Universidade Federal de Alfenas
Campus Avançado Poços de Caldas
Instituto de Ciência e Tecnologia
Rafael Matsumoto Pereira
Técnicas de imobilização e estabilização de lipases
obtidas a partir de diferentes fontes microbianas
Poços de Caldas-MG
2014
Rafael Matsumoto Pereira
Técnicas de imobilização e estabilização de lipases
obtidas a partir de diferentes fontes microbianas
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
como parte dos requisitos para obtenção de grau
em Engenharia Química pelo Instituto de Ciência
e Tecnologia na Universidade Federal de Alfenas
– Campus avançado de Poços de Caldas.
Área
de
concentração:
Engenharia
Biotecnológica.
Orientadora: Grazielle Santos Silva Andrade.
Poços de Caldas-MG
2014
AGRADECIMENTOS
À Profª Dra. Grazielle Santos Silva Andrade, orientadora, pela dedicação, paciência,
conhecimentos transmitidos e confiança depositada na realização deste trabalho.
À Profª Dra. Maria Gabriela Nogueira Campos pelos conhecimentos transmitidos e
ajuda na realização deste trabalho.
À colega de trabalho Paula Mari Sato pela ajuda na realização da parte experimental
deste trabalho.
RESUMO
A obtenção de produtos industriais é limitada pelos catalisadores químicos que
apresentam entre outras características, pouca versatilidade, pois necessitam de
altas temperaturas e não são biodegradáveis. Em 1960 iniciaram-se os estudos de
tecnologias que permitisse os usos catalisadores biológicos que são mais versáteis
e biodegradáveis para lidar com os problemas encontrados com os catalisadores
químicos. Atualmente são três os maiores seguimentos industriais que utilizam
biocatalisadores na sua linha de produção (farmacêutico, alimentos e ração animal),
porém cada vez mais esse recurso esta despertando interesse em outros
seguimentos. Enzimas são cadeias longas de polímeros formadas por aminoácidos
sucessivamente ligados covalentemente entre si por ligações peptídicas que
possuem diferentes formas de classificação e podem ser de origem vegetal, animal
ou microbiana. Dentre as enzimas mais utilizadas esta a lipase que são enzimas
nomeadas pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB)
como triacilglicerol acil-hidrolase, EC 3.1.1.3. Elas podem ser aplicadas em diversos
setores industriais e catalisar diferentes reações, além de ser imobilizadas em
diferentes tipos de suportes e métodos de imobilização. Foi realizado um
levantamento de diversos trabalhos que imobilizam esta enzima em diferentes
suportes e métodos e suas características. Durante o levantamento bibliográfico,
constatou-se que grande parte dos trabalhos relata apenas a utilização de lipase do
tipo extracelular em processos de imobilização. Nesse aspecto, com objetivo de
avaliar um novo processo de imobilização de lipase intracelular, uma metodologia
experimental foi desenvolvida, a fim de imobilizar células contendo lipase intracelular
em um hidrogel de quitosana, matriz muito utilizada como suporte de imobilização.
Os resultados preliminares demonstraram que o suporte tem boa estabilidade
mecânica, mas afetou a produção de lipase intracelular. Desse modo, mais estudos
se faz necessário para descobrir a melhor maneira de empregar o hidrogel de
quitosana na imobilização celular, visto que trata-se de um suporte de baixo custo.
Palavras-chaves: Lipase. Suportes. Imobilização.
ABSTRACT
The obtaining of industrial products is limited by chemical catalysts that have among
other features, little versatility, since they require high temperatures and are not
biodegradable. In 1960, began the studies of technologies that enable the use of
biological catalysts that are more versatile and biodegradable to deal with the
problems encountered with chemical catalysts. Currently there are three major
industrial sectors that use catalysts in the production line (pharmaceutical, food and
animal feed), but more and more this feature that attracted interest in other
segments. Enzymes are long chain polymers formed by successively amino acids
covalently linked together by peptide bonds that have different ways of classification
and can be of plant, animal or microbial origin. Among the most frequently used
enzymes, it is lipase which are named by the International Union of Biochemistry and
Molecular Biology (IUBMB) as triacylglycerol acyl-hydrolase, EC 3.1.1.3. They can be
applied in several industrial sectors and catalyze different reactions and be
immobilized on different types of supports and immobilization methods. A survey of
several studies that immobilize this enzyme in different supports and methods and
their characteristics was made During the bibliographic research, it was observed
that most studies report only the use of the extracellular lipase in immobilization
procedures. In this aspect, to evaluate a new process of immobilization of
intracellular lipase, an experimental methodology was developed in order to
immobilize cells containing intracellular lipase on a chitosan hydrogel array widely
used as immobilization support. Preliminary results demonstrated that carrier has
good mechanical stability, but affected the intracellular production of lipase. Thus,
more research is needed to discover the best way to employ the chitosan hydrogel in
cell immobilization, since it is a low-cost support.
Keywords: Lipase. Support. Immobilization.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CALB – Candida antarctica
CRL – Candida rugosa
EPI – Epicloridrina
GLI – Glicidol
GLU – Glutaraldeído
LLP – Lipase de pâncreas de porco
LTL – Thermomyces lanuginosus
MML – Mucor miehei
PHB – Poli-hidroxibutirato
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 8
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................ 9
ENZIMAS ..................................................................................................................................... 9
2.1.
LIPASE .................................................................................................................................. 11
2.1.1.
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS .................................................................................................... 14
2.1.
TIPOS DE SUPORTE ............................................................................................................. 14
2.2.1.
2.2.2. MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ............................................................................ 15
2.2.2.1. IMOBILIZAÇÃO POR ADSORÇÃO FÍSICA .............................................................................. 16
2.2.2.2. IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE ........................................................................ 18
2.2.2.3.
2.2.3.
3.
IMOBILIZAÇÃO POR ENCAPSULAMENTO ....................................................................... 20
IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS ............................................................................................... 21
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................. 22
3.1.
MATERIAIS ............................................................................................................................... 22
3.2.
METODOLOGIA EXPERIMENTAL ............................................................................................. 23
3.2.1.
PREPARAÇÃO DO HIDROGEL DE QUITOSANA .................................................................. 23
3.2.2.
PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS ................................................. 23
ANÁLISES ................................................................................................................................. 24
3.3.
3.3.1.
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS ...... 24
3.3.2.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS 24
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................... 25
5.
CONCLUSÕES .............................................................................................................................. 27
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 28
8
1. INTRODUÇÃO
Uma das maiores limitações encontradas na obtenção de produtos e
intermediários em indústrias são os catalisadores químicos que, normalmente, são
usados nas reações. Esses catalisadores apresentam pouca versatilidade,
necessitam de altas temperaturas para que a reação ocorra com uma velocidade
aceitável, são pouco específicos, formam produtos indesejados e, normalmente
precisam ser purificados, aumentando assim o custo de produção (MENDES et al.,
2011).
Por outro lado, os catalisadores biológicos (enzimas) podem ser aplicadas em
condições brandas de temperatura, pH e pressão, pois sua velocidade de reação é
superior aos catalisadores químicos e por serem mais específicos, aumentam o
rendimento final do processo, não havendo formação de reações paralelas. Os
produtos formados pela reação que utilizam enzimas tendem a ser biodegradável, o
que ajuda a reduzir os resíduos da produção (MESSIAS et al., 2011; MENDES et al.,
2011)
Devidos às inúmeras vantagens da utilização de enzimas como biocatalisadores,
a partir do inicio da década de 1960 iniciou-se os estudos de tecnologias que
permitissem o seu uso para tal fim. Segundo o estudo realizado pela empresa de
pesquisa Freedonia Group, a venda de enzimas pode chegar a 2,8 bilhões de
dólares em 2014 (SANTOS, 2012).
Atualmente são diversos os seguimentos que utilizam os biocatalisadores, sendo
que o mercado mundial concentra-se em três seguimentos: i) indústrias de alimentos
(produção de xarope e compostos aromatizantes); ii) enzimas técnicas (formulação
de detergentes, produção de papel e celulose) e iii) produção de ração animal.
As principais enzimas de aplicação industrial são proteases, amilases, lipases,
celulases, xilanases e fitases, e as maiores empresas produtoras líderes do mercado
são: a empresa Novozymes, Gist-Brocades e Genencor International Inc.
(MENONCINI et al., 2009).
Apesar dos grandes benefícios da utilização de enzimas, a sua aplicação
industrial ainda encontra alguns obstáculos que inviabilizam seu emprego em larga
escala, como por exemplo a solubilidade da enzima em água que resulta muitas
vezes na contaminação do produto desejado, exigindo assim uma etapa de
separação no final do processo que além de gerar custos (separação e purificação),
9
inutiliza a enzima. Uma forma encontrada para sanar esse problema é utilizar a
técnica de imobilização que estabiliza a enzima e permite o seu reuso (CANILHA;
CARVALHO; SILVA, 2006).
A imobilização pode ser feita utilizando diferentes suportes tanto orgânicos
quanto inorgânicos e por diferentes métodos, como por exemplo, a adsorção física,
encapsulação, ligação covalente ou por reticulação, sendo o primeiro o mais
empregado industrialmente por ter baixo custo. Porém, nos ultimos anos, diferentes
suportes estão sendo estudados para realizar a imobilização por ligação covalente
(GONÇALVES, 2007).
Nesse contexto, o presente trabalho tem por objetivo realizar uma revisão
bibliográfica das diversas técnicas de imobilização de enzimas
proveniente de
diferentes fontes microbianas, particularmente as lipases, bem como suas
caracteristicas cataliticas. Além disso, tendo em vista que praticamente não existe
relato na literatura sobre a imobilização de lipase intracelular em hidrogel de
quitosana, uma nova metodologia experimental foi testada a fim de avaliar a
potencialidade desse suporte na imobilização celular.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. ENZIMAS
Enzimas
são
cadeias
de
polímeros
formadas
por
aminoácidos
sucessivamente ligados covalentemente entre si por ligações peptídicas, sendo que
sua conformação e a estabilidade da estrutura molecular são mantidas por ligações
de hidrogênio, interações hidrofóbicas, forças de van der Walls, etc (SANTOS,
2012). São biocatalisadores presentes em sistemas biológicos e em organismos
vivos que aceleram ou possibilitam a ocorrência de uma reação sem serem
consumidas (SOUZA, 2006; SIMÕES et al., 2010; SANTOS, 2012).
As enzimas possuem diversas formas de classificação, sendo a mais
importante a estabelecida pela União Internacional de Bioquímica (IUB), que as
dividiu em 6 classes principais como é apresentado na Tabela 1:
10
Tabela 1 – Classificação das enzimas estabelecida pela IUB
Classificação
Reação que catalisam
Enzimas
Oxido-redutases
Reações de óxidoredução.
Transferência de átomos de
O e H ou elétrons de um
substrato para o outro.
Reações de transferência de
grupos específicos de um
composto para o outro.
Hidrogenase; Oxidase;
Peroxidase; Hidroxilases;
Oxigenases.
Transferases
Hidrolases
Reações hidrolíticas
Liases
Reações reversíveis, não
hidrolíticas de remoção de
grupos da molécula de
substrato.
Reação de isomerização
transformam isômeros entre
si (cis e trans).
Reação de síntese de novos
compostos, derivados da
junção de duas moléculas.
Isomerases
Ligases
Aminotransferases;
Acetiltransferase; Cinases;
Fosforilases;
Frutosiltransferase
Lipases; Proteases;
Amilases; Pectinases.
Descarboxilases;
Aldolases
Glicose-isomerase.
Piruvato carboxilase
Fonte: SANTOS, 2012
Até o século XIX, as enzimas foram nomeadas empregando-se o sufixo “ina”,
geralmente em seguida ao nome da fonte da enzima. No final do mesmo século, E.
Duclaux sugeriu que fosse utilizado o sufixo “ase” posteriormente ao nome do
substrato do qual a enzima foi extraída. Ambas as nomenclaturas ainda são
utilizadas nos dias de hoje, porém em 1956, a União Internacional de Bioquímica
propôs uma nova forma de classificação que entrou em vigência em 1961
(MENDES, 2009).
As enzimas podem ser de origem vegetal (papaína, bromelina, ficina, malte),
animal (pancreatina, tripsina, quimiotripsina, pepsina, renina, catalase) e microbiana
(celulases, amilases fúngicas, lipases) que podem ser obtidas através de bactérias,
fungos filamentosos e leveduras (ARAUJO, 2009; SANTOS, 2012). As enzimas
microbianas apresentam maior interesse industrial por serem produzidas com maior
facilidade em larga escala e também pela enorme diversidade microbiana que
oferecem, resultando em diversas possibilidades de trabalho (SANTOS, 2012).
11
2.1.1.
LIPASE
As lipases, juntamente com as esterases constituem o grupo de
enzimas que metabolizam e realizam a hidrolise dos lipídeos. São muito importantes
fisiologicamente,
pois
hidrolisam
óleos
e
gorduras
em
ácidos
graxos,
monoglicerídeos e diglicerídeos essenciais ao metabolismo.
As lipases são enzimas nomeadas pela União Internacional de Bioquímica e
Biologia Molecular (IUBMB) como triacilglicerol acil-hidrolase, EC 3.1.1.3. Sua
função é catalisar a hidrólise de ésteres de glicerol e ácidos graxos de cadeias
longas e também para catalisar a síntese de ésteres, para reações de
transesterificação e lactonização, como mostrado na Figura 1 (GONÇALVES, 2007;
VOLPATO, 2009; SANTOS, 2012). Apresentam massa molecular variando entre 20
a 75kDa e, normalmente, são estáveis em soluções aquosas neutras à temperatura
ambiente. Sua atividade ótima ocorre em temperaturas entre 30 e 40ºC, mas podem
variar dependendo de sua origem (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
Figura 1 – Exemplos de reações catalisadas por lípase
Fonte: (MENDES, 2009).
Essas enzimas são as mais utilizadas em síntese orgânica e mais de 20%
das biotransformações também ocorrem com a sua ajuda por apresentarem
especificidade por um grande numero de substratos, mas principalmente devido a
12
sua elevada enantioseletividade. Outro aspecto interessante que torna a lípase
muito procurada é a facilidade com que suas propriedades catalíticas podem ser
moduladas pelas condições de reação e pequenas variações na estrutura (SANTOS,
2012).
A lipase, assim como a maioria das enzimas, podem ser encontradas na
natureza a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Inicialmente, eram
obtidas a partir de pâncreas de animais. Porém com os avanços tecnológicos, as
enzimas de origem microbiana passaram a ser mais vantajosas por apresentarem
menor custo de produção, possibilidades de produção em larga escala em
fermentadores industriais e oferecer uma diversidade de características físicoquímicas
devido
as
suas
propriedades
enzimáticas,
como
especificidade,
estabilidade, temperatura e pH de atuação, ou habilidade para catalisar reações de
síntese na presença de solventes orgânicos, além do rápido crescimento.
Normalmente são produzidas por fermentação microbiana extracelular por serem
mais fáceis de extrair e purificar, além de apresentarem maior estabilidade
(MENDES, 2009; VOLPATO, 2009; SANTOS, 2012).
Muitos micro-organismos podem produzir diferentes lipases conforme as
condições de cultivos em que se encontram (pH, composição do meio de cultura,
temperatura, tempo de cultivo). Um estudo realizado por Sharma et al. (2001) listou
109 diferentes espécies capazes de produzir lipase, sendo que 47 são bactérias,
principalmente dos gêneros Bacillus, Pseudomanas e Staphylococcus, 42 são
fungos e 20 são leveduras. Os fungos filamentosos são considerados os melhores
produtores de lipase, sendo as espécies dos gêneros Aspergillus, Fusarium,
Geothrichum, Mucor, Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus e Thermomyces os maiores
produtores, assim como a levedura Candida rugosa. (GONÇALVES, 2007; DALLAVECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
Basicamente existem dois métodos qualitativos para seleção de microorganimos produtores de lipases na literatura. Um deles é descrito por Cardenas et
al. (2001) que consiste na utilização de ágar contendo tributirina (tipo de gordura
encontrada na manteiga) como substrato e a formação de um halo translúcido ao
redor da colônia pelo consumo do substrado que indica a produção de lipase. E o
outro método, é descrito por Wang et al. (1995), que utiliza ágar contendo rhodamina
B e a produção de lipase é determinada pela presença de um halo avermelhado
visível sob luz UV (ultra-violeta).
13
Fatores como fonte de carbono e nitrogênio, presença de indutores,
estimuladores inibidores, agentes que afetam a interface óleo/água, temperatura de
incubação, pH do meio de cultura e inóculo afetam o processo de produção de
lipase por microrganismos. Esses fatores infereferem no crescimento de todos os
tipos de microrganismos produtores de lipase, tornando assim necessario o estudo
de como ocorre essa influência na biossintese dessa enzima para que seja possivel
obter uma condição ótima de produção (GONÇALVES,2007).
São diversos os campos em que a lipase pode ser utilizadas, sendo que o seu
foco principal esta voltado aos setores setor alimentício e químico conforme indicado
na Tabela 2.
Tabela 2- Exemplos de aplicações de lipase na industria
Setor
Área
laticínio
Efeito Utilizado
hidrólise da gordura
do leite
bebidas
melhoramento do
aroma e aceleração
da fermentação, por
remoção de lipídeos
melhoramento da
qualidade do ovo por
hidrólise dos lipídeos
transesterificaçao de
óleos naturas;
hidrólise de óleos
(ácidos graxos),
diacilglicerol
síntese de ésteres
remoção de manchas
de óleo e gorduras
digestão de óleos e
gorduras de
alimentos
análise de
triacilglicerol no
sangue
remoção de lipídeos
processamento de
derivados do ovo
Alimentício
processamento de
óleos
química fina
detergentes
farmacêuticos
Químico
analítico
cosmético
curtume
remoção de gorduras
das peles de animais
Fonte: SANTOS, 2012
Produto
agente
aromatizante para
produtos lácteos
bebidas alcoólicas
(vinho e outras)
maionese, molhos
e cremes
óleos e gorduras
modificadas
(substitutos da
manteiga de
cacau)
ésteres
gorduras
digestivos
Diagnostico
cosméticos em
geral
produtos de couro
14
2.1.
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
A imobilização é o processo no qual se fixa a enzima de interesse em um
suporte para que sua atividade catalítica não seja afetada negativamente, ou seja é
uma forma de proteção contra condições adversas do meio (CANILHA;
CARVAOLHO; SILVA. 2006). Esse recurso é utilizado pois permite o usa da enzima
em processos continuos, pois diminiu os riscos de contaminação em operações com
altas taxas de diluição e a formação de subprodutos, aumenta a estabilidade,
permite o reaproveitamento do material e reduz o custo de operação. Além disso,
permite a utilização em diferentes solventes, pHs e temperaturas e podem ser
expostas a agentes desanturantes.
2.2.1. TIPOS DE SUPORTE
Os suportes utilizados para imobilização se dividem em dois tipos principais,
os que confinam fisicamente a enzima, ou seja, a enzima é encapsulada no suporte
que pode ser glóbulos ou fibras feitas de polissacarídeos, de proteína ou de
polímeros sintéticos e os que aderem a superficie (adosorção física), no qual a
enzima fixa-se ao suporte por ligação quimica (iônica ou covalente) (CANILHA;
CARVAOLHO; SILVA. 2006).
A escolha do tipo de suporte deve ser em função da porcentagem de
rentenção de atividade que o conjunto suporte-método apresentar, ou seja, quanto
maior a porcentagem desse conjunto, melhor ele é. Quão grande é essa
porcentagem dependerá basicamente de dois fatores: as caracterisiticas peculiares
do material biológico e das condições de uso do sistema imobilizado. Portanto, não
existe um suporte universal, sendo necessário, portanto, um estudo para determinar
qual é o melhor suporte com base na enzima que deseja confinar (CANILHA;
CARVALHO; SILVA. 2006).
Na literatura, são citados vários materiais que podem ser utilizados como
suporte, podendo ser geliformes (alginato, álcool polivinílico, quitosana, etc) ou
superficies sólidas (vidro poroso, alumina, etc). Esses materiais devem ser
facilmente encontrados e em abundância, ter baixo custo, ser de fácil operação, não
ser tóxico para a enzima e ter alta resistência mecânica. Outras caracteristicas que
deve ser observadas na seleção de um suporte é a sua área superficial,
permeabilidade,
insolubilidade,
capacidade
de
regeneração,
morfologia
e
15
composição, natureza hidrofílica, resistencia ao ataque microbiano, etc (MENDES,
2009).
Uma classe de material que se comporta como bons suportes são os
polímeros. Os polímeros sintéticos (resinas acrílicas) apresentam variedades de
formas físicas e estruturas quimicas e podem ser combinadas para formar um
suporte melhor. Já os polímeros naturais (agarose e hidrogéis de quitosana)
apresentam baixo custo e são degradáveis. São exemplos de suportes (MENDES,
2009):

Resina acrílica de afinidade –Toyopearl: com diferentes grupos químicos
em sua estrutura, são hidrofílicas, com alta porosidade e é estavel em
diferentes solventes organicos e em condições extremas de pH;

Poli-Hidroxibutirato (PHB): poliésteres simples, sintetizados por muitos
micro-organismos. Apresenta alta cristalinilidade e hidrofobicidade, é
biodegradável e possui carater hidrofóbico. Essas caracteristicas o torna
um material apropriado para a imobilização de enzimas, especificamente
lipase;

Quitosana: produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável
obtida pela desacetilação da quitina extraida das carapaças de crustáceos
que são um resíduo rejeitado pela indústria pesqueira. Pode ser aplicada
em diversos processos de imobilização de enzimas devido as suas
diferentes configurações geométricas tais como pó, hidrogéis, membranas
e fibras e pela presença de diferentes grupos funcionais em sua estrutura;

Agarose: mistura de moléculas de ágar com um conteúdo menor de cargas
e portanto com maior capacidade de gelificação. É um dos suportes mais
utilizados na imobilização de enzimas;

Silica: produto sintético, produzido pela reação de silicato de sódio e ácido
sulfúrico, que ao serem misturados, resultam em uma estrutura sólida de
sílica gel. Possue alta resistência mecânica e estabilidade térmica e
quimica.
2.2.2. MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Os métodos de imobilização, assim como o suporte, dependem das
características peculiares do material biológico e das condições de uso do sistema
16
imobilizado, ou seja, não existe um método geral que pode ser usado para qualquer
processo. Na literatura muitos métodos são descritos e utilizados para contornar os
possíveis problemas de instabilidade das enzimas frente a solventes orgânicos, bem
como otimizar as várias aplicações.
Lipases tem sido imobilizadas em diferentes suportes de natureza orgânica e
inorgânica empregando diferentes métodos de imobilização tais como adsorção ou
ligação da enzima a um material insolúvel por ligação cruzada, confinamento em
matrizes formadas por géis poliméricos ou encapsulamento em membrana
polimérica (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004, MENDES, 2009). Um
esquema dos métodos de imobilização de enzimas são mostrados na Figura 2.
Figura 2 – Diferentes métodos de imobilização de enzimas
Fonte: DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004.
A seguir, estão descritos os métodos mais empregados na imobilização de
lipases, bem como um compêndio de diferentes trabalhos relatados na literatura.
2.2.2.1. IMOBILIZAÇÃO POR ADSORÇÃO FÍSICA
O processo de adsorção física é o método mais utilizado por ser simples,
barato, não ser necessário a ativação do suporte e possibilitar a regeneração da
matriz utilizada. A enzima é imobilizada em um suporte sólido por ligações de baixa
energia tais como de van der Walls ou hidrofóbicas, iônicas, etc. Esse método
depende de fatores como tamanho da enzima a ser adsorvida, área superficial do
adsorvente, porosidade (permitem a ligação da enzima com a superficie interna do
suporte, fortalecendo a adsorção) e tamanho do poro. No entanto, possui a
17
desvantagem de sofrer dessorção devido às variações de tempertura, pH e força
iônica. Vários materias podem ser usados como suporte e a escolha depende de
propriedades tais como estabilidade e capacidade de adsorção. Alguns exemplos
desses suportes mais utilizados são o polietileno, poliprileno, resina sintética, entre
outros (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; CANILHA; CARVALHO;
SILVA, 2006; MENDES et al., 2011).
Palomo et al. (2002), testou a imobilização das lipases de Candida antarctica
(CALB), Mucor miehei (MML) e Candida rugosa (CRL) no suporte octadecilsepabeads pelo método de adsorção física e em glioxil-agarose e glutaraldeídoagarose pelo método de ligação covalente e estudou a atividade e estabilidade dos
métodos. Enquanto a imobilização covalente em glutaraldeído e glioxil-agarose
apresentou um efeito desprezível sobre a atividade da enzima (mesmo promoveu
uma ligeira diminuição) a imobilização interfacial promoveu um incremento
significativo na atividade da enzima. A estabilidade térmica do método de adsorção
é maior do que as imobilizadas por ligação covalente.
O trabalho de Fernandes et al. (2013) avaliou o efeito de parâmetros de
imobilização (tempo de imobilização e pH) da lipase comercial CaLB pelo método de
adsorção, utilizando como suporte nanopartículas do PHBV e a estabilidade térmica
da enzima imobilizada. De acordo com os resultados obtidos verificou-se que nos
tempos de 30 e 60 min a percentagem de adsorção foi superior a 93%, mas a
atividade do imobilizado foi de 0,11 e 0,09 U/g. No tempo de 120 minutos resultou no
maior valor de atividade do imobilizado (0,33 U/g), sendo que a percentagem de
adsorção foi de 88,90%. A avaliação do pH de imobilização foi realizada buscando
um maior fator de imobilização e os resultados mostram que a imobilização em pH 5
e pH 6 apresentaram a maior atividade do imobilizado (0,35 U/g). Após a exposição
de 21 horas a 40 °C, a lipase imobilizada manteve sua atividade inicial, no mesmo
período de tempo a 60 °C, a atividade hidrolítica da CalB/PHBV apresentou
decréscimo, com atividade residual de 67% e em 80 °C a enzima imobilizada
manteve mais de 50 % de sua atividade inicial.
Mendes (2009) imobilizou lipases CALB e Thermomyces lanuginosus (LTL) em
suportes hidrofóbicos octil-agarase, hexil-toyopearl e octadecil-sepabeads na
relação 1:60 (suporte: solução enzimática. A atividade hidrolitica, a estabilidade
térmica e o tempo de meia-vida foram determinados para casa caso.Os resultados
da atividade hidrolílica mostraram que o CALB imobilizado em hexil-toyopearl
18
apresentou o menor percentual de redução (16%), enquanto o suporte octadecilsepabeads apresentou o maior percentual de redução (63%). O LTL apresentou
redução no suporte octadecil-sepabeads (41%), porém apresentou um aumento na
atividade de 45x e 16x nos suportes octil-agarase, hexil-toyopearl, respectivamente.
A maior estabilidade térmica e o maio tempo de meia-vida foi encontrada para o
CALB imobilizado em octil-agarase (196x em relação à forma solúvel e 5,55h ) e a
menor para ambos também foi para o CALB, porém imobilizado em octadecilsepabeads (62x em relação à forma solúvel e 1,75h).
2.2.2.2. IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE
O método de ligação covalente baseia-se na ativação do suporte com algum
grupo reativo, como por exemplo polietilenoglicol, que interage com os grupos
nucleofílicos da enzima formando ligação covalente ou ligações cruzadas numa
matriz constituida pela enzima e por agentes bifuncionais (DALLA-VECCHIA;
NASCIMENTO; SOLDI, 2004; MENDES et al., 2011).
Mendes, Castro e Giordano (2013), testou a imoblização por ligação
covalente multipontual da (LTL) em bagaço de cana-de-açúcar, partículas de polihidróxibutirato (PHB) e hidrogéis híbridos de quitosana-alginato. Os hidrogéis foram
modificados quimicamente para a formação do hidrogel de quitosana-alginatolaurinaldeído
e
do
hidrogel
de
quitosana-alginato-
ácido
2,4,6
trinitrobenzenossulfônico (TNBS). Cada suporte foi ainda ativado com diferentes
agentes: glicidol (GLI), epicloridrina (EPI) e glutaraldeído (GLU) 25%. As
propriedades catalíticas de cada caso foram determinadas e o conjunto que
apresentou melhor atividade catalítica foi a lipase imolizada no suporte quitosanaalginato-TNBS ativada com GLI (234,6 U/g de suporte), e o maior tempo de meiavida foi no suporte quitosana-alginato-TNBS ativada com EPI (3,99h).
Amorim et al. (2003), testou a imobilização da lípase de Candida cylindraceae
em um filme de quitosana ativado com glutaraldeido. A estabilidade do sistema
imobilizado foi testado reutilizando o sistema 4 vezes e verificando sua atividade. A
atividade da lipase caiu drasticamente em 45% da atividade inicial depois de usado
pela segunda vez e manteve-se estável até a quarta.
Simões et al. (2010) testou uma matriz híbrida SiO2-quitosana preparada pela
técnica sol-gel, empregando como precursor silano tetraetilortossilicato (TEOS) para
19
imobilização da lipase de Candida rugosa por ligação covalente. Após realizado o
procedimento de imobilização, foram obtidos derivados com atividade hidrolítica de
668 U/g de suporte, o que corresponde a 40,7% de atividade recuperada. Para a
lipase livre, os valores de atividade hidrolítica variaram entre 4956 a 12296 U/g e os
valores mais elevados foram obtidos no ponto central (pH = 7,0 e 50 ºC). Já para a
lipase imobilizada, a atividade hidrolítica variou entre 307 a 891 U/g também em pH
7,0 e 50 ºC. O valor obtido para Vmax foi de 12050 mmol/g min para LCR livre e 1409
mmol/g min para a LCR imobilizada, já os valores de KM determinados foram 534
mM para LCR livre e 851 mM para LCR imobilizada, indicando uma mudança da
afinidade da lipase pelo substrato, na forma imobilizada. O tempo de meia-vida de
ambas a lipases encontrado foi de 0,19 e 1,63 h, respectivamente, para lipase livre e
imobilizada em SiO2-quitosana, que corresponde a um aumento da estabilidade
térmica de aproximadamente 9 vezes da lipase imobilizada em SiO 2-quitosana.
Mendes (2009) testou a imobiliação da lipase de pâncreas de porco (LPP)
ativada com glutaraldeído, glioxil, glicidol e epicloridrina e de fonte microbiana, LTL,
LPF CALB e Lipex
®
100L ativadas com glicidol (GLI), epicloridrina (EPI) e
glutaraldeído (GLU) em suporte de agarose 6BCL ativada. A imobilização da LPP
não apresentou atividade hidrolitica em nenhum caso devido possivelmente a baixa
estabilidade da enzima no pH de imobilização. Já as lipases de origem microbiana
em 30 minutos de imobilização, aproxidamente 80% da atividade enzimática
desapareceu do meio de imobilização e após 1 hora atingiu 100%. A lipase com
maior atividade hidrolítica foi a LTL ativada com GLU durante 12h (321,5 U/g de
suporte) e a lipase com mair tempo de meia-vida também foi a LTL imobilizada em
GLI, porém com tempo de imobilização de 48h.
Knezevic et al. (2006), testou a imobilização da lIpase obtida de Candida
rugosa no suporte Eupergit® C ativada por três agentes diferentes. O primeiro foi a
imobilização da lipase através de grupos oxirano, o segundo por glutaraldeído e o
terceiro pelo método do periodato. Foi calculada a eficiência da imobilização, a
atividade da enzima, a estabilidade térmica. A maior eficiência foi alcançada quando
a lipase foi imobilizada sobre Eupergit ® C através de grupos oxirano (52,4%). Já a
maior atividade da lipase foi encontrada na lipase imobilizada sobre Eupergit ® C
ativado por periodato.
Ellaiah et al. (2001) tratou da imobilização de lipase produzida por uma forma
mutante de A. niger utilizando diferentes técnicas de aprisionamento com matrizes
20
alginato de sódio, k-carragenina ou em gel de poliacrilamida. O efeito de diferentes
tempos de incubação na atividade em cada matriz foi investigado. A maior atividade
foi registrada na lipase imobilizada em alginato de sódio (4225 U/l) em um período
de incubação de 96h e o menor valor encontrado foi para a lipase livre (2660 U/l)
incubada 120h.
2.2.2.3.
IMOBILIZAÇÃO POR ENCAPSULAMENTO
A imobilização por encapsulação consiste em retenção física da enzima nas
cavidades internas de uma matriz sólida porosa, criando uma cela artificial
delimitada por uma membrana porosa. A velocidade com qual o substrato e os
produtos formados difundem-se através da membrana é um fator limitante deste
método. As enzimas apresentam maior atividade em substratos de baixa massa
molar, pois estes difundem-se com maior facilidade (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO;
SOLDI, 2004; MENDES et al., 2011).
O trabalho realizado por Alsarra, Neau e Howard (2003), realizou o
encapsulamento
da
lípase
com
diferentes
concentrações
de
tripolifosfato
pentassódico (TPP) e pH em 3 formas de hidrogel a base de quitosana (fresca,
liofilizada e re-hidratada) e o caracterizou quanto a eficiência do processo, liberação,
atividade da enzimática e eficiência na reutilização das enzimas. A máxima liberação
da lipase ocorreu na imobilização na forma fresca do suporte em pH 6,0 e
concentração de TPP 0,5 % (m/v) (0,759 mg) e a menor liberação também foi na
forma fresca no pH 7,0 com concentração de TPP 0,5 % (m/v) (0,219 mg). A maior
atividade enzimática foi encontrada para a lipase imolibizada em pH 7,0 e
concentração de TPP 0,5 % (m/v) no suporte fresco (4817 U/ml) e a menor atividade
em pH 7,0 e concentração de TPP 0,8 % (m/v) (697 U/ml) no suporte imobilizado. A
atividade de reuso após cinco vezes apresentada pela imobilização em suporte
fresco foi mantida em 88% da sua atividade inicial, o hidrogel liofilizado e rehidratadas forneceram atividades residuais de 87% e 83%, respectivamente.
O estudo de Chiou e Wu (2003) demonstrou a imobilização da lipase de
Candida rugosa em suporte de quitosana contendo grupos hidroxila ativados com
carbodiimida. Carga de proteína, atividade da lipase imobilizada de forma seca e
úmida apresentaram a maior eficácia em termos de carga de proteína (71 e 109 µg/
21
g de quitosana, respectivamente) e atividade final (0,98 e 3,28 U / g de quitosana,
respectivamente) no pH 6,0.
2.2.3. IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS
A morfologia do micro-organismo influência diretamente na obtenção dos
produtos microbianos em processos fermentativos, pois diminui o tempo de cultivo e
aumenta o rendimento do processo. Uma forma encontrada para controlar a
morfologia desses seres vivos, é a imobilização celular que ajuda a preservar a
atividade catalítica para aplicações industriais e permite a reutilização da célula
imobilizada. Esse método foi desenvolvido com o intuito de diminuir o custo do
processo, pois ao contrário da imobilização de enzima, não precisa passar pela
etapa de extração, isolamento e purificação. Alguns exemplos de processos em que
essa ferramenta é utilizada são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 – Exemplos de processos que empregam imobilização celular.
Processo
Produção de pigmentos
Produção de proteínas
Micro-organismo
M. purpureus
G. fujikuroi
S. cevevisiae
Suporte Utilizado
Alginato, PUF, carvão, perlita
Alginato
PVA
Produção de enzimas
Beijerinckia sp.
A. pullulans
N. frowardii
H. lutea
Aspergillus sp.
P. chrysosporium
Maltodextrina
Agar, alginato
PUF
PVA-MAA/PEG, alginato
CrioPAG®
PUF, cerâmica, náilon,
poliestireno
PUF
Alginato
PUF
Alginato
Agar, lã de vidro
Náilon
Alginato
Biotransformação
Agaricus sp.
A. Níger
P. ostreatus
T. turnirae
R. minuta
T. versicolor
Rhodococcus sp.
Fonte: COVIZZI et al., 2007
São quatros os métodos gerais utilizados para imobilização de células (COVIZZI et
al., 2007):

Adsorção em suporte sólido: o principio deste método é semelhante à
imobilização de enzimas somada à habilidade dos micro-organismos
22
produzirem e secretarem exopolissacarídeos (EPS). Um dos problemas deste
tipo de imobilização está relacionado com a formação e acúmulo de biofilme
ou EPS sobre a superfície, o que dificulta a absorção de nutrientes resultante
das condições não homogêneas do crescimento celular. Por isso o uso dessa
imobilização é limitado para alguns tipos de micro-organismos, de acordo com
o comportamento reológico do meio de cultivo e o tipo de matriz utilizada.

Engaiolamento e Encapsulamento: é baseado na inclusão artificial das células
em uma malha rígida ou semi-rígida que impede a difusão delas para o meio
de cultivo. O tamanho da barreira em torno da célula dependerá da
velocidade de fluxo, da densidade da solução polimérica e da concentração
da solução iônica em que o suporte formará. Esse método permite a troca de
nutrientes, metabólitos durante o processo fermentativo sem alteração na
morfologia. O encapsulamento difere-se do método de engaiolamento pelo
fato de que as células ficam somente envoltas na membrana e não há
presença de malhas entre as células envolvidas. Ambos os métodos são
limitados pela quantidade e tamanho dos poros e pela quantidade de
biomassa acumulada no interior da matriz. Ágar, agarose, alginato e
quitosana são alguns exemplos de matérias que podem ser utilizados como
suporte para as células por esses métodos.

Auto-imobilização: é um método utilizado quando o micro-organismo em seu
crescimento formando aglomerados de micélios que se conformam em forma
de esferas ou “pellets” que caracteriza esse método. Sofre influência pela
quantidade de inóculo, forças mecânicas durante a fermentação e pela
presença de O2 dissolvido.
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
MATERIAIS
O micro-organismo utilizado neste trabalho foi o fungo da cepa Penicillium
citrinum gentilmente cedida pelo laboratório de Biocatálise da Escola de Engenharia
de Lorena, da Universidade de São Paulo. Para a síntese do hidrogel foi utilizado
23
quitosana com alto peso molecular (Sigma-Aldrich, grau de desacetilação maior que
75%) e sal dissódico de glicerol fosfato (Sigma-Aldrich). Outros reagentes utilizados
são de grau analítico: azeite de oliva comercial (Carbonell), goma arábica em pó
pura (Synth) e acetona (Synth).
3.2.
METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.2.1. PREPARAÇÃO DO HIDROGEL DE QUITOSANA
O hidrogel foi preparado dissolvendo-se quitosana (1,0179g) em 15 mL de
solução aquosa de ácido clorídrico 0,1M a temperatura ambiente e posterior adição
gota a gota de 1,2 mL de uma solução aquosa do sal dissódico de glicerol fosfato
(3,390g em 6,0 mL de água destilada). O hidrogel foi autoclavado a 121°C por 15
minutos e cortado em cubos de aproximadamente 5x5x5 mm.
3.2.2. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS
As células íntegras foram preparadas utilizando a técnica de fermentação
submersa em frascos agitados. A metodologia que serviu de base para a realização
do cultivo foi a descrita por Andrade et al. (2012), que consiste de um meio líquido
sintético composto por 70g/L de peptona, 1g/L de NaNO3, 1g/L de KH2PO4 e 0,5g/L
de MgSO4.7H2O. Em Erlenmeyers contendo 100 mL do meio de cultura foram
adicionados 50 cubos de hidrogel de quitosana (5x5x5 mm), os quais foram
previamente autoclavados (121°C/15 min). 30g/L de azeite de oliva (comercial) foi
adicionado assepticamente ao meio estéril, como agente indutor da produção de
lipase.
Para preparo do inóculo, os esporos foram raspados, suspensos em água
estéril e submetidos à agitação até a obtenção de uma suspensão. A concentração
de esporos na suspensão foi determinada por contagem em câmara de Neubauer.
Um volume contendo 1x106 esporos de cada fungo foi inoculado em cada frasco
Erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultura e os cubos de hidrogel, os quais
foram incubados por 72 h a 30°C sob agitação orbital em shaker (220 rpm). A
imobilização ocorreu como forma espontânea de crescimento dos micro-organismos.
24
A biomassa imobilizada foi separada do meio de cultura por filtração a vácuo,
lavada com água e acetona e seca em bomba de vácuo. A biomassa imobilizada foi
avaliada por meio de medida de peso seco e a atividade lipolítica foi quantificada
pelo método da hidrólise do azeite de oliva modificado (ANDRADE et al., 2012) tanto
no biocatalisador, quanto no filtrado, afim de verificar se houve produção de lipase
extracelular.
3.3.
ANÁLISES
3.3.1. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS
O teor de umidade das células íntegras após a etapa de filtração, foi
determinado a partir da Equação 1:
(1)
em que:
é a massa de micélio obtida após filtração a vácuo (g);
éa
massa de micélio obtida após secagem em estufa a 100°C por 24h (g).
3.3.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS
O método de hidrólise do azeite de oliva modificado (ANDRADE et al., 2012)
consistiu na preparação do substrato pela emulsão de 10 mL de azeite de oliva e
90mL de goma arábica a 3% (m/v). Em frascos Erlenmeyer de 125 mL foram
adicionados: 5 mL de substrato, 4 mL de solução tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH
7,0) e 0,5 g de células imobilizadas (massa seca) ou 1,0 g do caldo fermentado. Os
frascos foram incubados a 37°C por 30 min, em banho termostatizado com agitação.
Após o período de incubação, a reação foi paralisada pela adição de 10 mL de uma
mistura de acetona, etanol e água destilada (1:1:1). Os ácidos graxos liberados
foram titulados com solução de KOH 0,025 M, utilizando fenolftaleína como
indicador. Os cálculos foram realizados pela Equação 2, sendo uma unidade de
atividade definida como a quantidade de enzima que libera 1µmol de ácido graxo
por minuto de reação, nas condições do ensaio. As atividades foram expressas em
moles/g.min (U/g).
25
Atividade
mol / g. min   VA - VB  . M .10
6
(2)
t. m
Em que: VA = volume de KOH gasto na titulação da amostra (mL); VB

volume do
KOH gasto na titulação do branco (mL); M = molaridade da solução de KOH (M); t =
tempo de reação (min); m = massa (g).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fim de avaliar o processo de imobilização celular por adsorção física, o
cultivo e imobilização do fungo filamentoso P. citrinum foi realizado em partículas
cúbicas de hidrogel de quitosana. Após o cultivo, a biomassa imobilizada foi filtrada
e lavada com água e seca a temperatura ambiente. Através da Figura 3(a,b,c,d,e,f) é
possível verificar o crescimento das células e avaliar o processo de imobilização e
filtração.
É possível notar (Figura 3a) que a presença do hidrogel não afetou o
crescimento das células, que possuem morfologia em forma de pellets. Na Figura
3(b,c,d,e) verifica-se que o processo de imobilização foi satisfatório, visto que as
células aderiram ao redor das partículas de hidrogel que adquiriram coloração mais
escura, e que mesmo após a filtração e lavagem com água as células
permaneceram aderidas ao suporte. Na Figura 3(f) é mostrado a biomassa
imobilizada filtrada após secagem a temperatura ambiente.
26
a
b
c
d
e
f
Figura 3 – Imagem da biomassa após cultivo antes de ser filtrado (a), imagem dam
massa formada ao longo da filtração (b),(c), (d) e (e), imagem da biomassa formada após
completar o processo de filtração (f) .
A biomassa imobilizada foi avaliada quanto a massa seca e a atividade
enzimática intracelular pelo método da hidrólise do azeite de oliva modificado. Os
valores da massa do hidrogel e do micélio, assim como a umidade, a atividade da
biomassa e do filtrado são mostrados na Tabela 4.
27
Tabela 4 – Valor da massa do hidrogel e do micélio, umidade e atividade da
biomassa e do filtrado.
Parametro
Valor
Massa do Hidrogel
1,47g
Massa do Micélio
4,96 g
Umidade
56,08 %
Atividade da biomassa imobilizada
5,52 U/g
Atividade do filtrado
3,87 U/g
Os dados da Tabela 4 indicam que a presença do suporte não inibiu o
crescimento do fungo, que atingiu o valor de 4,96g em 100 mL de meio de cultura.
No entanto, a produção de lipase intracelular foi prejudicada, visto que a atividade da
biomassa imobilizada foi de apenas 5,52 U/g. A atividade do filtrado foi semelhante
(3,87 U/g), indicando que houve baixa produção de lipase intracelular, assim como
de lipase extracelular. Esse resultado é inferior ao obtido por Andrade et al (2012)
que obteve atividade intracelular de 30,82 U/g empregando o mesmo fungo pelo
método de imobilização celular, porém sem nenhum suporte de imobilização.
5. CONCLUSÕES
Com base na revisão bibliográfica realizada foi possível concluir que o campo de
aplicação de enzimas imobilizadas em diferentes segmentos é muito amplo. A
revisão apresenta diversos trabalhos que estudaram a imobilização da lipases de
diversas fontes por diferentes métodos em diferentes suportes que podem ser
ativados ou não por algum agente químico. A quitosana é um suporte presente em
muitos estudos, pois pode ser trabalhada em diversas morfologias, além de poder
ser combinada com outros materiais para o desenvolvimento de um suporte melhor.
Apesar do resultado não ter sido satisfatório, o hidrogel de quitosana é um suporte
interessante por suas propriedades físico-químicas ideais requeridas para um
suporte de imobilização, além de ser de baixo custo. Aliado a isso, o processo de
imobilização celular reduz o custo de produção de lipases, visto que elimina as
etapas de extração e purificação. Portanto, mais estudos são necessários a fim de
tornar o hidrogel de quitosana viável para ser aplicado no processo de imobilização
celular.
28
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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