GLEICE CRISTINA DOS SANTOS
PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÕES NAS REGIÕES AZFa, AZFb e
AZFc DO CROMOSSOMO Y EM INDIVÍDUOS COM
OLIGOZOOSPERMIA OU AZOOSPERMIA EM MATO GROSSO
Orientador: Dr. Sebastião Freitas de Medeiros
Co-Orientador: Dr. Marcial Francis Galera
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO – REPRODUÇÃO HUMANA E CLIMATÉRIO
CUIABÁ-MT
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO – REPRODUÇÃO HUMANA
PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÃO NAS REGIÕES AZFa, AZFb e
AZFc DO CROMOSSOMO Y EM INDIVÍDUOS COM
OLIGOZOOSPERMIA OU AZOOSPERMIA EM MATO GROSSO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde, como prérequisito parcial para obtenção do Título de
Mestre em Ciências da Saúde – Área de
Concentração Reprodução Humana e Climatério
e área de atuação Reprodução Humana.
GLEICE CRISTINA DOS SANTOS
Cuiabá – MT
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO – REPRODUÇÃO HUMANA
Diretor da Faculdade de Ciências Médicas
Prof Dr Antônio José de Amorim
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde
Prof Dr Amílcar Sabino Damazo
CUIABÁ-MT
2011
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
S237p
Santos, Gleice Cristina dos.
PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÕES NAS REGIÕES AZFa, AZFb e AZFc
DO CROMOSSOMO Y EM INDIVÍDUOS COM OLIGOZOOSPERMIA OU
AZOOSPERMIA EM MATO GROSSO / Gleice Cristina dos Santos. -- 2011
xxi, 59 f. ; 30 cm.
Orientadora: Sebastião Freitas de Medeiros.
Co-orientadora: Marcial Francis Galera.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de
Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Microdeleção. 2. Azoospermia. 3. Infertilidade. 4. Oligozoospermia. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
iv
O presente estudo foi desenvolvido na Unidade de Genética e Biologia Molecular
UNIC/HGU em parceria com INTRO – Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e
Menopausa. Recebeu apoio das seguintes instituições:
 Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas.
 Universidade de Cuiabá, Faculdade de Medicina.
 INTRO – Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa.
GLEICE CRISTINA DOS SANTOS
PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÃO NAS REGIÕES AZFa, AZFb e
AZFc DO CROMOSSOMO Y EM INDIVÍDUOS COM
OLIGOZOOSPERMIA OU AZOOSPERMIA EM MATO GROSSO
Presidente da Banca
Dr. Sebastião Freitas de Medeiros
BANCA EXAMINADORA
Profº. Dr. Marcial Francis Galera
Profª. Dra. Bianca Borsatto Galera
vi
MENSAGEM PESSOAL
“Não existe crescimento sem mudança, nem crescimento sem renúncia, sem
dor.
Há coisas que só compreendemos na volta....”
vii
DEDICATÓRIA
À minha mãe Joana Leia, por sempre acreditar em mim, pelas orações e carinho
incondicional, por me ensinar qual o caminho em que devo andar.
Ao meu marido Gilberto, pelo total apoio e compreensão, por ser o meu “porto
seguro”, por me dar sempre muito mais que eu poderia desejar em oração.
Aos meus irmãos Wilson e Afonso pelo apoio nessa etapa importante da minha vida.
À minha sobrinha Adriana, pelo carinho de amiga, apoio de irmã, obrigada pelo
incentivo.
E por fim ao meu filho Lucas, que me ensinou o significado do amor verdadeiro e
sublime, a sua existência me da forças para superar os obstáculos e continuar
“SEMPRE”, nós dois sabemos a importância que temos um para o outro.
É na família que se mede o verdadeiro sucesso de uma pessoa, a minha família é o
meu maior patrimônio!
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar comigo em todos os momentos me fortalecendo e restaurando.
Ao Profº Dr. Sebastião Freitas de Medeiros, agradeço por toda calma e serenidade
que teve para me orientar, o senhor é para mim exemplo de equilíbrio. Obrigada
pelo incentivo, pelos conhecimentos compartilhados, foi um privilégio ter sido sua
orientanda.
Ao meu co-orientador Profº Dr. Marcial Francis Galera, por ter sonhado esse projeto
e pela confiança em dividir esse sonho comigo, pelo TOTAL apoio, sem a sua
colaboração não seria possível a realização deste trabalho.
À Profª Dra. Bianca Borsatto Galera, pelos seus conhecimentos, pelo apoio,
confiança, e incentivo que fizeram desse período algo que poderei me orgulhar em
ter trabalhado ao lado de pessoa com tamanho conhecimento.
À Profª Dra. Claudinéia de Araújo, exemplo de profissional, obrigada pelas noites
despendidas durante a padronização da técnica. Em muitos momentos difíceis a sua
amizade e suas palavras de incentivo e orientação foram primordiais para que eu
pudesse continuar sempre. Obrigada por estar sempre ao meu lado amiga querida.
À Kelly Matos “Guima”, amiga de longa data, obrigada pela sua amizade, fidelidade
e acima de tudo pela sua sinceridade, sempre me dizendo o que eu precisava ouvir
afinal nossa amizade permite isso. Você dividiu comigo momentos de tristeza e
alegria, quero compartilhar essa realização contigo. Quero ressaltar aqui a
admiração e respeito que tenho por você.
Ao Max Fernando, que começou como estagiário de biologia e hoje colega de
profissão, que me acompanhou durante toda a pesquisa, colaborando grandemente
com o trabalho e tornando-se um grande amigo.
Ao Dr. Luiz, urologista da Clínica Intro, pela colaboração e encaminhamento de
pacientes.
ix
À Arlene, Fernando, Jaqueline, Sabrina, Dayane e toda equipe da Clínica Intro, pela
disponibilidade em colaborar com a realização desta pesquisa.
À Elizangela, do Laboratório Carlos Chagas, pela colaboração.
À Camila Konopatzki, professora de inglês e amiga, que gentilmente colaborou na
tradução do resumo desta pesquisa.
Aos amigos, Sebastião Crispim, Cristina Sedlacek, Pedro Paulo, Ana Cristina,
Norma, obrigada pelo apoio, incentivo e orações.
À Jaqueline Seviero e Liége Fernandes, amigas queridas e grandes incentivadoras.
Aos pacientes que participaram deste estudo, pela confiança e colaboração,
tornando essa pesquisa possível, muito obrigada. Vocês transformaram esse estudo
em uma oportunidade única na minha vida profissional e
Enfim, a todos que de alguma maneira me ajudaram e apoiaram na realização deste
sonho.
x
SUMÁRIO
Abreviaturas e Siglas
xiii
Equipamentos
xv
Lista de Tabelas
xvi
Lista de Figuras
xviii
I.Resumo
xx
II.Abstract
xxi
1
– INTRODUÇÃO
1
1.1- Anatomia e fisiologia do aparelho reprodutor masculino
2
1.2- Esterilidade por fator masculino
5
1.2.1 – Causas genéticas da infertilidade masculina
5
1.2.1.1 – Anomalias cromossômicas
6
1.2.1.1.1 – Síndrome de Klinefelter
7
1.2.1.1.2 – Síndrome 47,XYY
9
1.2.1.1.3 – Translocações recíprocas
10
1.2.1.1.4 – Translocações Robertsonianas
11
1.2.1.2 – Alterações gênicas
11
1.2.1.2.1 – Fibrose Cística
11
1.2.1.3 – Microdeleções do cromossomo Y
12
1.3 – Avaliação do fator masculino
15
1.3.1 – Análise seminal
15
1.3.2 – Dosagem hormonal
17
1.3.3 – Avaliação genética
17
1.3.3.1 – Cariótipo de banda G
18
1.3.3.2 – Microdeleção do cromossomo Y
18
2 – JUSTIFICATIVA
19
3 – OBJETIVOS
20
3.1 – Objetivo Geral
20
3.2 – Objetivos Específicos
20
4 - MATERIAL E MÉTODOS
21
4.1 - Tipo de Estudo
21
4.2. – Tamanho da amostra
21
xi
4.3 – Pacientes
21
4.4 – Critérios de inclusão
21
4.5 – Critérios de exclusão
22
4.6 – Coleta de sangue
22
4.7 – Avaliação e procedimentos iniciais
22
4.8 - Técnicas Citigenéticas
22
4.8.1 - Cultura de linfócitos
22
4.8.2 - Preparação Citológica
23
4.8.3 - Método de Coloração - Bandeamento G
23
4.8.4 – Análise Cromossômica
23
4.8.5 – Documentação
24
4.9 – Análise Molecular
24
4.9.1 - Extração de DNA
24
4.9.2 – Quantificação do DNA
25
4.9.3 – Reação em cadeia de polimerase (PCR)
25
4.9.4 – Detecção do DNA amplificado
27
4.9.5 – Documentação
28
4.10 - Considerações Éticas
28
4.11 – Análise Estatística
28
5 – RESULTADOS
29
5.1 – Análise Descritiva
29
5.2 – Análise Bivariada
32
5.2.1 – Associação entre os cariótipos dos pacientes e o grau de
32
comprometimento no número de espermatozóide
5.2.2 - Identificação do gene SRY, do marcador SY86 na região AZFa, do
33
marcador SY134 na região AZFb e do marcador SY254 na região AZFc
6 – DISCUSSÃO
35
7 – CONCLUSÃO
44
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
9 – ANEXOS
56
9.1 – Anexo 1 - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de
56
Cuiabá (CEP/UNIC)
10 - APÊNDICE
57
xii
10.1 – Apêndice 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
57
10.2 – Apêndice 2 - Questionário
58
xiii
ABREVIATURAS E SIGLAS
µL: microlitros
AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Azf: Fator para azoospermia
AZFa: Fator para azoospermia localizado na região a
AZFb: Fator para azoospermia localizado na região
AZFc: Fator para azoospermia localizado na região
CBAVD: Ausência congênita bilateral dos vasos deferentes
CEP/UNIC: Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Cuiabá
CFTR: Gene regulador da condutância transmembrana da fibrose cística
DAZ (Deleted in Azoospermi): Genes suprimido em azoospermia
DBY (Mortos-box Y human RNA helicase): Gene que se expressa no testículo
Del: Deleção
DNA (Deoxyribonucleic acid): Ácido desoxirribonucléico
EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid): Ácido etilenodiamino tetra-acético
FC: Fibrose cística
FIV: Fertilização in vitro
FSH: Hormônio Folículo Estimulante
GnRH: Hormônio Liberador de Gonadotrofinas
HERVs (Human Endogenous Retroviral): Retrovírus endógenos humanos
HGU: Hospital Geral Universitário de Cuiabá
HUJM: Hospital Universitário Júlio Muller
ICSI: Injeção intracitoplasmática de espermatozóides
KCl: Cloreto de potássio
LH: Hormônio Luteinizante
mg/mL: Miligramas por mililitros
MgCl2: Dicloreto de magnésio
NaCl: cloreto de sódio
ºC: graus Celsius
OMS: Organização Mundial de Saúde
p: Braço curto do cromossomo
p+: Adição de região no braço curto do cromossomo
pb: Pares de base
xiv
PCR (Polymerase Chain Reaction): Reação em cadeia de polimerase
q: Braço longo do cromossomo
qter: Da região terminal do braço longo do cromossomo
RBMY (RNA binding motif on the Y): Gene que codifica células germinativas
masculinas associada a espermatogênese
rpm: Rotação por minuto
RPMI 1640: Meio de cultivo celular
SCO I (Sertoli cell-only): Células de Sertoli
SDS: Dodecil sulfato de sódio
SGA: Impedimento espermatogênico
SK: Síndrome de Klinefelter
SPAG11
(Organization
and
Expression
in
Cattle):
Gene
antígeno
de
espermatozóides associado 11
SRY: Gene responsável pelo desenvolvimento testicular
STS (Sequence Tagged Sites): Seqüência conhecida do DNA
TBE: Tampão tris-borato – EDTA
TE: Tampão tris – EDTA
TM1: Solução de lavagem para extração de DNA
Tris-HCl: Sal de hidroximetil - aminometano
UFMT: Universidade Federal de Mato Grosso
USP9Y (ubiquitina-specific protease Peptidase específica ubiquitina 9, Y):
enzima que codifica gene USP9Y
xv
EQUIPAMENTOS
Agitador de Tubos - FANEM® mod. 251
Agitador Magnético - FANEM® mod. 258
Balança Digital - ACCULAB® V-400
Banho-Maria 37°C - FANEM® 102 R
Bomba a Vácuo - FISATON® MODELO 820
Capela de Fluxo laminar - TROX® DO BRASIL serie 1388
Centrífuga Baby l - FANEM®
Contador de Tempo - CIENCOR®
Estufa de Cultura - FANEM® mod. 502
Forno Microondas - BRASTEMP®
Freezer FE -
ELETROLUX®
Geladeira 330 Lts -
BRASTEMP®
Microscópio Óptico Binocular – ZEISS® AXIOSTAR
Medidor de PH (PH-Metro) - MICRONAL® B474
Pipetador Automático – PIPET-AID DRUMOND®
Sistema de Computação – WINDOW XP
Software CHROMU - CITOGEM®
Software Excel 2007 – banco de dados
Software L-PIX-STR – LOCCUS BIOTECNOLOGIA® - sistema de captura de
imagem
Software estatístico SPSS – programa para análise estatística
Termociclador TC – 400 - TECHNE®
Transluminador – BIO RAD®
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
16
Características do sêmen normal em humanos.
Tabela 2
26
Sequências dos STS (Sequence Tagged Sites – seqüência conhecida
do DNA) SRY, SY86, SY134, SY254 usados nas análises de biologia
molecular.
Tabela 3
27
Descrição dos parâmetros usados nos ciclos de amplificação gênica
da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Tabela 4
29
Características gerais dos pacientes com união estável incluídos no
estudo.
Tabela 5
30
Características sócio-econômicas dos pacientes incluídos no estudo.
Tabela 6
31
Aspectos clinico-epidemiológicos dos pacientes incluídos no estudo.
Tabela 7
31
Resultados da análise seminal básica dos pacientes incluídos no
estudo segundo a OMS 2010.
Tabela 8
32
Distribuição dos pacientes segundo o diagnóstico de oligozoospermia
ou azoospermia.
Tabela 9
32
xvii
Resultados das análises citogenética e biologia molecular.
Tabela 10
33
Cariótipo (normal e alterado) dos pacientes de acordo com as
características
espermatozóides.
seminais
referentes
à
concentração
dos
xviii
LISTA DE FIGURAS
3
Figura 1
Representação esquemática do sistema reprodutor masculino.
4
Figura 2
Desenho
mostrando
as
fases
da
espermatogênese
e
representação histológica de seus diferentes tipos celulares.
7
Figura 3
Ilustração da formação de gametas e zigotos não equilibrados.
8
Figura 4
Efeitos da não-disjunção meiótica e mitótica na origem da
síndrome de Klinefelter clássico e mosaico.
10
Figura 5
Recombinações cromossômicas possíveis nos gametas de
portadores de translocações recíprocas.
13
Figura 6
Ilustração do cromossomo Y em humanos e as regiões
envolvidas na fertilidade e infertilidade.
26
Figura 7
Ideograma do cromossomo Y.
33
Figura 7
Gel de eletroforese mostrando as análises das regiões AZFa,
AZFb e AZFc.No “poço” 12 é possivel observar deleção da
região AZFc. P: marcador usado como padrão, M2:controle
positivo
(homem
positivo+SRY+AZFb,
normal)+SRY+Azfa+AZFc,
F4:controle
M2:
controle
negativo
xix
(feminino)+SRY+AZFa+AZFc, F5:controle negativo+ ZRY+AZFb,
P1
(6,
8,10,12,14):
paciente+SRY+Azfa+AZFc,
(7,9,11,13,15): paciente+SRY+AZFb.P: paciente.
feitas duas reações de multiplex para cada amostra
P2
Nota: foram
xx
I. RESUMO
Objetivos: estabelecer a prevalência de alterações cromossômicas e
microdeleções do cromossomo Y em indivíduos com oligozoospermia ou
azoospermia no Estado de Mato Grosso. Material e métodos: foram
selecionados 95 pacientes. O período de estudo foi entre 14 de março de 2009 e
14 de junho de 2011. Um paciente foi excluído por não ter realizado
espermograma. Desta forma, a amostra foi estabelecida em 94 pacientes. A
metodologia utilizada para análise cromossômica foi baseada na técnica de
cultura de linfócitos, proposta por Moorhead et al (1960), e as amostras de DNA
foram extraidas utilizando o método descrito por Lahiri e Nurnberg (1991). A
investigação da microdeleção foi realizada por técnica de PCR. Resultados: Na
avaliação citogenética dos pacientes, cinco (5,4%) apresentaram cariótipo
alterado, um deles com oligozoospermia grave tinha cariótipo 46,XY,8p+. Outro
paciente com azoospermia tinha cariótipo 46,XY,t(7;1)(qter-p35). O terceiro com
oligozoospermia leve tinha cariótipo 46,XY,delY(q). Em adição, outros dois
pacientes azoospérmicos apresentaram cariótipo 47,XXY, compatível com a
síndrome de Klinefelter. Microdeleção do cromossomo Y foi detectada apenas na
região AZFc, em um paciente (1/94; 1,1%), com azoospérmia. Conclusão:
conclui-se que todos os pacientes que procurem tratamento para infertilidade
com uma baixa contagem espermática deveria ser submetidos à pesquisa de
microdeleções e análise citogenética. O diagnóstico correto permite ao médico
encaminhar o paciente para tratamento clínico mais adequado.
Palavra chave: Microdeleção, azoospermia, infertilidade e oligozoospermia.
xxi
II.ABSTRACT
Objectives: to establish the prevalence of chromossomal alterations and
microdeletions of the chromosome Y in individuals with oligozoospermia or
azoospermia in the Mato Grosso state. Material and methods: 95 patients were
selected.The study period was between March 14, 2009 and June 14, 2011. A
patient was excluded by not having fulfill a semen. This way, the sample was
established in 94 patients. The methodology used for chromosomal analysis was
based on the lymphocyte culture technique, proposed by Moorhead et al (1960), and
DNA samples were extracted using the method described by Lahiri and Nurnberg
(1991). The investigation of microdeletion was performed by PCR technique.
Results: In the cytogenetic evaluation of patients, five (5.4%) had altered karyotype,
one with severe oligozoospermia had karyotype 46,XY, 8p+. Another patient with
azoospermia
had
karyotype
46,XY,t(7;
1)(qter-p35).
The
third
had
mild
oligozoospermia with karyotype 46, XY,del(q). In addition, two other patients had
azoospermia karyotype 47, XXY, consistent with the Klinefelter syndrome. Y
chromosome microdeletion was detected only in the AZFc region in one patient (1 /
94, 1.1%) with azoospermia. Conclusion: We conclude that all patients seeking
treatment for infertility with low sperm count should be tested for analysis
microdeletions and cytogenetic. The correct diagnosis allows the physician to refer
the patient to most appropriate medical treatment and provide a more accurate
diagnosis of infertility.
Keyword: Microdeletion, azoospermia, oligozoospermia e infertility.
1
1 – INTRODUÇÃO
A definição de infertilidade adotada pela Organização Mundial de Saúde
(OMS)1 é a ausência de concepção após 24 meses de relações sexuais regulares e
desprotegidas
2,3.
Por outro lado, o Colégio Americano de Obstetrícia e Ginecologia
propõe como definição a incapacidade para conseguir uma gravidez clinicamente
reconhecida após um ano de tentativa por parte do casal 4. De acordo com a OMS, a
infertilidade primária implica em casal que mantenha relações sexuais regulares
desprotegidas e nunca tenha conseguido uma concepção1. A infertilidade secundária
refere-se ao casal que já conseguiu uma concepção, mas que posteriormente
tornou-se incapaz, considerando que mantêm relações sexuais regulares e
desprotegidas durante um período de dois anos2, 5,6. A infertilidade foi reconhecida
pela OMS como um problema de extrema relevância em Saúde Pública,
representando um fenômeno mundial que afeta entre 50 e 80 milhões de pessoas
em idade reprodutiva4. A diferença entre infertilidade e esterilidade baseia-se no fato
de que a esterilidade representa uma condição em que os recursos terapêuticos
atuais não proporcionam cura5, 6.
Numa revisão de estudos de prevalência verificou-se que, nos países mais
desenvolvidos, a prevalência de infertilidade após 12 meses de coito sem
contraceptivo variou entre 3,5% e 16,7% e, nos países menos desenvolvidos, entre
6,9% e 9,3%; média global de prevalência de 9%. No Brasil, a infertilidade acomete
cerca de 18% dos casais e um dos fatores mais comuns é a ocorrência de
processos infecciosos pélvicos, adquiridos por contato sexual, pós-parto ou pósabortamento em condições precárias4. A proporção de infertilidade primária é maior
nos países desenvolvidos do que nos países em desenvolvimento, devido,
sobretudo à idade mais avançada da mulher na primeira tentativa de concepção4. É
possível que a infertilidade secundária seja menos frequente nos países
desenvolvidos devido à maior acessibilidade aos cuidados de saúde, maior controle
das doenças sexualmente transmissíveis e melhores práticas de higiene,
principalmente no período pós-parto4.
Considerando a infertilidade como problema de saúde do casal, qualquer
investigação deve incluir necessariamente a avaliação dos fatores masculinos e
2
femininos. Esta investigação consiste na elaboração de um histórico prévio de
fertilidade, exame físico detalhado e testes laboratoriais complementares para
investigar possíveis disfunções orgânicas e funcionais nos dois cônjuges 7.
As
causas mais freqüentes da infertilidade feminina são as alterações cervicais (10%),
uterinas (<10%), tubárias (40%), hormonais ou ovulatórias (20%) e peritoneais (1015%). Recentemente, tem-se dado maior ênfase à saúde reprodutiva masculina,
visto que entre 30% a 50% dos casais a infertilidade envolve uma causa masculina8.
Fatores como idade, nível socioeconômico, atividade profissional, freqüência das
relações sexuais, utilização de métodos contraceptivos, qualidade da assistência à
saúde, condições ambientais e a exposição a potenciais substâncias tóxicas
(solventes orgânicos, plásticos, mercúrio, álcool, nicotina, cafeína, cocaína e
maconha) ou medicamentos devem ser consideradas9-15. Fatores genéticos,
obesidade, perda ou ganho excessivo de peso, perturbações alimentares, má
nutrição ou exercícios físicos excessivos podem também estar associados à
infertilidade16, 17.
O aparelho reprodutor masculino é constituído pelo pênis, uretra, testículos,
canais deferentes, túbulos seminíferos, túbulos retos, ductos ejaculatórios,
epidídimos e glândulas acessórias incluindo a próstata, glândulas bulbouretrais,
vesículas seminíferas (Figura 1)18,19. A função endócrina do testículo é regulada pelo
eixo hipotálamo-hipofisário através da interação do hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH) com a hipófise e desta com o testículo, fechando-se o
circuito endócrino com a produção de testosterona, inibina e espermatozóides20. As
gonadotrofinas, FSH - hormônio folículo estimulante e LH – hormônio luteinizante,
participam diretamente do controle endócrino da espermatogênese 21. Estas
gonadotrofinas são os principais reguladores endócrinos da espermatogênese. LH
estimula a célula de Leydig para a secreção de testosterona, que, por sua vez, age
nos receptores androgênios localizados no epitélio seminífero para controlar a
espermatogênese. O FSH estimula os receptores específicos nas células de Sertoli
estimulando a produção de inúmeros fatores nestas células. Os papéis da
testosterona e FSH no testículo têm sido extensivamente estudados, ainda que
relativamente pouco se saiba sobre o modo exato como estes hormônios agem
dentro da célula de Sertoli para estimular e manter a espermatogênese22, 23, assim,
3
embora FSH não seja essencial para a espermatogênese, é relevante para a
espermatogênese ser quantitativamente normal24-25.
Figura 1- Representação esquemática do sistema reprodutor masculino (Fonte: Moore KL et al,
200719).
A espermatogênese é definida como o processo de diferenciação e maturação
da espermatogônia (célula indiferenciada situada na porção basal dos túbulos
seminíferos) em espermatozóides maduros24. Os estágios da espermatogênese são
mostrados na figura 2. Os espermatozoides são formados nos túbulos seminíferos
dos testículos após ter sido atingida a maturidade sexual. Os túbulos são revestidos
de espermatogônias, que estão em estágios diferentes de diferenciação. Estas
células desenvolveram-se de células germinativas primordiais por uma longa série
de mitoses. O último tipo de célula na sequencia de desenvolvimento é o
espermatócito primário, que sofre meiose l para formar dois espermatócitos
secundários haploides. Os espermatócitos secundários rapidamente entram em
meiose ll, cada um formando duas espermátides, que se diferenciam sem outras
divisões em
espermatozoides.
espermatogônias
até
a
A
formação
espermatogênese, desde a
dos
espermatozoides,
espermiogênese, ocorre em aproximadamente dois meses 27.
origem
passando
das
pela
4
Figura 2 – Desenho mostrando as fases da espermatogênese e representação histológica de seus
diferentes tipos celulares (Fonte: Moore KL et al, 200719).
A espermatogênese ocorre em todos os tubos seminíferos, durante a vida do
homem, iniciando-se, em torno dos 13 anos em consequência do estímulo dos
hormônios gonadotróficos adeno-hipofisários e prosseguindo durante todo resto da
vida
28,29.
O desenvolvimento das células germinativas tem uma interação altamente
coordenada com a célula de Sertoli, pois elas podem comunicar-se diretamente
através de interações mediadas ligante-receptor ou fatores parácrinos. A produção e
secreção de muitas proteínas das células de Sertoli estão envolvidas no
desenvolvimento de células germinativas ocorrendo em cada fase de forma
dependente30, refletindo na capacidade da célula de Sertoli em se adaptar à
evolução das necessidades das células germinativas31.
5
1.2 – Esterilidade por fator masculino
Um homem anteriormente fértil pode se tornar infértil ou até mesmo estéril
devido a problemas ocorridos ao longo da vida. Além disso, o próprio
envelhecimento
provoca
alterações
que
geram
a
redução
na
produção
espermática32. Nos dias atuais, a procura do fator masculino na esterilidade
conjugal tem se tornado cada vez mais importante durante a investigação dos
casais inférteis
12,
visto que, isoladamente, representa cerca de 50% dos casos de
esterilidade conjugal
11,6.
As causas de esterilidade masculina sejam estas pré-
testiculares, testiculares ou pós-testiculares, devem ser investigadas. É importante
considerar que as causas pré-testiculares incluem disfunções hormonais como
hipogonadismo
(hipogonadotrópico),
hiperestrogenismo,
hiperandrogenismo,
hiperprolactinemia e excesso de glicocorticóides. Entre as testiculares, estão os
distúrbios genéticos, varicocele, distrofia miotônica, orquite, criptorquidia, uso de
drogas
(álcool,
tabaco),
oligozoospermia
idiopática,
insuficiência
testicular
idiopática, obesidade e anemia falciforme. As causas pós-testiculares incluem os
distúrbios do transporte e função dos espermatozóides2.
1.2.1 - Causas genéticas da infertilidade masculina
Nos últimos anos o conhecimento sobre a etiologia genética da infertilidade
tem ampliado graças aos avanços neste campo, pois diferentes anormalidades
genéticas têm sido identificadas. Os erros acontecem na replicação do material
genético, transcrição dos genes e alterações em todo o cromossomo 32. As
possibilidades de fatores genéticos devem ser avaliadas em todos os pacientes com
problemas de infertilidade, principalmente naqueles que serão submetidos a
programa de reprodução assistida33. A incidência de oligozoopermia grave (abaixo
de 5 milhões de espermatozóides/mL) e azoospermia é de aproximadamente 10 a
12% de toda a população masculina infértil. Os três fatores genéticos mais
frequentemente
relacionados
à
infertilidade
masculina
são
as
aberrações
cromossômicas, as mutações gênicas e as microdeleções do cromossomo Y.
Atualmente essas alterações, em conjunto, são responsáveis por cerca de 15% dos
casos de infertilidade masculina 34.
6
1.2.1.1- Anormalidades cromossômicas
As anormalidades cromossômicas podem ser numéricas ou estruturais e
envolver um ou mais cromossomos autossômicos, sexuais ou ambos. A maioria
destas anomalias são acontecimentos de novo, secundárias a mutações nas células
germinativas parentais, podendo igualmente ser herdadas com um padrão de
transmissão mendeliano35. Sabe-se que indivíduos portadores de anomalias
cromossômicas somáticas, numéricas ou estruturais, têm maior probabilidade de
infertilidade, abortamentos espontâneos ou de repetição e maior risco de filhos
portadores de deficiências graves33. A prevalência de anomalias cromossômicas em
homens inférteis é superior à da população geral, variando inversamente com a
contagem espermática. Pode estar presente em 19% dos homens com azoospermia
não obstrutiva36.
Nas últimas décadas, com o avanço tecnológico, foi possível realizar estudos
mais aprofundados e com isso prover uma melhor compreensão dos processos de
recombinação
durante
a
meiose37.
A
análise
de
espermatozoides
por
imunofluorescência em homens inférteis, em particular naqueles com azoospermia,
revelou uma elevada prevalência de erros no emparelhamento e na recombinação
dos cromossomos durante a meiose, com conseqüente formação de um número
significativo de espermatozoides aneuplóides38 (Figura 3). Atualmente as técnicas de
reprodução assistida permitem que muitos homens inférteis sejam pais. Porém é
importante a realização do estudo citogenético nos homens que pretendam recorrer
a estas técnicas, de forma a evitar a transmissão dos erros cromossômicos à
descendência33.
7
Figura 3 - Ilustração da formação de gametas e zigotos não equilibrados (Adaptado de Thompson et
al, 200239)
1.2.1.1.1 – Síndrome de Klinefelter
A Síndrome de Klinefelter (SK) é uma anormalidade cromossômica numérica
altamente prevalente em indivíduos do sexo masculino. Incide em cerca de 1 entre
500 a 1000 nativivos masculinos e em 1 entre 300 abortamentos espontâneos,
sendo que somente 40% dos conceptos afetados sobrevivem ao período fetal. A
prevalência é 5 a 20 vezes maior em pessoas com retardo mental. Não há
preferência por grupos étnicos específicos40. Os achados clínicos são variáveis, os
sinais
mais
azoospermia,
específicos
deficiência
encontrados
androgênica,
são
estatura
hipogonadismo,
elevada,
ginecomastia,
anormalidades
de
maturação física e disfunção cognitiva. O desenvolvimento na infância processa-se
normalmente, pois as manifestações iniciais tornam-se aparentes durante a
8
puberdade, fase
adequadamente41,
em
42.
que
a diferenciação
sexual secundária
não
ocorre
Muitos diagnósticos são firmados quando o paciente realiza
avaliação durante a investigação de esterilidade, uma vez que a SK é a síndrome
genética que mais ocasiona infertilidade masculina, sendo responsável por 3% de
todos os casos43. A variante em mosaico da SK é geralmente menos severa do que
a forma clássica, e os portadores podem apresentar testículos de tamanho normal e,
com menor frequência, ginecomastia e azoospermia43. O diagnóstico da SK é feito
quando o cariótipo revela a presença de um ou mais cromossomos X, sendo a forma
mais frequente 47,XXY. Os mecanismos de ocorrência são mostrados na figura 4.
Figura 4 - Efeitos da não-disjunção meiótica e mitótica na origem da síndrome de Klinefelter clássica
e mosaico (Fonte: Cruz, Joana Pereira da, 201044).
A alta prevalência de aneuploidia espermáticas em pacientes com SK pode
ser explicada por duas teorias: a primeira afirma que espermatogônias 47, XXY
prosseguem na meiose, resultando num aumento da incidência de hiperploidias38; a
9
segunda teoria baseia-se no fato de existirem vários mecanismos de controle da
meiose, que levam à perda do cromossomo X adicional em fases precoces da
espermatogênese40. Nesse caso, apenas as espermatogônias normais 46,XY
prosseguem na espermatogênese, num ambiente testicular desfavorável e propenso
a novos erros de segregação cromossômica, nomeadamente nos autossomos41.
1.2.1.1.2 – Síndrome 47,XYY
A Síndrome 47,XYY é a segunda aneuploidia de cromossomos sexuais mais
freqüentes40, ocorrendo entre 1/1000 e 4/1000 nascidos do sexo masculino42. É
consequência de uma não disjunção na meiose II paterna43.
Na avaliação
citogenética em espermatozoides de indivíduos com Síndrome 47, XYY, a literatura
relata uma frequência desta aneuploidia que varia entre 0,3 e 15%40. Entretanto,
estudo recente realizado em dois homens 47,XYY com oligozoospermia grave,
demonstrou uma taxa de aneuploidia de 37-38%, metade das quais, aneuploidia dos
cromossomos sexuais45. Observou-se também neste estudo que os indivíduos
47,XYY apresentavam proporções variáveis de células germinativas em mosaico
XY/XYY de forma inversamente proporcional à contagem espermática 45. A análise
de células germinativas XYY no estágio de paquíteno revelou diferentes
combinações possíveis para o emparelhamento dos cromossomos sexuais, sendo a
mais
prevalente
o
emparelhamento
bivalente
de
dois
cromossomos
Y,
permanecendo o cromossomo X isolado YY+X. Outras combinações possíveis
incluem XY+Y, X+Y+Y e as XYY. Ao contrário do que acontece com as células
YY+X que tendem a ser letais, verificou-se que as células XY+Y e as trivalentes XYY
progridem na espermatogênese, levando à produção de espermatozoides com
aneuploidia 24,XY e 24,YY. Por outro lado, tal como ocorre em indivíduos com SK,
foi relatado um aumento da prevalência de dissomias dos cromossomos 13 e 21,
assim como de nulissomias45.
10
1.2.1.1.3 – Translocações recíprocas
As translocações recíprocas são relativamente comuns e são encontradas em
cerca de 1 em 600 neonatos46. Estas translocações consistem na troca de material
genético entre os braços de dois cromossomos não-homólogos, resultando nas
alterações sequenciais do material genético, sem que seja alterada a quantidade de
material cromossômico39. É mais comum encontrar translocações balanceadas em
casais que já tiveram dois ou mais abortamentos espontâneos e em homens
inférteis do que na população em geral. Durante a meiose I, os cromossomos
translocados formam quadrivalentes com os respectivos homólogos normais; na
anáfase os cromossomos em geral se segregam desta configuração em um dentre
três modos, descritos como segregação alternada, adjacente-1 e adjacente-2. Na
segregação alternada formam-se espermatócitos cromossomicamente balanceados,
com cromossomos portadores da translocação ou com os homólogos normais. Na
segregação
adjacente
produzem-se
gametas
cromossomicamente
não-
balanceados, responsáveis pela geração de embriões portadores de monossomia ou
trissomia46 (Figura 5).
Figura 5 – Recombinações cromossômicas possíveis nos gametas de portadores de translocações
recíprocas (Adaptado de Cruz, Joana Pereira da, 201044).
11
1.2.1.1.4 – Translocações Robertsonianas
Este tipo de rearranjo envolve dois cromossomos acrocêntricos que se
fundem perto da região do centrômero com a perda dos braços curtos 46. No entanto,
uma vez que os braços curtos dos cromossomos acrocêntricos são constituídos
unicamente por genes NOR (nucleolar organizer genes), esta perda de material
cromossômico não se traduz em consequências fenotípicas para os seus
portadores46. A prevalência de translocações Robertsonianas na população
masculina infértil varia entre 0,8 e 0,95%, sendo nove a dez vezes superior à da
população em geral48. Durante a meiose I, os cromossomos emparelham-se de
forma trivalente, podendo segregar na forma alternada ou adjacente. Da segregação
alternada resultam espermatozoides normais e espermatozoides com aneuploidia
balanceados (com a translocação do progenitor). Da segregação adjacente resultam
gametas
não-balanceadas,
responsáveis
pela
formação
de
zigotos
com
monossomia ou trissomia para um dos cromossomas envolvidos45.
As
monossomias não são compatíveis com a vida e a maioria das concepções
trissômicas resultam em abortamento espontâneo45.
1.2.1.2 – Alterações gênicas
Um distúrbio monogênico é aquele determinado por um alelo específico num
único locus em um ou ambos os membros de um par de cromossomos. O alelo
variante que surgiu, em geral relativamente raro, substitui um alelo do tipo selvagem
normal em um ou ambos os cromossomos. Foi identificado um número considerável
de genes, com funções essenciais nas diferentes etapas da reprodução humana e,
quando ausentes ou mutados, dão origem a anomalias no sistema reprodutor
masculino48.
1.2.1.2.1 – Fibrose Cística
A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva, causada por
mutações no gene regulador da condutância transmembrana da fibrose cística
(CFTR), afetando a proteína CFTR correspondente. A FC pode ser causada por uma
serie de diferentes mutações, sendo a mais frequente, a deleção de um códon na
12
posição 508,
responsável por 70 a 90% dos casos, dependendo da região
geográfica49. Mais de 95% dos homens com FC são também inférteis, primeiramente
devido à ausência congênita bilateral dos vasos deferentes (CBAVD). A FC contribui
com 2% das causas de infertilidade masculina49. Entretanto, nem todos os homens
com CBAVD têm FC, isso parece fazer parte de uma má-formação do sistema
urogenital. Estas más-formações geralmente não estão associadas com FC, porém
o risco de CBAVD nos descendentes masculinos é desconhecido. CBAVD sem
mutação identificada no gene CFTR pode ser devido a mutações em outros genes
até agora não identificados50. Homens com CBAVD devem ser rastreados para
mutações no gene CFTR, entretanto, este rastreamento é muito complexo, já que
mais de 500 diferentes mutações têm sido detectadas em pacientes com FC. Apesar
das dificuldades técnicas usadas na análise dos três tipos mais frequentes de
mutações, pode-se afirmar que 95% dos casos de FC serão detectados49.
1.2.1.3 – Microdeleções do cromossomo Y
O cromossomo Y é essencial para determinação sexual masculina, formação
e manutenção de células germinativas, sendo seu braço curto o responsável pelo
desenvolvimento testicular e o braço longo responsável pelos fatores envolvidos na
espermatogênese51,52. A translocação do gene SRY com o cromossomo X explica os
casos de homens com 46,XX, indivíduos com fenótipo masculino, cariótipo 46,XX e
positivos para o gene SRY53. Isto resulta de uma recombinação que ocorre perto do
limite pseudoautossômico do gene SRY, de tal forma que este fica translocado no
cromossomo X. Aproximadamente 10% dos homens com cariótipo 46,XX não
apresentam SRY detectável. A maioria destes indivíduos tem genitália externa
ambígua, embora um fenótipo masculino completo possa ser observado. Estudos
indicam que pode haver desenvolvimento testicular mesmo na ausência do SRY54.
Microdeleções no braço longo deste cromossomo Y estão associadas com
falhas da espermatogênese e algumas outras deleções neste cromossomo parecem
estar associadas com a contagem reduzida de espermatozóides54. Há mais de três
décadas verificou-se que microdeleções no braço longo do cromossomo Y (Yq)
representam a causa genética molecular mais freqüente da infertilidade masculina,
traduzida por azoospermia não obstrutiva ou oligozoospermia grave53. As áreas do
13
braço longo do cromossomo Y, responsáveis pela espermatogênese, foram
denominadas de azoospermia ou fatores de infertilidade (AZF) e estão localizadas
no intervalo 5-6 da banda Yq1153. Esta região AZF está subdividida em 43
intervalos, explicando a existência de múltiplos genes nesse locus, todos
responsáveis por etapas diferentes da espermatogênse. De acordo com as
microdeleções encontradas nos pacientes masculinos inférteis, a região AZF foi
redesenhada nos seus intervalos, estando mapeada em três subregiões: AZFa na
parte proximal (intervalo D3-D6), AZFb na porção mediana (D13-D16) e AZFc na
região distal (D20-D22)54,55. Recentes estudos demonstraram microdeleções em
outra região, AZFd, localizada entre AZFb e AZFc55. Esta região estaria associada a
oligozoospermia
leve
e
anormalidades
importantes
na
morfologia
do
espermatozóide54.
Figura 6 - Ilustração do cromossomo Y em humanos e as regiões envolvidas na fertilidade e
infertilidade (Adaptado de Repping S et al 200256).
O gene DAZ (Deleted in Azoospermi), localizado na região AZFc, está
ausente em 10 a 15% de homens cromossomicamente normais e azoospermia não
obstrutiva ou oligozoopermia grave. A freqüência relativa de microdeleções
individuais é de 60, 5 e 16%, respectivamente para as regiões AZFc, AZFa e AZFb.
Deleções combinadas ocorrem em cerca de 15% dos casos 57 . Pelo fato das
deleções terem tendência para ocorrer entre grandes sequências repetidas
palindrômicas,
alguns
pesquisadores
propuseram
uma
nomenclatura
mais
14
apropriada, usando o nome das sequências repetidas terminais para os diferentes
tipos de deleções recorrentes55 (Figura 6).
Homens com infertilidade ligada ao cromossomo Y que apresentam
oligozoospermia ou azoospermia no ejaculado, mas com espermatozóides
recuperados de seus testículos56,
57
poderão gerar gravidez pela injeção
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). A presença de uma deleção não tem,
aparentemente, efeitos negativos sobre a fertilização ou a gravidez e não aumenta o
risco de defeitos congênitos em crianças concebidas por meio da tecnologia de
reprodução assistida68. As microdeleções no cromossomo Y resultam de processos
de recombinação homóloga entre sequências de DNA repetitivas que ocorrem
anormalmente dentro do mesmo braço longo 58. As 19 alterações estruturais do Y
decorrem da meiose paterna, mesmo sem história familiar prévia e constituem
mutações de novo54,
55,57.
Dentro de uma mesma família, a mesma deleção do
cromossomo Y poderá causar infertilidade em alguns homens e não em outros;
portanto, alguns homens férteis com deleção das regiões AZF podem ter gerado
filhos inférteis59.
Em gestações obtidas por ICSI, originadas de homens com infertilidade
causada pela deleção das regiões AZF, os descendentes do sexo masculino terão a
mesma deleção de seus pais. A presença de espermatozoides em homens com
microdeleções do cromossomo Y varia com o tipo de deleção. Fenótipos testiculares
associados à microdeleções na região AZFa são os mais graves e incluem um
padrão histológico contendo apenas células de Sertoli (Sertoli cell-only; SCO)60.
Fenótipos testiculares associados a microdeleções somente na região AZFc
variaram de azoospermia a oligozoospermia moderada, enquanto microdeleções na
AZFb
estão
frequentemente
associados
à
azoospermia.
Indivíduos
com
microdeleções na região AZFd manifestam a mais ampla gama de fenótipos
testiculares. Em pacientes azoospérmicos com deleção parcial ou completa da
região AZFc , espermatozóides podem ser encontrados nos testículos em 70% dos
casos. Em contra partida, é improvável que se encontrem espermatozóides em
homens azoospérmicos com deleções completas nas regiões AZFa ou AZFb61.
Grandes deleções envolvendo múltiplas regiões AZF geralmente apresentam
fenótipos testiculares semelhantes àqueles com deleções restritas à região AZFa 58.
15
Havendo alteração no espermograma, o cromossomo Y assume importância
central na fertilidade masculina e a pesquisa de microdeleções no seu braço longo
deve ser incluída no protocolo básico de investigação do homem infértil, juntamente
com o cariótipo convencional55,62. Com base nas informações moleculares sobre a
estrutura genômica do cromossomo Y63, a contribuição da primeira pesquisa
brasileira foi a seleção de um conjunto de seis marcadores estrategicamente
localizados entre sequências de repetições específicas para compor um teste
simples, capaz de identificar 95% das microdeleções descritas na literatura.
1.3 – Avaliação do fator masculino
Na avaliação do fator masculino, torna-se relevante a anamnese, exame físico
e exames complementares. Além dos exames complementares dosagens
hormonais, imagens do genital e análise seminal são essenciais48.
1.3.1 – Análise seminal
A análise seminal é geralmente o primeiro e o mais comum teste realizado na
investigação da infertilidade masculina64,
65,.
Este exame tem como base os
parâmetros seminais estabelecidos pela OMS66. Apesar disso alguns autores
defendem a ideia de que a análise do sêmen fornece informações prognósticas
limitadas sobre a fertilidade67,
68,69.
A análise ideal da fertilidade masculina deverá
fornecer dados concretos a respeito da avaliação funcional do espermatozoide,
assim como a concentração, motilidade e morfologia58. Os critérios de normalidade
para avaliação seminal, de acordo com a OMS, baseiam-se na experiência clínica
de muitos investigadores que estudaram populações de homens férteis saudáveis.
Abaixo seguem os valores de referência de acordo com a OMS:
16
Tabela 1: Características do sêmen normal em humanos
Parâmetros
Valores de Referência
Volume
≥ 1,5 mL
pH
> 7,2
Concentração
≥ 15 milhões/mL
Motilidade
≥ 40% com motilidade A + B ou ≥ 32%
exibindo progressão rápida (grau A)
após 60 minutos da ejaculação
Vitalidade
≥ 58% vivos
Morfologia
≥ 4% normais
Viscosidade
< 3 (escala 0-4)
Leucócitos
< 1 x 106/ mL
Aglutinação espermática
< 2 (escala 0-3)
(Fonte: OMS. 2010)
O período de abstinência para realização da análise seminal deve ser entre
dois a sete dias. Para uma avaliação mais fidedigna e real da espermatogênese, são
recomendáveis no mínimo duas coletas de sêmen com intervalo de tempo entre as
coletas de aproximadamente quinze dias. Se os resultados provenientes do
espermograma diferirem muito entre si, uma nova análise seminal deverá ser
realizada. Para otimizar os resultados, recomenda-se que a primeira análise seja
básica e, de acordo com os resultados iniciais, solicitar exames complementares
como testes de função espermática e processamento seminal prognóstico na
segunda coleta. Por razões de padronização, e para que os resultados obtidos em
locais diferentes sejam comparáveis, os testes seminais devem ser realizados de
acordo com diretrizes. A concentração deve ser igual ou superior a 15 milhões. A
vitalidade deve apresentar uma porcentagem de espermatozoides vivos de até 58%.
A motilidade analisa 4 tipos de movimentos divididos em 4 grupos nomeados A, B, C
e D. O Grupo A (progressão linear rápida) é considerado o melhor por ter a maior
chance de fertilizar o óvulo. O Grupo B (progressão linear lenta) é também
considerado bom e deve estar em uma proporção que somado ao tipo A, totalize
32% segundo parâmetros atuais. O grupo C (motilidade não progressiva) tem menor
chance de fertilização, mas, ainda assim, pode fertilizar. São considerados
“espermatozoides moveis totais” os somatórios dos grupos A, B e C, sendo que esta
17
proporção deve ser maior ou igual a 40%. O grupo D é totalmente imóvel e incapaz
de fertilizar o óvulo. A morfologia espermática normal segundo a OMS é realizada
pelo critério de Kruger (1986), definindo-se como morfologicamente normais os
ejaculados que mostraram formas normais em maior ou igual a 4% dos
espermatozoides analisados. Os espermatozoides com a cabeça de formato oval e
com a parte intermediária e cauda perfeitas, são os que têm maior chance de
fertilização. Quando um ou mais desses critérios apresentam alterações podemos
ter: azoospermia – ausência completa de espermatozoides na ejaculação, após a
centrifugação; oligozoospermia – corresponde a diminuição do número de
espermatozoides. Pode ser discreta, moderada ou grave dependendo da proporção
desta redução; astenozoospermia – é quando a motilidade dos espermatozoides
está diminuída; teratozoospermia – são alterações do formato do espermatozóide66.
1.3.2 – Dosagem hormonal
Recomenda-se avaliação endócrina do homem infértil quando houver
concentração espermática <10 x 106 espermatozóides/mL, disfunção erétil, sinais e
sintomas de hipoandrogenismo ou endocrinopatias relacionadas. A avaliação inicial
deverá incluir níveis séricos de testosterona, hormônio folículo estimulante (FSH),
prolactina (PRL), hormônio estimulante da tireoide (TSH), estradiol (E2), globulina de
ligação dos esteroides hormonais (SHBG) e hormônio luteinizante (LH). Muito
embora endocrinopatias sejam encontradas em 10% dos homens inférteis,
comprometimento clinicamente significativos são encontrados em menos de 2% dos
casos70. A dosagem de inibina B também deve ser considerada.
1.3.3 – Avaliação genética
Nos indivíduos com alterações na concentração espermática ou com exame
físico anormal, além do perfil hormonal, deve ser solicitada a pesquisa genética de
cariótipo e de microdeleções do cromossomo Y71.
18
1.3.3.1 – Cariótipo de banda G
O exame de cariótipo deve ser realizado em homens para diagnosticar
alterações cromossômicas responsáveis pela infertilidade masculina. Até 25% dos
pacientes com oligozoospermia grave ou azoospermia não obstrutiva podem ter
alteração no cariótipo48.
1.3.3.2 – Microdeleção do cromossomo Y
A pesquisa de microdeleções do cromossomo Y pode fornecer um
diagnóstico
preciso
sobre
a
causa
da
infertilidade
masculina 72.
O teste molecular é realizado através da técnica PCR (reação em cadeia da
polimerase) que consiste em extrair o DNA das células do sangue e colocar esse
DNA em vários tubos plásticos contendo sondas e enzimas. Essas sondas são
construídas sob medida, de modo que, quando misturadas ao DNA do homem, elas
são capazes de identificar especificamente as regiões do cromossomo Y que se
deseja estudar. As sondas devem ser escolhidas de forma a identificar ou não a
presença das 3 regiões AZF no cromossomo Y72,73.
19
2 – JUSTIFICATIVA
Devido à significância clínica e grande número de homens inférteis com
alteração
cromossômica
numérica
ou
estrutural,
mais
especificamente
de
microdeleções do cromossomo Y, a definição da prevalência e das características
dessas alterações na população masculina infertil é necessária. Com a relativa
popularização das técnicas de reprodução assistida, muitos homens anteriormente
tidos como “inférteis” passaram a ter a possibilidade de procriar com utilização
destas
técnicas,
com
destaque
para
a
injeção
intracitoplasmática
de
espermatozoides (ICSI). Assim, a investigação mais ampla dos homens com
oligozoospermia grave ou azoospermia não obstrutiva deve ser realizada, visto que
alguns distúrbios genéticos implicam em alto risco de transmissão aos descendentes
masculinos, tendo como consequências a transferência da infertilidade masculina e
das anormalidades cromossômicas74. Este risco deve ser avaliado antes da tentativa
de fertilização ser feita em homens azoospérmicos ou oligozoospérmicos. Em Mato
Grosso não há estudos avaliando defeitos no cromossomo Y até o momento e os
serviços de reprodução humana que usam técnicas de reprodução assistida de alta
complexidade não realizam essa investigação como rotina. É justificável então a
realização deste estudo na população mato-grossense com objetivo de verificar a
dimensão desta condição nesta população. Espera-se assim prover intervenções
adequadas aos pacientes, médicos e gestores de saúde no sentido de estabelecer
diretrizes a serem observadas na assistência ao homem infertil.
20
3 - OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
Estabelecer a prevalência de alterações cromossômicas e microdeleções do
cromossomo Y em indivíduos com oligozoospermia acentuada ou azoospermia no
estado de Mato Grosso.
3.2 – Objetivos Específicos
1. Estabelecer o cariótipo dos pacientes oligozoospérmicos e azoospérmicos
em união infertil.
2. Estimar a freqüência do gene SRY, localizado no braço curo do
cromossomo Y.
3. Identificar microdeleções na região AZF, através do marcador SY86 na
região AZFa, do marcador SY134 na região AZFb e do marcador SY254
na região AZFc, localizadas no braço longo do cromossomo Y.
4. Examinar a relação entre os parâmetros seminais observados no
espermograma com cariótipo e tipo de deleção.
21
4 – MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Tipo de Estudo
Estudo descritivo, de corte transversal, incluindo indivíduos em união infértil
com oligozoospermia acentuada ou azoospermia de causa não identificada,
encaminhados a serviços de referência em Reprodução Humana no Estado de Mato
Grosso.
4.2. – Tamanho da amostra
Na determinação do tamanho da amostra, considerou-se o desenho do
estudo, uma prevalência de microdeleções do cromossomo Y em 7% dos homens
com oligozoospermia e azoospermia34,35, intervalo de confiança de 95% e
imprecisão de 5%35, segundo a formula: N= (1,96)² x p.(1 – p)/є² onde p=
prevalência de 0,07 e є² imprecisão de 0,0581. Após a resolução a quantidade
estimada foi de 100 pacientes.
4.3 – Pacientes
Os pacientes foram previamente triados por serviços de Reprodução Humana
e Urologia do estado de Mato Grosso (Clínica Intro, Hospital Geral Universitário de
Cuiabá – HGU e Hospital Universitário Júlio Muller – HUJM). Fez-se inicialmente
revisão do histórico reprodutivo negativo e reavaliou-se o resultado do diagnóstico
do espermograma. Todos os homens foram então submetidos à anamnese
padronizada para a coleta das variáveis de interesse: idade, tempo de vida conjugal,
ausência de prole, história familiar de esterilidade, resultado do espermograma e
outros exames de investigação pertinentes a cada caso (apêndice 1 e 2).
4.4 – Critérios de inclusão
Indivíduos em união infértil com oligozoospermia grave ou azoospermia,
diagnosticados pelo espermograma.
22
4.5 – Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo indivíduos com doenças adquiridas (orquite,
doenças causadas por álcool ou outros tipos de drogas) e agenesia congênita
bilateral dos ductos deferentes.
4.6 – Coleta de sangue
Todos os indivíduos foram submetidos à coleta de 10 mL sangue periférico,
por venopunção. As amostras colhidas foram fracionadas; 5 mL foram utilizados
para o exame citogenético (cariótipo) e 5 mL foram submetidos à extração de DNA.
Os estudos citogenético e molecular foram realizados no Laboratório da Unidade de
Genética Médica e Biologia Molecular da UNIC/Hospital Geral Universitário (HGU).
4.7 – Avaliação e procedimentos iniciais
Após seleção dos indivíduos elegíveis foi realizada entrevista padronizada
com todos os participantes para obtenção do consentimento e coleta de dados
clínicos. Os pacientes que concordaram em participar do estudo assinaram o termo
de consentimento livre e esclarecido antes de submeterem-se a realização da
colheita de sangue.
4.8 - TÉCNICAS CITOGENÉTICAS
4.8.1 - Cultura de linfócitos
As culturas de linfócitos periféricos foram realizadas a partir da técnica
modificada de Moorhead et al (1960)74. Em cada frasco de cultura de 15 mL (Gibco,
EUA) foram adicionados 5 mL de meio RPMI 1640 (Difco, EUA) enriquecido com
20% de soro fetal bovino (Gibco, EUA), 250 g/mL de fito-hemaglutinina P (Gibco,
EUA) e 25-30 gotas de sangue total, previamente homogeneizado. Os frascos foram
incubados em estufa a 37ºC por 72 horas. Toda a semeadura foi realizada em
capela de fluxo laminar. Após cerca de 70 horas de incubação, os frascos foram
retirados da estufa, adicionando-se a cada frasco 250 g/ml de colchicina (Sigma,
23
Brasil) na concentração final de 0,08 g/mL para promover a parada da divisão
celular na metáfase.
4.8.2 - Preparação Citológica
Após 40 minutos do tratamento com colchicina (Sigma, Brasil), o material foi
submetido à centrifugação 12879xg a 8000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante
foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 5 mL de solução hipotônica de KCl
0,075 M (Merck - Brasil). Os frascos de cultura foram então incubados em estufa
(FANEM M502) a 37ºC por 45 minutos. Após esta incubação, repetiu-se a
centrifugação e o sobrenadante foi novamente desprezado. Adicionou-se 5 mL da
solução fixadora (Metanol e Ácido Acético Glacial, 3:1 - Merck) ao sedimento. Este
processo de fixação foi repetido por 3 vezes. Após a fixação, o material foi mantido
em geladeira a 4ºC por pelo menos uma hora antes da preparação das lâminas.
4.8.3 - Método de Coloração - Bandeamento G
As lâminas usadas para bandeamento foram preparadas pelo menos 5 dias
antes da data da coloração. O bandeamento G foi realizado segundo técnica de
Sanchez et al, 197375. Em síntese, as lâminas foram incubadas em tampão fosfato
0,06 M, pH 6,8 (Merck - Brasil), durante 1 minuto à 37ºC, lavadas em água
deionizada e secas em temperatura ambiente. Colocou-se então uma camada de
solução corante, preparada com corante Wright (Merck , Brasil) e tampão fosfato
0,06 M(Merck - Brasil), numa proporção de 3:1, aguardando-se 3 a 4 minutos. Após
este procedimento as lâminas foram mantidas em temperatura ambiente ou em
estufa a 37ºC.
4.8.4 – Análise Cromossômica
Foram analisadas 15 metáfases, 5 por coloração convencional e 10 por banda
G de cada indivíduo. No caso de mosaico, foram analisadas 50 metáfases, sendo 10
por coloração convencional e 40 por banda G. A cada metáfase foi realizada a
contagem total de cromossomos e análise da estrutura do mesmo para a verificação
da
presença
de
anormalidades
cromossômicas
numéricas
(trissomias,
24
monossomias, e triploidias) e estruturais (deleções, translocações, inserções, entre
outras). Os resultados foram encaminhados ao médico do paciente para que
tivessem livre acesso aos mesmos e fossem orientados.
4.8.5 – Documentação
A documentação fotográfica das metáfases analisadas dos pacientes
participantes do estudo foi realizada através do microscópio AXIOSTAR (ZEISS 
-
Alemanha) auxiliado pelo software de captura de imagem CROMHU (Atonus
-
Brasil).
4.9 - ANÁLISE MOLECULAR
4.9.1 - Extração de DNA
Amostras de sangue periférico foram coletadas por venopunção em tubos
contendo EDTA 0,1% (volume final na concentração de 1mg/dL). A extração de DNA
será realizada utilizando o método descrito por Lahiri e Nurnberg (1991) 76, com
modificações. Para tanto, foram utilizados 5 mL de sangue periférico de cada
indivíduo, após a coleta a amostra foi foi transferida para tubos falcon de 15 mL
(Gibco® - EUA), identificados. Os tubos foram centrifugados por 8 minutos a 2236xg.
Após a centrifugação o sobrenadante foi retirado e a membrana celular submetida à
primeira etapa de lise, utilizando a solução 1xTM1, a partir da solução 10xTM1
100mM Tris-HCl (Invitrogen® - Brasil) 100mM KCl (Merck®- Alemanha), 100mM
MgCl2 (Merck®- Alemanha), 20 mM EDTA (Merck®- Alemanha) diluída em Triton
X-100 2,75% (USB Corporation Cleveland, EUA). O material foi centrifugado e após
a retirada do sobrenadante o sedimento foi novamente lavado em 8,5 mL de 1xTM1.
Esse
procedimento
(centrifugação,
retirada
do
sobrenadante,
lavagem
e
ressuspensão) foi repetido até que o precipitado de células estivesse isento de
hemoglobina. Após centrifugação, o sobrenadante foi retirado e o sedimento
ressuspendido em 1,6 mL de 1xTM2 (10 mM Tris HCl; 10 mM KCl; 10 mM MgCl 2; 2
mM EDTA; 0,4 N NaCl) para segunda etapa de lise. Adicionou-se 160 µL de dodecil
sulfato de sódio (SDS) 10% ao sedimento, incubou-se a mistura em banho-maria à
56 C por 15 minutos. Em seguida, adicionou-se 480 µL de 5M NaCl e o material foi
25
centrifugado a 12879xg por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubo
falcon 15 mL (Gibco®, EUA) contendo 10 mL de etanol absoluto gelado. Após esta
etapa, o DNA foi retirado do tubo falcon com pipeta Pauster e transferido para
microtubos de 0,5 mL, contendo em 200 L de TE (10mM Tris; 1mM EDTA pH 7,5) e
armazenado em freezer -20°C, até seu uso para a amplificação gênica por reação
em cadeia da polimerase (PCR).
4.9.2 – Quantificação do DNA
Para a quantificação das amostras de DNA extraídas adicionou-se 5 L do
material obtido a 1 L de tampão azul de bromofenol. Esta amostra foi submetida à
eletroforese em gel de agarose 1% diluída em TAE 1x (Tris 0,089 M, Acetato 0,089
M, EDTA 0,01 M pH 7,5). Para essa técnica utilizou-se campo elétrico de 148 Volts
por aproximadamente 1 hora. Em seguida, o gel foi corado em solução de brometo
de etídio 0,5 g/mL por cerca de 10 minutos e visualizado sob luz ultravioleta. A
quantificação do DNA foi feita por comparação padrões de pesos moleculares ʎ Hind
lll (Invitrogen®, Brasil).
4.9.3 – Reação em cadeia de polimerase (PCR)
Para verificar a ocorrência de microdeleção no cromossomo Y, utilizou-se
quatro diferentes pares de oligonucleotídeos iniciadores sintetizados a partir de
regiões ao redor do centrômero e braços curto e longo do cromossomo Y. A PCR
usada para a amplificação do DNA e investigação dos marcadores SRY gene
localizado no braço curto (Yp) com 472 pb, SY86 (seqüência localizada na região
AZFa com 320 pb), SY134 (seqüência localizada na região AZFb com 301 pb),
SY254 (seqüência localizada na região AZFc com 400 pb). (Figura 6 e Tabela 4).
26
Figura 6: Ideograma do cromossomo Y (Adaptado de Jobling et al, 2004). As setas indicam as
regiões investigadas no presente trabalho.
Tabela 2: Sequências dos STS (Sequence Tagged Sites – seqüência conhecida do DNA) SRY, SY86, SY134,
SY254 usados nas análises de biologia molecular.
Pares de
base (pb)
Primers
Região
STS
SRY
Yp
do produto
Seqüência 5’ - 3’ dos primers:
amplificado
forward/reverse
472 pb
F 5’ – GAATATTCCCGCTCTCCGGA - 3’
R 5’ – GCTGGTGCTCCATTCTTGAG - 3’
SY86
AZFa
320 pb
F 5’ – ACACACAGAGGGACAACCCT – 3’
R 5’ – GTGACACACAGACTATGCTTC – 3’
SY134
AZFb
301 pb
F 5’ – GTCTGCCTCACCATAAAACG – 3’
R 5’ – ACCACTGCCAAAACTTTCAA – 3’
SY254
AZFc
400 pb
F 5’ – GGGTGTTACCAGAAGGCAAA – 3’
R 5’ – GAACCGTATCTACCAAAGCAGC
– 3’
A PCR foi realizada com volume final de 25 µL. Constitui-se de 50 µL de PCR
Supermix com Taq Platinun (Invitrogen®, Brasil), 0,40 µL de cada seqüência
iniciadora (concentração final de 0,2 µM) e 1 µL de DNA. Os ciclos de desnaturação,
anelamento e extensão da PCR foram realizados em aparelho termociclador (Gene
Amp PCR System 9600 – Perkin Elmer®). O processo de amplificação foi
constituído
de
35
ciclos
com
diferentes
programas
para
cada
par
de
27
oligonucleotídeos iniciadores (Tabela 3). Para cada processo de amplificação
utilizou-se, além das amostras de DNA dos pacientes em avaliação, amostras de
DNA controles: indivíduo normal do sexo masculino (controle positivo), indivíduo
normal do sexo feminino (controle negativo).
Tabela 3: Descrição dos parâmetros usados nos ciclos de amplificação gênica da técnica de Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR)
Primers
Temperatura/Tempo
Temperatura/Tempo
Temperatura/Tempo
STS
de desnaturação
de anelamento
de extensão
SRY
94°C – 1 minuto
64°C – 1 minuto
72°C – 2:30 minutos
SY86
72°C – 1 minuto
72°C – 10 minutos
4°C – 5 minutos
SY134
94°C – 5 minutos
94°C – 1 minuto
56°C – 30 segundos
SY254
72°C – 1 minuto
72°C – 10 minutos
4°C – 5 minutos
4.9.4 – Detecção do DNA amplificado
A verificação da amplificação do DNA foi efetuada através de eletroforese em
gel de agarose 1,0% corado com brometo de etídio. Está técnica foi realizada em
Cuba Horizontal 20.25 Life Technologies (Gibco® - Brasil). Para o preparo do gel
usou-se 3 g de agarose dissolvida em 300 mL de tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE)
1X (Tris 0,089 M, Borato 0,089 M, EDTA 0,01 M pH 7,5). A mistura foi aquecida em
forno microondas por aproximadamente 3 minutos ou até que a agarose estivesse
totalmente dissolvida. Despejou-se a solução em cuba de eletroforese, contendo
pentes com caneletas adequadas deixando em repouso de 20 minutos para total
gelificação. Preparou-se tampão de migração usando 1000 mL de tampão TrisAcetato-EDTA (TAE) 1X, colocando-o em cuba de eletroforese, cobrindo totalmente
o gel de agarose para a homogeneização da temperatura. Com uma micropipeta de
10-20 µL, adicionou-se uma mistura de 19 µL do produto de amplificação (amplicon)
e 1 µL de tampão de corrida (azul de bromofenol 0,1%) em cada amostra. Utilizou-se
um marcador de peso molecular, DNA Ladder 100 pb (Invitrogen®- Brasil) como
padrão para análise das bandas. A migração ocorreu em voltagem de 98 V por
aproximadamente 40 minutos. Após esse período o gel foi transferido para cuba
contendo solução corante composta de brometo de etídio dissolvido em água
destilada na concentração de 10 mg/mL e estocada em ambiente escuro por cerca
28
de 10 minutos. Após a revelação o gel foi transferido para um transluminador (Bio
Rad®, USA).
4.9.5 – Documentação
Verificou-se no transiluminador o aparecimento ou não das bandas indicativas
de microdeleções. Foto foi obtida, sob luz ultravioleta através de Sistema de Captura
de Imagens L-PIX-STR (Loccus Biotecnologia® – Brasil).
4.10 - Considerações Éticas
O protocolo dessa pesquisa foi submetido à apreciação do Comitê de Ética
em Pesquisa da Universidade de Cuiabá CEP/UNIC. Todos os participantes foram
esclarecidos sobre os objetivos e procedimentos do presente estudo (punção
venosa, entrevista e revisão de prontuários médicos) e sobre sua total liberdade
para participar ou não sem prejuízo para sua assistência. Os participantes que
concordaram em fazer parte do estudo assinaram o Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIC.
4.11 – Análise Estatística
A análise descritiva dos dados inclui as características gerais dos
pacientes incluídos no estudo. Para os valores numéricos são descritos: média, erro
padrão, desvio padrão, qui-quadrado com correção de Fischer e valores mínimos e
máximos. Para os dados categóricos são descritas freqüência e prevalência de cada
categoria estabelecida. Os bancos de dados foram primeiramente compilados no
software Excel 2007 e posteriormente transferidos para os software estatístico
SPSS.
29
5 - RESULTADOS
De acordo com critérios de inclusão foram selecionados inicialmente para
análise citogenética e biologia molecular 95 pacientes, entretanto houve exclusão de
01 paciente que por ter 13 anos de idade na época, não realizou análise seminal.
5.1 - ANÁLISE DESCRITIVA
Da amostra de 94 pacientes, a idade média observada foi de 35,3 anos com
desvio padrão de 7,2, a média do tempo de união entre os casados foi de 8,6 anos e
4,9 de desvio padrão e o tempo médio de exposição sem método contraceptivo foi
de 5,7 anos com desvio padrão de 4,8 (Tabela 4).
Tabela 4: Características gerais dos pacientes com união estável incluídos no
estudo
Erro
Desvio
N
Mínimo Máximo
Média
Padrão Padrão
Idade (anos)
92
19,0
64,0
35,3
0,7
7,2
Tempo de união do
casal (anos)
92
1,00
23,00
8,6
Tempo de união do
91
1,00
23,00
5,7
casal sem
anticoncepção (anos)
*Um paciente não respondeu a data de nascimento durante o questionário.
0,5
4,9
0,5
4,8
Na tabela 5 pode-se observar a distribuição dos pacientes estudados segundo
estado civil, escolaridade, renda familiar e raça.
30
Tabela 5: Características sócio-econômicas dos pacientes incluídos no estudo
Freqüência
%
Estado Civil
Casado
89/94
94,7
Separado
1/94
1,1
Solteiro
4/94
4,2
Escolaridade
E.FI*
E.FII**
E.M***
E.S****
P.G*****
1/94
5/94
47/94
40/94
1/94
1,1
5,3
49,5
42,1
1,1
Raça
Branca
Negra
Parda
45/94
8/94
41/94
47,4
8,4
43,2
Até 3
2/94
2,1
3-10
10-20
20-30
30
76/94
8/94
4/94
4/94
80,0
8,4
4,2
4,2
Renda familiar
(salários
mínimos)
*Ensino fundamental l, **Ensino fundamental ll, ***Ensino médio, ****Ensino superior, *****Pós-graduação
A tabela 6 apresenta os aspectos epidemiológicos dos pacientes envolvidos
no estudo.
31
Tabela 6: Aspectos clinico-epidemiológicos dos pacientes incluídos no estudo
Frequência
%
Doença genital
Criptorquidia
1/94
1,1
DST
1/94
1,1
Prostatite
2/94
2,1
Varicocele
10/94
10,6
Varicocelectomia
8/94
8,5
Linfoma
2/94
2,1
Outra
3/94
3,2
Exposição ao calor intenso ou radiação
18/94
3,2
Caxumba na infância
49/94
52,1
Trauma na região genital
24/94
25,5
Doença autoimune
3/94
3,2
Infertilidade na família
17/94
18,1
Doença genética na família
14/94
14,7
Uso de cigarro (atual ou anterior)
32/94
34,0
Uso de drogas (atual ou anterior)
6/94
6,4
Uso de álcool (atual ou anterior)
61/94
64,9
Tratamento anterior para engravidar
13/94
13,8
A análise seminal dos pacientes com relação à concentração, motilidade,
morfologia e vitalidade estão descritos na tabela 7.
Tabela 7: Resultados da análise seminal básica dos pacientes incluídos no estudo segundo a OMS 2010
Parâmetro
Concentração
(x106 sptz / mL)
Motilidade progressiva
(% A+B)
Morfologia de Kruger
(% normais)
Vitalidade
(% sptz vivos)
N
53
Erro
Mínimo Máximo Média Mediana Padrão
1,0
68,0
8,6
7,0
1,4
39
2,0
85,0
38,0
35,0
3,5
27
1,0
11,0
5,0
5,0
0,4
31
46,0
88,0
57,3
53,0
2,0
Na tabela 8 são mostradas as proporções de indivíduos com oligozoospermia
e azoospermia.
32
Tabela 8: Distribuição dos pacientes segundo o diagnóstico de oligozoospermia ou azoospermia
Parâmetro
Oligozoospermia leve (5-20 x 106
sptz/mL)
Oligozoospermia grave (<5 x 106
sptz/mL)
Azoospermia
Freqüência
(%)
38/94
50.4
25/94
26.6
31/94
33.0
Na avaliação genética das amostras, cinco (5,4%) apresentaram cariótipo
alterado, microdeleção foi encontrada em apenas 1 paciente, com azoospermia
(Tabela9).
Tabela 9: Resultados das análises citogenética e biologia molecular
Frequência
(%)
Cariótipo normal
46,XY
86/91
94.5
Cariótipo alterado
46,XY,delY(q)
1/91
1,1
46,XY,8p+
1/91
1,1
46,XY,t(7;1)
47,XXY
1/91
2/91
1,1
2,2
AZFa
94/94
100,0
AZF
AZFb
AZFc
94/94
93/94
100,0
98,9
Microdeleção
AZFc
1/94
1,1
Presença das
regiões
5.2 - ANALISE BIVARIADA
5.2.1 – Associação entre os cariótipos dos pacientes e o grau de
comprometimento no número de espermatozóide
Nas culturas de 3 pacientes não houve crescimento celular, impedindo assim
a realização do
cariótipo; todos os três pertenciam ao grupo de pacientes
oligozoospérmicos. Como não foi possível fazer uma nova coleta, os três foram
excluídos da análise seminal. Dos 91 cariótipos analisados, 3 apresentaram
alteração estrutural. Um deles com oligozoospermia grave tinha cariótipo
33
46,XY,8p+. Outro com cariótipo 46,XY,t(7;1)(qter-p35) era azoospérmico. O terceiro
com cariótipo 46,XY,delY(q) tinha oligozoospermia leve. Em adição, outros dois
pacientes azoospérmicos apresentaram cariótipo 47,XXY, compatível com a SK.
Na tabela 10 observa-se a provável associação entre a alteração numérica
dos espermatozóides com o cariótipo encontrado.
Tabela 10 – Cariótipo (normal e alterado) dos pacientes de acordo com as características seminais referentes à
concentração dos espermatozóides
Sêmen
Cariótipo
Subtotal
Normal
Anormal
Oligozoospermia leve
34
01
35
Oligozoospermia grave
24
01
25
Azoospermia
28
03
31
Total
86
05
91
Qui-quadrado=1,62 p=0,462
5.2.2 - Identificação do gene SRY, do marcador SY86 na região AZFa, do
marcador SY134 na região AZFb e do marcador SY254 na região AZFc
Microdeleção do cromossomo Y foi detectada apenas na região AZFc, em um
paciente (1/94; 1,1%), com azoospermia e cariótipo normal (figura 7).
P
1
M
2
F
3
4
P1
5
6
P2
7
8
P3
9
10
P4
11
12
P5
13
14
15
Figura 7 – Gel de eletroforese mostrando as análises das regiões AZFa, AZFb e AZFc.No “poço” 12 é possivel
observar deleção da região AZFc. P: marcador usado como padrão, M2:controle positivo (homem
normal)+SRY+Azfa+AZFc, M2: controle positivo+SRY+AZFb, F4:controle negativo (feminino)+SRY+AZFa+AZFc,
F5:controle
negativo+
ZRY+AZFb,
P1
(6,
8,10,12,14):
paciente+SRY+Azfa+AZFc,
P2
(7,9,11,13,15):
paciente+SRY+AZFb.P: paciente. Nota: foram feitas duas reações de multiplex para cada amostra.
34
No experimento foi detectado associação entre pacientes azoospermicos e
microdeleção na região AZFc com p=0,524, não foi possível realizar teste
estastístico de correlação com as variáveis AZFa e AZFb, já que todos os pacientes
analisados não apresentaram microdeleção nessas regiões.
35
6 – DISCUSSÃO
A infertilidade masculina é uma desordem multifatorial complexa que pode
levar a diferentes graus de falha espermatogênica, sendo caracterizada pela
impossibilidade do casal conceber após um ano de relações sexuais normais
desprotegidas59. A idade do paciente e o tempo de infertilidade são considerados
fatores importantes na tomada de decisões a respeito da conduta de investigação,
tratamento e no prognóstico da infertilidade. No presente estudo, dos 94
participantes, a idade mínima foi de 19 anos e a máxima 64 anos, com média de
35,3 anos e, o período de união sem anticoncepcional apresentou uma média de 5,7
anos, dados que corroboram com os encontrados na literatura, o que é também
explicado pelo fato de nos centros urbanos, a maternidade tem sido adiada em
função principalmente da busca pela estabilidade profissional e financeira 77. A
literatura mostra também que os casais desejam ter filhos unidos por um vínculo
biológico, uma vez que, para estes a paternidade é a expressão de uma função
biológica normal e de um relacionamento íntimo entre um homem e uma mulher, ela
é vista como um critério necessário à realização pessoal78. Dos 94 pacientes
incluídos nesse estudo, 89 eram casados, 1 separado e 4 eram solteiros,
constataram a infertilidade em exames de rotina, já que não apresentavam nenhuma
causa aparente e nem tinham casos de infertilidade na família.
Quanto aos dados epidemiológicos, 49,5% dos participantes haviam
concluído, no mínimo, o ensino de nível médio, e outra grande parte 42,1% tinham
concluído o ensino superior o que leva a crer que esses pacientes possuíam
conhecimento sobre a fisiologia do processo reprodutivo, bem como acesso à
informação sobre diagnóstico e tratamento da infertilidade. Pela participação restrita
de homens com menor escolaridade, presumivelmente de classes socioeconômicas
mais baixas, constata-se a deficiência ao acesso às informações e aos serviços de
infertilidade existentes. Observou-se também que a grande maioria dos casais que
procuraram um serviço médico especializado, 80% tinham uma renda entre 3 a 10
salários mínimos e uma minoria 2,1% a renda era de até três salários mínimos. Os
casais considerados de baixa renda apresentam maior dificuldade ainda, uma vez
que nem o SUS nem os planos de saúde oferecem cobertura para o tratamento da
36
infertilidade, e assim, pacientes que não possuem condições econômicas favoráveis,
quase sempre não têm acesso a um diagnostico e um possível tratamento.
Quanto à raça não houve uma associação estatística entre esta variável e a
presença de microdeleção do cromossomo Y, os resultados demonstraram que tanto
indivíduos de raça branca e parda apresentaram uma prevalência da microdeleção
equiparada (47,4% e 43,2%) respectivamente e 8,4% eram negros.
Vários fatores relacionados com infertilidade masculina já foram descritos, e
são divididos em fatores pré-testiculares, testiculares e pós-testiculares. Quanto aos
fatores pré-testiculares podemos citar os hormonais, onde a função endócrina do
testículo é regulada pelo eixo hipotálamo-hipofisário através da produção de
hormônios liberador de gonadotrofinas para os testículos produzirem testosterona,
inibina e espermatozóides27,
29.
Entre as causas testiculares podemos destacar os
distúrbios genéticos, distrofia miotônica, orquite, criptorquidia, obesidade, varicocele,
uso de drogas como álcool e tabaco. No presente trabalho 52,1% dos pacientes
inférteis relataram ter tido caxumba na infância. A orquite pós-caxumba no póspúbere destrói o epitélio germinativo e é reconhecida como causa de infertilidade.
Aproximadamente 15 a 20% dos homens adultos que contraem caxumba podem
desenvolver orquite normalmente unilateral, embora comprometimento bilateral
ocorra
em
aproximadamente
10%
dos
homens
afetados.
Pode
ocorrer
desenvolvimento de atrofia testicular em 1 a 6 meses, ou mesmo depois de anos.
Menos de um terço dos homens com orquite bilateral voltam a apresentar
parâmetros seminais normais79.
Agentes inalados, ingeridos ou injetados que alterem a produção dos
espermatozóides são chamados de fatores gonadotóxicos e podem estar presentes
na rotina por contaminação ambiental, prescritos como tratamento médico,
envolvidos na atividade profissional ou utilizados como drogas ilícitas. São exemplos
de agentes gonadotóxicos: pesticidas, sulfasalazina, nitrofurantoína, cimetidina,
cafeína,
nicotina,
álcool,
maconha,
tabaco,
anabolizantes,
quimioterápicos,
radioterapia e fontes de calor80. A prevalência do consumo de álcool no presente
estudo foi de 64,9%.
37
Nos casos de infertilidade, para além das alterações clássicas na qualidade
do esperma, o tabaco pode afetar a qualidade do esperma de outras formas, tais
como: diminuir a capacidade do espermatozoide fertilizar o ovócito; aumentar a
probabilidade de aborto espontâneo da gravidez antes das 12 semanas; diminuir a
taxa de implantação do blastocisto, entre outras81. Neste estudo 34% dos pacientes
faziam uso de cigarro, destes apenas um teve alteração citogenética com um
cariótipo compatível para SK (47,XXY),
e nenhum apresentou microdeleção do
cromossomo Y, portanto não foi encontrado associação entre tabagismo e
alterações cromossômicas no sangue periférico. Em 1981, foi realizado o primeiro
estudo que demonstrou anormalidades espermáticas em homens fumantes 79. Este
estudo demonstrou que os fumantes têm uma percentagem significativa de
anormalidades da qualidade do esperma, demonstrando que estas alterações
espermáticas são fruto da exposição ao tabaco e aos seus constituintes82. Muitos
outros estudos subseqüentes83,84,85,86 obtiveram resultados idênticos demonstrando
os vários efeitos adversos que o cigarro provoca na qualidade do esperma. Em outro
estudo um grupo dinamarquês, realizou análise transversal com o maior grupo de
homens saudáveis36. Estes autores verificaram que quanto maior a quantidade de
cigarros fumados, menor era a qualidade do esperma87. Foram observadas
diferenças entre os 20‐30% em algumas características da qualidade do esperma,
tais como: concentração do esperma, volume de esperma, número total de
espermatozoides, mobilidade e densidade espermática87.
Neste estudo a oligozoospermia leve foi o diagnóstico que apresentou maior
prevalência de 50,4%, a oligozoospermia grave a prevalência foi de 26,6 e 33% dos
pacientes eram azoospermicos (dados apresentados na tabela 10). Também foi
observado que as alterações citogenéticas foram mais frequentes à medida que a
concentração
espermática
diminuía,
uma
vez
que
nos
pacientes
com
oligozoospermia leve 2,9% apresentaram análise citogenética alterada, nos
oligozoospermicos
grave
a
frequência
encontrada
foi
4,2
e
10,7%
nos
azoospermicos, um achado compatível com os da literatura 34,35,36 .
Atualmente muitos dos casos de infertilidade idiopática podem ter uma base
genética. A maioria das pesquisas relacionadas à infertilidade genética masculina
38
tem foco na análise do cromossomo Y59. O primeiro dado, sobre a existência de
fatores genéticos relacionados com a fertilidade masculina, foi relatado no ano de
1976, quando Tiepoli e Zuffardi, estudaram 1160 homens e detectaram a presença
de deleções citogenéticas na região Yq em 6 deles (0,5%). Com isso, postularam a
existência de um locus relacionado à espermatogênese localizado no Yq11 definido
como fator azoospérmico (AZF)63. Em dois casos, demonstraram que os pais desses
pacientes com deleção carregavam um cromossomo normal, indicando que essas
mutações eram eventos de novo63. Até 1996, não foi possível realizar mais análises
do cromossomo Y devido ao tamanho reduzido deste e ausência de tecnologia. A
partir desta data, com os avanços das técnicas de biologia molecular, verificou-se
que o braço longo do cromossomo Y possui diferentes genes responsáveis pela
espermatogênese capazes de atuarem em diferentes estágios de desenvolvimento
das células germinativas; e que falhas nessa região, chamada de azoospermia,
podem levar a parâmetros seminais anormais. Portanto, apesar dos vários fatores
etiológicos, sabe-se hoje que a pesquisa genética desempenha um papel importante
na investigação da infertilidade masculina59,61.
No presente estudo, dos 94 pacientes estudados, foram encontradas
alterações cromossômicas em 5 (5,3%) pacientes e microdeleção do cromossomo
Y, na região AZFc em 1 (1,1%). Estudos já relatam uma incidência de 13,5%
microdeleção no cromossomo Y73, entretanto outras pesquisas relatam que a
frequência das microdeleções varia entre 0,7%-34,5%, com média de 8,2%61.
Dentre as anomalias cromossômicas sexuais a SK é a causa mais frequente
de infertilidade e está associada com insuficiência espermatogênica grave,
causando uma redução acentuada no tamanho dos testículos e azoospermia64. No
presente estudo, encontrou-se 2 pacientes com cariótipo 47,XXY sendo ambos
azoospermicos, uma incidência de 6,4%. Esses achados são compatíveis com
outros estudos já publicados88,89. O mecanismo que pode levar a essa alteração
cromossômica é a não-disjunção, que se dá pela falta de ocorrência de segregação
entre os cromossomos durante alguma etapa da divisão celular, seja ela mitótica ou
meiótica. A meiose é a divisão celular através da qual as células diplóides da
linhagem germinativa dão origem a células haplóides que irão se diferenciar em
39
gametas. Esse processo envolve 2 etapas ( meiose I e meiose II) cada uma delas
acompanhada de uma redução do número de cromossomos, totalizando 23 no final
em cada gameta90. O primeiro passo é o pareamento de todos os cromossomos
replicados homólogos, após, os pares de cromátides homólogas trocam material
genético entre si (crossing-over). Os homólogos separam-se e s ão colocados em
polos celulares opostos, a célula divide-se e está concluída a primeira meiose.
Imediatamente após, um novo fuso é formado em cada célula e as cromátides irmãs
de cada homólogo são separadas migrando posteriormente para polos opostos
celulares. Para que essa separação cromossômica ocorra corretamente, existem
mecanismos celulares que atuam no controle desse processo. No começo da
meiose I ou II, um complexo especializado de proteínas em cada cromátide ativa o
cinetócoro, que se liga aos microtúbulos e regulam a migração dos cromossomos
dirigindo-os para os polos opostos do fuso. Nem todos os cinetócoros ligam-se aos
microtúbulos ao mesmo tempo, e alguns homólogos podem começar a mover-se em
direção ao mesmo polo do fuso. O ponto de checagem do fuso (spindle checkpoint)
atrasa a anáfase no seu início até que o cinetócoro livre ligue-se ao microtúbulo e
mova-se em direção ao polo oposto. Após a anáfase da meiose I, o processo ocorre
normalmente com a segregação dos pares homólogos. Durante a meiose II, ocorrerá
a separação das cromátides irmãs, então ambos os polos do fuso terão o mesmo
número de cromossomos e depois da anáfase II todos os quatro gametas herdarão
o cromossomo complementar correto100. Se o funcionamento do ponto de checagem
estiver comprometido, a célula vai iniciar a anáfase e começar a segregação
cromossômica antes que todos os homólogos pareados estejam devidamente
conectados com ambos os polos do fuso, alguns gametas irão herdar duas cópias
do cromossomo não segregado (trissomia do embrião) e outros não herdarão
nenhuma cópia (monossomia do embrião)100.
A SK é uma forma de falência testicular primária, com níveis de gonadotrofina
elevados, gerados pela perda de inibição por feedback da glândula pituitária91,92,93.
Os pacientes apresentam testículos pequenos usualmente incapazes de produzir
espermatozoides ou quantidades insuficientes de testosterona, resultando em
infertilidade94. Na sua forma clássica, azoospermia apresenta-se em 85% dos casos,
mas ocorre em apenas 50% dos pacientes com mosaicismo, pois esses indivíduos
possuem espermatogênese preservada em um dos testículos, havendo alguns
40
espermatozoides na ejaculação. A explicação para que isso ocorra considera a
possibilidade de existirem células maduras preservadas nos túbulos testiculares, nos
quais as células com o cariótipo 46,XY são prevalentes. Entretanto, a presença da
espermatogênese pode ser considerada como um passo de transição na
degeneração progressiva nos túbulos seminíferos que ocorre após a puberdade nos
pacientes sindrômicos, em homologia aos casos clássicos92.
No
presente
estudo
foi
observada
uma
translocação
autossômica
46,XY,t(7;1)(p35→qter) em um paciente do grupo de azoospérmicos. De fato, esse
tipo de anomalia tem sido relatado em homens inférteis com oligozoospermia grave
ou azoospermia. A hipótese levantada para essa ocorrência é que translocações
equilibradas interferem no emparelhamento de cromossomos normais e segregação
na meiose l, levando à uma potencial formação de gametas desbalanceados e prole
desequilibrada subsequente anormal43,56. Outra hipótese pressupõe que de
potenciais genes autossômicos envolvidos na gametogênese masculina podem ser
desregulados por breakpoints. A relação entre pontos de interrupção cromossômica
e infertilidade masculina tem sido investigada. Verificou-se que há uma distribuição
não-aleatória de pontos de interrupção associada à infertilidade 88, entretanto mais
pesquisas nesta direção são necessárias.
Estudos relatam que deleções no braço longo do cromossomo Y que
envolvem um determinado e consistente segmento, podem levar à oligozoospermia
grave e até azoospermia
73.
Entre os pacientes com oligozoospermia leve, foi
encontrado um com 46,XY,delY(q) foi detectado no grupo dos oligozoospérmicos
leves, entretanto, esse paciente não apresentou microdeleção em nenhuma das três
regiões analisadas e a hipótese provável para esse fato é que a região perdida do
braço longo do cromossomo Y possa ser de heterocromatina.
Além dos genes presentes no cromossomo Y, alguns genes localizados nos
cromossomos autossomos são também importantes para a fertilidade masculina.
Rearranjos intracromossômicos parecem envolver um único cromossomo. Estes
incluem deleções intersticiais e terminais, duplicações, cromossomos marcadores,
inversões e isocromossomos. Alguns rearranjos poderiam envolver um único
cromossomo homólogo (troca de cromátides irmãs) enquanto que outros poderiam
41
envolver ambos os cromossomos homólogos (recombinação entre homólogos) 64. As
duplicações, assim como as deleções, podem se originar por crossing desigual ou
por segregação anormal da meiose em um portador de uma translocação ou
inversão. Em geral, a duplicação parece ser menos prejudicial que a deleção. Como
a duplicação em um gameta resulta em desequilíbrio cromossômico (trissomia
parcial), as quebras cromossômicas podem romper genes, assim a duplicação em
geral leva a alguma anomalia fenotípica. Embora muitas duplicações tenham sido
relatadas, poucos tipos foram estudados até o momento. Entretanto, alguns
fenótipos parecem estar associados a duplicações de determinadas regiões
cromossômicas96,97.
Espermatozoides sofrem alterações de maturação no epidídimo necessárias
para a motilidade, capacitação e interação esperma-ovo. Proteínas específicas que
afetam a maturação do espermatozoide são secretadas, muitas vezes de uma
maneira dependente de testosterona, e codificadas pelo gene SPAG11. Através da
técnica de Southern blot e análises de sequência genômica determinou-se que o
gene SPAG11, que eles chamaram EP2 se localiza em uma região do braço curto
do cromossomo Y98. Posteriormente demonstrou-se que esse gene codifica uma
proteína importante para a aquisição de motilidade espermática e o início da
maturação dos espermatozóides99. No presente estudo um paciente com
oligozoospermia grave, apesar de não ter nenhuma região do cromossomo Y
deletada, apresentou cariótipo 46,XY,(8p+).
A pesquisa de microdeleções do cromossomo Y (regiões AZFa, AZFb e
AZFC) realizada nos 94 homens inférteis revelou microdeleção apenas da região
AZFc em um dos paciente, de acordo com os dados levantados o mesmo não teve
caxumba, nunca sofreu algum tipo de acidente na região genital, não sofre de
doença autoimune, nem faz uso de medicamentos, não fuma, bebe aos fins de
semana, sem histórico familiar de infertilidade e apresentou cariótipo normal. Sabese que microdeleções envolvem mais frequentemente a região AZFc (60%), com
menor frequência a região AZFb (16%) e raramente a região AZFa (5%). Grandes
microdeleções envolvendo duas ou três regiões AZF são diagnosticadas em 14%
dos casos. No entanto, nos 5% restante as microdeleções são localizadas em
regiões não sobrepostas AZFa, b ou c52,53,61. Não existe correlação clara entre o
42
tamanho e a localização da deleção e o fenótipo dos testículos. Entretanto, sabe-se
que deleções maiores estão associadas com dano testicular mais grave52,53,61. Esta
dificuldade de associar o genótipo com o fenótipo pode originar-se do critério de
seleção utilizado para os diferentes pacientes nos diversos estudos, habitualmente
baseados somente em dados clínicos (infertilidade, história, concentração hormonal
e volume testicular) e/ou em dados da análise seminal (normozoospérmico,
oligozoospérmico ou azoospérmico) e/ou estrutura testicular (síndrome de células
Sertoli, hipoespermatogênese, impedimento espermatogênico, formas obstrutivas)52.
A correlação entre genótipo/fenótipo pode se tornar mais fidedigna através da
seleção de pacientes, investigação clínica e histopatológica e definição precisa dos
diferentes fenótipos. Estudos de grupos de homens de diferentes origens
étnicas/geográficas
são
necessários
para
determinar
se
existe
diferença
populacional entre a frequência, posição ou extensão das deleções52,53,61. O primeiro
gene candidato AZF foi isolado em 1993 de uma região que mostrou
correspondência com AZFb. Dois anos depois, o segundo gene AZF candidato foi
identificado na região AZFc. A estrutura do AZFa e os genes que ela possui foram
descritos recentemente52,53,61. A região AZF possui três loci não sobrepostos, AZFa,
AZFb, AZFc, necessários para a espermatogênese normal52. Deleção nas três
regiões remove um ou mais desses genes (DAZ, RBMY, USP9Y e DBY) e causa
severa testiculopatia levando à infertilidade masculina52,53,61. Deleções que ocorrem
na AZFa resultam em síndrome de células de Sertoli tipo I (SCOS I) (nenhuma
presença de espermatogônia), deleções na AZFb resultam em um impedimento
espermatogênico (SGA) normalmente no estágio de espermatócitos e deleções na
AZFc estão associadas a SCOS tipo II (algumas espermatogônias estão presentes
com espermatogênese limitada) ou hipoespermatogênese 53. Não existe um
tratamento correto para melhorar a fertilidade de homens com microdeleção do
cromossomo Y. Entretanto, o conhecimento dessas microdeleções é útil por várias
razões. Primeiro, a detecção de deleções no cromossomo Y fornece um diagnóstico
para a infertilidade. Segundo, o diagnóstico de microdeleção do cromossomo Y
permite ao médico renunciar a um tratamento empírico e direcionar o paciente a
reprodução assistida ou à adoção em terceiro o conhecimento de microdeleções no
cromossomo Y permite informar os casais que conceberam por reprodução assistida
e aos que já têm um filho, a importância de uma investigação clinica sobre
43
infertilidade na idade apropriada, visto que filhos de homens com microdeleção do Y
herdam esse cromossomo52. A baixa prevalência de microdeleção do cromossomo Y
encontrada no presente trabalho poderia ser devido às características da população
ou o limiar de concentração de espermatozoides incluído para análise microdeleção
do cromossomo. Os critérios de inclusão foram menos rigorosos, já que todos os
casos
com
concentração
de
espermatozoides
menor
que
15
×
106
espermatozoides/mL foram incluídos.
No Estado de Mato Grosso não é relatado em literatura trabalho semelhante
ao descrito, refletindo a necessidade de expansão de tal atividade e integração
clínica-laboratorial, visto que até o momento os serviços de reprodução humana que
usam técnicas de reprodução assistida não contam com a realização da pesquisa de
microdeleção do cromossomo Y, apenas teste de cariótipo no sangue periférico.
44
7 – CONCLUSÃO
O estudo citogenético e análise molecular de homens inférteis do Estado de
mato Grosso permitiram as seguintes conclusões:
1 - A prevalência de alterações cromossômicas nos pacientes com
oligozoospermia e azoospermia encontrada foi de 5,3% (n=5);
2 - Microdeleção do cromossomo Y foi detectada em 1,1% (n=1) dos
pacientes;
3 – Dos 94 pacientes estudados, 34 tinha oligozoospermia leve, e destes
2,9% (n=1) apresentou cariótipo alterado; 24 eram oligozoospermicos grave e 4,2%
(n=1) com alteração citogenética; dos 28 pacientes azoospermicos 10,7% (n=3)
tinham cariótipo alterado;
4 – O gene SRY foi detectado em todos os pacientes analisados;
5 - Microdeleção do cromossomo Y foi encontrada na região AZFc em 1,1%
(n=1) dos pacientes. Nas regiões AZFa e AZFb não foi encontrado microdeleção, e
6 - As alterações citogenéticas e microdeleção do cromossomo Y foram mais
frequentes à medida que a concentração espermática diminuía, uma vez que nos
pacientes com oligozoospermia leve 2,9% apresentaram análise citogenética
alterada, nos oligozoospérmicos grave a frequência encontrada foi 4,2 e 10,7% nos
azoospérmicos, microdeleção do cromossomo Y foi detectada somente em 1 homem
com azoospermia.
45
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. WHO. Infertility: a tabulation of available data on prevalence of primary and
secondary infertility. Programme on Maternal and Child Health and Family Planning,
Division of Family Health. World Health Organization, Geneva: 1991.
2. Niederberger CS, Meacham RB. Male infertility. Rev Urol. 2003;5(3):200-3.
3. Lunenfeld B, Van Steirteghem A, Bertarelli F. Infertility in the third millennium:
implications for the individual, family and society: condensed meeting report from the
Bertarelli Foundation’s Second Global Conference. Hum Reprod. 2004;10(4):317-6.
4. Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG. International estimates of infertility
prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical
care. Hum Reprod. 2007;22(6):1506-12.
5. Nguyen RH, Wilcox AJ. Terms in reproductive and perinatal epidemiology: I.
Reproductive terms. J Epidemiol Community Health. 2005;59(11):916-9.
6. Daar A, Merali Z. Infertility and social suffering: the case of ART in developing
countries. In: Vayena E, Rowe P, Griffin D, editores. Report of a meeting on “Medical,
ethical, social aspects of assisted reproduction” 2001, Geneva, Switzerland: WHO;
2002.p.16-21.
7. Silva JSA, Utiyama SRR. Principais auto-anticorpos envolvidos na infertilidade
masculina e feminina, com ênfase nos aspectos clínicos e laboratoriais. Rev Bras
Anal Clín. 2005; 37(4): 233-8.
8. Maegawa GHB, Centa LJR. Aspectos genéticos do fator masculino de
infertilidade. Família Saúde e Desenvolvimento. 2000 jan/jun;2(1):7-12.
46
9. Pasqualotto FF, Lucon AM, Sobreiro BP, Pasqualotto EB, Arap S. Effects of
medical herapy, alcohol, smoking and endocrine disruptors on male infertility. Rev
Hosp Clin Fac Med São Paulo. 2004; 59(6):375-2.
10. Morell V. Basic infertility assessment. Prim Care. 1997;24(1):195-204.
11. Evens EM. International Health. A global perspective on infertility: an under
recognized public health issue 2004.18(1):1-45.
12. Illions EH, Valley MT, Kaunitz AM. Infertility – A clinical Guide for the internist.
Med Clin North Am. 1998;82(2):271-95.
13. Akre O, Cnattingius S, Bergström R, Kvist U, Trichopoulos D, Ekbom A.
Reproductive endocrinology. Human fertility does not decline: evidence from
Sweden. Fertil Steril. 1999;71(6):1066-9.
14. Ghazal-Aswad S, Badrinath P, Osman N, Abdul-Khaliq S, Mc Ilvenny S, Sidky I.
Prevalence of Chlamydia trachomatis infection among women in a Middle Eastern
community. BMC Womens Health. 2004; 4(1):27-3.
15. Buck GM, Sever LE, Batt RE, Mendola P. Life-Style factors and female infertility.
Epidemiology. 1997;8(4):435-41.
16. Augood C, Duckitt K, Templeton AA. Smoking and female infertility: a systematic
review and meta-analysis. Hum Reprod. 1998;13(60):1532-9.
17. Dunson DB, Baird DD, Colombo B. Increased infertility with age in men and
women. Obstet Gynecol. 2004;103(1):51-6.
18. Stites DP, Terr AI, Parslow, TG. Imunologia médica. 9ª ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan. 2000;(1): 478-80.
19. Moore KL, Persaud TVN. Embriologia clínica. 8ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier;
2007.
47
20. O'Donnell L, Robertson KM, Jones ME, Simpson ER. Estrogen and
Spermatogenesis. Endocr Rev. 2001;22(3):289-318.
21. Rich-Edwards JW, Spiegelman D, Garland M, Hertzmark E, Hunter DJ, Colditz
GA, et al. Physical activity, body mass index, and ovulatory disorder infertility.
Epidemiology. 2002;13(2):184-90.
22. Seibel M.M. Infertility. 2.ed. New York : Appleton and Lange, 1996.
23. Aitken RJ, Buchinghan DW, Brindle J, Gomez E, Baker HW, Irvine DS. Analysis
of sperm movement in relation to the oxidative stress created by leukocytes in
washed sperm preparations and seminal plasma. Hum Reprod. 1995;10(8):2061-71.
24. Sharpe RM. The roles of estrogens in the male. Trends Endocrinol
Metab.1998;9(9):371-7.
25. Kerr JB. Spontaneous degeneration of germ cells in normal rat testis:
assessment of cell types and frequency during the spermatogenic cycle. J.
Reprod.Fertil. 1992;95(3):825-0.
26. Gooren LJG. Endocrine aspects of ageing in the male. Mol. Cel. Endo.
1998;145(1-2):153-9.
27. Singh J, O’Neill C, Handelsman DJ. Induction of spermatogenesis by androgens
in gonadotropin-deficient (hpg) mice. Endocrinology. 1995; 136(12):5311-21.
28. Krishnamurthy H, Danilovich N, Morales CR, Sairam MR. Qualitative and
quantitative decline in spermatogenesis of the follicle- stimulating hormone receptor
knockout (FORKO) mouse. Biol Reprod, 2000; 62(5):1146-59.
29. França LR, Ogawa T, Avarbock MR, Brinster RL, Russell LD. Germ cell genotype
controls cell cycle during spermatogenesis in the rat. Biol Reprod.1998; 59(6):13717.
48
30. Houillon C. Espermatogênese e Ovogênese. In: Houillon C. Sexualidade. São
Paulo: Edgard Blucher; 2001; (1):17-36.
31. Devoto EC, Madariaga M, Lioi XC. Factores causales de infertilidad masculina.
Contribución del factor endocrino. Rev. Med. Chile. 2000; 128(2): 184-2.
32. Weinbauer GF, Nieschlag E. Hormonal control of spermatogenesis. In: Kretser
DM editor. Molecular Biology of the male reproductive system. 1ª edição. San Diego:
Academic Press; 1993 ;( 1): 99-142.
33. Wassarman PM, Jovine L, Litscher ES. A profile of fertilization in mammals.
Nature. Cell. Biology.2001; 3(2): 59-64.
34. Carrara RCV, Bisinella LF, Mazzucatto MD, Martins ES, Yamasaki R. Somatic
cytogenetic and azoospermia factor gene microdeletion studies in infertile men. Braz
J of Medl Biol Res. 2006; 39(4):555-56.
35. Achermann JC, Ozisik G, Meeks JJ, Jameson JL. Genetic causes of human
reproductive disease. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002; 87(6): 2447-4.
36. Düzcan F, Münevver AG, Ozan C, Bagci H. Cytogenetic studies in patients with
reproductive failure. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003; 82(1):53-6.
37. Huynh T, Mollard R, Trounson A. Selected genetic factors associated with male
infertility. Hum. Reprod. 2002; 8(2):183-98.
38. Visootsak J, Graham JMJ. Klinefelter syndrome and other sex chromosomal
aneuploidies. Orphanet Journal of Rare Disease. 2006; 38(1): 604-17.
39. Thompson MW, Innes RR, Willard HF. Thompson & Thompson-Genética
Médica. 5ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara- Koogan; 1993; (1): 8-14.
40. Smyth CM. Diagnosis and Treatment of Klinefelter’s Syndrome. Hospital
Practice. 2000;34(10):112-16,119-20.
49
41. Tharapel AT, Tharapel SA, Bannerman, RM. Recurrent pregnancy losses and
parentas chromosome abnormalities: a review. British Journal of Obstetrics and
Gynaecology. 1985; 92(9): 899-914.
42. Van AE, Bonduelle M. Cytogenetics of infertile men. Hum Reprod. 1996; 11(4):1–
26.
43. Pınar AK, Nurten ÖAK. Cytogenetic abnormalities detected in patients with nonobstructive azoospermia and severe oligozoospermia. J Assist Reprod Genet. 2010;
27(1):17–21.
44. Cruz, Joana Pereira da: Fatores genéticos na infertilidade masculina. Viana do
Castelo. 24p [dissertação] Universidade do Porto – Faculdade de Medicina, 2010.
45. Gonzalez-Merino E, Hans C, Abramowicz M, Englert Y, Emiliani S. Aneuploidy
study in sperm and preimplantation embryos from nonmosaic 47,XYY men. Fertil
Steril. 2007; 88(3):600-6.
46. Mustacchi Z, Peres S. Genética baseada em evidências- síndromes e heranças.
São Paulo: CID Editora; 2000:520-23.
47. Simpson JL, Elias S, Martin AO. Parental chromosomal rearrangements
associated with repetitive spontaneous abortions. Fertility and Sterility. 1981; 36(5):
584-90.
48. Lissitsina J, Mikelsaar R, Punab M. Cytogenetic analyses in infertile men. Arch
Androl. 2006;52(2):91–5.
49. Varlotta L. Manangement and care of the Newly diagnosed patient with cystic
fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 1998;4(6)311-18.
50. Cooke HJ, Saunders PT. Mouse models of male infertility. Nat. Rev. Genet.
2002; 3(10):790-801.
50
51. Pieri PC, Pereira DH, Glina S, Hallak J, McElreavy K, Moreira-Filho CA. A costeffective screening test for detecting AZF microdeletions on the human Y
chromosome. Genet Test. 2002; 6(3): 185-194.
52. Krausz CY. Chromosome and male infertility. Journal Compilation lackwell
Publishing Ltda Andrologia. 2005; 37(6):219–23.
53. Foresta C, Garolla A, Bartoloni L, Bettella A, Ferlin A.Genetic abnormalities
among severely oligospermic men who are candidates for intracytoplasmic
sperminjection. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90(02):152–6.
54. Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, et al. Sperm morphology,
motility and concentration in fertile and infertile men. N. Engl. J. Med .2001;
345(19):1388-93.
55. Wang WP, Cui YX. Clinical significance and relevant laboratory techniques of
detecting azoospermia factors of the Y chromosome. Zhonghua Nan Ke Xue. 2007;
13(12):1117-20.
56. Repping S, Skaletsky H, Lange J, Silber S,
Veen F, Oates RD,et al.
Recombination between Palindromes P5 and P1 on the Human Y Chromosome
Causes Massive Deletions and Spermatogenic Failure. Am J Hum. Genet. 2002;
71(1): 906-22.
57. Sadeghi-Nejad H, Farrokhi F. Genetics of azoospermia: current knowledge,
clinical implications, and future directions. Part II: Y chromosome microdeletions. Urol
J. 2007; 4(4):192-206.
58. Oehninger S, Franken DR, Sayed E, Barroso G, et al. Sperm function assays
and their predictive value for fertilization outcome in IVF therapy: a meta-analysis.
Hum. Reprod.2000; 6(2):160-8.
59. Silber SJ, Repping S. Transmission of male infertility to future generations:
lessons from the Y chromosome. Human Reproduction. 2002; 3(8):217-29.
51
60. Yen PH, Chon NN and Salido EC. The Human Autosomal gene DAZLA tests
specifity and a candidate for male infertility human male. Genet. 1996; 12(1):201317.
61. Foresta C, E Moro, A Ferlin. Microdeleções do cromossomo Y e alterações da
espermatogênese. Endocr. Ver. 2001; 22(2): 226-39.
62. Wolstenholme J, Burn J. The application of cytogenetic investigation to clinical
practice. In: Rooney, DE, Czepulkowski, BH. Human cytogenetics constitutional
analysis: a practical approach. Oxford: Oxford University Press; 1992. v.1, p. 119156.
63. Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the
nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet. 1976;
34:119-24.
64. World Health Organization. Reproductive, maternal and child health European
regional office. Definitions and indicators in family planning maternal & child health
and reproductive health used in the who regional office for Europe 2001; 1-14.
65. World Health Organization. Reproductive health indicators for global monitoring.
Report of an interagency technical meeting. Second meeting, 2000. Davison of
Reproductive Health 2001, 51p.
66. OMS - Organização Mundial de Saúde. Laboratory manual for the examination of
human semen and semen-cervical mucus interaction. 4th Ed. New York: England
Cambridge. UK, 2010.
67. Bolarine O, Masoud A, Spyros P, Khaldoun S, et al. Accuracy of spermcervical
mucus penetration testes in evaluating sperm motility in semen: a systematic
quantitative review. Hum. Reprod. 2003; 18(5):1037-1046.
68. Branigan EF, Estes MA, Muller CH. Advanced semen analysis: a simple
screening test to predict intrauterine insemination success. Fertil. Steril. 1999;
71(3):547-551.
52
69. Queiroz EK, Waissmann W. Occupational exposure and effects on the male
reproductive system. Cad Saude Publica. 2006; 22(3): 485-93.
70. Zinaman MJ, Brown CC, Selevan SG, Clegg ED. Semen quality and human
fertility: a prospective study with healthy couples. J Androl. 2000; 21(1):145-53.
71. Turek PJ. Practical approaches to the diagnosis and management of male
infertility. Nat Clin Pract Urol. 2005; 2(5):226-38.
72. Reijo R, Lee TY, Salo P, R Alagappan, Brown LG, Rosenberg M, Rozen S, T
Jaffe, Straus D, Hovatta O, et al. . Importância do Estudo das Microdeleções do
Cromossoma Yna Infertilidade Masculina. Acta Urológica. 2004; 21(4): 17-26.
73. Reijo R, Lee TY, Salo P, R Alagappan, Brown LG, Rosenberg M, Rozen S, T
Jaffe, Straus D, Hovatta O, et al. . Diversificada defeitos espermatogênica em
humanos causadas por deleções do cromossomo Y abrangendo um romance gene
da proteína RNA-binding. Nat Genet. 1995; 10(10):383-93.
74. Moorhed OS, PC Nowell, Mellman WJ, Battips DM e DA Hungerford.
Preparações de cromossomos de leucócitos cultivados a partit de sangue periférico
humano. Expi celular. 1960; 20(6): 613-616.
75. Sanchez O, Escobar JI, Yunis, JJ. A simple G Banding technique. Lancet. 1973;
ll: 269.
76. Lahiri DK, Nurnberg Jr. A rapid non-enzimatic method for the preparation of
HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucleic Acids Research. 1991; 1991): 5444.
77. Moraes PF, Gigante LP, Ferrari NA, Mattos ALG. Follow up of infertile couples
for up to ten years. Rev. AMRIGS, Porto Alegre. 2004; 48 (4): 230-34.
78. Pinto HG, Cardoso RM. Infertilidade: aspectos psicológicos, emocionais e
sociais. Climepsi editores, Lisboa. 1998; (1): 95-111.
53
79. Battista N, Rapino C, Di Tommaso M, Bari M, Pasquariello N, Maccarrone
M.Regulation of male fertility by the endocann abinoid system. Mol Cell Endocrinol.
2008; 286(1):S17‐23.
80. Shen HM, Chia SE, Ni ZY, New AL, Lee BL, Ong CN. Detection of oxidative DNA
damage in human sperm and the association with cigarette smoking. Reprod
Toxicol.1997; 11(5):675‐80.
81. Zitzmann M, Rolf C, Nordhoff V, Schräder G, Rickert‐Föhring M, Gassner P,
Behre HM, Greb RR, Kiesel L, Nieschlag E. Male smokers have a decreased
success rate for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril
2003; 79(3):1550‐4.
82. Evans HJ, Fletcher J, Torrance M, Hargreave TB. Sperm abnormalities and
cigarette smoking. Lancet. 1981; 1(8221):627‐9.
83. Kulikauskas V, Blaustein D, Ablin RJ. Cigarette smoking and its possible effects
on sperm. Fertil Steril. 1985; 44(4):526‐8.
84. Chia SE, Ong CN, Tsakok FM. Effects of cigarette smoking on human semen
quality. Arch Androl 1994;33(3):163‐8.
85. Sofikitis N, Miyagawa I, Dimitriadis D, Zavos P, Sikka S, Hellstrom W. Effects of
Smoking on Testicular Function, Semen Quality and Sperm Fertilizing Capacity. J
Urol.1995; 154(3):1030‐4.
86. Shaarawy M, Mahmoud KZ. Endocrine profile and semen characteristics in male
smokers. Fertil Steril. 1982; 38(2):255‐7.
87. Ramlau‐Hansen CH, Thulstrup AM, Aggerholm AS, Jensen MS, Toft G, Bonde
JP. Is smoking a risk factor for decreased semen quality? A cross‐sectional analysis.
Hum Reprod 2007; 22(1):188‐96.
88. Vicdan A, Vicdan K, S Günalp, Kence A, Akarsu C, Isik AZ, et al. Genetic
aspects pf human male infertility: The frequency of chromosomal abnormalities and Y
54
chromosome microdeletion in severe male factor infertility. Eur J Obstet Gynecol
Reprod Biol. 2004; 117 (1):49-54.
89. Samli H, M Solak, Imirzalioglu N, M M Samli. Genetic anomalies deteted in
patients with non-obstructed azoospermia an oligozoospermia. Med J. Kocatepe.
2006; 52(4):263-267.
90. Mark V. Jarvi KA: The genetics of male infertility. The Journal of Urology. 1996;
156(4):1254-56.
91. Palermo GD, Schlegel PN, Sills ES, Veeck LL,Zaninovic N, Menendez S, et al.
Births after intracy-toplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from
men with non mosaic Klinefelter’s syndrome. N Engl J Med. 1998; 338(1):588–90.
92. Smith CM & Bremner WJ Klinefelter Syndrome. Arch Intern Med. 1998;
158:1309-14.
93. Yamamoto Y, Sofikitis N, Kaponis A, Georgiou J,Giannakis D, Mamoulakis C, et
al. Use of a highlysensitive quantitative telomerase assay in intracyto-plasmic sperm
injection programmers for the treat-ment of 47, XXY non-mosaic Klinefelter men.
Androlog. 2002; 34(1):218–26.
94. Ramlau‐Hansen CH, Thulstrup AM, Aggerholm AS, Jensen MS, Toft G, Bonde
JP. Is smoking a risk factor for decreased semen quality? A cross‐sectional analysis.
Hum Reprod. 2007; 22(1):188‐96.
95. Abramsson L, Beckman G. Chromossomal aberrations and male infertility. J
Urol.1982; 128(1):52-3.
96. Shon MA, Mccaroll R, Murray AW. Requiriment of spindle checkpoint for proper
chromosome segregation in budding yeast meiosis. Science. 2000; 289(5477):30003.
97. Slude RG, Mccollum D. The ay meiosis. Science. 2000; 289(5477): 254-55.
55
98. Frohlich O, Po C, Young LG. Organization of the Human Gene Encoding the
Epididymis-Specific EP2 Protein Variants and Its Relationship to Defensin Genes1.
Biol. Reprod.2001; 64(1):1072-79.
99. Zhou CX, Zhang Y-L, Xiao L, Zheng M, Leung KM, Chan MY, Lo, PS Tsang, LL
Wong HY, Ho LS, Chung YW, Chan HC. An epididymis-specific β-defensin is
important for the initiation of sperm. Biol Nature Cell. 2004;6(1):458-64.
100. Slude RG, Mccollum D: The ay meiosis science. 2000; 289(5477): 254-55.
56
9 – ANEXOS
57
10 – APÊNDICE
9.1 – Apêndice 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÃO DO CROMOSSOMO Y NAS REGIÕES
AZFa, AZFb e AZFc EM INDIVÍDUOS COM OLIGOZOOSPERMIA OU
AZOOSPERMIA
Gleice Cristina dos Santos Oliveira (UFMT/UNIC)
Dr. Sebastião Freitas de Medeiros (UFMT)
Dr. Marcial Francis Galera (UNIC)
Com a relativa popularização das técnicas de reprodução assistida muitos homens “inférteis” passaram
a ter a possibilidade de gerar filhos biológicos com utilização de técnicas como a injeção
intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Contudo, ao ultrapassar este bloqueio natural, se a
causa da infertilidade for ordem genética, esses indivíduos podem transmitir aos seus descendentes
masculinos o mesmo tipo de infertilidade.
O presente estudo tem por objetivo a investigação do cromossomo Y em pacientes com
oligozoospermia ou azoospermia através de técnicas de Biologia Molecular.
Para a realização das técnicas serão coletados 10 mL de sangue periférico. Não é necessário jejum. Os
desconfortos decorrentes da punção podem ser: dor e vermelhidão local, considerados sem
complicações na clínica diária.
Os resultados obtidos poderão ser consultados por você a qualquer momento.
Em qualquer etapa do estudo, os profissionais responsáveis estarão à sua disposição para o
esclarecimento de eventuais dúvidas.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para
mim, descrevendo o estudo. Ficaram claros também quais os propósitos do estudo, os procedimentos a
serem realizados, seus riscos, as garantias de confiabilidade e de esclarecimentos permanentes.
Entendo que terei garantia de confiabilidade, ou seja, que apenas dados consolidados serão divulgados
e ninguém além dos pesquisadores terá acesso aos nomes dos pacientes desta pesquisa e que tenho
direito a receber informações adicionais sobre o estudo a qualquer momento, mantendo contato com o
pesquisador principal.
Eu _______________________________________________________, fui informado dos motivos
do estudo, procedimentos que serão realizados, riscos e benefícios da pesquisa. Concordo
voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento,
antes ou durante o mesmo, sem penalidade ou prejuízo.
Compreendo tudo o que me foi explicado sobre o estudo a que se refere este documento e concordo
em participar do mesmo.
_______________________________________
Assinatura do Participante
_______________________________________
Assinatura do Pesquisador Principal
Em caso de necessidade, contate a pesquisadora Gleice Cristina Santos Oliveira pelos telefones (65) 3363-7086 ou
9983-0381 ou na Unidade de Genética Médica e Biologia Molecular do Hospital Geral, situado à Rua 13 de Junho, nº
2101 Centro. CEP: 78016-000
Cuiabá, ______ de _______________________ de 20____.
58
10.2 – Apêndice 2 – Questionário
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MEDICA
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
UNIDADE DE GENÉTICA MÉDICA E BIOLOGIA MOLECULAR UNIC/HGU
PROJETO: ESTUDO DA PREVALÊNCIA DE MICRODELEÇÃO DO CROMOSSOMO Y NAS REGIÕES AZFa,
AZFb e AZFc EM INDIVÍDUOS COM OLIGOZOOSPERMIA OU AZOOSPERMIA
Registro: _______________
Data:__________________
Nome:_____________________________________________________________
Endereço:__________________________________________________________
Telefone de contato:__________________________ e-mail:__________________
Data de nascimento:____________ Naturalidade:__________________________
Profissão:__________________________________________________________
CPF:____________________________ RG:________________ UF:__________
Nome do seu médico(a): ___________________Telefone:___________________
Espermograma:_________________ Resultado:___________________________
Local de realização do exame:__________________________________________
1- Serviço de procedência:
(1) HGU
(2) HUJM (3) outros:__________________
2- Estado civil: (1) solteiro (2) casado
(3) viúvo
(4) separado (5) outros ____
3- Raça: (1) branco (2) negro (3) pardo (4) outros
4- Escolaridade:
(1) Analfabeto
(2) Alfabetizado
(3) Ensino Fundamental(1ª a 4ª série)
(4) Ensino Fundamental(5ª a 8ª série)
____
(5) Ensino médio(2ª grau) incompleto
(6) Ensino médio(2ª grau) completo
(7) Ensino Superior incompleto
(8) Ensino Superior completo
5- Qual a faixa de renda mensal das pessoas que moram em sua casa?____
(1) Até 3 salários-mínimos
(2) De 3 a 10 salários-mínimos
(3) De 10 a 20 salários-mínimos
(4) De 20 a 30 salários-mínimos
(5) mais de 30 salários-mínimos
FATORES DE RISCO
6- Tempo que o casal tem de união?
__________________________________________________________________________________________
7- Tempo de união sem anticoncepção?
__________________________________________________________________________________________
8- Quando foi a primeira vez que procurou auxílio médico após a suspeita de infertilidade?
(1) Logo após o casamento
(2) Após varias tentativas para ter filhos
(3) Na infância
(4) Na adolescência
(5) Na idade adulta
9- Já foi submetido a algum tratamento para ter filho?
(1) Sim
(2) Não
(3) Qual: ____________________________________
10- Na sua atividade profissional você fica ou já ficou exposto ao calor excessivo ou a algum tipo de radiação?
(1) Sim
Qual: _______________________________________
(2) Não
59
11- Já teve caxumba quando era criança?
(1) Sim
(2) Não
12- Já sofreu acidente ou teve algum trauma na região genital?
(1) Sim
Quando? _______________________
(2) Não
13- Teve algum tipo de doença reumática?
(1) Sim
(2) Não
Caso resposta positiva, relate qual o tratamento realizado, quais os medicamentos usados e por quanto
tempo;_____________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
14- Faz uso de algum medicamento?
(1) Sim
Qual/is: ____________________________________________
(2) Não
15- Em sua família tem alguém com história de esterilidade?
(1) sim
Qual o grau de parentesco? ____________________________
(2) não
16- Tem na família indivíduos com alguma doença genética?
(1) Sim
Qual? _____________________________________________
Qual o grau de parentesco? ____________________________
(2) Não
17- Faz uso de cigarro?
(1) Sim
Quantos cigarro consome por dia? _______________________
Quanto tempo faz que fuma? ___________________________
(2) Não
(3) Já fez uso. Mas parou desde _______________________________________
18- Usa algum tipo de droga ilícita?
(1) Sim
Qual? ______________________________________________
Usa há quanto tempo? _________________________________
Faz uso com que freqüência? ___________________________
(2) Não
(3) Já fez uso
Qual substância? _____________________________________
Parou há quanto tempo?________________________________
19- Faz uso de bebida alcoólica?
(1) Sim
Qual a freqüência?________________ ____________________
(2) Não
20- Já fez exame genético para a pesquisa de infertilidade?
(1) sim
Qual? ______________________________________________
(2) não
(3) Resultado: ______________________________________________________