JULIANE SELEME BREHMER
ESTUDO DE EXTRATOS DE PLANTAS MEDICINAIS
NO DESENVOLVIMENTO DO TUMOR ASCÍTICO DE
EHRLICH
ITAJAÍ - 2005
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ESTUDO DE EXTRATOS DE PLANTAS MEDICINAIS
NO DESENVOLVIMENTO DO TUMOR ASCÍTICO DE
EHRLICH
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
JULIANE SELEME BREHMER
Itajaí, Agosto de 2005.
ii
“Deus não escolhe os preparados, prepara os escolhidos.
Fazer ou não fazer algo só depende da nossa vontade e perseverança”
Albert Einsten
iii
Agradecimentos
A Ana Angélica, orientadora e grande amiga, que acreditou em mim muito mais que
eu mesma.
A Darci Sato, pela paciência e ensinamentos e pelo prazer que tem pela pesquisa.
Ao Cechinel, pela orientação com as plantas.
A toda equipe do laboratório, especialmente, Gabriela, Bruno, Miroval, Anna Paula,
Sheila, Michele Cris e Rafael que tratavam os animais e ajudavam na leitura com as
lâminas, meu eterno agradescimento.
A funcionárias do laboratório, Sônia, Tatiana e Andrea.
Ao Pink e Cérebro, Mickey mouse, Topo gigio, Ligeirinho e a todos os ratos de
laboratório. Um dia vou criar um como bixinho de estimação, para purgar os dias em
que fui apenas seu algoz.
As amigas de turma Karina Silva, Roberta Lamim, Vania Noldin e especialmente
Karina Machado e Sheila Santos pelo apoio e amizade em todas as horas.
A Tânia e todos os professores pela oportunidade e ensinamentos.
A Rosélia que sempre atendeu os meus pedidos nas horas mais inoportunas.
A Maria da Salete Sachweh e Argos Gumbowsky, por acredidarem na minha
capacidade e trabalho.
A UnC pela bolsa de mestrado.
A Saraí Hess pela amizade, trabalho e ombro amigo.
Aos alunos de farmácia da UnC de Canoinhas. Pela paciência nos momentos de
ausência, minha amizade e gratidão.
Aos meus funcionários pela compreensão e colaboração.
Aos tios Rita e Carlos, pelos jantares, bate-papo e apoio nos momentos de solidão.
A minha sogra pela ajuda com os filhos e marido.
Ao meu irmão, Geisa, Gabriel e Maria, pela minha ausência nestes quase três anos.
Aos meus pais. Quiçá um dia eu possa ser para os meus filhos, a metade dos “pais”
que vocês são para mim.
iv
Aos meus filhos, que eles saibam que eu sinto falta deles com eles sentem de mim e
que o amor e o sorriso deles fizeram o meu caminhar.
Ao meu marido Adilson, que fez do meu sonho o nosso sonho, que cuidou das
nossas farmácias, dos funcionários, filhos e que ainda achou tempo para cuidar de
mim...... meu orgulho, gratidão e amor.
v
ESTUDO DE EXTRATOS DE PLANTAS MEDICINAIS NO
DESENVOLVIMENTO DO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH
Juliane Seleme Brehmer
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para a obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Produtos Naturais e Análogos
Sintéticos Bioativos, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
_______________________________
Professor Valdir Cechinel Filho, Dr
Orientador
____________________________________
Professora Tânia Mari Bélle Bresolin, Dra
Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:
Professor Valdir Cechinel Filho, Dr
Presidente
Professora Ana Angélica Steil, Dra
Co-orientadora
Professra Ednéia Casagranda Bueno , Dra
Professora Denise Fecchio, Dra
vi
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
ESTUDO DE EXTRATOS DE PLANTAS MEDICINAIS NO
DESENVOLVIMENTO DO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH
Juliane Seleme Brehmer
Agosto/2005
Orientador: Valdir Cechinel Filho, Dr.
Co-orientadora: Ana Angélica Steil
Palavras-chaves: Plantas medicinais, atividade antitumoral, hematopoese
Número de páginas: 71p.
Neste trabalho, foi analisada a ação de sete plantas medicinais: Allamanda schottii,
Aleurites moluccana, Bauhinia microstachya, Bromelia antiacantha, Calophyllum
brasiliense, Ipomoea pes-caprea e Rubus rosaefolius no desenvolvimento do tumor
ascítico de Ehrlich (TAE) e no número de células da medula óssea dos animais
portadores do tumor. Camundongos Swiss foram inoculados com 5.106 células/mL
do TAE e tratados com plantas duas vezes ao dia, por gavagem. O tratamento foi
iniciado no momento da inoculação do tumor. No oitavo dia, os animais foram
sacrificados e avaliados os seguintes parâmetros: ganho de peso, volume ascítico,
número de células por mL e por animal e o número total de células da medula óssea.
Os extratos brutos das folhas de Aleurites moluccana, das raízes de Rubus
rosaefolius, das flores e raízes de Allamanda schottii não tiveram ação no
desenvolvimento do TAE e também não modificaram a hematopoese dos animais. O
extrato bruto das folhas de Allamanda schottii aumentou o crescimento do tumor
mas não alterou a hematopoese. O extrato bruto de Ipomoea pes-caprae aumentou
o crescimento do tumor e aumentou a hematopoese. A fração hexano de
Calophyllum brasiliense não tem ação importante no crescimento do tumor, mas
aumentou a hematopoese. O extrato bruto dos frutos de Bromelia antiacantha
diminuiu o desenvolvimento do tumor, mas não teve efeito sobre a hematopoese. O
extrato bruto das folhas de Bauhinia microstachya diminuiu o crescimento do tumor e
aumentou a hematopoese, porém, a fração acetato de etila aumentou a
hematopoese sem interferir no desenvolvimento do TAE. Os resultados obtidos com
estas plantas, nas doses testadas, indicam que o extrato bruto de Bauhinia
microstachya se mostrou o mais interessante para os estudos que visam avaliar os
mecanismos de ação sobre o crescimento tumoral. Na seqüência foi avaliada a
influência do tratamento dos camundongos portadores e não-portadores do tumor
com este extrato, na ativação de células peritoneais após inoculação de carragenina.
O tratamento dos camundongos com o extrato não alterou a redução de MTT, mas
reduziu a produção de óxido nítrico por células peritoneais provenientes de
camundongos não-portadores do tumor.
vii
Abstract of a dissertation presented to Univali in partial fulfillment of the require
ments of the Máster’s Degree in Pharmaceutical Science
STUDY OF MEDICINAL PLANTS EXTRACTS IN THE
DEVELOPMENT OF ERLICH ASCITIC TUMOR
Juliane Seleme Brehmer
August/2005
Advisor: Valdir Cechinel Filho, Dr.
Co-advisor: Ana Angélica Steil, Dra
Key-words: Medicinal plants, activity tumor, hematopoietic.
Number of Pages: 71p.
In this work, the action of seven wild plants with medicinal uses was analyzed:
Allamanda schottii, Aleurites moluccana, Bauhinia microstachya, Bromelia
antiacantha, Calophyllum brasiliense, Ipomoea pes-caprea and Rubus rosaefolius in
terms of the development of the Ehrlich ascitic tumor (EAT) and the bone marrow cell
cunt of tumor-bearing animals. Swiss mice were inoculated with 5.106 cell/mL of EAT
and treated with the plants twice a day, by per os. The treatment began at the
moment of inoculation of the tumor. On the eighth day, the animals were sacrificed
and appraised the following parameters appraised: weight gain, ascitic volume,
number of cells per mL and per animal and the total number of the bone marrow
cells. The crude extracts of the leaves of Aleurites moluccana, of the roots of Rubus
rosaefolius, and of the flowers and roots of Allamanda schottii showed no action in
the development of EAT and did not modify the hematopoietic of the animals. The
crude extract of the leaves roots of Allamanda schottii increased the growth of the
tumor it didn'
t alter the hematopoietic. The rude extract of Ipomoea pes-caprae
increased the growth of the tumor and also increased the hematopoietic. The hexane
fraction of Calophyllum brasiliense did not alter the development of the tumor, but
increased the hematopoietic. The crude extract of the fruits of Bromelia antiacantha
reduced the development of the tumor, but it had no effect on the hematopoietic. The
crude extract of the leaves of Bauhinia microstachya reduced the growth of the tumor
and increased the hematopoietic, however, the ethyl acetate fraction increased the
hematopoietic without interfering in the development of EAT. The results obtained
with these plants, in the tested doses, indicate that the crude extract of Bauhinia
microstachya proved to be the most interesting, in relation to studies which seek to
evaluate the action mechanisms of the tumor growth. Next, the sequence the
influence of the treatment of the mice bearers and not-bearers of the tumor bearing
and non-bearing mice was evaluated, with this extract in the activation of peritoneal
cells following carragenan inoculation. The treatment of the mice with the extract did
not alter the reduction of MTT, but it reduced the production of nitric oxide for
peritoneal cells coming from non tumor-bearing mice.
viii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................1
2 OBJETIVOS............................................................................................................3
2.1 OBJETIVO GERAL ..............................................................................................3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................3
3 EMBASAMENTO TEÓRICO....................................................................................4
3.1 NEOPLASIAS........................................................................................................4
3.2 SISTEMA IMUNOLÓGICO E CÂNCER ................................................................5
3.3 TUMOR DE EHRLICH...........................................................................................8
3.4 Compostos farmacológicos oriundos de produtos naturais ...................................9
3.5 Plantas de interesse para este estudo ................................................................10
3.5.1 Aleurites moluccana .........................................................................................10
3.5.2 Rubus rosaefolius.............................................................................................11
3.5.3 Allamanda schotti ...........................................................................................12
3.5.4 Ipomoea pes-caprae..........................................................................................14
3.5.5 Bromelia antiacantha........................................................................................ 15
3.5.6 Calophyllum brasiliense.....................................................................................16
3.5.7 Bauhinia microstachya......................................................................................17
4 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................20
4.1 Animais.................................................................................................................20
4.2 Manutenção do tumor..........................................................................................20
4.3 Determinação do número de células viáveis .......................................................20
4.4 Avaliação do crescimento do tumor ascítico .......................................................20
4.5 Determinação do número de células da medula óssea.....................................221
4.6 Indução da resposta inflamatória com carragenina na cavidade peritoneal ......221
4.7 Determinação da atividade metabólica celular ....................................................22
4.8 Determinação da produção de NO por células peritoneais .................................22
4.9 Extratos das plantas ............................................................................................23
4.8 Análise estatística ........................................................................................................... 23
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................25
5.1 Aleurithes moluccana.......................... ...............................................................25
5.2 Rubus rosaefolius.................................................................................................27
ix
5.3 Allamanda schottii................................................................................................29
5.4 Ipomoea pes-caprae.............................................................................................34
5.5 Bromelia antiacantha...........................................................................................36
5.6 Calophyllum brasiliense.......................................................................................38
5.7 Bauhinia microstachya ........................................................................................40
5.8 Efeito do tratamento com o extrato bruto de Bauhinia microstachya na ativação
de células peritoneais ..........................................................................................45
CONCLUSÕES .........................................................................................................50
REFERÊNCIAS.........................................................................................................51
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01 - Aleurites moluccana
11
FIGURA 02 - Rubus rosaefolius
12
FIGURA 03 - Allamanda schottii
13
FIGURA 04 - Ipomoea pes-caprae
14
FIGURA 05 - Bromelia antiacantha
15
FIGURA 06 - Calophyllum brasiliense
17
FIGURA 07 - Bauhinia microstachya
19
FIGURA 08 – Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de
26
Aleurites moluccana
FIGURA 09- Efeito do tratamento com o extrato bruto das raízes de
28
Rubus rosaefolius
FIGURA 10 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das flores de
31
Allamanda schotti
FIGURA 11 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das raízes de
32
Allamanda schottii
FIGURA 12 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de
33
Allamanda schottii
FIGURA 13 - Efeito do tratamento com o extrato bruto de Ipomoea pes-
35
caprae
FIGURA 14 - Efeito do tratamento com o extrato bruto dos frutos de
37
Bromelia antiacantha
FIGURA 15 - Efeito do tratamento com a fração hexânica das folhas de
39
Calophyllum brasiliense
FIGURA 16 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de
43
Bauhinia microstachya
FIGURA 17 - Efeito do tratamento com a fração acetato de etila das
44
folhas de Bauhinia microstachya
FIGURA 18- Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de
48
xi
Bauhinia microstachya na redução de MTT
FIGURA 19 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de
Bauhinia microstachya na produção de NO
49
1 INTRODUÇÃO
O câncer ou neoplasia é uma doença de natureza crônica que mata pela
invasão destrutiva de órgãos normais por extensão direta e/ou disseminação para
pontos distantes (metástases) (KUMAR; COTRAN, 2000; BRASILEIRO FILHO,
2004).
De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer
atinge 9 milhões de pessoas, matando 5 milhões a cada ano, sendo a segunda
causa de morte por doença. A OMS alerta para o fato de que, se não forem tomadas
medidas de prevenção, a incidência de câncer aumentará em 100% nos próximos 20
anos (BRASIL, 2003).
A importância das neoplasias localiza-se em seus efeitos sobre as pessoas.
Todos os tumores, até mesmo os não invasivos, podem causar morbidade e
mortalidade. Além disso, cada novo crescimento tumoral requer cuidadosa avaliação
devido ao receio de que seja canceroso (KUMAR; COTRAN, 2000).
O principal objetivo do tratamento das neoplasias é obter a completa
erradicação das células tumorais. Tal resultado pode, muitas vezes, ser obtido
através de procedimentos como cirurgia, radioterapia e quimioterapia, utilizados de
forma isolada, ou em associação (KUMAR; COTRAN, 2000; BRASILEIRO FILHO,
2004).
A cirurgia é o meio simples e seguro para remover tumores sólidos mas não
na maioria dos pacientes que apresentam a doença metastática. A radioterapia pode
ser curativa para tumores localizados, preservando a estrutura e funcionamento do
órgão ou tecido, mas tem suas limitações no tratamento de tumores volumosos. Já a
quimioterapia, um tratamento que envolve o uso de fármacos citotóxicos deveria
erradicar o câncer sem prejudicar os tecidos normais, mas a maioria destas drogas
causa significativos efeitos colaterais. Esses fármacos são mais efetivos contra
tumores de proliferação rápida do que contra alguns dos tumores de crescimento
lento e são mais tóxicos para células de crescimento rápido do que para os tecidos
normais do hospedeiro. Entretanto, tais agentes antiproliferativos podem ter
importantes efeitos tóxicos colaterais em tecidos normais que se dividem
rapidamente, como a medula óssea, mucosa gastrintestinal e pele (KO; WANG;
FERRONE, 2003; BUBENÍK; VONKA, 2003).
2
O emprego das terapêuticas convencionais, além dos efeitos colaterais e do
custo elevado, muitas vezes não permite a total erradicação das neoplasias. Assim,
outras alternativas têm sido propostas, como a terapia biológica, que leva em
consideração os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro e que constitui um
resultado de uma melhor compreensão dos mecanismos básicos de defesa
antitumoral (JANEWAY; WALPORT; SHLOMCHIK, 2002).
A necessidade de agentes antiinvasivos e/ou tumoricidas mais eficientes e
menos onerosos tem levado à busca de novos compostos com ação farmacológica
tanto no controle do crescimento das células tumorais como na modulação das
moléculas de adesão que permitem as metástases. Neste sentido, nos últimos anos
tem crescido também o interesse por produtos de origem vegetal na busca de
terapias mais eficazes. Nos Estados Unidos, entre 1983 e 1994, 60% dos
medicamentos anticancerígenos aprovados eram de origem vegetal (NEWMANN;
GRAGG; SNADER, 2003;).
O conhecimento que temos sobre o câncer nos mostra que tumores são
capazes de escapar do sistema imunológico. Pesquisar plantas que possam agir
como imunoestimuladoras e que possam aumentar a fraca resposta imune do
hospedeiro a estes tumores pode ser a chave para a cura desta doença.
3
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade, frente ao crescimento do tumor ascítico de Ehrlich (TAE),
de sete plantas em estudo no Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
(NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), e investigar alguns
mecanismos imunológicos importantes no combate ao tumor, frente ao tratamento
dos animais com uma planta selecionada.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar se as seguintes plantas: Aleurites moluccana, Rubus rosaefolius,
Allamanda
Calophyllum
schottii,
Ipomoea
brasiliense,
pes-caprae,
Bauhinia
Bromelia
microstachya;
antiacantha,
modificam
o
desenvolvimento do tumor ascítico de Ehrlich (TAE) em camundongo;
- Determinar se o extrato destas plantas altera o número de células totais da
medula óssea dos animais portadores do TAE;
- Escolher uma planta que apresente boa atividade antitumoral e investigar
se o tratamento dos camundongos com esta planta modifica a atividade
metabólica e a produção de óxido nítrico por células peritoniais de animais
portadores e não portadores do tumor, frente a um estímulo inflamatório.
4
3 EMBASAMENTO TEÓRICO
3.1 NEOPLASIAS
Neoplasia é uma massa tumoral anormal de tecido cujo crescimento excede
e está descoordenado daquele dos tecidos normais, persistindo da mesma forma
excessiva após cessar os estímulos que despertam esta alteração. O termo tumor
atualmente é aplicado quase que exclusivamente para massas neoplásicas.
Segundo a sua origem, tumor significa tumefação produzida não somente por
células neoplásicas e sim por edema ou hemorragia num tecido (KUMAR; COTRAN,
2000; BRASILEIRO FILHO, 2004).
Os tumores podem ser classificados em invasivos (malignos) e não
invasivos (benignos). Os tumores não invasivos apresentam atipia celular discreta,
ou seja, reproduzem o tecido que lhe deu origem. Geralmente não são letais e têm
crescimento lento. Estes tumores são formados por células que crescem unidas, não
se infiltrando em tecidos vizinhos, e formando geralmente, uma massa esférica.
Esse mecanismo lento permite a formação de vasos sanguíneos assegurando boa
nutrição e evitando degenerações e necrose. Por outro lado, os tumores invasivos
ou câncer, apresentam alta atipia celular, com propriedades morfológicas e
bioquímicas muito distintas do tecido que lhe deu origem. São tumores que crescem
rapidamente devido à velocidade da multiplicação de suas células. Podem ocorrer
degenerações, ulcerações, necroses e hemorragias porque os vasos sanguíneos
não crescem no mesmo ritmo das células tumorais (COUSSENS; WERB, 2002;
BRASILEIRO FILHO, 2004).
As neoplasias são originadas de apenas uma ou de algumas células normais
que sofreram transformação. O processo de crescimento anormal dos tumores é o
reflexo de complexas anormalidades fisiologicas resultantes da expressão de genes
virais mutados e/ou de expressão desregulada de genes normais (KUMAR;
COTRAN, 2000; BRASILEIRO FILHO, 2004).
O câncer ou neoplasia maligna é uma doença de natureza crônica que
possui repercussão de ordem econômica e social de grande monta. Dentre os
custos diretos, estão os gastos com prevenção, o diagnóstico e o tratamento. Para o
5
seu diagnóstico e tratamento são exigidos equipe multiprofissional altamente
especializada, de formação e manutenção onerosa, e o emprego de tecnologia
sofisticada
e
dispendiosa.
Exige-se
também
internação
hospitalar
e
acompanhamento ambulatorial freqüente. Nos custos indiretos estão computadas as
perdas de produção, o tempo potencial do trabalho perdido, da mortalidade,
morbidade e incapacidade provocada por esta doença (BRASIL, 2003).
A incidência dos diferentes tipos de tumores em todo o mundo podem estar
relacionadas a influências ambientais como práticas individuais, hábitos alimentares
e crescimento da urbanização, tendo como conseqüência o estresse e a poluição.
Outro fator que pode influenciar na ocorrência de mortes por câncer é a idade, pois
ocorre maior incidência entre 55 e 75 anos. Este fato pode ser explicado pelo
acúmulo de mutações somáticas nesta faixa etária e que estão
associadas ao
surgimento de neoplasias malignas. Entretanto, não é estranha a ocorrência de
câncer em jovens, sendo que nestes o câncer mais comum é a leucemia
(MONTENEGRO; FRANCO, 1999).
Acredita-se que as causas do câncer seriam uma mistura destes
componentes ambientais e alterações genéticas. Os incríveis avanços na biologia
molecular e genética esclarecem os elementos moleculares básicos do câncer. A
compreensão sobre esses eventos será de suma importância no controle do câncer
e que devem levar a terapias melhores, e possivelmente a prevenção da doença
( MOTULSKY, 2000; ADAM; ODHAV; BLOOLA, 2003; PAWELEC, 2004).
3.2 SISTEMA IMUNOLÓGICO E CÂNCER
O sistema imune é constituído por células e moléculas responsáveis pela
manutenção da homeostase, ou seja, a imunidade a substâncias estranhas como
bactérias, fungos, vírus e parasitas, bem como a eliminação de células neoplásicas
(ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003; BUBENÍK; VONKA, 2003).
O sistema imunológico é dividido em sistema inato (natural ou inespecífico)
e adaptativo (adquirido ou específico). As características da imunidade inata são de
uma limitada capacidade para distinguir um micróbio do outro, e sua natureza
regularmente esteriotípica, segundo a qual o sistema imune funciona quase do
mesmo modo contra a maioria dos agentes infecciosos. Os principais componentes
6
desta imunidade são o sistema complemento, as células fagocíticas (neutrófilo e
macrófago) e as células NK (“Natural Killer”). O sistema imune específico, composto
pelos linfócitos T e B, produzem uma resposta imune caracterizada pela
especificidade, diversidade, memória imunológica, autolimitação e discriminação
entre o próprio e o não próprio. Esta imunidade pode ser classificada em humoral e
celular. A imunidade humoral é mediada pelos anticorpos produzidos pelos linfócitos
B, comandados por citocinas liberadas pelos linfócitos TH2. Já a imunidade celular
é comandada pelos linfócitos TH1 e, dentre as células efetoras, destacam-se os
linfócitos T citolíticos, os macrófagos e as células NK. O sistema imune age através
destas duas imunidades na defesa do organismo, inclusive para eliminar células
tumorais. A resposta imune mediada por células é mais eficaz contra os tumores,
principalmente os tumores sólidos, do que a
resposta humoral. No entanto, a
imunidade humoral também coopera com a resposta celular, sendo o efeito final
dependente da ação conjunta das imunidades celular e humoral (BALLOW;
NELSON, 1997; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003; ROITT; BROSTOFF; MALE,
2003; ADAM; ODHAV; BLOOLA, 2003).
Embora ambas as unidades atuem no controle e combate ao tumor, há um
elevado índice de morte de indivíduos por câncer, mostrando que a resposta imune
contra o tumor é, muitas vezes, ineficiente. Sabe-se também que o sistema imune é
efetivo para remover células tumorais precocemente em seu desenvolvimento
quando estas células possuem antígenos tumorais reconhecidos por linfócitos.
Entretanto, quando as células tumorais apresentam poucos antígenos tumorais
específicos, o sistema imune se torna ineficaz. Além disso, algumas células tumorais
possuem mecanismos que contribuem para a evasão da resposta imunológica. Tais
mecanismos incluem a não expressão ou subexpressão de moléculas de MHC
(complexo de histocompatibilidade principal) de classe I e/ou de moléculas
coestimulatórias, inverção da proporção de linfócitos CD4/CD8 infiltrados na massa
tumoral e a produção de fatores imunossupressores como algumas citocinas
(JANEWAY; WALPORT; SHLOMCHIK, 2002; ADAM; ODHAV; BLOOLA, 2003;
PAWELEC, 2004).
Os macrófagos são células importantes na imunidade humoral e celular
como células apresentadoras de antígenos, para iniciar a resposta imune, e como
células efetoras para mediar lise tumoral. Macrófagos residentes não são citolíticos
para células tumorais in vitro, mas eles tornam-se citolíticos se ativados com fatores
7
de ativação de macrófagos (MAF). As células T secretam o MAF após a estimulação
antígeno-específico, assim a participação do macrófago como célula efetora é
dependente da ativação da célula T. Tal afirmação é suportada por estudos que
mostram que macrófagos isolados de tumores imunogênicos sofrendo regressão
exibem atividade tumoricida, enquanto macrófagos isolados de tumores que sofrem
progressão e não são imunogênicos geralmente não apresentam atividade
citotóxica. As linfocinas de células T com atividade MAF incluem IFN-γ (interferon-γ),
TNF (tumor necrose factor) e GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stímulating
factor) (GREENBERG, 1994; SANTOS-BERGAMI; MARIO; BARBUTO., 2004).
Alguns autores acreditam que os macrófagos são as células mais eficazes
na destruição de células tumorais. Dados in vitro e in vivo mostram que macrófagos
ativados lisam células cancerosas por meio da produção de TNF-α e óxido nítrico
(NO), pela liberação de radicais livres de oxigênio ou por citotoxidade celular
dependente de anticorpos (ADCC). Vários fatores aumentam o poder tumoricida dos
macrófagos, com o IFN-γ, componentes do Bacillus Calmett-Guerin (BCG) e do C.
parvum, polímeros artificiais, endotoxinas de bactérias Gram-negativas ou produtos
de alguns protozoários (T. cruzi, T. gondii) (COUSSENS; WERB, 2002).
Os macrófagos também representam um importante componente do
infiltrado linforeticular do tumor. Eles são chamados de macrófagos associados ao
tumor e apresentam um complexo relacionamento com as células tumorais. De um
lado, os dois tipos celulares produzindo fatores de crescimentos recíprocos, os
macrófagos induzindo a vascularização e as células tumorais liberando fatores
capazes de induzir a migração quimiotática dos monócitos. Por outro lado,
macrófagos associados ao tumor podem ser ativados para eliminar as células
tumorais e inibir o crescimento do tumor. O resultado da interação depende do
número de monócitos recrutados in situ e seu estado de ativação, bem como das
propriedades intrínsecas das células tumorais (MONTOVANI et al., 1992; SANTOSBERGAMI; MARIO; BARBUTO., 2004),
Os mecanismos efetores, tanto os da imunidade celular quanto os da
imunidade humoral, têm demonstrado matar células tumorais in vitro. O desafio para
os imunologistas estudiosos de tumores é determinar qual desses mecanismos pode
contribuir de forma mais importante para as respostas imunes protetoras contra os
diferentes tipos de tumores, aumentando a eficiência desses mecanismos de modo
8
tumor-específicos, pois sabe-se que tumores malignos são capazes de evadir ou
superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (ABBAS; LICHTMAN; POBER,
2003; BUBENÍK; VONKA, 2003; SANTOS-BERGAMI; MARIO; BARBUTO., 2004).
Os avanços do conhecimento sobre o sistema imune e dos antígenos das
células tumorais estimularam muitas estratégias de combate a esta doença,
destacando a imunoterapia que se destina a aumentar a fraca resposta imune do
hospedeiro aos tumores. O potencial para tratar pacientes com câncer pelas
abordagens imunológicas tem sido muito promissor para imunologistas e
oncobiólogos. A principal razão para o interesse na abordagem imunológica é que
as respostas imunes aos tumores poderão ser específicas para os antígenos
tumorais e não deverão lesar as células normais (JANEWAY; WALPORT;
SHLOMCHIK, 2002; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003; ROITT; BROSTOFF;
MALE, 2003).
3.3 TUMOR DE EHRLICH
O tumor de Ehrlich foi descrito inicialmente por Ehrlich e Apolant em 1905
como um adenocarcinoma mamário de camundongos. Este tumor experimental é
mantido até hoje por transplantes sucessivos no tecido subcutâneo ou no peritônio
de camundongos, desenvolvendo-se na forma sólida e ascítica, respectivamente
(SIGIURA, 1965). Na forma sólida o tumor de Ehlich apresenta extensas áreas de
necrose. Estas são oriundas da morte das células neoplásicas, a qual é bastante
intensa já na primeira semana pós-inoculação. Células anaplásicas com intensa
atipia são comumente vistas por microscopia. O tumor nesta forma possui poucas
células inflamatórias, estroma escasso e alto índice mitótico e de invasibilidade,
constituindo um excelente instrumento para o entendimento do comportamento dos
tumores malignos (GUERRA, 1983).
O exame macroscópio da forma ascítica, depois de aproximadamente sete
dias de implante na cavidade peritoneal revela a presença de grande quantidade de
fluído discretamente viscoso e de aspecto leitoso. Após o décimo dia de inoculação
intraperitoneal do tumor, cerca de 90% das células peritoneais são células tumorais
(GUERRA, 1983; FECCHIO et al., 1990; SANTOS-BERGAMI, 2004).
9
3.4 COMPOSTOS BIOATIVOS ORIUNDOS DE PRODUTOS NATURAIS
As plantas, desde os primórdios dos tempos, são fundamentais tanto na
alimentação quanto na cura de enfermidades. A utilização delas é uma prática
generalizada na crença popular e nas várias formações culturais que as usam como
recurso terapêutico. Tal valorização ocasionou um crescimento na procura de
informações comprovadas cientificamente sobre a segurança e eficácia terapêutica
destas plantas (COSTA, 1994; ROBBERS et al., 1997; SIMÕES et al., 1999 apud
CECHINEL-FILHO; BRESOLIN, 2003).
Aproximadamente 1/3 de todos os fármacos aprovados pela Food and Drugs
Administration (FDA) utilizados na medicina convencional tem sua origem de plantas
(SANDESAI, 2002). Estudos revelam que atualmente cerca de 120 substâncias
puras, isoladas de plantas, em geral através de indicações da medicina popular e
estudos fitoquímicos bio-direcionados, são usadas com finalidades terapêuticas
( CECHINEL FILHO;YUNES 2001; PINTO et al., 2002; NIERO et al., 2002).
Neste contexto, a pesquisa de novas substâncias oriundas de plantas
medicinais vêm ganhando grande dimensão, incentivando cada vez mais a pesquisa
por medicamentos que possam contribuir no tratamento das enfermidades que
acometem a população, como no tratamento de doenças do sistema sanguíneo
(SIMÕES et al., 2003; DAS DORES et al., 2003). Como resultado desta busca
incessante de novos fármacos, incluindo para o combate ao câncer, pode-se
mencionar um dos medicamentos originário de plantas mais promissores, o
diterpeno taxol, isolado da Taxus brevifolia, atualmente desenvolvido pelo Instituto
Nacional do Câncer e
pela
Companhia Bristol-Myer Squibb
(CORRÊA, 1995;
SIMÕES et al., 2003). Ainda que exista uma ampla variedade de compostos ativos
de origem natural que possam ser relacionados futuramente como medicamentos,
os desafios estão centrados principalmente em métodos farmacológicos apropriados
e ensaios biológicos que possam predizer uma certa eficácia clínica à substância
em estudo (HOSTETTMAN, 1997).
A escolha das plantas a serem avaliadas em um estudo deve ser feita de
forma cuidadosa, observando o uso e forma de administração na medicina popular,
bem como os possíveis efeitos tóxicos observados. Aliado a isto, faz-se necessário
10
o conhecimento e experiência da população e da cultura local ou informações
sobre composição química, relacionando ao gênero ou família e dos possíveis
compostos com atividade química e farmacológica definidas presentes na planta em
estudo (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998).
3.5 PLANTAS DE INTERESSE PARA ESTE ESTUDO
3.5.1 Aleurites moluccana
Planta da família Euphorbiaceae, nativa da Ásia e Polinésia, que aclimatouse bem no sul do Brasil, de São Paulo ao Rio Grande do Sul. O cultivo no estado de
Santa Catarina se dispersa entre os municípios de Florianópolis e Itajaí, florescendo
de novembro a abril. Conhecida como nogueira, nogueira de Iguape, nóz da índia,
nogueira-de-bancul, nogueira da índia, na medicina popular é utilizada para diversas
patologias como: febre, inflamações, hepatite, dores de cabeça, asma, conjuntivite,
úlceras, diarréia, hepatite, antirreumática, antitumoral entre outras (DUKE, 1991;
HOPEt et al., 1993 apud MEYRE-SILVA, 2003). Estudos científicos têm confirmado
sua atividade antinoceptiva (MEYRE-SILVA et al., 1999), anticolesterolêmica
(PEDROSA et al., 2002) e atividade contra vírus HIV (APERS et al., 1999).
Plantas do gênero Aleurites, quanto aos seus componentes químicos,
possuem,
principalmente
esteróis,
taninos,
hidrocarbonetos
e
flavonóides.
Investigações químicas com as cascas de Aleurites moluccana levaram ao
isolamento do composto pruceanol, um diterpeno da série rara de cleistantol, o qual
ainda não existe relatos de efeitos farmacológicos (MEYRE-SILVA, 2003).
Das folhas desta planta já foram isolados triterpenos α e β-amirinona. Outros
compostos, presentes nas folhas desta planta, o swertisina β e α-amirina e a mistura
de esteróides, estigmasterol, β-sitosterol e campesterol, que também são
encontrados em todas as partes da planta, contribuem para a atividade
antinociceptiva (MEYRE-SILVA et al, 1999). O composto β-sitosterol tem sido
associado à atividade antitumoral (PARK et al., 2003; JU et al., 2004).
O ácido acetil aleuritólico, um triterpeno, o qual possui atividade analgésica e
antibacteriana, foi encontrado nas cascas e raízes. Relatos da literatura indicam que
11
triterpenos podem agir como antitumorais (DIRSCH, et al.,1997; PLOHMANN, et al.,
1997; CORSINO et al., 2000).
Figura 01 - Aleurites moluccana
http://www.ctahr.hawaii.edu/forestry/Data/photos/aleurites_moluccana_flwr2.jpg&img
refurl
3.5.2 Rubus rosaefolius
Da família Rosaceae, as rosáceas do gênero Rubus conhecidas como
amoras do mato, compreendem três espécies. A Rubus rosaefolius Smith é um
arbusto escandente de panículas de flores brancas e frutos vermelhos, ocos por
dentro. Os ramos têm pêlos glandulares, são oculeados, têm folhas compostas de 2
a 6 pares de folículos oval-lanceolados, duplamente denteados (PENNA, 1946). Os
frutos são comestíveis e antidiarreicos (YOON; WROLSTAD, 1984). Estudos
12
farmacológicos com plantas deste gênero revelaram ação analgésica, hipoglicemica
(NOVAES et al. 2002; KANEGUSUKU et al., 2002).
Estudos feitos pelos pesquisadores do NIQFAR revelaram que triterpernos
como o Niga-ichigosede, isolado da espécie imperialis demonstrou potente efeito
analgésico (NIERO et al., 1998; KANEGUSUKU et al., 2002). Na espécie rosaefolius
foram feitos estudos botânicos, fitoquímicos e comprovação da atividade
antimicrobiana (MAURO et al., 2002).
Figura 02 - Rubus rosaefolius
http://. www.botany.hawaii.edu/.../ rub_ros_klove.jpg
3.5.3 Allamanda schottii
Planta da família Apocynaceae, com 200 gêneros e 2000 espécies, de
distribuição tropical e subtropical em todo o mundo.
O gênero Allamanda
é
constituído por 3 espécies. A espécie A. cathartica é utilizada pela medicina popular
como purgativo, catártico, vermífugo, em afecções do baço, em tumores hepáticos,
13
entre outros. Trabalhos farmacológicos com um composto isolado da planta,
denominado allamandina, mostrou atividade in vivo contra leucemia P-388 em ratos
e in vitro contra células derivadas de carcinoma humano nasofaringeal (KUPCHAN
apud MALHEIROS, 1995). A espécie A.schottii é utilizada em jardinagens como
planta de ornamentação e embora não seja utilizada como medicamento, os estudos
em andamento, realizados por um grupo da Universidade Federal de Santa Catarina
(UFSC), indicam que esta planta possui compostos parecidos com os compostos
das plantas do mesmo gênero (NAVARRO, 2004).
Figura 03 - Allamanda schottii
http://www.kartuz.com/f/r/alla-schottii.jpg
14
3.5.4 Ipomoea pes-caprae
Planta da família Convolvulaceae, é encontrada no Brasil na costa litorânea.
Conhecida popularmente como salsa-da-praia, pé-de-cabra, batateira-da-praia, a
Ipomoea é utilizada em na medicina popular para processos dolorosos
e
inflamações além de problemas digestivos.Trabalhos científicos comprovam sua
ação antiinflamatória
e antinoceptiva, hipoglicemica (KROGH et al., 1999; DE
SOUZA et al., 2000).
A atividade antiespasmódica foi atribuída a dois compostos, o βdamascenone e E-phytol, mostrando ser estes compostos antagonistas da
contração muscular, podendo estes serem usados também em dermatites causadas
por toxinas que estimulem a contração vascular (PONGPRAYOON et al,1992 ).
Outros compostos isolados desta espécie, como o ácido betulínico,
e
amirin,
acetatos, isoquercitrinas etc, demonstraram pronunciada atividade antinociceptiva, o
que justifica, em partes, o uso popular em tratamentos de processos dolorosos (DE
SOUZA et al, 2000). Seguindo esta linha, compostos como O hidroxi-4,4,7-trimetil1(4H)-naphthalenone(1), (-)-mellein(2), eugenol(3) e 4-vinil-guaiacol, demonstraram
importante inibição da síntese de prostaglandinas in vitro (POGPRAYOON, 1991),
mostrando que
extrato da Ipomoea age também na inibição do processo
inflamatório.
Figura 04 - Ipomoe pes-caprae
http://www.barbadine.com/images/Ipopescaprae1.jpg
15
3.5.5 Bromelia antiacantha
Da família Bromeliaceae, com 60 gêneros e mais de 1400 espécies. O
gênero Bromelia, compreende 50 espécies originárias da América Central, América
do Sul e Antilhas. A Bromelia antiacantha conhecida também como gravatá, banana
do mato, caraguatá. Planta nativa da mata atlântica do sul do Brasil, encontrada na
submata das araucáreas, esta bromélia não toma a forma de “tanque” para acumular
água, pois necessita de ambientes úmidos e é encontrada no solo (CORREIA,
1984). Algumas plantas desta família são utilizadas como medicinais: Bromelia alta
e Bromelia pinguin como antifúngica (CAMACHO-HERNANDEZ et al., 2002),
Bromelia scarlatina, Bromelia serra e Bromelia sylvicola como antimalárica
(GADELHA, 1994). A Bromelia antiacantha é utilizada pela medicina popular para o
tratamento de tosses, bronquites, aftas e inflamações em geral.
Figura 05 - Bromelia antiacantha
http://www.caire.bio.br/images/Bantiacantha4.jpg
16
3.5.6 Calophyllum brasiliense
Pertence
à
família
Clusiaceae/Guttiferae,
que
é
composta
de
aproximadamente 180 a 200 espécies. A Calophyllum é uma árvore de metros de
altura.
Encontra-se distribuída entre o México, América Central, Venezuela,
Colômbia, Peru, Bolívia e Brasil. No Brasil, podemos encontrá-la desde a região
amazônica até o norte de Santa Catarina. Possui folhas glabras e coriáceas,
perenifólia, característica exclusiva das florestas pluviais localizadas sobre os solos
úmidos e brejosos, vindo a florescer nos meses de setembro a novembro (LORENZI,
1998). A espécie Calophyllum brasiliense é conhecida popularmente como guarandi
ou guanandi, bari ou jacareúba (SANTOS; DE SOUZA, 2000; REYES-CHILPA et
al., 1997).
Esta planta é utilizada pela medicina popular para tratamento de dores,
inflamações e úlceras, entre outras. Algumas espécies do gênero Calophylum são
freqüentemente empregadas na medicina popular para o tratamento de diversas
patologias (SANTORI, 1999). Estudos científicos comprovaram a ação analgésica,
antiinflamatória, antimicrobiana, antiulcerosa (DA SILVA et al., 2001; PRETTO et
al., 2004; EMENDORFER et al., 2005) antifúngica (MOREL et al., 2000; HAY et al.,
2003; OGER et al., 2003).
Plantas do gênero Calophyllum são conhecidas por apresentarem inúmeros
princípios ativos de interesse medicinal. Tem sido realizada extensiva pesquisa
química, resultando no isolamento de diversas classes de compostos incluindo
xantonas, cumarinas, flavonóides, chalconas, benzofuranos, triterpenos, entre outros
(DA SILVA et al., 2001; HAY et al.,2003; OGER et al., 2003; ISAIAS et al., 2004).
Da Silva e colaboradores (2001) analisaram a composição química da folhas
do C. brasiliense e verificaram um possível efeito analgésico de algumas frações e
compostos isolados, comparando com fármacos de referência. Da fração acetato de
etila obtiveram cinco sólidos puros, identificados como quercetina, ácido gálico,
ácido
protocatético,
hiperin
ou
hiperoside
(quercetin-3-O-galactoside),
e
amentoflavona, os quais foram identificados por comparação direta com amostras
autênticas e dados espectrais. Os resultados farmacológicos indicam que as frações
hexano e acetato de etila exibiam efeito antinociceptivo similar aos fármacos de
17
referência, enquanto a fração diclorometano não mostrou atividade farmacológica
nos testes aplicados.
Recentemente, diversos compostos (cumarinas flavonóides e xantonas) de
outra
da espécie Calophyllum panciflorum também demonstraram atividade
preventiva anticâncer (ITO et al., 2002).
Figura 06 - Calophyllum brasiliense
http://www.msu.edu/~vriesend/Calophyllum%20brasiliense.htm
3.5.7 Bauhinia microstachya
A Bauhinia microstachya é uma planta pertencente a família das
Leguminosas, conhecida popularmente como cipó-escada, escada de jabuti ou
escada de macaco. Está amplamente distribuída na região sul do Brasil e ainda no
Uruguai, Argentina e Paraguai (MEYRE-SILVA, 2003). Esta planta apresenta caule
muito extenso, até 20 metros, casca fina, escura, folhas alternadas, pecioladas com
nervuras e gavinhas na base da inflorescência; folhas bilobadas, lobo ovadoobtusos; flores ferrugine, fruto vagem séssil, curto, até 6 centímetros de
18
comprimento . As folhas e cascas são usadas na medicina popular contra diversas
patologias incluindo infecções, inflamações, diabetes, afecções do trato urinário e
respiratório e processos dolorosos (CORRÊA, 1984). Estudos científicos com
espécies do gênero Bauhinia vem comprovando sua atividade antimalárica
(KITTAKOOP et al., 2000) antibacteriana, analgésica (SAVI et al., 1997; MEYRESILVA et al., 2001; DA SILVA et al., 2002), antioxidante (MENEZES et al., 2004) e
antitumoral (RAJKAPOOR et al., 2003; GUPTA et al., 2004).
Os estudos de Meyre-Silva (2000) levaram ao isolamento dos compostos
fenólicos, galato de metila, Kaempferol, 3-O-ramnosil, quercitrina, miricitrina e
epicatequina-3-O-galato; estes todos, da fração acetato de etila do extrato bruto das
folhas da Bauhinia microstachya.
O composto galato de metila tem sido isolado de várias plantas como
derivado do ácido gálico e apresenta atividade antibacteriana e antiviral (SANTOS,
1995 apud MEYRE –SILVA, 2003).
Dados
da
literatura
tem
demonstrado
atividade
antiinflamatória
e
antioxidante da parte aglicona(Kaempferol). O Kaempferol também exibiu atividade
antibacteriana, antiviral, alelopática, antioxidante e hipoglicemiante (BASILE et al.,
2000; LOIZZO et al., 2004; GABRIELSKA; SOCYNSKA-KORDALA; PRZESTALSKI,
2005).
O composto 3-O-ramnosil, um flavonóide somente encontrado em plantas
superiores, foi também encontrado no gênero Bauhinia (MEYRE-SILVA, 2003).
Dados da literatura revelaram atividade antioxidante deste composto (HOPIA,
HEINONEN, 1999).
19
Figura 07 - Bauhinia microstachya
http://www.mobot.mobot.org/W3T/Search/projs/P982).html
20
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram usados camundongos Swiss fêmeas, com peso entre 25 e 30
gramas, criados no biotério central da Universidade do Vale do Itajaí.
A utilização de animais neste estudo foi aprovada pela comissão de ética
o
em pesquisa CEP/UNIVALI sob o n 438/2003.
4.2 MANUTENÇÃO DO TUMOR (TAE)
O líquido ascítico foi aspirado da cavidade peritonial de um animal com um
6
tumor ascítico com seringa de 1 ml e um volume de 0,2 mL contendo 5x10 células,
foi inoculado na cavidade peritonial de 2 animais sadios (BERGAMI-SANTOS;
MARIANO; BARBUTO, 2004).
4.3 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS
O número total de células foi determinado através da contagem em câmara
de Neubauer, usando-se microscópio óptico. Para verificação da viabilidade celular
as células foram diluídas em corante vital azul de Tripan 0.4% imediatamente antes
da contagem, tendo em média 90% de células viáveis (CHIPA ; KAWAKAMI;
TOHYAMA, 1998).
4.4 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR ASCÍTICO
Os animais foram separados em grupos de 10 a 12 camundongos. Todos os
6
animais receberam 5x10 células tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle
recebeu o veículo de diluição do extrato (água , álcool puro 1,4% ou DMSO 1% em
21
água) e o grupo tratado recebeu o extrato da planta também diluída no mesmo
veículo, por gavagem (volume de 5 µL/g de peso), 2 x ao dia por 7 dias. O primeiro
tratamento foi administrado imediatamente antes da inoculação do tumor.
Para determinação do crescimento do tumor ascítico, foi avaliado o peso dos
animais no 1o e 8o dias do experimento. Após a morte dos animais, a cavidade
peritoneal foi lavada com 5 mL salina, sendo determinado o volume recolhido e o
número de células contidas neste volume.
Para contagem do número total de células, a uma alíquota de 100 µl da
suspensão celular diluída com salina foi adicionado 10 µL de solução de cristal
violeta ,(0,5% do corante em ácido acético a 30%) para fixação e coloração das
células. O número das células por mL e por animal foram determinadas através de
contagem em câmara de Neubauer ao
microscópio
óptico (objetiva de 40x)
(BERGAMI-SANTOS; MARIANO ; BARBUTO, 2004).
4.5 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
O fêmur do animal foi extraído e cortado nas suas extremidades distais. Para
a retirada das células, o canal interno do fêmur foi lavado com 3mL de salina. O
líquido celular obtido foi corado com cristal violeta (0,5% em 30% de ácido acético) e
inserido na câmara de Neubauer para a contagem das células foi realizada com o
auxílio de microscópio óptico (objetiva de 40x) (SODERBERG; FLICK; BARNETT,
1996).
4.6 INDUÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA COM CARRAGENINA NA
CAVIDADE PERITONEAL
Camundongos com tumor, receberam 0.2 mg de carragenina, em um volume
de 0.2 mL de salina estéril, pela via intraperitonial. Após 6 horas os animais foram
sacrificados e procedido o lavado da cavidade peritoneal com 5mL de salina .
22
4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE METABÓLICA CELULAR
Foi realizado o teste de MTT (3-(4,5-dimethiazol-2-yl)-2,5-dipheniltetrazolium
bromide) para determinar o nível de respiração celular (viabilidade e/ou ativação
5
celular). Para isto, 4x10 células peritoneais obtidas pela lavagem peritoneal, foram
ressuspendidas em meio de cultura RPMI, foram colocadas em placas de 96 poços
para cultura celular, foi adicionado 10µL de MTT 9-brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5 difeniltetrazolio) contendo 5mg/mL em PBS, em cada poço da placa, seguido
de uma incubação por mais de três horas em estufa a 37°C.
Após este período, um volume de 100µL de uma solução de SDS
(dodecilsulfato de sódio) a 10% em HCI (ácido clorídrico) 0.001N foi adicionado a
cada poço para dissolverem os cristais que foram formados devido a redução do
MTT pelas células que permanecerem vivas. Após 18 horas a DO (densidade ótica)
foi determinada em 540nm (MOSMANN, 1983).
4.8 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO POR CÉLULAS PERITONEAIS
A produção de NO (óxido nítrico) por células peritoneais, induzidas por
carregina, em animais portadores e não portadores do tumor, em cultura foi
determinada através da concentração de nitrito acumulado nas culturas por 48
horas, determinada pelo método de Griess. As células peritoneais foram obtidas
lavando-se a cavidade peritoneal, o lavado peritoneal foi centrifugado e o precipitado
celular foi ressuspendido em meio RPMI suplementando com soro bovino fetal (10%)
e antibióticos(penicilina e estreptomicina). As células foram distribuídas em alíquotas
de 200µl contendo 4x105 células em placas de 96 poços. A produção de nitrito foi
determinada 48 horas após a incubação em estufa 37oC com 5% de CO2,
adicionando-se reativo de Griess e procedendo-se a leitura da D. O. a 540nm (STEIL
et al., 1995)
23
4.9 EXTRATOS DAS PLANTAS
Os extratos testados foram preparados por pesquisadores do NIQFAR /
UNIVALI, em concentração entre 100 e 400mg/Kg.
Foram utilizados extratos brutos metanólicos das flores, folhas, e raízes da
planta Allamanda schottii, cedidos pela professora Dra. Ângela Malheiros.
O extrato metanólico das raízes da planta Rubus rosaefolius e o extrato
metanólico dos frutos da planta Bromelia antiacantha foram cedidos pelo professor
Dr. Rinaldo Niero.
O extrato bruto metanólico das folhas da planta Aleurites mollucana; extrato
bruto metanólico e fração acetato de etila das folhas da planta Bauhinia
microstachya; extrato hexanico das folhas da planta Calophyllum brasiliense; extrato
bruto de toda a planta Ipomoea pes-caprae foram cedidos pelo professor Dr. Valdir
Cechinel Filho.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises foram realizadas com o auxilio do programa de computador
Instat.
Para comparação de dois grupos de amostras com distribuição normal foi
utilizado o teste t de Student bicaudal e para comparações de amostras sem
distribuição normal foi utilizado o teste de Mann-Whitney (U). O nível de significância
adotado para a rejeição da hipótese de nulidade foi de erro de até 5% (p<0,05) em
todas as análises.
24
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com o objetivo de estudar a ação de algumas plantas no crescimento do
tumor ascítico de Ehrlich (TAE), em camundongos, foram selecionadas algumas
plantas em estudo pelos pesquisadores do NIQFAR, com relatos populares e/ou
estudos farmacológicos indicando ação em resposta inflamatória, analgésica ou
antitumoral.
Para o tratamento dos animais, foi escolhida a via oral. A grande maioria
dos estudos deste tipo, relatados na literatura, utilizam a via intraperitoneal para
administração dos extratos, mesmo quando o tumor cresce intraperitonealmente
(HAZRA et al., 2002; RAJESHKUMAR, et al., 2002; MATSUKAKI et al., 2003;
GUPTA et al., 2004). Entretanto, como o tumor é de localização intraperitoneal,
optou-se pela administração do extrato via oral. Isto porque a inoculação do extrato
diretamente sobre o tumor certamente interfere no crescimento tumoral, devido a
inflamação inespecífica no local induzida pelo extrato, independente da existência de
componentes antitumorais. Além disso, a população usa as plantas medicinais na
forma de chás e infusões e a administração do extrato por gavagem mimetiza este
uso, não interferindo diretamente no crescimento do tumor.
Sabendo-se que quase a totalidade dos tratamentos para tumores causam
aplasia de medula óssea (diminuição da produção de células por este órgão),
também foi avaliado se o tratamento dos camundongos portadores do TAE com os
extratos das plantas altera a produção de células pela medula óssea.
O tumor experimental utilizado neste estudo, o TAE, possui crescimento
muito rápido. Assim as mudanças no estabelecimento e desenvolvimento do tumor
são observadas somente quando o tratamento é muito eficiente. Por este motivo,
somado ao fato do estudo ser realizado com extratos brutos, foram utilizadas doses
elevadas dos extratos, de 100 a 400 mg/Kg. Na seqüência encontram-se os
resultados obtidos com as plantas estudadas.
25
5.1 Aleurites moluccana
No presente estudo, foi utilizado o extrato bruto das folhas de Aleurites
moluccana na concentração de 100mg/kg. Analisando-se os resultados obtidos nos
parâmetros usados para avaliar o crescimento do TAE, ganho de peso e volume
ascítico, número de células por mL e por animal, mostrados na figura 8 A a D,
observa-se que os valores do grupo tratado são semelhantes aos valores do grupo
controle. Da mesma forma o extrato não alterou significativamente a hematopoes
dos animais (figura 8E).
A A. mollucana possui a mistura de esteróides, estigasterol, β-sitosterol e
campesterol, e o ácido acetil aleuróico, compostos associados com atividade
antitumoral (DIRSCH et al., 1997; PLOHMANN et al., 1997; MEYRE-SILVA et al.,
1999; CORSINO et al., 2000; PARK et al., 2003; JU et al., 2004).Contudo, o extrato
de Aleurites moluccana, neste estudo, não alterou o desenvolvimento do TAE. Isto
pode ter acontecido devido a baixa concentração destes componentes nas folhas ou
a baixa dose utilizada neste estudo. A utilização de doses mais altas não foi possível
devido a não disponibilidade do material.
26
B
5.0
5
2.5
mL
10
∆
gramas
A
0
Controle
Tratado
Controle
Tratado
100
Células
x 107 / animal
10
Células
x 107 /mL
Controle
D
C
5
0
0.0
Tratado
Controle
50
0
Tratado
E
Células x 104 /
animal
200
100
0
Controle
Tratado
FIGURA 08 - Efeito do tratamento com o extrato bruto de Aleurites moluccana no
ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por ml (C) e por animal (D)
na cavidade peritoneal e no número total de leucócitos na medula óssea (E) de
camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106células tumorais na
cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu 1% de DMSO em água (5µl/g de peso);o
grupo tratado recebeu 100mg/kg do extrato diluído em 1% de DMSO em água, por
gavagem, duas vezes ao dia por sete dias. Os dados representam a média ±EPM de 10
animais do grupo controle e 9 animais do grupo tratado.
27
5.2 Rubus rosaefolius
A dose utilizada do extrato de Rubus rosaefolius neste estudo foi de
200mg/Kg e a ação no crescimento do TAE foi avaliada pelos mesmos parâmetros já
descritos e cujos resultados são apresentados na figura 9. Analisando os resultados
obtidos verifica-se que o tratamento dos camundongos com o extrato desta planta
não alterou de modo significativo o peso, o volume ascítico e o número de células
por mL e pos animal presentes na cavidade peritoneal destes animais figura 9 A a D,
que são os melhores parâmetros para se avaliar o crescimento de um tumor que
cresce na forma ascítica. Similarmente, o número total de leucócitos da medula
óssea observado indica que esta planta também não exerce ação importante na
hematopoese, figura 9E.
Os estudos químicos e o isolamento de compostos desta planta encontramse em andamento, pelo grupo de pesquisadores do NIQFAR. O estudo da espécie
rosaefolius se faz pertinente, visto que os triterpenos encontrados nesta espácie
vegetal são, dentre os metabólicos secundários, uma importante classe de agentes
terapêuticos e que poderiam ter atividade antitumoral (KANEGUSUKU et al., 2002).
28
B
5.0
5
2.5
mL
10
∆
gramas
A
0
Controle
0.0
Tratado
Tratado
D
C
10
100
Células
x 107 /animal
Células
x 107 /mL
Controle
5
0
Controle
50
0
Tratado
Controle
Tratado
E
Células x
104 /mL
200
100
0
Controle
Tratado
FIGURA 09- Efeito do tratamento com o extrato metanólico das raízes de Rubus
rosaefolius o ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por ml (C) e por
animal (D) na cavidade peritoneal e no número total de leucócitos na medula óssea (E) de
camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células tumorais na
cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o grupo tratado
recebeu 200 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas vezes ao dia por sete
dias. Os dados representam a média +/- EPM de 11 animais do grupo controle e 11
animais do grupo tratado.
29
5.3 Allamanda schottii
Como descrito na introdução deste trabalho, foi encontrado na Allamanda
cathartica, um princípio ativo chamado amantadina, com atividade em leucemia P388 em camundongos e in vitro em células de um tumor nasofaringeal humano
(KUPCHAN apud MALHEIROS, 1995). Para avaliar a ação antitumoral no nosso
modelo experimental do TAE proposta neste estudo, foram utilizados três extratos
brutos, preparados a partir das folhas, das raízes e das flores desta planta. Os
três extratos foram utilizados na dose de 200mg/Kg.
Iniciamos os nossos trabalhos testando o extrato bruto das folhas. De modo
semelhante as plantas descritas anteriormente, os parâmetros analisados foram o de
ganho de peso, o volume ascítico e o número de células por mL do lavado peritoneal
e o número de células total por animal. Os resultados obtidos apresentados nas
figuras 10A a D, mostram que o tratamento dos camundongos com o extrato das
folhas desta planta aumentou significativamente o número de células totais na
cavidade peritoneal, (figura 10D). O número total de células por animal é resultado
da multiplicação do volume ascítico do animal pelo número de células por mL deste
volume. Apesar de não haver diferenças estatisticamente significativas no número
de células por mL (figura 10C) e no volume ascítico (figura 10B), observa-se que os
valores do grupo tratado tendem a ser mais altos do que os valores do grupo
controle nestes dois eventos. A união destes dois dados no número de células por
animal resulta na diferença estatisticamente significativa, observada indicando que o
extrato das folhas desta planta pode acelerar ainda mais o crescimento do tumor.
Os resultados obtidos no número de leucócitos da medula óssea, mostram
que o extrato das folhas não teve efeito importante, visto que o número de células da
medula óssea não foram estatisticamente diferentes dos valores apresentados pelo
grupo controle (figura 10E).
O tratamento dos camundongos portadores do TAE com o extrato das
raízes, foi realizado por apenas 5 dias pois o mesmo precipitou. Os animais foram
sacrificados no oitavo dia como nos demais experimentos sendo analisados os
mesmos parâmetros.
Como pode ser observado nas figuras 11A a D, os valores do grupo tratado
foram semelhantes aos do grupo controle em todos os parâmetros utilizados para
30
avaliar o crescimento do tumor. Do mesmo modo, os resultados apresentados na
figura 11E mostram que o extrato bruto das raízes da Allamanda shottii não altera o
número total de leucócitos da medula óssea dos animais portadores do TAE . De
forma semelhante, o extrato das folhes de Allamanda shottii não altera de forma
significativa o crescimento do TAE (figura 12A a D), nem o número de leucócitos da
medula óssea (figura 12E).
Tomados em conjunto, os resultados obtidos com esta planta não apontam
qualquer ação positiva no controle do crescimento do tumor ascítico de Ehrlich. Com
estes resultados verificou-se a importância de estudos mais
criteriosos com as
plantas medicinais. Isto porque, como observado na espécie Allamanda aqui
estudada, temos um aumento no crescimento de um tumor experimental, ao
contrário de outra Allamanda do mesmo gênero que diminui o crescimento de outros
tumores experimentais (KUPCHAN apud MALHEIROS, 1995).
31
B
A
7.5
∆ gramas
10
mL
5.0
0
Controle
0.0
Tratado
C
Tratado
100
Células
x 107 / animal
Células
x 107 / mL
Controle
D
10
5
0
2.5
Controle
Tratado
*
50
0
Controle
Tratado
E
Células x 104 /
mL
200
100
0
Controle Tratado
FIGURA 10 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de Allamanda schotti no
ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por ml (C) e por animal na
cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula óssea (E) de
camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células tumorais na
cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu1,4% de álcool puro em água (5µl/g de
peso); o grupo tratado recebeu 200 mg/kg do extrato em 1,4% de álcool puro diluído em
água, por gavagem, duas vezes ao dia por sete dias. Os dados representam a média +/EPM de 12 animais do grupo controle e 10 animais do grupo tratado. *p<0,05
comparado ao grupo controle.
32
B
A
5
2.5
∆
mL
5.0
gramas
10
0
Controle
0.0
Tratado
C
Tratado
Controle
Tratado
D
10
100
Células
x 107 / animal
Células
x 107 /mL
Controle
5
0
Controle
50
0
Tratado
E
Células x 104 /
animal
200
100
0
Controle
Tratado
FIGURA 11 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das raízes de Allamanda
schottii no ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por ml (C)
e por animal na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula
óssea (E) de camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106
células tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu 1,4% de álcool
puro em água (5µl/g de peso); o grupo tratado recebeu 200 mg/kg do extrato diluído
em1,4% de álcool puro em água,por gavagem, duas vezes ao dia por sete dias.Os
dados representam a média +/- EPM de 12 animais do grupo controle e 11 animais
do grupo tratado.
33
B
A
5.0
mL
5
2.5
∆
gramas
10
0
Controle
Tratado
C
0.0
Tratado
Controle
Tratado
D
100
Células
x 107 /animal
10
Células
x 107 /mL
Controle
5
0
Controle
50
0
Tratado
E
Células x
104 /mL
100
50
0
Controle Tratado
FIGURA 12 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das flores de Allamanda
schottii no ganho de peso (A) e volume escítico (B), número de células por ml (C) e
por animal na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula óssea
(E) de camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células
tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o
grupo tratado recebeu 200 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas vezes
ao dia por sete dias.Os dados representam a média +/- EPM de 11 animais do grupo
controle e 12 animais do grupo tratado.
34
5.4 Ipomoea pes-caprae
O tratamento dos camundongos portadores do TAE com o extrato bruto da
planta Ipomoea pes-caprae não alterou o ganho de peso dos camundongos (figura
13A). Em relação ao volume ascítico destes animais, verifica-se uma tendência ao
aumento deste volume nos animais tratados com o extrato da planta em relação ao
grupo controle (figura 13B). A mesma tendência ao aumento é verificada também no
número de células por mL nos animais tratados com a planta (figura 13C). Quando
estes dados são unidos verifica-se um aumento significativo de células nos animais
tratados em relação ao controle (figura 13D).
Também foi avaliado se o tratamento dos animais com o extrato da planta
Ipomoea pes-caprae alterava o número de células da medula óssea dos animais. O
gráfico apresentado, figura 13E, mostra um aumento muito significatico no número
total destas células no grupo tratado em relação ao grupo controle.
Em nossos estudos foi observado que o extrato bruto da Ipomoea pescaprae
na concentração de 200mg/Kg estimula a proliferação de leucócitos na
medula óssea, porém também estimula o crescimento do tumor. Trabalhos
científicos envolvendo a extração, o isolamento e a identificação de constituintes
químicos presentes na planta Ipomoea pes-caprae mostram a riqueza de compostos
farmacologicamente ativos isolados dos seus diferentes extratos (KROGH et al,
1999;PONGPRAYOON et al,1992; DE SOUZA et al, 2000).
Os compostos O hidroxi-4,4,7-trimetil-1(4H)-naphthalenone(1), (-)-mellein(2),
eugenol(3) e 4-vinil-guaiacol, desta planta inibem a síntese de prostaglantinas.
FECCHIO et al. (1990) demonstraram que o TAE induz significante liberação de
prostaglandinas E2 (PGE2) um dia após o implante intraperitoneal das células
tumorais. Este aumento de PGE2 se mantém até o décimo dia de evolução do
tumor. Os autores sugerem que a PGE2, exerce uma retroalimentação negativa
sobre a ativação de macrófagos. Como a Ipomoea pes-caprae possui compostos
que inibem a produção de prostaglandinas era de se esperar que o tratamento dos
camundongos com o extrato desta planta reduzisse o crescimento do TAE, porém
isto não ocorreu.
35
B
10
10
5
5
0
mL
∆ gramas
A
Controle
0
Tratado
C
Tratado
D
10
100
Células
x107 /animal
Células
x107 /mL
Controle
5
0
Controle
*
50
Tratado
0
Controle
Tratado
E
Células
x107 /animal
500
**
250
0
Controle
Tratado
FIGURA 13 - Efeito do tratamento com o extrato bruto de Ipomoea pes-caprae no
ganho de peso (A) e circunferência abdominal (B), número de células por ml (C) e por
animal(D) na cavidade peritoneal e volume ascítico (E), no número total de leucócitos na
medula óssea (F) de camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106
células tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu 1% de DMSO em água
(5µl/g de peso); o grupo tratado recebeu 100 mg/kg do extrato em 1% de DMSO diluído
em água, por gavagem, duas vezes ao dia por sete dias. A contagem dos leucócitos
corados com Tukey foi realizada em câmara de Neubauer ao microscópio óptico. Os
dados representam a média±EPM de 10 animais do grupo controle e 8 animais do grupo
tratado. *p<0,05 comparado ao grupo controle **p<0,01 comparado ao grupo controle.
36
5 Bromelia antiacantha
Neste estudo, o extrato metanólico dos frutos da Bromelia antiacantha foi
utilizado na dose de 400mg/Kg . Os resultados obtidos, apresentados na figura 14A,
mostram
que
o
tratamento
dos
animais
com
este
extrato
não
alterou
significativamente o ganho de peso.
Os resultados, apresentados na figura 14B e C, mostram que o volume
ascítico e o número de células por mL do lavado peritoneal mostraram não ser
estatisticamente diferentes do grupo controle, contudo, pode ser observado uma
tendência a redução dos valores, tanto do líquido como das células. quando os
animais foram tratados com o extrato de Bromelia antiacantha. Quando calcula-se o
número de células por animal verifica-se que o tratamento levou a uma diminuição
significativa no número destas células (figura 14D). Estes resultados indicam que o
extrato
bruto
dos
frutos
da
planta
Bromelia
antiacantha
tem
ação
no
desenvolvimento do TAE, pois diminuiu o seu crescimento.
Quanto às células da medula óssea, o tratamento com o extrato da planta
não alterou de modo significativo o número total de células deste órgão linfóide
primário, como pode ser observado na figura 14E.
Como já descrito na introdução, a B. antiacantha vem sendo utilizada na
região de Santa Catarina para o tratamento de tosses, bronquites, aftas e
inflamações em geral, sendo este o primeiro trabalho científico com esta planta. O
estudo fitoquímico desta espécie está sendo realizado pelo grupo de pesquisadores
do NIQFAR, porém encontra-se em fase inicial. Novos estudos devem ser realizados
com frações deste extrato, afim de melhor avaliar os agentes farmacológicos
contidos neste gênero botânico.
37
B
5.0
5
2.5
mL
10
∆
gramas
A
0
Controle
0.0
Tratado
Tratado
D
C
100
Células
x 107 /animal
10
Células
x 107 /mL
Controle
5
0
Controle
0
Tratado
Controle
Tratado
100
Células x
104 /mL
E
*
50
0
Controle
Tratado
FIGURA 14 - Efeito do tratamento com o extrato metanólico dos frutos de Bromelia
antiacantha no ganho de peso (A) e volume escítico (B), número de células por ml (C) e
por animal na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula óssea
(E) de camundongos portadores do TAE. Grupos de animais de camundongos
portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células tumorais na cavidade
peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o grupo tratado recebeu
400 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas vezes ao dia por sete dias. Os
dados representam a média±EPM de 11 animais do controle e 12 animais do tratado. *
p< 0,05 comparada ao grupo controle.
38
5.6 Calophyllum brasiliense
O extrato hexânico desta planta não foi completamente solúvel em água, por
este motivo, neste estudo os camundongos portadores do TAE receberam dois
tratamentos diários de 300mg/kg com a fração do extrato que dissolveu em água,
que representa aproximadamente, 75% do extrato total.
O ganho de peso dos animais durante os sete dias de tratamento e o volume
ascítico na cavidade peritoneal não foram alterados com o tratamento com o extrato
desta planta (figuras 15A e B). O número de células por mL do lavado peritoneal
mostrou uma diminuição estatisticamente significativa quando comparada ao
controle mas, quando avaliou-se o número de células por animal, não houve
nenhum alteração no número destas células( figuras 15C e D). Esta discrepância
deve-se a grande heterogeneidade dos resultados, principalmente no volume
ascítico apresentado pelos animais.
Em relação ao número de células totais da medula óssea, o tratamento com
o extrato da planta induziu elevação do número destas células, uma vez que este
número foi significativamente mais alto no grupo tratado, quando comparado ao
grupo controle, como pode ser observado na figura 15E.
Estes resultados indicam que o extrato hexânico das folhas de Calophyllum
brasiense tem ação no desenvolvimento do TAE, porém esta ação não é muito
importante, mas estimula de modo importante a produção de células pela medula
óssea, mostrando ser um estimulador da hematopoese.
Como escrito acima, somente aproximadamente 75% deste extrato foi
dissolvido, podendo os princípios ativos estarem concentrados neste percentual ou
estarem diminuídos, caso não sejam hidrossolúveis. São, portanto, necessários mais
estudos com esta planta, com o mesmo extrato ou com outros extratos, para que
sejam conhecidos o real potencial antitumoral e e estimulador de hematopoese
desta planta.
39
B
A
7.5
5.0
5
0
mL
∆ gramas
10
Controle
2.5
0.0
Tratado
C
Controle
Tratado
D
10
100
0
Controle
Células
x 107 /animal
Células
x 107 /mL
*
0
Tratado
Controle
Tratado
E
Células x
104 /mL
200
*
100
0
Controle
Tratado
FIGURA 15 - Efeito do tratamento com o extrato bruto das folhas de Calophyllum
brasiliense no ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por mL (C)
e por animal na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula
óssea (E) de camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106
células tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de
peso); o grupo tratado recebeu 300 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem,
duas vezes ao dia por sete dias. Os dados representam a média +/- EPM de 10
animais do grupo controle e 11 animais do grupo tratado. *p< 0,05 comparado ao
grupo controle .
40
5.7 Bauhinia microstachya
Iniciamos os estudos com a planta B. microstachya utilizando o extrato bruto
das folhas. Camundongos portadores do TAE foram tratados com 200mg/Kg deste
extrato. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com o extrato levou a uma
tendência a diminuição do ganho de peso, volume ascítico e células por mL do
lavado peritoneal (figura 16A a C). Os valores de número total de células por
cavidade peritoneal foram significativamente inferiores nos tratados com o extrato do
que nos animais do grupo controle (figura 16D) indicando que o extrato bruto da
planta Bauhinia microstachya possui ação sobre o TAE, levando a uma diminuição
significativa do crecimento deste tumor.
Os resultados obtidos, apresentados na figura 16E, mostram que o
tratamento dos camundongos com o extrato
bruto desta planta aumentou
significativamente o número total de células da medula óssea, indicando ser, o
extrato desta planta, um estimulador da hematopoese dos camundongos portadores
do TAE.
Estudos realizados com extratos da planta Bauhinia racemosa mostraram
atividade antioxidante e antitumoral neste mesmo tumor experimental, o TAE
(GUPTA et al, 2004). Doses utilizadas de 50, 100, 200 e mg/Kg por via
intraperitoneal, 1 x ao dia, reduziram o ganho de peso e de volume ascítico e o
número de células tumorais, sem alterar os parâmetros hematólógicos do sangue
periférico. O extrato também restaurou a peroxidação lipídica hepática, inibiu a
formação de radicais livres por enzimas antioxidantes como superoxidase dismutase
(SOD) e catalase (CAT) no tumor dos camundongos portadores, mantendo os
radicais livres a níveis próximos do normal. Estudos de toxicidade indicaram que
nas doses de 50, 100 e 200 mg/Kg por 14 dias de tratamento com a Bauhinia
racemosa não mostraram nenhum efeito adverso. Doses de 400mg/Kg aumentaram
a concentração de uréia e a atividade da transaminase indicando uma disfunção no
metabolismo hepático e renal. Em nossos estudos não foram testadas doses acima
de 200mg/Kg, por esta razão não sabemos se doses mais altas possam ter efeitos
tóxicos.
Dados da literatura mostram que compostos como β-sitosterol, um potente
antitumoral, e daucosterol, ácido gálico entre outros, foram extraídos da Bauhinia
41
championii (BAI et al., 2005). Estes compostos existem na Bauhinia microstachya,
porém em quantidades pequenas. Estes compostos são absorvidos pelas frações
diclorometano e/ou hexano, as quais não foram testadas neste estudo.
O extrato bruto de B. microstachya mostrou ação antitumoral e ação
estimuladora da hematopoese. Sabe-se que atividade mieloprotetora de compostos
naturais e sintéticos contribuem para inibição do crescimento do TAE.
A avaliação de células da medula é impoetante também para a
compreensão de como os compostos alteram a produção de células sanguíneas e
como estas mudanças afetam o sistema imune do hospedeiro. No animal,
portadores do TAE, o número de células da medula óssea decai no terceiro dia da
inoculação do tumor (QUEIROZ et al., 2004)
Como a B. microstachya foi a planta que melhor inibiu o crescimento do
TAE, e além disso, aumentou o número de células da medula óssea, a etapa
seguinte foi avaliar a ação da fração acetato de etila do extrato desta planta no
crescimento do TAE e no número total de células da medula óssea .
A fração acetato de etila foi a escolhida para dar continuidade aos trabalhos,
pois são extraídos por este solvente flavonóides, xantonas, taninos, ácidos
triterpênicos, saponinas e compostos fenólicos. Como já citado, a literatura relata
alguns flavonóides e triterpenos como agentes antitumorais. Esta fração também
apresentou maior rendimento, o que facilitaria o trabalho visto que para cada
experimento são gastos 1g de extrato. Os camundongos portadores do TAE foram
tratados com a fração acetato de etila das folhas da planta Bauhinia microstachya na
concentração de 100mg/kg. A dose inicial foi menor do que a dose utilizada para o
extrato bruto pois as frações contém os compostos mais concentrados, pois retira do
extrato bruto somente uma classe de compostos específicos.
Os resultados obtidos nos parâmetros que avaliam o crescimento do TAE
, peso, volume ascítico, células por mL e células por animal, não mostraram
diferenças estatísticas
significativas entre os valores do grupo tratado quando
comparadas ao grupo controle (figura 17A a D).
Quanto ao número de células na medula óssea, os resultados obtidos,
apresentados na figura 17E, mostram que o tratamento dos camundongos com o
extrato bruto desta planta aumentou significativamente o número total de células
indicando que nesta fração encontra-se os compostos com ação estimuladora da
hematopoese
42
Como citado anteriormente, a investigação química com as folhas de B.
microstachya levaram ao isolamento de vários compostos, apresentando melhor
perfil fitoquímico e
melhor atividade analgésica em testes preliminares de
pesquisadores desta instituição de ensino (comunicação pessoal).
A fração acetato de etila absorve compostos de alta polaridade e como esta
fração não apresentou efeito sobre o TAE, somente sobre a medula óssea, o
composto ou os compostos que estão agindo como antitumorais não devem ter esta
polaridade, pois não foram carreados por este solvente químico. Também é
posssível que a ação antitumoral seja devido a efeito sinérgico de vários compostos,
alguns dos quais não estão presentes na fração acetato de etila, como o composto β
sitosterol , indicado como antitumoral, que é carreado pela fração diclorometano e/
ou hexano.
43
B
A
7.5
∆ gramas
10
mL
5.0
5
0
Controle
2.5
0.0
Tratado
C
Controle
Tratado
D
100
Células
x 107 /mL
Células
x 107 /animal
10
0
*
0
Controle
Tratado
E
Controle
Tratado
Células x
104 /mL
100
*
50
0
Controle
Tratado
FIGURA 16 - Efeito do tratamento com o extrato bruto de Bauhinia microstachya no
ganho de peso (A) e volume ascítico (B), número de células por mL (C) e por animall
na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula óssea (E) de
camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células tumorais na
cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o grupo tratado
recebeu 200 mg/kg do extrato diluído em água,por gavagem, duas vezes ao dia por sete
dias. Os dados representam a média±EPM de 10 animais do grupo controle e 12 animais
do grupo tratado. * p< 0,05 comparado com o grupo controle.
44
B
A
5.0
2
mL
∆ gramas
3
1
0
Controle
0.0
Tratado
C
Controle
Tratado
Controle
Tratado
D
10
75
Células
x 107 /animal
Células
x 107 /mL
2.5
5
0
Controle
Tratado
50
25
0
E
Células x
104 /mL
300
200
**
100
0
Controle Tratado
FIGURA 17 - Efeito do tratamento com o extrato da fração acetato de etila de Bauhinia
microstachya no ganho de peso (A) e no volume ascítico (B), número de células por ml (C)
e por animal na cavidade peritoneal (D) e no número total de leucócitos na medula óssea
(E) de camundongos portadores do TAE. Os animais receberam 5x106 células tumorais
na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o grupo tratado
recebeu 100 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas vezes ao dia por sete
dias. Os dados representam a média±EPM de 10 animais do grupo controle e 10
animais do grupo tratado. * *p<0,01comparado ao grupo controle.
45
5.8 EFEITO DO TRATAMENTO COM O EXTRATO BRUTO DE Bauhinia
microstachya NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS PERITONEAIS
Com o intuito de avaliar como o extrato bruto da planta Bauhinia
microstachya age reduzindo o crescimento do TAE, foi determinado a ativação de
células peritoneais por duas técnicas: produção de óxido nítrico e o consumo de
oxigênio
(determinado
pela
redução
de
MTT).
Nestes
experimentos
os
camundongos receberam as células tumorais no dia 0 e o tratamento com o extrato
na dose de 200mg/Kg duas vezes ao dia. No quarto dia os animais receberam
0,2mg de carragenina, i.p. Este modelo de indução de inflamação por carragenina
vem sendo largamente empregado no estudo do processo inflamatório (FECCHIO et
al., 1989). Após 6 horas, as células peritoneias foram coletadas sendo determinado
a redução de MTT ou cultivadas por 48 e determinada a produção de NO.
Com relação a redução de MTT, os resultados obtidos das células mostram
que o tratamento dos camundongos com o extrato bruto da Bauhinia microstachya,
não alterou de forma significativa a ativação das células inflamatórias (figura 18).
Cabe ressaltar que a respiração das células provenientes dos animais portadores do
TAE foi aproximadamente 5 vezes mais alta do que a respiração das células obtidas
de animais portadores do tumor porque as células tumorais estão em alta atividade
pois estão se dividindo rapidamente.
Com relação a produção de NO, a determinação da produção deste
mediador não mostrou diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo
tratado com o extrato da planta (figura 19B). Porém, a produção de NO pelas células
provenientes de camundongos não portadores do TAE, foi reduzida com o
tratamento dos animais com o extrato da planta (figura 19A).
O NO produzido por macrófagos ativados tem papel importante no controle
do crescimento de tumores. Macrófagos ativados iniciam os programas de morte
celular através da liberação de mediadores (JACKSON; EVANS, 2000; BRAUMIK;
KHAR, 1998). Um
destes mediadores é o óxido nítrico (KRONCKE; FEHSEL;
KOLB-BACHOFEN, 1998; BREDT, 1999; BRAUMIK; KHAR, 1998). Este gás causa
toxicidade no alvo celular por causa de sua alta reatividade inibindo a respiração
mitocondrial e a síntese de DNA, entre outros (KRONCKE; FEHSEL; KOLBBACHOFEN, 1998; BREDT, 1999; BRUNE; VON-KNETHEN; SANDAU,1999).
Foi postulado que os macrófagos se infiltram no tecido tumoral e produzem
46
óxido nítrico (NO), e este por difusão, é capaz de causar apoptose nas células
tumorais, direcionando a perda de viabilidade do tumor. (CHATTOPADHYAY et al.,
2002).
Dois dos mais conhecidos exemplos de genes reguladores de apoptose são
Bcl2 (B-cell lymphoma 2 ) e P53 (Proteína 53 quilodáltons). A Bcl2 estimula a resposta
antioxidativa nas células e previne a apoptose, diretamente, bloqueando complexos
de caspases e indiretamente impedindo a liberação para o citoplasma de
componentes da mitocôndria capazes de ativar caspase 3. O excesso de Bcl2
embora não seja suficiente para causar tumor, favorece a ação de outros agentes
oncogênicos. O excesso de Bcl2 também ativa a liberação de P53 para um equilíbrio
da expressão das proteínas pró e anti apoptóticas (CHATTOPADHYAY et al., 2002).
Sabemos da literatura que a radioterapia não mata por necrose e sim
danifica o DNA, ativando a P53 levando a apoptose. Células com baixa quantidade
de
P53
e
alta
quantidade
de
Bcl2
são
imunes
a
radioterapia
(NARDNE;BELLI;,TERRIBILE, 2002; BUCCI et al., 2005).
No caso das células do tumor de Ehrlich, sabe-se que estas apresentam
sensibilidade ao óxido nítrico, pois este promove uma troca no balanço entre
proteínas pró e anti apoptóticas, direcionando as células do tumor a morte eminente
(CHATTOPADHYAY et al., 2002).
Em relação a B. microstachya, dados da literatura mostram que a planta
apresenta efeitos antioxidantes (MENEZES; SCHWARZ; SANTOS, 2004) e em
nossos estudos o seu extrato inibiu a produção de óxido nítrico (NO) liberado por
macrófagos obtidos do peritôneo de animais não portadores do TAE. Portanto, a
diminuição do crescimento do TAE por este extrato não deve ter sido por este
caminho NO-dependente.
Por outro lado, dados da literatura nos mostram que plantas que contém
princípios ativos antioxidantes mostram citotoxicidade em células tumorais e
atividade antitumoral em animais experimentais (RUBY et al,. 1995; KOSTOVA,
2005).
Estudos in vitro mostram que a produção excessiva de radicais livres resulta
em stress oxidativo, que leva a danificação de macromoléculas, como lipídios. O
aumento da peroxidação lipídica poderia causar degeneração de tecidos. O peróxido
lipídico poderia ser transferido pela circulação e provocar danos pela propagação do
processo de peroxidação lipídica. O produto final da peroxidação lipídica, tem sido
47
encontrado em níveis mais altos nos tecidos carcinomatosos do que em órgãos
sadios.
A Glutationa, um potente inibidor do processo neoplásico, desempenha um
papel importante como antioxidante endógeno, que é encontrado particularmente em
altas concentrações no fígado e é conhecido pela sua função chave no processo de
proteção celular. O extrato de Bauhinia racemosa reduziu os elevados níveis de
peroxidação lipídica e aumentou o nível de glutationa nas camundongos portadores
do TAE (GUPTA et al, 2004).
O mecanismo de antioxidação SOD (dismutase) e CAT (catalase) está
presente em todas as células, tendo como função, a defesa contra reações danosas
do peróxido de hidrogênio e superóxidos. (Sun et al, appud GUPTA et al, 2004),
relataram um decréscimo na atividade do SOD nos camundongos portadores do
TAE, que pode ser devido a perda de atividade do MnSOD nas células do TAE e a
perda de mitocôndria, direcionada a um decréscimo da atividade total de SOD no
fígado. A inibição das atividades de SOD e CAT pelo crescimento do tumor também
foi relatada. A administração de Bauhinia racemosa em diferentes doses aumenta os
níveis de SOD e CAT de forma dose-dependente, que pode indicar a propriedade
antioxidante deste extrato (GUPTA et al, 2004).
Seguindo outro raciocínio, plantas do gênero Bauhinia são classificadas
como diuréticas (SIMÕES et al., 2003). Se o TAE cresce por aumento do volume da
ascite e que nesta ascite é que estão os nutrientes necessários para o seu
crescimento, pode-se especular que a diminuição deste volume e conseqüente
diminuição de nutrientes por uma melhor diurese do animal também levasse a uma
diminuição ou retardo do crescimento tumoral. Não que este seja o único motivo pelo
qual o tumor não cresceu e sim mais um fator na melhora fisiológica do animal e um
“ganho de tempo” para o sistema imunológico agir.
Todos os dados considerados no estudo não elucidam um ou os prováveis
mecanismos pelo qual o extrato bruto de Bauhinia microstachya propaga a
diminuição do crescimento do Tumor ascítico de Ehrlich. Novos estudos devem ser
feitos a fim de elucidar seus mecanismos tumoricidas no TAE.
48
A
SEM TUMOR
0.4
DO540nm
0.3
0.2
0.1
0.0
B
Controle
Tratado
COM TUMOR
DO54 0n m
2
1
0
Controle
Tratado
FIGURA 18- Efeito do tratamento com o extrato
bruto da planta Bauhinia
microstachya na redução de MTT por células peritoneais de camundongos não
portadores (A) e portadores (B) do TAE. Os animais receberam 5x106 células
tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o
grupo tratado recebeu 200 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas
vezes ao dia por três dias. No quarto dia, os animais receberam 0,2 mg de
carragenina i.p. e 6 horas após as células peritoneais foram coletadas, plaqueadas
(4x105 células/ poço) foi adicionado o MTT e mantido a 37 C.Após 3 horas, foi
adicionado SDS, sendo a leitura da densidade ótica realizada 18 horas após em 540
nm. Dados representam média±EPM de 6 animais ensaiados em quaduplicata.
49
A
SEM TUMOR
µM
200
100
***
0
B
Controle
Tratado
COM TUMOR
µM
50
25
0
Controle
Tratado
FIGURA 19 - Efeito do tratamento com o extrato bruto da planta Bauhinia
microstachya na produção de NO por células peritoneais de camundongos não
portadores (A) e portadores (B) do TAE. Os de animais receberam 5x106 células
tumorais na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu água (5µl/g de peso); o
grupo tratado recebeu 200 mg/kg do extrato diluído em água, por gavagem, duas
vezes ao dia por três dias. No quarto dia, os animais receberam 0,2 mg de
carragenina i.p. e 6 horas após as células peritoneais foram coletadas, plaqueadas
(4 x 105 células/ poço) a 37 C por 48 horas. O nitrito foi determinado pelo método
de Griess. Dados representam média±EPM de 6 animais ensaiados em
quaduplicata.***p<0,001 comparado com o grupo controle.
50
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo permitiram concluir que:
1. O extrato bruto das folhas de Aleurites moluccana, na dose de 100mg/kg, não
apresenta atividade sobre o tumor ascítico de Ehrlich nem modifica o número total
de leucócitos da medula óssea;
2. O extrato bruto das raízes de Rubus rosaefolius, na dose de 200mg/kg, não
modifica o crescimento do TAE nem modifica o número total de leucócitos da medula
óssea;
3. Os extratos brutos das flores e raízes de
200mg/kg,
Allamanda schotii,
na dose de
não apresentam atividade sobre o TAE enquanto que o extrato das
folhas na mesma dose aumenta o crescimento do tumor. Contudo, nenhum dos
tratamentos com esta planta modifica o número total de leucócitos da medula óssea;
4. O extrato bruto de Ipomoea pes-caprae, na dose de 200mg/kg, induz aumento do
crescimento do tumor e estimula a hematopoese;
5. O extrato bruto dos frutos de Bromelia antiacantha, na dose de 400mg/kg, reduz o
crescimento do TAE, mas não altera o número total de células da medula óssea;
6. A fração hexâno das folhas de Calophyllum brasiliense, na dose de 300mg/kg,
não tem ação importante no crescimento do TAE mas estimula a hematopoese;
7. O extrato bruto de Bauhinia microstachya, na dose de 200mg/kg, reduz o
crescimento tumoral e estimula a hematopoese;
8. A fração acetato de etila de Bauhinia microstachya, na dose de 100mg/Kg, não
altera o crescimento do TAE mas estimula a hematopoese;
9. O extrato bruto de Bauhinia microstachya reduz a produção de óxido
nítrico por células peritoneais ativadas com carragenina, em animais não portadores
sem alterar de forma
importante o consumo de oxigênio por estas células.
10. Dentre as plantas testadas, a Bauhinia microstachya mostro-se a mais
promissora no controle do crescimento do TAE.
51
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