UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE – UNIVALE IDENTIFICAÇÃO DO TIPO DE MÉTODO UTILIZADO POR LABORATÓRIOS CLÍNICOS DE GOVERNADOR VALADARES-MG PARA CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA SISTEMA ABO-Rh Marcelo Henrique Silva De Souza Governador Valadares – MG Julho 2011 2 Marcelo Henrique Silva De Souza IDENTIFICAÇÃO DO TIPO DE MÉTODO UTILIZADO POR LABORATÓRIOS CLÍNICOS DE GOVERNADOR VALADARES-MG PARA CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA SISTEMA ABO-Rh Monografia apresentada como requisito parcial ao curso de pós-graduação lato sensu em Análises Clínicas e Gestão de Laboratório da Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE Orientadora: Maria José Ferreira Morato Governador Valadares – MG Julho 2011 3 RESUMO Antígenos eritrocitários são substâncias presentes nas membranas dos glóbulos vermelhos, herdados geneticamente. Bioquimicamente, podem ser protéicos ou carboidratos (ligados a lipídios ou proteínas). A administração de sangue no intuito de salvar vidas humanas data das antigas civilizações egípcia, grega e romana. Temos como objetivo identificar qual(is) teste(s) tem sido empregado na rotina laboratorial na cidade de Governador Valadares. Foram consultados laboratórios da referida cidade através de questionário elaborado com questões específicas sobre os testes mencionados neste artigo. O número total de laboratórios consultados foi igual a quatorze, sendo doze (85,7%) empresas privadas e duas públicas (14,3%). Em relação ao método utilizado por estes laboratórios constatamos que apenas quatro (28,6%) utilizam o método de lâmina e cinco (35,7%) realizam suas classificações pelo método de tubos sendo que os demais (35,7%) mesclam seus exames utilizando lâminas e tubos para classificação do sistema ABO-Rh. Através deste estudo pode-se observar que os laboratórios de Governador Valadares, realizam em sua maioria, as classificações sanguíneas da forma preconizada pelos órgãos reguladores. Palavras chaves: classificação sanguínea; métodos tipagem sanguínea; sistema ABO-Rh 4 ABSTRACT Antigens erythrocyte are substances in red cell membranes of red blood cells, genetically inherited. Biochemically, protein or carbohydrates can be (linked to lipids or proteins). The administration of blood in order to save human lives date of the ancient civilizations of Egypt, Greece and Rome. We aim to identify which one (s) test (s) has been used in routine laboratory in the city of Governador Valadares. Laboratories were consulted through a questionnaire that city prepared with specific questions about the tests mentioned in this article. The total number of laboratories found was equal to fourteen, twelve (85.7%) public and two private companies (14.3%). Regarding the method used by these laboratories found that only four (28.6%) use the slide method and five (35.7%) hold their rankings by the method of tubes and the others (35.7%) mixed their tests using slides and tubes for the classification of ABO-Rh. Through this study may be noted that the laboratories of Governador Valadares, perform mostly the classifications of blood as recommended by regulators. Keywords: Classification blood; blood typing methods; ABO-Rh system 5 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 06 2. PROBLEMA DE PESQUISA 09 3. JUSTIFICATIVA 10 4. OBJETIVO 14 5. METODOLOGIA 15 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 16 7. CONCLUSÃO 18 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19 6 1. INTRODUÇÃO Antígenos eritrocitários são substâncias presentes nas membranas dos glóbulos vermelhos, herdados geneticamente. Bioquimicamente, podem ser protéicos ou carboidratos (ligados a lipídios ou proteínas). Já foram reconhecidos e classificados aproximadamente 285 antígenos eritrocitários de importância clínica, divididos em sistemas individualizados, bem como alguns antígenos de alta ou baixa incidência populacional ainda não ligados a sistemas ou coleções.(Vaz, Adelaide J.2007) A administração de sangue no intuito de salvar vidas humanas data das antigas civilizações egípcia, grega e romana. O Sistema ABO foi o primeiro dos grupos sanguíneos descobertos (1900, 1901) no início do século XX em 1900, pelo cientista austríaco Karl Landsteiner. Fazendo reagir amostras de sangue de diversas pessoas, ele isolou os glóbulos vermelhos (hemácias) e fez diferentes combinações entre plasma e hemácias, tendo como resultado a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns casos, e sua ausência em outros. Assim, Landsteiner classificou os seres humanos em três grupos sanguíneos: A, B e O (cuja denominação proveio da expressão "Ohne A, Ohne B", ou seja, "Sem A e Sem B"), e explicou por que algumas pessoas morriam depois de transfusões de sangue e outras não. Landsteiner não previu o grupo AB, mais raro, o qual foi descoberto quando, em 1902, seus colaboradores von Decastello e Sturli o encontraram e descreveram. Em 1930 Landsteiner ganhou o Prêmio Nobel por seu trabalho. (BEIGUELMAN, B.2003) O fator Rh é um dos dois grupos de antígenos eritrocitários de maior importância clínica, estando envolvido nas reações transfusionais hemolíticas e na Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN ou Eritroblastose fetal). Sua determinação, juntamente com a dos antígenos pertencentes ao sistema ABO, no procedimento laboratorial denominado Tipagem sanguínea (ABO e Rh) --- ou simplesmente tipagem sanguínea -- é obrigatória antes de qualquer transfusão sanguínea. Levin e Stone (1939) relataram o caso de um feto natimorto gerado por uma mulher que posteriormente manifestou reação hemolítica transfusional ao receber sangue de seu marido (compatível quanto ao sistema ABO, o único então conhecido). Landsteiner e Wiener (1940) descreveram um anticorpo produzido no soro de coelhos e cobaias, pela imunização com hemácias de Macacus rhesus, que 7 era capaz de aglutinar as hemácias de 85% das amostras obtidas de um grupo de caucasóides americanos. Wiener e Peters (1940) aproximaram as duas observações, determinando tratar-se do mesmo antígeno. O anticorpo produzido no sangue da cobaia foi denominado de anti-Rh. Os indivíduos que apresentavam o fator Rh passaram a ser designados Rh+, o que geneticamente acreditavam corresponder aos genótipos RR ou Rr. Os indivíduos que não apresentam o fator Rh foram designados Rh- e apresentavam o genótipo rr, sendo considerados geneticamente recessivos. (BEIGUELMAN, B.-2003; HENRY, 1999) Define-se um sistema de grupos sanguíneos o conjunto de antígenos formados a partir da expressão de genes alelos de mesmo locus gênico, ou mesmo por um complexo de dois ou mais genes homólogos intimamente ligados. Cada sistema apresenta potencialidade imunogênica característica, variando desde os antígenos que raramente causam problemas clínicos até os que, em caso de transfusão incompatível, podem resultar na morte do paciente. Cada sistema antigênico é também específico, os anticorpos correspondentes se fixam especificamente aos sítios antigênicos determinados por cada grupo correspondente. Dentre estes, há os antígenos denominados públicos (comuns à maioria dos seres humanos) e familiares ou privados (extremamente raros, de ocorrência limitada a grupamentos humanos restritos ou familiares). (Calich, Vera Lúcia-1988) Para alguns destes grupos, os anticorpos são ditos naturais (quando existem no soro da maioria dos seres humanos, sem que estes tenham sido expostos a inoculação dos antígenos correspondentes por via parenteral --- como é o caso do Sistema ABO. Em sua maioria, contudo, os anticorpos só surgem no soro de um determinado indivíduo após inoculação (anticorpos ditos imunes). Considera-se que os anticorpos naturais sejam formados através da imunização por antígenos iguais ou semelhantes presentes em alimentos e microorganismos. Existem importantes diferenças entre os anticorpos naturais e imunes: os anticorpos naturais são geralmente do tipo IgM (de grande tamanho e alto peso molecular), opondo-se aos imunes, que são geralmente do tipo IgG (de baixo peso molecular). Os anticorpos naturais são mais reativos a temperaturas inferiores a 37°C, sendo, portanto designados como anticorpos frios; já os anticorpos imunes têm melhor reatividade a 37°C, sendo ditos anticorpos quentes. 8 In vitro, os anticorpos naturais (Anti-A e Anti-B) geralmente são capazes tanto de sensibilizar as hemácias (produzir combinação dos antígenos eritrocitários com os respectivos anticorpos) --- o chamado primeiro estágio da reação --- como de produzir aglutinação (formação de grumos de hemácias sensibilizadas, com hemólise (destruição de hemácias sensibilizadas) --- o chamado segundo estágio ---, em meio salino. (BEIGUELMAN, B.-2003; HENRY, 1999) Já os anticorpos imunes (anti-Rh) são incapazes de produzir o segundo estágio. Desta forma, os anticorpos naturais são também denominados anticorpos completos ou salinos, ao passo que os imunes se designam como anticorpos incompletos. (BEIGUELMAN, B.-2003; HENRY, 1999) Essa incapacidade desaparece mediante estímulos como a execução da reação com as hemácias suspensas em meio protéico (o mais utilizado é a albumina bovina a 22%). Este fenômeno confere a estes anticorpos a designação de anticorpos albumínicos ou aglutininas albumínicas. Outros métodos de se obter a mesma reação incluem o tratamento prévio das hemácias com enzimas como a papaína, a tripsina, a bromelina ou a ficina, e o tratamento das hemácias com gamaglobulina anti-humana ou prova de Coombs. (Calich, Vera Lúcia-1988) 9 2. PROBLEMA DE PESQUISA Os laboratórios de análises clínicas vêm sofrendo nos últimos anos com a falta de reajustes nas tabelas dos planos de saúde e com isso cada dia mais tentam equacionar seus exames, mantendo a qualidade, para não ficarem no prejuízo. Dentro deste contexto encontra-se o exame de classificação sanguínea (ABO-Rh), teste esse importante pois muitas pessoas o realizam apenas uma vez ao longo da sua vida. Em virtude desta importância os órgãos regulamentadores determinam que o teste deva ser realizado pelo método utilizando tubos de ensaio (gel e microplaca também são aceitos) com diluição prévia da amostra em concentração conhecida. Este método aumenta o custo do exame quando se comparado ao tradicional e muito utilizado "teste na lâmina". 10 3. JUSTIFICATIVA A determinação do grupo sanguíneo ABO era originalmente realizada fazendo-se reagir as hemácias do paciente com soros Anti-A e Anti-B produzidos em laboratório, em lâminas limpas de microscopia. Entretanto, no Brasil, determinou-se pela legislação que as provas de aglutinação não sejam feitas em lâminas, mas sim por métodos mais precisos. Podem ser utilizados os métodos em microplacas escavadas e/ou em tubos de ensaio, ou o método do gel-centrifugação, mais recente. (Ministério da Saúde, RDC n° 153/2004; HENRY, 1999) Para realizar o exame o sangue deve ser coletado por procedimento asséptico aprovado, com ou sem adição de anticoagulante. As amostras coletadas em EDTA ou Heparina devem ser tipadas em até 48 horas. Se a demora para a execução do teste for inevitável, hemácias de sangue coagulado e as colhidas em EDTA ou Heparina devem ser separadas do soro/plasma, lavadas e ressuspendidas em solução preservativa de glóbulos. Estocar a 2° a 8 °C, por no máximo, 20 dias. O sangue coletado em anticoagulante ACD, CPD e CPDA-1 pode ser tipado até a data de expiração, se armazenado entre 2° e 8 °C. O armazenamento prolongado de hemácias antes da execução do teste pode causar deterioração de antígenos e resultar em reações mais fracas. (Ministério da Saúde, RDC n° 153/2004) Na técnica em lâmina deve-se preparar a suspensão de eritrócitos a 10% em solução fisiológica 0,9%. Coloca-se uma gota do reagente (comercial) na lâmina à temperatura ambiente (20º a 25ºC) adicionando uma gota da suspensão de eritrócitos. Deve-se misturar o reagente com a suspensão em uma área de 2 x 2 cm movimentando gentilmente a lâmina para promover a mistura e examinar a presença ou não de aglutinação. Os testes que não apresentarem aglutinação deverão ser observados por 2 minutos e não mais. Não interpretar secagem periférica como aglutinação. Na descrição da técnica em tubo deve-se preparar uma suspensão a 5% das hemácias a serem testadas, em solução fisiológica 0,9%, em seu próprio soro ou plasma. Colocar uma gota de reagente comercial em um tubo devidamente identificado. Acrescentar uma gota da suspensão ao tubo misturando bem o conteúdo. Após este processo, centrifugar por 15 segundos a 3400 rpm ( 900 . 1000g) ou 1 minuto a 1000 rpm (100 . 125g). A calibração adequada das centrífugas é imprescindível para a garantia da qualidade dos resultados. 11 Examinar a ausência de hemólise e ressuspender o botão de hemácias, agitando delicadamente o tubo, observando a presença ou não de aglutinação através de algutinoscópio. Neste método pode-se caracterizar e classificar o tipo de aglutinação em 4+, 3+, 2+, 1+. A pesquisa do RhD deve ser processada das mesmas formas acima explanadas. (Walker Rh, 1993) É preconizada a realização da Prova direta e da Prova reversa, após a centrifugação do sangue a ser testado, separando-se o soro (ou plasma) das hemácias. É recomendada, em todos os métodos, a determinação dos subgrupos de A: A1 e A2. Na prova direta, faz-se reagir uma porção das hemácias (de tipagem desconhecida) com soros anti-A, anti-B e anti-AB. Hemácias que reagem com o soro anti-A são ditas do grupo A, e hemácias que reagem com o soro anti-B são do grupo B. Hemácias do grupo AB reagem com ambos os anti-soros, e hemácias do grupo O não reagem com nenhum dos anti-soros. O soro divalente anti-AB é usado como confirmatório, e somente não reagirá com hemácias do grupo O. O procedimento oposto é feito na prova reversa, em que se faz reagir o soro (de tipagem desconhecida) com hemácias conhecidas dos grupos A e B. Assim, o soro de indivíduos do grupo O reagirá com ambas as hemácias (pois possui ambos os anticorpos); se do grupo A, reagirá apenas com as hemácias B, e se do grupo B, apenas com as hemácias A. O soro do grupo AB não reagirá com nenhuma das hemácias. Esta prova pode ser complementada pelo uso de hemácias conhecidas A1 e A2, o que auxilia na diferenciação destes dois subgrupos e na solução das principais discrepâncias ABO. (American Association of Blood banks, 14th edition, 2002) Caso as provas direta e reversa apresentem resultados de alguma maneira contraditórios (discrepância ABO), deverão ser feitas investigações adicionais para determinação de sua causa, antes da liberação definitiva do resultado do exame. Os antígenos do sistema Rh são de natureza glicoproteica, de grande variabilidade. Com o avançar das pesquisas, o sistema se revelou na prática bem mais complexo do que a tipificação simplesmente em Rh Positivo e Rh negativo. Hoje, conhecem-se mais de 40 antígenos diferentes pertencentes a este sistema. (BEIGUELMAN, B.-2003) 12 A presença de vários fenômenos de expressão incompleta, fraca e/ou parcial dos antígenos, além da síndrome do Rh Null (caracterizada pela ausência total de antígenos do sistema Rh, associada a uma anemia hemolítica compensada e à presença de estomatócitos no sangue periférico) dificulta o estabelecimento de uma teoria única, capaz de explicar todos os fenômenos observados. Duas teorias são atualmente aceitas para explicar a fenomenologia do sistema Rh. A teoria de Fischer-Race (Race, 1944; Race et al, 1944) estabeleceu sua determinação pelos pares de alelos autossômicos D,_, C,c e E,e , resultando em um conjunto de variações genotípicas desde o CCDDEE até o cc _ _ ee , correspondendo cada variação genética a uma expressão antigênica diferente. (o antígeno correspondente ao alelo d do gene D, nunca foi encontrado é considerado inexistente). Esta teoria nunca foi aceita unanimemente. Uma outra teoria, de Wiener, também aceita por alguns autores, propõe que cada um dos alelos determinaria a produção de um aglutinógeno, o qual seria um antígeno de efeitos múltiplos --- capaz de produzir diferentes anticorpos distintos, correspondentes a fatores de antígenos. Existiriam portanto os fatores Rh0, rh´, rh´´, hr´ e hr´´, correspondendo, respectivamente, aos antígenos D, C, E, c e e da teoria de Fisher-Rice. A teoria de Fisher-Race é a mais utilizada na prática, embora tenha-se revelado que nenhuma das duas explica completamente todos os fenômenos observados no sistema Rh. Assim, foi realizada uma correspondência entre as duas teorias, na tentativa de se chegar a uma teoria consensual. Desta maneira, às oito combinações gênicas de Fischer - respectivamente cDe, CDe, cDE, CDE, cde, Cde, cdE e CdE - corresponderiam os alelos de Wiener: R0, R1, R2, Rz, r, r´,r´´, e ry. As combinações dos oito haplótipos de Fischer (ou dos alelos de Wiener) resultariam na formação dos diversos antígenos associados ao sistema Rh. Do ponto de vista prático as duas teorias são equivalentes, sendo a teoria de Fischer-Race de mais fácil memorização(1). Entretanto nenhuma das duas teorias explica todas as mutações existentes, e outras variáveis antigênicas originalmente não previstas, como as variantes Cx, Cw e Ew (e os anticorpos correspondentes) já foram descobertas. Numerosos outros fenômenos muito raros, mas também bastante complexos, resultam em antígenos e aglutinógenos que ainda hoje desafiam a imuno-hematologia. Não existem anticorpos naturais no sistema Rh, sendo os anticorpos presentes apenas nos indivíduos sensibilizados por inoculação prévia. A inoculação pode ocorrer por episódios de transfusão incompatível ou, na mulher, devido à 13 introdução, no sangue materno da mãe Rh negativo, de hemácias provenientes de uma gravidez ou aborto de filho Rh Positivo. Este fato tem duas implicações importantes: Toda mulher Rh negativa grávida de um pai Rh Positivo deve tomar medidas especiais para evitar ser sensibilizada. (BEIGUELMAN, B.-2003; HENRY, 1999) Inexiste, na determinação laboratorial dos antígenos do sistema Rh, prova reversa análoga à praticada no caso do sistema ABO. A presença de antígenos fracos torna desaconselhável a determinação dos antígenos do sistema Rh em lâmina, pois nesta metodologia alguns dos antígenos mais fracos (que deveriam ser classificados como Rh positivos) podem ser incorretamente classificados como Rh negativos. No Brasil, a legislação estabelece como necessária a determinação do fator Rh em microplacas escavadas e/ou através da centrifugação em tubos de ensaio. Nessas metodologias, é obrigatória a investigação dos antígenos Rh fracos (antigamente designados como Du) por meio de incubação a 37°C e com acréscimo de Albumina bovina a 22%, e pela prova de Coombs. É também possível a determinação direta do D fraco pelo método de gelcentrifugação --- também admitido na legislação brasileira. Neste método, o Rh fraco é determinado diretamente através da intensidade de aglutinação, classificada em ausente ou --- se positiva --- em intensidades de (+) até (++++). (BEIGUELMAN, B.2003; HENRY, 1999) Em todos os métodos, é recomendada para os pacientes Rh negativos a determinação dos antígenos C,c e E,e, a qual pode ser executada através do uso de soro poliespecífico "CDE". Isto classifica estes pacientes em Rh Negativo e Rh negativo, CDE Positivo. 14 4. OBJETIVO GERAL Identificar qual(is) teste(s) tem sido empregado na rotina laboratorial na cidade de Governador Valadares, Minas Gerais e se os mesmos estão em acordo com as recomendações sanitárias vigentes. 15 5. METODOLOGIA Foram consultados laboratórios da cidade de Governador Valadares, Minas Gerais, através de questionário (Anexo 1) elaborado com questões específicas sobre os testes mencionados neste artigo. Visitamos os laboratórios para aplicação do referido questionário. Realizou-se uma revisão bibliográfica e as consultas foram feitas através de sites eletrônicos (medline, lilacs, pubmed, scielo, Google acadêmico), informes técnicos e livros. 16 6. RESULTADOS O número total de laboratórios consultados foi igual a quatorze, sendo doze (85,7%) empresas privadas e duas públicas (14,3%) (Gráfico 1). Deste total, nenhum laboratório mantinha vínculo com banco de sangue ou agência transfusional, que requer maior acurácia na classificação sanguínea. Em relação ao método utilizado por estes laboratórios constatamos que apenas quatro (28,6%) utilizam o método de lâmina e cinco (35,7%) realizam suas classificações pelo método de tubos. Demais laboratórios (35,7%) mesclam seus exames utilizando lâminas e tubos para classificação do sistema ABO-Rh, no entanto, nesta pesquisa não foram abordados os critérios de escolha para emprego de cada um dos testes (Gráfico 2). Um dado relevante é o fato de 75% (3 em 4) dos laboratórios que atendem a hospitais já utilizarem método em tubos, promovendo maior garantia para os resultados dos atendimentos neonatais e obstétricos (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Também foi observado que 100% do serviço público consultado (dois laboratórios) utilizavam na sua rotina o método de tubos, independente do atendimento hospitalar promovido por um dos laboratórios. Gráfico 1: Percentual de laboratórios públicos e privados consultados 17 Gráfico 2: Distribuição dos tipos de testes empregados nos laboratórios de Gov. Valadares 18 7. CONCLUSÃO Através deste estudo pode-se observar que os laboratórios de Governador Valadares, mesmo com as dificuldades em se agregar valores aos exames, realizam em sua maioria (71,4%) as classificações sanguíneas da forma preconizada pelos órgãos reguladores. Não foram abordados nesta pesquisa os critérios utilizados pelos laboratórios que utilizam ambos os testes. 19 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. American Association of Blood banks.Technical Manual. Bethesda, Maryland, 14th edition, 2002. 2. BALGIR, R.S, Detection of a Rare Blood Group "Bombay (Oh) Phenotype" Among the Kutia Kondh Primitive Tribe of Orissa, India. Int J Hum Genet, 5(3): (2005) 3. BEIGUELMAN B. Os Sistemas Sanguíneos Eritrocitários. Ribeirão Preto, SP: FUNPEC Editora, 3a Edição, 2003. 4. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa). Sangue e hemoderivados. Legislação. 5. Brasil. Ministério da Saúde. Resolução RDC n° 153/2004, de 14 de junho de 2004. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2004. 6. Calich, Vera Lúcia Garcia, Imunologia básica, Artes médicas, 1988 7. Guidelines for the Blood Transfusion Service H.M.S.O. 8. HENRY, John B, (ed). Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais.: Editora Manole LTDA; 19º edição, 1999. 9. Mollison PL. Blood Transfusion in Clinical Medicine. 7th Edition. Oxford Blackwell Scientific, 1983. 10. Race R.R and Sanger R. Blood Groups in Man, 6th Edition Oxford Blackwell Scientific Publishers,1975. 11. Vaz, Adelaide J. Imunoensaios, Fundamentos e Aplicações, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2007. 12. Walker Rh, ed. Technical Manual. 11th Edition. Bethesda: AABB, 1993. 20 Curso de Pós-graduação em Análises Clínicas e Gestão de Laboratórios – UNIVALE Farmacêutico e pesquisador Marcelo Henrique Silva de Souza CRF-MG: 12.811 A – Identificação: • Município: _____________________________________ • Laboratório: ____________________________________ • Responsável: ____________________________________ B – Questionário: 1. Tipo de empresa: ( ) Privado ( ) Público 2. O laboratório pertence a algum hospital: ( ) SIM ( ) NÃO 3. O laboratório atende algum hospital: ( ) SIM ( ) NÃO 4. O laboratório possui vínculo com banco de sangue ou agência transfusional: ( ) SIM ( ) NÃO 5. Em relação ao exame de Classificação do Sistema ABO qual método utilizado: ( ) Lâmina ( ) Tubos ( ) Outro:___________ Informamos que os resultados desta pesquisa serão publicados em monografia de pós-graduação ou em outro meio de divulgação científica. No entanto, asseguramos a confidencialidade dos nomes dos laboratórios e de seus responsáveis técnicos. SIM, declaro estar de acordo com a divulgação científica dos resultados deste laboratório.