu perfil químico,
ao uso medicinal e/ou as atividades biológicas.
53
Quadro 2 – Metabólitos secundários e uso medicinal e/ou estudos biológicos de
espécies da família Melastomataceae.
Espécie
Clidemia cf. rubra
Mart
Clidemia hirta (L.)
G. Don
Henriettella
fascicularis (Sw.) C.
Wright
Leandra australis
(Cham.) Cogn.
Marcetia latifolia
Naudin.
Melastoma
malabathricum L.
Melastoma
pauciflora Lam.
Classe química
Uso medicinal/
Atividade biológica
Afecções de garganta
Antocianinas e
compostos fenólicos
Antocianidinas e
compostos fenólicos
Flavonoides,
terpenos e derivados
do ácido elágico
Taninos, flavonoides,
antocianinas e
saponinas
Triterpenos e
flavonoides
polimetoxilados e
glicosilados
Taninos
hidrolisáveis e
flavonoides
Taninos hidrolisáveis
e flavonoides
Mouriri elliptica
Mart.
Flavonoides
glicosilados
Pterolepis glomerata
(Rottb.)Miq.
Tibouchina asperior
(Cham.) Cogn
Flavonoides e
terpenos
Flavonoides e
terpenos
Tibouchina
semidecandra F.
Taninos
hidrolisáveis
Tibouchina
urvilleana
Antocianidinas
Antidesintérico,
antisséptico,
antiespasmótico,
cicatrizante, vômitos
e banhos genitais
Antitumoral
Diarreia,
enfermidade do
aparelho circulatório
e espasmos
Antimicrobiana
Flavanona e
triterpenos
RODRIGUES, 2007;
MOURA, 2006;
GORDON et al.,
2011
GUARIM NETO;
MORAIS, 2003;
COSTA et al., 2006;
GIRALDI;
HANAZAKI, 2010
CALDERÓN
et al., 2002;
CALDERÓN
et al., 2003
HASS; VAN
POSER, 1990;
PLANTMED, 2015
LEITE, 2009
Antiviral e
tratamento de úlceras
Úlceras
Pressão alta, varizes,
prurido, hemorroida,
depurativo do
sangue, gastrite e
úlceras
Diarreia e outros
problemas intestinais
Diurético
Dores de cabeça e
cicatrizante
Analgésica
(DC.) Cogn.
Trembleya laniflora
(D. Don) Cogn.
Referência
Antimicrobiana
YOSHIDA et
al., 1992; DÉVÉHAT
et al., 2002
MOREIRA, 1862
ANDRÉO, 2008
SANTOS et al., 2009
ALICE et al., 1995
YOSHIDA et
al., 1999; PIVA,
2002
TERAHARA
et al., 1993
VENTURA et al.,
2007
54
3. 5 Gênero Miconia
3. 5. 1 Distribuição e aspectos botânicos
O gênero Miconia Ruiz & Pav., é considerado um dos maiores gêneros
neotropicais de Angiospermas, apresentando entre 1.000 a 2.000 espécies publicadas
(GOLDENBERG, 2000; RENNER; BECK, 2003). De acordo com ROMERO e
MARTINS (2002) este gênero tem distribuição ampla nas formações florestais do
neotrópico, ocorrendo desde o sul do México até o norte da Argentina e Uruguai. No
Brasil é representado por 281 espécies, das quais 123 são endêmicas (GOLDENBERG;
CADDAH, 2015), distribuídos em todos os estados, com predominância nas regiões
Norte e Sudeste (Figura 3) (GOLDENBERG, 2000; BAUMGRATZ; CHIAVEGATTO,
2006; GOLDENBERG et al., 2012).
Figura 3 - Distribuição geográfica do gênero Miconia no Brasil e determinação atual do número de
espécies por estado. Extraída de GOLDENBERG; CADDAH (2015).
55
As espécies deste gênero são reconhecidas pelo hábito arbustivo ou arbóreo com
ramos e face abaxial das folhas densamente recobertas por tricomas dendríticos curtos,
mesclados com tricomas estrelados, folhas discolores, com margem inteira. As
inflorescências são terminais multiflorais, geralmente glomeruladas, mas com alguns
ramos, às vezes com flores mais esparsadas e estames brancos (GOLDENBERG;
REGINATO,
2006).
Segundo
JUDD
(1989),
estas
características
são
simplesiomórficas, ou seja, são características compartilhadas por dois ou mais grupos,
e por isso contribuem para problemas taxonômicos (WURDACK; RENNER, 1993;
MARTINS et al., 1996).
3. 5. 2 Etnofarmacologia
O uso econômico do gênero Miconia concentra-se na existência de espécies
ornamentais (SOUZA; LORENZI, 2008), em que cerca de 250 são utilizadas para este
fim (GIL-SANTANA; MARQUES, 2008). Devido à exibição de flores bonitas e
atrativas, essas espécies, são empregadas na ornamentação de ruas, parques e praças
públicas (LORENZI; SOUZA, 2001). Outra importância é sua aplicação medicinal
(CRUZ; KAPLAN, 2004), em que, essas espécies são encontradas de forma endêmica
na região do Cerrado. Contudo, apesar da diversidade desse gênero poucas espécies
foram exploradas quanto ao seu potencial químico-farmacológico.
O uso popular ocorre principalmente na forma de infuso e extratos alcoólicos das
folhas e flores para tratamento de doenças inflamatórias, infecciosas e ações antiofídicas
e analgésicas (CRUZ; KAPLAN, 2004; RODRIGUES et al., 2008). As indicações
medicinais de espécies do gênero Miconia relatadas na literatura se encontram
resumidas no Quadro 3.
56
Quadro 3- Indicação etnofarmacológica de espécies do gênero Miconia.
Espécie
Forma
utilizada
Infuso das
M. albicans Canela-develha, pixirica folhas
e
Steud
ou quaresmeira caule
ou
banhos
M.
aplostachya
(Bonpl.) DC.
Nome popular
---
Folhas
M.
ciliata Caiuia- branca
(Rich.) DC.
Folhas
Mexerico,
M.
cinnmonifolia jaguatirao
(DC) Naudin
Infuso
folhas
caule
Miconia
fallax DC.
M.
ferruginata
DC.
M.
ligustroides
(DC.) Naudi
--Babatenão,
pixirica
Carpuna
branca
M. mirabilis Capa-de(Aubl.) L.O. Xangô
Williams
Pixirica,
jaguatirão,
carrasco
Sedativa,
insolação,
diurética,
depurativa,
coceira e suores
noturnos
Referência
STALCUP,
2000; PAULA,
2009;
ZANDONÁ,
2009
CAVALCANTE;
FRIKEL, 1973;
FENNER et al.,
2006
HASRAT et al.,
1997
das Resfriado e febre BOSCOLO,
e
2003;
BOSCOLO;
VALLE, 2008
Uso tópico e Antiofídica
DE
PAULA,
banhos
2009
Infusão,
AntiALMEIDA;
banho com inflamatória,
BANDEIRA,
as folhas
infecções e dores 2010
Partes aéreas Analgésico
CUNHA et al.,
2003b; SILVA;
FRANCO, 2010
Banho
ou
cataplasma
das folhas e
flores
Infuso dos
M. rubiginosa Pixirica,
(Bonpl.) DC. Capiroroquinha ramos com
folhas
Miconia sp.
Indicação
popular
Infecções
urinárias
e
genitais, regular
o ritmo cardíaco,
antiofídico,
reumatismo
e
prevenir infartos
Úlceras,
antisépticas
e
cicatrizantes
Descarrego
reumatismo
Infecções
garganta
Folhas ou a Escorbuto,
planta inteira reumatismo
dores crônicas
e STALCUP, 2000
de RODRIGUES;
CARVALHO,
2001; MOURA,
2006;
MAIA;
ANDRADE,
2009
TENE et al.,
e 2007
57
3. 5. 3 Fitoquímica
As triagens fitoquímicas com espécies deste gênero mostrou perfil químico rico em
flavonoides, taninos, triterpenos, cumarinas, benzoquinonas e outros compostos
fenólicos (CUNHA et al., 2003a; SERPELONI et al., 2008a e b; ZHANG et al., 2003;
RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2011). Uma
triagem química realizada por CREVELIN e colaboradores (2006) identificaram
triterpenos e esteroides em seis espécies de Miconia, como os triterpenos β-amirina e αamirina e o esteroide β-sitosterol presentes em todas as espécies. Neste estudo
observou-se ainda a presença de estigmasterol e lupeol, na maioria das espécies.
Além destes compostos, os triterpenos pentacíclicos têm sido frequentemente
identificados e isolados de espécies do gênero Miconia (CUNHA et al., 2003a;
SPESSOTO et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2006), entre eles o inédito acetato 28carboxi-3-oxoolean-12-en-21α-il (C32H48O5) obtido das folhas de M. macrothyrsa
(DINIZ et al., 2006). Além desses, os ácidos ursólico e oleanólico, são apontados como
os constituintes majoritários deste gênero, que se encontram, principalmente, na forma
de mistura isomérica (LIN et al., 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006;
VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2010).
3. 5. 4 Estudos biológicos com espécies do Gênero Miconia
Alguns estudos tem comprovado o potencial terapêutico de espécies do gênero
Miconia. Entre as atividades biológicas relatadas destacam-se os efeitos antiinflamatórios (VASCONCELOS et al., 2006; RODRIGUES, 2007), analgésicos
(HASRAT et al., 1997; SPESSOTO et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2006),
antimutagênicos (RESENDE et al., 2006; SERPELONI et al., 2008a), antioxidantes
(PIERONI et al., 2011) antimicrobianos (LI et al., 2001; CELOTTO et al., 2003;
ALVES et al., 2008; RODRIGUES et al., 2008), antitumoral (CUNHA et al., 2008; LIN
et al., 2002; GUNATILAKA et al., 2001), tripanocida (CUNHA et al., 2003a; CUNHA
et al., 2006) e leishmanicida (PEIXOTO et al., 2011).
Os metabólitos secundários mais relacionados às atividades biológicos são os
pertencentes à classe de triterpenos ácidos, tais como os ácidos ursólico, oleanólico,
sumaresinólico, gipsogênico, hidroxiursólico, máslico, urjnólico, entre outros (LIN et
al., 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006; CUNHA et al., 2006;
VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008). No Quadro 4 estão resumidas as
58
substâncias isoladas e as atividades biológicas relatados na literatura de espécies do
gênero Miconia.
Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos vegetais de
espécies do gênero Miconia.
Espécies
Extrato
Classe química/
substâncias
isoladas
Triterpenos ácidos
M.
albicans Clorofórmico
Diclometânico
(ursólico,
(Sw.) Steud.
Etanólico e
oleanólico,
Metanólico
sumaresinólico e
gipsogênico);
Flavonoides
(quercetina
e
derivados
glicosilados, rutina,
α-amirina
e
derivados,
ácido
epi-betulínico);
compostos
fenólicos e taninos
Flavonoides
M.
alypifolia Metanólico
(apigenina-7-ONaudin.
glucosidio,
campferol-3-Odiglucosidio,
kaempferol-3-Ogalactosidio
e quercetina-3-Ogalactosidio)
M.
cabucu Clorofórmico e Flavonoides
Metanólico
glicosilados
Hoehne
derivados
da
quercetina
e
campferol
(5hidroxi-4’,7dimetoxiflavona(6-C-6”)-5”hidroxi-3”’,4”’,7”trimetoxiflavona),
ácidos fenólicos,
ácido gálico e
derivados,
catequinas e
taninos.
Atividades
biológicas
Referência
Tripanocida
Analgésico
Antiinflamatório
Antimutagênico
Citoprotetor e
Antioxidante
CUNHA et al.,
2003a;
VASCONCELOS
et
al.,
2006;
SERPELONI et al.,
2008a; PEIXOTO
et
al.,
2011;
SERPELONI et al.,
2011
Antioxidante
MANCINI et al.,
2008
Antibacteriano
Antifúngico
Antimicrobiano
Analgésico
Antimutagênico
Citoprotetor
e
Antiinflamatório
RODRIGUES,
2007;
RODRIGUES et
al.,
2008;
SERPELONI et al.,
2008a;
SERPELONI et al.,
2011
59
Continuação do Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos
vegetais de espécies do gênero Miconia.
M. fallax DC.
Diclometânico
e
Etanólico
M. langsdorffii Hidroalcoólico
Cogn.
M. lepidota DC. Etanólico
M. ligustroides Diclometânico
(DC.) Naudin
M. rubiginosa Hexânico
Clorofórmico
(Bonpl.) DC.
Diclometânico
Etanólico
Hidroalcoólico
e Metanólico
Triterpenos ácidos
(ursólico,
oleanólico,
sumaresinólico e
gipsogênico)
Ácidos ursólico e
oleanólico
benzoquinonas (2metoxi-6-heptil1,4-benzoquinona,
2-metoxi-6-pentil1,4-benzoquinona,
2-metoxi-6-butil1,4-benzoquinona e
2-metoxi-6-decil1,4benzoquinona)
Triterpenos ácidos
(ursólico,
urjinólico,
oleanólico, mistura
de acido 2α hidroxiursólico e
ácido máslico)
Flavonoides
glicosilados
derivados
da
quercetina
(5hidroxi-4’,7dimetoxiflavona(6-C-6”)-5”hidroxi-3”’,4”’,7”trimetoxiflavona),
ácidos fenólicos,
ácido gálico e
derivados
,
catequinas, taninos,
α e β-amirina,
lupeol, β-sitosterol
e mistura de ácidos
ursólico
e
oleanólico
Tripanocida e
Antitumoral
Leishmanicida
Antitumoral
CUNHA et al.,
2003a; CUNHA et
al.,
2008;
FERREIRA et al.,
2013
PEIXOTO et al.,
2011
GUNATILAKA et
al., 2001
Tripanocida e
Antimicrobiano
CUNHA et al.,
2006; CUNHA et
al., 2010
Antibacteriano
Antifúngico
Antimicrobiano
Analgésica
Antimutagênico
Citoprotetor
e
Antiinflamatório
CELOTTO et al.,
2003; SPESSOTO
et
al.,
2003;
RODRIGUES,
2007;
RODRIGUES et
al.,
2008;
SERPELONI et al.,
2008a; QUEIROZ
et
al.,
2011;
SERPELONI et al.,
2011
60
Continuação do Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos
vegetais de espécies do gênero Miconia.
M. sellowiana Diclometânico
Naudin.
Triterpenos ácidos
(ursólico,
urjinólico,
oleanólico, mistura
de acido 2α hidroxiursólico e
ácido máslico)
Clorofórmico
Flavonoides
M. stenostachya
Diclometânico
derivados
da
DC.
Etanólico
e quercetina
e
Metanólico
campferol, ácidos
fenólicos,
ácido
gálico
e
derivados
,
catequinas, taninos
e
triterpenos
ácidos (ursólico,
oleanólico,
sumaresinólico e
gipsogênico)
Tripanocida
CUNHA
2006
et
al.,
Antibacteriano
Antifúngico
Antimicrobiano
Antimutagênico
Citoprotetor
e
Tripanocida
CELOTTO et al.,
2003; CUNHA et
al.,
2003a;
RODRIGUES et
al.,
2008;
SERPELONI et al.,
2008a;
SERPELONI et al.,
2011
A resistência bacteriana, principalmente na área hospitalar, tem sido considerada um
grande problema de saúde pública (JACOBS et al., 2008; NGWOKE et al., 2011).
Assim, a necessidade do desenvolvimento de novas drogas antibióticas, vem resgatando
o interesse por novas moléculas derivadas de plantas (MAREGESI et al., 2008; SILVA
JR et al., 2009). O estudo de espécies do gênero Miconia tem revelado possuir um
grande potencial antimicrobiano de seus metabólitos. RODRIGUES et al. (2008) ao
avaliar três espécies deste gênero verificaram que os extratos metanólicos apresentaram
atividade contra Staphylococcus epidermidis, Candida albicans, Staphylococcus aureus,
Micrococcus luteus, Bacillus subtilis e Bacillus cereus. Já o extrato clorofórmico
apresentou baixos valores de CIM para C. albicans.
Outros estudos revelam ainda que os compostos fenólicos isolados de M. myriantha
possuem efeitos inibitórios contra proteases aspárticas secretadas por C. albicans (LI et
al., 2001). Confirmando esses achados, outros estudos têm mostrado de média a forte a
atividade antimicrobiana para diversas espécies deste gênero (CELOTTO et al., 2003;
MOURA, 2006; RODRIGUES, 2007; CUNHA et al., 2010; ARAÚJO, 2011). Esta
atividade foi atribuída à presença de alguns compostos químicos, como os triterpenos
ácidos: ursólico e oleanólico. Ambos compostos tem apresentado atividade contra
algumas bactérias multirresistentes (HORIUCHI et al., 2007), principalmente, quando
61
avaliados isoladamente (CUNHA et al., 2010). Além disso, uma quinona isolada da M.
eriodonta mostrou atividade antimicrobiana e antitumoral (LIMA et al., 1970).
Atualmente, outra carência está relacionada à disponibilidade de novos fármacos
anti-inflamatórios atuantes em diferentes vias. O processo inflamatório consiste em uma
complexa resposta fisiológica frente a um agente infeccioso, um antígeno ou uma lesão
tecidual (TILLEY et al., 2001) com objetivo de reparar o tecido afetado. Entretanto, os
processos inflamatórios crônicos são prejudiciais, podendo promover efeitos deletérios
no tecido afetado (SCHETTER et al., 2010). Consequentemente existe a necessidade em
se investigar substâncias que interfiram ou inibam a inflamação por diferentes vias.
Algumas espécies do gênero Miconia têm apresentado atividade moduladora do sistema
imunológico, como a M. cabucu e a M. rubiginosa (RODRIGUES, 2007). Em um
estudo, in vivo, realizado por VASCONCELOS et al. (2006) foi observado que os
ácidos ursólico e oleanólico isolados de M. albicans reduziram o edema de pata
induzido por carragenina. Além disso, os autores observaram que ambos os triterpenos
exibiram uma atividade analgésica similar ao ácido acetilsalicílico na concentração 40
mg/mL. SPESSOTO et al. (2003) também verificaram atividade analgésica central e
periférica dos extratos hexânico, diclorometânico e etanólico de M. rubiginosa.
Segundo os autores, os prováveis mecanismos de ação dessas substâncias devem estar
relacionados à inibição da via de prostaglandinas e inibição central da dor.
As doenças tropicais negligenciadas são um sério problema de saúde pública que
atingem populações que se encontram em estado deplorável de pobreza. Normalmente,
essas doenças ocorrem de forma endêmica e atingem países em desenvolvimento, como
grande parte da América Latina, África e Ásia. Estima-se que um bilhão de pessoas
sejam infectadas por ano, entre as quais cerca de um milhão chegam a óbito (OMS,
2010a; GARG, 2011). Apesar destes números assustadores, o investimento em
pesquisas relacionadas à busca de novas formas de diagnóstico, vacinas e fármacos
ainda é escasso (OMS, 2010b). Entre as doenças negligenciadas a doença de Chagas e a
leishmaniose, configuram entre as seis endemias tropicais elencadas pela OMS, devido
a elevada prevalência e morbidade associadas a essas infecções.
A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi, e na América Latina,
representa um grande problema de saúde pública, sendo a principal causa de óbito por
problemas cardíacos. Os medicamentos disponíveis para seu tratamento são escassos,
ineficientes na fase crônica, apresentam tempo prolongado de uso e causam sérios
efeitos colaterais (SANTORO et al., 2007; DIAS et al., 2009). Assim, a busca de novas
62
substâncias para a profilaxia e/ou tratamento desta endemia se faz extremamente
necessária (AMBROZIN et al., 2008; FERREIRA, 2010) e o estudo de plantas
medicinais tem demonstrado resultados promissores. Segundo CUNHA et al. (2003a) as
espécies M. fallax DC. e M. stenostachya DC. apresentaram significativa atividade
tripanocida, das quais os compostos ácidos ursólico, gipsogênico e oleanólico presentes
mostraram maior potencial.
A leishmaniose também apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade
(DUJARDIN, 2006; BERN; MAGUIRE; ALVAR, 2008), principalmente associada a
forma visceral (LV). No Brasil observa-se um crescimento alarmante dos casos desta
infecção nos centros urbanos (OMS, 2010a). O seu tratamento é baseado na
administração de antimoniais pentavalentes, anfotericina B e pentamidinas, os quais são
tóxicos, de custo elevado, difícil administração e podem gerar resistência ao parasito
(RATH et al., 2003; CROFT; COOMBS 2003; TAKAHASHI et al., 2006). Desta forma,
considerando as dificuldades de tratamento e a ausência de vacinas, há urgência na
busca de novas drogas terapêuticas (CARVALHO; FERREIRA, 2001; PAULA et al.,
2003; NAKAMURA et al., 2006). Assim como para a doença de Chagas, os ácidos
ursólico e oleanólico têm demonstrado um grande potencial também contra as formas
evolutivas do agente da leishmaniose (CUNHA et al., 2003a; TORRES-SANTOS et al.,
2004; LEITE et al., 2006; HOET et al., 2007).
O potencial quimiopreventivo de produtos naturais é de grande interesse para clínica
médica (PARK; PEZZUTO, 2002), uma vez que o câncer está se tornando a doença que
causa as maiores taxas de morbi-mortalidade (JEMAL; BRAY; FERLAY, 2011). As
substâncias isoladas de extratos naturais como compostos fenólicos tem exibido efeitos
antimutagênicos (KAUR et al., 2000; BELICOVA et al., 2001; POERSCH et al., 2007).
De acordo com SERPELONI et al. (2008a) as espécies do gênero Miconia apresentaram
atividade protetora ao DNA contra alterações induzida por ciclofosfamida, além de não
apresentarem atividade mutagênica pelo teste de micronúcleos. Este efeito protetor
também foi associado à presença de compostos fenólicos, tais como flavonoides e
terpenos, que tem elevado potencial antioxidante e anti-carcinogênico (LIU, 2004). Em
um estudo in vitro, verificou-se que tanto o extrato etanólico quanto a mistura de ácidos
ursólico e oleanólico de M. fallax DC. inibiram o crescimento tumoral de
adenocarcinoma uterina dose-dependente (CUNHA et al., 2008). GUNATILAKA et al.
(2001) verificaram que a citotoxicidade e atividade antitumoral da M. lepidota estão
relacionados à presença das benzoquinonas.
63
3. 6 Miconia ferruginata DC.
A espécie M. ferruginata (Melastomataceae), popularmente conhecida como
pixirica-do-campo ou babatenão (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010) apresenta dispersão
endozoocórica por aves e encontra-se distribuída desde o sul do México até o norte da
Argentina, Uruguai e Bolívia (GOLDENBERG, 2009). No Brasil, a espécie foi descrita
nos estados do Pará, Tocantins, Distrito Federal, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Goiás, Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro, Sergipe, Bahia e Pernambuco. E está
inserida nos biomas do Cerrado e da Caatinga (GOLDENBERG; CADDAH, 2013). No
estado mineiro esta espécie é encontrada nos campos rupestres (Figura 4), cerrado
sentido restrito e em áreas de altitude elevada (SANTOS, 2003).
Figura 4 – Espécie Miconia ferruginata. Botanical Garden, Brasília, DF, Brasil; 4/2005. Disponível em:
http://www.virboga.de/Miconia_ferruginata DC.htm.
Em uma revisão do gênero Miconia, REZENDE et al. (2014), realizou uma
descrição botânica detalhada da espécie M. ferruginata na qual, o autor caracteriza a
planta da seguinte forma:
64
“Miconia ferruginata DC. caracteriza-se pelos ramos bastante
robustos,
rugosos,
com
estrias
bem
evidentes,
grandes
inflorescências escorpioides (14-38,5 cm comprimento.) e folhas
discolores geralmente grandes (7-32,5 x 2,5-13 cm), indumento
ferrugíneo (ocráceo) recobrindo toda a planta, baga imatura verde
oliva e enegrecida quando madura, com cerca de 50 sementes por
fruto e conectivo prolongado das tecas (0,6 mm comprimento),
espessado no dorso com expansão dorso-basal e dois apêndices
ventrais e baga verde-oliva a enegrescida, com cerca de 50
sementes.”
Diferente das outras espécies, a M. ferruginata apresenta os períodos de florescência
e frutificação prolongados (SANTOS, 2003), de fevereiro a outubro, e presença de
frutos entre setembro a julho (REZENDE, 2012; REZENDE et al., 2014). No Quadro 5
é apresentada a taxonomia desta espécie.
Quadro 5 – Taxonomia de Miconia ferruginata
Classificação
Classe
Subclasse
Superordem
Ordem
Família
Gênero
Espécie
Taxonomia atribuída
Equisetopsida C. Agardh
Magnoliidae Novákex Takht.
Rosanae Takht.
Myrtales Juss. Ex Bercht. & J. Presl
Melastomataceae Juss.
Miconia Ruiz & Pav.
Miconia ferruginata DC.
Disponível em: http://www.tropicos.org/Name/20301059
Na região nordeste do estado de Minas Gerais, no município de Diamantina, como
citado anteriormente, também tem sido registrada a presença de espécies do gênero
Miconia, como a M. ferruginata. Como outras espécies do gênero, ela apresenta uso
medicinal na forma de infuso e banhos (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010), para
tratamento de doenças de pele, e de origens inflamatórias, parasitárias e infecciosas
(CRUZ; KAPLAN 2004; ZANDONÁ, 2009). Em estudo recente observou-se a
presença de flavonoides, saponinas, cumarinas, terpenos e taninos nas folhas, por meio
de análise de fitoquímica preliminar (LIMA et al., 2013). Embora esta espécie apresente
uso medicinal, em levantamento bibliográfico recente não foram encontrados estudos
aprofundados sobre esta espécie. Assim, este estudo teve por objetivo realizar uma
65
avaliação químico-farmacológica da espécie Miconia ferruginata encontrada na região
de Diamantina, MG.
4 METODOLOGIA
4. 1 Equipamentos
Agitador Magnético (Quimis®, modelo Q221-1)
Agitador Magnético com Aquecimento (Mhtoli®, modelo 100M005)
Agitador orbital (Fanem® - Modelo 255-B).
Autoclave (Phoenix-Luferco®, modelo AV-137)
Balança analítica (Bioprecisa®, modelo JA3003N)
Banho de Ultrassom (Unique®, Ultra Cleaner 1400)
Banho-maria (Fanen LTDA®, modelo 102)
Bombas de solvente (LC-20AD)
Bomba quaternária (LC-20AT)
Capela de fluxo laminar (Veco®, modelo BIO SEG 12) e (Airstream®, Esco, Class II
BSC)
Centrifuga (Thermo®, modelo BR4imultifunction)
Citômetro de fluxo (FACScan® - Becton-Dickinson)
Computador para análise de espectros e cromatogramas (Dell®, modelo OPTIFLEX 780)
Contador automático de células (CELM®, modelo CC-550)
Cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu®, modelo ClassVp 20) e (Shimadzu®,
modelo Proeminence)
Degaseificador (DGU-20AS)
Detector por arranjo de diodos (SPD-M20A)
Espectrofotômetro (Biospectro®, modeloSP-22) e (Femto®, modelo 600)
Espectrômetro de massas (BurkerDaltonics®, modelo MICROTOF II) e (Shimadzu®,
modelo QP2010)
Estufa bacteriológica (Solab®, modelo SL 101) e (Sterilifer®, modelo 1.3 DMTC)
Estufa de ar circulante (Biopar®, modelo S480AT)
Estufa Incubadora com demanda bioquímica de Oxigênio (B. O. D.) (Solab® Cientifica,
SL 200/364)
Evaporador rotativo (Fisaton®, modelo 801)
Forno para coluna (CTO-20A)
66
Incubadora de CO2 (Ultrasafe®, modelo HF 212 UV)
Injetor (Rheodyne®, modelo 7125)
Injetor de amostras automatizado (SIL-20AC HT)
Leitor de ELISA (Molecular Devices®, modelo SPECTRA MAX 190)
Liofilizador (Terroni®, modelo LS3000)
Microscópio óptico (Olympus®, modelo CX 41)
Microscópio Invertido (Medilux®, modelo MDL 150 TAI)
Moinho de facas (Marconi®, modelo MA580)
PHmetro (Hanna® Instrumentos, modelo HI 3221 pH/ORP/ISE Meter)
Sistema controlador para CLAE (CBM-20A)
Sonicador (Quimis®, modelo Q335D)
Unidade controladora do CLAE (CBM-20A)
Ultrapurificador de água (Elga®, modelo Classic Di-MK2)
Vortex (Phoenix Luferco®, modelo AP-56)
4. 2 Preparo de reagentes e soluções
4. 2. 1 Azul de Tripan
As soluções de Azul de Tripan foram preparadas a concentração de 0,4% e
0,002%. Para preparação da solução de Azul de Tripan a 0,4 % foi adicionado 0,2 g de
Azul de Tripan (Sigma®) a 50 mL de tampão PBS. Em seguida, a solução foi filtrada
em filtro-seringa com membrana de 0,22 µm (TPP®). O filtrado foi transferido para um
frasco estéril hermeticamente fechado e armazenado em geladeira entre 2 e 8 °C.
A solução de Azul de Tripan 0,002%, foi preparada em capela de fluxo laminar
a partir de 50 µL da solução estoque de Azul de Tripana 0,4 %, que foram diluídos em
10 mL de tampão PBS. Esta solução foi preparada no momento do uso.
4. 2. 2 Caldo Muller Hinton (CMH)
O CMH (Himedia®) foi preparado a partir da dissolução de 4,2 g do meio CMH
em 200 mL de água Milli-Q. A solução foi esterilizada em autoclave e armazenada a
temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo dez dias.
67
4. 2. 3 Caldo e meio sólido Brain Heart Infusion Broth (BHI)
Para o preparo do caldo BHI (Himedia®) foi dissolvido 7,4 g do meio BHI em
200 mL de água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada em autoclave e armazenada a
temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo dez dias. O meio sólido de BHI, foi
preparado a partir da dissolução de 7,4 g de BHI e 3,0 g de Ágar-Ágar (Isofar®) em 200
mL de água Milli-Q. Em seguida, a solução foi esterilizada em autoclave e distribuída
uniformemente, em capela de fluxo laminar, em placas de Petri estéreis (Plast-Bio®). As
placas solidificadas foram colocadas em sacos plásticos estéreis e armazenados a
temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo trinta dias.
4. 2. 4 Carbonato de sódio
As soluções de carbonato de sódio foram preparadas a 10% e 0,2 M. Para o
preparo destas soluções 1 e 1,06 g de carbonato de sódio (Vetec®) foram dissolvidos
para 100 e 50 mL de água Milli-Q, respectivamente. O volume das soluções foi aferido
em balão volumétrico, e em seguida, foram armazenadas a temperatura ambiente em
frasco âmbar.
4. 2. 5 Cloreto de cádmio 2µM
Inicialmente foi preparada uma solução estoque de 20 mM. Foi dissolvido 0,41 g
de cloreto de cádmio (Proquimios®) em 100 mL de água Milli-Q, após completa
solubilização a solução foi filtrada em filtro-seringa com membrana de 0,22 µm (TPP®),
em capela de fluxo laminar. A solução foi armazenada em frasco âmbar a temperatura
ambiente (ROMERO et al., 2003). Para uso, a solução de cloreto de cádmio 20 mM foi
diluída em meio de cultura RPMI ou DMEM suplementados para a concentração de 2
µM, a partir de um volume de 0,1 µL da solução estoque em um volume final de 1mL.
4. 2. 6 Meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado
Para preparo do meio de cultura DMEM foi utilizado o preparado em pó, sem
bicarbonato de sódio, alta concentração de glicose e com L-glutamina (Sigma®) que foi
dissolvido em 900 mL de água Milli-Q. Em seguida, foi adicionado 3,7 g de
bicarbonato de sódio (Vetec®). Após completa solubilização o pH da solução foi
ajustado para 7,2 utilizando o PHmetro (Hanna®). Em balão volumétrico, o volume da
solução foi completado para 1 L com água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada por
filtração a vácuo, em capela de fluxo laminar, com auxilio de um filtro com membrana
68
de 0,22 µM (Millipore®). O meio foi envasado em frasco de cultura transparente estéril
e, armazenado a temperatura entre 2 e 8 °C.
Para aplicação nos ensaios, o meio foi suplementado, em capela de fluxo laminar,
com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado (Gibco®) e 1% de solução estabilizada
de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL e 10 mg/mL, respectivamente) (Sigma®).
Para avaliação da esterilidade uma alíquota de 5 mL foi armazenada em incubadora de
CO2 a 37 ºC, por 24 horas com posterior análise de alteração e/ou crescimento
microbiano.
4. 2. 7 Meio de cultura Liver Infusion Tryptose (LIT) suplementado
O meio LIT foi preparado pela dissolução de 1,9 g de NaCl (Vetec®), 3,75 g de
Na2HPO4 (Vetec®), 4,56 g de Triptose (DifcoTM BD®), 1,5 g de extrato de levedura
(Vetec®), 1,5 g de Liver Infusion (DifcoTM BD®) e 0,2 g de KCl (Dinâmica®) em 350
mL de água Milli-Q. A solução foi homogeneizada em capela de fluxo laminar e, em
seguida, o pH foi ajustado para 7,4 utilizando o PHmetro (Hanna®). O volume foi
acertado para 450 mL e a solução foi transferida para uma garrafa de cultura estéril. O
meio foi esterilizado por 30 minutos a 120°C, em autoclave. A suplementação do meio
foi realizada em capela de fluxo laminar, na qual foi adicionado 1 mL de solução de
estreptomicina 100 µg/mL (Sigma®), 0,9 mL de solução de hemina 10 mg/mL (Sigma®)
e 50 mL de SFB inativado (Gibco®). Posteriormente a solução foi filtrada à vácuo por
meio de um filtro de membrana com 0,22 µm (Millipore®). O meio foi armazenado em
frascos estéreis a temperatura entre 2 e 8 °C. Para avaliação da esterilidade, uma
alíquota de 5 mL foi incubada em estufa B. O. D a temperatura de 26 °C, por 24 horas
com posterior análise de alteração e/ou crescimento microbiano.
4. 2.8 Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado
Para o preparo do meio, foi adicionado em um becker 10,4 g de RPMI-1640
(Sigma®) e 2,0 g de bicarbonato de sódio (Vetec®) e cerca de 900 mL de água Milli-Q.
Após completa solubilização, o pH do meio foi acertado para 7,2 utilizando o PHmetro
(Hanna®). Em seguida, o volume foi completado para 1L com água Milli-Q, com
auxilio de balão volumétrico. Em capela de fluxo laminar o meio foi esterilizado por
filtração a vácuo utilizando filtro de membrana com 0,22 µm (Milipore®) e,
posteriormente, transferido para frasco estéril transparente e armazenado em geladeira a
temperatura entre 2ºC e 8ºC.
69
Para aplicação nos ensaios, o meio foi suplementado, em capela de fluxo laminar,
com 10% de SFB inativado (Gibco®), 1,6% de L-glutamina 200 mM (Sigma®) e 1% de
solução estabilizada de penicilina/estreptomicina 10000 U/mL e 10 mg/mL,
respectivamente (Sigma®). Para avaliação da esterilidade uma alíquota de 5 mL foi
armazenada em incubadora de CO2 a 37 ºC, por 24 horas com posterior análise de
alteração e/ou crescimento microbiano.
4. 2. 9 Reagente de Bouchardat/Wagner
O reagente de Bouchardat/Wagner foi preparado a partir da dissolução de 1 g de
iodo (Isofar®) e 2 g de iodeto de potássio (Synth®) em 100 mL de água Milli-Q. A
solução foi transferida para em balão volumétrico de 100 mL e o volume aferido. Esta
solução foi armazenada a temperatura ambiente em frasco âmbar.
4. 2. 10 Reagente de Dragendorff
O reagente de Dragendorff foi utilizado como reagente geral nas reações de
precipitação e reagente da Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)
para detecção de alcaloides, cada um preparado distintamente. Para o preparo do
reagente geral de alcaloides, 5 g de carbonato de bismuto (Vetec®) foram dissolvidos
em 50 mL de água Milli-Q. Em seguida, foram adicionados 12 mL de ácido clorídrico
concentrado padrão analítico (PA) (Proquímicos®). A esta solução foi adicionado
gradativamente, 25 g de iodeto de potássio (Vetec®) e após a dissolução completa da
solução, o volume foi completado em balão volumétrico de 100 mL com água Milli-Q,
e armazenada em temperatura ambiente em frasco âmbar.
Para preparo do revelador da CCDC foi inicialmente confeccionado uma solução
estoque composta de subnitrato de bismuto (Synth®) e iodeto de potássio (Synth®)
dissolvendo 0,85 g de subnitrato de bismuto em 40 mL de água Milli-Q, seguida da
adição de 10 mL de ácido acético glacial PA (Proquímicos®). A solução foi aquecida
em banho-maria (Fanen®), e filtrada em papel de filtro. A esta solução foi adicionado 50
mL de solução aquosa de iodeto de potássio a 27%. A solução estoque foi armazenada
em frasco âmbar a 4 ºC. Para o preparo do revelador, 1 mL da solução estoque foi
misturado a 2 mL de ácido acético glacial PA e 10 mL de água Milli-Q.
70
4. 2. 11 Reagente de Hager
No preparo do reagente de Hager foram dissolvidos 4,58 g de ácido pícrico
(Isofar®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume foi acertado em balão volumétrico e a
solução final transferida para frasco âmbar e armazenada a temperatura ambiente.
4. 2. 12 Reagente de Mayer
Para o preparo deste reagente 1,35 g de cloreto de mercúrio (Belga Química®)
foi dissolvido em 60 mL de água Milli-Q. Em seguida, foram adicionados 20 mL de
uma solução aquosa de iodeto de potássio 25%. Em um balão volumétrico de 100 mL, a
solução teve seu volume final acertado com água Milli-Q, em seguida, a solução foi
transferida para um frasco âmbar e armazenada a temperatura ambiente.
4. 2. 13 Solução de acetato de chumbo 10%
A solução de acetato de chumbo 10% foi preparada dissolvendo 10 g de acetato
de chumbo (Vetec®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em
balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura
ambiente.
4. 2. 14 Solução de ácido acético 10%
Para preparo da solução de ácido acético 10% foi diluído 1 mL de ácido acético
glacial PA (Proquímicos®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi
aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a
temperatura ambiente.
4. 2. 15 Solução de ácido clorídrico 10%
Para preparo da solução de ácido clorídrico 10% foi diluído 1 mL de ácido
clorídrico concentrado PA (Proquímicos®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da
solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco
transparente a temperatura ambiente.
4. 2. 16 Solução de ácido gálico 100 mg/mL
A solução de ácido gálico 100 mg/mL foi preparada no momento do uso, em que
foram dissolvidos 0,5 g de ácido gálico (Sigma®) em 5 mL de água Milli-Q. O volume
71
da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, diluída seriadamente com
água Milli-Q nas concentrações de 100 a 0,1 mg/mL.
4. 2. 17 Solução de ácido sulfúrico
As soluções de ácido sulfúrico foram preparadas nas concentrações de 1 e 5%.
Foram diluídos 1 e 5 mL
de ácido sulfúrico concentrado PA
(Proquímicos®),
respectivamente, e o volume completado para 100 mL com água Milli-Q em balão
volumétrico. As soluções foram armazenadas em frascos transparentes a temperatura
ambiente.
4. 2. 18 Solução de alfa-bisabolol 0,1 g/mL
Para a solução de alfa-bisabolol foi misturado em um becker 0,1 g de alfabisabolol (Biotec®) em 1 mL de clorofórmio PA (Dinâmica®), até completa dissolução.
A solução foi armazenada em frasco de vidro a temperatura entre 2 e 8 °C.
4. 2. 19 Solução de anfotericina B 1 µg/mL
Primeiramente, foi preparado uma solução estoque de 5 mg/mL. Foram
dissolvidos 10 mg de Anfotericina B (Sigma®) em 2 mL de DMSO (Vetec®). A solução
foi submetida à agitação utilizando vortex (Phoenix Luferco®) por 30 minutos para
completa dissolução do fármaco. Em seguida, a solução foi armazenada em frasco
estéril, protegido da luz, a temperatura de -20 °C. Para o uso, a solução de Anfotericina
B foi diluída em meio LIT suplementado para a concentração de 1 µg/mL, a partir de
um volume de 0,2 µL da solução estoque em um volume final de 1mL.
4. 2. 20 Solução de antibióticos e antibiótico/antimitótico
Para o preparo da solução de estreptomicina 100 µg/mL foi dissolvido 750 mg
de sulfato de estreptomicina (Sigma®) em 15 mL de água Milli-Q, seguida de
homogeneização em vortex por 5 minutos. A solução foi aliquotada em eppendorfs de
1,5 mL (LabPlast®) que foram armazenados em freezer a -20 °C. Essa solução foi
utilizada para suplementação do meio LIT.
O coquetel
de antibiótico/antimitótico
de penicilina G 100 UI/mL,
estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL (Sigma®) foi aliquotada em
eppendorfs de 1,5 mL e armazenados em freezer a -20 °C. Essa solução foi utilizada
72
para suplementação do meio RPMI para os ensaios de viabilidade e proliferação sobre
células mononucleares do sangue periférico (PBMC).
A solução estabilizada de penicilina/estreptomicina a 1000 U/mL e 10 mg/mL
(Sigma®) foi aliquotada em eppendorfs de 1,5 mL e armazenados em freezer a -20 °C.
Essa solução foi utilizada para suplementação dos meios RPMI e DMEM para os
demais ensaios biológicos.
4. 2. 21 Solução de benznidazol 75 µg/mL
Inicialmente foi preparada uma solução estoque 10 mg/mL do fármaco padrão
benznidazol. Foram pesados 10 mg de benznidazol (Lafepe®) e dissolvidos em 1 mL de
DMSO (Vetec®). A solução foi submetida a banho de ultrassom por 2 horas para
favorecer a dissolução completa do fármaco. Em seguida, a solução foi armazenada em
frasco âmbar estéril, protegido da luz, a temperatura de -20 °C. Para o uso, a solução de
benznidazol foi diluída em meio LIT suplementado para a concentração de 75 µg/mL, a
partir de um volume de 7,5 µL da solução estoque em um volume final de 1 mL.
4. 2. 22 Solução de butilbrometo de escopolamina 0,08 mg/mL
No preparo da solução, foram diluídos 11 gotas do medicamento butilbrometo
de escopolamina (EMS®) em 5 mL de metanol PA (Vetec®). A solução foi transferida
para frasco âmbar e armazenada protegida da luz, em local fresco a temperatura
ambiente.
4. 2. 23 Solução de cloranfenicol 30 µg/mL
Primeiramente foi preparado uma solução estoque de cloranfenicol 20 mg/mL.
Foram dissolvidos 0,02 g de cloranfenicol (Sigma®) em 1 mL de álcool 96° GL (Belga
Química®). Após completa dissolução, a solução foi filtrada em filtro-seringa de
membrana com 0,22 µm (TPP®), transferida para um frasco âmbar e armazenada a
temperatura entre 2 e 8 °C. No momento do uso foi realizado a diluição da solução
estoque em CMH para a concentração de 30 µg/mL, a partir de um volume de 3 µL em
um volume final de 2 mL.
4. 2. 24 Solução de cloreto de alumínio 5%
Para preparo da solução de cloreto de alumínio 5% foi dissolvido 5 g de cloreto
de alumínio (Vetec®) em 100 mLágua Milli-Q. Em seguida, o volume da solução foi
73
aferida em balão volumétrico e, armazenada em frasco transparente a temperatura
ambiente.
4. 2. 25 Solução de cloreto férrico 2%
Para preparo da solução de cloreto férrico 2% foi dissolvido 2 g de cloreto
férrico (Cromato®) em 50 mL de água Milli-Q, em seguida foi adicionado 2 mL de
ácido clorídrico 10%. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico de 100 mL
e, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.
4. 2. 26 Solução de sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%
Para o preparo da solução de SDS 10%, foi dissolvido 50 g de SDS em 200 mL
de água Milli-Q estéril. Após completa dissolução adicionou-se, em balão volumétrico,
álcool isopropílico PA (Neon®) para completar 500 mL de solução. A solução foi
armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.
4. 2. 27 Solução de etanol
As soluções de etanol foram preparadas nas concentrações de 25 e 70%. Foram
diluídos 25 e 70 mL de etanol PA (Neon®) respectivamente, e o volume aferido em
balão volumétrico de 100 mL com água Milli-Q. As soluções foram preparadas no
momento do uso.
4. 2. 28 Solução de gelatina 2,5%
Para preparo da solução de gelatina 2,5% foi dissolvido 0,25 g de gelatina
(Isofar®) para 10 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão
volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura entre 2 e 8
ºC, por no máximo três dias.
4. 2. 29 Solução de hemina 10 mg/mL
Inicialmente foi preparado uma solução estoque de hemina 20 mg/mL, pela
dissolução de 0,1 g hemina (Sigma®) em 5 mL de trietanolamina (Vetec®), seguida de
homogeneização em vortex (Phoenix Luferco®) por 10 minutos. A solução de hemina
10 mg/mL foi preparada a partir de 5 mL da solução estoque diluída em 5 mL de água
Milli-Q, seguida de homogeneização em vortex por 5 minutos. Esta solução foi
armazenada em frasco âmbar estéril, protegido da luz a temperatura entre 2 e 8 °C.
74
4. 2. 30 Solução de hidróxido de amônia
As soluções de hidróxido de amônia foram preparadas nas concentrações de 5 e
10%. Foram diluídos 5 e 10 mL de hidróxido de amônia PA (Dinâmica®),
respectivamente, e o volume final aferido para 100 mL com água Milli-Q em balão
volumétrico. As soluções foram armazenadas em frascos transparentes a temperatura
ambiente.
4. 2. 31 Solução de hidróxido de potássio 5%
Para preparo da solução de hidróxido de potássio 5% foi dissolvido 5 g de
hidróxido de potássio (Audaz®) com etanol PA (Neon®). O volume da solução foi
aferida em balão volumétrico de 100 mL e, em seguida, armazenada em frasco
transparente a temperatura ambiente.
4. 2. 32 Solução de hidróxido de sódio 1M
Para preparo da solução de hidróxido de sódio 1 M foi dissolvido 3,99 g de
hidróxido de sódio (Vetec®) em água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão
volumétrico de 100 mL e, em seguida, armazenada em frasco âmbar a temperatura
ambiente.
4. 2. 33 Solução de iodeto de potássio
As soluções de iodeto de potássio foram preparadas nas concentrações de 25 e
27%, dissolvendo 25 e 27 g de iodeto de potássio (Synth®) respectivamente, em 100 mL
de água Milli-Q. O volume das soluções foram aferidas em balão volumétrico e, em
seguida, armazenadas em frascos transparentes a temperatura ambiente.
4. 2. 34 Solução de metanol 80%
Para preparo da solução de metanol 80% foi diluído 80 mL de metanol PA
®
(Vetec ) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão
volumétrico e utilizada logo em seguida.
4. 2. 35 Solução de paclitaxel 6 µM
Primeiramente, foi preparado uma solução estoque de paclitaxel 250 µM, em
que 0,01 g de paclitaxel (Quiral Química®) foi dissolvido em 5 mL de álcool etílico
75
96 °GL (Belga Química®), o volume foi aferido em balão volumétrico de 5 mL. Em
seguida, a solução foi filtrada em filtro-seringa de membrana com 0,22 µm (TPP®),
distribuída em frasco âmbar e armazenada a temperatura de -20 °C, por no máximo 30
dias. Para o uso, a solução de Paclitaxel foi diluída em meio DMEM suplementado para
a concentração de 6 µM, a partir de um volume de 48 µL da solução estoque em um
volume final de 2 mL.
4. 2. 36 Solução de quercetina 0,5 mg/mL
No preparo desta solução foram pesados 0,020 g de quercetina (Biotec®) e
dissolvidos em 40 mL de metanol PA (Vetec®). A solução foi armazenada em frasco
transparente a temperatura ambiente.
4. 2. 37 Solução de resazurina 0,01%
Para o preparo da solução reveladora de resazurina 0,01%, foram dissolvidos
0,01 g de resazurina (Sigma®) em 100 mL de água Milli-Q estéril. O volume final foi
acertado em balão volumétrico, a solução foi filtrada em filtro-seringa de membrana
com 0,22 µm (TPP®), distribuída em frasco âmbar e armazenado a temperatura -20 °C.
Para o uso, a solução reveladora foi descongelada em geladeira entre 2 e 8 °C.
4. 2. 38 Solução de saponina 0,3 g/mL
Para o preparo da solução de saponina 0,3 g/mL, 1 g de saponina (Isofar®) foi
dissolvida em 3 mL de água Milli-Q. A solução foi armazenada em frasco transparente
a temperatura ambiente.
4. 2. 39 Solução de vanilina sulfúrica 1%
Para o preparo de vanilina sulfúrica a 1%, 1 g de vanilina (Isofar®) foi
adicionada a metanol PA (Vetec®) até sua completa solubilização. Esta solução foi
transferida para um balão volumétrico de 100 mL, no qual foi adicionado 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado PA (Proquímicos®). O volume final acertado com metanol, e a
solução foi utilizada logo após o preparo.
4. 2. 40 Solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT)
As soluções de MTT (Sigma®) foram preparadas nas concentrações de 0,5, 2 e 3
mg/mL. A solução de 0,5 mg/mL foi preparada em meio LIT, a partir da dissolução de
76
0,02 g de MTT em 40 mL de meio LIT suplementado. A solução de 2 mg/mL foi
preparada em PBS, a partir da dissolução de 0,08 g de MTT em 40 mL de PBS estéril.
A solução de 3 mg/mL foi preparada em meio RPMI, a partir da dissolução de 0,12 g
MTT em 40 mL de meio RPMI suplementado. Todas as soluções foram armazenadas
em frasco âmbar recobertos por papel alumínio a temperatura entre 2 e 8 °C, por no
máximo dez dias.
4. 2. 41 Solução salina 0,09%
A solução salina 0,09% foi preparada dissolvendo 1,8 g de cloreto de sódio
(Vetec®) em 200 mL de água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada em autoclave e
armazenada a temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo de sete dias.
4. 2. 42 Tampão fosfato salino (PBS)
Primeiramente, para o preparo da solução de PBS foi preparado uma solução
estoque de PBS 10x concentrada, dissolvendo 0,256 g de fosfato monossódico (Vetec®),
1,178 g de fosfato dissódico (Vetec®) e 8,760 g de cloreto de sódio (Proquímicos®) em
800 mL de água Milli-Q sob agitação em agitador magnético (Mhtoli®). Após completa
solubilização, o pH da solução foi medido e acertado para 7,2 utilizando o PHmetro
(Hanna®). Em seguida, o volume da solução foi aferido em balão volumétrico para 1 L
com água Milli-Q. Esta solução foi armazenada em frasco transparente fechado a
temperatura entre 2 e 8 ºC.
A partir da solução descrita anteriormente, foi preparado à solução PBS usada
nos protocolos experimentais. Foi diluído 100 mL da solução estoque de PBS 10x em
800 mL de água Milli-Q e o pH foi acertado para 7,2. Em seguida, o volume da solução
foi aferido para 1 L com água Milli-Q, em balão volumétrico. Esta solução foi
esterilizada em autoclave e armazenada em frasco de vidro transparente a temperatura
entre 2 e 8ºC.
4. 2. 40 Tampão Fosfato Salino/Bovine serum albumin (PBS/BSA) 0,1%
Para o preparo dessa solução foi dissolvido 0,1 g de BSA (Sigma®) em 100 mL
de PBS estéril. Após completa dissolução a solução foi aliquotada em tubos côncavos
estéreis e armazenada em freezer a -20°C.
77
4. 3 Coleta e identificação taxonômica
A espécie M. ferruginata foi coletada na região norte de Minas Gerais pelo Dr.
Luiz Elídio Gregório (código do coletor n° LEG 67), na comunidade Ribeirão de Areia,
Diamantina – MG no dia 13 de maio de 2013. A espécie não consta da Lista Nacional
Oficial das Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção (BRASIL, 2014a). O
material coletado foi georeferenciado (18°11'08.0"S 43°42'11.0"W) e o voucher foi
depositado no Herbário Dendrológico Jeanine Felfili (HDJF) e no herbário DIAM da
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) sob os números
de registro HDJF2953 e DIAM 4964, respectivamente (Figura 5). A identificação foi
realizada por João Paulo Goulart Mendes, aluno de Iniciação Científica do
Departamento de Engenharia Florestal da UFVJM.
A
B
C
11 cm
24 cm
4 cm
Figura 5 - Exsicatas e figura sistemática de Miconia ferruginta coletadas na região de Cerrado em Minas
Gerais. A - voucher depositado no HDJF; B - voucher depositado no DIAM; C - Figura sistemática da
espécie Miconia ferruginta.
78
4. 4 Preparo dos extratos brutos
A preparação dos extratos foi realizada no Laboratório do Núcleo de Estudos de
Produtos Naturais (NEPRONAT) da UFVJM. O material coletado foi segregado em
folhas/flores e caule, seco em estufa de ar circulante (Biopar®) a 40 ºC, durante uma
semana. Após esse período, o material foi pulverizado em moinho de facas (Marconi®),
obtendo 732,0 g de folhas/flores e 705,0 g de caule. O pó obtido foi armazenado em
sacos plásticos, a temperatura ambiente, em local fresco até o momento do preparo dos
extratos.
Foram preparados extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de
M. ferruginata. O extrato etanólico foi preparado a partir do material pulverizado
submetido à extração por maceração durante uma semana na proporção: 100 g planta
para 1 L solvente (1:10). Etanol 96 °GL (Dinâmica®) foi usado como solvente extrator e,
após o período da maceração, os extratos foram filtrados em algodão e concentrados em
evaporador rotativo (Fisaton®), entre 40 e 45 °C sob pressão reduzida. Os extratos
aquosos foram preparados por infusão, utilizando 50 g do material pulverizado que foi
exposto a 500 mL de água Milli-Q fervente, deixado em contato por 10 minutos. Após
resfriamento a temperatura ambiente, o infuso foi filtrado em algodão, congelado em
nitrogênio líquido e seco em liofilizador (Terroni®).
Os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule obtidos foram
transferidos para frascos âmbar previamente tarados, os quais foram submetidos à
secagem final a temperatura ambiente em dessecador sob vácuo contendo sílica gel. Os
extratos obtidos foram utilizados para as análises descritas em seguida conforme
esquema representado na Figura 6.
79
Reações cromogênicas e de
precipitação e CCDC
CG-EM
PERFIL QUÍMICO
Extrato etanólico
CLAE-DAD
CLAE-DAD-EM
Partição com solventes de
polaridades crescentes
CLAE-DAD
Frações
Extrato aquoso
CLAE-DAD
Teor compostos fenólicos
Fracionamento em
Sephadex LH-20
Frações
CLAE-DAD
CG-EM
Figura 6 – Representação esquemática das análises realizadas para triagem fitoquímica com a droga
vegetal e com os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
4. 5 Análises Fitoquímicas Preliminares
As análises fitoquímicas preliminares foram realizadas no NEPRONAT da
UFVJM. O estudo fitoquímico preliminar com a finalidade de identificação das
principais classes de metabólitos secundários foi realizado por meio de reações
cromogênicas e de precipitação e análises em cromatografia em camada delgada
comparativa (CCDC). As reações cromogênicas e de precipitação foram realizadas
conforme descrito por SIMÕES et al. (2007), SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO
(2010), COSTA (2012) e pela Sociedade Brasileira de Farmacognosia (2014) e, estão
descritas no Quadro 6. Para cada classe química analisada foram realizados os controles
negativo com apenas adição do extrato e o controle positivo com um padrão conhecido
cuja composição química está descrita na Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010a;
STICHER, 1993). Os controles positivos foram adquiridos no mercado municipal de
Ribeirão Preto (Casa Massaro®, BOX 29, Industria Brasileira). As análises CCDC
foram realizadas conforme descrito por WAGNER e BLADT (1995).
80
Quadro 6 – Relação das reações cromogênicas e de precipitação aplicada para
cada classe química analisada na caracterização do perfil fitoquímico da Miconia
ferruginata.
Classes
químicas
Reações químicas inespecíficas
Reações químicas específicas
analisadas
Alcaloides
Reagentes gerais de alcaloides
(Mayer,
Dragendorff,
Bouchardat, Hager)
Antraquinonas
gerais
alcaloides
para
(Mayer,
Dragendorff,
Bouchardat,
Hager) após extração alcalina
Reação de Borntrager direta e
indireta
Esteroides
/ Reação de Liebermann-Burchard
Triterpenos
Reação com vanilina sulfúrica
Flavonoides
Reagentes
Reação de Salkowisk
Reação de Shinoda
Reação
de
Wilson-Taubock
Reação com cloreto de alumínio
(flavonóis)
Reação com cloreto férrico
Reação de Pew
Reação com hidróxidos alcalinos
Reação afrogênica
Saponinas
Taninos
Índice de espuma
Reação com cloreto férrico
Precipitação com gelatina
Precipitação com acetato de
chumbo
Fonte: SIMÕES et. al. (2007); SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO (2010); COSTA (2012)
As classes químicas foram consideradas presentes quando 70% das reações
realizadas apresentaram resultado positivo.
4. 5.1 Teste para alcaloides
Os alcaloides são compostos orgânicos cíclicos que possuem um ou mais átomos
de nitrogênio com estado de oxidação negativo pertencente ao anel heterocíclico (Figura
7). Este grupo de compostos apresenta elevada diversidade estrutural, propriedades
físico-químicas e ações farmacológicas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997;
81
HENRIQUES et al., 2000). Por serem compostos nitrogenados, os alcaloides,
apresentam caráter alcalino e reagem com compostos metálicos, como o mercúrio, o
ouro, o iodo e a platina, formando precipitado de sais complexos. Os métodos de
detecção de alcaloides são geralmente precedidos de uma extração baseada em suas
propriedades de insolubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos e,
consistem de reações de precipitação com reativos específicos. A maioria desses
reagentes são soluções neutras ou levemente ácidas, como os regentes de Mayer
(solução de iodeto de potássio e cloreto de mercúrio), Dragendorff (solução de iodeto de
potássio e subnitrato de bismuto), Wagner ou Bouchardat (solução de iodo e iodeto de
potássio) e Hager (solução saturada de ácido pícrico) (SIMÕES et al., 2007).
Figura 7 – Representação da estrutura do alcaloide verdadeiro, atropina. ChemDraw Ultra (2004).
Assim, para a pesquisa de alcaloides, foram adicionados em um becker 2 g da
droga vegetal e 20 mL de ácido sulfúrico a 1%. A solução foi fervida por 2 minutos e,
em seguida, filtrada. Após resfriamento, o filtrado foi dividido em duas porções (A e B).
A porção A foi distribuída em cinco tubos de ensaio, em que nos quatro
primeiros foram adicionadas duas gotas de reagentes gerais de alcaloides, apresentados
no Quadro 7. O quinto tubo serviu de controle negativo para comparação. O resultado
foi considerado positivo quando ocorreu turvação ou precipitação.
Na porção B foram adicionadas gotas da solução de hidróxido de amônio 10%
até atingir pH 8, medida por meio de tiras para pH (Qualividros®). Em seguida, foram
adicionados 7 mL de clorofórmio PA (Dinâmica®). Foi feita extração durante 10
minutos. A camada clorofórmica foi coletada e levada ao banho-maria para evaporação
até secura. O resíduo obtido foi suspendido em 5 mL de ácido sulfúrico a 1% que foi
distribuída em cinco tubos de ensaio no qual seguiu o mesmo protocolo descrito para a
porção A. O controle positivo foi realizado com folhas de Peumus boldus Molina
82
(boldo-do-chile). Para considerar resultado positivo pelo menos três reações da porção
B devem apresentar turvação ou precipitado.
Quadro 7 - Reagentes gerais para pesquisa de alcaloides.
Reagente geral de alcaloide
Cor do precipitado
Dragendorff
Alaranjado
Mayer
Branco
Bouchardat
Marrom
Hager
Amarelo
4. 5. 2 Teste para antraquinonas
As antraquinonas são moléculas fenólicas derivadas da dicetona do antraceno
composta por dois grupamentos carbonílicos e duas ligações duplas entre carbonos
(Figura 8). Estes compostos geralmente apresentam coloração alaranjada ou vermelha e
são solúveis em água quente ou álcool diluído.
Figura 8 – Representação da estrutura química básica das antraquinonas. ChemDraw Ultra (2004).
Assim, para a pesquisa de antraquinonas foram realizadas as reações de
Bornträger direta e indireta com hidrólise ácida. Como controle positivo foi usado
folhas de Senna alexandrina Mill. (sene).
a) Reação de Bornträger direta
Em um tubo de ensaio foram colocados 200 mg da droga vegetal em 5 mL de
solução de hidróxido de amônio a 5%. O aparecimento de coloração rósea ou
avermelhada é indicativo da presença de antraquinonas.
83
b) Reação de Bornträger indireta com hidrólise ácida
Foram colocados em um tubo de ensaio 1 g da droga vegetal em 8 mL de
solução aquosa de etanol 25%. A solução foi fervida durante 1 minuto e, em seguida,
filtrada para um tubo de ensaio contendo 4 mL de ácido sulfúrico a 5%. A mistura foi
aquecida levemente, posteriormente, resfriada em torneira. Foram adicionados 5 mL de
clorofórmio PA (Dinâmica®) e realizada partição líquido-líquido por 3 minutos. A
camada orgânica foi recolhida para um tubo de ensaio, no qual foram adicionados 5 mL
de hidróxido de amônio a 5%. O tubo foi agitado fortemente e deixado em repouso. A
formação de coloração rósea ou avermelhada na fase aquosa indica presença de
antraquinonas.
4. 5. 3 Teste de esteroides/triterpenoides
Os terpenos são uma classe metabólitos provenientes das vias acetatomevalonato e de oxi-celulose fosfato, por meio da condensação de unidades de isopreno
podendo apresentar inúmeras formas estruturais. São classificados de acordo com o
número de unidades presentes no seu esqueleto carbônico, entre os mais comuns estão
os monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30)
(Figura 9 A-D) (SIMÕES et al., 2007; BAKKALI et al., 2008). Os esteroides (C27)
(Figura 9 E) produzidos a partir dos terpenos (SIMÕES, et al., 2007) apresentam um
amplo espectro de ações biológicas (PATOCKA, 2003; SONBOLI; BABAKHANI;
MEHRABIAN et al., 2006; COLOMA et al., 2011; LIANG et al., 2011).
84
C
B
A
H
HO
HO
H
O
H
H3C
DE
D
C
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
H3C
HO
HO
Figura 9 – Representação da estrutura dos terpenoides e esteroides. A - Monoterpeno, limoneno; B Sesquiterpeno, α-humuleno; C - Diterpeno, cafestol; D - Triterpeno, betulina; E - Esteroide, β-sitosterol.
ChemDraw Ultra (2004).
Devido à presença da dupla ligação em um dos anéis do núcleo esteroidal ou
triterpênico ocorre à formação de cor quando estes compostos estão em contato com
ácidos inorgânicos concentrados. O princípio das reações de triagem destes compostos é
baseado na desidratação e desidrogenações do núcleo fundamental da molécula por um
ácido forte, com posterior formação de produtos mono ou dissulfonados (FUJIWARA,
2012). A reação de Lieberman-Burchard é o principal teste analítico para detecção de
terpenoides/esteroides, em que o composto desidratado pelo ácido sulfúrico reage com o
anidrido
acético,
formando
um
ácido
monossulfônico,
responsável
pelo
desenvolvimento da formação de um anel colorido. A intensidade da coloração
desenvolvida é proporcional à concentração destes compostos na amostra (FUJIWARA,
2012). O mecanismo da reação de Salkowisk é semelhante a reação anterior (XIONG et
al., 2007; ATINAFU; BEDEMO, 2011).
Assim, para o teste de esteroides/triterpenoides foram realizadas as reações de
Liebermann-Burchard, Salkowisk e reação com vanilina sulfúrica. As folhas de Ginkgo
biloba L. foram utilizadas como controle positivo para o teste. Para isso foi realizado
um infuso com 5 g da planta em 100 mL de água Milli-Q. O extrato aquoso obtido foi
particionado, por extração líquido-líquido com três porções de 40 mL de clorofórmio
85
PA (Dinâmica®). As fases orgânicas foram recolhidas em um becker e levadas ao
banho-maria para concentrar o extrato, obtendo um volume de 20 mL,
aproximadamente. Este extrato orgânico final foi usado para as reações descritas abaixo.
a) Reação com vanilina sulfúrica
Em um tubo de ensaio foi adicionado 2,5 mL do extrato orgânico que foi
evaporado em banho-maria até a secura. Após a secagem foi adicionado duas gotas de
uma solução de vanilina sulfúrica 1%. O tubo foi submetido a aquecimento por alguns
minutos sobre chama direta. O aparecimento de coloração violeta-azulada é indicativo
de núcleos esteroidais ou triterpênicos.
b) Reação de Libermann-Burchard
Foi evaporado até a secura 2,5 mL do extrato orgânico em um tubo de ensaio.
Ao resíduo foi adicionado 3 mL de ácido acético glacial PA (Proquímicos®) e, em
seguida, duas gotas de cloreto férrico 2%. Pelas paredes do tubo e sem agitar,
adicionou-se cuidadosamente 2 mL de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos®).
O resultado é considerado positivo para presença de núcleo esteroidal quando há
aparecimento de um anel de coloração azul ou violeta na zona de contato entre as duas
camadas, enquanto que anel de coloração pardo-avermelhada ou verde indica presença
de núcleo triterpênico.
c) Reação de Salkowisk
Em um tubo de ensaio foram adicionados 2,5 mL do extrato orgânico que foi
evaporado em banho-maria até a secura. Ao tubo foi adicionado cuidadosamente 2 mL
de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos®) pelas paredes, sem agitar. O
aparecimento de anel de coloração vermelha ou pardo-acastanhado indica presença de
núcleo triterpênico, enquanto que de anel de coloração rósea a violeta indica núcleo
esteroidal.
4. 5. 4 Teste de flavonoides
Os flavonoides constituem uma classe de compostos fenólicos de baixo peso
molecular, derivados de benzo-γ-pironas (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002)
provenientes das vias dos fenilpropanoides e do acetato (YOKOZAWA et al., 1997). A
estrutura básica consiste em um núcleo fundamental, constituído de quinze átomos de
86
carbono arranjados em três anéis, sendo dois anéis fenólicos substituídos (A e B) e um
anel pirano (cadeia heterocíclica C) acoplado ao anel A (DI CARLO et al., 1999), como
representado na Figura 10. As principais classes dos flavonoides são as flavonas, as
flavanonas, os flavonóis, as antocianidinas, as isoflavonas, leucoantocianidinas,
proantocianidinas, auronas e chalconas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997;
BRAVO, 1998). Os flavonoides frequentemente se encontram oxigenados ou
conjugados com açúcares e, exercerem uma gama de propriedades biológicas
(RICARDO et al., 2001; KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003; DASTIBAR et al., 2004;
SIMÕES et al., 2007).
Figura 10 – Representação da estrutura química básica dos flavonoides. ChemDraw Ultra (2004).
As técnicas de pesquisa e isolamento dos flavonoides estão relacionadas à
presença de ligações duplas alternadas que desempenham papel de cromóforos, fazendo
com que estes metabólitos apresentem solubilidade em meios alcalinos, propriedades
redutoras e várias reações cromáticas. Essas reações, embora não permitam identificar
os flavonoides, são capazes de distinguir os subgrupos particulares como as flavonas, os
flavonóis, as flavanonas, as chalconas e as isoflavonas (COSTA, 2001). Os ensaios
cromáticos são importantes para análises preliminares e, em alguns casos, podem ser
utilizados na dosagem dos derivados flavônicos. As cores obtidas nas reações
cromogênicas variam de acordo com o núcleo, número e a disposição dos substituintes
hidroxilados (SIMÕES, et al., 2007).
As reação de Shinoda se baseiam na redução na posição 3 de derivados
flavônicos de cor amarela, que após a adição de magnésio ou zinco metálico e ácido
clorídrico, adquirem uma cor avermelhada. Apenas as flavonas, flavonóis, flavanonas e
diidroflavonóis apresentam positividade para estas reações (MARTÍNEZ, 2005). A
reação com o cloreto de alumínio ocorre devido à fluorescência amarela intensa de
87
compostos flavônicos quando submetidos à luz ultravioleta. Na reação de Taubouk, os
compostos flavônicos obtidos após reação com ácido bórico apresentam fluorescência
amarelo-esverdeada. Esta última é característica de flavonóis (COSTA, 2001; SIMÕES
et al., 2007).
Já as reações com hidróxidos alcalinos e cloreto férrico (FeCl3) são muito
utilizadas para a identificação de fenóis, como os flavonoides. Assim, os fenóis reagem
com substâncias alcalinas, como o NaOH e forma fenóxidos que sofrem facilmente
oxidação pelo ar, e adquirem cor amarelada. Na reação com FeCl3 ocorre liberação dos
íons Fe+3 na solução, e, esses íons formam complexos coloridos com grupamentos
fenólicos. Para esta reação as flavonas coram-se de verde-claro, flavonóis e flavanonas
de verde-escuro e chalconas de amarelo (SOFIATI, 2009).
Assim, para pesquisa de flavonoides, 1 g da droga vegetal e 10 mL da solução
aquosa de etanol 70% foram aquecidos durante 5 minutos em banho-maria e,
posteriormente, foi realizada filtração. Como controle positivo foi utilizado folhas de
Baccharis trimera (Less) DC. (carqueja). A presença de flavonoides foi confirmada
quando pelo menos quatro reações apresentaram resultados positivos.
a) Reação de Shinoda
Foram adicionados em um tubo de ensaio 2 mL do extrato hidroalcoólico e de
quatro a seis fragmentos de magnésio metálico (Vetec®). Logo após foi adicionado 1
mL de ácido clorídrico concentrado PA (Proquímicos®). Após alguns minutos, foi
observado o aparecimento de cor na solução, que pode indicar flavonóis quando rósea
ou vermelha, flavanonas quando violeta ou flavonas quando alaranjado.
b) Reação com cloreto de alumínio
Uma tira de papel de filtro foi umedecida em áreas diferentes com o extrato
hidroalcoólico. Em uma das regiões foi adicionada uma gota de solução de cloreto de
alumínio 5%. Após evaporação do solvente, a temperatura ambiente, foi feita
comparação das duas regiões sob luz ultravioleta a 254 e 366 nm (lâmpadas Sankyo
Denk®). Flavonas e flavonóis apresentam fluorescência amarelada e flavanonas azulesverdeada.
88
c) Reação com cloreto férrico
Em um tubo de ensaio, 1 mL do extrato hidroalcoólico foi diluído em 9 mL de
água Milli-Q. Esta solução foi subdividida em dois tubos de ensaio com 5 mL cada. Em
um dos tubos foi adicionado lentamente pelas paredes do tubo, uma gota de cloreto
férrico 2%. O segundo tubo foi o controle negativo da reação, em que não foi
adicionado nenhum reagente. Comparando os tubos, a formação de coloração verdeclaro, verde-escuro ou amarelo, indica presença de flavonas, flavonóis/flavanonas ou
chalconas, respectivamente.
d) Reação com hidróxidos alcalinos
Foi diluído 0,5 mL do extrato hidroalcoólico em 9,5 mL de água destilada, em
um tubo de ensaio. A solução foi subdividida em dois tubos de ensaio com 5 mL cada,
uma delas constituindo o branco da reação. Em um dos tubos foi adicionado 15 gotas da
solução de hidróxido de sódio 1 M. Comparando os tubos, o aparecimento de coloração
amarela na solução, indica a presença de flavonoides com hidroxilas fenólicas livres.
e) Reação de Wilson-Taubock
Em uma cápsula de porcelana foram colocados 3 mL do extrato hidroalcoólico e
levado ao banho-maria até secura. Após resfriamento, o resíduo foi umedecido com
algumas gotas de acetona PA (Dinâmica®). Foram adicionados alguns cristais de ácido
bórico (Proquímicos®) e de ácido oxálico (Dinâmica®). Evaporou-se novamente em
banho-maria até a secura. O resíduo foi dissolvido em 3 mL de éter etílico PA (Vetec®)
e observado sob luz ultravioleta (lâmpadas Sankyo Denk®). A presença de fluorescência
amarelado-esverdeada é indicativa da presença de flavonoides.
f) Reação de Pew
Foram adicionados em uma cápsula de porcelana 3 mL do extrato hidroalcoólico
e levado ao banho-maria até secura. O resíduo obtido foi dissolvido com 3 mL de
metanol PA (Vetec®) e transferido para um tubo de ensaio, usando uma pipeta de
Pasteur. Foi adicionado uma pequena porção de zinco metálico (Vetec®) e, em seguida,
três gotas de ácido clorídrico concentrado PA (Proquímicos®). O desenvolvimento lento
de coloração vermelha indica a presença de flavonoides.
89
4. 5. 5 Teste de saponinas
As saponinas são glicosídeos de esteroides ou de triterpenos que apresentam
estrutura química de caráter anfifílico (Figura 11), ou seja, parte da estrutura com
característica lipofílica (como um triterpeno ou esteroide) e outra hidrofílica (açúcares).
Essa característica é responsável pela propriedade de redução da tensão superficial da
água e suas ações detergentes e emulsificante (SCHENKEL et al., 2001), como também
possibilita a formação complexos com esteroides, proteínas e fosfolipídeos de
membranas a essas substâncias, o que as confere ações biológicas variadas. Assim, a
formação de espuma abundante e persistente em solução aquosa é característica deste
grupo metabólico (GURIB-FAKIM, 2006).
Figura 11 – Representação da estrutura da saponina, glicirrizina. ChemDraw Ultra (2004).
Para a pesquisa de saponinas foi realizado a análise da propriedade afrogênica e
a determinação do índice de espuma. As folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.
(carqueja) foram utilizadas como controle positivo do teste. Para ambos os testes foi
preparado um extrato aquoso, por decocção, a partir de 1 g da droga vegetal em 100 mL
de água Milli-Q. Dessa forma, o decocto foi fervido em bico de Bunsen, durante 5
minutos. Após resfriamento e filtração foi adicionado gotas de carbonato de sódio 0,2 M
até atingir pH 7,0, verificado em tiras para medida de pH (Qualividros®). O extrato
aquoso final foi transferido para um balão volumétrico de 100 mL e o volume
completado com água Milli-Q.
90
a) Propriedade afrogênica
Foi adicionado 5 mL do extrato aquoso, em um tubo de ensaio, submetido a
agitação vigorosa por 15 segundos e deixado em repouso durante 15 minutos. Após este
período foi observado se ocorreu permanência de espuma igual ou maior que 1 cm de
altura, indicando a presença de saponinas.
b) Determinação do índice de espuma
Foi realizada uma diluição seriada do extrato aquoso em água Milli-Q como
descrito na Tabela 1. Cada tubo foi agitado vigorosamente por 15 segundos e deixado
em repouso durante 15 minutos. O tubo mais diluído que apresentou espuma
permanente com no mínimo 1 cm de altura, foi usado para o calculo do índice de
espuma (IE) conforme a fórmula:
=
, em que, V é igual ao volume do extrato no
tubo selecionado.
Tabela 1 - Diluição dos extratos na determinação do índice de espuma para
pesquisa de saponinas na Miconia ferruginata.
N° dos Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Extrato (mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Água destilada (mL)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
-
Volume total (mL)
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
4. 5. 6 Teste de taninos
Os taninos são compostos fenólicos com estruturas complexas e se apresentam
sob forma de esteres ou heterosídeos solúveis em água e em solventes orgânicos polares.
De acordo com a estrutura química, os taninos são classificados em dois grupos:
hidrolisáveis ou condensados (Figura 12). Estes compostos possuem habilidade de
formar complexos insolúveis em água com proteínas, gelatinas e alcaloides, por meio de
pontes de hidrogênio entre seus grupos fenólicos e determinados sítios protéicos ou
grupamentos amina. Assim, o método mais comumente utilizado é a reação com
solução de gelatina, que promove a formação de precipitado esbranquiçado. Os testes
com cloreto férrico e acetato de chumbo neutro ou ácido se baseiam na complexação
dos taninos com sais de metais pesados com desenvolvimento de cor azul ou verde e de
precipitado, respectivamente (COSTA, 2012; SIMÕES et al., 2007) .
91
Figura 12 – Representação da estrutura química básica dos taninos. A - Taninos hidrolisáveis; B Taninos condensados. ChemDraw Ultra (2004).
Assim, para pesquisa de taninos foi preparado um decocto a partir de 5 g da
droga vegetal em 100 mL de água Milli-Q por 15 minutos. Após resfriamento e filtração
em algodão, o extrato obtido foi distribuído em quatro tubos de ensaio. Para três tubos
foram adicionados os reagentes como descrito abaixo. No último tubo foi adicionado
apenas o extrato servindo de controle negativo do teste. Para o controle positivo foram
realizados testes com folhas de Hamamelis virginiana L. (Hamamélis).
a) Reação com gelatina
Em um tubo de ensaio foram adicionados 2 mL do extrato, duas gotas de ácido
clorídrico 10% e três gotas de solução de gelatina 2,5%. A formação de precipitado ou
turvação é indicativa de reação positiva para a presença de taninos.
b) Reação com cloreto férrico
Foram adicionados em um tubo de ensaio 2 mL do extrato, 10 mL de água MilliQ e quatro gotas de solução de cloreto férrico 2%. O desenvolvimento de coloração azul
indica a presença de taninos hidrolisáveis ou gálicos, enquanto a coloração verde indica
a presença de taninos condensados ou catéquicos.
92
c) Reação com acetato de chumbo
No terceiro tubo de ensaio foram adicionados 5 mL do extrato, 10 mL de
solução de ácido acético 10% e 5 mL de solução de acetato de chumbo 10%. A
formação de precipitado é indicativa da presença de taninos.
4. 6 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
Para confirmação dos resultados obtidos nos testes de triagem fitoquímica
preliminar foi realizado uma CCDC específica para cada classe de metabólito
secundário detectado na espécie M. ferruginata. Na análise foi utilizado padrões
conhecidos, a fim de se calcular os valores dos respectivos Rfs. Assim a CCDC foi
realizada para detecção da presença de flavonoides, alcaloides, terpenoides e
antraquinonas conforme metodologia adaptada de WAGNER e BLADT (1995), e para a
detecção de saponinas e taninos conforme descrito por KEREM; GERMANSHASHOUA; YARDEN (2005) e SOUZA et al. (2007a), respectivamente.
A cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) é uma técnica de
adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação ocorre pela diferença de afinidade dos
componentes de uma mistura tanto pela fase estacionária quanto pela fase móvel. A
aplicação de diferentes reagentes cromogênicos proporciona a obtenção de dados
adicionais sobre as substâncias separadas. Esta técnica consiste em um método rápido,
simples, sensível, eficiente, de baixo custo e comumente empregado no controle de
qualidade de plantas medicinais, tanto em matéria-prima vegetal quanto em
fitoterápicos (JULIÃO et al., 2003; VALENTE et al., 2006).
Em condições padronizadas é possível caracterizar a amostra pelo valor
numérico do fator de retenção (Rf) o qual é a razão entre a distância percorrida pela
substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel, na mesma análise
(Figura 13) (ZEEUW et al., 1992). Para este tipo de análise, é recomendado o uso de
padrões, em virtude da dificuldade de uniformizar as condições do ensaio. Os padrões
podem ser constituídos pela própria substância a ser identificada, pura, ou na sua
ausência por outros compostos com valores de Rfs próximos (COSTA, 2001).
93
dm
dr
Figura 13 – Representação esquemática para calculo do fator de retenção (Rf).
Para realização da CCDC foram utilizadas cromatoplacas de sílica gel 60
(Whatman®) 20 x 20 cm, espessura 250 µm, em cuba saturada, com migração
ascendente do eluente. O eluente empregado na maioria dos casos foi uma mistura de
solventes orgânicos. Os reagentes usados foram: clorofórmio PA (Dinâmica®), metanol
PA (Vetec®), hidróxido de amônio PA (Dinâmica®), n-propanol PA (Vetec®), acetato de
etila PA (Vetec®), ácido acético glacial PA (Proquímicos®), tolueno PA (Proquímicos®),
ácido fórmico PA (Ecibra®), n-butanol PA (Rio Lab®).
As amostras testadas foram obtidas a partir de extratos etanólicos ou aquosos das
folhas/flores e caule de M. ferruginata ressuspendidos em clorofórmio:metanol na
proporção 1:1 e metanol: água na proporção 8:2, respectivamente. As amostras e os
padrões foram aplicados na placa com auxílio de um capilar. A detecção dos compostos
foi feita por meio de revelação sob luz ultravioleta a 254 e 366 nm (lâmpadas
SankyoDenk®) e de reveladores específicos de acordo com cada metabólito secundário
avaliado, conforme descrito abaixo. A partir destes dados foi calculado o fator de
retenção (Rf) dos padrões e das amostras de acordo com a fórmula:
=
Onde, dr é a distância percorrida pela substância padrão ou amostra em
centímetros e dm é a distância percorrida pela fase móvel em centímetros.
94
4. 6. 1 Análise de alcaloides
Para determinar a presença de alcaloides na amostra foi realizado uma CCDC
com fase móvel constituída de clorofórmio:metanol:hidróxido de amônio na proporção
de 50:9:1. O padrão comparativo foi uma solução de butilbrometo de escopolamina a
0,08 mg/mL. Como revelador especifico foi utilizado o reagente de Dragendorff. O
surgimento de manchas de cor alaranjada após revelação indica resultado positivo.
4. 6. 2 Análise de antraquinonas
Para determinar a presença de antraquinonas na amostra foi realizada uma
CCDC com fase móvel composto de n-propanol: acetato de etila: água Milli-Q: ácido
acético glacial na proporção de 40:40:29:1. Como padrão comparativo foi preparado um
extrato metanólico de folhas de Senna alexandrina Mill (sene). A solução etanólica de
hidróxido de potássio a 5% foi usada como revelador específico. A observação de
manchas de cor vermelha na luz visível indica presença de antraquinonas.
4. 6. 3 Análise de terpenoides
Para determinar a presença de terpenoides na amostra foi realizado um CCDC
com fase móvel composta por tolueno: acetato de etila, na proporção 93:7. O padrão
comparativo foi o alfa-bisabolol 0,1 g/mL. A revelação foi realizada com vanilina
sulfúrica 1%. O aparecimento de manchas de cor azul-violeta, vermelho-violeta, azul,
verde, vermelho ou marrom no visível é indicativo de positividade.
4. 6. 4 Análise de flavonoides
Para determinar a presença de flavonoides na amostra foi realizado um CCDC
com fase móvel constituída de acetato de etila:ácido fórmico: ácido acético glacial: água
Milli-Q na proporção de 100:11:11:26. Quercetina a 0,5 mg/mL foi usada como padrão
comparativo. A revelação foi realizada com vanilina sulfúrica a 1%. Os flavonoides
apresentam coloração amarelo escuro, verde ou azul fluorescente sob luz a 366 nm. No
visível, a presença de flavonoides é indicada pelo aparecimento de manchas de
coloração amarelo-alaranjado ou amarelo-esverdeado.
95
4. 6. 5 Análise de saponinas
Para determinar a presença de saponinas na amostra foi realizado um CCDC
com fase móvel utilizando uma mistura de n-butanol: água Milli-Q: ácido acético na
proporção 84:14:7. O padrão comparativo foi saponina 0,3 g/mL. A detecção foi
realizada por meio de aspersão de etanol: ácido sulfúrico concentrado na proporção de
90:10 seguido de aquecimento a 110 ºC por 10 minutos. A observação de manchas azulvioleta no visível indica positividade.
4. 6. 6 Análise de taninos
Para determinar a presença de taninos na amostra foi realizado um CCDC com
fase móvel composta de clorofórmio: metanol: n-propanol: água Milli-Q, na proporção
de 5:6:1:4. Como padrão comparativo foi usado extrato aquoso das folhas de
Hamamelis virginiana L. O revelador foi o cloreto férrico 2%. A presença de manchas
azul escuro no visível é indicativa da presença de taninos hidrolisáveis.
4. 7 Teor de compostos fenólicos
A determinação do conteúdo de fenóis totais foi realizada através do método
colorimétrico com o reagente de Folin-Ciocalteu, conforme descrito por SINGLETON
et al. (1999) e ANDRADE et al. (2007), com modificações. Este método foi descrito
primeiramente por SINGLETON; JOSEPH; ROSSI (1965), sendo bastante eficiente
para avaliar o teor de compostos fenólicos totais de produtos naturais. Ele se baseia nas
reações de oxi-redução envolvendo os compostos fenólicos e os íons metálicos
presentes no reagente de Folin-Ciocalteu. O Reagente de Folin-Ciocaulteu consiste em
uma mistura dos ácidos fosfomolibídico (H3PMo12O40) e fosfotúngstico (H3PW12O40),
na qual o molibdênio se encontra no estado de oxidação (VI) e apresenta cor amarela
devido ao complexo formado (Na2MoO4.2H2O).
Em meio alcalino, ocorre uma transferência de elétrons entre os compostos
fenólicos e outras espécies redutoras para o molibdênio, formando complexos azuis de
molibdênio-tungstênio [(PMoW11O4)4-], nos quais o estado de oxidação dos metais está
entre (V) e (VI). A intensidade de coloração obtida pode ser então monitorada
espectrofotometricamente a 750-765 nm e a concentração dos compostos fenólicos
redutores é determinada por meio de curvas de calibração de substâncias padrões, tais
como o ácido gálico (GENOVESE et al.,2003; HUANG; PRIOR, 2005). Este método é
amplamente utilizado em pesquisa de produtos naturais antioxidantes, pois apresenta
96
simplicidade, baixo custo, sensibilidade e precisão. A reação do ácido gálico com o
reagente Folin-Ciocaulteu é mostrada na Figura 14.
Figura 14 – Reação do ácido gálico com o reagente Folin-Ciocaulteu, durante quantificação do teor de
compostos fenólicos. ChemDraw Ultra (2004).
A Figura 14 apresenta a desprotonação do padrão ácido gálico em meio básico,
gerando o ânion carboxilado. Em seguida, ocorre uma reação de oxi-redução entre este
ânion e o reagente de Folin, na qual o molibdênio, componente do reagente de Folin,
sofre redução e o meio reacional muda a coloração de amarela para azul.
O teor de fenóis totais foi determinado pela interpolação da absorbância da
amostra contra a curva de calibração do ácido gálico (Sigma®) e expressos como
equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de extrato). Primeiramente, os
extratos aquosos foram ressuspendidos em uma solução de metanol 80% e deixados em
repouso por 24 horas. Após este período, foi retirado o sobrenadante com auxilio de
uma pipeta Pasteur, e este foi diluído 100 e 200 vezes em água Milli-Q. Em um tubo de
rosca foi adicionado 1,0 mL de amostra em diferentes diluições, 1,0 mL do reagente de
Folin-Ciocalteu 2 N (Sigma®) e 2,0 mL de água Milli-Q. Após 5 minutos de repouso foi
acrescentado 1,0 mL de carbonato de sódio 10%, sob agitação. Após duas horas de
incubação à temperatura ambiente, a absorbância foi medida em espectrofotômetro
(Biospectro®) a 750nm. Um branco, utilizando água Milli-Q no lugar da amostra, foi
conduzido nas mesmas condições descritas.
97
Para construção da curva de calibração foi preparado uma solução estoque de
ácido gálico, em água Milli-Q, na concentração de 1,0 g/mL. A partir da soluçãoestoque foram realizadas diluições seriadas, obtendo as concentrações finais de 0,1 a
100 mg/mL. O padrão foi submetido à análise da mesma forma descrita para a amostra.
A Equação da curva de calibração do ácido gálico foi:
=
,
Onde C é a concentração do ácido gálico e A é a absorbância a 750 nm. O
coeficiente de correlação da curva foi R=0,9956. Todas as leituras foram realizadas em
triplicata.
4. 8 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase
sólida por headspace (HS-SPME).
A análise em CG-EM foi realizada no Núcleo de Pesquisas em Produtos
Naturais e Sintéticos (NPPNS) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto da Universidade Federal de São Paulo (FCFRP-USP).
A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
é amplamente utilizada em compostos voláteis e termicamente estáveis. Podem ser
analisados os metabólitos secundários com peso molecular de até 500 u.m.a. e com
pontos de ebulição inferiores a 300 °C (MAHMOUD, 2010). Esta ferramenta é muito
útil na identificação de compostos de produtos naturais graças à disponibilidade de
bibliotecas espectrais, com detector de massas com ionização por elétrons. Na ionização
por elétrons, as moléculas da amostra, depois de separadas pelo sistema cromatográfico,
passam na fonte de íons onde são ionizadas pela colisão com os elétrons gerados num
filamento de tungstênio ou rênio. Essa colisão leva à fragmentação e ionização das
moléculas da amostra (RODRIGUES et al., 2006b). Outra forma de análise ocorre por
meio do cálculo do índice de retenção relativa (IRR). Na qual os índices obtidos podem
ser comparados com os descritos na literatura, e juntamente com os dados de
espectrometria de massas permitem a identificação e caracterização dos constituintes
(SOUZA; MELLO; LOPES, 2012).
A análise em CG-EM foi realizada para as partes aéreas frescas de M.
ferruginata por meio de microextração em fase sólida por headspace (HP-SPME). A
SPME é uma microtécnica, em que os processos de extração e pré-concentração dos
98
analitos se baseiam no equilíbrio de partição ou adsorção entre a fibra e componentes da
amostra ou seu headspace. O dispositivo básico consiste de um bastão de fibra, de sílica
fundida recoberto com um filme fino de polímero ou de um sólido adsorvente
(VALENTE; AUGUSTO, 2000) (Figura 15). Assim que o equilíbrio na fibra é
alcançado, a quantidade de composto extraído está diretamente relacionada à afinidade
com a fase da fibra e sua concentração na amostra. Para aplicação no cromatógrafo, os
compostos são dessorvidos termicamente, sob fluxo do gás de arraste e carregados para
a coluna cromatográfica no qual são separados, identificados e quantificados. Esta
técnica apresenta muitas vantagens, tais como simplicidade, rapidez, não utiliza
solvente, não produz artefatos, apresenta baixo custo e pode ser aplicada à análise de
amostras sólidas, líquidas e gasosas, especialmente na triagem de compostos voláteis
produzidas por plantas (MATA et al., 2004).
Figura 15 – Representação do dispositivo de microextração em fase sólida (SPME). A - Posição com
a fibra retraída na agulha; B - Posição com a fibra exposta. Extraído de VALENTE; AUGUSTO (2000).
99
A análise em CG-EM foi realizada em um cromatógrafo (Shimadzu®) acoplado
a espectrômetro de massas (QP2010), equipado com injetor automático (AOC-20i). Foi
utilizada coluna capilar com dimensões de 30 m de comprimento por 0,25 mm de
diâmetro interno e 0,25 µm de espessura como fase estacionária (DB-5MS). Para a
SPME foi utilizada fibra de polidimetilsiloxano 100 µm (Sigma®).
Na extração por HP-SPME, 300 mg das partes aéreas frescas compostas de
folhas, flores e caule de M. ferruginata foram pulverizadas com auxílio de nitrogênio
líquido em gral com pistilo, e colocadas em vial de 4 mL. Em seguida, o preparado foi
exposto à fibra de polidimetilsiloxano durante 30 minutos com aquecimento em banhomaria a 60 °C. As injeções foram realizadas no modo splitless (250 °C) utilizando hélio
como gás de arraste. O fluxo na coluna foi de 1,41 mL/min, pressão de 87,1 kPa e
aquecimento com programação de temperatura de 60-240 °C a razão de 3 °C/minuto.
Os espectros de massas foram obtidos através de ionização por elétrons (EI) com
voltagem de ionização em 70 eV, temperatura interface em 250 °C e temperatura da
fonte de ionização em 200 °C. Uma série de hidrocarbonetos n-alcanos (C9-C22) foi
analisada concomitantemente.
Para a identificação das substâncias foram utilizadas três espectrotecas: Wiley7,
Nist8 e Nist 8c e foi determinado o índice de retenção relativa (IRR) conforme descrito
por ADAMS (2007) e em conformidade com a base de dados Pherobase (2014). O IRR
foi calculado a partir da equação:
= 100 [ +
−
!"
−
#
$− #
Em que,
IRR = índice de retenção relativa de Kovats
n = número de átomos de carbono do n-alcano eluído antes da substância de interesse
N = número de átomos de carbono do n-alcano eluído após a substância de interesse
tr = tempo de retenção
4. 9 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de
diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e caule de
Miconia ferruginata.
A análise em CLAE-DAD foi realizada em equipamento da central analítica do
Núcleo de Apoio Técnico de Ensino e Pesquisa (NATEP) da Universidade Federal de
São Paulo (UNIFESP) Campus Diadema. A cromatografia líquida de alta eficiência
100
(CLAE) é fundamentada no mecanismo de partição, na qual ocorre uma competição
entre os componentes da amostra e da fase móvel, pelos sítios ativos na superfície da
fase estacionária. Este tipo de equipamento permite a realização de análises qualitativas
e quantitativas de modo eficaz, uma vez que esta técnica apresenta maior rapidez, alta
sensibilidade e seletividade (SHARAPIN, 2000). As técnicas hifenadas, vem sendo uma
importante ferramenta para identificação dos constituintes de produtos naturais
(DRASARA; MORAVCOVA, 2004; LIU et al., 2007), em especial, para compostos
fenólicos como a classe dos flavonoides (TARNAWSKI et al., 2006). Os detectores
mais usados são os Ultravioleta-visível (UV-vis) espectrometria de massas (EM e EMEM) e ressonância magnética nuclear (RMN) (LIANG; XIE; CHAN, 2004).
O detector de UV-vis mede a quantidade de luz absorvida pelos compostos que
absorvem luz na região ultravioleta do espectro eletromagnético, os ditos grupos
cromóforos (RODRIGUES et al., 2006b; MAHMOUD, 2010). O detector por arranjo de
diodos (DAD) é o mais vantajoso, pois permite a determinação da pureza e a
identificação de alguns picos por meio da detecção de diversos comprimentos de onda e
com a possibilidade de análise dos diferentes espectros (SOUZA; MELLO; LOPES,
2012). Já o detector de EM é o detector universal, além de ser mais sensível que o DAD
(RODRIGUES et al., 2006b), por apresentar a possibilidade de confirmação dos
compostos analisados (SILVA; COLLINS, 2011).
Para isso, foi empregado cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE)
(Shimadzu®), equipado com bomba quaternária (LC-20AT), degaseificador (DGU20AS), injetor de amostras automatizado (SIL-20AC HT), forno para coluna (CTO20A), detector de arranjo de diodos (SPD-M20A) e unidade controladora (CBM-20A)
acoplada a computador (Dell®). Foi utilizada coluna C18(2), com 150 mm de
comprimento x 4,6 mm de diâmetro interno, tamanho de partícula de 3,0 µm, acoplada a
pré-coluna do mesmo material e fabricante (Phenomenex Luna®).
Os extratos alcoólicos foram ressuspendidos em metanol grau HPLC (J.T.
Baker®) e os extratos aquosos em água ultrapurificada (Direct-Q®) na concentração de
10 mg/mL e, posteriormente, filtrados em filtros de seringa PTFE hidrofílico de 1,3 cm
de diâmetro e poros de 0,22 µm (Millex®). A eluição foi realizada por gradiente
conforme descrito na Tabela 2.
101
Tabela 2 – Gradiente utilizado nas análises em cromatografia líquida de alta
eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) para análise dos extratos
etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
Tempo (minutos)
% fase móvel A
% fase móvel B
0
90
10
5
90
10
45
0
100
50
0
100
52*
90
10
60*
90
10
A – água ultrapura
B – acetonitrila grau HPLC (Tedia – EUA) contendo 10% de metanol grau HPLC (J T Baker, México)
*Reequilíbrio da coluna cromatográfica
Fluxo: 1mL/min
4. 10 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
A análise em CLAE-DAD-EM foi realizada no NPPNS da FCFRP-USP. A
análise do extratos etanólicos das folhas/flores de M. ferruginata foi analisado por
CLAE-DAD-EM com as mesmas condições cromatográficas (coluna e gradiente de
eluição) descritas no item 4. 9.
As análises foram realizados em cromatógrafo líquido de alta eficiência
(Shimadzu®) acoplado com um espectrômetro de massas (Burker Daltonics®), equipado
com uma fonte de ionização por electrospray e analisador por tempo de vôo. As
amostras foram injetadas utilizando injetor (Rheodyne®), equipado com um loop de 20
µL. Para análise, 100 mg do extrato alcoólico bruto foi ressuspendido em etanol grau
HPLC em volume final de 10 mL e submetido a sonicador (Quimis®). Posteriormente o
extrato foi submetido à extração em fase sólida em coluna contendo 500 mg de C18 e
finalmente filtrados em filtro seringa PTFE hidrofílico de 0,22 µm com diâmetro de 13
mm (Millex®).
102
4. 11 Fracionamento dos extratos brutos e análise das frações
4. 11. 1 Extratos aquosos
Os extratos aquosos liofilizados foram submetidos a fracionamento em coluna
aberta por exclusão molecular (Sephadex LH-20™). Primeiramente, 1,5 g dos extratos
foram ressuspendidos em 10 mL de metanol PA (Vetec®), o sobrenadante foi filtrado
em seringa de vidro 0,45 µm (Yale BD®). O filtrado foi aplicado cuidadosamente pelas
paredes da coluna com auxilio de uma pipeta Pasteur. A eluição foi do tipo isocrática
com metanol PA (Vetec®), durante todo o fracionamento. A coleta das frações com
aproximadamente 15 mL cada, foi realizada em frascos de vidro pesando entre 50 a 100
g. As frações obtidas foram armazenadas a temperatura ambiente em local fresco e
protegido da luz até o momento da análise.
Todas as frações recolhidas foram monitoradas por análise em cromatografia
líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) com o
emprego de coluna C-18, nas mesmas condições cromatográficas descritas no item 4. 9.
Após serem ressuspendidas em metanol grau HPLC (J.T. Baker®) na concentração de
10 mg/mL e filtradas em filtro de seringa PTFE hidrofílico de 0,22 µm com diâmetro de
13 mm(Millex®).
4. 11. 2 Extratos etanólicos
Os extratos etanólicos brutos secos foram fracionados por meio de partição
líquido/líquido, em funil de separação. Os extratos de folhas/flores (39,0 g) e caule
(12,5 g) de M. ferruginata foram ressuspendidos em solução metanol: água (9:1) e após
decantação, o sobrenadante foi submetido à partição com solventes orgânicos de
polaridade crescente: n-hexano (Proquímicos®), diclorometano (Vetec®) e acetato de
etila (Vetec®). Na Figura 16 está representado o esquema do procedimento da partição
líquido/líquido. As frações n-hexânica, diclorometânica e acetato de etila foram
coletadas, concentradas em evaporador rotativo e transferidas para frascos de vidro
âmbar previamente pesados. Já a fração aquosa remanescente foi congelada e
armazenada em freezer -20 °C. Todas as frações n-hexânica, diclorometânica e acetato
de etila foram armazenados a temperatura ambiente em dessecador à vácuo até o
momento da análise. O valor do peso seco foi obtido em balança analítica (Bioprecisa®)
para cálculo do rendimento das frações.
103
Extrato etanólico
seco
Extração com metanol : água (9:1)
Partição em funil de separação
Extrato
ressuspendido
Adição de n-hexano PA
3 vezes de 50 mL
Fração
n-hexânica
Fração
aquosa
Concentração em evaporador rotativo
Dobrar o volume com água Milli-Q
Adição de diclorometano PA
3 vezes de 50 mL
Fração
diclorometânica
Concentração em evaporador rotativo
Fração aquosa
Adição de acetado de etila PA
3 vezes de 50 mL
Fração aquosa
Fração acetato
Congelar e liofilizar
Concentração em evaporador rotativo
Figura 16 – Representação esquemática do procedimento de partição líquido/líquido realizada com os
extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
As frações hexânica e diclorometânica obtidas dos extratos etanólicos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram avaliadas em cromatografia em fase
gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) como descrito no item 4.8, após
serem ressuspendidas em acetato de etila PA (Synth®) a concentração de 10 mg/mL. As
frações foram submetidas à extração em fase sólida com cartucho de sílica (1000 mg/6
mL; Applied Separations®) e injetadas em modo Split na razão 1:20.
A fração acetato de etila obtidas dos extratos etanólicos das folhas/flores e do
caule de M. ferruginata foram avaliadas em cromatografia líquida de alta eficiência com
detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) nas mesmas condições cromatográficas
descritas no item 4. 9, após serem ressuspendidas em metanol grau HPLC (J.T. Baker®)
na concentração de 10 mg/mL.
104
4. 12 Atividades Biológicas dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do
caule de Miconia ferruginata
Os ensaios de viabilidade e proliferação celular foram realizados no Laboratório
de Imunologia do Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde (CIPqSaúde) da UFVJM. Os ensaios biológicos de citotoxicidade, avaliação de atividades
antibacteriana, antitumoral, leishmanicida e tripanocida foram realizados no Laboratório
de Doenças Parasitárias do Departamento de Farmácia (UFVJM) e Laboratório de
Biotecnologia do CIPq-Saúde.
4. 12. 1 Preparo dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de
Miconia ferruginata
Para o preparo dos extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule de
M. ferruginata, 10 mg de cada extrato seco foi diluído em 100 µL de dimetilsulfóxido
(DMSO) (Vetec®), em frasco estéril. Os extratos diluídos foram submetidos a banho de
ultrassom (Unique®) por 2 horas e, em seguida, foram armazenados a -20 °C até o
momento do uso.
Nos ensaios de viabilidade e proliferação celular foram utilizados os extratos
aquosos das folhas/flores e do caule. No ensaio antibacteriano foi utilizado o extrato
aquoso das folhas/flores e etanólicos das folhas/flores e do caule. Nos ensaios de
citotoxicidade sobre células de mamíferos da linhagem L929 e atividade antitumoral
foram utilizados os extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule. Para
avaliação da atividade tripanocida e leishmanicida foram utilizados os extratos
etanólicos das folhas/flores. A concentração de DMSO nas culturas não ultrapassou
0,5%.
4. 12. 2 Avaliação da Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata
4. 12. 2. 1 Linhagem celular
A linhagem celular utilizada foi a CLL I NCTC da American Type Culture
Collection (ATCC) 929-clone da linhagem L, tecido conjuntivo de camundongo,
designado L929. Esta linhagem foi adquirida do Laboratório de Imunopatologia (LIMP)
da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
As células L929 foram submetidas à expansão celular em cultura contendo meio
RPMI 1640 suplementado, seguida de incubação em estufa de CO2, a 37°C, até
105
obtenção de 80% de confluência. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com
PBS e, foi adicionada 1 mL de tripsina-EDTA (Sigma®), para promover a dispersão da
monocamada de células. Essa foi deixada em repouso por 3 a 5 minutos e, para
favorecer o desprendimento celular foi realizado leves batidas na garrafa de cultivo.
Após este período, a tripsina foi inativada com 9 mL do meio de cultura suplementado,
e as células concentradas por centrifugação (2500 rpm, 18 °C, 10 minutos) e
ressuspendidas em RPMI 1640 suplementado contendo 40% de SFB inativado (Gibco®)
e 1% de coquetel de antibióticos (penicilina G 100 UI/mL / estreptomicina 100 µg/mL Sigma®) e distribuídas em criotubos estéreis (Alfa®). Em cada criotubo foram
adicionados 900 µL da suspensão celular e 100 µL de DMSO (Sigma®) destilado. Os
criotubos foram devidamente identificados e vedados e congelados em freezer -80 °C,
até sua utilização nos ensaios.
4. 12. 2. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre
células de mamífero L929
Os testes de viabilidade celular “in vitro” são utilizados para verificar a
citotoxicidade aguda. Entre as diversas alternativas encontra-se o método do MTT que
foi utilizado no presente estudo. A técnica do MTT é um ensaio colorimétrico
quantitativo sensível, confiável e eficaz na avaliação da viabilidade, proliferação e
atividade celular (WACHESK, 2011). Ele se fundamenta na atividade de uma enzima
mitocondrial específica, a succinato desidrogenase, que reage com o brometo de 3-[4,5dimetiltiazol-2il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT), o reduzindo apenas por mitocôndrias
viáveis a formazano, um composto colorido solúvel em solventes orgânicos, como o
DMSO (Figura 17). Os ensaios de citotoxicidade permitem controle do ambiente físicoquímico e fisiológico o que fornece uniformidade na amostragem e reprodutibilidade
dos resultados (FRESHENEY, 2005). Uma vez que os valores de absorbância medidos
após a redução do sal de formazano pelas mitocôndrias é diretamente proporcional ao
número de células viáveis (MOSMANN et al., 1983; GOMES et al., 2001; DUTTA et
al., 2005). Além disso, as linhagens de fibroblastos de mamífero (L929) são as células
mais preferíveis nos ensaios de citotoxicidade (ROGUET; SCHAEFE, 1997) por
apresentarem facilidade de cultivo e manutenção em culturas in vitro, sensibilidade e
correlação com dados biológicos.
106
Figura 17 – Reação de oxi-redução do 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT) em
formazano após a conversão pela enzima succinato desidrogenase. ChemDraw Ultra (2004).
Na realização dos ensaios de citotoxicidade as células da linhagem L929 foram
retiradas do freezer -80 °C e descongeladas a temperatura ambiente. Em capela de fluxo
laminar, a suspensão de células foi transferida para uma garrafa de cultura estéril de 75
cm2 (TPP
®
) contendo aproximadamente 9 mL do meio RPMI suplementado. As
culturas foram colocadas em incubadora de CO2 por 24 horas. Posteriormente, foi
realizada uma lavagem da cultura com PBS para retirar as células mortas e/ou não
aderentes, renovado o meio de cultura e realizada nova incubação nas mesma condições.
A cultura foi monitorada diariamente durante todo o período experimental até obtenção
da quantidade de células para realização dos ensaios, com aproximadamente uma
confluência de 80%.
As culturas com 80% de confluência foram submetidas à lavagem com PBS,
seguida da adição de 1 mL de tripsina-EDTA (Sigma®) por 3 a 5 minutos. Após
dispersão das células, a tripsina foi inativada com 9 mL do meio RPMI suplementado.
A suspensão celular foi contada em câmera hemacitométrica de Neubauer após
coloração com Azul de Tripan 0,4%, e a concentração foi ajustada para 1 x 105
células/mL em RPMI suplementado (Sigma®). As células foram submetidas a um novo
cultivo quando necessário, por no máximo 40 passagens.
Para a realização do ensaio 100 µL da suspensão celular a concentração de 1 x
105 células/mL em RPMI suplementado (Sigma®) foi plaqueada em microplacas de 96
poços (TPP®). A microplaca foi incubada por 24 horas em estufa a 37°C e 5% de CO2
para permitir a adesão e obtenção de uma monocamada celular nos poços. Após esse
período, o meio de cultura foi removido cuidadosamente e as células foram submetidas
107
à exposição aos diferentes extratos de M. ferruginata nas concentrações de 500 a 7,8
µg/mL em meio RPMI suplementado (Sigma®).
O esquema da confecção das microplacas esta representada na Figura 18. Os
grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do
solvente (DMSO), grupo controle de mortalidade (CM) e grupo teste com diferentes
concentrações dos extratos etanólicos das folhas/flores (E1), do caule (E2) e aquosos
das folhas/flores (E3) e do caule (E4). As culturas controle do solvente receberam igual
volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não
ultrapassando 0,125%, enquanto que para o grupo controle de morte foi utilizado o
cloreto de cádmio nas concentrações de 4 mM a 62,5 µM.
Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 por
72 horas, mantidas ao abrigo da luz, sendo enroladas com papel alumínio para evitar
possíveis reações de foto-oxidação. Após o período de incubação, a placa foi
centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi removido e a
cada poço foi adicionado 100 µL de MTT 0,5 mg/ml em RMPI suplemento (Sigma®). A
placa foi novamente incubada a 37 °C e 5% CO2 por 4 horas e, após este período, foi
novamente centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi
removido e, adicionado a cada poço, 100 µl de DMSO (Vetec®). Após completa
solubilização dos cristais de formazano, a microplaca foi submetida à leitura da
absorbância em leitor de ELISA (Molecular Devices®) a 540 nm.
Os extratos e os grupos controles foram testados em triplicata e, em três
experimentos independentes. Os resultados obtidos foram usados para a determinação
da porcentagem de citotoxicidade dos extratos em que o grupo CON correspondeu a
100% de viabilidade celular.
108
Poços -Testes
1
2
3
4
Controles
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Extrato
etanólico das
folhas/flores
(E1)
Extrato
etanólico do
caule (E2)
Controle do
meio cultura
Controle do
solvente
(DMSO)
Controle de
morte
Placlitaxel
Controle de
viabilidade
Figura 18 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na avaliação da citotoxicidade em
células de mamíferos L929 e atividade antitumoral (MDA-MB-231) dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. A mesma placa foi realizada tendo como poços testes os
demais grupos: E3, E4 e Cloreto de cádmio.
4. 12. 3 Avaliação de Atividade antibacteriana
4. 12. 3. 1 Micro-organismos
Para avaliação da atividade antibacteriana foram usadas 14 espécies de bactérias
provenientes da coleção de culturas ATCC, que foram gentilmente doadas pelo Dra.
Regina Nardi do Instituto de Ciências Biológicas – Departamento de Microbiologia da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os micro-organismos utilizados foram:
Staphylococcus aureus (ATCC 29313), Salmonella typhimurium (ATCC 14028),
Bacillus cereus (ATCC 11778), Shigella sonnei (ATCC), Escherichia coli (ATCC
25922), Salmonella enteriditis (ATCC 13076), Klebsiella oxytoca (ATCC 49131),
Streptococcus agalactiae (ATCC 29313), Listeria monocytogenes (ATCC 19115),
109
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Proteus mirabilis (ATCC 25931),
Streptococcus
agalactiae
(ATCC
29313),
Micrococcus
sp.
(ATCC
49732),
Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Enterococcus faecalis (ATCC 19433).
As cepas bacterianas foram mantidas em criotubos contendo caldo BHI
acrescido de 30% de glicerol e mantidas a -20 °C. Para os ensaios, as cepas bacterianas
foram descongeladas a temperatura ambiente, repicadas em meio BHI sólido em capela
de fluxo laminar (Veco®) e incubadas a 37 °C por 24 horas em estufa bacteriológica
(Solab®).
4. 12. 3. 2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pela técnica de
diluição em microplacas (96 poços) de acordo com a metodologia descrita no Manual
do CLSI (2006) para as bactérias aeróbicas, com adaptações.
Inicialmente, para obtenção das células bacterianas utilizadas nos experimentos
foi realizada a padronização da suspensão bacteriana conforme descrito no manual do
CLSI (2006). A partir de uma cultura de 24 horas em meio BHI sólido foram retiradas
colônias isoladas, que foram ressuspendidas em solução salina 0,09% estéril até atingir
turvação igual à suspensão do tubo correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Em
seguida,
foi
verificada
a
concentração
de
micro-organismos
por
leitura
espectrofotométrica (Femto®) a 620 nm, onde a faixa de absorbância deve se encontrar
entre 0,08 a 0,1. Isso resulta em uma suspensão contendo aproximadamente de 1 a 2 x
108 UFC/mL. Posteriormente, foi realizada uma diluição na proporção de 1:10 em CMH,
obtendo uma suspensão de 1,0 x 107 UFC/mL, a qual foi utilizada nos ensaios.
Os orifícios da microplaca (Global®) foram distribuídos de acordo com o
esquema representado na Figura 19. Os poços teste foram preenchidos com 50 µL da
solução dos extratos diluídos seriadamente em CMH nas concentrações de 500, 250 e
125 µg/mL. Em seguida foram acrescentado a cada poço teste 50 µL da suspensão
bacteriana padronizada. Como controle positivo foi utilizado o cloranfenicol 30 µg/mL
e para controle negativo foi utilizado o DMSO 0,125%. Também foram realizados o
controle do meio de cultura (CMH), o controle de crescimento bacteriano (CON) e o
controle de esterilidade dos extratos. Ao final da confecção das microplacas, estas foram
submetidas à agitação por 20 minutos em agitador orbital (Fanem®). As microplacas
foram incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas. Os ensaios foram realizados em
triplicata em três experimentos distintos
110
Figura 19 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na avaliação da atividade
antibacteriana e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), utilizando os extratos etanólicos
das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Na análise da avaliação da atividade antibacteriana foi utilizado o corante 7hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-óxido – Resazurina (Sigma®). O mecanismo de ação
baseia na reação de oxi-redução entre o corante indicador e flavinas (enzimas do
sistema de transporte durante o metabolismo celular) e outros transportadores de
hidrogênio constituindo uma estratégia eficiente para avaliar a viabilidade celular
microbiana (PALOMINO et al., 2002; MONTEJANO; GERVALDO; BERTOLOTTI,
2005; VIRIATO, 2014). O mecanismo da reação de redução da resazurina (cor púrpura)
em resofurina (cor rósea), está indicado na Figura 20. A observação da presença de cor
azul representa ausência de crescimento e de cor rosa, presença de crescimento
microbiano (PALOMINO et al., 2002).
Desta forma a leitura visual das microplacas foi realizada após 24 horas de
incubação a 37 °C, em que foi adicionado, em cada poço, 30 µL da solução aquosa de
resazurina 0,01%, seguida de homogeneização em agitador orbital (Fanem®) por 20
minutos e, reincubadas a 37 ºC por 2 horas. Foram considerados com atividade
antibacteriana os extratos que cujas bactérias após tratamento não desenvolveram cor
rosa em 4 horas de incubação.
111
Poços -Testes
1
2
3
4
5
6
Controles
7
8
9
10
11
12
Bactéria 1
A
B
C
Bactéria 2
D
E
Controles
F
G
H
Extrato
etanólico das
folhas/flores
(E1)
Extrato
etanólico do
caule (E2)
Extrato
aquoso das
folhas/flores
(E3)
Controle do
meio (CMH)
Controle do
solvente
(DMSO)
Controle
positivo
Cloranfenicol
Controle de
crescimento
Figura 20 - Reação de oxi-redução da resazurina em resofurina após conversão pelas enzimas do sistema
de transporte do metabolismo celular. ChemDraw Ultra (2004).
4. 12. 4 Atividade antitumoral
4. 12. 4. 1 Linhagem celular
A avaliação da atividade antitumoral foi realizada sobre as células de
adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 ATCC® HTB-26TM, derivada de metástase, in
situ, de tecido epitelial obtida pela primeira vez por meio da efusão pleural de uma
paciente em 1973 no M. D. Anderson Câncer Center (CAILLEAU et al., 1974;
CAILEAU; OLIVE; GRUCIGER, 1978; BRINKLEY et al., 1980). A linhagem foi
doada pelo Laboratório de Cultura Celular do Departamento de Produtos Farmacêuticas
da UFMG. As células MDA-MB-231 foram submetidas à expansão celular e posterior
congelamento em cultura contendo meio DMEM suplementado, conforme descrito no
item 4. 12. 2. 1.
A linhagem de MDA-MB-231 foi descongelada e submetida a crescimento em
cultura contendo meio DMEM suplementados com 20% de SFB inativado (Gibco®) e 1%
coquetel de antibióticos (penicilina G 100 UI/mL / estreptomicina 100 µg/mL - Sigma®)
112
e 1,6% de L-glutamina (Sigma®). A cultura celular foi monitorada diariamente durante
todo o período experimental.
4. 12. 4. 2 Avaliação da atividade antitumoral dos extratos de Miconia ferruginata sobre
células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231
A avaliação do efeito citotóxico sobre células de adenocarcinoma de mama
MDA-MB-231 foi realizada segundo a técnica por MTT, conforme descrito
anteriormente no item 4. 12. 2. 2, com adaptações. Para a realização do método, 100 µL
a suspensão celular de 1 x 105 células/mL em DMEM (Sigma®) suplementado foram
plaqueadas em placas de 96 poços (TPP®). As células foram incubadas durante 24 horas
em estufa a 37°C e 5% de CO2. Após esse período, o meio de cultura foi removido
cuidadosamente e as células foram submetidas à exposição às diferentes concentrações
dos extratos de M. ferruginata.
O esquema da confecção das microplacas esta representada na Figura 18. Os
grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do
solvente (DMSO), grupo controle de mortalidade (CM e PXT) e grupo teste com
diferentes concentrações dos extratos etanólicos das folhas/flores (E1), do caule (E2) e
aquosos das folhas/flores (E3) e do caule (E4). As concentrações avaliadas foram 500 a
7,8 µg/mL em meio DMEM suplementado. O grupo CM foi realizado com cloreto de
cádmio nas concentrações de 4 mM a 62,5 µM e o fármaco utilizado foi o
antineoplásico paclitaxel (PXT) nas concentrações de 50 a 0,39 µM. As culturas
controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do
extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%.
Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por
48 e 72 horas e mantidas ao abrigo da luz. Após o período de incubação, o meio foi
removido, e a cada poço foi adicionado 100 µL de MTT (Sigma®) 2 mg/ml em PBS
estéril. A placa foi novamente incubada em incubadora de CO2 por 4 horas.
Posteriormente, a placa foi centrifugada (2500 rpm, 18 °C, 15 minutos), o sobrenadante
removido e, adicionou-se 100 µL de DMSO (Vetec®). Após completa solubilização do
formazano, a placa foi submetida à agitação em agitador orbital (Fanen®) por 15
minutos, e determinou-se a absorbância em leitor de ELISA (Molecular Devices®) a 540
nm. Os extratos e os controles foram testados em triplicata em três experimentos
independentes. Os resultados obtidos foram usados para a determinação da atividade
antitumoral, a qual o grupo CON correspondeu a 0% de atividade.
113
4. 12. 5 Avaliação da atividade tripanocida
4. 12. 5. 1 Cepas
Nos ensaios da avaliação de atividade tripanocida foram utilizadas duas cepas do
Trypanosoma cruzi com diferentes perfis de susceptibilidade ao Benznidazol e
pertencentes a dois grupos genéticos distintos. A cepa Y (DTU T. cruzi II) foi isolada
por xenodiagnóstico em 1950 por Pereira de Freitas, referente a caso agudo humano e
representa um prótotipo de susceptibilidade parcial ao Benznidazol. A cepa Colombina
(DTU T. cruzi I) representa um protótipo de resistência ao Benznidazol. Essas cepas
foram cedidas pelo Laboratório de Doença de Chagas do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da UFOP.
As formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana foram mantidas
criopreservadas em nitrogênio líquido no banco de cepas do Laboratório de Doenças
Parasitárias, UFVJM. Para realização dos ensaios, as cepas foram descongeladas a
temperatura ambiente e cultivadas em garrafas de cultivo de 25 cm2 estéreis (TPP®) a
26 °C, em estufa de B. O. D (Solab®), contendo meio LIT suplementado até fase
estacionária de crescimento. O comportamento das cepas foi avaliado por meio do
estabelecimento da curva de crescimento. No procedimento foi realizado a contagem
das formas epimastigotas diariamente utilizando câmara hemacitométrica de Neubauer
desde o inoculo até o término da fase estacionária. As culturas que não apresentaram
qualquer alteração morfológica, contaminação e/ou perda de motilidade foram utilizadas
nos ensaios. A padronização do inoculo foi realizado a partir de culturas na fase
estacionária de crescimento, em que as formas epimastigotas foram contadas em câmera
hemacitométrica de Neubauer, e ajustadas para 1 x 107 parasitos/mL em meio LIT
suplementado.
4. 12. 5. 2 Avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de
Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de T. cruzi
A avaliação da atividade tripanocida sobre as formas epimastigotas das cepas Y
e Colombiana de T. cruzi foi realizada conforme descrito por TEMPONE et al. (2007).
O método empregado para avaliação da viabilidade celular foi o MTT segundo
MOSMANN et al. (1983). Foi realizado a distribuição de 50 µL da suspensão de
epimastigotas na concentração de 1 x 107 parasitos em microplaca de cultura 96 poços
114
(Global®) e, em seguida, adicionado 50 µL das diferentes concentrações do extrato
etanólico das folhas/flores de M. ferruginata.
Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade das formas
epimastigotas (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle com fármaco
padrão (BEN), grupo de esterilidade do meio (LIT) e o grupo teste com as
concentrações do extrato etanólico das folhas/flores (E1). As concentrações avaliadas
foram 500, 250 e 125 µg/mL em meio LIT suplementado. Como fármaco padrão foi
utilizado o benznidazol (Lafepe®) a concentração de 75 µg/mL. As culturas controle do
solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior
concentração, não ultrapassando 0,125%.
Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas por 72 horas em estufa
incubadora B. O. D (Solab®), a 26 °C e mantidas ao abrigo da luz. Após o período de
incubação, a placa foi centrifugada a 4000 rpm por 30 minutos, e o sobrenadante foi
removido. Em seguida, foi adicionado 100 µL da solução de MTT (Sigma®) 3 mg/mL
em meio LIT suplementado, seguida de incubação em B. O. D. a 26 °C por 4 horas.
Posteriormente, foi adicionado 100 µL da solução de SDS 10%, e após completa
solubilização do formazano, foi realizada a medida da absorbância em leitor de ELISA
(Molecular Devices®) a 540 nm. O extrato e os controles foram testados em triplicata
em três experimentos independentes. Os resultados obtidos foram usados para a
determinação da viabilidade celular das formas epimastigotas, a qual o grupo CON
correspondeu a 100% de viabilidade celular.
4. 12. 6 Avaliação da atividade leishmanicida
4. 12. 6. 1 Cepas
Nos ensaios para avaliação da atividade leishmanicida foram empregadas duas
cepas de Leishmania sp., que causam as formas visceral e tegumentar da leishmaniose,
respectivamente:
cepa
BH46
-
Leishmania
(leishmania)
infantum
(MHOM/BR/1070/BH46) e a cepa M2269 -Leishmania (leishmania) amazonensis
(MHOM/BR/73/M2269).
Essas
cepas
constituem
amostras
de referência da
Organização Mundial de Saúde (OMS) que são mantidas no criobanco de cepas do
Laboratório de Doenças Parasitárias. A cepa M2269 foi gentilmente cedida pelo
laboratório de Imunopatologia (LIMP) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
da UFOP e a cepa BH46 pelo Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular (LPCM)
115
da Fundação René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCUZ-MG). A obtenção das
formas promastigotas das cepas BH46 e M2269 foi realizado conforme descrito no item
4. 12. 5. 1.
4. 12. 6. 2 Avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de
Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de Leishmania sp.
A determinação da atividade leishmanicida contra as formas promastigotas das
cepas BH46 de L. infantum e M2269 de L. amazonensis foi realizada conforme descrito
por OLIVEIRA et al. (2012), empregando a técnica de MTT anteriormente descrita no
item 4. 11. 5. 2. Foi realizado a distribuição de 50 µL da suspensão de promastigotas na
concentração de 1 x 107 parasitos/mL em microplaca de cultura 96 poços (Global®) e,
em seguida, adicionado 50 µL das diferentes concentrações do extrato etanólico das
folhas/flores de M. ferruginata.
Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade das formas
promastigotas (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle com
fármaco padrão (ANFB), grupo de esterilidade do meio (LIT) e o grupo teste com o
extrato etanólico das folhas/flores (E1), nas concentrações de 500, 250 e 125 µg/mL.
Para o grupo ANFB foi utilizado o fármaco padrão anfotericina B (Sigma®) a 1 µg/mL.
As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao
volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%. A seguir, foi
aplicado o mesmo protocolo descrito no item 4. 12. 5. 2.
4. 12. 7 Avaliação da viabilidade e proliferação celular
4. 12. 7. 1 Amostra biológica
O estudo foi realizado com aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da
UFVJM por meio de um projeto geral envolvendo plantas do Cerrado, denominado
“Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de plantas
nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha)”, sob o número de
registro 28665514. 2.0000.5108 (Anexo A)
A amostra biológica utilizada constituiu de 10 mL de sangue venoso coletado de
forma asséptica por punção venosa em tubos a vácuo contendo heparina como
anticoagulante (Vacutainer®). Todos os indivíduos participantes deste estudo
apresentavam entre 20 a 39 anos de idade e declararam não apresentar doença
116
infecciosa, auto-imune, crônico degenerativa ou de hipersensibilidade bem como não
estavam ou não ingeriram, cinco dias antes da coleta, medicamentos com ação antiinflamatória e imunomoduladora. As mulheres também declararam não estar grávidas,
além de preencherem os requisitos anteriormente citados. Os voluntários foram
esclarecidos sobre os objetivos da pesquisa, e assinaram o termo de consentimento livre
e esclarecido (Anexo B). Os procedimentos de coleta foram conduzidos por profissional
treinado e capacitado para tal de acordo com as Recomendações da Sociedade Brasileira
de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso (2010).
Após a utilização da amostra biológica, o material remanescente foi descartado em
sacos plásticos brancos com indicação de material infectante e símbolo de risco
biológico.
Para todas as amostras biológicas foram realizadas avaliações dos parâmetros
hematológicos. Para obtenção dos valores de leucócitos totais foi empregado contador
automático de células (CELM CC-550®). A contagem relativa das diferentes populações
leucocitárias (contagem diferencial) foi realizada por observação em microscópio óptico
(Olympus®) do esfregaço sanguíneo, após coloração com Giemsa e May-Grunwald,
conforme descrito em VALLADA (1999).
4. 12. 7. 2 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)
Para a análise da viabilidade e da inibição da proliferação celular das culturas de
leucócitos tratadas com os extratos, obtiveram-se as PBMC a partir do sangue periférico
venoso de 10 voluntários. Assim, 10 mL de sangue venoso foram diluídos na proporção
1:1 em PBS estéril. As PBMC foram obtidas após centrifugação a 400 g, 21°C por 30
minutos com Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma®), conforme descrito por BICALHO et al.
(1981). Após centrifugação, o anel de PBMC foi recolhido com uma pipeta automática
e transferido para um tubo cônico de 50 mL. As células recolhidas foram lavadas duas
vezes em PBS estéril utilizando centrifugação a 250 g, 4ºC, por 15 minutos. Em seguida,
as células foram ressuspensas em 1 mL de RPMI 1640 (Sigma®) e contadas em câmara
hemacitométrica de Neubauer após coloração com Azul de Tripan 0,4%. As células
foram ajustadas a concentração de1 x 107 células/mL em RPMI suplementado.
O RPMI (Sigma®) utilizado na cultura foi suplementado com L-glutamina 2 mM
(Sigma®), 10% de SFB inativado (Gibco®) e 1% de coquetel antibiótico/antimitótico
(penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL –
Sigma®).
117
4. 12. 7. 3 Avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata sobre a viabilidade das PBMC humanas, in vitro
A avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e caule de M. ferruginata, sob
a viabilidade de leucócitos humanos foi realizado pela técnica de exclusão com Azul de
Tripan.
Estudos mostraram que o complexo Azul de Tripan-proteína emite fluorescência
passível de detecção por citometria de fluxo (KUMAR et al., 2008) se mostrando como
uma técnica mais confiável e sensível em relação a convencional contagem em
microscopia óptica. AVELAR-FREITAS et al. (2014) padronizaram a técnica de
exclusão por Azul de Tripan através da citometria de fluxo por esta se mostrar ser mais
rápida, fácil, de baixo custo, confiável e de alta sensibilidade. Assim, esta técnica tem
sido muito aplicada na avaliação da toxicidade de produtos naturais, na qual as células
não viáveis incorporam o corante ao citoplasma devido à perda de seletividade da
membrana, enquanto as células vivas permanecem inalteradas (MASCOTTI et al., 2000;
KIM et al., 2011; CASAROTO et al., 2012).
Para realização deste teste, um volume de 50 µL de suspensão celular (cerca de 5
5
x 10 células) foi incubado em meio contendo RPMI suplementado. Os grupos
avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do solvente
(DMSO), grupo controle de mortalidade (CM) e grupo teste com diferentes
concentrações dos extratos aquosos das folhas/flores (E1) e do caule (E2). As
concentrações finais avaliadas foram de 250, 125, 62,5 e 31,2 µg/mL. As culturas
controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do
extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,5%. Como controle de morte celular
foi utilizado uma solução de cloreto de cádmio 2 mM.
As culturas foram realizadas em tubos côncavos em U (Falcon 15 - BD®) e cada
n da amostra (n=5) foi analisada após 24 horas e cinco dias de cultura a 37°C com 5%
CO2. Após o período de incubação, as células foram removidas por lavagem com 2 mL
de PBS, transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059 – BD®) e centrifugadas a
250 g, 21º C por 7 minutos. Em seguida, foi avaliada a viabilidade das suspensões
celulares através da citometria de fluxo (FACScan®), após incubação de 10 µL das
suspensões de células com 190 µL de Azul de Tripan 0,002%. A aquisição foi de pelo
menos 10.000 eventos, dentro de uma região (gate) correspondente às células de
interesse.
118
Para avaliação da viabilidade celular por citometria, utilizou o programa
específico de análise de dados Cell-Quest (BD Biosciences®). A estratégia de análise
consistiu, primeiramente, na seleção da população linfocitária pela análise de gráficos
de distribuição pontual em função do tamanho (forward side scatter – FSC) e
granulosidade (side light scatter – SSC) celulares (Figura 21A e C). Após a seleção das
células de interesse, foi determinado o percentual de células marcadas com Azul de
Tripan, por meio de histogramas de intensidade de fluorescência-3 (FL-3) em função do
número de células (M1, Figura 21B). Neste caso foi estabelecido um limiar de
negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o grupo controle de
viabilidade (CON). O mesmo marcador foi empregado para as demais situações
experimentais a fim de se obter os valores percentuais de células fluorescentes positivas,
ou seja, o percentual de células mortas (Figura 21D).
SSC
C
SSC
A
Linfócitos
Linfócitos
FSC
Número de Eventos
B
D
2,2%
2,62%
FL3
Figura 21 - Estratégia de análise da viabilidade celular por citometria de fluxo. A e C - Gráfico de
distribuição pontual para a seleção da população linfocitária utilizando os parâmetros de tamanho celular
(FSC) e granulosidade celular (SSC), das culturas CON e E3, respectivamente. B – Histograma de FL-3
representando o percentual de células fluorescentes positivas nas culturas CON. D – Histograma de FL-3
representando o percentual de células positivas após incubação com extrato E3 de Miconia ferruginata.
E3: Extrato aquoso das folhas/flores.
119
4. 12. 3. 4 Análise do extrato aquoso das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
sobre a proliferação de linfócitos humanos, in vitro
A resposta proliferativa dos linfócitos na presença do extrato aquoso das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata foi avaliada para verificar a estimulação ou
supressão dos linfócitos, um evento inicial da complexa gama de estímulos
inflamatórios imune-mediados (ALMEIDA, 2012). Para essa análise, foi utilizada a
técnica de incorporação e decaimento da fluorescência de CFSE (5-[and-6]-carboxy
fluoresceindi acetate succinimidyl ester), conforme descrito por LYONS (2000). Para
isso, foram isoladas PBMC de cinco voluntários na concentração de 1 x 107 células/mL
ressuspendidas em PBS/BSA 0,1%. Para cada 500 µL da suspensão celular foi
acrescentado 1 mL de CFSE 10 µM (Sigma®) diluído em PBS/BSA 0,1%, esta solução
foi homogeneizado e incubada a 37ºC, 5% de CO2 por 10 minutos. Após a incubação, a
reação foi interrompida com a adição de 13 mL de RPMI suplementado gelado, seguido
de incubação em gelo por 5 minutos. Em seguida, foram realizadas duas centrifugações
com RPMI suplementado a 200 g, 4º C por 10 minutos, para lavagem das células e
retirada do excesso de CFSE. As células foram ressuspensas em 500 µL de RPMI
suplementado e mantidas em banho de gelo até o momento do uso.
Na análise do efeito inibitório do extrato sobre a proliferação de linfócitos foram
confeccionadas culturas estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) na
presença dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata em placas
cultura de 24 poços (TPP®). Para isso 5 x 105 células foram incubadas em RPMI
suplementado e foram estimuladas ou não com 10 µL de PHA 5 µg/mL (Sigma®) na
ausência ou presença do extrato nas concentrações finais de 45, 30, 20 e 15 µg/mL. Para
o controle de inibição, células estimuladas com PHA foram também tratadas com o
anti-inflamatório Dexametasona (Fosfato Dissódico de Dexametasona- Decadron®
injetável, 4 mg/mL) na concentração de 8 µg/mL que corresponde a 15 µM. Todas as
culturas tiveram o volume final ajustado para 2 mL com RPMI suplementado e
incubadas em estufa a 37 °C, 5% de CO2 por 5 dias. Após o período de incubação, as
células foram retiradas da placa, transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059 –
BD®) e lavadas duas vezes com PBS gelado, utilizando centrifugação a 1800 rpm, 18 ºC
por 7 min.
A proliferação celular foi determinada pela medida do decaimento da
fluorescência do CFSE, através da citometria de fluxo (FACScan®) com aquisição de
50.000 eventos. Após aquisição dos eventos, dentro de uma região (gate)
120
correspondente à população de interesse foi feita a análise da proliferação celular
utilizando o programa Cell-Quest (BD Biosciences®). Em gráficos de distribuição
pontual, através dos parâmetros FSC x SSC, a população de linfócitos foi definida pela
região do gate, para culturas não estimuladas (CON) (Figura 22A) e estimuladas com
PHA. Em seguida, os eventos no gate foram analisados para intensidade de
fluorescência do CFSE, usando histogramas de fluorescência (FL-1) em função do
número de eventos. A região M1 foi definida como células marcadas com CFSE
derivadas de culturas não estimuladas (CON), que representa o pico de células
quiescentes (Figura 22B). Os picos de M2 a M8 foram definidos de acordo com picos
de diferentes intensidades de CFSE em culturas estimuladas com PHA (Figura 22C).
Por meio do percentual de células presentes nas regiões M1 a M8 foi calculado o índice
de proliferação das culturas celulares através da seguinte equação:
%=
100 − &
&
Em que,
& x =( +
(
(
(+ (
X/
+
+ +
+
2
4
8 16 32
Onde X0 representa a porcentagem de células que não se dividiram representada
em M1, e X1 a X5 representam os picos de divisão gradual representadas em M2 a M8
(ÂNGULO; FULCHER, 1998).
121
A
SSC
SSC
C
FSC
M
D
Número de Eventos
B
FSC
CFSE
Figura 22 – Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do CFSE. A e C- Gráfico de
distribuição pontual para a seleção das populações de linfócitos utilizando os parâmetros de tamanho
celular (FSC) e granulosidade celular (SSC) das culturas CON e PHA, respectivamente. B - Histogramas
de FL-1, utilizados para definir as regiões M1 do grupo CON. D – Histograma de FL-1 utilizado para
definir as regiões M1 a M8 do grupo PHA, com as quais foi obtido o índice de proliferação (IP) para a
população de linfócitos.
4. 13 Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas através do software GraphPad Prism 5.
Para análise da normalidade dos dados, foi utilizado o teste Shapiro-Wilk e as
diferenças entre as variáveis com distribuição normal foram testadas utilizando
ANOVA com pós-teste de Tukey. Para as variáveis com distribuição assimétrica, foi
utilizado o teste Kruskall-Wallis com pós-teste de Dunns ou ANOVA seguido do pósteste de Bonferroni. Diferenças significativas foram consideradas quando p<0,05,
adotando intervalo de confiança de 95%.
122
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Perfil químico da Miconia ferruginata
O perfil químico foi determinado por meio de análises fitoquímicas preliminares
clássicas e por técnicas hifenadas dos extratos e frações das folhas/flores e caule de M.
ferruginata.
5. 1.1 Preparo e rendimento dos extratos e frações
O rendimento dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de
M. ferruginata estão descrito na Tabela 3 e das frações obtidas por partição líquidolíquido dos extratos etanólicos na Tabela 4. Os extratos etanólicos e aquoso das
folhas/flores tiveram maior rendimento (9,02% e 5,67%) do que os do caule (3,67% e
3,38%), respectivamente. Já o rendimento das frações obtidas do extrato etanólico tanto
das folhas/flores quanto do caule não ultrapassou 2%, com exceção da fração hexânica
das folhas/flores que rendeu 5,10%. Para o fracionamento do extrato aquoso das
folhas/flores foram obtidas 43 frações, entretanto não foi possível calcular os
respectivos rendimentos devido a baixa massa obtida nas frações.
Tabela 3 - Rendimento dos extratos etanólicos e aquosos brutos das folhas/flores e do
caule de Miconia ferruginata
Extrato
Material vegetal
usada (g)
Massa do extrato
(g)
Rendimento
(%)
E1
500
45,1233
9,02
E2
500
18,3437
3,67
E3
100
5,666
5,67
E4
100
3,3847
3,38
E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico do caule; E3: Extrato aquoso das
folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.
123
Tabela 4- Rendimento das frações obtidas do extrato etanólico bruto das folhas/flores e
do caule de Miconia ferruginata por meio de partição líquido-líquido com solventes de
polaridades crescentes
Fração
Massa do
Massa da
Rendimento
extrato (g)
fração (g)
(%)
1,9939
5,10
0,2296
0,59
0,6104
1,56
0,2394
1,91
0,0896
0,72
0,1005
0,80
Fração hexânica das
folhas/flores
Fração diclorometânica das
folhas/flores
39,0269
Fração acetato de etila das
folhas/flores
Fração hexânica do caule
Fração diclorometânica do
12,5210
caule
Fração acetato de etila do caule
5. 1. 2 Fitoquímica preliminar
5. 1. 2. 1 Reações cromogênicas e de precipitação
A análise da fitoquímica preliminar para determinação da presença das
principais classes metabólicas (alcaloides, antraquinonas, esteroides/triterpenoides,
flavonoides, saponinas e taninos) das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram
realizadas por meio de reações cromogênicas e de precipitação e cromatografia em
camada delgada comparativa (CCDC) (WAGNER; BLADT, 1995; SIMÕES et. al.,
2007; COSTA, 2012). Nas reações cromogênicas e de precipitação, a formação de
precipitados ou aparecimento de cor podem ser causadas por diferentes classes de
metabólitos, tais como proteínas, betalaínas, taninos, cumarinas e, outros. Assim, os
resultados negativos indicam ausência ou baixa concentração do metabólito pesquisado,
enquanto os resultados positivos devem ser considerados como provável presença
desses metabólitos (COSTA, 2001; SIMÕES et al., 2007).
Na pesquisa de alcaloides foram realizados os testes de precipitação com
reagentes específicos para extrações ácida e básica. Porém, para a espécie M.
ferruginata não se observou a formação de precipitado em nenhum dos reagentes
124
utilizados. Assim, considera-se que esta classe de metabólito provavelmente está
ausente ou em baixas concentrações na espécie (Figura 23). Esses achados estão de
acordo com os encontrados para outras espécies da família Melastomataceae, como para
a espécie Clidemia strigillosa e Miconia cabucu (CÓRDOBA; BÁEZ; DOMÍNGUEZ,
1995; SILVA, 2013).
B
A
M
B
H
D
C
M
B
H
D
M
B
H
D
Figura 23 – Pesquisa de alcaloides nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle
positivo (folhas de Peumus boldus Molina); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule; M:
Reagente de Mayer; B: Reagente de Bouchardat; H: Reagente de Hager; e D: Reagente de Dragendorff.
Na identificação de antraquinonas foram realizadas as reações de Bornträger
direta e indireta, não ocorrendo o desenvolvimento de nenhuma coloração para a
espécie M. ferruginata em ambas as reações, conforme mostrado na Figura 24. A
presença de antraquinonas na amostra é considerada positiva apenas se a reação
confirmatória de Bornträger com hidrólise ácida apresentar formação de cor
avermelhada na fase aquosa. Assim, o resultado para antraquinonas tanto nas
folhas/flores quanto no caule foi considerado negativo. Para outras espécies da família
Melastomataceae também não foi descrito a presença desta classe de metabólito
(MARTÍNEZ, 2012), como para a espécie Miconia cabucu (SILVA, 2013).
125
A
B
BD
BI
C
BD
BI
BD
BI
Figura 24 – Pesquisa de antraquinonas nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A –
Controle positivo (folhas de Senna alexandrina Mill.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule.
BD: Bornträger direta; BI: Bornträger indireta.
Na Figura 25, estão representados os resultados positivos para a presença de
triterpenos e esteroides tanto para as folhas/flores quanto para o caule de M. ferruginata.
As reações de Salkowisk e de Libermann-Burchard apresentaram a formação de um
anel castanho-avermelhada e verde, respectivamente, indicativo da presença de anel
triterpênico. Na reação com a vanilina sulfúrica foi observado a cor violeta após
aquecimento direto em chama.
C
B
A
LB
S
LB
S
LB
S
Figura 25 – Pesquisa de esteroides/triterpenos nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A –
Controle positivo (folhas de Ginkgo biloba L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. LB:
Reação de Libermann-Burchard; S: reação de Salkowisk.
126
Em inúmeros estudos com espécies do gênero Miconia tem sido observada a
presença da classe dos triterpenos, sendo estes apontados como os compostos
majoritários (LIN; GUO; YANG, 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006;
VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2010). Os
triterpenoides mais descritos na literatura são os ácidos triterpênicos pentacíclicos,
sendo os mais comuns o ácido ursólico e oleanólico (VASCONCELOS et al., 2006;
SERPELONI et al., 2008b; PIERONI et al., 2011; RODRIGUES et al., 2008; CUNHA
et al., 2008; CUNHA et al., 2006; PEIXOTO et al., 2011).
Na pesquisa de flavonoides tanto as folhas/flores quanto o caule de M.
ferruginata apresentaram positividade para todas as reações desse metabólito (Figura
26). Nas reações de Taubouk e hidróxidos alcalinos foi observado a coloração
amarelada intensa, nas reações de Shinoda e Pew foi observada cor vermelha, indicativa
da presença de flavonóis, e, nas reações com cloreto férrico foi desenvolvida cor verdeescuro indicativa de flavonóis e flavanonas. Já na reação com cloreto de alumínio foi
observado sob luz UV o aparecimento de zonas de cor amarelada.
A
C
B
S
P
CF
S
CN
CF
P
CN
S
CF
P
CN
Figura 26 – Pesquisa de flavonoides nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle
positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. S:
Reação de Shinoda; CF: Reação com cloreto férrico; P: Reação de Pew; e CN: controle negativo.
Em outras espécies do gênero Miconia também foram identificados e isolados
diversos flavonoides (ZHANG et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al.,
2008; RODRIGUES et
flavonoides
al., 2011). Na M. alypifolia foram identificados quatro
glicosilados:
apigenina-7-glucosídio,
campferol-3-O-diglucosídio,
campferol-3-O-galactosídio e quercetina-3-O-galactosídio (MANCINI et al., 2008).
RODRIGUES e colaboradores (2007) identificaram um dímero de flavona da M.
cabucu. No estudo de ZHANG et al., (2003) foi identificado na espécie M. trailii dois
novos flavonoides glicosilados: os miconiosidios A e B.
127
Para a pesquisa de saponinas foi realizado a avaliação da propriedade afrogênica
e a determinação do índice de espuma (Figura 27). Tanto as folhas/flores quanto o caule
de M. ferruginata apresentaram positividade para a propriedade afrogênica. Na
determinação do índice de espuma, apenas as folhas/flores apresentaram espuma
persistente de no mínimo 1 cm no tubo com diluição de 20% v/v. No cálculo do índice
de espuma foi obtido o índice de 500. Já no caule não foi observado espuma persistente
de no mínimo 1 cm, assim considera-se que esta classe se encontra em baixas
concentrações nesta parte da planta. Estes achados estão de acordo com os encontrados
por HASS; VAN POSER (1990) e LIMA et al. (2013).
B
A
C
Figura 27 – Pesquisa de saponinas nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle
positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule.
Na identificação de taninos, a espécie M. ferruginata apresentou resultados
positivos para todas as reações. Nos testes com gelatina e acetato de chumbo foi
observada a formação evidente de precipitado e, no teste com cloreto férrico foi
observada formação de cor azul, indicativa da presença de taninos hidrolisáveis, como
indicado na Figura 28. Semelhantemente a M. ferruginata, outras espécies da família
Melastomataceae tem apresentado oligômeros de taninos hidrolisáveis (LEITE, 2009).
Foi sugerido à presença de taninos nas folhas das espécies: M. albicans, M. cabucu, M.
rubiginosa e M. stenostachya (RODRIGUES, 2007; SERPELONI et al., 2008b).
A
B
G
AC
CF
CN
C
G
AC
CF
CN
G
AC
CF
CN
Figura 28 – Pesquisa de taninos nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle
positivo (Folhas de Hamamelis virginiana L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. G:
Reação com gelatina; AC: Reação com acetato de chumbo; CF: Reação com cloreto férrico; CN: controle
negativo.
128
A síntese dos resultados obtidos para as reações cromogênicas e de precipitação
estão descritos no Quadro 8, que sugerem a presença na espécie M. ferruginata de
taninos, flavonoides e terpenoides, tanto nas folhas/flores quanto no caule. A classe das
saponinas estava presente nas folhas/flores e possivelmente em baixas concentrações no
caule. Como já relatado, algumas espécies do gênero Miconia apresentaram resultados
semelhantes ao do presente estudo (RODRIGUES, 2007; RODRIGUES et al., 2007;
ARAÚJO, 2011; BERALDO, 2011).
Quadro 8 – Resultados da fitoquímica preliminar por meio das reações
cromogênicas e de precipitação das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
Classes
metabólicas
Partes da planta
Subclasses
Folha
Caule
Alcaloides
---
Negativo
Negativo
Antraquinonas
---
Negativo
Negativo
Flavonóis
Positivo
Positivo
Flavanonas
Positivo
Positivo
Flavonas
Positivo
Positivo
chalconas
Negativo
Negativo
isoflavonas
Negativo
Negativo
Hidrolisáveis
Positivo
Positivo
Condensados
Negativo
Negativo
Triterpenoides
---
Positivo
Positivo
Saponinas
---
Positivo
Negativo
Flavonoides
Taninos
5. 1. 2. 2 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
Para confirmar o perfil fitoquímico preliminar obtido nas reações cromogênicas e de
precipitação para M. ferruginata foram realizadas CCDC específicas para cada classe de
metabólito secundário. Na análise de terpenoides à luz visível, após aplicação do
reagente revelador, vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10
minutos, evidenciou-se a presença de zonas azuis típicas desta classe de metabólito no
extrato aquoso das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. Os Rfs obtido para os
componentes de ambos os extratos foram próximos ao do padrão α-bisabolol (Rf =
129
0,61), no qual para as folhas/flores o Rf foi de 0,65 e para o caule foi de 0,63. Tanto a
proximidade dos valores de Rfs e a visualização de manchas azuis sugerem a presença
de terpenoides na planta.
A presença de flavonoides foi avaliada após revelação com vanilina sulfúrica a
1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10 minutos. Foi possível observar sob luz
visível zonas amareladas características de flavonoides nos extratos etanólicos e
aquosos das folhas/flores e do caule (Figura 29). Os Rfs calculados foram de 0,94 tanto
para as folhas/flores quanto para o caule. Esses achados confirmam a presença de
flavonoides na planta, uma vez que o Rf do padrão quercetina foi de 0,95. Na análise
sob a luz UV a 365 nm, os flavonoides aparecem como zonas de fluorescência amarela,
verde ou azul, relativo à presença de diferentes tipos estruturais (WAGNER; BLADT,
1995). Para a amostra das folhas/flores e do caule sob luz UV evidenciou-se a presença
de zonas amarelas. Ambos os componentes dos extratos apresentaram cor e formato da
mancha e Rfs próximos ao padrão, o que indica que os flavonoides presentes na amostra
possivelmente apresentam estrutura semelhante à quercetina.
P
E1
E2
E3
E4
Figura 29 – Cromatograma dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
para pesquisa de flavonoides após revelação com vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a
100°C por 10 minutos. P: padrão (quercetina); E1: extrato etanólico das folhas/flores; E2: extrato
etanólico do caule; E3: extrato aquoso das folhas/flores; E4: extrato aquoso do caule.
130
Na pesquisa de saponinas foi observada uma mancha azul violeta no extrato
aquoso das folhas/flores, após revelação com etanol e ácido sulfúrico seguido de
aquecimento. A solução padrão de saponinas apresentou Rf de 0,67 e cor azul violeta,
confirmando a presença desta classe nas folhas/flores de M. ferruginata em que o Rf foi
de 0,68. Assim, foi sugerida a presença de saponinas nas folhas/flores da planta. Já no
caule este metabólito pode ou estar ausente ou em baixas concentrações e, por isso, não
foi observado aparecimento de nenhuma mancha referente a saponinas.
Na análise de taninos, a cromatoplaca foi revelada com cloreto férrico 1% em
metanol, em que os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule apresentaram
manchas azuis características de taninos. O Rf calculado foi de 0,87 para as
folhas/flores e 0,88 para o caule. Esses achados confirmam a presença desta classe de
metabólitos na planta, uma vez que o Rf do padrão (0,90) e a coloração da mancha
foram muito semelhantes ao da amostra.
Para as análises de alcaloides não foi observado nenhuma mancha após
revelação com reagente de Dragendorff. Apenas o padrão apresentou zona alaranjada,
esses achados confirmam resultado negativo para presença de alcaloides, tanto nas
folhas/flores quanto no caule. Assim, como na pesquisa de antraquinonas não foram
observadas manchas vermelhas indicativas deste metabólito nos extratos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata, sugerindo ausência desta classe de
metabólitos na planta.
Na Tabela 5 se encontra o resumo dos resultados encontrados para a CCDC
realizados nas folhas/flores e caule de M. ferruginata. A partir da correlação dos
resultados obtidos da CCDC com os achados nas reações cromogênicas e de
precipitação é sugerida a presença de flavonoides, terpenoides e taninos nas
folhas/flores e caule de M. ferruginata e, a presença de saponinas apenas nas
folhas/flores. Porém, para maior confiabilidade dos resultados e indicação de prováveis
estruturas de cada metabólito foram realizadas análises por meio de fracionamento e
técnicas hifenadas de detecção.
131
Tabela 5 – Triagem por meio de cromatografia em camada delgada comparativa
(CCDC) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata
Extratos
Metabólitos
secundários
Alcaloides
E1 (Rf)
E2 (Rf)
E3 (Rf)
E4 (Rf)
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Antraquinonas Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Padrão
(Rf)
Butilbrometo
de
escopolamina (0,65)
Extrato das Folhas de C.
Senna (0,76)
Flavonoides
Presente
(0,94)
Presente (0,94)
Presente
(0,94)
Presente
(0,94)
Quercetina (0,95)
Taninos
Presente
(0,87)
Presente (0,88)
ND
ND
Extrato das folhas de
Hamamelis virginiana
(0,90)
Terpenoides
ND
ND
Presente
(0,63)
α-bisabolol (0,61)
Saponinas
ND
ND
Presente
(0,67)
Presente
(0,68)
Ausente
Saponina (0,67)
ND: não determinado; Rf: fator de retenção; E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico
do caule; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.
5. 2 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase
sólida por headspace
O cromatograma obtido na análise por CG-MS está representado na Figura 30.
Para análise dos picos e identificação das substâncias foram utilizadas três espectrotecas:
Wiley7, Nist8 e Nist 8c. Para cada pico foi determinado o índice de retenção relativa
(IRR) em relação à injeção simultânea de hidrocarbonetos n-alcanos (C9-C22), conforme
descrito por ADAMS (2007) e em conformidade com a base de dados Pherobase (2014).
Apenas as substâncias com índice de similaridade igual ou superior a 90% foram
selecionadas para identificação. Dentre os 25 picos obtidos foram identificados 14
compostos totalizando 51,4% dos compostos presentes (Tabela 5). As respectivas
estruturas das substâncias propostas estão apresentadas na Figura 31 e os seus
respectivos espectros de massas estão demonstrados no apêndice A.
132
Intensidade
β-cariofileno
TR: 24,99
8-heptadeceno
TR: 35,17
α-humuleno
TR: 26,36
1-octen-3-ol
TR:7,13
Minutos
Figura 30 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por
headspace (HS-SPME).
Os compostos identificados com picos de maior intensidade foram os
sesquiternos β-cariofileno (8) (56,27%) e α-humuleno (9) (7,39%), o hidrocarboneto 8heptadeceno (14) (16,81%) e o álcool 1-octen-3-ol (2) (9,54%). Já os compostos com
picos de menor intensidade foram o hidrocarboneto hexadecano (12) (0,13%) e o
sesquiterpeno β-cubebeno (6) (0,16%). Dentre os compostos identificados encontram-se
seis sesquiterpenos (42,85%), quatro hidrocarbonetos (28,57%), um monoterpeno
bicíclico (7,14%), um fenilpropanoide (7,14%) e dois alcoóis (14,28%). À presença de
hidrocarbonetos e terpenos tem sido amplamente relatadas nas análises por CG-EM, em
outras espécies do gênero Miconia, entre elas: M. cabucu, M. rubiginosa e M.
stenostachya (MACARI; EMERECIANO; FERREIRA, 1990; CUNHA et al., 2003a;
SPESSOTO et al., 2003; CREVELIN et al., 2006; RODRIGUES et al., 2008).
133
Tabela 6 – Dados obtidos na análise em cromatografia em fase gasosa acoplada
à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através
de microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME)
Tempo de %
Índice
retenção
Retenção
Retenção
calculado
Literatura*
Área
(minutos)
de Índice
de Índice
de Substância
similaridade**
proposta
4,165
0,24
ND
ND
95%
3-hexen-1-ol (1)
7,137
9,54
977
ND
98%
1-octen-3-ol (2)
14,399
0,89
1171
1165
91%
isoborneol (3)
22,071
1,69
1349
1351
97%
Eugenol (4)
23,057
0,21
1372
1376
94%
α-copaeno (5)
23,580
0,16
1385
1389
90%
β-cubebeno (6)
23,653
0,36
1386
1391
91%
β-elemeno (7)
24,699
0,20
1411
ND
ND
ND
24,994
56,27
1418
1418
95%
β-cariofileno (8)
26,070
0,76
1444
ND
ND
ND
26,369
7,39
1451
1455
96%
α-humuleno (9)
26,689
0,23
1459
ND
ND
ND
27,054
0,07
1468
ND
ND
ND
27,406
0,25
1477
1480
92%
Germacreno D (10)
27,500
0,07
1479
ND
ND
ND
27,581
0,10
1481
ND
ND
ND
28,328
2,17
1499
1500
97%
Pentadecano (11)
31,398
0,75
1577
ND
ND
ND
32,264
0,13
1598
1600
97%
Hexadecano (12)
34,811
0,44
1666
ND
92%
8-Hexadecino (13)
35,176
16,81
1676
1672
97%
8-heptadeceno (14)
36,019
0,59
1698
ND
ND
ND
40,970
0,31
1838
ND
ND
ND
42,085
0,11
1871
ND
ND
ND
42,805
0,07
1892
ND
ND
ND
*ADAMS (2007) e Pherobase (2014)
**Espectrotecas de massas Wiley7, Nist 8 e Nist 8c
ND: não determinado
Total identificadO: 96,55%
134
O β-cariofileno (8) é um sesquiterpeno bicíclico que pode ser encontrado em
óleos essenciais e resinas de uma ampla variedade de plantas (RAMOS, 2006; SOUZA
et al., 2007b; ZIECH et al., 2013; MEDEIROS, 2014). Este composto ocorre
normalmente na forma de mistura de isômeros com o isocariofileno e o α-humuleno (9)
(SILVA et al., 2014). Na M. ferruginata a mistura de β-cariofileno e α- humuleno
estava presente nas partes aéreas da planta. Dentre as classes dos terpenoides, os mais
relatados no gênero Miconia tem sido os pertencentes a classe dos ácidos triterpênicos
pentacíclicos (CUNHA et al., 2003a; VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al.,
2008; CUNHA et al., 2010; QUEIROZ et al., 2011; PEIXOTO et al., 2011; FERREIRA
et al., 2013).
Na espécie M. ferruginata foi observado a presença de um fenilpropranoide, o
eugenol (4). Este composto é um fenol arilpropanóide, natural, aromático e
farmacologicamente ativo, presente em óleos essenciais de algumas plantas do cerrado
brasileiro. O germacreno D (10), é um hidrocarboneto intermediário na biossíntese de
muitos
sesquiterpenos
(BÜLOW;
KÖNIG,
2000;
PROSSER
et
al.,
2004;
STELIOPOULOS et al., 2002). Tem como característica especial a capacidade de atrair
insetos e outros organismos (MOZURAITIS et al., 2002;. STRANDEN; BORGKARLSON; MUSTAPARTA, 2002; PETRAKIS et al., 2005). Outro integrante dos
terpenos, o monoterpeno bicíclico isoborneol (3), é frequentemente encontrado em
muitos óleos essenciais de plantas usadas na medicina tradicional (SANTOS, 2013),
como nas partes aéreas frescas de M. ferruginata.
135
Figura 31 – Representação estrutural das substâncias identificadas (1 a 14) por análise por cromatografia
em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata
através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME). ChemDraw Ultra (2004).
136
5. 3 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e do caule de
Miconia ferruginata
Os extratos aquosos e etanólicos obtidos a partir de folhas/flores e caule de M.
ferruginata foram analisados por CLAE-DAD. Os cromatogramas e espectros na região
do UV-Vis (190-800 nm) obtidos dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de
Intensidade
M. ferruginata estão representados nas Figuras 32 e 33, respectivamente.
Minutos
Figura 32 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
Intensidade
ferruginata (λ 280 nm).
Minutos
Figura 33 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata
(λ 280 nm).
137
Os cromatogramas e espectros na região do UV-Vis (190-800 nm) obtidos dos
extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão representados nas
Intensidade
Figuras 34 e 35, respectivamente.
Minutos
Figura 34 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia
Intensidade
ferruginata (λ 280 nm).
Minutos
Figura 35 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata (λ
280 nm).
Na Tabela 7 constam os tempos de retenção e dados de absorção na região do
UV-Vis e as classes químicas propostas a partir da análise em CLAE-DAD tanto dos
extratos etanólicos quanto aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. Na
Figura 36 se encontra a estrutura dos classes químicas propostas nesta análise.
138
Os dados mostram que os constituintes detectados nos extratos etanólicos foram
semelhantes aos dos extratos aquosos, porém os extratos etanólicos apresentaram maior
grau de complexidade em sua composição. Isso mostra que ambas as formas de extração
(etanólica e aquosa) propicia a extração de compostos de polaridade próximas. E por
isso, ambos os extratos etanólicos e aquosos apresentaram um perfil químico rico em
compostos fenólicos, principalmente compostos pertencentes a classe dos flavonoides.
Tabela 7 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com
detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata
Extrato etanólico das folhas/flores
Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta
(nm)
15.562
255; 354
Flavonol derivado da
quercetina (15)
16.540
256; 352
Flavonol derivado da
quercetina (15)
17.098
255; 346
Flavonol derivado da
quercetina (15)
26.341
278; 330
Flavona (16)
31.142
274; 331
Flavona (16)
40.747
290, 310
Ácido fenólico (17)
Extrato aquoso das folhas/flores
Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta
(nm)
8.790
202; 278
Catequina (18)
11.320
203; 278
Catequina (18)
15.600
254; 354
Flavonol derivado da
quercetina (15)
17.127
255; 348
Flavonol derivado da
quercetina (15)
Extrato etanólico do caule
Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta
(nm)
15.674
204; 281
Catequina (18)
18.351
250; 350 (ombro); 365
Flavonol (19)
19.082
247; 351 (ombro); 367
Flavonol (19)
Extrato aquoso do caule
Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta
(nm)
4.294
205; 264
Fenólicos (20)
5.678
203; 255; 286
Fenólicos (20)
15.716
204; 281
Catequina (18)
139
16
15
H
O
OH
B
OH
HO
O
OH
A
C
H
17
OH
OH
18
19
20
Figura 36 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas identificadas (15 a 20) pela
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)
para os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Os resultados obtidos na presente pesquisa estão de acordo com outros estudos
químicos realizados com espécies da família Melastomataceae. BOMFIM-PATRÍCIO e
colaboradores (2001) relataram a presença de 116 flavonoides, dos quais 69 eram
flavonóis e 47 flavonas em diferentes espécies da família Melastomataceae. Existe uma
ocorrência comum de flavonoides metoxilados nos diferentes gêneros pertencentes a
esta família. Em outro estudo sobre a composição e distribuição de flavonoides no
gênero Huberia foi possível identificar 17 compostos, como as agliconas livres,
apigenina, campferol, quercetina e seus derivados glicosilados (MIMURA; SALATINO;
SALATINO, 2004). Na espécie Mouriri pusa foram identificados diversos flavonoides,
entre eles a epicatequina, miricetina, campferol e quercetina e seus derivados
140
glicosilados (ANDREO et al., 2006; SANTOS et al., 2008). Estes compostos fenólicos
têm sido propostos como marcadores quimiotaxonômicos da família Melastomataceae.
Em muitas espécies do gênero Miconia tem sido observado a presença de
diversos grupos fenólicos, principalmente da classe dos flavonoides, assim como os
observados na espécie em estudo. Na M. rubiginosa foi identificado onze compostos
fenólicos, entre eles se encontram quercetina-o-glicosiladas, ácido gálico, epicatequina e
campferol-o-glicosilados (RODRIGUES et al., 2011). Já na M. trailii foi possível
identificar dois novos flavonoides, os miconiosídio A e B, além do ácido bartogênico,
ácido arjunólico e ácido miriânthico (ZHANG et al., 2003). Um estudo químico do
extrato metanólico das folhas de M. alypifolia mostrou a presença de quatro flavonoides:
apigenina-7-O-glucosídio, campferol-3-O-diglucosídio, campferol-3-O-galactosídio e
quercetina-3-O-galactosídio (MANCINI et al., 2008). RODRIGUES e colaboradores
(2007) descrevem a identificação a partir do extrato metanólico de folhas de M. cabucu
do primeiro dímero de flavonas metoxiladas ligadas por dois anéis aromáticos, o 5hidróxi-4’,7-dimetoxiflavona-(6-C-6’’)-5’’- hidróxi-3’’’,4’’’,7’’’-trimetoxiflavona.
O espectro de UV de um flavonoide consiste em dois picos de absorção máxima,
na qual a banda I ocorre entre 300-550 nm e está relacionado ao anel B e, a banda II
entre 240- 285 nm está relacionado ao anel A. A posição precisa e as intensidades
relativas desses picos máximos fornecem informações sobre a natureza do flavonoide e
de seu padrão de oxigenação. Assim, alterações na substituição do anel A modificam a
banda II, enquanto que alterações nos anéis B e C modificam a banda I (MABRY;
MARKHAM; THOMAS, 1970; ANDERSEN; MARKHAM, 2006). RODRIGUES
(2007) avaliou as espécies M. cabucu e M. rubiginosa e verificou compostos que
apresentavam espectros de UV contendo duas bandas, com a banda I ocorrendo entre
328 - 357 nm, característico de flavonoides derivados, principalmente da quercetina,
com glicosilações na posição 3 do anel C. Também foi observada a presença de outros
compostos fenólicos como a catequina e taninos. Esses achados concordam com os
encontrados para a espécie M. ferruginata.
Os flavonoides (Figura 10) são considerados uma das classes químicas mais
abundantes e com uma importância biológica tanto para os próprios vegetais quanto
para o homem. Entre as subclasses de destaque estão às flavonas e os flavonóis, que
apresentam origem biossintética próxima. Os flavonóis (19) são basicamente a estrutura
das flavonas (16) com um grupo hidroxila substituído na posição C3 (SIMÕES et al.,
2007). Os flavonóis mais abundantes nos vegetais e hortaliças são campferol, quercetina
141
e miricetina (FENNEMA, 1992; VOLP et al., 2008). A 3, 3`,4`,5,7-pentahidroxiflavona, conhecida como quercetina, pertencente a este subgrupo, sendo
considerado o composto mais presente na dieta humana, principalmente na forma
glicosilada (15) (OLTHOF et al., 2000).
O 3-flavanol é um composto fenólico conhecido como catequina (18) pertence
ao grupo dos flavanóis e são constituídos por um anel floroglucinol (A), um anel
pirânico (C) e um anel catecol (B) em sua estrutura. Essa molécula apresenta centros
quirais que resultam na formação de quatro isômeros: (+), (-)-catequina e (+), (-)epicatequina. São encontrados em grande quantidade em uvas e chás verde e preto
(WANG; PROVAN; HELLIWELL, 2000; HOWARD et al., 2002; SABU; SMITHA;
KUTTAN, 2002; SAITO et al., 2007) utilizados em muitas dietas e na prevenção de
doenças crônico-degenerativas, como as cardiovasculares, neurodegenerativas e o
câncer (SASKIA; BAST, 1998; UESATO et al.; 2001; GONZALO; ALONSO, 2002;
HAN et al., 2004). Estes efeitos ocorrem devido à conversão dos compostos instáveis
gerados por radicais livres em compostos inativos de baixa energia, pelas catequinas e
outros compostos fenólicos.
5. 4 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata
Na Figura 37 é apresentado os cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos no
modo de ionização negativo e de ultravioleta (UV). Na análise foi possível identificar
seis compostos e conhecer a classe química de outros cinco compostos. Na Figura 38
estão representados algumas estrutura químicas obtidas nesta análise, as demais foram
representadas na Figura 36. Esses resultados estão descritos na Tabela 8. No apêndice B
estão representados os espectros de massas obtidos das substâncias ou classes químicas
gerados a partir da análise de CLAE-DAD-EM do extrato etanólico das folhas/flores de
M. ferruginata.
Intensidade
142
Minutos
Figura 37 – Cromatograma de íons totais (vermelho) e cromatograma na região do ultravioleta (verde)
obtidos a partir da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata.
Tabela 8 – Dados obtidos a partir da análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DADEM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata
Tempo de
retenção
11,3
15,5
16,2
17,1
18,2
19,0
19,4
27,5
28,0
28,8
31,8
Espectro de massas
(-)
383,1212
191,0563
353,1101
191,0567
579,1537
289,0731
479,0858
337,0807
128,0339
463,0906
433,0807
447,0960
595,1640
297,0789
327,0895
357,1007
297,0783
ND: não determinado; UV: ultra-violeta
Picos de Absorção
máxima (nm)
Substância / classe química
proposta
ND
Ácido quínico (21)
ND
Ácido monocafeoilquínico (22)
278
Catequina (18)
261; 356
Flavonol (19)
255; 354
254; 354
254; 348
Quercetina-O-hexose (23)
Quercetina-O-pentose (24)
Quercetina-O-deoxihexose (25)
278; 330
Flavona (16)
277; 339
280; 328
274; 331
Flavona (16)
Flavona (16)
Flavona (16)
143
21
22
OH
OH
HO
O
O
O
OH
O
OH
HO
OH
23
24
25
Figura 38 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas identificadas (21 a 25) pela
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à
espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata.
Os resultados encontrados nesta análise foram bastante semelhantes aos dados
observados na análise anterior de CLAE-DAD, porém esta técnica permitiu identificar
algumas substâncias no extrato etanólico das folhas/flores, como os derivados do ácido
clorogênico e os derivados glicosilados da quercetina. Os ácidos mono (22) e
144
dicafeoilquínicos pertencem ao grupo de ácidos fenólicos, conhecidos como ácidos
clorogênicos, são caracterizados pela ligação éster entre o ácido quínico (21) e uma ou
mais moléculas de ácidos hidroxicinâmicos, entre eles, o ácido cafeico (BASTOS et al.,
2005 e 2007; HECK; MEJIA, 2007; JAISWAIL et al., 2010). Estes esteres de ácido
cafeico e outros compostos fenólicos foram apontados como responsáveis por
importantes atividades, tais como antimicrobiana e antitumoral (SFORCIN; ORSI;
BANKOVA, 2005).
Outras espécies do gênero Miconia tem apresentado perfil químico semelhante
ao encontrado para a M. ferruginata (BOMFIM-PATRÍCIO et al., 2001; RODRIGUES,
2007; MANCINI et al., 2008). Relatos na literatura, mostraram que os flavonoides
encontrados em espécies deste gênero normalmente se encontram nas formas de
agliconas livres e derivados glicosilados, principalmente da apigenina, campferol e
quercetina (RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al., 2008; RODRIGUES et al.,
2008) como observado no presente estudo. Assim, os dados encontrados para a espécie
M. ferruginata por meio destas análises juntamente com os resultados anteriores
corroboram no estudo sobre seu perfil químico rico em compostos fenólicos,
principalmente os compostos pertencentes a classe dos flavonoides.
5. 5 Teor de compostos fenólicos
A curva padrão do ácido gálico foi utilizada para extrapolação do teor em
miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama de extrato (mg EAG/g) (Figura
39). Os resultados do teor de fenóis totais médios e os desvios padrões obtidos dos
extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão apresentados na
Tabela 9. Em ambos os extratos, o teor de compostos fenólicos foi elevado, acima de 66%
do extrato seco. As folhas apresentaram maior teor de compostos fenólicos (857,64 ±
0,11 mg EAG/g) que o caule (664,50 ± 0,03 mg EAG/g). Para a espécie M. albicans
também foi realizado este doseamento que revelou um conteúdo de compostos fenólicos
inferior ao encontrado no presente estudo (70,04 ± 0,12 mg EAG/g) (PIERONI et al.,
2011).
145
Figura 39 – Curva de calibração do padrão ácido gálico traçada pelo método colorimétrico de FolinFolin
Ciocalteu.
Tabela 9 – Média e desvio padrão do teor de compostos fenólicos totais dos extratos
aquosos de folha/flores e do caule de Miconia ferruginata
Extrato
Teor de compostos fenólicos mg
EAG/g extrato
Folha/Flores
857,64 ± 0,11
Caule
664,50 ± 0,03
A quantidade de compostos fenólicos tem sido associada ao potencial
antioxidante encontrado em frutas, hortaliças, vegetais e outros produtos naturais
(MANACH et al., 2004; ALVES, et al., 2007; ZULETA et al., 2007; REZENDE,
2010). A propriedade antioxidante dos compostos fenólicos depende de sua estrutura
química, podendo ser determinada pela (1) velocidade de inativação do radical livre, (2)
potencial de quelação de metais através da estrutura orto-dihidroxifenólica,
orto dihidroxifenólica, (3)
reatividade e estabilidade de seus radicais intermediários pelo mecanismo de
ressonância (PANNALA
PANNALA et al., 2001; GONZALO; ALONSO, 2002; RIBEIRO;
SERAVALLI, 2004).. RICE-EVANS
RICE
e colaboradores (1996) demonstram que a
atividade antioxidante dos flavonoides, in vitro, é maior que a encontra para as
vitaminas E e C.
146
A capacidade antioxidante dos flavonoides já tem sido bastante relatada na
literatura (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; HARBORNE; WILLIAMS,
2000;
HAVENSTEEN,
2002;
HEIM;
TAGLIAFERRO;
BOBILYA,
2002;
MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003; GREGOR et al.,
2005;
HURBER;
AMAYA-RODRIGUEZ,
2008;
CROZIER;
JAGANATH;
CLIFFORD, 2009; GUTIERREZ-MERINO et al., 2011). As flavonas e flavonóis são
subclasses dos flavonoides de particular importância para a atividade antioxidante
observado na espécie M. ferruginata. Este efeito apresenta reflexos em estudos
epidemiológicos, que mostraram que o consumo diário destes metabólitos reduz o risco
de câncer e outras doenças cardiovasculares (WANG; HUANG, 2004).
Entre os flavonóis que se destacam quanto ao potencial antioxidante, in vitro, se
encontra a quercetina. Ela atua na prevenção de peroxidação lipídica, promove efeito
quelante de metais e remoção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, em especial
para o ânion superóxido (HANASAKI; OGAWA; FUKUI, 1994; CUSHNIE; LAMB,
2005) e o radical óxido nítrico (VAN ACKER et al., 1995; WOJDYLO; OSZMIAŃSKI;
CZEMERYS, 2007; BOOTS; HAENEN; BAST, 2008). O mecanismo proposto está
relacionado à presença dos grupos hidroxila nas posições 3`e 4` do anel B e nas
posições 5 e 7 do anel A, bem como a ressonância promovida pelos anéis aromáticos e o
grupo cetona do anel C (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002; AMIC´ et al.,
2003; MICHALAK, 2006).
Além dos flavonoides, os derivados de ácidos fenólicos como os derivados do
ácido clorogênico, o ácido cafeico e seus derivados ésteres, esteróis e triterpenos
também apresentam essas propriedade (ADELMANN, 2005; SIMÕES et al., 2007). O
elevado teor de compostos fenólicos encontrados na espécie M. ferruginata se deve as
classes dos flavonoides e taninos observados na triagem fitoquímica preliminar. Como
também pelos compostos identificados por CLAE-DAD-EM e CG-EM entre eles se
destacam
as
flavonas,
catequina,
ácido
quínico,
ácido
monocafeoilquínico,
sesquiterpenos e flavonóis, em especial os derivados glicosilados da quercetina.
5. 6 Fracionamento em coluna Sephadex LH-20 e análise por cromatografia líquida de
alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das
folhas/flores de Miconia ferruginata
Para o fracionamento do extrato aquoso das folhas/flores de M. ferruginata foi
utilizado eluição isocrática com metanol PA em cromatografia por exclusão usando
147
coluna Sephadex LH-20. Foram obtidos 43 frações que apresentaram, após secagem,
um resíduo de cor amarelada ou acastanhado, avaliadas através de CLAE-DAD. As
frações com maior grau de pureza obtidas foram as de número 3 (Figuras 40) e 18
(Figuras 41), para as quais são apresentados os respectivos cromatogramas. Os
espectros na região do ultravioleta-visível gerados para cada fração analisada estão
representados no apêndice C e D, respectivamente. Na Tabela 10 constam os tempos de
retenção e dados de absorção na região do UV-Vis e as classes químicas propostas a
partir da análise em CLAE-DAD das frações 3 e 18. A representação das estruturas das
classes químicas identificadas estão apresentadas na Figura 38, com exceção do ácido
gálico que foi representado no apêndice C, juntamente com seu espectros na região do
ultravioleta-visível.
Intensidade
Ácido gálico
TR= 1,78
Nào identificado
TR= 14,15
Catequina
TR= 2,49
Minutos
Figura 40 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 254nm).
148
Catequina
TR= 1,77
Catequina
TR= 11,23
Catequina
TR= 8,70
Flavonol derivado da quercetina
TR= 13,99
Intensidade
Flavonol derivado da quercetina
TR= 15,58
Flavonol derivado da quercetina
TR= 17,12
Minutos
Figura 41 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por
arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).
A partir dos dados obtidos na análise em CLAE-DAD da fração 3 sugere-se que
os picos com tempo de retenção de 1.78 (λmáx 210 e 269 nm) e 2.49 (λmáx 275 nm)
minutos correspondem a um derivado do ácido gálico e catequina, respectivamente.
Para o pico majoritário, com tempo de retenção de 14.16 min (λmáx 254 nm) não foi
possível atribuir a classe química correspondente.
A partir dos dados obtidos na análise em CLAE-DAD da fração 18 sugere-se
que os picos com tempo de retenção de 1.77 min (λmáx 200 e 279 nm) , 8.70 min (λmáx
201 e 278 nm) e 11.23 minutos (λmáx 197 e 278 nm) correspondam a catequinas. Os
picos com tempo de retenção de 13.99 min (λmáx 255 e 356 nm), 15.58 min (λmáx 255 e
356 nm e 17.12 min (λmáx 255 e 348 nm) são indicativos da presença de flavonóis
derivados da quercetina. As demais frações apresentaram perfil cromatográfico mais
complexo, no entanto contendo os mesmos constituintes, mas em diferentes proporções.
149
Tabela 10 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta
eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações 3 e 18 obtida a
partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores
de Miconia ferruginata
1.77
8.70
11.23
13.99
Fração 3
Picos de Absorção máxima
(nm)
210; 269
275
254
Fração 18
Picos de Absorção máxima
(nm)
200; 279
201; 278
197; 278
255; 356
15.58
255; 356
17.12
255; 348
Tempo de retenção (min)
1.78
2.49
14.16
Tempo de retenção (min)
Classe química proposta
Ácido gálico (26)
Catequina (18)
ND
Classe química proposta
Catequina (18)
Catequina (18)
Catequina (18)
Flavonol derivado da
quercetina (15)
Flavonol derivado da
quercetina (15)
Flavonol derivado da
quercetina (15)
ND: Não determinado
Por meio do fracionamento do extrato aquoso das folhas/flores não foi possível
isolar nenhuma substância, em que o perfil cromatográfico obtido para as diferentes
frações foi bastante semelhante ao extrato aquoso bruto. As classes químicas observadas
nesta análise foram os flavonóis, catequinas e ácido gálico, também foram observadas
na análise em CLAE-DAD-EM do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata
e foram discutidas no item 5. 3 e 5. 4.
150
5. 7 Análise das frações dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD)
5. 7. 1 Análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica provenientes do fracionamento dos
extratos etanólicos de Miconia ferruginata
As frações n-hexânica e diclorometânica obtidas a partir dos extratos etanólicos
das folhas e do caule por meio de partição líquido-líquido foram analisadas por CG-EM
no mesmo equipamento e condições da análise por HS-SPME das partes aéreas de M.
ferruginata (item 4. 8). O cromatograma obtido para a fração n-hexânica das
folhas/flores está apresentado na Figura 42. Todos os índices de similaridade obtidos
para os espectros de massas desta fração foram abaixo de 90% e, consequentemente,
Intensidade
não permitiram a identificação com segurança dos seus constituintes.
Minutos
Figura 42 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato
etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Os respectivos cromatogramas e espectros de massas da fração n-hexânica do
extrato etanólico do caule a partir da análise em CG-EM estão apresentado nas Figuras
43 e 44.
Intensidade
151
Palmitato de etila
TR= 45,950
Minutos
Figura 43 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato
etanólico do caule de Miconia ferruginata.
A
B
Figura 44 – Espectro de massas da substância palmitato de etila (27) obtido para o pico com tempo de
retenção de 45.950 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração n-hexânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. (A).
Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 93% (B).
Os respectivos cromatogramas e espectros obtidos da fração diclorometânica do
extrato etanólico das folhas/flores a partir da análise em CG-EM estão apresentados nas
Figuras 45 a 47.
Intensidade
152
Ciclopropil metil cetona
TR= 9,930
2,3 hexanodiol
TR= 13,010
Minutos
Figura 45 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato
etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
A
B
Figura 46 – Espectro de massas da substância ciclopropil metil cetona (28) obtido para o pico com tempo
de retenção de 9.930 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
(A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 90% (B).
153
A
B
Figura 47 – Espectro de massas da substância 2,3-hexanodiol (29) obtido para o pico com tempo de
retenção de 13.010 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
(A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 100% (B).
Os respectivos cromatogramas e espectros obtidos das frações diclorometânica
do extrato etanólico do caule a partir da análise em CG-EM estão apresentados nas
Intensidade
Figuras 48 e 49.
Palmitato de etila
TR= 45,950
Isobutirato de etila
TR= 6,315
Minutos
Figura 48 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato
etanólico do caule de Miconia ferruginata.
154
A
B
Figura 49 – Espectro de massas da substância isobutirato de etila (30) obtido para o pico com tempo de
retenção de 6.315 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. (A).
Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).
Os compostos identificados nas análises de CG-EM das frações n-hexânica e
diclorometânica obtidos do fracionamento do extrato etanólico das folhas/flores e do
caule de M. ferruginata estão apresentados na Figura 50. Por meio dessas análises,
alguns esteres foram encontrados nas frações n-hexânicas e diclorometânicas dos
extratos etanólicos do caule de M. ferruginata. Os esteres são compostos de baixa
polaridade e com ponto de ebulição menor do que os ácidos carboxílicos de peso
molecular semelhante. Entre eles, o palmitato de etila (27) é um ácido graxo de cadeia
longa, proveniente da reação de esterificação entre o ácido palmítico e o álcool etílico
catalizado pela enzima fatty acid ethyl esteres syntase (GAGERI; KLEIN; KOREN,
2006). Este éster possui uma cadeia saturada com 15 átomos de carbono e uma
extremidade esterificada com grupamento etila. Já o isobutirato de etila (30) é um éster
de cadeia curta, proveniente da esterificação do ácido isobutílico e o álcool etílico.
Ambos esteres são comumente empregados na fabricação de bebidas e cosméticos, por
apresentar aroma e sabor agradável (MARKLEY, 1960; ALLINGER et al., 1978). Foi
também detectado o ciclopropil-metil-cetona (28) que é um composto intermediário
utilizado na fabricação de produtos farmacêuticos e agroquímicos.
155
27
29
28
30
Figuras 50 – Representação estrutural dos compostos identificados (27 a 30) por meio da análise em
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das frações n-hexânica e
diclorometânica dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. ChemDraw
Ultra (2004).
5. 7. 2 - Análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos
de diodos (CLAE-DAD) das frações acetato de etila provenientes do fracionamento dos
extratos etanólicos de Miconia ferruginata
As respectivas frações acetato tanto das folhas/flores quanto do caule foram
analisadas por CLAE-DAD nas mesmas condições cromatográficas descritas no item 4.
9. Os cromatogramas obtidos das frações acetato de etila do extrato etanólico das
folhas/flores e do caule e os respectivos espectros na região do ultravioleta estão
apresentados nas Figuras 51 e 52, e, nos apêndices E e F, respectivamente. Os dados
referentes aos principais picos observados nos comatogramas e as respectivas classes
químicas propostas estão listados na Tabela 11. As classes químicas observadas nesta
análise foram representadas na Figura 36.
156
Intensidade
Flavonol
Flavona
TR= 26,38
Flavona
TR= 26,38
Minutos
Figura 51 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de
arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do
Intensidade
extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Flavonol
Flavonol
TR= 20,85
Minutos
Figura 52 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de
arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do
extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.
157
Tabela 11 - Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência
com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetado de etila do
extrato etanólico das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.
Fração acetato de etila do extrato etanólico das folhas/flores
Tempo de retenção (min)
Picos de Absorção
Classe química proposta
máxima (nm)
14.01
256; 356
Flavonol (19)
14.86
263; 352
Flavonol (19)
15.14
257; 355
Flavonol (19)
15.60
254; 353
Flavonol (19)
16.58
256; 353
Flavonol (19)
17.13
255; 348
Flavonol (19)
26.38
278; 330
Flavona (16)
31.17
274; 331
Flavona (16)
Fração acetato de etila do extrato etanólico do caule
Tempo de retenção (min)
Picos de Absorção
Classe química proposta
máxima (nm)
15.98
243; 367
Flavonol (19)
17.13
254; 351
Flavonol (19)
18.38
249; 350 (ombro); 365
Flavonol (19)
19.11
247; 351 (ombro); 367
Flavonol (19)
20.85
250; 350 (ombro); 364
Flavonol (19)
A classe predominante na fração acetato de etila dos extratos etanólicos das
folhas/flores e do caule foi a dos flavonoides, em especial as subclasses das flavonas e
flavonóis, como observado para o extrato etanólico bruto das folhas/flores de M.
ferruginata. As subclasses das flavonas (16) e flavonóis (19) são derivados do 2fenilcromona e 3-hidróxi-2-fenilcromona, respectivamente, e se apresentam, geralmente,
oxigenadas, substituídos com hidroxilas e/ou metoxilas (RICE-EVANS; MILLER;
PAGANGA, 1996; SIMÕES et al., 2007). Estes compostos são conhecidos como
protetores químicos, por promover a absorção da luz ultravioleta e proteger as células
vegetais de danos causados pela fotoxidação. Além disso, favorecem a polinização por
apresentam sinais atrativos visuais para os insetos, como as abelhas. Dentre os
compostos mais comuns estão o campferol, fisetina, luteolina, morina, miricetina, rutina,
apigenina e quercetina. O último composto foi encontrado nos diferentes extratos e
frações de M. ferruginata conforme discutido nos itens 5. 3; 5. 4 e 5. 6.
158
5. 8 Ensaios Biológicos
A avaliação das atividades biológicas foi precedida da análise de citotoxicidade
frente a células de mamíferos utilizando fibroblastos e leucócitos humanos. Foram
investigadas as atividades (1) antibacterianas utilizando modelos de bactérias Gram
negativas e Gram positivas; (2) antitumoral utilizando modelo de adenocarcinoma de
mama; (3) tripanocida usando cepas parcialmente sensíveis e resistentes ao benznidazol;
(4) leishmanicida usando espécies causadoras de leishmaniose visceral e tegumentar; e
(5) atividade anti-proliferativa sobre linfócitos do sangue periférico.
5. 8. 1 Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre fibroblastos
A citotoxicidade dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e caule de M.
ferruginata foram avaliados em células de fibroblastos L929 através da metodologia do
MTT. De acordo com os dados obtidos apenas os extratos etanólicos na concentração de
500 µg/mL apresentou redução significativa da viabilidade celular de L929 tanto das
folhas/flores quanto do caule (p<0,05). Os demais extratos nas diferentes concentrações
não reduziram a viabilidade celular, ou seja, não apresentaram toxicidade frente a essa
linhagem, como demonstrado na Figura 53. O grupo controle do solvente (DMSO) não
apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle na avaliação da
viabilidade celular (CON: 99,67 ± 4,914; DMSO: 99,288 ± 7,22), enquanto que o
controle de morte (16,98 ± 2,80) reduziu a viabilidade em 83,01%. A partir destes
achados determinou-se que a concentração máxima de 500 µg/mL seria utilizada nas
demais análises das atividades biológicas.
159
L929
A
C
100
100
75
*
% Viabilidade Celular
*
**
75
50
50
25
25
***
***
0
CON CM
3,9
7,8
15,6
31,2
62,5 125
250
500
0
B
CM
3,9
7,8
15,6
31,2
62,5 125
7,8
15,6
31,2
62,5
250
500
D
100
100
*
75
50
25
CON
75
50
25
***
***
0
0
CON CM
3,9
7,8
15,6
31,2
62,5
125
250
500
CON
CM
3,9
125
250
500
Grupos (µg/mL)
Figura 53 – Porcentagem da viabilidade de fibroblastos L929 expostos a diferentes concentrações
dos extratos de Miconia ferruginata. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B- Extrato etanólico do
caule; C – Extrato aquoso das folhas/flores; D – Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando
como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguida do pós-teste de
Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; CM: grupo controle de morte com cloreto de cádmio.
Os dados mostraram que os extratos etanólicos de M. ferruginata apresentam
uma maior toxicidade frente células de mamíferos do que os extratos aquosos. Isso pode
ter ocorrido devido a diferenças nas concentrações dos compostos fenólicos, uma vez
que o perfil químico de ambos os extratos foi semelhante. Além disso, o extrato
etanólico apresentou um perfil químico mais complexo que o extrato aquoso.
5. 8. 2 Atividade antibacteriana de Miconia ferruginata
Para avaliação antibacteriana foram utilizadas seis cepas de bactérias Grampositivas e oito cepas de Gram-negativas, que frequentemente ocasionam infecções
oportunistas no homem, conforme descrito no Quadro 9. A técnica de análise
empregada foi de microdiluição em placa conforme as normas do CLSI (2006), na qual
foram avaliados os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso
das folhas/flores de M. ferruginata.
160
Quadro 9 – Características das cepas bacterianas utilizadas para determinação
da atividade antibacteriana dos extratos brutos de Miconia ferruginata.
Cepas Bacterianas
Bacillus cereus
Classificação
pelo Gram
Gram-positivo
Enterobacter aerogenes
Gram-negativo
Enterococcus faecalis
Gram-positivo
Escherichia coli
Gram-negativo
Klebsiella oxytoca
Gram-negativo
Listeria monocytogenes
Gram-positivo
Micrococcus sp.
Gram-positivo
Proteus mirabilis
Gram-negativo
Pseudomonas
aeruginosa
Gram-negativo
Salmonella enteritidis
Gram-negativo
Salmonella typhimurium
Gram-negativo
Shigella sonnei
Gram-negativo
Staphylococcus aureus
Gram-positivo
Streptococcus agalactiae
Gram-positivo
Patologias causadas no Referência
homem
Intoxicações alimentares
SOARES et al.,
2008
Infecção
nosocomial CHANG et al.,
associadas
aos
tratos 2009
urinários e respiratórios
Infecções
urinárias, PARADELLA
endocardite e endodônticas et al., 2007
Infecções do trato urinário FRANCO, 2002
e gastrointestinais
Infecção neonatal e em
REREISS et al., 2000
recém -nascidos
Listeriose
e
incluem BARANCELLI
septicemia,
meningite, et al., 2011
encefalite,
infecção
cervical ou intra-uterina
Infecção nosocomial, como MURRAY
et
abscessos intracranianos, al., 1999
pneumonia, artrite séptica,
endocardite e meningite
Infecções
em
trato MICHELIM,
respiratório
superior, 2008
urinárias e gastroenterites
Infecção
nosocomial NEVES et al.,
relacionadas
ao
trato 2011
Urinário,
sistema
respiratório, pele e tecidos
moles,
oftalmológicas,
ósseas, articulares e outras
infecções sistêmicas
Intoxicações alimentares
CARDOSO;
CARVALHO,
2006
Gastrenterite
e BOROWSKY et
intoxicações alimentares
al., 2006
Shigelose ou disenteria PENATTI, 2007
Bacilar
Desde simples infecções DOS SANTOS,
até
infecções
graves et al., 2007
(pneumonia,
meningite,
endocardite, síndrome do
choque tóxico, septicemia
e outras).
Infecção neonatal
CAETANO,
2008
161
Entre os ensaios para avaliação antimicrobiana de produtos naturais, destacam-se os
ensaios in vitro, tais como as técnicas de difusão em ágar, diluição (macro e
microdiluição) e autobiografia (AGRIPINO et al., 2004; LANGFIELD et al., 2004;
SASIDHARAN et al., 2011). Porém, a técnica mais amplamente utilizada,
principalmente para screening e determinação da concentração inibitória mínima (CIM),
é a microdiluição em placa. Esta técnica é extremamente vantajosa no estudo de
produtos naturais, uma vez que são necessárias pequenas quantidades dos extratos e/ou
substâncias isoladas. Além disso, apresenta baixo custo, simplicidade, rapidez, alto
rendimento, permite realizar várias amostras simultaneamente, e é 30 vezes mais
sensível que outros métodos relatados na literatura (LANGFIELD et al., 2004;
CUSHNIE; LAMB, 2005; ALVES et al., 2008; OSTROSKY et al., 2008; SALAZARARANDA et al., 2009; PALOMBO, 2011).
Na Tabela 12 está indicada a atividade antibacteriana e a CIM dos extratos para
cada bactéria testada.
Tabela 12 – Determinação da atividade antibacteriana e da concentração
inibitória mínima (CIM) dos extratos brutos de Miconia ferruginata pela técnica de
microdiluição em placa utilizando a resazurina como revelador.
Bactérias
B. cereus
E. aerogenes
E. faecalis
E. coli
K. oxytoca
L. monocytogenes
Micrococcus sp.
P. mirabilis
P. aeruginosa
S. enteriditis
S. typhimurium
S. sonnei
S. aureus
S. agalactiae
E1
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
*(n=9)
E1: Extrato etanólico das folhas/flores;
E2: Extrato etanólico do caule;
E3: Extrato aquoso das folhas/flores.
CIM (µg/mL)*
E2
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
E3
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
> 500
162
Para os extratos brutos de M. ferruginata não foi observado nenhuma atividade
frente às 14 cepas bacterianas avaliadas, nas diferentes concentrações. Na Figura 54
mostra uma fotografia da microplaca após leitura com o revelador resazurina para as
bactérias Staphylococcus aureus (linhas 1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas
4, 5, 6 e 8). Resultados semelhantes foram encontrados por QUEIROZ et al. (2011) que
avaliaram o extrato etanólico e diclometânico bruto de M. rubiginosa e substâncias
isoladas (ácido ursólico e oleianólico) frente a bactérias de isolados clínicos. Neste
estudo foi verificada baixa atividade do extrato bruto (CIM – 2 mg/mL e 6 mg/mL,
respectivamente) e ausência de atividade para as sustâncias isoladas. Porém, ALVES et
al. (2008) verificaram a existência de atividade bactericida do extrato etanólico bruto de
M. rubiginosa, para as cepas ATCC de Enterococcus faecalis, Kokuria rhizophila,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium, com os valores
de CIM variando entre 250 e 400 µg/mL.
Poços testes
E1
E2
Controle do meio
DMSO
Poços controle
E3
Clorafenicol
E1
E2
E3
Controle de
crescimento
Figura 54 – Microplaca teste com os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso
das folhas/flores de Miconia ferruginata, após revelação com a resazurina, para as bactérias
Staphylococcus aureus (linhas 1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas 4, 5, 6 e 8).
163
Para outras espécies do gênero Miconia, tem sido demonstrado atividade
antibacteriana e antifúngica (CELOTTO et al., 2003; MOURA, 2006; RODRIGUES,
2007; RODRIGUES et al., 2008; CUNHA et al., 2010; ARAÚJO, 2011; LEITE et al.,
2013). RODRIGUES (2007) verificou atividade antimicrobiana para o extrato
metanólico de M. rubiginosa frente a S. epidermis, C. albicans, S. aureus, M. luteus, B.
subtilise B. cereus e o extrato clorofórmico de M. cabucu frente a S. epidermis, C.
albicans e S. aureus. Além disso, foi verificado que tanto a atividade antimicrobiana
quanto a propriedade analgésica estavam relacionadas ao perfil químico, rico em
flavonoides, principalmente, os derivados glicosilados da quercetina. Porém as
concentrações que apresentaram atividade (30 a 1,5 mg/mL) estavam acima das
utilizadas no presente estudo (≤ 500 µg/mL), o que poderia justificar a ausência de
atividade antibacteriana na espécie M. ferruginata.
Alguns compostos isolados do gênero Miconia tem mostrado atividade
antibacteriana e antifúngica, tais como ácido ursólico e oleanólico (CUNHA et al.,
2010). Além de outros compostos identificados na espécie estudada, como os
sesquiterpenos cariofileno e o germacreno D (GARG; SIDDIQUI, 1992; FORMISANO
et al., 2006; MAIA et al., 2010; HUANG et al., 2012). Este último tem mostrado
potente atividade antifúngica e antibacteriana principalmente para bactérias grampositivas (NGASSAPA et al., 2003; DUARTE et al., 2005; DEUSCHLE et al., 2007;
KIRAN; DEVI, 2007).
Segundo GERSHENZON e DUDAREVA (2007) os sesquiterpenos dentre
outras funções são os principais metabólitos antimicrobianos de origem vegetal. Como
por exemplo, o α-copaeno, que é um sesquiterpeno não-oxigenado, detentor de
comprovada ação contra insetos (VEIGA JR; PINTO, 2002). Entretanto estes
compostos foram encontrados na planta fresca e podem estar em baixa concentração ou
ausentes nos extratos testados devido aos procedimentos de secagem, o que
possivelmente influenciou a ausência de atividade.
As plantas são fontes ricas de uma grande variedade de metabólitos ativos tais
como taninos, terpenoides e flavonoides que têm sido relatados devido às suas
propriedades antimicrobiana, in vitro (HAMILTON-MILLER, 1995; KAWAI et al.,
2003; PADUCH et al., 2007; ARIF; MANDAL; DABUR, 2011; SALAS et al., 2011).
Entre os metabólitos que se destacam se encontra a classe dos flavonoides (CUSHNIE;
LAMB, 2005). Estes compostos frequentemente se encontram oxigenados ou conjugado
com açúcares e, já foram relatadas quanto as atividades antibacteriana, antifúngica e
164
antiviral (DASTIBAR et al., 2004; SIMÕES et al., 2007). Os mecanismos de ação
propostos são por meio da inibição da germinação de esporos patogênicos, formação de
complexos com proteínas solúveis presentes nas paredes das células microbianas,
redução dos efeitos indesejáveis de toxinas e capacidade de romper diretamente as
membranas das células fúngicas (ARIF et al., 2011; SALAS et al., 2011).
A subclasse dos flavonóis derivados da quercetina presentes tanto no extrato
bruto quanto nas frações de M. ferruginata tem demonstrado um efeito significativo
contra algumas espécies de bactérias Gram-positivas e leveduras bem como inibição do
vírus HIV em 80% (GATTO et al., 2002). Além disso, em estudos iniciais, foi
observado a inibição da enzima transcriptase reversa, podendo servir de modelo para
novos fármacos utilizados no controle de infecções causadas pelos retrovírus
(HIRPARA et al., 2009). Os compostos derivados dos ácidos cafeoilquínicos também
tem apresentado ação potente e seletiva contra o vírus Tipo 1 da Síndrome Imuno
Deficiência Adquirida (AIDS), além de inibirem a replicação viral (PEREIRA et al.,
2003), e apresentarem atividades antibacterianas e antihelmínticas (SCHOLZ et al.,
1993).
5. 8. 3 Efeito citotóxico de Miconia ferruginata sobre células tumorais de
adenocarcinoma
A avaliação da atividade antitumoral dos extratos etanólicos e aquosos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram realizados frente a linhagem de
adenocarcinoma de mama MDA-MB-231, em culturas de 48 e 72 horas. Os dados
obtidos para a linhagem tumoral de 48 e 72 horas foram expressos como porcentagem
da viabilidade celular e são mostrados nas Figuras 55 e 56, respectivamente. Os valores
de IC50 para os extratos e para os controles de mortalidade estão apresentados na Tabela
13.
Após 48 horas de exposição das células MDA-MB-231 as diferentes
concentrações dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M.
ferruginata foi observado que todos os extratos se mostraram tóxicos para as células
tumorais. O extrato aquoso do caule promoveu redução significativa da viabilidade
celular na concentração de 500 µg/mL (p<0,05), com um IC50 de 180,4 µg/mL. Os
demais grupos apresentaram reduções significativas da viabilidade celular em
concentrações menores, variando entre 62,5 µg/mL para os extratos etanólico do caule e
aquoso das folhas/flores e 31,2 µg/mL para o extrato etanólico das folhas/flores
165
(p<0,01). O extrato etanólico das folhas/flores apresentou o menor IC50 (70,15 µg/mL)
do que os demais extratos, que variaram entre 180,4 a 119,2 µg/mL.
MDA-MB-231
A
C
100
100
75
75
*
50
***
% Viabilidade Celular
25
**
***
25
***
***
*** ***
***
0
CON DMSO PXT
**
50
**
7,8
15,6
31,2
62,5 125
250
500
***
***
0
B
CON DMSO PXT
***
7,8
15,6
31,2
62,5 125
250
500
D
100
100
75
75
**
***
50
25
***
CON DMSO PXT
***
7,8
15,6
31,2
62,5
125
250
*
25
***
***
0
50
500
***
***
0
CON DMSO PXT
7,8
15,6
31,2
62,5
125
250
500
Grupos (µg/mL)
Figura 55 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-231 submetidas à exposição
com os extratos de Miconia ferruginata, após 48 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados
foram representando como média e o desvio padrão (n=9).* p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA
seguido de pós-teste de Bonferroni.CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do
solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel.
Após 72 horas de exposição a citotoxicidade sobre as células MDA-MB-231 foi
aumentada para todos os extratos de M. ferruginata. A atividade antitumoral observada
no tempo de 48 horas e de 72 horas se mostraram concentração dependente. A maior
variação de citotoxicidade foi observada para o extrato aquoso do caule, em que o IC50
reduziu de 180,4 µg/mL após 48 horas para 70,45 µg/mL após 72 horas, revelando que
o fator tempo de exposição é essencial para a atividade antitumoral do extrato. Já o
extrato etanólico das folhas/flores foi o que apresentou maior atividade, com redução
significativa da viabilidade celular na concentração de 15,6 µg/mL (p<0,05),
apresentando IC50 de 56,44 µg/mL. Os demais extratos reduziram de forma significativa
à viabilidade celular a partir da concentração de 31,2 µg/mL, e o IC50 variou entre 135,8
a 119,2 µg/mL. Isso reforça que o aumento da atividade antitumoral, de todos os
166
extratos brutos, é dependente do fator tempo de exposição. Adicionalmente, é relevante
comentar que após 72 horas de exposição aos extratos, estes não se apresentaram
tóxicos para células normais de mamíferos nas concentrações com atividade frente a
células tumorais, se tornando uma possibilidade de agente terapêutico. Porém se faz
necessário outros estudos com as frações e substâncias isoladas destes extratos, bem
como avaliar os prováveis mecanismos de ação.
MDA-MB-231
C
A
100
100
75
75
**
*
**
50
**
50
***
***
% Viabilidade Celular
25
25
***
*** ***
***
0
CON DMSO PXT
7,8
15,6
31,2
62,5 125
250
***
500
***
***
***
0
B
CON DMSO PXT
***
7,8
15,6
31,2
62,5
125
250
500
D
100
100
75
75
*
**
50
**
50
***
**
25
0
***
***
***
***
***
CON DMSO PXT
25
0
7,8
15,6 31,2
62,5
125
250
500
*** ***
***
CON DMSO PXT
7,8
15,6
31,2
62,5
125
250
500
Grupos (µg/mL)
Figura 56 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-231 submetidas à exposição
com os extratos de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados
foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA
seguido de pós-teste de Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do
solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel.
167
Tabela 13 – Valores de Concentração inibitória 50% (IC50) da viabilidade
celular de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) exposto aos extratos etanólicos e
aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata nos tempos de 48 e 72
horas de cultura.
IC50 extratos (µg/mL)*
Extratos
48 horas
72 horas
E1
70,15
56,44
E2
119,2
79,78
E3
153,6
135,8
E4
180,4
70,45
Paclitaxel**
2,25
2,099
Cloreto de cádmio**
391,6
314,2
*(n=9)
**Os valores de IC50 dos controles foram expressos em µM.
E1: Extrato etanólico das folhas/flores;
E2: Extrato etanólico do caule;
E3: Extrato aquoso das folhas/flores;
E4: Extrato aquoso do caule.
Resultados semelhantes aos encontrados no presente estudo foram observados
em outras espécies do gênero Miconia, entre elas a M. lepidota. Nesta espécie foram
isolados derivados das benzoquinonas, como a primina, que apresentaram valores de
IC50 entre 10 a 2,9 µg/mL frente células de carcinoma de Madison Lung (M109) e
adenocarcinoma ovariano humano (A2780) (GUNATILAKA et al., 2001). CUNHA et
al. (2008) avaliaram o potencial antitumoral de M. fallax frente células de
adenocarcinoma do colo uterino humano (HeLa). Os autores verificaram que tanto o
extrato etanólico bruto quanto a fração contendo uma mistura isomérica de ácidos
triterpênicos (ursólico e oleanólico) apresentaram elevada citotoxicidade, concentração
dependente, sobre as células tumorais a partir da concentração de 45 µg/mL.
Outro estudo realizado por PAIS (2011) avaliou o efeito citotóxico dos extratos
brutos etanólico e diclorometânico de M. latecrenata sobre diferentes linhagens
tumorais. O autor verificou que ambos os extratos foram citotóxicos (IC50 = 2,5 ug/ml e
250 ug/ml, respectivamente), porém, o etanólico apresentou maior potência e
seletividade. A maior potência do extrato etanólico também foi observada no presente
estudo, possivelmente devido ao perfil químico rico em compostos fenólicos.
O câncer de mama representa a principal causa de morte por câncer nos países
desenvolvidos e a segunda causa nos países em desenvolvimento (BRASIL, 2008b;
168
JEMAL; BRAY; FERLAY, 2011). Esta patologia acomete mulheres entre 30 e 60 anos
com quadros de crescimento e progressão geralmente rápidos e podem apresentar
formação de metástases agravando o quadro clínico (SILVA; RIUL, 2011; ARTACHOCORDÓN et al., 2012). Segundo o INCA, no Brasil foram estimados 57.120 novos
casos para 2014 com um risco de 50 a 90 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2014).
As taxas de incidência de câncer de mama são influenciadas, dentre outros fatores, pela
idade, história reprodutiva da mulher, predisposição genética, doença benigna prévia,
estilo de vida e exposição da mama à radiação (MCPHERSON; STEEL; DIXON, 2000;
TRICHOPOULOS et al., 2008).
Com base no quadro histopatológico e classificação do câncer é possível
estabelecer a melhor estratégia terapêutica individual. Entre as terapias mais aplicadas
se encontra a remoção cirúrgica associada a sessões de radioterapia, quimioterapia,
imunoterapia e terapia hormonal. Entre os fármacos mais amplamente usados no
tratamento se encontram: a doxorrubicina, a ciclofosfamida e os taxanos, como o
paclitaxel (SEIDMAN et al., 2008; BERTOLLO, 2010). Porém, essas estratégias
terapêuticas são agressivas, dolorosas e repletas de efeitos colaterais, por essa razão se
torna necessário o desenvolvimento de novos neoplásicos (IBRAHIM et al., 2002;
SEIDMAN et al., 2008; BERTOLLO, 2010).
Entre os compostos com potencial antineoplásico se encontram os compostos
voláteis isolados das folhas/flores de M. ferruginata, como o β-cariofileno, α-humuleno
e β-elemeno. Estes compostos têm apresentado citotoxicidade contra linhagens tumorais,
tais como A- 549, HeLa e HT-29 DLD-1, M4BEU, Bel-7402, CT-26, com valores de
IC50 variando entre 80.3 e 109.7 µg/mL (DUH et al., 1999; TATMAN; MO, 2002;
LEGAULT et al., 2003; WANG et al., 2005; TAO et al., 2006; DA SILVA
FIGUEIREDO; YANO, 2007; LEGAULT, PICHETTE, 2007).
Além destes compostos, a quercetina tem sido descrita na literatura possuir um
alto potencial antitumoral (MULHOLLAND et al., 2001; MATERSKA, 2008;
MURAKAMI; ASHIDA; TERAO, 2008; HIRPARA et al., 2009). Os mecanismos de
ação propostos estão relacionados à regulação do ciclo celular, interação com os locais
de ligação do estrogênio tipo II, diminuição da resistência às drogas, indução de
apoptose de células tumorais e inibição da atividade da tirosina quinase (XIAO et al.,
1998; YOSHIDA et al., 1990). Um estudo realizado por FORMICA e REGELSON
(1995) mostrou que a administração da quercetina previne etapas de iniciação e
promoção do melanoma induzido quimicamente. Como também AVILA et al. (1994)
169
observaram que a quercetina inibiu a proliferação celular da linhagem MDA-MB-468
por meio da inibição da atividade da proteína p53. Esses achados corroboram com os
encontrados neste estudo, podendo ser atribuída aos compostos fenólicos, como a
quercetina, ou uma ação conjunta com outras substâncias, a atividade antitumoral
observada sobre as células MDA-MB-231.
5. 8. 4 Atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata
A avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de M.
ferruginata foi realizada contra as cepas Y e Colombiana de T. cruzi, após 72 horas de
exposição. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de viabilidade das
cepas e estão representados na Figura 57. O extrato bruto, em nenhuma das
concentrações avaliadas foi capaz de inibir de forma significativa o crescimento das
diferentes cepas de T. cruzi. O grupo controle do DMSO, como esperado, não alterou a
porcentagem de viabilidade de nenhuma das cepas (CON: 99,9 ± 0,00; DMSO: 99,9 ±
0,00) enquanto que para o grupo com o fármaco padrão benznidazol a viabilidade das
formas epimastigotas foi reduzida (Y: 51,36 ± 1,834; Colombiana: 68,01 ± 3,883) em
31,99% e 48,64% paras cepas Colombiana e Y, respectivamente.
Cepas Y e Colombiana de T. cruzi
% Viabilidade
A
B
100
100
75
75
***
50
50
25
0
**
25
CON
BEN
125
250
500
0
CON
BEN
125
250
500
Grupos (µg/mL)
Figura 57 – Porcentagem da viabilidade das formas epimastigotas das cepas de Tryanosoma cruzi
expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa Y de
T. cruzi; B – Cepa Colombiana de T. cruzi. Os dados foram representando como média e o desvio padrão
(n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo
controle de viabilidade; BEN: Fármaco padrão benznidazol a 75 µg/mL.
170
Embora no presente estudo não tenha sido detectada as atividades tripanocida
pelo extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata, na literaturas estão descritos
atividades relacionadas às espécies deste gênero associadas à presença de ácidos
triterpênicos pentacíclicos, em especial, os ácidos ursólico e oleanólico. Esses dois
compostos têm sido relatados possuir potente ação tripanocida quando avaliados de
forma conjugada em misturas isoméricas (SEPÚLVIDA-BOZA; CASSELS, 1996;
CUNHA et al., 2006; PADUCH et al., 2007; FERREIRA et al., 2013). Porém, o mesmo
não foi observado por CUNHA et al., (2003a) que verificaram uma maior atividade nas
substâncias isoladas.
O estudo realizado por CUNHA et al. (2006) revelou que a mistura de ácidos
ursólicos e oleanólico apresentaram maior atividade tripanocida (IC50 de 5,4 µM) que as
substâncias isoladas (IC50 de 17,1 e 12,8 µM, respectivamente). Esse maior efeito pode
estar relacionado ao efeito sinérgico entre estas moléculas. Já o sal de potássio do ácido
ursólico também revelou um aumento da atividade tripanocida quando comparado com
a substância pura, IC50 de 8,9 µM. Nos testes in vivo, o ácido ursólico e o seu sal
derivado, mostraram uma redução significativa da parasitemia em 75,7% e 70,4%
respectivamente. No entanto, o mesmo comportamento de redução da parasitemia não
foi obtido frente à cepa Boliviana (FERREIRA, 2006). De acordo com FERREIRA et
al. (2013) o mecanismo de ação para atividade tripanocida destas substâncias podem
estar relacionados aos efeitos imunomoduladores e produção de citocinas proinflamatórias.
Além dos terpenos, outras substâncias têm apresentado atividade tripanocida,
como a miconidina (2-metoxi-6-n-pentil-1,4-dihidroxibenzeno) isolada de M. eriodonta
(MARINI-BETTÓLO et al., 1971; SEPÚLVIDA-BOZA; CASSELS, 1996). E também,
o cariofileno (sesquiterpeno) e o eugenol (fenilpropanoide), que promoveram a inibição
de 67% e 17,34% da viabilidade da cepa Y de T. cruzi, na concentração de 100 µg/mL,
respectivamente (LEITE et al., 2013). Estes resultados demonstram o potencial de
espécies de Miconia sp. no estudo para a busca de produtos naturais tripanocidas
(MOURA, 2006).
Na literatura tem sido relatado o potencial antiparasitário dos compostos
fenólicos, em especial os flavonoides (TASDEMIR et al., 2006; SEN et al., 2008).
TASDEMIR et al. (2006) verificaram que a subclasse dos flavonóis e das flavonas
apresentaram efeito letal aos parasitas avaliados, além de apresentarem baixa
citotoxicidade em células de mamíferos. Apesar destas classes estarem presentes no
171
extrato avaliado de M. ferruginata, possivelmente as concentrações destes metabólicos
foram insuficientes para promover uma resposta satisfatória. Desta forma, se faz
necessário o estudo das frações ricas em flavonóis e flavonas, como a fração acetato de
etila obtida dos extratos etanólicos, para favorecer a avaliação da atividade tripanocida
desta espécie.
5. 8. 5 Atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
ferruginata
A avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de
M. ferruginata foi realizada frente as cepas BH46 e M2269 de Leishmania sp. Os
resultados obtidos foram expressos em porcentagem de viabilidade das cepas e estão
representados na Figura 58. O extrato bruto, em nenhuma das concentrações avaliadas
foi capaz de inibir de forma significativa o crescimento das diferentes cepas de
Leishmania sp. após 72 horas de exposição. O grupo controle do DMSO, como
esperado, não alterou a porcentagem de viabilidade de nenhuma das cepas (CON: 99,9
± 0,00; DMSO: 99,9 ± 0,00) enquanto que o grupo com o fármaco padrão anfotericina
B reduziu a viabilidade (BH46: 54,89 ± 2,435; M2269: 53,53 ± 2,191) em 45,11% e
46,48% para as cepas BH46 e M2269, respectivamente.
Cepas BH46 e M2269 de Leishmania sp.
A
B
100
100
% Viabilidade
75
75
**
*
50
50
25
25
0
CON
ANF
125
250
500
0
CON
ANF
125
250
500
Grupos (µg/mL)
Figura 58 – Porcentagem da viabilidade das cepas de Leishmania sp. expostas ao extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa BH46 - Leishmania (leishmania)
infantum; B – Cepa M2269 -L. (leishmania) amazonensis. Os dados foram representando como média e o
desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON:
Grupo controle de viabilidade; ANF: Fármaco padrão anfotericida B a 1 µg/mL.
172
Contrariamente aos achados do presente estudo, em outras espécies do gênero
Miconia tem sido relatada atividade leishmanicida. Por exemplo, a espécie M.
langsdorffii apresentou atividade leishmanicida moderada em ensaio in vitro, sobre as
formas promastigotas de L. amazonensis. Neste estudo, o extrato bruto hidroalcoólico
apresentou um valor de IC50 de 175,4 mg/mL, enquanto que a fração contendo os ácidos
ursólico e oleanólico exibiram maior atividade, com IC50 de 4,5 µg/mL. Porém, esses
triterpenos puros não exibiram atividade isoladamente (IC50 360,3 e 439,5
respectivamente). Quando avaliados conjugados o valor de IC50 foi aumentado (IC50
199,6), mas inferior ao obtido pela fração anteriormente avaliada. Esses dados sugerem
que os compostos minoritários presentes na fração apresentam um papel fundamental na
atividade leishmanicida (PEIXOTO et al., 2011).
Outros compostos, encontradas na M. ferruginata também têm demonstrado
potencial
leishamicida,
entre
eles
o
cariofileno
(sesquiterpeno)
e
eugenol
(fenilpropanoide). Na concentração de 100 µg/mL esses compostos promoveram a
redução da viabilidade da cepa L. brasiliensis em 100 e 40%, respectivamente (LEITE
et al., 2013). Em outro estudo, o eugenol (100 µg/mL) também inibiu o crescimento da
cepa L. amazonensis em 100% na fase aguda da infecção, sem afetar a viabilidade das
células de macrófagos (UEDA-NAKAMURA et al., 2006).
Os derivados de flavonóis e flavonas, como a fisetina, 3-hidroxiflavona,
luteolina e quercetina tem apresentado notável potencial leishmanicida, in vitro, com
valores de IC50 de 0,6, 0,7, 0,8, e 1,0 µg/ml, respectivamente. Já os compostos 7,8dihidroxiflavona e quercetina revelaram maiores atividades leishmanicida e tripanocida
em modelos in vivo (TASDEMIR et al., 2006). SEN et al. (2008) mostraram que a
quercetina combinada com a albumina do soro aumentou a disponibilidade deste
flavonol e intensificou em 75% a redução da carga parasitária de L. donovani. O
mecanismo de ação proposto pelos autores, para a quercetina está relacionado à
interferência no metabolismo do ferro pelo parasita. Contudo, para a espécie M.
ferruginata não foi observado nenhuma atividade, podendo estar relacionado a baixa
concentração dos derivado da quercetina no extrato avaliado. Consequentemente,
necessita-se avaliar suas frações ricas nestes compostos.
173
5. 8. 6 Ação do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a viabilidade de PBMC
humana, in vitro
Os valores médios e desvio padrão correspondentes aos leucogramas para os
voluntários participantes do estudo para a avaliação da viabilidade e proliferação de
celular estão descritos na Tabela 14. De acordo com os dados, os voluntários
apresentaram leucograma dentro dos limites da normalidade para indivíduos adultos.
Tabela 14 – Leucograma dos voluntários saudáveis participantes do estudo de
viabilidade e proliferação de celular.
Parâmetros (valor de referência*)
Média ± desvio padrão
Número de voluntários
10
Homens
3
Mulheres
7
Idade
24 ± 6 anos
Leucócitos (3,5 - 11 x 103/mm3)
6,818 x 103 ± 1,10
Neutrófilos (40-70%)
49,54 ± 5,33
Eosinófilo (0-8%)
2,09 ± 1,31
Linfócitos (20-50%)
44 ± 5,15
Basófilos (0-3%)
0,45 ± 0,65
Monócitos (2-20%)
2,81 ± 1,58
*Valores de referência de acordo com Xavier et al. (2010).
Nos ensaios de viabilidade e proliferação sobre PBMC humanas in vitro, foram
utilizados os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata uma vez
que na medicina popular esta é a forma de extração utilizada, para tratar inflamações. O
ensaio de viabilidade celular sobre leucócitos humanos foi realizado inicialmente, com o
intuito de definir as concentrações não tóxicas dos extratos aquosos para realização do
ensaio de proliferação. Para confiabilizar os resultados observados no ensaio posterior
de proliferação, as células mononucleares devem se manter viáveis após contato com os
extratos, a fim de garantir que as variações observadas não sejam devidas à morte
174
celular por toxicidade (OLIVEIRA, 2010; ALMEIDA, 2012). Para isso, foi realizado o
teste de exclusão com Azul de Tripan por meio da citometria de fluxo.
Na Figura 59 estão representados a análise do percentual de PBMC viáveis, após
incubação com os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata nas
concentrações finais de 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg/mL e 31,2 µg/mL, após 24
horas (Figura 59 A e B) e 5 dias (Figura 59 C e D) de exposição. Os dados mostraram
que após 24 horas o extrato aquoso das folhas/flores não reduziu a viabilidade celular na
concentração de 250 µg/mL, quando comparado às culturas CON (CON: 97,42 ±
0,4633; E3: 83,66 ± 5,191), enquanto o extrato aquoso do caule foi tóxico nesta
concentração (CON: 97,42 ± 0,4633; E4: 82,98 ± 4,02) com p<0,05. Após 5 dias de
exposição, a viabilidade celular tanto do extrato aquoso das folhas/flores quanto do
caule não foi reduzida em concentrações iguais ou menores que 62,5 µg/mL (CON:
97,73 ± 0,4788; E3: 96,29 ± 0,6265; E4: 94,14 ± 0,7101).
Com relação ao grupo solvente (DMSO) este não apresentou diferença
significativa entre o percentual de células viáveis das culturas em comparação ao grupo
CON, para os diferentes tempos avaliados (24 horas: 96,65 ± 0,8063; 5 dias: 97,40 ±
0,623). O grupo controle de morte, com cloreto de cádmio, nos tempos de 24 (7,55 ±
3,41) e 5 dias (5,77 ± 1,77) reduziu a viabilidade celular em 92,45% e 94,23%,
respectivamente.
175
A
C
100
100
*
75
75
% Viabilidade Celular
50
**
**
25
0
CON
DMSO
CdCl2
62,5
125
250
B
CON
DMSO
CdCl2
31,2
62,5
125
*
*
62,5
125
250
D
100
*
*
100
75
75
50
50
25
0
*
**
*
25
0
*
50
CON
DMSO
CdCl2
**
25
**
**
**
62,5
125
250
0
CON
DMSO CdCl2
31,2
250
Grupos (µg/mL)
Figura 59 – Percentual de viabilidade das PBMC em culturas de 24 horas e 5 dias submetidas aos
extratos aquosos de Miconia ferruginata. A – Extrato aquoso das folhas/flores em 24 horas; B – Extrato
aquoso do caule em 24 horas; C – Extrato aquoso das folhas/flores em 5 dias; D – Extrato aquoso do
caule em 5 dias. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p<0,05; **p<0,01
ANOVA seguido pós-teste de Dunns. CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do
solvente; CdCl2: grupo controle de morte.
5. 8. 7 Efeito do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a proliferação de
linfócitos humanos
O sistema imunológico quando exposto a um antígeno, o reconhece
especificamente e passa a secretar citocinas, entre elas a IL-2. Esta interleucina atua
como fator de crescimento autócrino, promovendo a expansão clonal e a proliferação
dos linfócitos, um importante evento junto à complexa rede de estímulos inflamatórios
imune-mediados (BOYMAN et al., 2007; GANGULY; BANDHEKA; SAINIS, 2001).
O ensaio de proliferação celular permite verificar o efeito de produtos naturais,
concomitamente com mitógenos, sobre o estímulo ou supressão dos linfócitos
(PANDIMA DEVI et al., 2003; PHILIPPI et al., 2010). Entre os mitógenos comumente
utilizados, está uma lectina obtida de Phaseolus vulgaris, a fitohemaglutinina (PHA)
(NOWELL, 1960). Assim, com o objetivo de investigar a possível atividade anti-
176
inflamatória dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata, in vitro,
avaliou-se o efeito dos mesmos sobre a resposta proliferativa de linfócitos estimulados
ou não com o mitógeno PHA, em culturas de 5 dias de exposição.
As concentrações testadas foram escolhidas de acordo com os resultados obtidos
nos ensaios de viabilidade celular. Inicialmente foi verificado o índice de proliferação
de culturas tratadas somente com o extrato, sem estímulo com PHA. De acordo com os
resultados obtidos os extratos não induziram a proliferação dos linfócitos, como
apresentado na Tabela 15, assim os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M.
ferruginata não possuem efeito mitogênico.
Tabela 15 - Percentual do índice de proliferação de culturas não estimuladas
com PHA e tratadas com os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia
ferruginata
Culturas
Média ± Desvio padrão
Controle
0,01 ± 0,001
E3 45 µg/mL
0,02 ± 0,008
E3 30 µg/mL
0,015 ± 0,004
E3 15 µg/mL
0,015 ± 0,004
E4 30 µg/mL
0,01 ± 0,008
E4 20 µg/mL
0,01 ± 0,008
E4 15 µg/mL
0,005 ± 0,04
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. *p<0,05 - ANOVA seguido de Tukey.
E3: Extrato aquoso das folhas/flores;
E4: Extrato aquoso do caule.
Os resultados da análise do extrato aquoso das folhas/flores e do caule de M.
ferruginata sobre a proliferação de linfócitos estimulados com PHA estão representados
na Figura 60. Os dados demonstram que tanto os extratos aquosos das folhas/flores
quanto do caule reduziram a proliferação de linfócitos. Para o extrato das folhas/flores,
apenas na concentração de 45 µg/mL, houve redução significativa do índice de
proliferação (0,588 ± 0,216), quando comparado com as culturas controle estimuladas
com PHA (1,988 ± 0,379). Para o extrato do caule houve uma redução concentração
dependente do índice de proliferação (30 µg/mL: 0,093 ± 0,025; 20 µg/mL: 0,172 ±
0,053 ;15 µg/mL: 0,410 ± 0,158). Como esperado, o grupo solvente (DMSO) não
177
influenciou a proliferação dos linfócitos (1,68 ± 0,310), enquanto que a dexametasona
reduziu de forma expressiva a proliferação dos mesmos (0,235 ± 0,084) ambos grupos
comparados com as culturas estimuladas com PHA.
2,5
Índice de Proliferação
2,0
1, 5
1, 0
**
**
0, 5
0
PHA (5 µg/mL)
DEXA (8 µg/mL)
E3 (µg/mL)
E4 (µg/mL)
***
***
***
***
+
+
+
+
+
15
30
45
+
+
+
15
20
30
+
Figura 60 - Índice de proliferação de linfócitos expostos aos extratos aquosos das folhas/flores e do
caule de Miconia ferruginata. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p<
0,05; **p<0,01; ***p<0,001. ANOVA seguido de Tukey em relação ao grupo PHA. DEXA: grupo
controle positivo com a dexametasona 8 µg/mL; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso
do caule.
Na Figura 61 estão demonstrados histogramas representativos das análises
realizadas. Os resultados indicam que tanto para o grupo dexametasona, quanto para os
grupos expostos aos extrato do caule (30, 20 e 15 µg/mL) e das folhas/flores (45 µg/mL)
ocorreram uma diminuição da quantidade de leucócitos, resultando em maior
intensidade de fluorescência para região M1 e, refletindo em menores índices de
proliferação. A eficácia na redução da proliferação pelos extratos das folhas/flores (45
µg/mL) e do caule (15, 20 e 30 µg/mL) foram de 39,94%, 57,3%, 137,4% e 251,8% em
relação à dexametasona a 8 µg/mL. Esses dados mostraram um potente efeito
178
antiproliferativo do extrato do caule maior que a dexametasona. Este efeito inibitório
sobre a proliferação linfocitária sugere que os componentes dos extratos aquosos de M.
ferruginata, possam modular mecanismos celulares envolvidos
no processo
inflamatório e, assim, refletir em um possível efeito anti-inflamatório desta espécie.
A
E
D
Eventos
C
B
M
M3
M2
M1
M4
M5
M6
F
G
H
CFSE
Figura 61 – Histogramas representativos da análise sobre a proliferação dos linfócitos expostos aos
extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. A – Histograma das culturas
estimuladas com PHA; B – Histograma das culturas estimuladas com PHA e Dexametasona; C, D e E –
Histograma das culturas estimuladas com PHA e E3 nas concentrações de 45, 30 e 15 µg/mL,
respectivamente; F, G e H – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E4 nas concentrações de 30
20 e 15 µg/mL, respectivamente. E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.
Alguns
compostos
identificados
em
M.
ferruginata
têm
apresentado
significativos efeitos anti-inflamatórios, entre eles pode-se citar a classe dos flavonoides
(SANTANGELO et al., 2007), em especial, os derivados da quercetina (READ 1995;
MUTOH et al., 2000; RASO et al., 2001; HAVSTEEN, 2002; ORSOLIC et al., 2004;
YOON; BAEK, 2005; BIESALSKI, 2007; SANDHAR et al., 2011). Os mecanismos de
ação anti-inflamatória propostos para a quercetina estão relacionados à inibição das
enzimas fosfolipase A2 (PLA2) (KIM et al., 2004), lipo-oxigenase, ciclo-oxigenase e
179
modulação da enzima iNOS que inibe a produção de óxido nítrico (NO) (YOON;
BAEK, 2005; SANTANGELO et al., 2007). Outros estudos têm demonstrado que a
quercetina é capaz de inibir a secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como o TNFα e IL-1 (KIM et al., 2004; LÓPEZ-POSADAS et al., 2008; CAZAROLLI et al., 2008).
Além de que vários outros flavonoides também são capazes de diminuir a produção de
NO e a expressão da enzima iNOS (SANTANGELO et al., 2007; CAZAROLLI et al.,
2008).
Além desses, os sesquiterpenos encontrados na M. ferruginata, o α-humuleno e
o β-cariofileno tem apresentado propriedades anti-inflamatórias (PASSOS et al., 2007;
FERNANDES et al., 2007). A partir do óleo essencial de Cordia verbenacea rico nestes
sesquiterpenos foi desenvolvido o fitoterápico Acheflan®, de grande aceitação no
mercado. Este fitoterápico é indicado no tratamento de traumas, tendinites, dores
musculares e miofascial (RAMOS, 2006; FERNANDES et al., 2007; MEDEIROS et al.,
2007; PASSOS et al., 2007). Estudos têm mostrado que o α-humuleno apresenta rápida
absorção, promovendo assim, alívio rápido da dor e inflamação quando comparado a
outros anti-inflamatórios comerciais, como o diclofenaco (GREGÓRIO et al.; 2005;
CHAVES et al., 2008). Outras atividades biológicas também têm sido associadas ao αhumuleno, tais como ações inseticida, antioxidante, antimicrobiano, anticancinogênica
(WEEL et al., 1999; BOUGATSOS et al., 2003; LEGAULT et al., 2003; KIM et al.,
2003; YANG et al., 2003; ALMEIDA et al., 2005 a e b; FERNANDES et al., 2007).
LIU et al. (2015) avaliaram o cariofileno sobre atividade convulsiva induzida
por ácido caínico. Os autores verificaram que o cariofileno reduziu o score de apreensão
e de mortalidade em ratos. Além disso, diminuiu significativamente a geração de
malondialdeído (subproduto que induz a peroxidação lipídica) e preservou a atividade
da superóxido-dismutase (SOD), catalase (CAT), e glutationa peroxidase (Gpx). Foi
observado que o cariofileno também apresentou efeitos anti-inflamatórios cerebrais,
reduzindo a expressão de citocinas pró-inflamatória, tais como TNF-α e IL-1b. Estes
dados sugerem que o cariofileno tem um potencial protetor sobre convulsão e danos
cerebrais, por meio da redução da resposta inflamatória. Assim, estes sesquiterpenos
presentes em altas concentrações na M. ferruginata podem ser responsáveis ou coauxiliar juntamente com outros compostos fenólicos, nos efeitos antiproliferativos
observados.
Estudos com outras espécies do gênero Miconia tem demonstrado um potencial antiinflamatório. De acordo com RODRIGUES (2007) as espécies M. rubiginosa e M.
180
cabucu podem apresentar propriedades anti-inflamatórias, avaliadas por meio das baixas
dosagens de H2O2 e baixa produção de NO e TNF-α. Em outro estudo in vivo, realizado
por VASCONCELOS et al., (2006) foi avaliado o efeito anti-inflamatório dos ácidos
ursólico e oleanólico de M. albicans pelo teste de edema de pata induzido por
carragenina. Os resultados mostraram que ambos os ácidos apresentaram uma redução
significativa do edema de pata. A mistura destes triterpenos apresentou efeito
semelhante ao ácido acetilsalicílico.
6 CONCLUSÕES
As espécies do gênero Miconia ainda são pouco estudadas quimicamente e
farmacologicamente, por isso foi selecionado a espécie Miconia ferruginata para este
estudo. Os resultados da presente pesquisa contribuíram de forma significativa para o
conhecimento científico desta espécie, amplamente utilizada na medicina popular no
município de Diamantina – MG.
Foi traçado o perfil químico da M. ferruginata por meio de triagem fitoquímica
preliminar e análises cromatográficas dos extratos e frações. A triagem fitoquímica
sugeriu a presença de taninos, flavonoides e terpenoides nas folhas/flores e no caule, e
de saponinas apenas nas folhas/flores. Esses dados foram confirmados em análises de
CLAE-DAD dos extratos etanólicos e aquosos brutos, que evidenciaram a presença das
subclasses das flavonas e flavonóis, principalmente, os derivados da quercetina. Além
de outros compostos fenólicos como ácidos fenólicos e catequinas. Como também a
análise em CLAE-DAD-EM permitiu identificar seis compostos pertencentes às classes
químicas dos flavonoides, taninos e dos ácidos fenólicos e outros cinco compostos entre
eles os derivados dos ácidos clorogênicos e derivados glicosilados da quercetina.
Na análise dos constituintes voláteis por CG-EM foi possível identificar
quatorze compostos, sendo eles sesquiterpenos, hidrocarbonetos, monoterpenos,
fenilpropanoides e alcoóis. Dentre os compostos majoritários identificados se
encontram os sesquiterpenos β-cariofileno e α-humuleno que já foram relacionados a
diversas atividades biológicas, tais como antitumoral, anti-inflamatória, antioxidante e
antimicrobiana.
Nas análises das frações aquosas por CLAE-DAD, apenas das frações 3 e 18 foi
possível traçar um perfil químico de maior grau de pureza. Em ambas as frações foi
observado um perfil rico em compostos fenólicos, como as catequinas, flavonóis e
flavonas. Na fração 3 foi observado também a presença do ácido gálico e na fração 18 a
181
presença da subclasse dos flavonóis derivados da quercetina. As frações obtidas do
fracionamento por partição líquido-líquido foram analisadas por CG-EM e CLAE-DAD.
Na análise das frações n-hexânicas e diclorometânicas foi observado a presença de
esteres graxos de grande importância industrial, o palmitato de etila e o isobutirato de
etila, respectivamente. Nas frações acetato foi observado perfil semelhante aos do
extrato bruto, rico em flavonas e flavonóis.
Os ensaios farmacológicos realizados forneceram resultados interessantes para a
espécie M. ferruginata. Nos ensaios de citotoxicidade sobre células normais de
mamíferos foi observado que os extratos etanólicos na maior concentração avaliada
(500 µg/mL) se mostraram mais tóxicos que os extratos aquosos. Assim as
concentrações para avaliar as outras atividades biológicas foi estabelecida em até 500
µg/mL.
Para as atividades antibacterianas não foi observado inibição de crescimento
bacteriano a 500 µg/mL, isso pode ter ocorrido devido à baixa concentração dos
compostos ativos nos extratos avaliados. Contudo, se faz necessários estudos com as
frações ou substâncias isoladas para melhor avaliação da atividade antimicrobiana desta
espécie. Na avaliação das atividades tripanocida e leishmanicida não foi observado
efeito inibitório significativo do extrato etanólico bruto das folhas/flores sobre as cepas
avaliadas. Entretanto, foi avaliado apenas o extrato bruto e, por isso, são necessários a
avaliação das frações e compostos isolados, que na literatura tem demonstrado potente
atividade antiparasitária.
Na avaliação antitumoral foi verificado que os extratos aquosos e etanólicos das
folhas/flores e do caule apresentam um grande potencial citotóxico dose dependente
sobre células de adenocarcinoma de mama. Os valores de IC50 variaram de 56,44 a
180,4 µg/mL, visto que o fator tempo de exposição influenciou positivamente na
resposta antitumoral. Esta atividade possivelmente está relacionada à composição dos
extratos ricos em compostos fenólicos, dos quais se destaca os flavonoides. A classe dos
flavonoides, em especial a quercetina glicosilada identificada nos extratos etanólicos,
tem sido associada a inúmeras atividades biológicas.
Em relação à avaliação do efeito citotóxico dos extratos aquosos das
folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre leucócitos humanos, os resultados
mostram que não houve indução de morte celular nas culturas tratadas com o extrato nas
concentrações inferiores a 125 µg/mL em 24 horas. Já em culturas de 5 dias, a
concentração não tóxica para as células foram inferiores a 62,5 µg/mL. Além disso, foi
182
demonstrado que os extratos promoveram a inibição significativa da proliferação de
linfócitos estimulados por mitógenos, a concentração de 45 a 15 µg/mL. A inibição da
proliferação celular reflete, em parte, em uma provável atividade anti-inflamatória da
espécie M. ferruginata. A partir destes resultados pode-se sugerir que os efeitos
antiproliferativos observados possam estar relacionados com constituintes dos extratos
aquosos dentre eles: as catequinas e outros compostos fenólicos, uma vez que o extrato
aquoso do caule foi mais ativo que o extrato aquoso das folhas/flores. Provavelmente,
estes compostos devem estar relacionados com a ação anti-inflamatória M. ferruginata
relatada na medicina popular.
7 PERSPECTIVAS
Esses resultados abrem novas perspectivas para a realização de ensaios de
triagem de atividade biológica com as frações obtidas dos extratos etanólicos e aquosos
das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. Como também realizar outras formas de
fracionamento para um possível isolamento e caracterização dos constituintes ativos
presentes nos extratos brutos, dos quais foram observados potencial antiproliferativo e
antitumoral. Além disso, devem-se verificar os prováveis mecanismos intracelulares
envolvidos, tanto para os extratos brutos quanto para os possíveis compostos bioativos.
Foi observado um possível potencial antioxidante para os extratos aquosos,
sendo necessário avaliar e determinar este potencial por meio de outros ensaios
específicos. Como também deve-se avaliar este potencial nos extratos etanólicos, uma
vez que, o perfil químico destes extratos foi bastante semelhante aos extratos aquosos e,
provavelmente, devem apresentar um forte potencial antioxidante.
Neste trabalho foi avaliado apenas os extratos de alta polaridade, sendo
necessário também avaliar o perfil químico e possíveis atividades biológicas de extratos
de baixa polaridade. Isso porque, outras espécies deste gênero, apresentaram forte
potencial biológico para os compostos pertencestes a classe dos triterpenos pentacíclicos,
que foram obtidos a partir de extratos de baixa polaridade. Assim, se torna necessário
confeccionar e avaliar o potencial biológico destes extratos para a espécie M.
ferruginata. Além disso, pode-se realizar o fracionamento de tais extratos e verificar a
presença e o potencial biológico deste compostos triterpênicos isolados. Sendo que estes
estudos posteriores irão contribuir de forma significativa para o conhecimento científico
da espécie M. ferruginata.
183
8 REFERÊNCIAS
ADAMS,
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Essential
Oils
Components
by
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226
ANEXO A – Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa
227
ANEXO B- Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Termo de esclarecimento
Projeto de pesquisa
ELABORAÇÃO DE EXTRATOTECA E BANCO DE DADOS QUÍMICOS E
BIOLÓGICOS A PARTIR DE PLANTAS NATIVAS DA REGIÃO DE
DIAMANTINA – MG (VALE DO JEQUITINHONHA)
O objetivo do presente estudo é realizar uma biblioteca contendo dados químicos
e atividades biológicas de plantas da região de Diamantina-MG, para o qual você foi
escolhido por ter entre 20 e 39 anos, não ter doenças como catapora, lúpus, diabetes,
alergia, e não fazer uso regular de anti-inflamatórios. Sua participação no estudo
consistirá em doar 10 mL de sangue, que será coletado por punção venosa com tubos a
vácuo (da mesma maneira que é coletado quando você faz algum exame de sangue), em
data e horário a combinar. A partir do sangue serão obtidos os leucócitos para os
experimentos em laboratório. Os riscos de sua participação incluem hematoma (roxo no
local da coleta de sangue), dor, tontura e enjôo. A coleta será feita por pessoa treinada,
em local limpo e reservado, equipado com maca, utilizando material estéril e
descartável. Ao doar seu sangue para este projeto você estará contribuindo para a
identificação de plantas da região de Diamantina com atividades biológicas. Os seus
dados serão mantidos em sigilo e sua identidade não será revelada. Só os pesquisadores
envolvidos no projeto terão acesso aos dados, que serão utilizados apenas para fins de
pesquisa e divulgação científica em congressos, livros e revistas. Não está prevista
qualquer forma de remuneração pela sua participação no estudo e você não terá
nenhuma despesa (portanto, não está previsto nenhuma forma de ressarcimento).
Quaisquer dúvidas que possam surgir durante o andamento deste estudo por parte do
voluntário poderão ser esclarecidas junto aos membros da equipe responsáveis pelo
projeto, pessoalmente ou por telefone. Você poderá recusar e/ou deixar de participar
deste estudo a qualquer momento, sem nenhum constrangimento ou prejuízo na sua
relação com os pesquisadores e a UFVJM. Os pesquisadores responsáveis por este
projeto podem decidir sobre a sua exclusão do estudo por razões científicas, a respeito
228
das quais você deverá ser devidamente informado. Em caso de qualquer dúvida deverá
e/ou poderá entrar em contato a qualquer hora com a pesquisadora responsável Profa.
Bethânia
Alves
de
Avelar
Freitas
pelo
telefone
38-88374054
e
e-mail
[email protected]. Você também poderá contactar o Comitê de Ética em
Pesquisa – UFVJM (35326060) para informações sobre a aprovação do projeto pelo
comitê.
Termo de livre consentimento pós-informado
Eu discuti os riscos e benefícios da minha participação no estudo intitulado
“Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de
plantas nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha)” com os
pesquisadores envolvidos. Eu li e compreendi todos os procedimentos que envolvem
esta pesquisa e tive tempo suficiente para considerar a minha participação no estudo. Eu
perguntei e obtive as respostas para todas as minhas dúvidas. Eu sei que posso me
recusar a participar deste estudo ou que posso abandoná-lo a qualquer momento sem
qualquer constrangimento ou prejuízo. Eu também compreendo que os pesquisadores
podem decidir a minha exclusão do estudo por razões científicas, sobre as quais eu serei
devidamente informado. Não terei nenhuma remuneração e nenhum gasto por participar
do projeto. Tenho uma cópia deste formulário, o qual foi assinado em duas vias
idênticas e rubricadas.
Portanto, aqui forneço o meu consentimento para participar do estudo intitulado
““Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de
plantas nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha)”, durante
todos os testes realizados.
Diamantina,
Assinatura do voluntário:
Testemunha: ___________
Testemunha: ______
Declaro que expliquei todos os objetivos, benefícios e riscos deste estudo ao voluntário,
dentro dos limites de meus conhecimentos científicos.
Pesquisador responsável:
Bethânia Alves de Avelar Freitas
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFVJM
229
CAMPUS JK - RODOVIA MGT 367 –
KM 583 - Nº 5000 - ALTO DA JACUBA CEP 39100-000 DIAMANTINA - MG
TELEFONE: 55 XX (38) 3532-1200
COORDENAÇÃO: PROFª. THAIS PEIXOTO GAIAD MACHADO
(38) 3532-1240 E 3532-1200 RAMAL 1240
[email protected]
230
ANEXO C – Autorização para coleta da espécie Miconia ferruginata.
231
ANEXO D – Autorização para acesso ao patrimônio genético
232
233
APÊNDICE A – Espectros de Massas dos compostos identificados por meio análise
por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das
partes aéreas frescas de Miconia ferruginta
A
B
Espectro de massas da substância 3-hexen-1-ol (1) obtido para o tempo de retenção de 4,165
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 95% (B).
A
B
Espectro de massas da substância 1-octen-3-ol (2) obtido para o tempo de retenção de 7,137
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 98% (B).
234
A
B
Espectro de massas da substância isoborneol (3) obtido para o tempo de retenção de 14,399
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).
A
B
Espectro de massas da substância eugenol (4) obtido para o tempo de retenção de 22,071
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).
A
B
Espectro de massas da substância α-copaeno (5) obtido para o tempo de retenção de 23,057
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 94% (B).
235
A
B
Espectro de massas da substância β-cubebeno (6) obtido para o tempo de retenção de 23,580
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 90% (B).
A
B
Espectro de massas da substância β-elemeno (7) obtido para o tempo de retenção de 23,653
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).
A
B
Espectro de massas da substância β-cariofileno (8) obtido para o tempo de retenção de 24,994
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta DC. (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 95% (B).
236
A
B
Espectro de massas da substância α-humuleno (9) obtido para o tempo de retenção de 26,369
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 96% (B).
A
B
Espectro de massas da substância germacreno D (10) obtido para o tempo de retenção de 27,406
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 92% (B).
A
B
Espectro de massas da substância pentadecano (11) obtido para o tempo de retenção de 28,328
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).
237
A
B
Espectro de massas da substância hexadecano (12) obtido para o tempo de retenção de 32,264
minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CGEM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na
espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).
A
B
Espectro de massas da substância hexadecino (13) obtido para o tempo de retenção de
34,811minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas
obtido na espectroteca com índice de similaridade de 92% (B).
A
B
Espectro de massas da substância 8-heptadeceno (14) obtido para o tempo de retenção de
35,176 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas
obtido na espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).
238
APÊNDICE B – Espectros de massa obtidos da análise em cromatografia líquida de
alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas
Intensidade
(CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
m/z
Espectro de massas para o ácido quínico (15), obtido para o tempo de retenção de 11,3 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores
Intensidade
de Miconia ferruginata.
m/z
Espectro de massas para o ácido monocafeoilquínico (16), obtido para o tempo de retenção de
15,5 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
239
m/z
Espectro de massas para a catequina (17), obtido para o tempo de retenção de 16,2 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada
à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia
Intensidade
ferruginata.
m/z
Espectro de massas para a subclasse do flavonol (18), obtido para o tempo de retenção de 17,1
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
240
m/z
Espectro de massas para a quercetina-O-hexose (19), obtido para o tempo de retenção de 18,2
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
Intensidade
folhas/flores de Miconia ferruginata.
m/z
Espectro de massas para a quercetina-O-pentose (20), obtido para o tempo de retenção de 19,0
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
241
m/z
Espectro de massas para a quercetina-O-deoxihexose (21), obtido para o tempo de retenção de
19,4 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
Intensidade
folhas/flores de Miconia ferruginata.
m/z
Espectro de massas para a subclasse das flavonas (22), obtido para o tempo de retenção de 27,5
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
242
m/z
Espectro de massas para a subclasse das flavonas (22), obtido para o tempo de retenção de 28,0
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
Intensidade
folhas/flores de Miconia ferruginata.
m/z
Espectro de massas para a subclasse das flavonas (22), obtido para o tempo de retenção de 28,8
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
243
m/z
Espectro de massas para a subclasse das flavonas (22), obtido para o tempo de retenção de 31,8
minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de
diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das
folhas/flores de Miconia ferruginata.
244
APÊNDICE C - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise em
cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
Intensidade
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 1.78 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata. Representação estrutural do ácido gálico (26)
Intensidade
identificado neste espectro.
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 2.49 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
245
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 14.16 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
246
APÊNDICE D - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise em
cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
Intensidade
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 1.77 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
Intensidade
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 8.70 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato
aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
247
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 11.23 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
Intensidade
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 13.99 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
248
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 15.58 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
Intensidade
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 17.12 minutos
da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos
(CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do
extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.
249
APÊNDICE E - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da análise em
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-
Intensidade
DAD) da fração acetato do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Flavona
TR= 26,38
Flavona
TR= 26,38
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 14.01 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 14.86 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
250
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.14 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.60 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
251
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 16.58 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 17.13 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
Intensidade
252
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 26.38 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 31.17 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
das folhas/flores de Miconia ferruginata.
253
APÊNDICE F - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da análise em
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-
Intensidade
DAD) da fração acetato do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.98 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
do caule de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 17.13 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
do caule de Miconia ferruginata.
Intensidade
254
nm
Espectro UV-Vis do pico com tempo de retenção de 18.38 minutos da análise em cromatografia
líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de
etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia
Intensidade
ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 18.83 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
do caule de Miconia ferruginata.
Intensidade
255
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 19.11 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
Intensidade
do caule de Miconia ferruginata.
nm
Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 20.85 minutos da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAEDAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico
do caule de Miconia ferruginata.