Controle da expressão gênica
Como são usados os elementos na seqüência de DNA?
Em que condições o produto de cada gene é feito?
Quando feito, o que ele faz?
O Genoma de quase todas as células do organismo é igual
Diferenciação celular depende de mecanismos de memória celular
Uma célula humana típica expressa cerca de 10.000
genes de seus aproximadamente 25.000 genes.
O padrão de abundância de cada mRNA é muito típico
de cada tipo de célula.
Para um mesmo tipo de célula, a abundância de cada
mRNA varia de acordo com a fase de
desenvolvimento, com o estado funcional, com o ciclo
circadiano.
No DNA, existem seqüências específicas de nucleotídeos que são
alvos dos fatores de transcrição:
Elementos Regulatórios (“cis-acting elements”)
Os fatores de transcrição são denominados “trans-acting
elements” – pois são codificados por genes localizados em locais
distintos daquele ocupado pelo gene que está sendo regulado.
Os fatores reguladores reconhecem sequências de acordo com os grupos
químicos expostos nas incisuras maior e menor do DNA dupla fita
As diversas combinações das bases expõem grupos químicos de
forma distinta, especialmente na incisura maior
Fator regulador
Elemento cis
reconhecido
Reconhecem o sítio por
interações de fraca
intensidade: pontes de H,
interações eletrostáticas,
interações hidrofóbicas
Motivos observados nos domínios de interação com o DNA
Helix-turn-helix
Homeodomain – 3 hélices alfa
Zinc-finger
Beta sheet
Alças que entram nas incisuras do DNA (p53)
Ziper de leucina
Frequentemente formam dímeros
Reconhecimento de sequências palindrômicas
• Os primeiros estudos dos mecanismos de regulação da
expressão de genes foram realizados em bactérias
• Bactérias: o controle gênico tem como consequência o
ajuste metabólico da célula para que essa se adapte a
alterações nutricionais do meio.
• O controle gênico é feito por fatores de transcrição.
Promotor em genes bacterianos
Operator: elemento de regulação ao qual se liga o regulador do operon
Figure 7-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
No operador pode se ligar um regulador
helix-turn-helix
Figure 7-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Um regulador pode funcionar
como ativador em um promotor
e como inbidor em outro.
Operator mais próximo do
promotor em 2 pb
Figure 7-38 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Jacques-Monod
Francois Jacob
Estudo do
Lac Operon
Figure 7-39 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
• O controle da transcrição em eucariotos é bastante mais complexa
No promotor são
integrados todos os inputs
regulatórios do gene
PROMOTORES DE EUCARIOTOS
Lenhard B, Sandelin A, Carninci P
Nature Rev 13:233,2012
Tipo I
Promotores com TATA-box têm sítio de início de transcrição
bem definido. Correspondem a 10-12% dos genes, são
genes regulados e expressos em tecidos bem diferenciados
Fatores gerais de transcrição e Pol II
Fatores específicos de transcrição (em CRM)
• Dependem principalmente de módulos regulatórios cis (CRM) para sua regulação
• Sítio de início de transcrição coberto por nucleossomos
• Distribuição adjacente de nucleossomos sem padrão definido
Lenhard B, Sandelin A, Carninci P
Nature Rev 13:233,2012
Tipo II
Ilhas CpG parecem ser o promotor “default”em mamíferos
CpG -
início de transcrição em pontos variáveis
Promotores com ilhas CpG pequenas
Promotores com início de transcrição disperso
Sem TATA-box
Genes de expressão constitutiva (79-88% dos genes)- housekeeping
Promotores ricos em sequências consensuais para Sp1
• Core promoter desprovido de nucleossomos
• Região imediatamente à montante, onde também pode
iniciar-se a transcrição, desprovida de nucleossomos
• Possuem poucos “enhancers” próximos ao core-promotor
Lenhard B, Sandelin A, Carninci P
Nature Rev 13:233,2012
Uma região livre de nucleossomos (NFR) próxima ao sítio de início de
transcrição (TSS) é uma característica comum dos promotores tipo II/III
(Transcription Start Site)
Venters BJ & Pugh BF. 2009
Tipo III
CpG grandes, estendendo-se pelo gene
• Regulados durante o desenvolvimento
Genes ativos durante o desenvolvimento
•
Regulados por vários enhancers localizados a distâncias variáveis do TSS
(distantes até em megabases)
•
Região livre de nucleossomos no TSS
Lenhard B, Sandelin A, Carninci P
Nature Rev 13:233,2012
Lenhard B, Sandelin A, Carninci P
Nature Rev 13:233,2012
Genes relacionados ao
desenvolvimento, quando inativos
estão próximas à lâmina nuclear. Ao
serem ativados, movem-se no núcleo.
PROMOTORES TCT
(com polipiridimidinas)
CpG overlapping
Promotores de genes de proteínas altamente expressas envolvidas
com tradução do mRNA:
• proteínas ribossomais
• proteínas de início e alongamento de tradução
Elementos essenciais na regulação da taxa de transcrição dos genes
em eucariotos:
 Fatores de transcrição específicos para certas sequências
 Organização dos nucleossomos
 Remodelagem da cromatina acoplada à montagem dos fatores gerais
de transcrição
 Estados de fosforilação da cauda C-terminal (CTD – C Terminal
Domain) da RNA polimerase II (Pol II) associados a modificações na
cromatina
Fatores de transcrição que se ligam a sequências específicas (enhancers)
MEDIATOR
TFIID
TBP
Enhancers:
Elementos no DNA que ativam a transcrição independente de direção,
localização e distância em relação ao promotor do gene.
Regulador sequência
específicos
Complexos remodeladores de cromatina:
Remodelam nucleossomos com gasto de ATP
Não possuem especificidade, devem ser recrutados pelos fatores seq-específicos
Por força mecânica deslocam o octâmero de histonas ou o remove
Deslizamento (sliding)
Quatro famílias de remodeladores de cromatina:
• SWI/SNF (SWItch Sucrose Non-Fermentable)
•ISWI (Imitation SWItch)
• CHD (Chromodomain-Helicase DNA-biding protein)
• INO80/SWR1 (INOsitol requiring 80/ SWI/SNF Related protein 1)
Bromodomínio
(lisinas acetiladas)
Cromodomínio
(lisinas metiladas)
REMODELADORES DE CROMATINA
• Família SWI/SNF: ativadores de transcrição
• Remoção de histonas ou do octâmero inteiro
• Importantes para remoção de nucleossomos junto aos promotores
• Remodelagem de nucleossomos em genes que são rapidamente ativados
• Presentes no promotor e no corpo dos genes ativos
• SWI/SNF, RSC, parte dos complexos de acetilação SAGA e p300
ATPase
Bromodomínio
Bromodomínio: liga-se a lisinas metiladas
REMODELADORES DA CROMATINA
• ISWI
ATPase
SANT SLIDE
• Implicados no alongamento do transcrito
• Observados no corpo dos genes altamente transcritos
• Trocam histonas dos nucleossomos
• Propicial deslizamento de nucleossomos
REMODELADORES DA CROMATINA
• CHD
• Colocalizam-se com RNA Pol II
• Participam nos passos iniciais do alongamento do transcrito
• Propiciam o deslizamento de nucleossomos
Chromodomínio
ATPase
Domínio de
ligação ao DNA
Complexo SAGA tem como um de seus componentes Chd1
CHD1 interage com chaperona de histonas (FACTS – facilitates chromatin transcription)
CHD1 interage dom DSIF
CHD1 interage com H3K4me3
Associado a transcrição: tem atividade de acetilase de histonas, de remodelador de
cromatina, reconhecimento H3K4me3 e deubiquitinação
REMODELADORES DE CROMATINA
• INO80/SWR1
ATPase
• Atuam no alongamento da transcrição realizando troca de histonas
SWR1
H2A
INO80
H2A.Z
(Remodel the Structure of Chromatin)
Ativação
Substituição das histonas
H2A por H2A.Z
Nucleossomo removido
Variantes de Histonas
H3
H2A
Chaperonas na substituição de histonas
Chaperonas de histonas:
• Proteínas com forte afinidade por regiões específicas na superfície de H2A:H2B ou de H3:H4
• Propiciam a desmontagem do complexo
• Não dependem de ATP
Chaperonas que facilitam a transcrição:
• Chaperonas de H2A:H2B  Nap1 (Nucleosome assembly protein 1)
FACT (FACilitates chromatin Transcription)
• Nap1 interage com remodeladores de cromatina (Chd1, RSC) e facilita a desmontagem dos
dímeros H2A:H2B
• Nap1 interage com nucleossomos com H3K14Ac desmontando-os
• FACT segue a Pol II durante o alongamento e interage com outros fatores de alongamento
• Chaperonas de H3:H4
• Asf1 (antisilence factor 1)
• Spt6 (Supressor of Ty homolog 6)
• Ambos facilitam o alongamento da transcrição
• Asf1 facilita a remoção e a deposição de H3 no promotor e no corpo do gene
• Ast1 se associa com a histona acetilase que acetila H3K56Ac, que facilita a troca de H3 e H4
• Spt6 facilita a reincorporação de H3 nos nucleossomos após a passagem da Pol II
• Chaperona de H2A.Z
• Chz1 (levedura; parte do complexo de remodelagem Swr1)
• Chaperonas de H3.3
• HIRA (HIstone Regulator A protein  interage com o remodelador Chd1
• Daxx (Death domain associated protein)
Ativação da transcrição por tipos de histonas
• O complexo remodelador Swr1 troca os dímeros H2A:H2B para formar
nucleossomos com o dímero H2A.Z:H2B na extremidade 5’ dos genes
• As chaperonas HIRA e Daxx troca H3 por H3.3 nos nucleossomos próximos ao
promotor na extremidade 5’ do gene
• A duas substituições, H2A.Z e H3.3, torna os nucleossomos mais instáveis,
facilitando a remoção dos mesmos do promotor
Elementos essenciais na regulação da taxa de transcrição dos genes
em eucariotos:
 Organização dos nucleossomos
 Remodelagem da cromatina acoplada à montagem dos fatores gerais
de transcrição
 Fatores de transcrição específicos para certas sequências
 Estados de fosforilação da cauda C-terminal (CTD – C Terminal
Domain) da RNA polimerase II (Pol II) associados a modificações na
cromatina
Os reguladores sequência-específicos orquestram múltiplos
aspectos da transcrição pelos seguintes mecanismos:
1 - Recrutamento de remodeladores da cromatina
2 - Recrutamento de complexos modificadores da cromatina
3 - Recrutamento dos fatores gerais de transcrição
4 - Recrutamento da RNA Pol II via complexo Mediator
Modificações pós-tracicionais nas caudas das histonas são essenciais na
regulação da taxa de transcrição
Modificações em lisinas (Lys – K)
Modificações pós-transcricionais em histonas que ativam a transcrição
• Alteração direta da estrutura da cromatina
• Acetilação :
• A acetilação neutraliza cargas positivas das lisinas, reduzindo a força de interação
entre DNA e histona
• Acelitação das caudas de H2A e H2B reduz a interação do DNA com as díades
• Acetilação das caudas de H3 e H4 impede formação de estruturas de ordem
superior (a cauda de H4 usualmente faz a conexão entre nucleossomos vizinhos)
• Ex: H4K16Ac Aumentado em genes do cromossomo X para cpmesenção de
dosagem
• Recrutamento de complexos remodeladores da cromatina devido a marcas nas
histonas
• Histona H3 acetilada interage com bromodomínios presentes em subunidades dos
complexos remodeladores SWI/SNF e RSC
• H3K4me3 recruta Chd1, uma proteína com cromodomínio, para a extremidade 5’ de
genes ativos
• H3K4me3 + H4K16Ac recruta a subunidade com domínio PHD, BPTF, do complexo
ISWI
• H3K36me3 recruta histonas-deacetilases com cromodomínio para o corpo do gene,
necessárias para a remontagem dos nucleossomos após a passagem da Pol II e para
inibir sítios de início de transcrição no corpo do gene.
“PARylation” como ativador da transcrição
• PARP – Poly-(ADP Ribose) Polymerase
• Usa NAD+ para adicionar ADP-riboses em proteínas
• Estruralmente similar a ácido nucléico, mas dois grupos fosfato com carga negativa
• Pode adicionar até ~ 200 unidades de DAP-ribose linearmente ou com ramificações
• Proteínas usualmente modificadas: proteínas de reparo do DNA, fatores de transcrição e histonas
• Induzem forte relaxamento da cromatina e depleção de nucleossomos
• Marcas de histonas que podem ativar PARP:
• Fosforilação C-terminal de H2A
• H2AK5Ac
Fatores de transcrição que se ligam a sequências específicas (enhancers)
MEDIATOR
TFIID
TBP
Enhancers:
Elementos no DNA que ativam a transcrição independente de direção,
localização e distância em relação ao promotor do gene.
Enhancers modulam a transcrição por:
• Recrutar enzimas modificadoras de histonas
• Recrutar complexos remodeladores de cromatina dependentes de ATP
• Recrutar proteínas que substituem histonas
• Facilitar o recrutamento da RNA Pol II
• Afrouxamento da cromatina
• Maior acessibilidade a outras proteínas regulatórias
• Formação do PIC
• Facilitação do início da transcrição e do alongamento
A especificidade que determina a diferenciação celular:
Quais enhancers irão participar da regulação?
• Informações epigenéticas nos enhancers,adicionadas antes da ativação do gene,
permitem a seleção dos enhancers a serem utilizados a cada momento.
• Quais moléculas regulam a deposição de marcas epigenéticas em enhancers
específicos durante o desenvolvimento e diferenciação celular?
Fatores que se ligam a DNA
Sequências específicas do DNA
Estado de metilação do DNA
As marcas H3K4me1/2 e H3.3/H2AZ
nos enhancers (além de outras menos conservadas)
resultam em afrouxamento da cromatina e depleção de
nucleossomos no local, com consequente ativação rápida
do gene via recrutamento eficiente de fatores de
transcrição e de complexos remodeladores da cromatina
Chin-Tong Ong & Victor G. Corces
EMBO Reports 13(5):423, 2012
Fatores de transcrição chaves que participam no processo de diferenciação:
• Células Tronco Embrionárias Humanas: hESC
• Para manter os estado pluripotente: Oct4, Sox2 e Nanog
Inibe
Diferenciação neural ectodérmica
Sox2
Oct4
Ativa
Diferenciação mesodérmica
Sinais de diferenciação modulam
contínua e assimetricamente os
níveis de Oct4 e Sox2, alterando
seus padrões de ligação no genoma
e as decisões quanto ao destino celular
Marcação de enhacers para GR (Glucocorticoid receptor): GRE
Grau de metilação do DNA e fatores específicos
Chin-Tong Ong & Victor G. Corces
EMBO Reports 13(5):423, 2012
Células tronco
embrionárias
p300: histona
acetil transferase
(HAT)
PU.1 – Fator de diferenciação de
células da linhagem hematopoiética
Oct4
LSD1: (histona
demetilase)
PU.1 modifica o enhacer com marcas de ativação
Chin-Tong Ong & Victor G. Corces
EMBO Reports 13(5):423, 2012
A disponibilidade dos enhancers varia com o tipo de célula
FoxA1 liga-se a seu enhancer marcado com H3K4me1/2
Mama: FoxA1 recruta ER
Próstata: FoxA1 recruta AR
Chin-Tong Ong & Victor G. Corces
EMBO Reports 13(5):423, 2012
A integração dos sinais provenientes dos enhancers é feita pelo complexo co-ativador
MEDIATOR (Mediador)
• Por meio do MEDIATOR, um ativador pode influenciar no efeito do outro
• Presente desde leveduras a mamíferos, o MEDIATOR é complexo multiprotéico com
mais de 1 MDa
• O complexo possui 4 domínios: cabeça (head), cauda média (mid tail) e
dois domínios cinases
• Adquire uma configuração estendida ao contato com RNA Pol II
• Elevada flexibilidade conformacional
• Duas formas:
• Grande (TRAP ou ARC-L) com com o subdomínio Cdk8 (MED12,MED13, ciclina C e Cdk8)
• Pequena, sem Cdk8
MEDIATOR: um fator geral de transcrição
• Localizado em regiões intergênicas de genes ativos e inativos e em
regiões codificantes de muitos genes
• Associado a enhancers
• Recruta Pol II e propicia a formação do PIC (Pré-Inciation Complex)
• Domínio head – sítio multipartite de interação com TBP (TATA Binding
Protein)
Mediator tem 26 subunidades
MED1 a MED26
• MEDIATOR tem mais ações
além de recrutar Pol II:
• Permite a interação de
fatores de transcrição
ligados a enhancers com os
fatores gerais de transcrição
Borggrefe T & Yue X. Seminars in Cell and
Developmental Biology. 22:759-768, 2011
1
Um exemplo de
sequência de eventos
na ativação de um gene
Promotor do gene
interferon humano
2
2
3
3
Acetyl
transferase
4
4
SWI/SNF
5
TFIID
Primeiro fator geral
de transcrição a se
ligar no promotor.
Faz parte do
complexo TBP
Montagem dos fatores gerais de transcrição
• O mediador é recrutado precomente na montagem do PIC
• Mediador recruta a acetilase p-300 (subunidade de SAGA)
• p-300 acetila todos os alvos e de dissocia do promotor
• A montagem do PIC continua
Fatores gerais de transcrição:
TFIID (com TATA biding protein – TBP e TAFs),
TFII A, - B, -D, -E, -F e –H
Mediator
SAGA
TF
Ac
Ac
A
TFIID
TBP
B
F
Ac
Ac
E
PIC = Pré-Iniciation Complex
Complexo remodelador
• TFIIB e TFIIF são necessários para o recrutamento da RNA Pol II
• TFIIE junta-se após Pol II
• TFIIE recruta TFIIH e modula sua atividade de helicase e cinase
NC2
Mot1
Mediator
TF
TF
Ac
TFIID
TBP
Pol II
B
F
Ac
E
H
PIC pronto para dar a largada
CTD
Em células tronco embrionárias, > 55% dos genes silenciosos
têm RNA Pol II no promotor (Poised or stalling Pol II )
• Após transcrever os primeiros 30-50 nts iniciais, Pol II faz uma pausa
• DSIF e NELF inibem a progressão
A pausa é essencial para a montagem do complexo de alongamento completo
P-Ser5
Ac
Ac
DSIF
H
Transcrito inicial
NELF
Pol II
Ac
Ac
DSIF: DRB Sensitivity Inducing Factor
NELF: Negative regulator factor
O complexo NELF/DSIF inibe a transcrição depois
que o transcrito já atingiu ~30 nts
BRCA-1
DSIF
A
ER-a
B
E
C/D
AP-1
NELF: subunidades A, B, C/D e E
NELF recruta fatores reguladores da transcrição
A pausa induzida por NELF e DSIF parece fundamental para
a montagem de todo o complexo de alongamento produtivo
YSPTSPS
YSPTSPS
YSPTSPS
Pol II
CTD com 52 repetições YSPTSPS
2
P
YSPTSPS
5
P
YSPTSPS
YSPTSPS
Pol II
Sub-unidade cinase (Kin 28) do TFIIH fosforila CTD em Ser5 e a polimerase sai do promotor
mRNA
P-Ser5
PAF
SAGA
TF
Ac
TBP
Ac
B
Rad6
TFIID
F E
Fatores Gerais de
Transcrição são
deixados para trás
Fatores de
alongamento
Bre1
COMPASS
H
Pol II
Complexo PAF conecta
Ser5-P a uma rede de
modificdores de histonas
YSPTSPS
YSPTSPS
YSPTSPS
Pol II
Proteínas envolvidas com: modificações em histonas, alongamento,
término e processamento do RNA
Os complexos ligados à Pol II CTD vão sendo trocados, de acordo com o estado
de fosforilação do CTD
Pol II CTD conecta-se a escritores, leitores e apagadores do código de histonas
Ssu72 fosfatase
P
YSPTSPS
P
Cdk1
P-TEFb
P
YSPTSPS
P
Positive-elongation factor b
P
YSPTSPS
Pol II
Mecanismos epigenéticos
• Metilação do DNA
• Modificações de Histonas
DNA metiltransferases: DNMT1 - DNMT3a - DNMT3b
Metilação do DNA permite a herança do padrão de metilação por várias gerações
Herança epigenética
Células diferenciadas:
• Metilação de citosinas ocorre quase que exclusivamente em dinucleotídoes CpG
• Ilhas CpG nas regiões promotoras de genes ativos não estão metiladas
• Ilhas CpG metiladas ocorrem mais em regiões intragênicas ou intergênicas
• Metilação CpG ocorre em promotores alternativos e em promotores de genes inativos
• O Padrão de metilação se altera em certas doenças: cancer  genoma hipometilado
Células tronco:
• 25% das 5mC não estão em contexto CG
• Metilação mais frequente no corpo dos genes e próximo ao sítio de início de transcrição
• Com a diferenciação celular, esse padrão desaparece
• Padrão de modificações em histonas também é herdado, contribuindo para a
manutenção do estado da cromatina em células diferenciadas
Mecanismos que produzem formas epigenéticas de herança num organismo
Herança epigenética é perdida na ocasião da formação de células germinativas
DNA metiltransferases são
direcionadas para o DNA pelas
modificações em histonas:
• H3K9m e H3K27m
• H3K9 atrai HP1
• HP1 recruta DNMT
• HP1 recruta HMT garantindo
a marca de metilação H3K9
na fita nova
Andrew P. Feinberg & Benjamin Tycko 2004
Fêmea
Alelo
silenciado(imprint
ed)
do gene A
Alelo expresso
do gene A
Ambos os pais expressam
O Mesmo alelo do gene A
Macho
Cromossomo
herdado dos pais
Célula somática
Célula somática
Nas células germinativas o imprinting é removido
Meiose
Imprinting é restabelecido
de forma sexo-específica
A prole irá diferir quanto ao alelo do gene A que é expresso
Como identificar “Transcription Factor Binding Sites”- TFBS?
Ensaios bioquímicos:
• DNA footprint
• Eletroforetic mobility assay
• Capture of transcription-factor-bound sequences
DNA footprint
Figure 7-27a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Como identificar “Transcription Factor Binding Sites”- TFBS –
ocupados “in vivo"?
No genoma humano, de cada 500 TFBS para um dado fator, apenas 1 é
ocupado.
Ex:
GATA-biding factor 1 (GATA1):
8 milhões no genoma; 15.000 ocupados em células eritróides
DNA precipitado com a cromatina pode ser identificado
por hibridização de arrays ou sequenciado
Imunoprecipitaçãoda cromatina para identificação de modificações em histonas
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Immunoprecipitação de histonas +
DNA crosslinked
ChIP-Chip: DNA ligado a histonas precipitadas é
identificado por hibridização de microarrays
ChIP e sequenciamento (Next Generation Sequencing)
ChIP-Seq
Genoma de mamíferos: ~ 1.000 TF
As sequências de reconhecimento
são curtas e variáveis
Enhancers em geral têm mais de
um sítio de ligação para TFs: “cisregulatory module”
Podem estar próximos ao promotor
ou tão distantes quanto 1 Mpb
CRM: Cis Regulatory Module
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012
CTCF é a proteína que se liga aos “insulators” impedindo a ação
de "enhancers" sobre determinados promotores
Impedem também a propagação da heterocromatina
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012
Chip-Seq para 4 fatores de transcrição (TF) em um segmento
de DNA. Nem todos os sítios (TFBS) estarão ocupados
Quantificação das sequencias de DNA imunoprecipitadas com
o anticorpo específico para o fator de transcrição.
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012
Comparação das sequências: região codificante conservada
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012
Avaliação funcional
Transfecção
Cultivo das células
Inserção da sequência contendo o
suposto enhancer em vetor de
Lise das células e medida da
expressão no qual o gene repórter é
atividade da Luciferase
controlado por um promotor fraco
Atividade de Luciferase em relação à atividade basal
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012
A avaliação funcional pode ser feita no animal inteiro
Identificar os tecidos que podem ativar o enhancer
Identificar a fase do desenvolvimento em que é ativado
Hardison RC & Taylor J. Nature Rev 13:469, 2012