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Atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre bactérias patogênicas humanas
1
2
3
4*
1
ALVARENGA, A.L. ; SCHWAN, R.F. *; DIAS, D.R. ; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F. ; BRAVO-MARTINS, C.E.C.
2
Departamento de Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Lavras (UFLA); Departamento de Biologia,
3
Universidade Federal de Lavras, Campus Universitário 37200-000, Lavras, MG; Unilavras – Centro Universitário de
4*
Lavras; Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá (UEM)-PR. Autor para correspondência:
[email protected]
1
RESUMO: Extratos aquosos e alcoólicos de alecrim (Rosmarinus officinalis), capim-limão
(Cymbopogon citratus), gengibre (Zingiber officinale), hortelã (Mentha piperita), orégano (Origanum
vulgare) e sálvia (Salvia officinalis), a 10 e 20% (m:m), foram testados quanto à atividade
antibacteriana sobre Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090),
Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis
(ATCC 9811) e Streptococcus mutans (ATCC 25175), utilizando-se o método de difusão em ágar
Müller Hinton. Não houve ação antimicrobiana dos extratos aquosos, independente da
concentração, sobre nenhum dos microrganismos pesquisados. Os extratos etanólicos das plantas
testadas, na concentração de 20%, inibiram parcialmente o crescimento de Shigella flexneri.
Palavras-chave: Extratos, plantas medicinais, atividade antimicrobiana
ABSTRACT: Antimicrobial activity of plant extracts against human bacterial pathogens.
Aqueous and alcoholic plant extracts, from rosemary ( Rosmarinus officinalis), lemongrass
(Cymbopogon citratus), gingerroot (Zingiber officinale), peppermint (Mentha piperita), oregano
(Origanum vulgare ) and sage ( Salvia officinalis), at 10 and 20%, were tested against
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella
choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis (ATCC 9811)
and Streptococcus mutans (ATCC 25175) using the agar diffusion method. No antimicrobial activity
was found in aqueous plant extracts in both concentrations prepared (10 and 20%) upon all
microorganisms tested. All alcoholic extracts showed intermediary inhibition properties at 20%
against Shigella flexneri.
Key words: Plant extracts, antimicrobial activity, bacterial inhibition
INTRODUÇÃO
Várias patologias que afetam a Saúde
Pública são de origem microbiana e especialmente
bacteriana. Estudos com patógenos veiculados pela
ingestão de alimentos contaminados, como espécies
de Staphylococcus, Listeria, Shigella, Salmonella,
entre outros, têm sido realizados (Murray, 2000;
Tauxe, 2002). O controle das espécies de
Streptococcus, reconhecido como uma das principais
bactérias responsáveis pela cárie dentária, tem sido
realizado com o uso de produtos antimicrobianos,
como forma preventiva de inibir o crescimento destas
espécies de bactérias (Yamashita et al., 1993; Koo
et al., 2003). A forma de aquisição desta bactéria é
por contato direto entre os hospedeiros com objetos
inanimados (chupetas e brinquedos) ou através da
saliva (principal via de transmissão) ou ainda pela mãe
(a mais importante fonte de infecção) (Yamashita et
al., 1993; Cai et al., 1994). Embora estas bactérias
apresentem vias de transmissão, sintomatologia e
mecanismos de infecção diferentes, as doenças
bucais causadas por microrganismos são
consideradas grandes problemas de saúde pública
(Silver, 2003; Chinivasagam et al., 2004). Para o
controle destas patologias bucais são utilizados
fármacos que, na maioria são sintetizados em
laboratório, e para os quais muito tempo e recursos
econômicos são gastos em pesquisas até que
possam ser utilizados (Barraca & Minami, 1999).
Recebido para publicação em 23/11/2006
Aceito para publicação em 20/03/2007
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.9, n.4, p.86-91, 2007.
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Apesar da grande diversidade de
antimicrobianos que agem sobre diversos
microrganismos patogênicos, estudos buscam por
um antimicrobiano ideal, ou seja, aquele que
apresenta maior espectro de ação, menor toxicidade,
menor custo e menor indício de resistência
bacteriana, haja vista que já existe resistência
bacteriana a alguns produtos antimicrobianos
(Nascimento et al., 2000; Pazhani, 2004). A atividade
antimicrobiana desejada pode ser encontrada em
espécies de plantas medicinais. A flora brasileira
apresenta-se altamente diversificada em espécies que
na sua maioria ainda não foi pesquisada
cientificamente quanto à sua ação antimicrobiana
(Simões et al., 2000; Auricchio & Bacchi, 2003).
Tem-se verificado cientificamente o uso
popular de plantas com a finalidade de obtenção dos
mais variados efeitos medicamentosos, incluindo sua
aplicação como antimicrobianos (Pozetti et al., 1972;
Kumar & Berwal, 1998; Castro et al., 2000; Koo et
al., 2003; Burt, 2004). O uso de plantas medicinais,
muitas delas cultivadas no fundo do quintal, é prática
secular baseada no conhecimento popular e
transmitida oralmente, na maior parte das situações
(Nascimento et al., 2000; Castro et al., 2000). Numa
população com baixo acesso a medicamentos, como
a brasileira, agregar garantias científicas a essa prática
terapêutica traz variadas vantagens, como baixo custo
e fácil acesso, diminuição de efeitos adversos e evitar
ou diminuir os riscos de intoxicação por uso
inadequado (Furlan, 1998). Neste sentido, a
investigação de materiais naturais como fontes de
novos agentes antibacterianos têm aumentado
potencialmente nos últimos vinte anos, onde diferentes
extratos de plantas medicinais, condimentares e
aromáticas têm sido testados (Nascimento et al.,
2000; Castro et al., 2000).
Assim, o objetivo deste trabalho foi o de
avaliar o efeito de extratos aquoso e etanólico de
diferentes plantas aromáticas ou medicinais (orégano
(Origanum vulgare), hortelã (Mentha piperita), alecrim
(Rosmarinus officinalis L), sálvia (Salvia officinalis),
capim limão ( Cymbopogon citratus ) e gengibre
(Zingiber officinale)) sobre bactérias patogênicas de
importância em saúde pública (Staphylococcus
aureus , Listeria monocytogenes , Salmonella
choleraesuis, Shigella flexneri, Streptococcus mitis
e Streptococcus mutans).
MATERIAL E MÉTODO
Microrganismos testados
O experimento foi realizado no Laboratório
de Fisiologia de Microrganismos do Departamento
de Biologia e no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos do Departamento de Ciência dos Alimentos
da UFLA. Foram utilizadas cepas de Staphylococcus
aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC
33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028),
Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis
(ATCC 9811), Streptococcus mutans (ATCC 25175),
adquiridos na Fundação André Tosello.
Preparo dos inóculos
Para a padronização da técnica e
dimensionamento do inóculo, uma alçada de cada cepa
bacteriana foi semeada em 10 mL do meio de cultura
líquido BHI (Brain Heart Infusion) e incubadas a 37ºC
por 24 horas. As suspensões de microrganismos foram
ajustadas de acordo com o tubo 2 da escala de
MacFarland, expressa em número de bactérias mL-1
de meio de cultura (aproximadamente de 6,0 x 108
células mL-1). Foram removidos 100 µL de cada uma
das suspensões bacterianas para posterior inoculação
nos meios de origem.
Preparo dos extratos
Para o teste de inibição dos microrganismos
foram utilizados extratos aquosos e etanólicos nas
concentrações de 10 e 20% (m/m), fornecidos pelo
Horto Medicinal do Centro Universitário de Lavras
(Unilavras). Estes extratos foram preparados a partir
de plantas frescas selecionadas, coletadas no período
de 12:00 às 14:00h: folhas e caules novos de orégano
(Origanum vulgare L. família Lamiaceae), hortelã
(Mentha piperita L; família Lamiaceae) e alecrim
(Rosmarinus officinalis L; família Lamiaceae); folhas
de sálvia (Salvia officinalis L; família Lamiaceae) e
capim limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf, família
Poaceae) e rizomas de gengibre (Zingiber officinale
[Willd] Roscoe, família Zingiberiaceae). As plantas
utilizadas foram botanicamente identificadas e o material
herborizado está depositado no Herbário Luna - Unilavras.
Para o preparo dos extratos aquosos foram
adicionados 100 g de planta em 400 g de água
destilada e triturada em Hand Blender (JD-1001)
Modelo 14A4257. O homogeneizado obtido foi coado
em gaze e filtrado em papel de germinação com
auxílio de bomba a vácuo e posteriormente em papel
de filtro quantitativo (poros de 8 µm, Quanty). A
solução foi ainda submetida à filtragem, utilizandose filtro Millipore (0,45 µm) originando a solução
aquosa a 20% (m/m), que foi acondicionada em
frascos e congelada. Em seguida foram adicionados
250 g de água destilada estéril a 250 g da solução a
20%, obtendo-se a solução aquosa a 10%.
Os extratos alcoólicos foram obtidos em
etanol/água (70% v/v) nas concentrações de 10 e 20%
(m/m), por maceração durante 20 dias à temperatura
ambiente. Após este período, a solução foi filtrada
em gaze e conservada em frasco âmbar. O extrato
etanólico a 10% foi obtido diluindo-se o extrato a 20%
em etanol 70% (1:1).
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.9, n.4, p.86-91, 2007.
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Semeadura dos microrganismos
Streptococcus mutans e S. mitis foram
transferidos para meio líquido BHI e incubados para
reativação e posterior cultivo em ágar mitis salivarius.
Foram removidas 04 alçadas de cada uma delas para
10 mL do meio de cultura líquido BHI, em tubos de
ensaio. Após homogeneização, os tubos foram
incubados a 37oC por 24 horas e utilizados para os
testes de inibição de crescimento. As demais
bactérias foram transferidas para o meio TSB
(Tripticase Soy Broth) para reativação e posterior
cultivo em TSA (Tripticase Soy Agar) e incubadas
conforme mencionado anteriormente. Antes de iniciar
os ensaios de inibição, a concentração de células
bacterianas foi ajustada ao tubo 2 da escala de
MacFarland, apresentando aproximadamente 6 x108
bactérias mL-1, segundo padrões estabelecidos pelo
National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS, 2000). O crescimento foi evidenciado pela
constatação macroscópica da turvação deste meio
de cultura e foi realizada a coloração de Gram para
todos os isolados bacterianos utilizados no
experimento.
Avaliação da atividade antibacteriana dos
extratos
A atividade antibacteriana dos extratos
vegetais foi realizada de acordo com Nakamura et al.
(1999). Um volume de 100 µL das suspensões
bacterianas foi inoculado, em triplicata, em placas
contendo Ágar Müeller-Hinton previamente solidificado,
utilizando-se alça de Drigaslky. Após a distribuição
da suspensão bacteriana, foram inseridos,
assepticamente, oito anéis (microcilindros de aço)
no meio de cultura em cada placa (à exceção da
placa controle). Em seis destes anéis foram
colocados os extratos (aquoso ou alcoólico), em um
anel o solvente (água ou etanol, a depender do extrato
a ser testado) e, no último anel, o antibiótico,
específico para cada cepa de bactéria testada. Os
antibióticos testados sobre os respectivos
microrganismos foram selecionados por serem
considerados como padrão para os testes de inibição
do crescimento (NCCLS, 2000). Foram utilizados
vancomicina (500 mg mL -1) como controle de
Staphylococcus aureus; ciprofloxacina (250 mg mL-1)
nas placas com Shigella flexneri e Salmonella
choleraesuis; ampicilina (500 mg mL-1) sobre Listeria
monocytogenes e clorexedina (0,12% m/v) para inibir
Streptococcus mutans e S. mitis. Os antibióticos
utilizados possuem ação bactericida de largo espectro
sobre microrganismos Gram-positivos e Gramnegativos, apresentando-se bastante efetivos contra
infecções causadas por estas bactérias (Murray et
al., 2000).
Depois de montadas, as placas foram
incubadas a 37ºC por 24 horas e avaliado os halos
de inibição formados (Ejechi et al., 1999). Para a
interpretação dos resultados foram seguidas as
recomendações do NCCLS (2000), onde os halos de
inibição formados foram comparados com a tabela
de referência, sendo os microrganismos classificados
como resistente (zona de inibição inferior a 15 mm),
intermediário (de 15 a 29 mm) e sensível (de 30 a 35
mm) a determinado agente (NCCLS, 2000).
RESULTADO E DISCUSSÃO
Os extratos aquosos das plantas testadas,
a 10%, não promoveram a formação de halos de
inibição sobre S. aureus, S. choleraesuis, S. mitis e
S. mutans. No caso de S. choleraesuis, o extratos
aquosos a 10 e 20% não levaram à formação de halo
de inibição, verificando-se resistência ou
insensibilidade a estes extratos. No caso de S.
aureus, S. mitis e S. mutans os extratos aquosos a
10% não formaram halo. Os extratos aquosos a 20%
de gengibre e de hortelã apresentaram halos de
inibição superiores àquele observado pela ação da
vancomicina sobre S. aureus (Tabela 1). Os demais
extratos aquosos estudados apresentaram halos de
inibição inferiores aos apresentados pelos antibióticos
correspondentes a cada espécie bacteriana.
Na Tabela 2 podem ser observados os
resultados da atividade antibacteriana dos extratos
etanólicos testados. Os extratos etanólicos a 10%
de todas as plantas testadas não causaram qualquer
inibição no crescimento de L. monocytogenes, S.
choleraesuis e S. aureus, sendo que para este, o
extrato etanólico a 20%, também não apresentou
formação de halo.
À exceção dos dados observados em S.
flexneri, nenhum dos extratos foi capaz de inibir o
crescimento bacteriano de forma intermediária ou
sensível sendo os halos formados considerados na
faixa de resistência microbiana. Todos os extratos
vegetais etanólicos, na concentração de 20%, levaram
à formação de halos de inibição intermediária de S.
flexineri. Os halos encontrados neste trabalho são
superiores aos valores encontrados na literatura,
sobre o gênero Shigella, quando submetido à ação
de extratos de goiabeira, cujo halo foi de 15 mm
(Carvalho et al., 2002). Quando testados na
concentração de 10% contra o mesmo microrganismo,
os extratos de alecrim, capim-limão e gengibre
produziram halos de inibição intermediária cujos
valores foram superiores ao gerado pelo solvente e
também superiores aos respectivos halos a 20%,
enquanto que os extratos de hortelã, orégano e sálvia
levaram à formação de halos de forma inversa, sendo
inferiores na concentração de 10%.
Os resultados obtidos mostraram que os
microrganismos Gram-positivos testados (S.aureus, L.
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.9, n.4, p.86-91, 2007.
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TABELA 1. Halos de inibição (mm) das colônias bacterianas, formados pelos extratos vegetais aquosos nas
concentrações de 10 e 20%.
R
Resistente = halo de inibição inferior a 15 mm; I Intermediário = halo de inibição de 15 a 29 mm; S Sensível
= halo de inibição de 30 a 35 mm; n = não adicionado. Os espaços em branco (-) indicam ausência de halo
de inibição. S. a = Staphylococcus aureus; L. m = Listeria monocytogenes; S. f = Shigella flexneri; S. mitis =
Streptococcus mitis; S. mutans = Streptococcus mutans
TABELA 2. Halos de inibição (mm) formados pelos extratos vegetais etanólicos nas concentrações de 10 e 20%.
R
Resistente = halo de inibição inferior a 15 mm; I Intermediário = halo de inibição de 15 a 29 mm; S Sensível =
halo de inibição de 30 a 35 mm; n = não adicionado. Os espaços em branco (-) indicam ausência de halo de
inibição. L. m = Listeria monocytogenes; S. c = Salmonella choleraesuis; S. f = Shigella flexneri; S. mitis =
Streptococcus mitis; S. mutans = Streptococcus mutans
monocytogenes, S. mitis e S. mutans) apresentaram
resistência aos extratos vegetais, tanto alcoólicos
quanto aquosos. Entre os dois Gram-negativos, S.
choleraesuis e S. flexneri, houve inibição intermediária
da S. flexneri pelos extratos alcoólicos a 10% e 20%,
exceto da hortelã e orégano a 10%. Estes resultados
corroboram as informações reportadas por outros
autores (Deans & Ritchie, 1987; Zaika, 1988; Dorman
& Deans, 2000) a respeito da tendência de maior
resistência a extratos vegetais em microrganismos
Gram-positivos. Em outros relatos, porém, foi
observada maior susceptibilidade de microrganismos
Gram-positivos a óleos essenciais (Smith-Palmer et
al.,1998; Hussein, 1990). Gonçalves et al. (2005)
testaram extratos hidro-alcoolicos de 17 espécies
vegetais no controle de S. aureus e verificaram que
para 7 destes extratos, a bactéria apresentou-se
resistente, demonstrando sensibilidade para os
demais.
Dos antibióticos testados, a ciprofloxacina
foi capaz de inibir o crescimento de S. choleraesuis
de forma sensível (halo médio de 39,0 mm). Sobre
Shigella flexneri a inibição foi intermediária (halo médio
de 21,0 mm). Ampicilina promoveu inibição
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.9, n.4, p.86-91, 2007.
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intermediária sobre L. monocytogenes, com halo
médio de 29,0 mm. Os demais microrganismos
apresentaram resistência aos respectivos antibióticos
contra eles testados, de acordo com o preconizado
pela NCCLS (2000). Alguns autores (Salyers &
Amábile-Cuevas, 1997; Levy, 1997; Chartone-Souza,
1998) citam a existência de cepas de S. aureus
multiresistentes, limitando as opções terapêuticas
apenas aos antibióticos vancomicina e teicoplamina.
Neste trabalho, a cepa de S. aureus testada
apresentou resistência a vancomicina (halo médio de
7,5 mm), resultados também observados por outros
autores, que isolaram linhagens com sensibilidade
reduzida a vancomicina e meticilina (Domin, 1998;
Labischinski et al., 1998; Fridkin, 2001).
Os extratos alcoólicos de todas as plantas
testadas apresentaram atividade inibitória sobre
Shigella flexineri. Para a maioria dos extratos houve
formação de halo. Podem ser pesquisadas novas
concentrações ou testar as plantas durante o
fracionamento químico dos componentes, como
perspectivas de melhores resultados e aplicação
desses extratos como antibióticos.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a Vilmar Arlindo de
Oliveira e Prof. João Antonio Argenta (Unilavras), por
disponibilizar os extratos de plantas testados neste
trabalho.
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