Comunicado
No. 013
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Universidade de São Paulo Curva de conversão da contagem
bacteriana individual (CBI), para
contagem padrão em placas (UFC)
Projeto Nacional da Rede Brasileira de Controle da Qualidade do Leite
COMUNICADO
(RBQL),
LANAGRO/CGAL/SDA/MAPA,
define
novas
curvas
de
conversão da CBI para UFC que serão adotadas a partir de
01/Outubro/2013.
Piracicaba, 30 d e Setembro de 2013 Elaborado por equipe Clínica do Leite Direitos autorais reservados A análise de contagem bacteriana total
A análise de contagem bacteriana total (CBT) é feita através de equipamentos automatizados de alta
capacidade analítica e precisão, que utilizam o método de citometria de fluxo. Neste método, cada
bactéria presente no leite é identificada e enumerada, sendo que o equipamento expressa o resultado em
“contagem bacteriana individual” (CBI/mL).
No entanto, a legislação (IN-62) estabelece os limites em “unidades formadoras de colônia”(UFC) obtidos até
então pelo método tradicional de contagem padrão em placas. Neste método o leite é adicionado a uma
placa com meio de cultura e incubada a 30oC por 72h. As bactérias presentes no leite se multiplicam
formando uma colônia que passa a ser visível e enumerada. Com isso, o resultado da contagem padrão em
placas, é dado em UFC/mL. Uma colônia, por sua vez, pode ter sido originada de uma ou várias bactérias.
Desta forma, via de regra, a CBI é sempre superior ao número de UFC, cerca de 2 a 3 vezes.
Em função da diferença entre as metodologias é necessário que os resultados de CBI sejam transformados
em UFC e para isso, desenvolve-se o que chamamos de curva de conversão. O desenvolvimento desta curva
é padronizado por documento internacional da ISO/IDF.
Projeto da RBQL, LANAGRO/CGAL/MAPA
A CGAL/SDA/MAPA, com o objetivo de padronizar a curva de transformação entre os laboratórios da RBQL,
coordenou um projeto nacional que se iniciou em 2011. Durante os 2 anos, e com participação ativa de
todos laboratórios da RBQL, foram coletadas amostras provenientes de praticamente todos os estados. No
projeto foram adotados procedimento padronizados de construção da curva, com base nas normas
internacionais da ISO/IDF.
O projeto teve sua primeira fase concluída recentemente e após compilação dos dados e análise estatística,
foram definidas as curvas de conversão para as macrorregiões do país, nas diferentes estações do ano. Para
que as curvas de cada região possam ser utilizadas, a indústria deverá informar a localização de cada
produtor. Os laboratórios da RBQL deverão substituir as suas equações próprias, por estas novas, a partir de 01
de Outubro.
Como prevê a própria ISO/IDF, o projeto é contínuo e será definido um protocolo de manutenção e
atualização das curvas.
A curva atual da Clínica do Leite é diferente das curvas definidas no projeto ?
No caso da Clínica do Leite, a equação atual é muito semelhante às novas curvas e, portanto, os resultados
não sofrerão alteração. Este fato nos deixa muito feliz e comprova que o que vínhamos fazendo desde 2004,
quando adotamos um protocolo de atualização da nossa curva, baseado na ISO/IDF, estava perfeitamente
correto. Isto, também, deixa os usuários da Clínica do Leite completamente seguros quanto à confiabilidade
de nossos resultados.
Veja alguns exemplos abaixo, de como ficarão alguns resultados com a nova curva, em comparação à
curva atual:
Exemplo 1 2 3 4 5 Localização produtor Região Sudeste/Centro Oeste Região Sudeste/Centro Oeste Região Sul Região Sul Região Norte/Nordeste Estação Primavera/Verão/Inverno Outono Inverno/Primavera Outono Todas estações Comparação -­‐ CBT mil UFC/mL Equação Clínica Equação RBQL/MAPA 31 713 31 713 168 41 756 37 648 170 Em caso de dúvidas adicionais, estaremos à disposição. Entre em contato com a nossa Central de
Relacionamento.
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Clínica do Leite - ESALQ/USP
Comunicado No. 013
Comunicado
No. 14
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Universidade de São Paulo Alteração do modelo do
arquivo excel para pedido de
etiquetas
COMUNICADO
Este comunicado tem como objetivo divulgar o novo
formato do arquivo para pedido das etiquetas de
identificação dos produtores. Este envio será necessário a
partir do dia 11 de Novembro de 2013.
Piracicaba, 02 de Outubro de 2013 Elaborado por equipe Clínica do Leite Direitos autorais reservados Novo formato do arquivo
A partir da necessidade do laboratório em saber a localização de cada fornecedor, será necessário
informar o estado (unidade da federação) que cada fazenda esta localizada.
Esta informação será encaminhada no arquivo em excel no momento da solicitação das etiquetas que
identificam as amostras. Veja abaixo o novo formato:
Nova coluna no arquivo
em excel para pedido de
etiqueta
Observações
- A informação do estado deve ter 2 caracteres, como
- Deixamos a disposição um link para download
por exemplo: MG, SP, PR, GO, MS, RJ, BA, SC, CE
do novo arquivo modelo na tela de pedido de
- É obrigatório o envio do estado da fazenda
material:
- Caso o arquivo não tenha as 6 colunas, o Portal
apresentará a seguinte mensagem e o pedido não será
realizado :
Para que esta informação será utilizada ?
O MAPA junto à CGAL, SDA e o LANAGRO publicou o ofício circular No. 11/2013 - LANAGRO MG/POA
alterando o procedimento operacional da análise de Contagem Bacteriana Total (CBT). A partir desta
alteração, a Clínica do Leite necessitará receber a localização de cada fornecedor da indústria para que,
no processo da análise de CBT seja utilizado a metodologia correta. Para facilitar o entendimento, a Clínica
do Leite preparou 2 documentos:
1) COM no. 13 – Curva de conversão da contagem bacteriana individual (CBI), para contagem padrão em
placas (UFC)
2) Artigo publicado na revista LeiteIntegral – Contagem Bacteriana Total: Entendendo o processo de análise –
publicado na revista LeiteIntegral na Edição 44 de Outubro de 2012
Em caso de dúvidas adicionais, entre em contato com a nossa Central de Relacionamento pelo telefone
(19)3422-3631 ou pelo e-mail [email protected] .
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Clínica do Leite - ESALQ/USP
Comunicado No. 014
Contagem bacteriana total: Entendendo o processo de análise Laerte Dagher Cassoli Clínica do Leite – ESALQ/USP Estamos chegando ao quinto artigo sobre “qualidade do leite” publicado aqui na Revista Leite Integral. Abordamos sobre a IN-­‐51/62, amostragem, monitoramento de fraudes e na última edição apresentamos um diagnóstico da qualidade do leite e a sua evolução nos últimos anos. Neste artigo iremos olhar um outro lado do monitoramento da qualidade do leite, o as análises laboratoriais, ou seja, o que ocorre dentro do laboratório. Quando realizamos treinamentos dos transportadores das indústrias, nos procedimentos de coleta de amostras, reforçamos a importância de uma boa coleta para se obter resultados confiáveis. Invariavelmente sempre algum deles se manifesta com perguntas do tipo: “Mas e vocês do laboratório, nunca erram ?”, “Outro dia o produtor coletou outra amostra, mandou para outro laboratório e o resultado foi totalmente diferente, como pode ?”. A seguir iremos esclarecer algumas dúvidas quanto a análise de contagem bacteriana total (CBT) e fatores ligados ao processo de análise que podem afetar os resultados. Dentre todas as análises feitas atualmente talvez a CBT seja a mais crítica, não somente aqui no Brasil como também em outros países como veremos a seguir. Como é feita a análise de contagem bacteriana total pelos equipamentos automatizados ? Existem atualmente dois fabricantes no mundo que desenvolveram equipamentos específicos para determinação da contagem bacteriana em leite cru, e que adotam a metodologia conhecida como citometria de fluxo. Essa técnica, consiste na adição de brometo de etídio ao leite, para que o DNA e RNA das bactérias sejam corados. O leite com o corante é injetado num capilar acoplado a um sistema óptico, que recebe, constantemente um feixe de laser. Ao passar pelo feixe, cada bactéria emite fluorescência, a qual é captada pelo sistema óptico e com isso o número de bactérias é determinado (Veja Figura 01). A contagem bacteriana realizada pelo equipamento é expressa em contagem individual de bactérias (CIB), ou seja, número de bactérias em cada mL de leite (CIB/mL de leite). Luz (laser) é direcionado no capilar e atinge as bactérias com corante. Luz refletida pela bactéria Leite misturado com corante é injetado por uma agulha num capitar Como é feita a análise de contagem bacteriana total pelo método tradicional ? Um dos métodos mais utilizados para caracterizar a qualidade microbiológica do leite é a contagem bacteriana em placas, ou também conhecida como contagem padrão em placas (CPP). Por ser um dos métodos mais utilizados e antigo é reconhecido como o método de “referência”. Na CPP, uma alíquota de leite é distribuída em placa com meio de cultura e incubada a 36ºC por 48 horas (método analítico oficial do Ministério da Agricultura – MAPA). As bactérias presentes no leite, e que se encontram viáveis, crescem a tal ponto de serem visíveis a olho nu. São as chamadas “colônias”. Com isso é possível contarmos quantas colônias cresceram e em função do volume da amostra, determina-­‐se a CPP expressa em unidades formadoras de colônias por mL de leite (UFC/mL). No método de CPP, portanto, conta-­‐se colônias e não bactérias. Sabe-­‐se que na maioria das vezes uma colônia é formada por várias bactérias como mostra o esquema abaixo de uma placa. Nesta placa, por exemplo, existem 15 colônias (números em cinza) formadas a partir de 82 bactérias (números em preto). No caso desta colônia, ela foi formada por 10 bactérias No caso desta colônia, ela foi formada por 4 bactérias Neste caso, as 6 bactérias não se desenvolveram/multiplicaram e com isso não formaram uma colônia visível Com base no exemplo acima, esta amostra analisada pelo equipamento teria uma contagem bacteriana individual (CBI) de 82 bactérias/mL, enquanto que na contagem padrão em placas o resultado seria de 15 UFC/mL. Fica claro portanto que a CBI sempre será superior a UFC, basicamente pelos seguintes motivos: a) Algumas bactérias podem não crescer na placa e com isso não formam colônias, b) Uma única colônia é formada geralmente por mais de uma bactéria. Mais adiante discutiremos em maior detalhe a relação entre CIB e UFC, mas estudos mostram que a UFC é de 2,5 a 4 vezes menor que a CBI. O que diz a legislação ? Deve-­‐se usar a CBI ou UFC ? Como os equipamentos que determinam a CBI são relativamente novos, e a maioria das legislações/padrões foram escritos há muitos anos, adota-­‐se como via de regra a CPP (UFC/mL) para se definir os padrões de qualidade do leite. A grande maioria dos países na Europa, América do Norte e Pacífico, adotam a medida de UFC/mL, assim como o Brasil. Na IN-­‐62 os limites são definidos em UFC/mL, ou seja, quando dizemos que o leite deverá ter menos que 100.000 para CBT, significa que deve possuir menos que 100.000 UFC/mL. Alguns países, porém, como o Canadá, Noruega e Inglaterra, alteraram a sua legislação e passaram a adotar contagem bacteriana individual (CBI) em seus padrões de qualidade. Os laboratórios da RBQL do MAPA realizam a determinação da CBT através de equipamentos de citometria de fluxo e os resultados são originalmente expressos em CBI. Como a IN-­‐62 utiliza UFC/mL, os resultados em CBI dos equipamentos precisam ser transformados/convertidos para UFC, tema que será abordado a seguir. Como transformar os resultados de CBI para UFC ? Existem entidades responsáveis por elaborar normas com o objetivo de padronizar os procedimentos analíticos entre diferentes laboratórios e com isso alcançar resultados de análise próximos (e tecnicamente “iguais”). É fundamental que uma amostra analisada aqui num laboratório no Brasil ou na França, por exemplo, possua resultados “iguais” para gordura, proteína, CCS, CBT, etc. A principal entidade que elabora as normas em análises de leite é a IDF (International Dairy Federation) que atualmente trabalha em conjunto com outra entidade a ISO (International Organization for Standardization). Especialistas em métodos analíticos formam grupos de trabalho e elaboram as normas para cada tipo de análise e/ou método analítico. Como a análise de CBT por citometria de fluxo é relativamente nova, somente no ano de 2004 que a IDF publicou a IDF-­‐196 (ou ISO 21187). Esta norma define claramente como que deverá ser elaborada a equação para transformar os resultados de CBI para UFC. Basicamente o documento define que cada laboratório deve desenvolver a sua equação de transformação. Para isso, amostras de leite devem ser analisadas pelo equipamento e ao mesmo tempo através da contagem padrão em placas. Com isso é possível criar uma relação entre CBI e UFC e chegar a equação de transformação. Alguns pontos são críticos neste processo: a) Para ter uma equação de transformação robusta/confiável, deve-­‐se ter pelo menos 400 amostras analisadas pelo equipamento e pela CPP. No caso da Clínica do Leite, por exemplo, adotam-­‐se 600 amostras; b) A análise de CPP deve ser realizada em laboratórios com competência, ou seja, credenciado/acreditado por órgãos competentes. No caso da Clínica do Leite as amostras são analisadas em laboratório credenciado pelo próprio MAPA. c) A equação desenvolvida deve ser verificada e atualizada periodicamente. No caso da Clínica do Leite, a cada bimestre, são analisadas cerca de 50 amostras que são incorporadas a equação original, garantindo-­‐se a confiabilidade da mesma. Ao adicionar as 50 amostras mais novas, descarta-­‐se as mais antigas, mantendo sempre as últimas 600 amostras analisadas. Pode haver diferença entre as equações de diferentes laboratórios e com isso os resultados em UFC serem diferentes ? A diferença entre as equações é um tema que ganhou destaque na Europa a partir de 2005, quando o grupo conhecido como NRL (National Reference Laboratories) realizou um levantamento com 17 laboratórios em diferentes países da Europa. Em especial, foi verificada qual era a equação de transformação que cada laboratório havia desenvolvido e se o laboratório havia seguido as normas da IDF/ISO (196/21187). O relatório publicado em 2006, mostra que existe grande diferença entre as equações dos laboratórios na Europa. Abaixo gráfico que mostra a correlação entre CBI e UFC para diferentes laboratórios. Uma mesma amostra com CBI de 800 mil pode apresentar resultado de 40 mil UFC (laboratório FR_2) ou então 600 mil UFC (laboratório PT). O exemplo acima mostra que uma amostra com CBI de 800 mil poderia apresentar resultados entre 40 e 600 mil UFC dependendo do laboratório em que é analisada. Este é um problema sério e que preocupa todos os envolvidos na cadeia do leite na Europa. Porém, ao comparar os laboratórios que seguiram a norma IDF/ISO (196/21187) no desenvolvimento das suas equações viram que estes apresentaram resultados muito próximos, como mostra a outra figura abaixo. Uma mesma amostra com CBI de 800 mil pode apresentar resultado de 100 mil UFC (laboratório NL) a 300 mil UFC (laboratório SK). Equação da Clinica do Leite (linha verde) que também adota a ISO/IDF O exemplo acima mostra que as variações são bem menores, e que uma amostra com CBI de 800 mil apresentaria resultados variando no máximo entre 100 a 300 mil UFC, sendo que a maioria dos laboratórios, a diferença seria entre 200 e 300 mil UFC/mL. Respondendo a questão feita inicialmente, pode haver sim grande diferença entre os resultados transformados em UFC, caso os laboratórios não sigam a norma IDF/ISO que tem como objetivo exatamente padronizar os procedimentos . Por exemplo, na figura acima pode-­‐se observar a equação que foi desenvolvida na Clínica do Leite, seguindo-­‐se a norma IDF/ISO e que é muito semelhante, sendo que a relação entre CBI e UFC fica ao redor de 2,8 (UFC é 2,8 vezes menor que a CBI). Atualmente este tema ainda continua em discussão em vários países. Por exemplo, alguns países estão buscando padronizar as equações entre os laboratórios, desenvolvendo uma equação de transformação nacional. Outros estão simplesmente alterando seus padrões para que seja utilizada a contagem bacteriana individual (CBI) diretamente sem necessidade de transformação nos resultados. Considerações finais Fica evidente a necessidade de se padronizar os procedimentos adotados pelos laboratórios. Se houver a adoção de normas como a IDF/ISO, certamente a diferença entre os resultados serão minimizadas. Com isso, ganham produtores e indústrias que passam a confiar nos resultados e não mais se preocupar se um determinado resultado está correto ou não.