UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE
DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO NA
PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE
DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO
NAPRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para
obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia F. Schuck
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
Dedico este trabalho aos meus familiares, em
especial aos meus pais, Elcio e Adioni, que estão
presentes em todos os momentos da minha vida e
por serem sempre os maiores incentivadores de
todas as minhas escolhas.
AGRADECIMENTOS
Considerando esta dissertação como resultado de uma caminhada que não começou
na UNESC, agradecer pode não ser tarefa fácil, nem justa. Para não correr o risco da
injustiça, agradeço de antemão a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e
contribuíram para a construção de quem sou hoje. E agradeço, particularmente, a algumas
pessoas pela contribuição direta na construção deste trabalho:
A Deus, que sempre olha por mim e que me concedeu tantas maravilhas. Por seu amor
incondicional, sua misericórdia, sua luz e, principalmente, por ter me dado força, coragem e
incentivo para que, nos momentos de fraqueza, eu me levantasse e continuasse a minha
jornada. Obrigada, Senhor!
Aos meus pais, Adione Cardoso Scaini e Elcio Scaini, pelas noites mal dormidas, pelas
angústias e preocupações, por todo amor, carinho e felicidade que me concederam. Obrigada
pela vida e por terem feito de mim o que sou hoje. Por terem me dado a melhor educação e
incentivo ao aperfeiçoamento constante. Por serem exemplos a ser seguidos e por serem tudo
aquilo que um dia eu quero ser para o meu filho. Muito obrigada. Amo vocês!
Aos meus irmãos, Junior e Giovanna, presenças alegres e incentivos constantes, pelo
carinho e força que me dão, por estarmos sempre juntos nos momentos mais importantes, por
"contar" com vocês! Agradeço também a minha cunhada e ao meu futuro sobrinho que com
certeza vai ser lindo e já é muito amado. Tenho certeza de que a minha alegria os faz alegres
também.
Agradecimento muito especial ao meu orientador, Prof. Dr. Emilio Luiz Streck,
obrigada primeiramente pela confiança depositada, pelo exemplo de profissionalismo e
comprometimento com o conhecimento científico, pelos ensinamentos, amizade, e,
principalmente, por nunca ter medido esforços para que esse trabalho acontecesse. O seu
apoio incondicional foi fundamental para que tudo desse certo. A você serei eternamente
grata. Minha eterna gratidão pela valiosa orientação que tornou real a concretização de um
sonho.
A Profa. Dra. Patrícia Fernanda Schuck, pela paciência, pelos ensinamentos no
âmbito profissional e pessoal, pelo incentivo, pela amizade e pela experiência profissional que
contribuíram para o meu crescimento. Agradeço imensamente o carinho em todos os
momentos.
Aos professores que compõem a banca examinadora dessa dissertação: Agradeço as
valiosas contribuições dadas durante a defesa do projeto, sua disponibilidade e abertura à
troca de conhecimentos.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, agradeço
pelo muito que aprendi nestes dois anos, pelas dúvidas e incertezas que por vocês foram
esclarecidas.
À Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), em especial ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pela formação e pela possibilidade de realizar esse
trabalho de pesquisa. Agradeço também a CAPES, pelo auxílio financeiro.
A todos os meus amigos pela amizade, carinho, companheirismo, cumplicidade e,
principalmente paciência e tolerância por todos os “nãos” recebidos a muitos dos seus
convites feitos a mim nesses dois últimos anos. São tantos os amigos que se encaixam nessas
palavras, que eu precisaria de muitas páginas para nomear a todos. Deixo aqui, meu muito
obrigada e minha eterna gratidão pelo simples fato de existirem.
As minhas companheiras de laboratório, em especial a Gabi, a Bela e a Gislaine, pelo
incentivo, força, amizade, carinho que partilhamos durante nosso caminhar... Muito
Obrigada!
Agradecimento muito especial as “minhas” aprimorandas, Nati, Joana (mesmo que
longe) e Meline, pela amizade, pela confiança que depositaram em mim, pelas coincidências e
reencontros em nossas vidas e também pelo auxílio na etapa final desse trabalho. Muito
obrigada!
A toda a família do Laboratório de Fisiopatologia Experimental pela grande amizade,
convivência e troca de experiência. Obrigada por tudo.
“Qualquer caminho que você decida tomar,
sempre existe alguém para te dizer que você está
errado. Existem sempre dificuldades surgindo
que te tentam a acreditar que as críticas estão
corretas. Mapear um caminho de ação e segui-lo
até o fim requer coragem”
Ralph Waldo Emerson
RESUMO
A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) é o mais
frequente defeito da oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo
tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média, ácido octanóico (AO) e ácido
decanóico (AD). Os pacientes afetados apresentam hipoglicemia hipocetótica, rabdomiólise,
hepatomegalia, hiperamonemia, letargia e convulsões, podendo rapidamente evoluir para o
coma e morte. Atualmente, os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais apresentados
pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Assim, no presente
trabalho, investigamos o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) na
ausência ou presença de acetato de amônia (AA) sobre parâmetros do metabolismo energético
e de estresse oxidativo em córtex cerebral, fígado e músculo esquelético de ratos jovens.
Verificamos que o AO e AD inibem a atividade do complexo I-III, II-III e IV no fígado, e
também inibiu a atividade do complexo IV no músculo esquelético. Além disso, o AD causou
uma diminuição da atividade do complexo II-III no músculo esquelético. Verificamos também
que o AO e AD aumentaram os níveis de TBA-RS e o conteúdo de carbonilas em ambos os
tecidos. Finalmente, AD, mas não AO, diminuiu significativamente os níveis de GSH no
músculo esquelético de ratos. Além disso, observamos que o AA inibiu a atividade do
complexos II-III no fígado, e a atividade do complexo IV no músculo esquelético, cérebro e
fígado. Por outro lado, houve um aumento na atividade do complexo II no fígado. Quanto à
associação entre AA e os ácidos graxos, observamos uma inibição do complexo I-III e II no
cérebro, e do complexo II no músculo esquelético quando o AD e o AA estiveram presentes
simultaneamente no meio de incubação, sugerindo uma ação sinérgica entre AA e AD. Além
disso, as evidências de efeitos aditivos entre AA e os ácidos graxos foram observadas, uma
vez que o AA potencializou os efeitos inibitórios do AO e AD sobre a atividade do complexo
IV em diferentes estruturas. Observou-se também que o AO, AD e AA, sozinhos ou
associados, inibiram a atividade da citrato sintase no cérebro, mas somente a combinação do
AD com AA inibiu a atividade da citrato sintase no fígado. Já a atividade da succinato
desidrogenase no córtex cerebral foi reduzida pelo AD isolado ou associado com AA. O
presente estudo fornece evidências de que os AO e AD, os principais metabólitos acumulados
na MCADD, alteram a bioenergética mitocondrial e causam estresse oxidativo em tecidos
periféricos de ratos jovens. Esse estudo também demonstrou um efeito sinérgico/aditivo entre
o AO, DA e a amônia, prejudicando a bioenergética mitocondrial no cérebro, fígado e músculo
esquelético de ratos.
Palavras-chave: ácido octanóico; ácido decanóico; amônia; mitocôndrias; deficiência de
MCAD.
ABSTRACT
Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) is the most frequent
fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), and decanoic
(AD) acids. Affected patients present hypoketotic hypoglycemia, rhabdomyolysis,
hepatomegaly, hyperammonemia, seizures and lethargy, which may quickly progress to coma
and death. At present the pathophysiological mechanisms underlying tissues damage in
affected patients are poorly known. Therefore, in the present study we investigated the in vitro
effects of OA and DA in the absence or presence ammonium acetate (AA) on energy
metabolism and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex, liver and skeletal muscle. It
was first verified that OA and DA decreased complex I-III, II-III and IV activities in liver, and
also inhibit complex IV activity in skeletal muscle. In addition, DA decreased complex II-III
activity in skeletal muscle. We also verified that OA and DA increased TBA-RS levels and
carbonyl content in both tissues. Finally, DA, but not OA, significantly decreased GSH levels
in rat skeletal muscle. Moreover, we verified that AA inhibited complex II-III in liver,
complex IV activity in the brain, liver and skeletal muscle. On the other hand, AA increased
complex II activity in liver. Regarding the associations between AA and the fatty acids, we
observed that inhibitions of complex I-III and II in the brain and complex II in skeletal muscle
were detected only when DA plus AA were simultaneously present in the incubation medium,
suggesting a synergistic action between AA and DA. In addition, evidences for additive effects
between AA and the fatty acids were observed, since AA enhanced the effects of OA and DA
on complex IV in the different structures. We observed that OA, DA and AA, per se or
associated, inhibited citrate synthase activity in the brain, but only the combination of DA plus
AA inhibited the same enzyme activity in liver. On the other hand, citrate synthase activity
was not affected by these compounds in skeletal muscle. Succinate dehydrogenase activity
was decreased by DA, but AA failed to enhance this inhibition. The present study provides
evidences that OA and DA, the major metabolites accumulating in MCADD, disturb
mitochondrial bioenergetics and elicit oxidative stress in rat peripheral tissues. This study also
demonstrated evidence for a synergistic/additive effect between OA, DA and ammonia
impairing bioenergetics parameters in brain, liver and skeletal muscle of rats.
Keywords: octanoic acid; decanoic acid; ammonia; mitochondria; MCAD deficiency
Lista de Figuras
Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica ...........................................................
15
Figura 2. Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia ..............................
22
Figura 3. Destinos da glicose .................................................................................
28
Figura 4. Ciclo de Krebs ........................................................................................
29
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial ............................................................
31
Lista de Abreviaturas
AD – Ácido decanóico
AcD – Ácido cis-4-decenóico
AO – Ácido octanóico
Acetil-CoA – acetil coenzima A
ATP – trifosfato de adenosina
CK – creatina quinase
CoQ – coenzima Q
EIM – erros inatos do metabolismo
ERO – espécies reativas de oxigênio
ERN – espécies reativas de nitrogênio
FAD+ – flavina adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
GABA – ácido γ-aminobutírico
GTP – trifosfato de guanosina
GSH – glutationa reduzida
LCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa
LDL – lipoproteína de baixa densidade (low density lipoprotein)
MCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia média
NAD+ – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
NMDA – ácido N-metil-D-aspartato
NOS – óxido nítrico sintase
SDH – succinato desidrogenase
SOD – superóxido dismutase
Pi – fosfato inorgânico
PKC – proteína quinase C
SCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia curta
SCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia curta
SDH – succinato desidrogenase
SNC – Sistema nervoso central
VLCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
1. Erros Inatos do Metabolismo ....................................................................................... 14
1.1. Histórico ....................................................................................................................... 14
1.2. Defeitos da Oxidação de Ácidos Graxos ..................................................................... 15
1.3. Deficiência da Desidrogenase de Acil-CoA de cadeia média (MCAD) ...................... 16
1.3.1. Metabólitos Acumulados nos pacientes com deficiência de MCAD ........................ 18
1.3.2. Aspectos Moleculares da deficiência de MCAD ....................................................... 18
1.3.3. Fisiopatologia da deficiência de MCAD .................................................................. 19
2. Hiperamonemia ............................................................................................................. 21
2.1. Hiperamonemia na deficiência de MCAD ................................................................... 22
2.2. Toxicidade da Amônia ................................................................................................. 23
3. Metabolismo Energético ............................................................................................... 27
3.1. Histórico ....................................................................................................................... 27
3.2. Destino da Glicose e Ciclo de Krebs ............................................................................ 27
3.3. Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa ............................................................. 30
3.4. Creatina Quinase .......................................................................................................... 32
4. Radicais Livres .............................................................................................................. 34
4.2. Defesa Antioxidante ..................................................................................................... 35
4.3. Estresse Oxidativo ....................................................................................................... 36
II. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 39
Objetivo Geral ..................................................................................................................... 39
Objetivos Específicos .......................................................................................................... 39
III. RESULTADOS ............................................................................................................... 40
Artigo 1 ............................................................................................................................... 40
Artigo 2 ................................................................................................................................ 60
IV. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 87
V. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 90
PARTE I - INTRODUÇÃO
1. Erros Inatos do Metabolismo
1.1. Histórico
Em 1908, Sir Archibald E. Garrod usou o termo erros inatos do metabolismo (EIM)
para designar doenças como a alcaptonúria, em que os indivíduos afetados excretam grandes
quantidades de ácido homogentísico na urina. Garrod observou uma maior frequência desta
doença em indivíduos de uma mesma família e maior incidência de consanguinidade entre os
pais dos pacientes. Baseando-se nas leis de Mendel e no fato de que os pais dos indivíduos
afetados não apresentavam a doença, Garrod propôs um modelo de herança autossômica
recessiva para este distúrbio. Através da observação de que o ácido homogentísico presente
em excesso na urina dos pacientes era um metabólito normal da degradação protéica, ele
relacionou este acúmulo a um bloqueio na rota de catabolismo da tirosina. Com o surgimento
de novos distúrbios relacionados a alterações genéticas e que envolviam o acúmulo de outras
substâncias nos líquidos biológicos dos pacientes, postulou-se que estas doenças resultavam
da síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma proteína, enzimática ou não,
pertencente ao metabolismo (Scriver et al., 2001). Presumiu-se, então, que em consequência
deste bloqueio metabólico pode ocorrer o acúmulo de precursores da reação catalisada pela
enzima envolvida, com a formação de rotas metabólicas alternativas e a deficiência de
produtos essenciais ao organismo (Bickel, 1987).
14
Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica (Adaptado de Scriver et al., 2001).
Até o momento foram descritos mais de 500 EIM, a maioria deles envolvendo
processos de síntese, degradação, transporte e armazenamento de moléculas no organismo
(Scriver et al., 2001). Embora individualmente raras essas doenças em seu conjunto afetam
aproximadamente 1 a cada 500/2.000 recém nascidos vivos (Baric et al., 2001).
1.2. Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos
A beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos é uma fonte de energia muito
importante para a síntese de ATP, principalmente em períodos de jejum, já que este processo
gera acetil-coenzima A (acetil-CoA) e energia na forma de ATP. A rota de oxidação dos
ácidos graxos é complexa e inclui muitos passos: captação celular de ácidos graxos, ativação
desses mesmos ácidos graxos a ésteres acil-CoA, trans-esterificação a acilcarnitinas,
translocação através da membrana mitocondrial, re-esterificação a acil-CoA, e a espiral da
beta-oxidação intramitocondrial, que fornece elétrons para flavoproteínas transferidoras de
elétrons e acetil-CoA. Cada etapa da espiral de oxidação é catalisada por enzimas específicas
para o comprimento da cadeia carbônica do ácido graxo (Smith et al., 2005).
Na década de setenta foram descritos os primeiros erros inatos do metabolismo
atribuídos a defeitos na oxidação dos ácidos graxos em pacientes com astenia ou rabdomiólise
15
induzida por exercício. Pouco tempo depois foi descrita a deficiência sistêmica de carnitina e,
em 1982, a deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) foi
diagnosticada em pacientes que apresentavam descompensação metabólica com sintomas
neurológicos durante o jejum (Kolvraa et al., 1982). Atualmente, já estão descritas pelo menos
23 diferentes entidades clínicas dentro deste grupo de doenças, incluindo defeitos no
transporte de carnitina na membrana plasmática, nas enzimas carnitina palmitoiltransferase I e
II, carnitina/acilcarnitina translocase, nas desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa
(VLCAD), média (MCAD) e curta (SCAD), na 2,4-dienoil-CoA redutase e nas
desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa (LCHAD) e curta (SCHAD), bem
como na proteína trifuncional mitocondrial (Roe & Ding, 2001).
Acredita-se que a prevalência dessas doenças seja subestimada, visto que seu
diagnóstico depende da detecção dos metabólitos acumulados por métodos sofisticados e
equipamentos de alto custo que poucos laboratórios possuem (Walker, 1994). Além disso,
devido à semelhança do quadro clínico, uma parte considerável dos pacientes afetados por
defeitos de oxidação de ácidos graxos é diagnosticada erroneamente como síndrome de morte
súbita da infância, infecção bacteriana aguda (sepse), síndrome de Reye, fígado gorduroso da
gravidez ou síndrome de vômito cíclico (Rinaldo et al., 1998).
Dentre os defeitos de beta-oxidação, a MCADD é o mais frequente destes distúrbios,
com uma prevalência similar à da fenilcetonúria, o mais frequente erro inato do metabolismo.
1.3. Deficiência de Desidrogenase de Acil-CoA de Cadeia Média (MCAD)
A MCADD é um defeito hereditário metabólico de herança autossômica recessiva
cujos primeiros sinais clínico-laboratoriais geralmente aparecem entre os primeiros dias de
vida até os seis anos de idade (Wilcken et al., 2007), podendo, no entanto, ocorrer na fase
16
adulta (Ruitenbeek et al., 1995). Os pacientes afetados pela MCADD geralmente são
assintomáticos e os sintomas são precipitados por períodos de jejum ou de outras formas de
estresse metabólico, usualmente associadas a infecções virais ou bacterianas ou mesmo à
vacinação (Derks et al., 2006). Pacientes afetados pela MCADD apresentam uma
sintomatologia muito variada, incluindo episódios de vômitos, letargia, apnéia e coma,
podendo levar à morte súbita (Grosse et al., 2006). Podem também apresentar atraso no
desenvolvimento psicomotor, rabdomiólise, paralisia cerebral, retardo no crescimento,
problemas comportamentais e déficit de atenção (Roe & Ding, 2001). Durante as crises mais
graves o coma, muitas vezes acompanhado de convulsões, e a hiperamonemia com disfunção
hepática são frequentes (Ruitenbeek et al., 1995).
Os principais achados neuropatológicos dos pacientes com MCADD são microcefalia,
edema cerebral e anomalias no lobo frontal (Egidio et al., 1989; Maegawa et al., 2008). Em
muitos casos ocorre acúmulo microvesicular de lipídeos no fígado, similar ao acúmulo
observado em pacientes com síndrome de Reye (Roe & Ding, 2001). Também pode ocorrer
rabdomiólise, acúmulo microvesicular de lipídeos entre as miofibrilas e de glicogênio
detectados por biópsia muscular (Ruitenbeek et al., 1995).
Se não diagnosticados precocemente, 20 a 25% dos pacientes afetados pela MCADD
morrem durante o primeiro episódio de crise metabólica (Grosse et al., 2006), enquanto o
risco de sofrer uma crise fatal estende-se por toda a vida (Roe & Ding, 2001).
17
1.3.1. Metabólitos Acumulados nos Pacientes com Deficiência de MCAD
O defeito no catabolismo de ácidos graxos de cadeia média ocasiona o acúmulo desses
ácidos graxos e seus derivados que, principalmente durante os períodos de crise, encontram-se
muito aumentados no sangue e em outros tecidos, bem como na urina dos pacientes. Os
principais metabólitos acumulados são os ácidos graxos de cadeia média octanoato, decanoato
e cis-4-decenoato. Outro achado comum na doença é a elevação da concentração urinária de
hexanoilglicina, fenilpropionilglicina e suberilglicina (Costa et al., 2000).
1.3.2. Aspectos Moleculares da Deficiência de MCAD
A MCADD é uma doença autossômica recessiva, cuja mutação mais comum é uma
mutação ponto que resulta na substituição de lisina por ácido glutâmico no aminoácido 329 do
precursor da MCAD (K329E). Isso ocorre devido à adição de um nucleotídeo adenina (na
posição 985) no lugar de guanina no gene da MCAD (c.985A>G), mutação responsável por
aproximadamente 80-90% dos alelos mutantes em caucasianos. Deve-se considerar também
que o desenvolvimento dos sintomas deve ser influenciado pelo grau de estresse metabólico e
a combinação de fatores, tais como infecção e jejum (Matsubara et al., 1992). Por outro lado,
mais recentemente tem-se tentado correlacionar o tipo de mutação envolvida na doença com o
acúmulo de metabólitos nos pacientes, sendo que aparentemente a presença da mutação
c.985A>G parece estar correlacionada a maiores níveis de acúmulo neonatal de
octanoilcarnitina no plasma bem como de acilglicinas na urina. Além disso, as mutações
c.985A>G e c.583G>A parecem resultar em maior severidade, enquanto que a mutação
c.199T>C está associada a sintomas menos severos da doença (Waddell et al., 2006).
18
1.3.3. Fisiopatologia na Deficiência de MCAD
A síntese diminuída de corpos cetônicos durante o jejum é uma característica da
MCADD, fazendo com que aumente a importância da glicose sanguínea como fonte de
energia celular, ocasionando hipoglicemia nos pacientes. Outra consequência da nãoutilização dos ácidos graxos de cadeia média na síntese de corpos cetônicos é o acúmulo de
acil-CoA de ácido graxo de cadeia média dentro das mitocôndrias. Eleva-se então a razão
acil-CoA:CoA, causando a inibição das enzimas piruvato desidrogenase e α-cetoglutarato
desidrogenase, que utilizam coenzima A como substrato. Assim, ocorre diminuição da
conversão do piruvato a acetil-CoA e diminuição na velocidade do ciclo de Krebs, visto que a
síntese do citrato e a conversão do α-cetoglutarato a sucinil-CoA também estão diminuídas.
Além disso, a sucinil-CoA ligase é inibida pelo ácido octanóico e também por intermediários
de acil-CoA. Com a baixa produção de acetil-CoA, há diminuição da síntese de citrato, o
citrato por sua vez é precursor de malato, intermediário necessário para a produção de glicose,
via gliconeogênese, e precursor de malonil-CoA, o principal regulador inibitório da carnitina
palmitoil transferase I, enzima responsável pela entrada de ácidos graxos de cadeia longa na
mitocôndria. Portanto, a diminuição dos níveis de citrato ocasionada pelo acúmulo do
octanoato e outros ácidos graxos na MCADD provoca também uma diminuição da
gliconeogênese e um aumento da entrada de ácidos graxos de cadeia longa na mitocôndria, o
que deve ser um agravante para a hipoglicemia e deve provocar o acúmulo de derivados de
acil-CoA graxos nos pacientes (Roe & Ding, 2001). Além disso, com a pouca disponibilidade
de substratos energéticos, há uma exacerbação de processos catabólicos, dentre os quais
podemos salientar a proteólise. Com a grande degradação de proteínas e utilização de
aminoácidos como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto
resultante da degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005), que apresenta alta toxicidade
19
para os tecidos em geral, em especial para o sistema nervoso central (SNC) (Felipo &
Butterworth, 2002).
Por outro lado, acredita-se que o quadro de letargia, que pode evoluir a coma e morte,
seja devido, particularmente, ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia média e seus derivados
(Gregersen et al., 2008). Até o presente momento, poucos estudos foram realizados sobre os
efeitos tóxicos dos ácidos graxos de cadeia média acumulados na MCADD. Foi demonstrado
que o octanoato causa um aumento do consumo de oxigênio (O2) e produção de dióxido de
carbono (CO2), sem causar um correspondente aumento na produção de ATP em fígado de
ratos (Berry et al., 1983; Scholz et al., 1984). Além deste, outros efeitos têm sido atribuídos
ao octanoato, quando testado in vitro, como inibição do controle do volume de astrócitos e da
Na+,K+-ATPase em cultura de células gliais (Olson et al., 1989), que poderiam estar
relacionados ao edema cerebral observado na deficiência de MCAD e também na síndrome de
Reye, ambas caracterizadas por acúmulo de octanoato nos tecidos dos pacientes afetados. Foi
também demonstrado que o octanoato e o decanoato são inibidores do transporte de ácidos
orgânicos através do plexo coróide em coelhos. Os autores do trabalho sugeriram que tal
efeito poderia impedir a depuração do octanoato e compostos relacionados, contribuindo para
o acúmulo desses compostos no cérebro e no líquido cerebroespinhal e para a encefalopatia
das doenças em que essas substâncias se acumulam (Kim et al., 1983).
Mais recentemente, foi demonstrado que os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e
cis-4decenóico (AcD) inibem in vitro importantes parâmetros do metabolismo energético em
cérebro de ratos jovens, incluindo as atividades de complexos da cadeia respiratória, da
creatina quinase e Na+,K+-ATPase, bem como a
produção de
14
CO2 a partir de [U-
14
C]glicose, [1-14C]acetato e [U-14C] citrato (de Assis et al., 2003; 2006; Reis de Assis et al.,
2004). Também foi demonstrado recentemente que esses mesmos compostos induzem
estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens (Schuck et al., 2007; 2009a).
20
Enfatize-se que, apesar de se ter investido muito no estudo dos defeitos da oxidação de
ácidos graxos com evidentes progressos no diagnóstico da maioria delas, poucas informações
estão disponíveis na literatura internacional sobre a etiopatogenia do dano neurológico nos
pacientes afetados por essas doenças (Lund et al., 2003). Assim, a expectativa é de que
estudos bioquímicos, como o presentemente proposto, sejam levados a efeito para clarificar a
associação do defeito genético e dos sintomas dos pacientes nos distúrbios propostos com a
finalidade precípua de contribuir mais decisivamente para o tratamento dos portadores dessas
doenças.
Neste contexto, apesar dos sintomas dos pacientes afetados pela MCADD piorarem
subitamente durante ou após crises metabólicas em que há exacerbação dos processos
catabólicos, levando uma parte deles a degeneração aguda ou crônica de estruturas cerebrais
durante esses episódios, praticamente nada tem-se investigado sobre a etiopatogenia da
disfunção neurológica e dano cerebral que acomete os indivíduos afetados pela MCADD
nestas situações de estresse metabólico. É possível que o acúmulo maior dos produtos tóxicos
nesses distúrbios durante as crises de descompensação metabólica possa ter um papel
importante na fisiopatologia dos danos apresentados pelos pacientes, embora não se possa
afastar a possibilidade de que um déficit de energia primário causado por hipoglicemia ou
pela impossibilidade de degradar ácidos graxos seja responsável por parte desse dano.
2. Hiperamonemia
A amônia é uma substância proveniente do metabolismo dos compostos nitrogenados,
sendo produto e/ou precursor de importantes compostos (Lehninger et al., 2007). Este
metabólito possui um papel importante na manutenção da homeostase do nitrogênio nos
21
organismos vivos, mas quando em altas concentrações se torna extremamente tóxico,
principalmente para o SNC (Cooper & Plum, 1987).
2.1. Hiperamonemia na deficiência da MCAD
A MCADD é clinicamente caracterizada por alterações no SNC, fígado e músculo
esquelético e cardíaco, ocorrendo principalmente após situações de estresse metabólico
associado a catabolismo exacerbado. Desta forma, a hiperamonemia é um dos achados
clínicos encontrados em pacientes com a MCADD (Ruitenbeek et al., 1995). Segundo Fenton
& Rosenberg (1995), ésteres de CoA inibem diretamente a enzima carbamil fosfato sintetase
I, enzima responsável pelo primeiro passo do ciclo da uréia. Um bloqueio na síntese da uréia
resulta num acúmulo de amônia, justificando a hiperamonemia apresentada por estes
pacientes. Além disso, com a grande degradação de proteínas e utilização de aminoácidos
como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto resultante da
degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005).
Figura 2: Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia (Adaptado de Fenton & Rosenberg, 1995) .
22
A hiperamonemia é causa primária da neurotoxicidade em uma gama de doenças,
principalmente aquelas associadas à insuficiência hepática (Stewart & Walser, 1980; Smeltzer
& Bare, 1996), levando a dificuldades motoras, alterações comportamentais, convulsões,
coma e morte. Além disso, os pacientes que possuem níveis séricos elevados de amônia
podem apresentar diarréia, vômitos e acidose metabólica (Smeltzer & Bare, 1996).
Os mecanismos de neurotoxicidade da amônia ainda não estão bem esclarecidos.
Entretanto, existem evidências de que os distúrbios provocados pela amônia no SNC sejam
decorrentes da combinação de alterações bioquímicas, morfológicas, energéticas e físicoquímicas, tais como alterações no pH celular e consequente modificações na estrutura celular,
principalmente em astrócitos (Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al., 1991; Dolinska et al.,
1996), alterações no metabolismo de alguns neurotransmissores (Felipo et al., 1994; Zhou et
al., 1999), produção de radicais livres (Kosenko et al., 1999) e possível depleção de alguns
intermediários do ciclo de Krebs e depleção de ATP (Cooper & Plum, 1987; Lai & Cooper,
1991; Felipo et al., 1994).
2.2. Toxicidade da Amônia
Os efeitos tóxicos provocados pela amônia parecem estar relacionados àqueles
envolvidos na neurotoxicidade glutamatérgica, uma vez que concentrações elevadas de
amônia induziram um aumento nos níveis extracelulares de glutamato por inibir a sua
captação (Felipo et al., 1994; Zhou & Noremberg, 1999), o acúmulo extracelular deste
neurotransmissor ativa receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, levando à abertura dos
canais de íons a ele associados, permitindo o influxo neuronal de íons Ca+2 e Na+ (Lai &
Cooper, 1991; McDonald & Schoepp, 1993). Kosenko & colaboradores (2000) demonstraram
que a administração de amônia em ratos induziu uma importante alteração na homeostase de
23
cálcio nas células do SNC, levando a um rápido aumento no conteúdo de cálcio
intramitocondrial, seguido por uma redução na capacidade e na taxa de captação desse íon,
além de aumentar o efluxo espontâneo deste íon da mitocôndria para o citosol. O aumento
intracelular de cálcio permite a ativação de algumas enzimas dependentes deste íon e de
outros mecanismos que desencadeiam injúria neuronal (Brorson et al., 1995; Pavlakovic et al.,
1995).
Kosenko & colaboradores (1995) demonstraram que administração de compostos que
previne a toxicidade glutamatérgica do tipo NMDA, como os inibidores da enzima óxido
sintetase, atenuaram a toxicidade e as alterações nos metabólitos cerebrais provocadas pela
amônia. A nitroarginina, um inibidor da óxido nítrico sintase (NOS), preveniu parcialmente a
morte dos animais, a depleção de ATP, o aumento no conteúdo da glicose, o aumento de
lactato e piruvato e o decréscimo no conteúdo de glicogênio. No entanto não preveniu o
aumento dos níveis de glutamina e a diminuição de glutamato. Estes dados sugerem o
envolvimento da produção de óxido nítrico via ativação de receptores NMDA nos efeitos
tóxicos causados pela amônia. Entretanto, estudos demonstram que o mecanismo de
toxicidade da amônia não está exclusivamente ligado aos efeitos mediados pelo receptor
NMDA, mas que a ativação deste receptor é um passo essencial no processo que levará a
depleção de ATP e morte (Marcaida et al., 1992; Felipo et al., 1994; Kosenko et al., 1994).
Um dos achados mais importantes nos estados de hiperamonemia é a depleção de
ATP. Recentemente foi proposto que a depleção de ATP é decorrente da ativação da enzima
Na+,K+-ATPase, induzida pela amônia (Felipo et al., 1994; Ratnakumari et al., 1995).
Kosenko & colaboradores (1994) demonstraram que a amônia induziu uma ativação da
enzima Na+,K+-ATPase, e que o MK-801 preveniu completamente este aumento, indicando
que este evento estava relacionado com ativação de receptores NMDA, e que poderia estar
envolvido na depleção de ATP. Foi proposto que a amônia pudesse ter influência sobre a
24
fosforilação desta ATPase pela proteína quinase C (PKC) ou sobre a desfosforilação desta
enzima por uma fosfotase (Felipo et al., 1993).
Além disso, a depleção de ATP pela amônia também foi associada a incorporação dos
grupos amônio ao α-cetoglutarato, glutamato e glutamina, em uma sequência de reações que
culminaram no consumo de ATP pela glutamina sintetase. Além do consumo de ATP pela
glutamina sintetase, o seqüestro do α-cetoglutarato provavelmente resultaria em uma
interferência no funcionamento do ciclo de Krebs, já que este é um intermediário desse ciclo,
prejudicando assim a formação do ATP (Hertz & Kala, 2007).
Além das teorias já citadas para a depleção de ATP, alguns trabalhos demonstraram
que a amônia influência diretamente o funcionamento do ciclo de Krebs, uma vez que este
composto inibe algumas enzimas importantes deste ciclo, como a α-cetoglutarato
desidrogenase e a isocitrato desidrogenase (Lai & Cooper, 1986; Siegel et al., 1994). Outra
hipótese sugeriu que a amônia pudesse causar uma inibição da lançadeira de elétrons malatoaspartato, uma vez que a diminuição no nível de glutamato total pode comprometer o
funcionamento desta lançadeira pela diminuição do fluxo de elétrons, e consequentemente
causar uma interferência no metabolismo energético (Fitzpatrick et al., 1983). Segundo Siegel
& colaboradores (1994) ratos com hiperamonemia apresentam as relações de lactato/piruvato
e NADH/NAD+ citoplasmáticas aumentadas, indicando assim que pode existir um
comprometimento no funcionamento da lançadeira de elétrons, através de uma diminuição na
translocação do glutamato-aspartato e pelo decréscimo nas atividades das aspartato
aminotransferases, principalmente a mitocondrial.
Por outro lado, estudos demonstraram que a amônia também interfere no metabolismo
da glicose. Muntz & Hurwitz (1951) verificaram que a amônia estimula a glicólise em
extratos cerebrais. A partir destes resultados os autores sugeriram que a amônia desinibia ou
ativava a fosfofrutoquinase, uma das enzimas marca-passo da via glicolítica in vivo e in vitro.
25
Uma desinibição ou ativação dessa enzima pode estimular a utilização de glicose, fato esse
observado em animais que apresentaram hiperamonemia aguda (Hawkins et al., 1973; James
et al., 1974). Outra evidência que indica a interferência da amônia sobre a glicólise é o
aumento nos níveis de lactato cerebral e a relação lactato/piruvato de animais
hiperamonêmicos (Duffy et al., 1972; Lai et al., 1986).
Além dos mecanismos já descritos para a toxicidade da amônia, acredita-se que este
composto cause prejuízo na função mitocondrial através da produção de radicais livres.
Alguns estudos demonstraram que a amônia provocou uma diminuição na atividade das
enzimas antioxidantes e um aumento na produção de radicais superóxido no cérebro
(Kosenko et al., 1997).
Embora as causas das disfunções neurológicas provocadas pela amônia não sejam
totalmente conhecidas, acredita-se que parte das alterações ocorridas nas células do SNC seja
decorrente, além das alterações já citadas, do acúmulo de água, já que altos níveis de amônia
induzem um grande acúmulo mitocondrial de glutamina no cérebro (Dolinska et al., 1996),
um metabólito que promove retenção de água, causando assim um edema celular que aparece
principalmente nos astrócitos, embora algumas alterações possam ocorrer nos neurônios
(Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al., 1991).
Drewes & Leino (1985) demonstraram que a exposição aguda a amônia e ao ácido
octanóico causou dano nos corpos celulares dos neurônios em preparações de cérebro de cães.
Neste estudo foi verificado que as mitocôndrias dos neurônios se apresentam alteradas e,
apesar do edema, as mitocôndrias dos astrócitos pareciam normais. A partir destas
observações, os autores concluíram que além dos astrócitos, os neurônios também podem
sofrer alterações nas síndromes hiperamonêmicas.
26
3. Metabolismo Energético
3.1. Histórico
Hans Krebs propôs, em 1937, uma série de reações do metabolismo intermediário dos
carboidratos. Atualmente, o ciclo proposto por Krebs leva o seu nome. Há aproximadamente
meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que as mitocôndrias contêm as enzimas do
ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios.
Alguns anos depois, Palade e Sjonstrand, através de microscopia eletrônica, mostraram que a
mitocôndria apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961,
Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de elétrons e a
síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na membrana mitocondrial interna.
Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam este gradiente de prótons, que seria a força
motriz para a síntese de ATP (Berg et al., 2008).
3.2 Destinos da glicose e Ciclo de Krebs
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por exemplo, o
transporte ativo de íons e moléculas, neurotransmissão, síntese de macromoléculas e outras
biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular. A energia
necessária para realizar essas funções é obtida com a oxidação de substâncias pela respiração
celular. O ATP é o principal combustível da célula na maioria dos processos que precisam de
energia, sendo a energia liberada pela hidrólise de ATP, que impulsiona uma série de reações
(Lehninger et al., 2007)
27
A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das células e ocupa uma
posição central no metabolismo. Ela é transportada para dentro das células por proteínas
transportadoras especificas, e ao entrar na célula, a glicose pode ser metabolizada em
diferentes rotas metabólicas. No entanto, a principal via de degradação da glicose é a
glicólise. Esta via é composta por uma sequência de 10 reações enzimáticas, cuja função no
metabolismo energético é fornecer parte da energia utilizada pelos organismos; este processo
ocorre no citoplasma e tem como produto final o piruvato (Lehninger et al., 2007; Berg et al.,
2008). Uma molécula de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso, a
glicose pode participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar NADPH, um
doador de elétrons de fundamental importância para as biossínteses redutoras, e ribose-5fosfato, precursor da biossíntese de nucleotídios. Quando a célula está com elevados níveis de
ATP, a glicose pode ser armazenada na forma de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado
rapidamente se a célula necessitar de energia (Clark et al., 1993; Lehninger et al., 2007; Berg
et al., 2008).
Figura 3. Destinos da glicose (Nelson & Cox, 2000).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de glicose, pode
seguir duas rotas metabólicas distintas. No metabolismo anaeróbico, o piruvato apresenta dois
28
caminhos. Primeiro, e mais comum, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase,
consumindo NADH. Segundo, nos organismos capazes de fazer fermentação alcoólica, o
piruvato perde dióxido de carbono produzindo acetoaldeído, que então será reduzido a etanol.
No metabolismo aeróbico, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria e sofre ação
do complexo enzimático da piruvato desidrogenase formando acetil-CoA, que seguirá para o
ciclo Krebs (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial, onde uma molécula de acetil-CoA é
completamente oxidada a CO2, através de uma série de reações composta por oito passos,
onde cada um é catalisado por enzimas diferentes (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs começa e termina com oxaloacetato e consiste de uma sequência de reações
onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH, uma de FADH2, duas
de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de
elétrons que serão posteriormente utilizados na cadeia transportadora de elétrons para a
produção de ATP na fosforilação oxidativa (Marks et al., 1996; Lehninger et al., 2007; Berg
et al., 2008).
Figura 4. Ciclo de Krebs (Nelson & Cox, 2000).
29
Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos complementares em
vários locais do ciclo. Um dos pontos de controle é a conversão de piruvato a acetil-CoA pela
enzima piruvato desidrogenase, inibida por ATP, acetil-CoA e NADH (Smith et al., 2005;
Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
3.3. Cadeia respiratória e fosforilação oxidativa
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs, ocorrem
nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série de complexos protéicos, onde
ocorre a transferência de elétrons doados por NADH e FADH2. O fluxo de elétrons do NADH
e FADH2 até O2 se dá através de complexos enzimáticos ancorados na membrana
mitocondrial interna, essa transferência de elétrons é impulsionada por um crescente potencial
redox entre as coenzimas NADH e FADH2, os complexos enzimáticos e oxigênio, o aceptor
final da cadeia respiratória (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV). O complexo I,
conhecido como NADH desidrogenase ou NADH: ubiquinona oxidorredutase, transfere
elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol. Essa reação faz com que quatro
prótons sejam bombeados para o espaço intermembrana. O complexo II, também denominado
de succinato: ubiquinona oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH)
e três subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs e transfere
elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O complexo III, ou
citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c, reação que serve
para o bombeamento de mais quatro prótons para o espaço intermembrana. O complexo IV,
mais conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do citocromo c reduzido para o
30
oxigênio, reduzindo-o a H2O. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (Wallace,
1999; Murray, 2002; Voet et al., 2008).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a cadeia
respiratória mitocondrial é utilizado como força-motriz para o complexo V, ou ATP sintase,
formar ATP (fosforilação oxidativa). Dessa forma, a oxidação de substratos energéticos está
acoplada ao processo de fosforilação do ADP, ou seja, quando o potencial de membrana é
dissipado pelo fluxo de prótons a favor do gradiente eletroquímico, a energia liberada é
utilizada pela ATP sintase, que atua como uma bomba de prótons ATP-dependente
(Lehninger et al., 2007).
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial (Nelson & Cox, 2000).
Além da regeneração do ATP, a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de
oxigênio e de defesas antioxidantes nas células (Cadenas & Davies, 2000), gerando ânions
31
superóxido no espaço intermembrana pelo vazamento de elétrons que se combinam com
oxigênio molecular no complexo III em um processo que é dependente do potencial de
membrana, e na matriz, através do complexo I (Han et al., 2001). Além disso, a mitocôndria
participa ativamente da homeostase de cálcio (Nicholls & Akerman, 1982). Neste contexto,
alterações na função mitocondrial levam a uma rápida queda na produção de energia e morte
celular (Ankarcrona et al., 1995). Além disso, a diminuição do metabolismo energético pode
levar a apoptose através da liberação de citocromo c (Liu et al., 1996; Heales et al., 1999).
A redução de produção de energia no cérebro pode comprometer a síntese se
neurotransmissores (acetilcolina, glutamato, aspartato e GABA) e lipídios nesse tecido e
pode, por isso, levar ao dano neuronal (Di Donato, 2000). Acredita-se que a diminuição no
metabolismo energético pode estar envolvido na fisiopatologia de diversas doenças
neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer, Parkinson, Huntington, isquemia
cerebral e esclerose amiotrófica lateral (Brennan et al., 1985; Beal et al., 1992; Heales et al.,
1999; Blass, 2001), e também de vários erros inatos do metabolismo (Schuck et al., 2002;
Reis de Assis et al., 2004; Latini et al., 2005; Ferreira et al., 2007; Viegas et al., 2008).
3.4 Creatina quinase
Outra forma de produção de ATP é a partir da enzima creatina quinase (CK). Esta
enzima foi descoberta em extratos de músculos por Karl Lohman, em 1934 (Wallimann et al.,
1992). A CK é uma enzima que possui um papel central no metabolismo energético,
principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e
esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de
ATP, sendo assim é uma enzima crucial para a homeostase energética (Pilla et al., 2003). A
reação da CK catalisa a transferência metabolicamente reversível do grupamento N-fosforil da
32
fosfocreatina para o ADP, regenerando o ATP (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000; Pilla et al.,
2003; Berg et al., 2008).
Esta enzima possui cinco isoenzimas, três citoplasmáticas e duas mitocôndrias. As
isoenzimas citoplasmáticas são compostas por dois tipos de subunidades, a M de “muscle” e a
B de “brain”; os nomes são em função dos lugares de onde foram primeiramente isoladas.
Essas isoenzimas são conhecidas como CK-MM, encontrada no músculo esquelético, CK-BB,
encontrada no cérebro e CK-MB, encontrada no músculo cardíaco (Eppemberg et al., 1967;
Wallimann et al., 1992).
A CK consiste de dois domínios, um pequeno domínio de natureza α-helicoidal e um
amplo domínio contendo uma lâmina β antiparalela produzida por oito intermitências
franqueadas por sete α-hélices. Seu sítio ativo está localizado entre os dois domínios e é
coberto por resíduos que são conservados dentro da família CK. Além disso, as isoenzimas da
CK possuem no seu sítio ativo um grupo sulfidril que é altamente reativo, desta forma este
grupo pode ser uma maneira tanto para inibir a ativação da CK como proteger contra o dano
irreversível durante períodos de estresse oxidativo. Entretanto as isoenzimas da CK foram
identificadas como alvos primários da modificação e inativação irreversível pelas espécies
reativas de oxigênio (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000).
O sistema creatina quinase/creatina /fosfocreatina mostra diferentes funções integradas
em células cerebrais, isto é, tamponamento de energia, capacidade metabólica, transferência
de energia e controle metabólico. Desta forma este sistema é reconhecido como um regulador
metabólico importante entre a saúde e a doença (Pilla et al., 2003). A CK parece estar
envolvida em certas condições patológicas relacionadas com déficit de energia cerebral, foi
postulado que o prejuízo na função da CK possa ter um papel crítico no processo
neurodegenerativo que leva à perda neuronal. Além disso, a baixa atividade desta enzima está
33
associada a doenças neurodegenerativas, como por exemplo, isquemia cerebral, transtorno
bipolar, doença de Alzheimer e outros estados patológicos (Tomimoto et al., 1993).
4. Radicais Livres
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de
forma independente e que contenha um ou mais elétrons desemparelhados. Por isso, são muito
reativos e atacam moléculas, como lipídios, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres,
podem-se destacar dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as de nitrogênio
(ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido (O2•-), radical hidroxila (OH•),
peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion hipoclorito (OCl-) e o oxigênio “singlet” (1O2). O óxido
nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO-) constituem as principais ERN (Halliwell &
Gutteridge, 1999).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbico, o oxigênio molecular
sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons resultando na formação de água.
Cabe a citocromo oxidase mitocondrial a função de acrescentar quatro elétrons em cada
molécula de oxigênio para gerar duas moléculas de água (Bergendri et al., 1999). Porém,
devido a uma forte configuração eletrônica, o oxigênio tem uma forte tendência a receber um
elétron de cada vez, formando compostos intermediários altamente reativos, como o radical
ânion superóxido e o radical hidroxil (Babior, 1997; Güinçin et al., 2004). O radical ânion
superóxido é formado pela redução do oxigênio molecular por apenas um elétron mediante
aporte de energia (Bowles & Crapo, 2002). Apesar do radical ânion superóxido não poder
atacar diretamente o DNA, lipídeos e proteínas (Halliwell & Gutteredge, 1999); ele é
altamente reativo, devendo ser removido rapidamente dos tecidos pela reação da dismutação
realizada pela enzima superóxido dismutase, em que dois ânions superóxido reagem entre si;
34
sendo um oxidado a oxigênio e outro reduzido a peróxido de hidrogênio (Bowles & Crapo,
2002; Forman & Torres, 2002).
As ERO ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto em processos patológicos do
organismo. Fisiologicamente, essas espécies reativas apresentam diversas funções (Bergendi
et al., 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais livres pode ser benéfico, como
é o caso da liberação de radicais livres pelos neutrófilos, que podem atuar na defesa do
hospedeiro contra uma infecção (Delanty & Dichter, 1998; Halliwell & Gutteridge, 2007).
Participam ainda de processos de sinalização celular e também estão envolvidos na síntese e
regulação de algumas proteínas (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Por outro lado, quando formadas em excesso, essas espécies altamente reativas têm o
potencial de oxidar moléculas (Maxwell, 1995). Com relação aos efeitos prejudiciais das
reações oxidantes ao organismo, os radicais livres podem promover lipoperoxidação, causar a
oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), reagir com proteínas, levando à sua
inativação e consequente alteração de sua função, e reagir com o DNA e RNA, levando a
mutações somáticas e a distúrbios de transcrição (Delanty & Dichter, 1998), dentre outros
efeitos.
4.1. Defesas antioxidantes
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, em baixas concentrações
em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a oxidação desse substrato. Desse
modo, os antioxidantes atuam como protetores da oxidação de biomoléculas por radicais
livres e impedem a propagação da reação em cadeia provocada pelos mesmos (Halliwell &
Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
35
As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX). Além disso, antioxidantes não-enzimáticos,
como a glutationa reduzida (GSH), tocoferol (vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C),
entre outros, auxiliam no combate às ERO. Os antioxidantes estão amplamente distribuídos
nos organismos vivos e constituem um sistema de defesa muito importante em condições
aeróbicas (Halliwell & Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
4.2. Estresse oxidativo
Os radicais livres são formados normalmente no metabolismo celular. As defesas
antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas espécies e são
responsáveis pela manutenção da homeostase entre a produção e a eliminação de radicais
livres. No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um desequilíbrio entre
a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo a ocorrência do estresse
oxidativo. Assim, o termo “estresse oxidativo” é usado para se referir à situação na qual a
geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas antioxidantes disponíveis,
que pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de uma produção
aumentada de oxidantes, bem como da liberação de metais de transição ou a combinação de
quaisquer desses fatores (Bondy & Le Bel, 1993; Cadenas & Davies, 2000; Halliwell, 2006).
O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular, onde a
adaptação ocorre quando as células podem tolerar um estresse oxidativo moderado, que
geralmente resulta em um aumento da síntese de sistemas de defesa antioxidante a fim de
restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar disso, nem sempre o estresse oxidativo
precisa envolver um aumento das defesas antioxidantes. No dano celular, o estresse oxidativo
pode danificar alvos moleculares (DNA, proteínas, carboidratos e lipídios) (Halliwell &
36
Gutteridge, 2007). A resposta à injúria pode ser reversível: a célula entra em um estado de
homeostase alterado temporário ou prolongado, que não leva à morte celular. Já a morte
celular pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose. Na morte celular por necrose, a
célula incha e se rompe, liberando seu conteúdo para o meio extracelular. Pode haver a
liberação de antioxidantes, como a catalase e a glutationa reduzida, e também de próoxidantes, como os íons cobre e ferro e proteínas do grupo heme, agentes esses que podem
afetar as células adjacentes, podendo até mesmo induzi-las a um estresse oxidativo. Já na
apoptose, o mecanismo de morte celular programada é ativado e não há a liberação do
conteúdo celular (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Todos os tecidos humanos são suscetíveis ao dano oxidativo. No entanto, o cérebro
parece ser especialmente sensível a este tipo de lesão. Uma razão importante para isso seria o
alto consumo de oxigênio apresentado por este tecido. Além disso, as membranas neuronais
apresentam grande quantidade de lipídios poliinsaturados, altamente suscetíveis a
lipoperoxidação. Ainda, a autooxidação de muitos neurotransmissores, como dopamina e
noradrenalina, gera espécies reativas, sendo que esta autooxidação pode ser acelerada pela
presença de ferro, amplamente distribuído no cérebro. Por fim, o tecido cerebral apresenta um
baixo nível de defesas antioxidantes (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Existem evidências crescentes sugerindo que as espécies reativas desempenham um
papel importante na patogênese de muitas doenças, como diabetes, neoplasias, aterosclerose,
doenças inflamatórias e doenças neurodegenerativas, em particular a doença de Alzheimer, a
doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica (Reznick & Packer, 1993; Przedborski
et al., 1996; Bem–Menachem et al., 2000), sem, entretanto, obter até o momento uma
explicação completamente satisfatória para explicar o dano cerebral dessas doenças. No
entanto, acredita-se que possíveis mecanismos envolvam deficiência no metabolismo
energético, estresse oxidativo e neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos do
37
tipo NMDA (excitotoxicidade), ou, possivelmente, um somatório desses fatores (Rose &
Henneberry, 1994).
Tem também sido recentemente demonstrado que o estresse oxidativo atua em vários
erros inatos do metabolismo (Colomé et al., 2000, Wajner et al., 2004). A produção excessiva
de radicais livres e a redução das defesas antioxidantes ocorrem em algumas acidemias
orgânicas, como nas acidemias glutárica (Kolker et al., 2001; Latini et al., 2005; 2007),
propiônica e metilmalônica (Fontella et al., 2000), bem como em aminoacidopatias como na
homocistinúria (Streck et al., 2003; Stefanello et al., 2005), tirosinemia tipo I (Bird et al.,
1995) e fenilcetonúria (Artuch et al., 2001; Hagens et al., 2002; Artuch et al., 2004; Sirtori et
al., 2005; Sitta et al., 2006) e também na doença peroxissomal adrenoleucodistrofia ligada ao
X (Vargas et al., 2004; Deon et al., 2006), sugerindo que o estresse oxidativo possa estar
envolvido no dano neurológico observado nessas doenças. Embora o mecanismo responsável
pelo estresse oxidativo nos erros inatos do metabolismo não seja totalmente compreendido, é
possível que o acúmulo de metabólitos tóxicos induza a formação excessiva de radicais livres.
38
PARTE II - OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar os efeitos in vitro dos principais metabólitos que se acumulam na deficiência
de MCAD (ácidos octanóico e decanóico) na ausência ou presença de hiperamonemia
induzida pelo acetato de amônio (AA) sobre parâmetros de estresse oxidativo e de
metabolismo energético em córtex cerebral, fígado e músculo de ratos jovens.
Objetivos Específicos
Investigar o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) sobre as
atividades dos complexos da cadeia transportadora de elétrons (I-IV) e da creatina
quinase em homogeneizados de fígado e músculo esquelético de ratos de 30 dias de
vida.
Investigar o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) sobre dano
oxidativo lipídico (níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), dano
oxidativo protéico (formação de carbonilas) e as defesas antioxidantes nãoenzimáticas (níveis de glutationa reduzida) em homogeneizado de fígado e músculo
esquelético de ratos de 30 dias de vida;
Investigar o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) na presença
ou ausência de hiperamonemia induzida por acetato de amônia sobre as atividades dos
complexos da cadeia transportadora de elétrons (I-IV), da creatina quinase, da citrato
sintase e da succinato desidrogenase em homogeneizados de fígado, músculo
esquelético e córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida.
39
PARTE III – RESULTADOS
Artigo 1
Toxicity of octanoate and decanoate in rat peripheral tissues: evidence of
bioenergetic dysfunction and oxidative stress induction in liver and skeletal
muscle
Giselli Scaini, Kellen R. Simon, Anelise M. Tonin, Estela N. B. Busanello, Alana P. Moura,
Gustavo C. Ferreira, Moacir Wajner, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido ao periódico Archives of Biochemistry and Biophysics
40
Toxicity of octanoate and decanoate in rat peripheral tissues: evidence of bioenergetic
dysfunction and oxidative stress induction in liver and skeletal muscle
Giselli Scainia, Kellen R. Simona, Anelise M. Toninb, Estela N. B. Busanellob, Alana P.
Mourab, Gustavo C. Ferreirac, Moacir Wajnerb, Emilio L. Strecka, Patrícia F. Schucka*
a
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em Ciências da
Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense,
Criciúma, SC, Brazil.
b
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
c
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Sul de Santa Catarina,
Tubarão, SC, Brazil.
*Corresponding Author: Patrícia F. Schuck, Laboratório de Fisiopatologia
Experimental, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica
de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000,
Criciúma, SC, Brazil. Tel: +55 48 34312539. Fax: +55 48 34312671, E-mail:
[email protected]
Abbreviations
CSF: cerebral-spinal fluid; DA: decanoic acid; EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid; GSH:
reduced glutathione; MCAD: medium-chain acyl-Coenzyme A dehydrogenase; MCADD:
medium-chain acyl-Coenzyme A dehydrogenase deficiency; MCFA: medium-chain fatty
acids; OA: octanoic acid; TBA-RS: thiobarbituric acid-reactive substances
41
Abstract
Octanoic (OA) and decanoic (DA) acids tissue accumulation are common findings in
medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency (MCADD), the most frequent
defect of fatty acid oxidation. Affected patients present hypoketotic hypoglycemia,
rhabdomyolysis, hepatomegaly, seizures and lethargy, which may progress to coma and
death. At present the pathophysiological mechanisms underlying hepatic and skeletal
muscle alterations in affected patients are poorly known. Therefore, in the present work we
investigated the in vitro effects of OA and DA, the accumulating metabolites in MCADD,
on various bioenergetics and oxidative stress parameters. It was verified that OA and DA
decreased complex I-III, II-III and IV activities in liver, and also inhibit complex IV
activity in skeletal muscle. In addition, DA decreased complex II-III activity in skeletal
muscle. We also verified that OA and DA increased TBA-RS levels and carbonyl content in
both tissues. Finally, DA, but not OA, significantly decreased GSH levels in rat skeletal
muscle. Our present data show that the medium-chain fatty acids that accumulate in
MCADD impair cellular respiration and elicit oxidative stress in rat liver and skeletal
muscle. It may be therefore presumed that these mechanisms are involved in the
pathophysiology of the hepatopathy and rhabdomyolysis presented by MCADD affected
patients.
Keywords: octanoic acid; decanoic acid; respiratory chain; oxidative stress; liver; skeletal
muscle
42
1. Introduction
Medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase (MCAD, E.C. 1.3.99.3) deficiency
(MCADD) is the most frequent inborn error of fatty acid oxidation with a prevalence
estimated between 1:6,500 and 1:17,000 newborns, depending on the ethnic background of
the population studied [1,2]. This enzyme defect leads to the accumulation of predominantly
octanoic (OA) and decanoic (DA) acids in tissues and body fluids of patients, as well as their
glycine and carnitine derivatives [3]. Cis-4-decenoic acid also accumulates in this disorder,
but to a much lesser extend. The clinical presentation in MCADD typically occurs before two
years of age but can occasionally be delayed until adulthood [4,5,6]. Symptoms tend to appear
in response to crises of metabolic stress triggered by fasting, cold or infections, with patients
presenting vomiting, seizures and lethargy, which may quickly progress to coma and death.
Hypoketotic hypoglycemia, acute encephalopathy, rhabdomyolysis and hepatomegaly are also
common features of MCADD affected patients [7]. Nevertheless, the prognosis is excellent in
case of early diagnosis, especially when detected before the onset of the symptoms, and
frequent feedings are instituted to avoid prolonged period of fasting characterized by lipolysis
and accumulation of the medium-chain fatty acid (MCFA) [8]. At present, the
pathophysiological mechanisms underlying the clinical features in affected patients are poorly
established, especially the hepatic and muscular alterations. Previous works demonstrated
that OA and DA impair energy metabolism and elicit oxidative stress in cerebral cortex of rats
[9,10,11,12]. However, there are few studies evaluating the biochemichal effects of OA and
DA on tissue preparations from peripheral organs. Therefore, in the present work we
investigated the in vitro effects of these MCFA on important biochemical parameters of
energy metabolism and oxidative stress, namely the mitochondrial respiratory chain
complexes and creatine kinase activities, as well as thiobarbituric acid-reactive substances
43
(TBA-RS) levels, carbonyl content and reduced glutathione (GSH) levels, in skeletal muscle
and liver of young rats.
2. Material and Methods
2.1. Reagents
All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). OA and DA were
dissolved on the day of the experiments in the incubation medium used for each technique
with pH adjusted to 7.4.
2.2. Animals
Thirty-day-old male Wistar rats obtained from the Central Animal House of
Universidade do Extremo Sul Catarinense were used. Rats were kept with dams until weaning
at 21 days of age. The animals had free access to water and to a standard commercial chow
and were maintained on a 12:12 h light/dark cycle in an air-conditioned constant temperature
(22±1°C) colony room. The “Principles of Laboratory Animal Care” (NIH publication n° 8023, revised 1996) and the “EC Directive 86/609/EEC” were followed in all experiments. All
efforts were made to minimize the number of animals used and their suffering.
2.3. Tissue preparation and incubation
On the day of the experiments the animals were sacrificed by decapitation without
anesthesia and the liver and skeletal muscle were rapidly excised on a Petri dish placed on ice.
For the determination of the creatine kinase and the mitochondrial complexes II, I-III, II-III
and IV activities, liver and skeletal muscle were homogenized (1:20, w/v) in SETH buffer, pH
7.4 (250 mM sucrose, 2.0 mM EDTA, 10 mM Trizma base and 50 UI.mL-1 heparin). The
44
homogenates were centrifuged at 750 × g for 10 min to discard nuclei and cell debris [13] and
the supernatants were kept at -70°C until being used for enzyme activity determination. The
energy metabolism parameters were determined in homogenates pre-incubated for 30 minutes
at 37º in the absence (control group) or in the presence (test group) of various concentrations
(0.5 - 3 mM) of octanoate (OA) or decanoate (DA) according to standard methods.
For the determination of the oxidative stress parameters, structures were homogenized
in 10 volumes (1:10, w/v) of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM
KCl and centrifuged at 750 x g for 10 min at 4ºC. The pellet was discarded and the
supernatant, a suspension of mixed and preserved organelles, including mitochondria, was
separated and incubated in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl
at 37° C for one hour with OA or DA at concentrations of 0.5, 1 or 3 mM. Controls did not
contain any of these metabolites in the incubation medium. Immediately after incubation,
aliquots were taken to measure the values of TBA-RS levels, GSH concentrations and
carbonyl content.
We always carried out parallel experiments with various blanks (controls) in the
presence or absence of the tested metabolites (OA and DA) and also with or without
supernatants in order to detect artifacts caused by the fatty acids in the assays. By doing so,
any interference of these acids on the reactions used to measure the biochemical parameters
would be identified.
2.4. Spectrophotometric analysis of the respiratory chain complexes I-IV
The activities of succinate-2,6-dichloroindophenol (DCIP)-oxidoreductase (complex
II) and succinate:cytochrome c oxidoreductase (complex II-III) were determined in the
homogenates according to Fischer and colleagues [14]. The activity of NADH:cytochrome c
oxidoreductase (complex I-III) was assayed in the homogenates according to the method
45
described by Schapira and colleagues [15] and that of cytochrome c oxidase (complex IV)
according to Rustin and colleagues [16]. The methods described to measure these activities
were slightly modified, as described in details in a previous report [17]. OA or DA (0.5-3
mM) was added to the reaction medium at the beggining of the assays, while no fatty acid was
added to controls. The activities of the respiratory chain complexes were calculated as nmol .
min-1. mg protein-1.
2.5. Creatine kinase activity
CK activity was measured in total homogenates according to Hughes (1962) with
slight modifications [18]. Results are expressed as µmol of creatine . min-1 . mg protein-1.
2.6. Thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels
TBA-RS was determined according to the method of Esterbauer and Cheeseman [19].
A calibration curve was performed using 1,1,3,3-tetramethoxypropane, and each curve point
was subjected to the same treatment as supernatants. TBA-RS values were calculated as nmol
of TBA-RS. mg protein-1.
2.7. Determination of protein carbonyl formation content
Protein carbonyl content formation, a marker of oxidized proteins, was measured
spectrophotometrically according to Reznick and Packer [20]. The results were calculated as
nmol of carbonyls groups . mg of protein-1, using the extinction coefficient of 22,000 x 106
nmol . mL-1 for aliphatic hydrazones.
46
2.8. Reduced glutathione (GSH) concentrations
Reduced glutathione (GSH) concentrations were measured according to Browne and
Armstrong [21]. Calibration curve was prepared with standard GSH (0.01 - 1 mM) and the
concentrations were calculated as nmol . mg protein-1.
2.9. Protein determination
Protein was measured by the method of Lowry and colleagues [22] using bovine
serum albumin as standard.
2.10. Statistical analysis
Results are presented as mean ± standard error of mean. Assays were performed in
duplicate or triplicate and the mean or median was used for statistical analysis. Data was
analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the post-hoc Duncan
multiple range test when F was significant. Differences between groups were rated significant
at P < 0.05. All analyses were carried out in an IBM-compatible PC computer using the
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software.
3. Results
3.1. OA and DA inhibit mitochondrial respiratory chain activities in peripheral tissues
It was first investigated the effects of OA and DA on the mitochondrial respiratory
chain enzyme activities in rat skeletal muscle and livers. Figure 1 shows that preincubation of
increasing OA and DA concentrations with liver homogenates inhibits complex I-III [OA:
F(3,19)=5.02; P<0.05; DA: F(3,19)=11.3; P<0.001], complex II-III [OA: F(3,23)=8.06;
P<0.001; DA: F(3,23)=14.7; P<0.001] and complex IV [OA: F(3,19)=14.0; P<0.001; DA:
47
F(3,19)=18.3; P<0.001] activities. In addition, preincubation of OA and DA with skeletal
muscle homogenates decreased complex IV activity [OA: F(3,18)=3.87; P<0.05; DA:
F(3,18)=5.63; P<0.01], whereas only DA [F(3,19)=4.73; P<0.05], but not OA, inhibited
complex II-III acitivity. In contrast, neither OA nor DA was able to affect complex II activity
in skeletal muscle and liver.
We then assessed the influence of OA and DA on creatine kinase activity in skeletal
muscle and liver. It can be seen in Table I that these fatty acids did not affect creatine kinase
activity at the tested concentrations in these peripheral tissues.
3.2. OA and DA elicit oxidative damage in skeletal muscle and liver
The next set of experiments was carried out in order to evaluate whether OA and DA
could elicit oxidative damage in rat skeletal muscle and liver. It can be observed in Figure 2
that these fatty acids increased TBA-RS levels [liver: OA: F(3,23)=3.77; P<0.05, DA:
F(3,23)=10.8; P<0.001; skeletal muscle: OA: F(3,23)=3.12; P<0.05, DA: F(3,23)=45.2;
P<0.001] (Figure 2A) and carbonyl content [liver: OA: F(3,19)=18.6; P<0.001, DA:
F(3,19)=4.80; P<0.05; skeletal muscle: OA: F(3,23)=7.39; P<0.01, DA: F(3,23)=47.5;
P<0.001] (Figure 2B) in both tissues. We then investigated the in vitro effect of OA and DA
on the levels of GSH and found that DA [F(3,23)=15.5; P<0.001], but not OA, significantly
decreased this parameter in rat skeletal muscle. In contrast, GSH levels were not altered by
OA and DA in the liver at the tested concentrations (Figure 2C).
4. Discussion
The clinical presentation of MCADD patients occurs especially during or following
crises of metabolic stress and typically includes episodes of hypoketotic hypoglycemia,
48
rhabdomyolysis, hepatomegaly and acute encephalopathy, which may quickly progress to
coma and death [7]. There are a few studies showing in vitro neurotoxic effects of MCFA
accumulating in this disease, impairing energy metabolism and eliciting oxidative damage,
which may be involved in the pathophysiology of tissue damage in MCADD [9,10,12,23,24].
These studies showed that OA and DA disrupt the glycolytic pathway and citric acid cycle,
inhibit the respiratory chain complexes and creatine kinase activities, uncouple oxidative
phosphorylation and induce oxidative stress [10-12]. However, practically nothing has been
reported on the effect of these major fatty acids accumulating in MCADD on the liver and
skeletal muscle, tissues that have been shown to be altered in patients affected by this disorder
[7,25]. To our knowledge, the only observations available in the literature indicate that OA
increases oxygen consumption and decreases cytosolic ATP concentrations and the glycolytic
rate in perfused rat liver [26-28]. The present study extended these investigations by initially
studying the effects of OA and DA on important energy metabolism parameters in liver and
skeletal muscle of young rats, namely the respiratory chain complexes and creatine kinase
activities. It was first verified that OA and DA decreased complex I-III, II-III and IV activities
in the rat liver. Furthermore, OA and DA decreased complex IV activity, whereas DA, but not
OA, inhibited complex II-III activity in skeletal muscle. Previous studies have shown that OA
does not affect these respiratory chain activities in vitro [9] and that DA inhibits complex IIIII and complex IV in cerebral cortex homogenates only at 3 mM concentration [10]. Taken
together these data, it is conceivable that the respiratory chain in hepatic cells is more
vulnerable to the MCFA OA and DA, as compared to the cerebral cortex and skeletal muscle.
The distinct OA- and DA-elicited inhibition of the respiratory chain observed in the various
tissues may be possibly attributed to distinct cellular milieu, tissue-specific isoforms of
various nuclear-encoded subunits of the respiratory chain complexes, as previously
emphasized [16,29,30], or alternatively, to organ specific regulation of electron fluxes of the
49
respiratory chain [31]. As a matter of fact, similar findings were already reported for
methylmalonic acid [32]. We also observed that OA and DA did not affect creatine kinase
activity in skeletal muscle and liver, which is in line with results obtained using brain
preparations [10].
Our present findings showing impairment of energy homeostasis by the MCFA
accumulating in MCADD may be related to the high levels of lactate in blood and CSF, as
well as to the abnormalities of skeletal muscle (rhabdomyolysis), indicating mitochondrial
dysfunction of muscle fibers, seen in some MCAD-deficient patients, especially during crises
[4,6].
We also investigated whether OA and DA could elicit oxidative damage in rat skeletal
muscle and liver. We observed that OA and DA increased TBA-RS levels and carbonyl group
content in liver and skeletal muscle. Since TBA-RS levels reflect the amount of
malondialdehyde formation, an end product of membrane fatty acid peroxidation [33], and
carbonyl group content is a marker for assessing protein oxidation, it may be concluded that
these fatty acids elicit lipid and protein oxidative damage in liver and skeletal muscle.
Regarding to the mechanisms by which OA and DA exerted their effects, it has been showed
that the reactive species scavengers trolox and melatonin were able to prevent the lipid
peroxidation caused by these MCFA in brain [11], indicating that it is probably mediated by
reactive oxygen species generation. In this scenario, it is tempting to speculate that the same
mechanism occurs in liver and skeletal muscle. Nevertheless, it cannot be ruled out the
involvement of additional mechanisms leading to oxidative damage.
Regarding to GSH concentrations, the major contributor to the redox state of the cells,
DA diminished GSH levels in skeletal muscle, but not in liver. In contrast, OA did not affect
GSH concentrations in these tissues. Since this parameter is used to evaluate the capacity of a
tissue to prevent and respond to damage associated to free radical processes [13,33,34], it may
50
be concluded that the rat skeletal muscle antioxidant defenses were compromised by DA.
Considering that adequate levels of antioxidants are essential to protect cells against oxidative
damage and an imbalance in the pro-oxidant/antioxidant homeostasis induces oxidative stress,
it is possible that the significant reduction of GSH induced by DA may be related at least in
part to the increased in vitro lipid peroxidation caused by this fatty acid. This is in line with
the observations that GSH is considered an important defense against lipid oxidative damage
eliminating hydrogen peroxide and peroxyl radicals formed during this process and that
supplementation of GSH to cortical supernatants attenuated in vitro lipid oxidative damage
induced by DA in cerebral cortex [11]. On the other hand, we cannot rule out that GSH
decrease could be secondary to the increased reactive species generation provoked by DA.
At present, we cannot establish the exact pathophysiological relevance of our data.
However, it should be stressed that OA and particularly DA provoked bioenergetic
dysfunction and elicited oxidative stress at similar concentrations (0.5 mM and higher) to
those found in plasma (about 0.7 mM) of MCADD-affected patients [3,35]. Moreover, during
metabolic crises, the concentrations of these fatty acids dramatically increase in these patients
due to accelerated lipolysis and a blockage of the MCAD reaction [7,36].
5. Conclusion
In conclusion, the present study provides evidence that OA and DA, the major
metabolites accumulating in MCADD, disturb mitochondrial bioenergetics and elicit
oxidative stress in rat peripheral tissues. In case our findings could be extrapolated to the
human condition, it is presumed that these effects could be involved in the hepatopathy and
skeletal muscle-related symptoms frequently found in MCADD patients [7].
51
6. Acknowledgements
This work was supported by grants from CNPq, FAPESC and PIBIC/UNESC.
7. References
[1] P. Rinaldo, D. Matern, M.J. Bennett, Fatty acid oxidation disorders. Annu. Rev. Physiol.
64 (2002) 477-502.
[2] M. Lindner, G.F. Hoffmann, D. Matern, Newborn screening for disorders of fatty-acid
oxidation: experience and recommendations from an expert meeting. J. Inherit. Metab. Dis. 33
(2010) 521-526.
[3] W. Onkenhout, V. Venizelos, P.F.H. van der Poel, M.P.M. Van der Heuvel, B.J.H.M.
Poorthuis, Identification and quantification of intermediates of unsaturated fatty acid
metabolism in plasma of patients with fatty acid oxidation disorders. Clin. Chem. 41 (1995)
1467–1474.
[4] W. Ruitenbeek, P.J. Poels, D.M. Turnbull, B. Garavaglia, R.A. Chalmers, R.W. Taylor,
F.J. Gabreels, Rhabdomyolysis and acute encephalopathy in late onset medium chain acylCoA dehydrogenase deficiency. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 58 (1995) 209-214.
[5] K. Raymond, A.E. Bale, C.A. Barnes, P. Rinaldo, Medium-chain acyl Co-A
dehydrogenase deficiency: sudden and unexpected death of a 45 year old woman. Genet.
Med. 1 (1999) 293–294.
[6] F. Feillet, G. Steinmann, C. Vianey-Saban, C. de Chillou, N. Sadoul, E. Lefebvre, M.
Vidailhet, P.E. Bollaert, Adult presentation of MCAD deficiency revealed by coma and
severe arrhythmias. Intensive Care Med. 29 (2003) 1594–1597.
52
[7] C.R. Roe, J. Ding, Mitochondrial fatty acid oxidation disorders, in: C.R. Scriver, A.L.
Beaudet, W.S Sly, D. Valle (Eds.), The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease.
McGraw-Hill, New York, 2001, pp. 1909–1963.
[8] P. Rinaldo, S. Hahn, D. Matern, Inborn errors of amino acid, organic acid, and fatty acid
metabolism, in: C.A. Burtis, E.R. Ashwood, D.E. Bruns, (eds.) Tietz textbook of clinical
chemistry and molecular diagnostics. 4th Edition. Elsevier Saunders, St. Louis, 2006, pp.
2207-2247.
[9] D.R. de Assis, C.A. Ribeiro, R.B. Rosa, P.F. Schuck, K.B. Dalcin, C.R. Vargas, C.M.
Wannmacher, C.S. Dutra-Filho, A.T. Wyse, P. Briones, M. Wajner, Evidence that
antioxidants prevent the inhibition of Na+,K+-ATPase activity induced by octanoic acid in rat
cerebral cortex in vitro. Neurochem. Res. 28 (2003) 1255-1263.
[10] D. Reis de Assis, R.C. Maria, R. Borba Rosa, P.F. Schuck, C.A. Ribeiro, G. da Costa
Ferreira, C.S. Dutra-Filho, A. Terezinha de Souza Wyse, C.M. Duval Wannmacher, M.L.
Santos Perry, M Wajner, Inhibition of energy metabolism in cerebral cortex of young rats by
the medium-chain fatty acids accumulating in MCAD deficiency. Brain Res. 1030 (2004)
141-151.
[11] P.F. Schuck, G.C.Ferreira, A.P. Moura, E.N. Busanello, A.M. Tonin, C.S. Dutra-Filho,
M. Wajner, Medium-chain fatty acids accumulating in MCAD deficiency elicit lipid and
protein oxidative damage and decrease non-enzymatic antioxidant defenses in rat brain.
Neurochem. Int. 54 (2009) 519-525.
[12] P.F. Schuck, G.C.Ferreira, A.M. Tonin, C.M. Viegas, E.N. Busanello, A.P. Moura, A.
Zanatta, F. Klamt, M. Wajner, Evidence that the major metabolites accumulating in mediumchain acyl-CoA dehydrogenase deficiency disturb mitochondrial energy homeostasis in rat
brain. Brain Res. 1296 (2009) 117-126.
53
[13] P. Evelson, M. Travacio, M. Repetto, J. Escobar, S. Llesuy, E.A. Lissi, Evaluation of
total reactive antioxidant potential (TRAP) of tissue homogenates and their cytosols. Arch.
Biochem. Biophys. 388 (2001) 261-266.
[14] J.C. Fischer, W. Ruitenbeek, J.A. Berden, J.M. Trijbels, J.H. Veerkamp, M. Stadhouders,
R.C. Sengers, A.J. Janssen, Differential investigation of the capacity of succinate oxidation in
human skeletal muscle. Clin. Chim. Acta. 153 (1985) 23-36.
[15] A.H. Schapira, V.M. Mann, J.M., Cooper, D. Dexter, S.E. Daniel, P. Jenner, J.B. Clark,
C.D. Marsden, Anatomic and disease specificity of NADH CoQ1 reductase (complex I)
deficiency in Parkinson’s disease. J. Neurochem. 55 (1990) 2142-2145.
[16] P. Rustin, D. Chretien, T. Bourgeron, B. Gérard, A. Rötig, J.M. Saudubray, A
Biochemical and Molecular investigations in respiratory chain deficiencies. Clin. Chim. Acta.
228 (1994) 35-51.
[17] C.G. da Silva, C.A. Ribeiro, G. Leipnitz, C.S. Dutra-Filho, A.T. Wyse, C.M.
Wannmacher, J.J. Sarkis, C. Jakobs, M. Wajner, Inhibition of cytochrome c oxidase activity
in rat cerebral cortex and human skeletal muscle by D-2-hydroxyglutaric acid in vitro.
Biochim. Biophys. Acta. 1586 (2002) 81-91.
[18] P.F. Schuck, G. Leipnitz, C.A. Ribeiro, K.B. Dalcin, D.R. Assis, A.G. Barschak, V.
Pulrolnik, C.M. Wannmacher, A.T. Wyse, M. Wajner, Inhibition of creatine kinase activity in
vitro by ethylmalonic acid in cerebral cortex of young rats. Neurochem. Res. 27 (2002) 16331639.
[19] H. Esterbauer, K.H. Cheeseman,. Determination of aldehydic lipid peroxidation
products: malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Methods Enzymol. 186 (1990) 407-421.
[20] A.Z. Reznick, L. Packer, Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for
carbonyl assay. Methods Enzymol. 233 (1994) 357-363.
54
[21] R.W. Browne, D. Armstrong. Reduced glutathione and glutathione disulfide. Methods
Mol. Biol. 108 (1998) 347-352.
[22] O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall, Protein measurement with the
Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275.
[23] J.A. Perper, M. Ahdab-Barmada, Fatty liver, encephalopathy, and sudden unexpected
death in early childhood due to medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency.
Am. J. Forensic Med. Pathol. 13 (1992) 329-334.
[24] F.B. Davis, P.J. Davis, S.D. Blas, M. Schoeln, Action of long-chain fatty acids in vitro on
Ca2+-stimulatable, Mg2+-dependent ATPase activity in human red cell membranes. Biochem.
J. 248 (1987) 511 – 516.
[25] P. Rinaldo, Fatty acid transport and mitochondrial oxidation disorders. Semin. Liver Dis.
21 (2001) 489-500.
[26] R. Scholz, U. Schwabe, S. Soboll, Influence of fatty acids on energy metabolism. 1.
Stimulation of oxygen consumption, ketogenesis and CO2 production following addition of
octanoate and oleate in perfused rat liver. Eur. J. Biochem. 141 (1984) 223-230.
[27] S. Soboll, S. Gründel, U. Schwabe, R. Scholz. Influence of fatty acids on energy
metabolism. 2. Kinetics of changes in metabolic rates and changes in subcellular adenine
nucleotide contents and pH gradients following addition of octanoate and oleate in perfused
rat liver. Eur. J. Biochem. 141 (1984) 231-236.
[28] C. Morand, C. Besson, C. Demigne, C. Remesy, Importance of the modulation of
glycolysis in the control of lactate metabolism by fatty acids in isolated hepatocytes from fed
rats. Arch. Biochem. Biophys. (1994) 254-260.
[29] V.J. Clay, C.I. Ragan. 1988. Evidence for the existence of tissue specific isoenzymes of
mitochondrial NADH dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 157 (1988) 1423–
1428.
55
[30] P. Merle, B. Kadenbach. On the heterogeneity of vertebrate cytochrome c oxidase
polypeptide chain composition. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 361 (1980) 1257–1259.
[31] R.W. Taylor, M.A. Birch-Machin, K. Bartlett, D.M. Turnbull. Succinate-cytochrome c
reductase: assessment of its value in the investigation of defects of the respiratory chain.
Biochim. Biophys. Acta 1181 (1993) 261–265.
[32] L.F. Pettenuzzo, G.C. Ferreira, A.L. Schmidt, C.S. Dutra-Filho, A.T. Wyse, M. Wajner.
Differential inhibitory effects of methylmalonic acid on respiratory chain complex activities
in rat tissues. Int. J. Dev. Neurosci. 24 (2006) 45-52.
[33] B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Detection of free radicals and others reactive species:
trapping and fingerprinting, in: B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge (eds.), Free Radicals in
Biology and Medicine. Oxford University Press, Oxford, 1999, pp. 351–425.
[34] E. Lissi, M. Salim-Hanna, C. Pascual, M.D. del Castillo, Evaluation of total antioxidant
potential (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enhanced chemiluminescence
measurements. Free Rad. Biol. Med. 18 (1995) 153-158.
[35] M. Duran, S.K. Wadman. Chemical diagnosis of inherited defects of fatty acid
metabolism and ketogenesis. Enzyme. 38 (1987) 115-123.
[36] G. Martínez, G. Jiménez-Sánchez, P. Divry, C. Vianey-Saban, E. Riudor, M. Rodés, P.
Briones, A. Ribes, Plasma free fatty acids in mitochondrial fatty acid oxidation defects. Clin.
Chim. Acta 267 (1997) 143-154.
56
Table I. Creatine kinase (CK) activity in liver and skeletal muscle homogenates exposed
to octanoic (OA) and decanoic (DA) acids
Tissue
Control
3 mM OA
3 mM DA
Liver
2.69 ± 0.06
2.61 ± 0.09
2.43 ± 0.08
Skeletal Muscle
68.4 ± 2.24
63.8 ± 3.01
69.13 ± 3.38
Values are mean ± standard error of mean for four independent experiments (animals) per
group measured in the presence or absence of OA or DA. Data were expressed as (µmol
creatine . min-1 . mg protein-1). No significant differences were detected between groups
(ANOVA).
57
Figures
Figure 1. In vitro effects of octanoic (OA) and decanoic (DA) acids on the respiratory chain
complexes I-III (A), II (B), II-III (C) and IV (D) activities in rat liver and skeletal muscle.
Values are means ± standard error of mean for five to six independent experiments performed
in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg protein-1. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <
0.001 compared to controls (Duncan multiple range test).
58
Figure 2. In vitro effect of octanoic (OA) and decanoic (DA) acids on thiobarbituric acidreactive substances (TBA-RS) (A), carbonyl content (B) and glutathione (GSH) levels (C) in
rat liver and skeletal muscle. Values are means ± standard error of mean for five to six
independent experiments performed in triplicate and are expressed as nmol . mg protein-1. *P
< 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared to controls (Duncan multiple range test).
59
Artigo 2
Ammonia potentiates toxicity of octanoate and decanoate in rat tissues
Giselli Scaini, Natália Rochi, Bethânia M. Borges, Bruna W. Freitas, Isabela C. Jeremias,
Gustavo C. Ferreira, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido ao periódico Cellular Physiology and Biochemistry
60
Ammonia potentiates toxicity of octanoate and decanoate in rat tissues
Giselli Scainia, Natália Rochia, Bethânia M. Borgesa, Bruna W. Freitasa, Isabela C. Jeremiasa,
Gustavo C. Ferreirac, Emilio L. Strecka, Patrícia F. Schucka*
a
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em Ciências da
Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense,
Criciúma, SC, Brazil.
b
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Sul de Santa Catarina,
Tubarão, SC, Brazil.
Short Title: Ammonia and medium-chain fatty acids toxic effects
*Corresponding Author: Patrícia F. Schuck, Laboratório de Fisiopatologia Experimental,
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da
Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Criciúma, SC, Brazil. Tel: +55
48 34312539. Fax: +55 48 34312671, E-mail: [email protected]
61
Abstract
Background/Aims: Hyperammonemia is observed in patients affected by medium-chain acylCoA dehydrogenase deficiency (MCADD). At present, the pathomechanisms of tissues
damage are unclear. We investigated the in vitro effect of octanoic (OA) and decanoic (DA)
acids in the presence of ammonium acetate (AA) on energy metabolism parameters in rat
cerebral cortex, liver and skeletal muscle.
Methods: OA and DA were added to the reaction medium containing rat tissue homogenates
in the absence or presence of AA and the respiratory chain complexes, succinato
dehydrogenase, citrate synthase and creatine kinase activities were evaluated.
Results: Our results showed that AA plus DA inhibited complex I-III and II and that AA
potentiate DA-induced complex IV inhibition in cerebral cortex, whereas OA plus AA
inhibited complex IV. AA also enhanced the OA-induced complex IV inhibition in liver. In
addition, AA strengthened the OA- and DA-induced decrease in complex IV in skeletal
muscle and, when combined with DA, inhibited complex II and citrate synthase activities, but
not interfere on OA- and DA-effects on citrate synthase in brain and skeletal muscle.
Conclusion: Our results suggest that AA potentiates the energy disturbance elicited by OA
and DA in different tissues. These findings might contribute to the pathophysiology of
MCADD.
Keywords: octanoic acid; decanoic acid; ammonia; mitochondria; MCAD deficiency
62
1. Introduction
Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD; E.C. 1.3.99.3) deficiency
(MCADD; OMIM #201450) is the most common mitochondrial beta-oxidation of fatty acids
defect. Its prevalence is estimated to range between 1:6,500 and 1:17,000 newborns,
depending on the ethnic background of the population studied [1,2]. This autossomic
recessive disorder causes a defective breakdown of medium-chain fatty acids, leading to the
accumulation of octanoic, decanoic and cis-4-decenoic acids and their glycine and carnitine
derivatives in patients’ tissues and body fluids [3]. The clinical presentation of MCADD
typically occurs before two years of age but can occasionally be delayed until adulthood [4-6].
Symptoms tend to appear in response to potentially lethal metabolic crises usually triggered
by fever, vomiting, diarrhea, infections and mainly prolonged fasting, with patients presenting
episodes of encephalopathy, behavior abnormalities, attention deficit disorder, seizures and
lethargy, which may quickly progress to coma and death [3,7,8]. The patients also present
muscle weakness, rhabdomyolisis, and liver compromising [8]. Laboratory features includes
hypoketotic hypoglycemia, metabolic acidosis, hyperlactiacidemia, and myoglobinuria [8]. In
addition, hyperammonemia is also frequently observed in patients suffering from MCADD
[3,8,9].
At present, the pathophysiological mechanisms underlying the tissue damage in
affected patients are not clear yet. It has been demonstrated that OA and DA compromise the
glycolytic pathway and citric acid cycle functioning, increase oxygen consumption in the liver
and inhibit activities of the respiratory chain complexes, Na+,K+-ATPase and creatine kinase
in rat brain [10-12]. These fatty acids were also shown to induce oxidative stress in the brain,
as well as compromise brain mitochondrial homeostasis [13,14]. Considering that the role of
hyperammonemia in the pathophysiology of MCADD is virtually unknown, in the present
63
work we investigated the in vitro effects of these OA and DA, the main fatty acids
accumulated in MCADD, associated with ammonium acetate (AA) on biochemical
parameters of energy metabolism, namely the mitochondrial respiratory chain complexes IIV, creatine kinase, citrate synthase and succinate dehydrogenase activities in cerebral cortex,
liver and skeletal muscle of young rats.
2. Material and Methods
2.1. Reagents
All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). OA, DA and AA
were dissolved on the day of the experiments in the incubation medium used for each
technique with pH adjusted to 7.4.
2.2. Animals
Twelve 30-day-old male Wistar rats obtained from the Central Animal House of
Universidade do Extremo Sul Catarinense were used. Rats were kept with dams until weaning
at 21 days of age. The animals had free access to water and to a standard commercial chow
and were maintained on a 12:12 h light/dark cycle in an air-conditioned constant temperature
(22±1°C) colony room. The “Principles of Laboratory Animal Care” (NIH publication n° 8023, revised 1996) and the “EC Directive 86/609/EEC” were followed in all experiments. All
efforts were made to minimize the number of animals used and their suffering.
2.3. Tissue preparation and incubation
On the day of the experiments the animals were sacrificed by decapitation without
anesthesia and the brain, liver and skeletal muscle were rapidly excised on a Petri dish placed
64
on ice. For the determination of the creatine kinase, citrate synthase, succinate dehydrogenase
and the mitochondrial complexes II, I-III, II-III and IV activities, cerebral cortex, liver and
skeletal muscle were homogenized (1:20, w/v) in SETH buffer, pH 7.4 (250 mM sucrose, 2.0
mM EDTA, 10 mM Trizma base and 50 UI.mL-1 heparin). The homogenates were centrifuged
at 750 × g for 10 min to discard nuclei and cell debris [15] and the supernatants were kept at 70°C until being used for enzyme activity determination. The energy biochemical parameters
were determined in homogenates pre-incubated for 30 minutes at 37°C in the absence (control
group) or in the presence (test group) of OA (3 mM), DA (3 mM) and/or AA (1 mM)
according to standard methods.
We always carried out parallel experiments with various blanks (controls) in the
presence or absence of the tested metabolites (OA, DA and AA) and also with or without
supernatants in order to detect artifacts caused by the fatty acids in the assays. By doing so,
any interference of these compounds on the reactions used to measure the biochemical
parameters would be identified.
2.4. Spectrophotometric analysis of the respiratory chain complexes I-IV
The activities of succinate-2,6-dichloroindophenol (DCIP)-oxidoreductase (complex
II) and succinate:cytochrome c oxidoreductase (complex II-III) were determined in the
homogenates according to Fischer and colleagues [16]. The activity of NADH:cytochrome c
oxidoreductase (complex I-III) was assayed in the homogenates according to the method
described by Schapira and colleagues [17] and that of cytochrome c oxidase (complex IV)
according to Rustin and colleagues [18]. The methods described to measure these activities
were slightly modified, as described in details in a previous report [19]. OA or DA (0.5-3
mM) was added to the reaction medium at the beggining of the assays, while no fatty acid was
65
added to controls. The activities of the respiratory chain complexes were calculated as nmol .
min-1. mg protein-1.
2.5. Creatine kinase activity
CK activity was measured in total homogenates according to Hughes [20] with slight
modifications [21]. Results are expressed as µmol of creatine . min-1 . mg protein-1.
2.6. Citrate synthase activity
The activity of citrate synthase was measured in cerebral cortex and liver homogenates
according to Srere [22]. The activity was determined as DTNB reduction at λ=412 nm and
was calculated as nmol . min-1. mg protein-1.
2.7. Succinate dehydrogenase activity
The activity of succinate dehydrogenase was determined in homogenates from
cerebral cortex, liver and skeletal muscle according to Fischer and colleagues [17]. The
activity of the succinate dehydrogenase was calculated as nmol . min-1. mg protein-1.
2.8. Protein determination
Protein was measured by the method of Lowry and colleagues [23] using bovine
serum albumin as standard.
2.9. Statistical analysis
Results are presented as mean ± standard error of mean. Assays were performed in
duplicate or triplicate and the mean was used for statistical analysis. Data were analyzed using
one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the post-hoc Duncan multiple range test
66
when F was significant. Differences between groups were rated significant at P < 0.05. All
analyses were carried out in an IBM-compatible PC computer using the Statistical Package
for the Social Sciences (SPSS) software.
3. Results
We first examined the effects of OA and DA in the absence or the presence of AA on
the mitochondrial respiratory chain enzyme activities in rat cerebral cortex, liver and skeletal
muscle. It was observed that AA plus DA inhibited complex I-III and II activities in cerebral
cortex, whereas OA plus AA inhibited complex IV activity. In addition, AA was able to
potentiate the DA-induced inhibition of complex IV activity in this tissue, but not that of
complex II-III (Figure 1). We also observed that AA enhanced only the OA-induced complex
IV inhibition in liver, without altering the effects of OA and DA on the other respiratory chain
complexes (Figure 2). In skeletal muscle, AA strengthened the OA- and DA-induced decrease
in complex IV activity and, when supplemented simultaneously to DA, provoked an
inhibition of complex II activity. On the other hand, the effects of OA and DA on complex IIII and II-III were not modified by the presence of AA in the incubation medium in this
peripheral tissue (Figure 3).
We then evaluated the effects of OA and DA in the absence or the presence of AA on
the activities of important enzymes involved in energy metabolism. We observed that the
combination of AA plus DA elicited a decrease in citrate synthase activity in liver (Figure 4).
However, AA was not able to modify the influence of OA and DA on citrate synthase in
cerebral cortex and skeletal muscle. Finally, it was verified that AA did not alter the effects of
OA and DA on creatine kinase (data not shown) and succinate dehydrogenase (Figure 5),
regardless of the studied structure.
67
4. Discussion
High ammonia levels have been reported in patients affected by MCADD, a disorder
affecting fatty acid oxidation [3,8,9]. At the present, the ammonia toxicity has been widely
described, especially in the brain. In this context, Felipo and colleagues [24] have
demonstrated that high ammonia concentrations increase nitric oxide production and inhibit
glutamate uptake, leading to neurochemistry alterations and excitotoxicity. In addition,
mitochondrial energy alterations, such as ATP depletion, inhibition of citric acid cycle
enzymes activities and induce mitochondrial sweeling have also been attributed to ammonia
[24-27], as well as potentiation of alpha-ketoglutarate dehydrogenase inhibition elicited by
fatty acyl-CoA [28].
In the present work we studied the effects of OA, DA and/or AA on various
bioenergetic parameters. It was first verified that the effects of OA and DA separately
inhibiting mitochondrial respiratory chain complexes activities in brain, liver and skeletal
muscle were similar to those obtained in previous studies [11,12,29]. We then evaluated the
influence of AA on these effects in different central and peripheral structures. When added
alone to incubation medium, AA inhibited complex II-III in liver, complex IV activity in the
brain, liver and skeletal muscle, and increased complex II in liver. Regarding the associations
between AA and the fatty acids, we observed that inhibitions of complex I-III and II in the
brain and complex II in skeletal muscle were detected only when DA plus AA were
simultaneously present in the incubation medium, suggesting a synergistic action between AA
and DA. In addition, evidences for additive effects between AA and the fatty acids were
observed, since AA enhanced the effects of OA and DA on complex IV in the different
structures. Taken together, we can see that ammonia potentiates OA and DA effects and that
68
complex IV features a higher vulnerability to these metabolites, as compared to the other
respiratory chain complexes.
The distinct inhibitions of the respiratory chain observed in the various tissues may be
possibly attributed to distinct cellular milieu, tissue-specific isoforms of various nuclearencoded subunits of the respiratory chain complexes, as previously emphasized [18,30,31], or
alternatively, to organ specific regulation of electron fluxes of the respiratory chain [32]. As a
matter of fact, similar findings were already reported for methylmalonic acid [33].
Our next step was to investigate the effect of OA, DA and AA on citrate synthase and
succinate dehydrogenase activity, important enzymes of the citric acid cycle. We observed
that OA, DA and AA, per se or associated, inhibited sitrate synthase activity in the brain, but
only the combination of DA plus AA inhibited the same enzyme activity in liver. On the other
hand, citrate synthase activity was not affected by these compounds in skeletal muscle.
Succinate dehydrogenase activity was decreased by DA, but AA failed to enhance this
inhibition. The data suggest that citric acid cycle activity is impaired by the presence of OA,
DA and/or AA, probably yielding a diminished NADH and FADH2 production to feed
respiratory chain and consequently potentiating ATP depletion caused by the direct inhibition
elicited by OA, DA and/or AA.
Finally, we observed that creatine kinase, a critical enzyme needed for cell energy
transfer, was not affected by OA, DA and AA, which is in line with previous results [12,29].
Our present findings showing impairment of energy homeostasis by high levels of OA,
DA and AA may be related to the high levels of lactate in blood and CSF, as well as to the
abnormalities of skeletal muscle (rhabdomyolysis), indicating that mitochondrial dysfunction
of muscle fibers, frequently observed in MCAD-deficient patients, especially during crises
[4,6] may be secondary to an bioenergetic disturbance due to the toxicity to the toxicity of the
accumulating fatty acids associated to high ammonia concentrations.
69
In conclusion, the present study provides evidence for a synergistic/additive effect
between OA, DA and ammonia impairing bioenergetics parameters in brain, liver and skeletal
muscle of rats. Taken together, our results give rise to the hypothesis of hyperamonemia,
which is commonly found in patients suffering from MCADD, exacerbating the cell damage
caused by toxic medium-chain fatty acids. In case our findings could be extrapolated to the
human condition, it is presumed that these effects could be involved in the brain damage,
hepatopathy and skeletal muscle-related symptoms frequently found in MCADD patients [3].
5. Acknowledgements
This work was supported by grants from CNPq, FAPESC and PIBIC/UNESC.
70
6. References
[1] Rinaldo P, Matern D, Bennett MJ: Fatty acid oxidation disorders. Annu Rev Physiol
2002;64:477-502.
[2] Lindner M, Hoffmann GF, Matern D: Newborn screening for disorders of fatty-acid
oxidation: experience and recommendations from an expert meeting. J Inherit Metab Dis
2010;33:521-526.
[3] Roe CR, Ding J: Mitochondrial fatty acid oxidation disorders, in: Scriver CR, Beaudet
AL, Sly WS, Valle D (Eds.): The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease.
McGraw-Hill, New York, 2001, pp. 1909–1963.
[4] Ruitenbeek W, Poels PJ, Turnbull DM, Garavaglia B, Chalmers RA, Taylor RW,
Gabreels FJ: Rhabdomyolysis and acute encephalopathy in late onset medium chain acyl-CoA
dehydrogenase deficiency. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1995;58:209-214.
[5] Raymond K, Bale AE, Barnes CA, Rinaldo P: Medium-chain acyl Co-A dehydrogenase
deficiency: sudden and unexpected death of a 45 year old woman. Genet Med 1999;1:293–
294.
[6] Feillet F, Steinmann G, Vianey-Saban C, de Chillou C, Sadoul N, Lefebvre E, Vidailhet
M, Bollaert PE: Adult presentation of MCAD deficiency revealed by coma and severe
arrhythmias. Intensive Care Med 2003;29:1594–1597.
[7] Iafolla AK, Thompson RJ Jr, Roe CR: Medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase
deficiency: clinical course in 120 affected children. J Pediatr 1994;124:409-415.
[8] Schatz UA, Ensenauer R: The clinical manifestations of MCAD deficiency: challenges
towards adulthood in the screened population. J Inherit Metab Dis 2010;33:513-520.
[9] Lang TF: Adult presentations of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency
(MCADD). J Inher Metab Disease 2009;32:675-683.
71
[10] Scholz R, Schwabe U, Soboll S: Influence of fatty acids on energy metabolism. 1.
Stimulation of oxygen consumption, ketogenesis and CO2 production following addition of
octanoate and oleate in perfused rat liver. Eur J Biochem 1984;141:223-230.
[11] de Assis DR, Ribeiro CA, Rosa RB, Schuck PF, Dalcin KB, Vargas CR, Wannmacher
CM, Dutra-Filho CS, Wyse AT, Briones P, Wajner M: Evidence that antioxidants prevent the
inhibition of Na+,K+-ATPase activity induced by octanoic acid in rat cerebral cortex in vitro.
Neurochem Res 2003;28:1255-1263.
[12] Reis de Assis D, Maria RC, Borba Rosa R, Schuck PF, Ribeiro CA, da Costa Ferreira G,
Dutra-Filho CS, Terezinha de Souza Wyse A, Duval Wannmacher CM, Santos Perry ML,
Wajner M: Inhibition of energy metabolism in cerebral cortex of young rats by the mediumchain fatty acids accumulating in MCAD deficiency. Brain Res 2004;1030:141-151.
[13] Schuck PF, Ferreira GC, Moura AP, Busanello EN, Tonin AM, Dutra-Filho CS, Wajner
M: Medium-chain fatty acids accumulating in MCAD deficiency elicit lipid and protein
oxidative damage and decrease non-enzymatic antioxidant defenses in rat brain. Neurochem
Int 2009;54:519-525.
[14] Schuck PF, Ferreira GC, Tonin AM, Viegas CM, Busanello EN, Moura AP, Zanatta A,
Klamt F, Wajner M: Evidence that the major metabolites accumulating in medium-chain acylCoA dehydrogenase deficiency disturb mitochondrial energy homeostasis in rat brain. Brain
Res 2009;1296:117-126.
[15] Evelson P, Travacio M, Repetto M, Escobar J, Llesuy S, Lissi EA: Evaluation of total
reactive antioxidant potential (TRAP) of tissue homogenates and their cytosols. Arch
Biochem Biophys 2001;388:261-266.
[16] Fischer JC, Ruitenbeek W, Berden JA, Trijbels JM, Veerkamp JH, Stadhouders M,
Sengers RC, Janssen AJ: Differential investigation of the capacity of succinate oxidation in
human skeletal muscle. Clin Chim Acta 1985;153:23-36.
72
[17] Schapira AH, Mann VH, Cooper JM, Dexter D, Daniel SE, Jenner P, Clark JB, Marsden
CD: Anatomic and disease specificity of NADH CoQ1 reductase (complex I) deficiency in
Parkinson’s disease. J Neurochem 1990;55:2142-2145.
[18] Rustin P, Chretien D, Bourgeron T, Gérard B, Rötig A, Saudubray JM: A Biochemical
and Molecular investigations in respiratory chain deficiencies. Clin Chim Acta 1994;228:3551.
[19] da Silva CG, Ribeiro CA, Leipnitz G, Dutra-Filho CS, Wyse AT, Wannmacher CM,
Sarkis JJ, Jakobs C, Wajner M: Inhibition of cytochrome c oxidase activity in rat cerebral
cortex and human skeletal muscle by D-2-hydroxyglutaric acid in vitro. Biochim Biophys
Acta 2002;1586:81-91.
[20] Hughes BP: A method for estimation of serum creatine kinase and its use in comparing
creatine kinase and aldolase activity in normal and pathologic sera. Clin Chim Acta
1961;7:597-604.
[21] Schuck PF, Leipnitz G, Ribeiro CA, Dalcin KB, Assis DR, Barschak AG, Pulrolnik V,
Wannmacher CM, Wyse AT, Wajner M: Inhibition of creatine kinase activity in vitro by
ethylmalonic acid in cerebral cortex of young rats. Neurochem Res 2002;27:1633-1639.
[22] Srere PA: Citrate synthase. Methods Enzymol 1969;13:3-11.
[23] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ: Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.
[24] Felipo V, Kosenko E, Minana MD, Marcaida G, Grisolia S: Molecular mechanism of
acute ammonia toxicity and of its prevention by L-carnitine. Adv Exp Med Biol 1994;368:65–
77.
[25] Cooper AI, Plum F: Biochemistry and physiology of brain ammonia. Physiol Rev 1987;
67:440–519.
73
[26] Lai CK, Cooper AJL: Neurotoxicity of ammonia and fatty acids: differential inhibition of
mitochondrial dehydrogenases by ammonia and fatty acyl coenzyme A derivates. Neurochem
Res 1991;16:795–803.
[27] Dolinska M, Hilgier W, Albrecht J: Ammonia stimulates glutamine uptake to the cerebral
non-synaptic mitochondria of the rat. Neurosci Lett 1996; 213:45–48.
[28] McNaught KSP, Altomare C, Cellamare S, Carotti A, Thull U, Carrupt PA, Testa PJ,
Marsden CD: Inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase by isoquinoline derivates
structurally related to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). Neuroreport
1995;6:1105–1108.
[29] Scaini G, Simon KR, Tonin AM, Busanello ENB, Moura AP, Ferreira GC, Wajner M,
Streck EL, Schuck PF: Toxicity of octanoate and decanoate in rat peripheral tissues: evidence
of bioenergetic dysfunction and oxidative stress induction in liver and skeletal muscle.
Submitted manuscript.
[30] Merle P, Kadenbach B: On the heterogeneity of vertebrate cytochrome c oxidase
polypeptide chain composition. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 1980;361:1257–1259.
[31] Clay VJ, Ragan CI: Evidence for the existence of tissue specific isoenzymes of
mitochondrial NADH dehydrogenase. Biochem Biophys Res Commun 1988;157:1423–1428.
[32] Taylor RW, Birch-Machin MA, Bartlett K, Turnbull DM: Succinate-cytochrome c
reductase: assessment of its value in the investigation of defects of the respiratory chain.
Biochim Biophys Acta 1993;1181:261–265.
[33] Pettenuzzo LF, Ferreira GC, Schmidt AL, Dutra-Filho CS, Wyse AT, Wajner M:
Differential inhibitory effects of methylmalonic acid on respiratory chain complex activities
in rat tissues. Int J Dev Neurosci 2006;24:45-52.
74
Figures
Figure 1. In vitro effect of ammonium acetate (AA; 1 mM), octanoic (OA; 3 mM) and
decanoic (DA; 3 mM) acids on the respiratory chain complexes I-III (A), II (B), II-III (C) and
IV (D) activities in rat cerebral cortex. Values are means ± standard error of mean for five to
six independent experiments performed in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg
protein-1. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared to controls. aP < 0.001 compared to
OA group, bP < 0.001 compared to AA group, cP < 0.001 compared to DA group (Duncan
multiple range test).
75
Figure 2. In vitro effect of ammonium acetate (AA; 1 mM), octanoic (OA; 3 mM) and
decanoic (DA; 3 mM) acids on the respiratory chain complexes I-III (A), II (B), II-III (C) and
IV (D) activities in rat liver. Values are means ± standard error of mean for five to six
independent experiments performed in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg
protein-1. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared to controls (Duncan multiple range
test). aP < 0.001 compared to OA group, bP < 0.001 compared to AA group (Duncan multiple
range test).
76
Figure 3. In vitro effect of ammonium acetate (AA; 1 mM), octanoic (OA; 3 mM) and
decanoic (DA; 3 mM) acids on the respiratory chain complexes I-III (A), II (B), II-III (C) and
IV (D) activities in rat skeletal muscle. Values are means ± standard error of mean for five to
six independent experiments performed in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg
protein-1. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared to controls (Duncan multiple range
test). aP < 0.001 compared to OA group bP < 0.001 compared to AA group, cP < 0.001
compared to decanoic (Duncan multiple range test).
77
Figure 4. In vitro effect of ammonium acetate (AA; 1 mM), octanoic (OA; 3 mM) and
decanoic (DA; 3 mM) acids on the citrate synthase activitiy in rat liver, skeletal muscle and
cerebral cortex. Values are means ± standard error of mean for five to six independent
experiments performed in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg protein-1. *P <
0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared to controls (Duncan multiple range test).
78
Figure 5. In vitro effect of ammonium acetate (AA), octanoic (OA) and decanoic (DA) acids
on the succinate dehydrogenase synthase activitiy in rat liver, skeletal muscle and cerebral
cortex. Values are means ± standard error of mean for five to six independent experiments
performed in duplicate and are expressed as nmol . min-1 . mg protein-1. *P < 0.05, **P <
0.01, ***P < 0.001 compared to controls (Duncan multiple range test).
79
PARTE IV – DISCUSSÃO
A deficiência da MCAD é um EIM, sendo o mais frequente defeito da oxidação de
ácidos graxos, com uma prevalência estimada entre 1:6.500 e 1:17.000 recém-nascidos vivos,
dependendo da origem étnica da população. É caracterizado bioquimicamente por acúmulo
tecidual de ácidos graxos de cadeia média, principalmente os ácidos octanóico (AO),
decanóico (AD) e cis-4-decenóico (AcD), e seus derivados (Scriver et al., 2001); é causada
pela deficiência de atividade da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média, uma enzima
envolvida na β-oxidação de ácidos graxos de cadeia média.
A apresentação clínica em pacientes com a MCADD tende a aparecer em resposta a
crises de estresse metabólico e normalmente inclui episódios de hipoglicemia hipocetótica,
rabdomiólise, hepatomegalia e encefalopatia aguda, que pode rapidamente evoluir para coma
e morte (Roe & Ding, 2001). Há um número considerável de estudos in vitro mostrando que
os efeitos tóxicos dos ácidos graxos podem estar envolvidos na fisiopatologia do dano
tecidual nos pacientes com MCADD, estando a maioria deles relacionados com um prejuízo
em etapas distintas do metabolismo energético (Parker et al., 1983; Davis et al., 1987; De
Assis et al., 2003; Reis de Assis et al., 2004; Schuck et al., 2009b). Neste contexto, especulase que o dano cerebral encontrado nos pacientes está associado aos efeitos dos AO e AD
relatados em estudos utilizando preparações de cérebro de ratos, que englobam alterações da
via glicolítica e do funcionamento do ciclo de Krebs, inibição dos complexos da cadeia
respiratória e da creatina quinase, desacoplamento da fosforilação oxidativa e indução de
estresse oxidativo (Reis de Assis et al., 2004; Schuck et al., 2009a,b). Deve-se ainda enfatizar
que várias manifestações clínicas desta doença ocorrem sem a presença de hipoglicemia (Roe
& Ding, 2001) e que as com as concentrações dos ácidos graxos de cadeia média aumentam
drasticamente no plasma de pacientes durante as crises (Rinaldo et al., 2001); é concebível
80
que esses metabólitos podem estar associados com a toxicidade periférica na MCADD. De
fato, estudos anteriores mostraram que o AO aumenta o consumo de oxigênio e diminui a
concentração citosólica de ATP e taxa glicolítica em fígado de ratos perfundidos (Scholz et
al., 1984; Sobool et al., 1984). Desta forma, o presente estudo estendeu as investigações,
inicialmente estudando o efeito dos AO e AD, os principais metabólitos acumulados
MCADD, sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em fígado e músculo
esquelético de ratos jovens. Foi verificado que a pré-incubação de homogeneizados de fígado
com AO e AD diminuiu as atividades dos complexos I-III, II-III e IV. Além disso, a préincubação de homogeneizados de músculo esquelético com AO e AD causou uma diminuição
da atividade do complexo IV, enquanto que altas concentrações de AD, mas não AO, inibiram
a atividade do complexo II-III. Estudos anteriores mostraram que o AO não afeta as
atividades dos complexos da cadeia respiratória in vitro (de Assis et al., 2003), e que o AD na
concentração de 3,0 mM inibe as atividades dos complexos II-III e IV em homogeneizados de
córtex cerebral (Reis de Assis et al., 2004). Em conjunto, estes dados indicam que a cadeia
respiratória nas células hepáticas apresenta uma maior vulnerabilidade para os AO e AD,
quando comparados ao córtex cerebral e músculo esquelético. A inibição da cadeia
respiratória causada pelos AO e AD pode ser parcialmente atribuída a diferenças entre os
tecidos, como isoformas das subunidades da cadeia respiratória codificadas pelo núcleo (Clay
& Ragan, 1988; Merle & Kadenbach, 1980; Rustin et al., 1994), ou, alternativamente, pela
regulação do fluxo de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial específica para cada órgão
(Taylor et al., 1993). De fato, resultados semelhantes já foram relatados para o ácido
metilmalônico (Pettenuzzo et al., 2006). Observamos também que os AO e AD não alteraram
a atividade da creatina quinase em homogeneizados de músculo esquelético e fígado, estando
esses resultados em concordância com os resultados obtidos em homogeneizados cerebrais
(Reis de Assis et al., 2004).
81
O próximo passo do nosso estudo foi investigar os efeitos dos AO e AD sobre alguns
parâmetros de estresse oxidativo em homogeneizados de fígado e músculo esquelético.
Enfatiza-se que alterações mitocondriais, especialmente inibições de complexos da cadeia
respiratória, podem levar a um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio (Halliwell & Gutteridge, 1999). Observamos que os AO e AD aumentaram os
níveis de TBA-RS e o conteúdo de carbonilas no fígado e músculo esquelético. Como os
níveis de TBA-RS refletem a quantidade de malondialdeído (MDA) formado, um produto da
oxidação de ácidos graxos poliinsaturados de lipídios complexos (Halliwell & Gutteridge,
1999), e o conteúdo de carbonilas é um marcador para avaliar a oxidação protéica, pode-se
concluir que esses ácidos graxos causam dano oxidativo em lipídeos e proteínas do fígado e
músculo esquelético. No que diz respeito aos mecanismos pelos quais os AO e AD exercem
seus efeitos, foi demonstrado que a adição de melatonina e trolox foi capaz de impedir a
peroxidação lipídica causada por esses ácidos graxos de cadeia média no cérebro (Schuck et
al., 2009a), reforçando a idéia de um envolvimento de espécies reativas nos efeitos dos AO e
AD. Neste cenário, é tentador especular que o mesmo mecanismo ocorra no fígado e no
músculo esquelético. No entanto, não se pode excluir a participação de mecanismos
adicionais que levam ao dano oxidativo.
No que diz respeito aos níveis de GSH, o maior contribuinte para o estado redox das
células, o AD ocasionou uma diminuição nos níveis de GSH no músculo esquelético, mas não
no fígado. Em contraste, o AO não alterou os níveis de GSH em nenhum dos tecidos
estudados. Uma vez que este parâmetro é usado para avaliar a capacidade de um tecido em
responder e prevenir os danos causados pelos radicais livres (Lisse et al., 1995; Halliwell &
Gutteridge, 1999; Evelson et al., 2001), pode-se concluir que as defesas antioxidantes do
músculo esquelético foram comprometidas pelo AD. Visto que níveis adequados de
antioxidantes são essenciais para a proteção da célula contra dano oxidativo, e que um
82
desequilíbrio na homeostase entre pró-oxidantes e antioxidantes induz estresse oxidativo, é
possível que a diminuição significativa dos níveis de GSH ocasionada pelo AD esteja
relacionada ao aumento da lipoperoxidação in vitro ocasionado por este ácido graxo. Isto está
de acordo com as observações de que o GSH é considerado uma importante defesa contra o
dano oxidativo a lipídios eliminando o peróxido de hidrogênio e radicais peroxil formados
durante este processo e que a suplementação de GSH em homogeneizados de córtex atenuou
o dano oxidativo induzido pelo AD (Schuck et al., 2009a). Por outro lado, não podemos
descartar a possibilidade de que o decréscimo nos níveis de GSH se deva a um aumento na
geração de espécies reativas causado pelo AD.
Embora tenha sido sugerido que os AO e AD exerçam efeitos neurotóxicos
importantes, afetando principalmente o metabolismo energético, muito pouco se sabe sobre a
contribuição da hiperamonemia para o dano neurológico, a hepatopatia e as alterações
musculares encontradas nos pacientes, uma vez que a hiperamonemia está relacionada com
uma série de condições patológicas. Neste contexto, decidiu-se avaliar os efeitos da amônia
sobre para parâmetros do metabolismo energético. Investigou-se a hipótese de que a amônia
pudesse alterar as atividades de enzimas do ciclo de Krebs, dos complexos da cadeia
respiratória mitocondrial e da creatina quinase em ratos jovens, e se essa atuaria
sinergicamente com os AO e AD, potencializando a inibição que esses ácidos causam.
Apesar dos mecanismos básicos pelos quais a amônia induz neurotoxicidade ainda não
estarem completamente esclarecidos, existem evidências de que tais mecanismos envolvam
falência no metabolismo energético e depleção de ATP (Felipo et al., 1994; Kosenko et al.,
1994; 1995; Ratnakumari et al., 1995), inibição de enzimas do ciclo de Krebs e sweeling
mitocondrial (Cooper & Plum, 1987; Lai & Cooper, 1987; Felipo et al., 1994; Dolisnka et al.,
1996), bem como a potenciação da inibição da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelos
acil-CoA graxos (McNaught et al., 1995), ativação de receptores glutamatérgicos (Bosman et
83
al., 1992; Felipo et al., 1994; Zhou et al., 1999), geração de radicais livres (Kosenko et al.,
1997; 1999), alterações nas funções dos neurotransmissores (Cooper & Plum, 1987; Felipo et
al., 1994; Zhou et al., 1999), dentre outras alterações.
Neste contexto, decidiu-se no presente estudo, avaliar os efeitos do AO, AD e/ou AA
em vários parâmetros do metabolismo energético. Foi inicialmente verificado que o AO e AD
separadamente causaram uma inibição da atividade dos complexos da cadeia respiratória
mitocondrial no cérebro, fígado e músculo esquelético semelhante aos resultados obtidos em
estudos anteriores (de Assis et al., 2003; Reis de Assis et al., 2004). Posteriormente, foi
verificada a influência do AA sobre esses efeitos em diferentes estruturas, quando adicionado
sozinho no meio de incubação, o AA inibiu a atividade dos complexos II-III no fígado, e a
atividade do complexo IV no músculo esquelético, cérebro e fígado. Por outro lado, houve um
aumento na atividade do complexo II no fígado. Quanto à associação entre AA e os ácidos
graxos, observamos uma inibição do complexo I-III e II no cérebro, e do complexo II no
músculo esquelético quando o AD e o AA estiveram presentes simultaneamente no meio de
incubação, sugerindo uma ação sinérgica entre AA e AD. Além disso, as evidências de efeitos
aditivos entre AA e os ácidos graxos foram observadas, uma vez que AA potencializou os
efeitos do AO e AD sobre a atividade do complexo IV em diferentes estruturas. Tomados em
conjunto, podemos verificar que a amônia potencializa os efeitos dos AO e AD e que o
complexo IV apresenta uma maior vulnerabilidade a esses metabólitos, em comparação com
os outros complexos da cadeia respiratória.
Nosso próximo passo foi investigar o efeito do AO, AD e AA sobre a atividade da
citrato sintase e da succinato desidrogenase, enzimas importantes do ciclo de Krebs.
Observou-se que os AO, AD e o AA, sozinhos ou associados, inibiram a atividade da citrato
sintase no cérebro, mas somente a combinação do AD com AA inibiram a atividade da citrato
sintase no fígado. Por outro lado, a atividade da citrato sintase não foi afetada por esses
84
compostos no músculo esquelético. A atividade da succinato desidrogenase no córtex cerebral
foi reduzida pelo AD isolado, e a sua associação com o AA não reforçou tal inibição. Nossos
dados sugerem que a atividade do ciclo de Krebs é prejudicada pela presença de AO, AD e/ou
AA, provavelmente gerando uma produção reduzida de NADH e FADH2 para alimentar a
cadeia respiratória, consequentemente, potencializando a depleção de ATP causada pela
inibição direta provocada pelos AO, AD e/ou AA. Finalmente, observamos que a creatina
quinase, uma enzima crucial para a homeostase energética, não foi afetada pelo AO, AD e
AA, estando esses resultados em concordância com os resultados obtidos anteriormente (Reis
de Assis et al., 2004).
Tem sido proposto que a amônia inibe a recaptação de glutamato e leva a um aumento
na concentração extracelular deste neurotransmissor (Felipo et al., 1994; Zhou & Noremberg,
1999), o que leva à ativação nos receptores glutamatérgicos NMDA. A ativação destes
receptores tem sido associada com a depleção de ATP induzida pela amônia, geração de
radicais livres e neurotoxicidade (Felipo et al., 1994; Kosenko et al., 1997). A amônia e o
glutamato induzem a conversão da enzima Na+,K+-ATPase para o estado ativo
(desfosforilado) (Marcaida et al., 1996), o que leva à depleção de ATP devido ao aumento do
consumo deste nucleotídeo. Segundo alguns autores, a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral
está aumentada no cérebro de ratos com síndromes hiperamonêmicas congênitas ou
adquiridas (Ratnakumari et al., 1995). Além disso, tem sido demonstrado que a amônia inibe
algumas enzimas do ciclo de Krebs (Lai & Cooper, 1991), potencializa o efeito inibitório de
vários ésteres de CoA sobre a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase (McNaught et al.,
1995), inibe a lançadeira malato-aspartato (Siegel et al., 1994) e induz swelling mitocondrial
em astrócitos devido ao acúmulo excessivo de glutamina na matriz e ativação do poro de
transição de permeabilidade, o qual colapsa o potencial de membrana (Schinlder et al., 1996;
White & Reynolds, 1996), um efeito que pode ser compartilhado pelo AO e AD, uma vez que
85
esses alteram a homeostase energética mitocondrial (de Assis et al., 2003; 2006; Reis de Assis
et al., 2004; Schuck et al., 2007; 2009b), o que contribui para a depleção de ATP (Dolinska et
al., 1996).
Em conclusão, o presente estudo fornece evidências de que os AO e AD, os principais
metabólitos acumulados na MCADD, alteram a bioenergética mitocondrial e causam estresse
oxidativo em tecidos periféricos de ratos jovens em concentrações semelhantes (0,5 mM e
superior) aos encontrados nos pacientes com MCADD (cerca de 0,7 mM). Além disso,
durante as crises metabólicas as concentrações desses ácidos aumentam drasticamente nestes
pacientes, devido a uma lipólise aumentada e um bloqueio na reação da MCAD (Martínez et
al., 1997; Roe & Ding, 2001). Esse estudo também demonstrou um efeito sinérgico/aditivo
entre o AO, AD e a amônia, prejudicando a bioenergética mitocondrial no cérebro, fígado e
músculo esquelético de ratos.
Tomados em conjunto, nossos resultados dão origem à hipótese de que a
hiperamonemia, que é comumente encontrada em pacientes que sofrem de MCADD, agrava o
dano a células causado pelos ácidos graxos de cadeia média. No caso de nossos resultados
serem extrapolados para a condição humana, presume-se que estes efeitos poderiam ser
envolvidos no dano cerebral, na hepatopatia e nas alterações musculares, freqüentemente
encontradas em pacientes MCADD (Roe & Ding, 2001). Embora não sejam conhecidos os
mecanismos de interação entre a amônia e os ácidos graxos de cadeia média, o presente
achado pode ser de grande valor para a compreensão da fisiopatologia dos sintomas
observados nos pacientes e pode contribuir para o desenvolvimento de novas condutas para o
tratamento dos pacientes afetados.
86
REFERÊNCIAS
ANKARCRONA M; DYPBUKT JM; BONFOCO E; ZHIVOTOVSKY B; ORRENIUS S;
LIPTON AS; NICOTERA P. Glutamate-induced neuronal death: a succession of
necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron 15: 961-973.
1995.
ARTUCH R; COLOME C; VILASECA MA; SIERRA C; CAMBRA FJ; LAMBRUSCHINI
N; CAMPISTOL J. Plasma phenylalanine is associated with decreased serum
ubiquinone-10 concentrations in phenylketonuria. Journal of Inherited Metabolic
Disease 24: 359-366. 2001.
ARTUCH R; COLOME C; SIERRA C; BRANDI N; LAMBRUSCHINI N; CAMPISTOL J;
UGARTE D; VILASECA MA. A longitudinal study of antioxidant status in
phenylketonuric patients. Clinical Biochemistry 37: 198-203. 2004.
BABIOR BM. Superoxide: a two-edged sword. Brazilian Journal of medical and Biological
Research 30: 141-155. 1997.
BARIC I; FURNIC K; HOFFMANN GF. Inborn errors of metabolism at the turn of the
millennium. Croatian Medical Journal 42: 379-383. 2001.
BEAL MF. Does impairment of energy metabolism result in excitotoxic neuronal death in
neurological ilnesses? Annals of Neurology 31: 119-130. 1992.
BEM–MENACHEM E; KYLLERMAN R; MARKLEIND S. Superoxide dismutase and
glutathione peroxidase function in progressive myoclonus epilepsies. Epilepsy
Research 40: 33-39. 2000.
BERG JM; TYMOCZKO JL; STRYER L. Bioquímica. 6ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara,
2008.
87
BERGENDINI L; BENES L; DURACKOVA Z; FERENCK M. Chemistry, physiology and
pathology of free radicals. Life Sciences 65: 1865-1874. 1999.
BERRY MN; CLARK DG; GRIVELL AR; WALLACE PG. The calorigenic nature of
hepatic ketogenesis: an explanation for the stimulation of respiration induced by fatty
acid substrates. European Journal of Biochemistry 131: 205-14. 1983.
BICKEL H. Early diagnosis and treatment of inborn errors of metabolism. Enzyme 38: 1426. 1987.
BIRD S; MILLER NJ; COLLINS JE; RICE-EVANS A. Plasma antioxidant capacity in two
cases of tirosinaemia type 1: one case treated with NTBC. Journal of Inherited
Metabolic Disease 18: 123-126. 1995.
BLASS JP. Brain metabolism and brain disease: is metabolic deficiency the proximate cause
of Alzheimer dementia? Journal of Neuroscience Research 66: 851-856. 2001.
BONDY SC; LE BEL CP. The relationship between excitotoxicity and oxidative stress in the
central nervous system. Free Radical Biology Medicine 14: 633-642. 1993.
BOSMAN DK; DEUTZ NEP; MAAS MAW; VAN EIJK HMH; SMIT JJH; HAAN JG;
CHAMULEAU RAFM. Amino acid releasefrom cerebral cortex in experimental acute
liver failure, studied by in vivo cerebral cortex microdialysis. Journal of
Neurochemistry 59: 591-599. 1992.
BOWLER R; CRAPO JD. Oxidative Stress in Airways: is there a role for extracellular
superoxide dismutase? American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine 166: 38-43. 2002.
BRENNAN WA; BIRD ED; APRILLE JR. Regional mitochondrial respiratory activity in
Huntington´s disease brain. Journal of Neurochemistry 44: 1948-1950. 1985.
BRORSON JR; MARCUCCILLI CJ; MILLER RJ. Delayed antagonism of calpain reduces
excitotoxicity in cultured neurons. Stroke 26: 1259-67. 1995.
88
CADENAS E; DAVIES KJ. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and
aging. Free Radical Biology Medicine 29: 222-230. 2000.
CLARK JB; BATES TE; CULLINGFORD T; LAND JM. Development of enzymes of
energy metabolism in the neonatal mammalian brain. Developmental Neuroscience
15: 174-180. 1993.
CLAY VJ; RAGAN CI. Evidence for the existence of tissue specific isoenzymes of
mitochondrial NADH dehydrogenase. Biochemical and Biophysical Research
Communications 157: 1423–1428. 1998.
COLOMÉ C; SIERRA C; VILASECA MA. Congenital errors of metabolism: cause of
oxidative stress? Medicine Clinical 115: 111-117. 2000.
COOPER AI; PLUM F. Biochemistry and physiology of brain ammonia. Physiological
Reviews 67: 440–519. 1987.
COSTA CG; GUÉRAND WS; STRUYS EA; HOLWERDA U; TEN BRINK HJ; TAVARES
DE ALMEIDA I; DURAN M; JAKOBS C. Quantitative analysis of urinary
acylglycines for the diagnosis of beta-oxidation defects using GC-NCI-MS. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21: 1215-1224. 2000.
DAVIS FB; DAVIS PJ; BLAS SD; SCHOELN M. Action of long-chain fatty acids in vitro
on Ca2+-stimulatable, Mg2+-dependent ATPase activity in human red cell membranes.
The Biochemical Journal 248: 511-516. 1987.
DE ASSIS DR; RIBEIRO CA; ROSA RB; SCHUCK PF; DALCIN KB; VARGAS CR;
WANNMACHER CM; DUTRA-FILHO CS; WYSE AT; BRIONES P; WAJNER M.
Evidence that antioxidants prevent the inhibition of Na+,K+-ATPase activity induced
by octanoic acid in rat cerebral cortex in vitro. Neurochemical Research 28: 12551263. 2003.
89
DE ASSIS DR; MARIA RC; FERREIRA GC; SCHUCK PF; LATINI A; DUTRA-FILHO
CS; WANNMACHER CM; WYSE AT; WAJNER M. Na+,K+-ATPase activity is
markedly reduced by cis-4-decenoic acid in synaptic plasma membranes from cerebral
cortex of rats. Experimental Neurology 197: 143-149. 2006.
DELANTY N; DICHTER MA. Oxidative injury in the nervous system. Acta Neurologica
Scandinavica 98: 145-153. 1998.
DEON M; WAJNER M; SIRTORI LR; FITARELLI D; COELHO D; SITTA A;
BARSCHAK AG; FERREIRA GC; HAESER A; GIUGLIANI R; VARGAS CR. The
effect of Lorenzo’s oil on oxidative stress in X-linked adrenoleukodistrophy. Journal
of the Neurological Sciences 247: 157-164. 2006.
DERKS TG; REIJNGOUD DJ; WATERHAM HR; GERVER WJ; VAN DEN BERG MP;
SAUER PJ; SMIT GP. The natural history of medium-chain acyl CoA dehydrogenase
deficiency in the Netherlands. The Journal of Pediatrics 148: 665-670. 2006.
DI DONATO S. Disorders related to mitochondrial membranes: pathology of the respiratory
chain and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease 23: 247-263.
2000.
DOLINSKA M; HILGIER W; ALBRECHT J. Ammonia stimulates glutamine uptake to the
cerebral non-synaptic mitochondria of the rat. Neuroscience Letters 213: 45–48. 1996.
DREWES LR; LEINO RL. Neuron-specific mitochondrial degeneration induced by
hyperammonemia and octanoic acidemia. Brain Research 340: 211–218. 1985.
DUFFY TE; NELSON SR; LOWRY OH. Cerebral carbohydrate metabolism during acute
hypoxia and recovery. Journal of Neurochemistry 19: 959-977. 1972.
EGIDIO RJ; FRANCIS GL; COATES PM; HALE DE; ROESEL A. Medium-chain acyl-CoA
dehydrogenase deficiency. American Family Physician 39: 221-226. 1989.
90
EPPENBERGER HM; DAWSON DM; KAPLAN NO. The comparative enzymology of
creatine kinases isolation and characterization from chicken and rabbit tissues.
Journal of Biological Chemistry 242: 204-209. 1967.
EVELSON P; TRAVACIO M; REPETTO M; ESCOBAR J; LLESUY S; LISSI EA.
Evaluation of total reactive antioxidant potential (TRAP) of tissue homogenates and
their cytosols. Archives of Biochemistry and Biophysics 388: 261-266. 2001.
FANG YZ; YANG S; WU GW. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Nutrition 18: 872879. 2002.
FELIPO V; GRAU E; MIÑANA MD; GRISOLÍA S. Hyperammonemia decreases protein
kinase C-dependent phosphorilation of microtubule-associated protein 2 and increases
its binding to tubulin. European Journal of Biochemistry 214: 243-249. 1993.
FELIPO V; KOSENKO E; MINANA MD; MARCAIDA G; GRISOLIA S. Molecular
mechanism of acute ammonia toxicity and of its prevention by L-carnitine. Advances in
Experimental Medicine and Biology 368: 65–77. 1994.
FELIPO V; BUTTERWORTH RF. Neurobiology of ammonia. Progress in Neurobiology
67: 259-279. 2002.
FENTON WA; ROSEMBERG LE. Disorders of propionate and methylmalonate metabolism.
In: The Metabolic Basis of Inherited Disease (SCRIVER CR; BEAUDET AL; SLY
WS; VALLE D. eds). New York, McGraw-Hill, 1423-1449. 1995.
FERREIRA GC; TONIN A; SCHUCK PF; VIEGAS CM; CEOLATO PC; LATINI A;
PERRY ML; WYSE AT; DUTRA-FILHO CS; WANNMACHER CM; VARGAS
CR; WAJNER M. Evidence for a synergistic action of glutaric and 3-hydroxyglutaric
acids
disturbing
rat
brain
energy
metabolism.
International
Journal
of
Developmental Neuroscience 25: 391-398. 2007.
91
FITZPATRICK SM; COOPER AJL; DUFFY TE. Use of (-methylene-D,L-aspartate to assess
the role of aspartate aminotransferase in cerebral oxidative metabolism. Journal of
Neurochemistry 41: 1370-1383. 1983.
FONTELLA FU; PULROLNIK V; GASSE E; WANMECHER CMD; KLEIN AB; WAJNER
M; DUTRA-FILHO CS. Propionic and L-methylmalonic acids induce oxidative stress
in brain of young rats. Neurochemistry 11: 541-544. 2000.
FORMAN HJ; TORRES M. Reactive oxygen species and cell signaling respiratory burst in
macrophage signaling. American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine 166: 4-8. 2002.
GREGERSEN N; ANDRESEN BS; PEDERSEN CB; OLSEN RK; CORYDON TJ; BROSS
P. Mitochondrial fatty acid oxidation defects-remaining challenges. Journal of
Inherited Metabolic Disease 31: 643-657. 2008.
GROSSE SD; KHOURY MJ; GREENE CL; CRIDER KS; POLLITT RJ. The epidemiology
of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency: An update. Genetics in
Medicine 8: 205-212. 2006.
GÜNÇIN I; BEYDEMIR S; ALICI HA; ELMASTAS M; BÜYÜKUROGLU M. In Vitro
Antioxidant Properties of Morfine. Pharmacological Research 49: 59-66. 2004.
HAGENS MEK; PEDEREZOLLI CD; SGARAVATTI AM; BRIDI R; WAJNER M;
WANMACHER
CMD;
WYSE
ATS;
DUTRA-FILHO
CS.
Experimental
hyperphenylalaninemias provokes oxidative stress in rat brain. Biochimica et
Biophysica Acta 1586: 344-352. 2002.
HALLIWELL B; GUTTERIDGE JMC. Detection of free radicals and others reactive species:
trapping and fingerprinting. In: Free Radicals in Biology and Medicine
(HALLIWELL B; GUTTERIDGE JMC. eds.) Oxford University Press, Oxford, pp.
351–425. 1999.
92
HALLIWELL B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of
aerobic life. Plant Physiology 141: 312-322. 2006.
HALLIWELL B; GUTTERIDGE JMC. Oxygen is a toxic gas – an introduction to oxygen
toxicity and reactive species. In: Free Radicals in Biology and Medicine
(HALLIWELL B; GUTTERIDGE JMC. eds.) Oxford University Press, Oxford, pp. 129. 2007.
HAN D; WILLIAMS E; CADENAS E. Mitochondrial respiratory chain-dependent generation
of superoxide anion and its release into the intermembrane space. The Biochemical
Journal 353: 411-416. 2001.
HAWKINS RA; MILLER AL; NIELSEN RC; VEECH RL. The acute action of ammonia on
rat brain metabolism in vivo. The Biochemical Journal 134: 1001–1008. 1973.
HEALES SJ; BOLAÑOS JP; STEWART VC; BROOKES PS; LAND JM; CLARK JB.
Nitric oxide, mitochondria and neurological disease. Biochimica et Biophysica Acta
1410: 215-228. 1999.
HERTZ L; KALA G. Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia
concentrations. Metabolic Brain Disease 22: 199-218. 2007.
JAMES IM; MAcDONNELL L; XANALATOS C. Effect of ammonium salts on brain
metabolism. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry 37: 948-953.
1974.
KIM CS; O’TUAMA LA; MANN JD; ROE CR. Effect of increasing carbon chain length on
organic acid transport by the choroid plexus: a potential factor in Reye’s syndrome.
Brain Research 259: 340–343. 1983.
KOLKER S; AHLEMEYER B; KRIEGLSTEIN J; HOFFMANN GF. Contribution of
reactive oxygen species to 3-hydroxyglutarate neurotoxicity in primary neuronal
cultures from chick embryo telencephalons. Pediatric Research 50: 76-82. 2001.
93
KØLVRAA S; GREGERSEN N; CHRISTENSEN E; HOBOLTH N. In vitro fibroblast
studies in a patient with C6-C10-dicarboxylic aciduria: evidence for a defect in general
acyl-CoA dehydrogenase. Clinical Chimica Acta 126: 53-67. 1982.
KOSENKO E; KAMINSKY Y; GRAU E; MIÑANA MD; MARCAIDA G; GRISOLÍA S;
FELIPO V. Brain ATP depletion induced by acute ammonia intoxication in rats is
mediated by activation of the NMDA receptor and of Na+,K+-ATPase. Journal of
Neurochemistry 63: 2172-2178. 1994.
KOSENKO E; KAMINSKY Y; GRAU E; MIÑANA MD; GRISOLÍA S; FELIPO V.
Nitroarginine, an inhibitor of nitric oxido synthetase, attenuates ammonia toxicity and
ammonia-induced alterations in brain metabolism. Neurochemical Research 4: 451456. 1995.
KOSENKO
E;
KAMINSKY
Y;
KAMINSKY
A;
VALENCIA
M;
LEE
L;
HERMENEGILDO C; FELIPO V. Superoxide production and antioxidant enzymes in
ammonia intoxication in rats. Free Radical Research 27: 637-644. 1997.
KOSENKO E; KAMINSKI Y; LOPATA O; MURAVYOV N; FELIPO V. Blocking NMDA
receptors prevents the oxidative stress induced by acute ammonia intoxication. Free
Radical Biology Medicine 26: 1369-1374. 1999.
KOSENKO E; KAMINSKY Y; STAVROSKAYA IG; FELIPO V. Alteration of
mitochondrial calcium homeostasis by ammonia-induced activation of NMDA
receptors in rat brain in vivo. Brain Research 880: 139-146. 2000.
LAI JK; COOPER AJL. Brain α-ketoglutarate dehydrogenase complex: kinetic properties,
regional distribution, and effects of inhibitors. Journal of Neurochemistry 47: 13761386. 1987.
94
LAI CK; COOPER AJL. Neurotoxicity of ammonia and fatty acids: differential inhibition of
mitochondrial dehydrogenases by ammonia and fatty acyl coenzyme A derivates.
Neurochemical Research 16: 795–803. 1991.
LATINI A; SCUSSIATO K; LEIPNITZ G; DUTRA-FILHO CS; WAJNER M. Promotion of
oxidative stress by 3-hydroxyglutaric acid in rat striatum. Journal of Inherited
Metabolic Disease 28: 57-67. 2005.
LATINI A; FERREIRA CG; SCUSSIATO K; SCHUCK PF; DUTRA-FILHO CS; VARGAS
CR; WAJNER M. Induction of oxidative stress by chronic and acute glutaric acid
administration to rats. Cellular and Molecular Neurobiology 27: 423-438. 2007.
LEHNINGER AL; NELSON DL; COX MM. Lehninger Princípios de Bioquímica. 5ª ed.
São Paulo: Sarvier. 2007.
LISSI E; SALIM-HANNA M; PASCUAL C; DEL CASTILLO MD. Evaluation of total
antioxidant potential (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enhanced
chemiluminescence measurements. Free Radical Biology and Medicine 18: 153-158.
1995.
LIU X; KIM CN; YANG J; JEMMERSON R; WANG X. Induction of apoptotic program in
cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cellular 86: 147-157.
1996.
LUND AM; DIXON MA; VREKEN P. What is the role of medium-chain triglycerides in the
management of long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency? Journal of
Inherited Metabolic Disease 26: 353-360. 2003.
MAEGAWA GH; POPLAWSKI NK; ANDRESEN BS; OLPIN SE; NIE G; CLARKE JT;
TESHIMA I. Interstitial deletion of 1p22.2p31.1 and medium-chain acyl-CoA
dehydrogenase deficiency in a patient with global developmental delay. American
Journal of Medical Genetics 146: 1581-1586. 2008.
95
MARCAIDA G; FELIPO V; HERMENEGILDO C; MIÑANA MD; GRISOLÍA S. Acute
ammonia toxicity is mediated by the NMDA type of glutamate receptors. FEBS
Letters 296: 67-68. 1992.
MARKS DB; MARKS AD; SMITH CM. Basic Medical Biochemistry. Baltimore,
Lippincott Williams & Wilkins. 1996.
MARTÍNEZ G; JIMÉNEZ-SÁNCHEZ G; DIVRY P; VIANEY-SABAN C; RIUDOR E;
RODÉS M; BRIONES P; RIBES A. Plasma free fatty acids in mitochondrial fatty
acid oxidation defects. Clinica Chimica Acta 267: 143-154. 1997.
MATSUBARA Y; NARISAWA K; TADA K. Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase
deficiency: molecular aspects. European Journal of Pediatric 151: 154-159. 1992.
MAXWELL SR. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs 49: 345-361. 1995.
McDONALD JW; SCHOEPP DD. Aminooxyacetic acid produces excitotoxic brain injury in
neonatal rats. Brain Research 624: 239-244. 1993.
McNAUGHT KSP; ALTOMARE C; CELLAMARE S; CAROTTI A; THULL U;
CARRUPT PA; TESTA PJ; MARSDEN CD. Inhibition of α-ketoglutarate
dehydrogenase by isoquinoline derivates structurally related to 1-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). Neuroreport 6: 1105–1108. 1995.
MERLE P; KADENBACH B. On the heterogeneity of vertebrate cytochrome c oxidase
polypeptide chain composition. Hoppe-Seyler's Zeitschrift Für Physiologische
Chemie 361: 1257–1259. 1980.
MUNTZ JA; HURWITZ J. The effect of ammonium ions upon isolated reactions of the
glycolytic scheme. Archives of Biochemistry and Biophysics 32: 137-149. 1951.
MURRAY RK; MAYES DKG; RODWELL VW. Harper: bioquímica. 9.ed São Paulo:
Atheneu. 2002.
96
NELSON DL; COX MM. Lehninger: principles of biochemistry. 3rd ed. New York, USA:
Worth publischers, p. 1152. 2000.
NICHOLLS D; AKERMAN K. Mitochondrial calcium transport. Biochimica et Biophysica
Acta 683: 57-88. 1982.
NOREMBERG MD; BAKER L; NOREMBERG L-OB; BLICHARSKA J. Ammoniainduced astrocyte swelling in primary culture. Neurochemical Research 16: 833-836.
1991.
OLSON JE; HOLTZMAN D; SANKAR R; LAWSON C; ROSENBERG R. Octanoic acid
inhibits astrocyte volume control: implications for cerebral edema in Reye's syndrome.
Journal of Neurochemistry 52: 1197-1202. 1989.
PARKER WD; HAAS R; STUMPF DA; EGUREN LA. Effects of octanoate on rat brain and
liver mitochondria. Neurology 33: 1374–1377. 1983.
PAVLAKOVIC G; EYER CL; ISOM GE. Neuroprotective effects of PKC inhibition against
chemical hypoxia. Brain Research 676: 205-211. 1995.
PETTENUZZO LF; FERREIRA GC; SCHMIDT AL; DUTRA-FILHO CS; WYSE AT;
WAJNER M. Differential inhibitory effects of methylmalonic acid on respiratory
chain complex activities in rat tissues. International Journal of Developmental
Neuroscience 24: 45-52. 2006.
PILLA C; CARDOZO RFD; DUTRA CS; WYZE ATS; WAJNER M; WANNMACHER
CMD. Effect of leucine administration on creatine kinase activity in rat brain.
Metabolic Brain Disease 18: 17-25. 2003.
PRZEDBORSKI S; DONALDSON DBS; JAKOWEC M; KISH JS; GUTTMAN M;
ROSOKLIJA G; HAYS AP. Brain Superoxide Dismutase, Catalase and Glutathione
Peroxidase Activities in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Annals of Neurology 39:
158-165. 1996.
97
RATNAKUMARI L; AUDET R; QURESHI IA; BUTTERWORTH RF. Na+,K+-ATPase
activities are increased in brain in both congenital and acquired hyperammonemic
syndromes. Neuroscience Letters 197: 89–92. 1995.
REIS DE ASSIS D; MARIA RC; BORBA ROSA R; SCHUCK PF; RIBEIRO CA; DA
COSTA FERREIRA G; DUTRA-FILHO CS; TEREZINHA DE SOUZA WYSE A;
DUVAL WANNMACHER CM; SANTOS PERRY ML; WAJNER M. Inhibition of
energy metabolism in cerebral cortex of young rats by the medium-chain fatty acids
accumulating in MCAD deficiency. Brain Research 1030: 141-151. 2004.
REZNICK AZ; PACKER L. Free radicals and antioxidants in muscular neurological diseases
and disorders. In: Free Radicals: from Basic Science to Medicine (POLI G;
ALBANO E; DIANZANI MU. eds.). Basel: Birkhäuser Verlag, pp. 425-437. 1993.
RINALDO P; RAYMOND K; AL-ODAIB A; BENNETT M. Clinical and biochemical
features of fatty acid oxidation disorders. Current Opinion in Pediatrics 10: 615–621.
1998.
RINALDO P. Fatty acid transport and mitochondrial oxidation disorders. Seminars Liver
Disease 21: 489-500. 2001.
ROE CR; DING J. Mitochondrial fatty acid oxidation disorders. In: The Metabolic and
Molecular Bases of Inherited Disease (SCRIVER CR; BEAUDET AL; SLY WS;
VALLE D. eds). New York: McGraw-Hill, New York, pp. 1909–1963. 2001.
ROSE CD; HENNEBERRY RC. Etiology of the neurodegenerative disorders: a critical
analysis. Neurobiology Aging 15: 233-234. 1994.
RUITENBEEK W; POELS PJ; TURNBULL DM; GARAVAGLIA B; CHALMERS RA;
TAYLOR RW; GABREELS FJ. Rhabdomyolysis and acute encephalopathy in late
onset medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency. Journal of Neurology
Neurosurgery and Psychiatry 58: 209-214. 1995.
98
RUSTIN P; CHRETIEN D; BOURGERON T; GÉRARD B; RÖTIG A; SAUDUBRAY JM.
A Biochemical and Molecular investigations in respiratory chain deficiencies. Clinica
Chimica Acta 228: 35-51. 1994.
SCHINLDER AF; OLSON EC; SPITZER NC; MONTAL M. Mitochondrial dysfunction is a
primary event in glutamate neurotoxicity. Journal of Neuroscience 16: 6125-6133.
1996.
SCHOLZ R; SCHWABE U; SOBOLL S. Influence of fatty acids on energy metabolism.
Stimulation of oxygen consumption, ketogenesis and CO2 production following addition
of octanoate and oleate in perfused rat liver. European Journal Biochemistry 141:
223-230. 1984.
SCHUCK PF; LEIPNITZ G; RIBEIRO CA; DALCIN KB; ASSIS DR; BARSCHAK AG;
PULROLNIK V; WANNMACHER CM; WYSE AT; WAJNER M. Inhibition of
creatine kinase activity in vitro by ethylmalonic acid in cerebral cortex of young rats.
Neurochemical Research 27: 1633-1639. 2002.
SCHUCK PF; CEOLATO PC; FERREIRA GC; TONIN A; LEIPNITZ G; DUTRA-FILHO
CS; LATINI A; WAJNER M. Oxidative stress induction by cis-4-decenoic acid:
relevance for MCAD deficiency. Free Radical Research 41: 1261-1272. 2007.
SCHUCK PF; FERREIRA GC; MOURA AP; BUSANELLO EN; TONIN AM; DUTRAFILHO CS; WAJNER M. Medium-chain fatty acids accumulating in MCAD deficiency
elicit lipid and protein oxidative damage and decrease non-enzymatic antioxidant
defenses in rat brain. Neurochemistry International 54: 519-525. 2009a.
SCHUCK PF; FERREIRA GDAC; TONIN AM; VIEGAS CM; BUSANELLO EN; MOURA
AP; ZANATTA A; KLAMT F; WAJNER M. Evidence that the major metabolites
accumulating in
medium-chain
acyl-CoA
dehydrogenase
deficiency
disturb
99
mitochondrial energy homeostasis in rat brain. Brain Research 1296: 117-126.
2009b.
SCRIVER CR; BEAUDET AL; SLY WS; VALLE D (Eds). The Metabolic and Molecular
Bases of Inherited Disease. 8ª ed. New York: McGraw-Hill, 3-45. 2001.
SIEGEL GJ; AGRANOFF BW; ALBERS RW; MOLINOFF PB. Basic neurochemistry:
molecular, cellular and medical aspects. 5º ed. Raven Press, New York. 1994.
SIRTORI LR; DUTRA-FILHO CS; FITARELLE D; SITTA A; HAESER A; BARSCHAK
AG; WAJNER M; COELHO DM; LLESUY S; BELLÉ-KLEIN A; GIUGLIANI R;
DEON M; VARGAS CR. Oxidative stress in patient with phenyketonuria.
Biochimica et Biophysica Acta 1740: 68-73. 2005.
SITTA A; BARSCHAK AG; DEON M; TERROSO T; PIRES R; GIUGLIANI R; DUTRAFILHO CS; WAJNER M; VARGAS CR. Investigation of oxidative stress parameters
in treated phenylketonuric patients. Metabolic Brain Disease 20: 287-296. 2006.
SMELTZER SC; BARE BG. Brunner e Suddarth’s textbook of medical-surgical nursing.
8ª ed. Philadelphia, USA, p. 825-872. 1996.
SMITH CM; MARKS AD; LIEBERMAN MA. Marks’ Basic Medical Biochemistry: A
Clinical Approach. 2ª ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins. 2005.
SOBOLL S; GRÜNDEL S; SCHWABE U; SCHOLZ R. Influence of fatty acids on energy
metabolism. 2. Kinetics of changes in metabolic rates and changes in subcellular
adenine nucleotide contents and pH gradients following addition of octanoate and
oleate in perfused rat liver. European Journal of Biochemistry 141: 231-236. 1984.
STEFANELLO FM; FRANZON R; TAGLIARI B; WANNMACHER L; WAJNER M;
WYSE AT. Reduction of butyrylcholinesterase activity in rat serum subjected to
hyperhomocysteinemias. Metabolic Brain Disease 20: 97-103. 2005.
100
STEWART PM; WALSER M. Failure of the normal ureagenic response in organic acid
loaded rats. Proposed mechanism for the hyperamonemia of propionic and
methylmalonic acidemia. Journal of Clinical Investigation 66: 484-492. 1980.
STRECK EL; VIEIRA PS; WANMACHER CM; DUTRA-FILHO CS; WAJNER M; WYSE
AT. In vitro effect of homocysteine on some parameters of oxidative stress in rat
hippocampus. Metabolic Brain Disease 18: 147-154. 2003.
TAYLOR RW; BIRCH-MACHIN MA; BARTLETT K; TURNBULL DM. Succinatecytochrome c reductase: assessment of its value in the investigation of defects of the
respiratory chain. Biochimica et Biophysica Acta 1181: 261–265. 1993.
TOMIMOTO
H;
YAMAMOTO
K;
HOMBURGER
HA;
YANAGIHARA
T.
Immunoelectron microscopic investigation of creatine kinase BB-isoenzyme after
cerebral ischemia in gerbils. Acta Neuropathologica 86: 447– 455. 1993.
VARGAS CR; WAJNER M; SIRTORI LR; GOULART L; CHIOCHETTA M; COELHO D;
LATINI A; LLESUY S; BELLÓ-KLEIN A; GIUGLIANI R; DEON M; MELLO CF.
Evidence
that
oxidative
stress
in
increased
in
patients
with
x-linked
adrenoleukodystrophy. Biochimica et Biophysica Acta 1688: 26-32. 2004.
VIEGAS CM; DA COSTA FERREIRA G; SCHUCK PF; TONIN AM; ZANATTA A; DE
SOUZA WYSE AT; DUTRA-FILHO CS; WANNMACHER CM; WAJNER M.
Evidence that 3-hydroxyisobutyric acid inhibits key enzymes of energy metabolism in
cerebral cortex of young rats. International Journal of Developmental
Neuroscience 26: 293-299. 2008.
VOET D; VOET JG; PRATT CW. Fundamentos de bioquímica. 2 ed. Porto Alegre:
Artmed, p. 931. 2008.
WADDELL L; WILEY V; CARPENTER K; BENNETTS B; ANGEL L; ANDRESEN BS;
WILCKEN B. Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency: genotype101
biochemical phenotype correlations. Molecular Genetics and Metabolic 87: 32-39.
2006.
WAJNER M; LATINI A; WYSE ATS; DUTRA-FILHO CS. The role of oxidative damage in
the neuropathology of organic acidurias: Insights from animal studies. Journal of
Inherited Metabolic Disease 27: 427-448. 2004.
WALKER V. Inherited organic acid disorders. In: Clinical Biochemistry and the Sick Child
(CLAYTON BE; ROUND JM. eds.) Oxford: Blackwell. 1994.
WALLACE DC. Mitochondrial diseases in man and mouses. Science 283: 1482-1487. 1999.
WALLIMANN T; WYSS M; BRDICZKA D; NICOLAY K; EPPENBERGER HM.
Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes
in tissues with high and fluctuating energy demands: the 'phosphocreatine circuit' for
cellular energy homeostasis. The Biochemical Journal 281: 21-40. 1992.
WHITE RJ; REYNOLDS IJ. Mitochondrial depolarization in glutamate-stimulated neurons:
an early signal specific to excitotoxin exposure. The Journal of Neuroscience 16:
5688-5697. 1996.
WILCKEN B; HAAS M; JOY P; WILEY V; CHAPLIN M; BLACK C; FLETCHER J;
MCGILL J; BONEH A. Outcome of neonatal screening for medium-chain acyl-CoA
dehydrogenase deficiency in Australia: a cohort study. Lancet 369: 37-42. 2007.
WYSS M; KADDURAH-DAOUR R. Creatine and creatinine metabolism. Physiological
Reviews 80: 1107–1213. 2000.
ZHOU BG; NOREMBERG MD. Ammonia downregulates GLAST mRNA glutamate
transporter in rat astrocyte cultures. Neuroscience Letters 276: 145–148. 1999.
102