UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ABINADABE JACKSON DE MELO
METAGENÔMICA: BUSCA DE NOVOS GENES ENVOLVIDOS COM A
BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS E SÍNTESE
DE BIOSSURFACTANTES
NATAL – RN
2012
ABINADABE JACKSON DE MELO
METAGENÔMICA: BUSCA DE NOVOS GENES ENVOLVIDOS COM A
BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS E SÍNTESE
DE BIOSSURFACTANTES
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como requisito para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientador: Prof.ª Dra Lucymara Fassarella Agnez
NATAL – RN
2012
Catalogação da Publicação na Fonte / Bibliotecário Raimundo Muniz de Oliveira
CRB15-429
Melo, Abinadabe Jackson de.
Metagenômica: busca de novos genes envolvidos com a biodegradação
de hidrocarbonetos / Abinadabe Jackson de Melo. – Natal, RN, 2012.
66 f. : il.
Orientadora Lucymara Fassarella Agnez.
.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Ciências
Biológicas.
1. Genômica microbiana – Dissertação 2. Metagenômica – Dissertação. 3. Microrganismo –
Dissertação. 4. Biodegradação. 5. Hidrocarboneto. I. Agnez, Lucymara Fassarella. II. Título.
RN
CDU 575.111:579
A minha família, a pedra
angular da minha vida, que
sempre está presente em todos
os momentos me ensinando a
lutar com muita determinação
pelos meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
 A minha família, especialmente, a meu pai José Cícero de Melo e a minha
mãe Maria Selma dos Santos de Melo, pelas lições e por investirem tudo na
minha formação.
 A minha orientadora professora Dra Lucymara Fassarela por tudo, pela
confiança, pela brilhante orientação, pelos sábios conselhos que levarei para
vida toda.
 Aos “metagenômincos”, Rita, Del, Uaska, Fernanda, Larissa “briba “ André
Fonseca, Fabíola Marques, Sinara Carla, Jéssica Paiva, Edson, Tatiana
Pereira,Bia e Ralfo, pelo espírito de equipe e de união em todos os
momentos. Sem eles eu não conseguiria!
 A família LBMG/LAMA, amigos inenarráveis ! Especialmente a Thayse,
Daniele Maria, Juliana, Julianeee, Fafa, Kellya, Lelinha, Iza, Aninha Sales
Mariènne,Amanda, Isabella (a galega), Déborah, Joana, Jana Dara, Tatiana
Bressel, Ana Paula, Marcos Felipe, Felipe, Gabriel Gralha, Adilson,
Naldo,Leonam Cris, Cecília, Karol Melo, Sara, Paulinho, Jessica Fernanda,
Fanny, Djair, Luiz Sodré, Rai, Daniel Chaves, Fabão, Vivi, Rayssa,Geka e as
professoras Silvia Regina e Katia Scortecci !
 As Dras Viviane Amaral e Keronninn Bessa pelas críticas e sugestões na
banca de qualificação.
 A Dra Magnólia Fernandes Florêncio de Araújo pela participação na banca de
defesa.
 Ao Dr Demetrius A.M Araujo Araújo pela participação na banca de defesa.
 Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ)
pelo apoio financeiro.
 A Deus, sobretudo, a quem devo toda honra e toda glória para todo sempre !
RESUMO
Atividades industriais, derramamentos de petróleo e seus derivados, bem
como a combustão incompleta de combustíveis fósseis têm causado um grande
acúmulo de hidrocarbonetos no meio ambiente. O número de microrganismos no
planeta é estimado em 1030, sendo os procariotos os mais abundantes. Eles
colonizaram diversos ambientes durante milhares de anos, incluindo aqueles
considerados extremos e representam uma fonte inexplorada de diversidade
genética e metabólica com um grande potencial biotecnológico. Sabe-se que muitos
microrganismos possuem vias metabólicas complexas atuando na biodegradação de
hidrocarbonetos derivados de petróleo e, em muitos ecossistemas, existe uma
comunidade autóctone capaz de realizar essa função. A metagenômica tem
revolucionado a Microbiologia permitindo o acesso às comunidades microbianas não
cultiváveis, sendo uma potente ferramenta para elucidação de suas funções
ecológicas, dos perfis metabólicos, bem como para identificação de novas
biomoléculas. Assim, o presente estudo aplicou abordagens metagenômicas não
apenas para seleção funcional de genes envolvidos nos processos de
biodegradação e biossurfactação de hidrocarbonetos derivados do petróleo, mas
também para descrição da composição taxonômica e metabólica de dois
metagenomas de microbiota aquática. Foram analisadas 123.116 (365 ± 118 pb) e
127.563 sequências (352 ± 120 pb) dos metagenomas marinho e estuarino,
respectivamente. Oito clones foram encontrados, sendo quatro envolvidos na
biodegradação de petróleo e quatro capazes de emulsificar querosene, indicando a
habilidade de sintetizar biossurfactantes. Portanto, as análises metagenômicas
realizadas foram eficientes não apenas na busca de bioprodutos de interesse
biotecnológico como também na análise do perfil funcional e taxonômico dos
metagenomas estudados.
Palavras chave: Genômica microbiana. Metagenômica. Microrganismo.
Biodegradação. Hidrocarboneto.
ABSTRACT
Industrial activities, oil spills and its derivatives, as well as the incomplete
combustion of fossil fuels have caused a great accumulation of hydrocarbons in the
environment. The number of microorganisms on the planet is estimated at 10 30 and
prokaryotes the most abundant. They colonized diverse environments for thousands
of years, including those considered extreme and represent an untapped source of
metabolic and genetic diversity with a large biotechnological potential. It is also
known that certain microorganisms have the enzymatic capacity to degrade
petroleum hydrocarbons and, in many ecosystems, there is an indigenous
community capable of performing this function. The metagenomic has revolutionized
the microbiology allowing access uncultured microbial communities, being a powerful
tool for elucidation of their ecological functions and metabolic profiles, as well as for
identification of new biomolecules. Thus, this study applied metagenomic approaches
not only for functional selection of genes involved in biodegradation and
emulsification processes of the petroleum-derived hydrocarbons, but also to
describe the taxonomic and metabolic composition of two metagenomes from aquatic
microbiome. We analyzed 123.116 (365 ± 118 bp) and 127.563 sequences (352 ±
120 bp) of marine and estuarine metagenomes, respectively. Eight clones were
found, four involved in the petroleum biodegradation and four were able to emulsify
kerosene indicating their abilities in biosurfactants synthesis. Therefore, the
metagenomic analyses performed were efficient not only in the search of bioproducts
of biotechnological interest and in the analysis of the functional and taxonomic profile
of the metagenomes studied as well.
Key words: Microbial genomic. Metagenomic.
Microorganism.Biodegradation.Hydrocarbon.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO........................................................................................................
14
1.1
PETRÓLEO: BENEFÍCIOS, IMPACTOS E BIORREMEDIAÇÃO...........................
14
1.2
Biodegradação De Hidrocarbonetos........................................................................
15
1.2.1 GENES E ENZIMAS ENVOLVIDOS COM A BIODEGRADAÇÃO DE
HIDROCARBONETOS POR BACTÉRIAS..............................................................
16
1.3
18
BIOSSURFACTANTES............................................................................................
1.3.1 GENES ENVOLVIDOS COM A SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES
BACTERIANOS.......................................................................................................
20
1.4
METAGENÔMICA: DESCOBERTA DO DESCONHECIDO...................................
21
1.4.1 METAGENÔMICA: ABORDAGEM FUNCIONAL E BASEADA EM SEQUÊNCIA..
23
2
JUSTIFICATIVA.......................................................................................................
26
3
OBJETIVOS.............................................................................................................
27
3.1
GERAIS....................................................................................................................
27
3.2
ESPECÍFICOS.......................................................................................................... 28
4
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 28
4.1
COLETA DAS AMOSTRAS AMBIENTAIS...............................................................
28
4.2
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS...............................................................................
29
4.3
EXTRAÇÃO DO eDNA.............................................................................................
29
4.4
CONSTRUÇÃO DAS BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS......................................
29
4.4.1 TRATAMENTO DAS EXTREMIDADES DOS FRAGMENTOS GERADOS POR
SONICAÇÃO............................................................................................................
30
4.4.2 PURIFICAÇÃO DOS INSERTOS TRATADOS........................................................
30
4.4.3 PREPARAÇÃO DO VETOR PBC SK................................................................
30
4.4.4 CLONAGEM DO EDNA.....................................................................................
31
4.5
SEÇÃO FUNCIONAL.........................................................................................
33
4.5.1 TESTE QUALITATIVO DE BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS....
33
4.5.2 HABILIDADE DE SINTETIZAR BIOSSURFACTANTES...................................
33
4.5.3 CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DOS INSERTOS AMBIENTAIS..................
34
4.6
SEQUENCIAMENTOS....................................................................................... 35
4.7
ANÁLISES DE BIOINFORMÁTICA.................................................................... 36
5
RESULTADOS................................................................................................... 38
5.1
BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS................................................................... 38
5.2
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DAS AMOSTRAS AMBIENTAIS.....................
38
5.3
HABILIDADE DE SINTETIZAR BIOSSURFACTANTES...................................
39
5.4
BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS................................................ 42
5.5
DADOS GERAIS, COMPOSIÇÃO TAXONÔMICA E METABÓLICA DOS
METAGENOMAS...............................................................................................
44
6
DISCUSSÃO......................................................................................................
50
7
CONCLUSÕES..................................................................................................
56
8
REFERÊNCIAS BLIOGRÁFICAS.....................................................................
57
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Esquema mostrando as abordagens metagenômicas: análise
funcional e análise baseada em sequência................................
24
Figura 2.
Esquema resumindo a estratégia usada nesse estudo..............
37
Figura 3.
Teste de emulsificação...............................................................
41
Figura 4.
Teste de confirmação da atividade de biodegradação...............
42
Figura 5.
Curvas de rarefação dos metagenomas EST (azul) e MAR
(vermelho)...................................................................................
Figura 6.
Composição taxonômica relativa (domínio) dos metagenomas
EST e MAR............................................................................
Figura 7.
45
Composição taxonômica (classe) dos metagenomas EST e
MAR.....................................................................................
Figura 9.
45
Composição taxonômica (filo) dos metagenomas EST e
MAR.....................................................................................
Figura 8.
44
Composição
metabólica
(nível
1
do
MG-RAST)
46
dos
metagenomas.............................................................................
47
Figura 10.
Perfil metabólico representado pelo mapa de vias do KEGG..... 48
Figura 11.
Perfil de distribuição de algumas proteínas relacionada à
atividade de biodegradação de hidrocarbonetos (a) e de
alguns genes envolvidos na síntese de biossurfactantes
conhecidos (b)............................................................................
49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Análise físico-química de amostras de água do estuário
jundiaí/potengí (Natal/RN) e da praia de pirangí do norte
(Parnamirim/RN).........................................................................
Tabela 2.
Clones positivos para o teste de emulsificação de
querosene..................................................................................
Tabela 3.
39
Melhores resultados do blastx dos clones positivos para
síntese de biossurfactantes........................................................
Tabela 4.
38
40
Melhores resultados do blastx dos clones positivos para
atividade de biodegradação........................................................ 43
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 PETRÓLEO: BENEFÍCIOS, IMPACTOS E BIORREMEDIAÇÃO
Atividades industriais, derramamentos de petróleo e seus derivados (tais
como gasolina, diesel e querosene), bem como a combustão incompleta de
combustíveis fósseis têm causado um grande acúmulo de hidrocarbonetos no meio
ambiente (SANTOS et al., 2011a).
O petróleo é uma mistura heterogênea de compostos orgânicos, incluindo
hidrocarbonetos alifáticos (n-alcanos), alicíclicos e aromáticos, com pequenas
quantidades de compostos como oxigênio, nitrogênio e enxofre, que variam em
propriedades físicas e composição de acordo com o reservatório de origem (HAMME
et al., 2003).
Em virtude de ainda ser a principal fonte energética do mundo, este recurso
natural é responsável por grandes movimentações financeiras na economia mundial,
gerando emprego e renda para famílias do mundo inteiro. Neste cenário, o Brasil
certamente deverá alcançar uma posição de destaque no ranking dos grandes
produtores a partir da exploração da recentemente descoberta camada pré-sal.
Todavia, como se sabe, a utilização em larga escala desse recurso gera
impactos ambientais decorrentes da poluição dos solos, aquíferos, mares e da
atmosfera proveniente da alta produção, distribuição e consumo dos derivados do
petróleo. Aproximadamente 0,08 – 0,4% da produção mundial de petróleo acabam
chegando aos oceanos (BARTHA et al., 1986) gerando, sobretudo, impactos
ecológicos a ecossistemas marinhos e terrestres (SANTOS et al., 2011b).
Para minimizar os danos, estratégias visando à contenção e remoção do
contaminante livre ou dissolvido vêm sendo aplicadas na remediação de áreas
contaminadas.
Vários
métodos
podem
ser
empregados
para
remover
hidrocarbonetos do solo e de água subterrânea, tais como extração a vapor do solo,
bombeamento e biorremediação (MARIANO, 2006). Tratamentos físicos separam os
contaminantes do solo sem destruí-los ou modificá-los quimicamente, mas
apresentam muitas limitações, destacando-se o alto custo e eficiência relativamente
baixa. Processos biológicos, por outro lado, são alternativas promissoras para
15
remover esses contaminantes, principalmente devido à simplicidade e eficiência de
custo quando comparados a outros métodos tradicionais (ALEXANDER, 1994 apud
MARIANO, 2006). Microrganismos podem degradar ou produzir hidrocarbonetos
dependendo da presença de vias metabólicas específicas para cada função em
certas condições ambientais (PEIXOTO et al., 2011).
Biorremediação pode ser considerada como uma nova tecnologia para tratar
locais contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de modificar ou
decompor poluentes alvos. Estratégias de biorremediação incluem: a utilização de
microrganismos autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de
tecnologias ativas de remediação (biorremediação intrínseca ou natural); a adição de
agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestimulação);
e a inoculação de consórcios microbianos enriquecidos (bioaumento) (BENTO et al.,
2003). O benefício desses processos é a mineralização do poluente e a
transformação em gás carbônico, água e biomassa. Assim, a biorremediação é
bastante pertinente, já que é natural e seus produtos finais não apresentam riscos
ao meio ambiente.
1.2 BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Muitos microrganismos possuem a capacidade de degradar hidrocarbonetos
derivados de petróleo e, em muitos ecossistemas, existe uma comunidade autóctone
de microrganismos capazes de realizar essa função, os quais são denominados de
hidrocarbonoclásticos (KATAOKA, 2001 apud MARIANO, 2006). Alguns degradam
alcanos, compostos aromáticos, e outros degradam tanto hidrocarbonetos
parafínicos quanto os aromáticos (ATLAS, 1995).
Alcanos na faixa de C10 e C26 são vistos como os mais facilmente
degradados, porém aromáticos de baixo peso molecular tais como benzeno, tolueno
e xileno, que estão entre os compostos tóxicos encontrados no petróleo, são
também muito facilmente biodegradados por diversos microrganismos marinhos
(ATLAS, 1995).
Os primeiros estudos da utilização de hidrocarbonetos por microrganismos
foram realizados por Sohnger e Kaserer em 1906. Em 1913, Sohnger relatou que
16
gasolina, querosene, parafina e óleo de parafina poderiam ser oxidados a gás
carbônico, água e traços de ácidos orgânicos por microrganismos, esses pertenciam
principalmente aos gêneros Mycobacterium e Pseudomonas (BUSHNELL e HAAS,
1941). Posteriormente, as seguintes espécies de bactérias estudadas pelos métodos
tradicionais da microbiologia como Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Bacillus sp.,
Escherichia coli, Flavobacterium sp., Klebsiella cepacia, Micrococcus luteus,
Moraxella phenylpiruvica, Nocardia sp., Ochrobactrum anthropi, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas sp., Proteus mirabilis, Vibrio sp., Rhodococcus sp.,
Streptomyces sp., Vibrio fisheri e Xanthomonas maltophilia, foram identificadas
como hicrocarbonoclásticas (SORKHOH et al., 1990; AL-HADHRAMI et al., 1995).
De modo geral, vazamentos de petróleo provocam um aumento
na
atividade e abundância de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos no
local, proporcionando uma alteração na estrutura das comunidades, além de afetar
a função e a integridade do ecossistema (EL-TARABILY, 2002; BRADDOCK et al.,
1996; ATLAS, 1995). A proporção de microrganismos degradadores aumenta de
menos de 1%, em ambientes marinhos não contaminados, para mais de 10%, em
ambientes marinhos contaminados (ATLAS, 1981).
Assim, mudanças na riqueza, diversidade e padrões estruturais das
comunidades microbianas refletem alterações ambientais, que podem ser utilizadas
estrategicamente tanto no monitoramento de impactos quanto como bioindicadores
para biorremediação.
1.2.1 GENES E ENZIMAS ENVOLVIDOS COM A BIODEGRADAÇÃO DE
HIDROCARBONETOS POR BACTÉRIAS
A biodegradação dos inúmeros componentes de petróleo ocorre sob
diferentes condições ambientais (aeróbica ou anaeróbica em variados pHs e
salinidades), graças a uma miríade de enzimas e vias metabólicas (PEIXOTO et al.,
2011). A degradação anaeróbica é catalisada por bactérias anaeróbicas tais como
as bactérias redutoras de sulfato, usando diferentes aceptores finais de elétrons
como nitrato, sulfato e ferro (III) (HAMME et al., 2003). No metabolismo anaeróbico,
geralmente os compostos são convertidos a benzoil-CoA, que é alvo da enzima
17
benzoil-CoA redutase (BCR). Vale ressaltar, que esse tipo de degradação é
fundamental em processos de biorremediação onde a disponibilidade de oxigênio é
bastante limitada como em mangues e aquíferos, por exemplo. (SANTOS et al.,
2011a).
Os genes envolvidos nos processos de degradação de compostos orgânicos
estão não apenas localizados em cromossomos, mas em diferentes plasmídeos,
transposons e elementos genéticos integrativos, cujo embaralhamento e fenômenos
de transferência horizontal têm levado a evolução de novas vias degradativas
(PHALE et al., 2007). A base genética e bioquímica da biodegradação de alifáticos
saturados (alcanos), hidrocarbonetos aromáticos e policíclicos aromáticos são as
mais estudadas. Os aspectos fundamentais do metabolismo de n-alcanos e os
genes envolvidos são conhecidos há muito. A via de degradação desse composto
extensivamente caracterizada é codificada pelo plasmídeo OCT de Pseudomonas
oleovorans (VAN BEILEN et al.,1994).
Os principais genes, as vias metabólicas envolvidos na degradação aeróbica
de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, bem como um modelo para o
metabolismo de alcano, incluindo a localização das proteínas ALK e a regulação dos
genes alk foram revisados por Van Beilen et al
(2001). De acordo com esse
trabalho, o operon alkBFGHJKL codifica as enzimas necessárias para conversão de
alcanos a acetil-coenzima A (CoA), ao passo que alkST codifica uma rubredoxin
redutase (ALKT) e um regulador positivo do operon alkBFGHJKL (ALKS).
O catabolismo aeróbico de hidrocarbonetos é mais rápido em virtude da
vantagem metabólica de ter oxigênio (O2) como aceptor de elétron (CAO et al.,
2009). Hidrocarbonetos aromáticos tais como benzeno, tolueno, xileno e naftaleno
podem ser degradados nessas condições. A degradação desses compostos
normalmente serve como etapa inicial na formação de catecol, que uma vez
formado, pode ser consumido gerando compostos que entram no ciclo do ácido
cítrico sendo completamente degradados a CO2 (PEIXOTO et al., 2011).
A hidroxilação de um grupo alquil catalisada por oxigenases é normalmente
a primeira etapa na degradação de compostos orgânicos. Há diversos tipos de
hidroxilases de grupo alquil, incluindo CYP153, uma enzima da superfamília
18
citocromo p450 (CYP), e alcano hidroxilase (codificada por alkB) (YERGEAU et al.,
2012).
Embora os anéis aromáticos também precisem ser hidroxilados para serem
degradados, a etapa crucial na degradação de hidrocarbonetos aromáticos é a
abertura do anel aromático hidroxilado, que é catalisada por dioxigenases de
clivagem do anel aromático. Existem três tipos dessas dioxigenases: intradiol,
extradiol e gentisato/homogentisato, que podem ser diferenciadas com base em seu
substrato e na posição onde ocorre a fissão do anel em relação aos grupos
hidroxilas (HARAYAMA et al., 1992).
Como aromáticos são componentes reduzidos, aumentando o estado de
oxidação do núcleo aromático, esses compostos ficam mais susceptíveis a
degradação permitindo aos microrganismos usá-los como única fonte de carbono e
energia. Isso só é possível pela incorporação de oxigênio molecular mediante a
participação das oxigenases, visto que o oxigênio, devido a sua estrutura química
peculiar, é de baixa reatividade (HAYAISHI et al., 1955). Mono-oxigenases (tal como
metano mono-oxigenase) introduzem apenas um átomo de oxigênio a um substrato,
ao passo que dioxigenases introduzem dois átomos ao mesmo substrato (PEIXOTO
et al., 2011).
Portanto, enzimas como catecol dioxigenase, benzeno dioxigenase, tolueno
dioxigenase, bifenil dioxigenase, clorobenzeno dioxigenase, naftaleno dioxigenase e
outras, que estão envolvidas na clivagem do anel aromático, são responsáveis pela
capacidade de degradação de compostos aromáticos em um grande número de
espécies bacterianas (BRODERICK, 1999).
1.3 BIOSSURFACTANTES
Durante
degradadores
a
biodegradação
geralmente
de
produzem
hidrocarbonetos,
moléculas
os
adjuvantes
microrganismos
chamadas
de
biossurfactantes. Entretanto, é comum o uso industrial de moléculas sintéticas com
propriedades semelhantes denominadas surfactantes (MULLIGAN, 2005). Em geral,
surfactantes são moléculas anfipáticas que, em solução aquosa, podem reduzir
19
significativamente a tensão superficial por acumular-se na interface e facilitar a
formação de emulsões entre líquidos de diferentes polaridades (MILLER, 1995).
Biossurfactantes são surfactantes naturais (biológicos) sintetizados por
microrganismos, fungos, plantas e animais, incluindo os humanos (CHRISTOFI;
IVSHINA, 2002). Assim como os surfactantes sintéticos, os biológicos também
apresentam uma porção hidrofílica e outra hidrofóbica (apolar). A parte hidrofóbica
constitui-se tipicamente de ácidos graxos de cadeia longa, ao passo que a outra
porção pode ser um carboidrato, aminoácido, peptídeos cíclicos, fosfato, ácido
carboxílico ou um álcool (MULLIGAN, 2005). Eles estão agrupados em glicolipídeos,
lipopeptídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros e componentes
poliméricos (BIERMANN et al., 1987).
Estas moléculas têm sido exploradas para uma variedade de aplicações
industrial e de biorremediação (BODOUR et al., 2003). De uma perspectiva clínica, é
sabido que alguns têm atividade antibiótica (VOLLENBROICH et al., 1997;
BECHARD et al., 1998) e que pelo menos um biossurfactante rhamnolipídio
produzido por Pseudomonas aeruginosa tem um papel na sua patogênese (SINGH
et al., 2000), além de estudos demonstrarem dados que sugerem importante
envolvimento no crescimento e sobrevivência microbiana no ambiente.
Foi demonstrado que a estrutura do biossurfactante tem um efeito na
solubilização e degradação dos n-alcanos (ZANG; MILLER, 1992) e sua presença
pode levar a um aumento na concentração de compostos hidrofóbicos na fase
aquosa, o que é conseguido através da formação de emulsões óleo/água e
consequente solubilização (CHRISTOFI; IVSHINA, 2002). A formação de emulsões
estáveis de petróleo e água por microrganismos pode aumentar a degradação desse
poluente (BREDHOLT et al., 1998). Nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado
que biossurfactantes podem também solubilizar e mobilizar componentes orgânicos
sorvidos no solo (ZANG; MILLER 1992; SCHEIBENBOGEN et al., 1994;
LAFRANCE; LAPOINTE, 1998; PAGE et al., 1999).
Além disso, os biossurfactantes também têm potenciais aplicações na
agricultura, em cosméticos, indústrias farmacêuticas, detergentes, produtos de
cuidado pessoal, processamento de alimentos, indústria têxtil, processamento e
20
tratamento de metais, processamento de papel e indústrias de tintas (BANAT et al.,
2000).
Desse modo, esses compostos biológicos apresentam um enorme potencial
biotecnológico como adjuvantes na biorremediação de áreas afetadas por petróleo e
hidrocarbonetos derivados, uma vez que são menos tóxicos e menos persistentes
do que os surfactantes sintéticos (MULLIGAN, 2005).
1.3.1 GENES ENVOLVIDOS COM A SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES
BACTERIANOS
Estudos de genética molecular e bioquímica da síntese de biossurfactantes
bacterianos
são
melhor
compreendidos para
as espécies de
Bacillus e
Pseudomonas e têm revelado operons, enzimas e as vias metabólicas necessárias
para sua produção. Surfactina, um lipopeptídeo produzido por Bacillus subtilis e
rhamnolipideo, um glicolipídeo produzido por Pseudomonas aeruginosa foram os
primeiros a serem decifrados e são os mais estudados.
Além desses, os genes envolvidos na síntese de outros surfactantes
microbiológicos menos conhecidos tais como viscosina, amphisina, putisolvina,
arthrofactina, alasan, serrawentina, lichenisina e iturina também foram elucidados,
embora mais estudos sejam necessários para uma compreensão mais acurada dos
processos
bioquímicos
e
de
regulação
da
síntese
dessas
biomoléculas
(PALASHPRIYA et al., 2008).
A biossíntese de surfactina, o primeiro e melhor conhecido biossurfactante
de B.subtilis, é catalisada não-ribossomicamente por um complexo multienzimático
peptídeo sintetase mais conhecido como surfactina sintetase e consiste de três
subunidades protéicas: SRFA, SRFB (ou COMA) e SRFC (PALASHPRIYA et al.,
2008). Essa peptídeosintetase é codificada por três ORFs dispostas no operon srfA
(FABRET et al., 1995). A ORF srfaa contem o sítio ativo para adição de Glu, Leu e
D-Leu; srfab tem o sítio ativo para adição de Val, Asp, e D-Leu; ao passo que srfac
para Leu (GALLI et al., 1994), mas codifica também uma tioesterase de motivo tipo
1 responsável pela terminação do peptídeo. Há ainda a ORF srfad que não está
envolvida na sínese de surfactina. Alguns kilobases downstream do operon srfA está
21
o gene sfp, que também é fundamental para síntese desse biossurfactante. SFP é
uma fosfopantenil transferase necessária para ativação da surfactina sintetase
através de modificação pós traducional (LAMBALOT et al., 1996).
Espécies de Pseudomonas são o segundo maior grupo de bactérias
produtoras
de
biossurfactantes,
especificamente
rhamnolipídios.
Durante
o
crescimento de P. aeruginosa as principais moléculas produzidas são monorhamolipídeos e di-rhamnolipídeos através de duas reações sucessivas de
transferência de glicosil, de modo que cada uma é realizada por uma
rhamnosiltransferase diferente (BURGER et al., 1963). Quatro genes denominados
rhla, b, r e i estão dispostos em um operon, transcritos no sentido 5´-rhlabri-3´ e são
suficientes para produção de rhamnolipideo (OCHSNER et al., 1995).
A
síntese
de
mono-ramnolipidios
é
catalisada
pela
enzima
rhamnosiltransferase 1, codificada pelos genes rhla e rhlb. A proteína RHLA, que
reside no periplasma, presumivelmente está envolvida na síntese e/ou transporte de
substratos precursores de rhamnosiltransferase ou na estabilização de RHLB, uma
proteína
citoplasmática
estrutural
(OCHSNER
et
al.,
1994).
Uma
rhamnosiltransferase 2 é codificada pelo gene rhlc, cuja expressão parece ser
coordenadamente regulada com rhla e rhlb pelo mesmo sistema de quorum sensing
que é codificado pelos genes rhlr e rhli (RAHIM et al. 2001).
1.4 METAGENÔMICA: DESCOBERTA DO DESCONHECIDO
O número de microrganismos no planeta é estimado em 1030, sendo os
procariotos os mais abundantes (TURNBAUGH et al., 2008). Eles colonizaram
diversos ambientes durante milhares de anos, incluindo aqueles que, para a maioria
dos organismos, são considerados extremos.
Além de colonizar o ambiente, os microrganismos habitam outros
organismos e são imprescindíveis para manutenção da vida na Terra, visto que são
os principais componentes das cadeias alimentares, participam dos ciclos
biogeoquímicos, mantêm diversas relações simbióticas com organismos superiores
(PEIXOTO et al., 2011) e representam uma fonte inexplorada de diversidade
genética e metabólica com potencial biotecnológico (DANIEL et al., 2011). Todavia,
22
apenas 1% deles pode ser cultivado em laboratório pelos métodos tradicionais
(AMANN et al., 1990).
Nesse contexto, a metagenômica tem revolucionado a Microbiologia abrindo
caminho para o acesso pleno a comunidades microbiológicas de ecossistemas
complexos, tornando-se uma potente ferramenta para exploração da ecologia
(BIDDLE et al., 2008), do perfil metabólico dessas comunidades (DELONG et al.,
2006; TRINGE et al., 2005), bem como para identificação de novas biomoléculas a
partir da construção de bibliotecas contendo DNA de diversas amostras ambientais
tais como solo (HÅRDEMAN et al., 2007; VOGET et al., 2006; WASCHKOWITZ et
al., 2009), sedimentos de superfícies contaminadas (ABULENCIA et al., 2006),
águas subterrâneas (UCHIYAMA et al., 2005), águas superficiais de rios (WU et al.,
2009), geleiras (SIMON et al., 2009), solo do deserto antártico (HEATH et al., 2009),
rúmen de búfalo (DUAN et al., 2009), dentre outros.
O termo metagenoma é derivado do conceito estatístico de meta-análise, o
processo de combinar estatisticamente análises separadas, e genômica, a análise
ampla do material genético de um organismo (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003).
Embora atribua-se a Handelsman et al (1998) a elaboração do termo, este pode ser
adequadamente aplicado para alguns estudos anteriores como o trabalho de
Torsvik et al (1990) que purificaram DNA de uma fração bacteriana isolada do solo;
a pesquisa de Schmidt et al (1991) que, com o intuito de minimizar a seleção de
sequências particulares, caracterizaram sequências de rRNA 16S de uma população
de picoplancton a partir da clonagem direta em fago tendo E. coli como cepa
hospedeira;
e o trabalho de
Healy et al (1995), no qual obtiveram clones
expressando celulase de um ambiente termofílico a partir da montagem das então
denominadas zoobibliotecas.
Sendo assim, a metagenômica consiste na análise, independente de cultivo,
de genomas presentes em dado hábitat (RIESENFELD et al., 2004). Esse excitante
campo de pesquisa vem obtendo significativo progresso nos últimos anos graças
aos avanços não apenas no desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de
última geração, cuja aplicação resultou na criação de grandes bancos de dados
derivados de vários ambientes, tais como solo e mar (SIMON e DANIEL, 2009), mas
também na geração de novos algoritmos, softwares e ferramentas de bioinformática,
23
permitindo análises mais robustas da enorme quantidade de dados gerados, o que
vem abrindo caminho para novas aplicações tais como metagenômica comparativa,
metatranscriptômica e metaproteômica (CHISTOSERDOVA, 2010; SJÖLING et al.,
2008).
Além disso, abordagens metagenômicas são ferramentas plausíveis para o
acesso ao perfil taxonômico e metabólico dos mais variados ambientes, como
também para descoberta de produtos de interesse biotecnológico provenientes da
inexplorada diversidade genética de 99% das espécies de microrganismos, embora
esses não possam ser cultivados pelos métodos padrões da microbiologia (AMANN
et al., 1990).
1.4.1 METAGENÔMICA: ABORDAGEM FUNCIONAL E BASEADA EM SEQUÊNCIA
Estudo de metagenomas podem ser divididos em análise funcional e análise
baseada na sequência (GABOR et al., 2007) (Figura 1). A análise funcional
corresponde à seleção de clones de uma biblioteca metagenômica para um fenótipo
particular como tolerância a elevadas concentrações de sal, produção de antibióticos
e inúmeras atividades enzimáticas específicas, e envolve ainda a identificação da
origem filogenética do DNA clonado (DINSDALE et al., 2008).
A construção de bibliotecas metagenômicas é sempre uma tarefa
desafiadora e laboriosa, pois começa com o isolamento de eDNA (DNA ambiental)
de alta qualidade apropriado para clonagem. A qualidade e quantidade da extração
de eDNA depende das características bióticas e abióticas (propriedades físicoquímicas) da amostra. Por exemplo, um problema relacionado ao isolamento de
DNA diretamente do solo, tipo de amostra mais comum em projetos de metagenoma
funcional, é a possibilidade de co-extração de ácidos húmicos e outros
contaminantes,
tornando
crucial,
passos
de
purificação
mais
eficientes
(RAJENDHRAN; GUNASEKARAN, 2008). Já a extração de DNA de amostras de
águas marinhas normalmente tem baixo rendimento, visto que os microrganismos
estão mais dispersos na coluna d’água (KENNEDY et al., 2010).
Dependendo do tamanho do inserto desejado, bibliotecas metagenômicas
são montadas usando plasmídeos (até 15 Kb), fosmídeos, cosmídeos (ambos até 40
24
Kb), ou cromossomos artificiais de bactérias (>40 Kb) como vetores (SIMON;
DANIEL, 2011). A escolha do vetor depende da qualidade do DNA, dos genes alvos,
e da estratégia de varredura. Bibliotecas contendo pequenos insertos podem ser
aplicadas para identificação de novos biocatalisadores codificados por um só gene
ou por pequenos operons, enquanto bibliotecas de grandes insertos são necessárias
para buscar clusters gênicos maiores, que codificam vias complexas (DANIEL,
2005).
Amostra Ambiental
Extração
de eDNA
Construção de
bibliotecas
metagenômicas
Sequenciamento
de genes
marcadores
filogenéticos
Bioprospecção
Acesso à
diversidade
taxonômica
Sequenciamento
do eDNA
Acesso ao
potencial
metabólico
Figura 1. Esquema mostrando as abordagens metagenômicas: análise funcional e análise baseada
em sequência. Na construção de uma biblioteca metagenômica, o eDNA é extraído da amostra,
fragmentado por processos físicos ou enzimáticos, clonado no vetor escolhido e por fim este é
transformado num hospedeiro (normalmente Escherichia coli). A partir da biblioteca metagenômica
faz-se a bioprospecção por novos genes e biomoléculas. O mesmo DNA metagenômico ainda pode
ser sequenciado para estudos de biodiversidade e do potencial metabólico da microbiota escolhida.
Adaptada de Sleator et al (2008) e Daniel et al (2011).
O passo subsequente à clonagem nos vetores é a transformação num
hospedeiro desejado, sendo as cepas de Escherichia coli as mais usadas em
estudos de metagenoma funcional. Como existem diferenças significativas no modo
de expressão entre diferentes grupos taxonômicos de procariotos e apenas 40% de
atividades enzimáticas podem ser detectados pela clonagem aleatória em E. coli
25
(GABOR et al., 2004) outros hospedeiros, tais como Streptomyces spp (WANG et
al., 2000), Thermus thermophilus (ANGELOV et al., 2009), Sulfolobus solfataricus
(ALBERS et al., 2009) e outras Proteobacterias (CRAIG et al., 2010) têm sido
aplicados para aumentar a faixa de atividades detectáveis nos ensaios funcionais.
Três diferentes tipos de seleção funcional foram descritos na literatura: a)
detecção direta de fenótipos específicos de clones individuais; b) complementação
heteróloga de linhagens hospedeiras ou mutantes; c) expressão gênica induzida
(SIMON; DANIEL, 2009). No primeiro, uma função enzimática pode ser identificada
em clones individuais pela adição do substrato da enzima ao meio de cultura
(proteases, lipases); no segundo linhagens hospedeiras exigem complementação
por genes exógenos para crescimento em condições seletivas, de modo que apenas
clones recombinantes levando o gene alvo e produzindo o correspondente produto
gênico funcional são capazes de crescer (SIMON et al., 2009). A terceira consiste
num sistema de expressão gênica induzida pelo substrato para identificação de
novos genes catabólicos (UCHIYAMA et al., 2005).
A análise baseada na sequência consiste tanto no sequenciamento completo
de clones contendo âncoras filogenéticas como o gene 16S rRNA e o gene de
reparo de DNA radA , que indicam o grupo taxonômico e informação funcional dos
organismos dos quais derivaram tais clones (SINGH et al., 2009), quanto no
sequenciamento aleatório de todo metagenoma para buscar âncoras filogenéticas
em genomas reconstruídos (RIESENFELD et al., 2004; HOFF et al., 2008).
A principal desvantagem em relação à abordagem funcional é a limitação
quanto à identificação de apenas novos membros de famílias gênicas conhecidas.
Em geral, genes alvos são identificados por primers aplicados em abordagens
envolvendo hibridização e PCR, ou por sondas derivadas de regiões conservadas de
genes ou produtos gênicos conhecidos (DANIEL, 2005; HANDELSMAN, 2004).
Assim, embora a seleção baseada na sequência não seja a mais indicada
para prospecção de novos genes ou produtos gênicos inteiros, é possível encontrar
novos genes ao sequenciar todo o metagenoma e, a partir de análises de
bioinformática, inferir a função de novos genes a partir daqueles conhecidos
(DANIEL, 2005; HANDELSMAN, 2004), como foi feito para a descoberta de novas
enzimas funcionais tais como quitinase, álcool oxirredutases, diol desidratases, e
26
outras que conferem resistência a antibióticos (SIMON; DANIEL, 2009). A vantagem
dessa estratégia de seleção é a independência da expressão de genes exógenos no
hospedeiro utilizado para construção de uma biblioteca metagenômica (LORENZ et
al., 2002).
Genes novos são um grande desafio a ser vencido, pois se não é observada
similaridade com sequências já descritas, em geral não tem sido possível inferir
funções. Apesar da análise funcional ser a mais indicada para identificação de
clones que expressem um fenótipo particular, seguida da caracterização genética e
bioquímica, a análise do perfil taxonômico e metabólico do metagenoma como todo
permite uma melhor compreensão de fenômenos. Desta forma, análises baseadas
em função e em sequência se complementam, tornando a pesquisa mais robusta.
2 JUSTIFICATIVA
Diversos estudos têm identificado novos produtos gênicos a partir da
abordagem de seleção funcional, dentre eles citam-se: esterase/lipase (HENNE et
al., 2000), protease (GUPTA et al., 2002), álcool oxidoredutase (KNIETSCH et al.,
2003), celulase (REES et al, 2003), dehidratase (KNIETSCH et al., 2003b), amidase
(GABOR et al., 2004), amilase e β-lactamase (GABOR, 2004), poliphenol oxidase
(BELOQUI et al., 2006) endoglucanase (PANG et al., 2009), lipase termoestável
alcalina (MEILLEUR, 2009), e metaloproteases (WASCHKOWITZ et al., 2009),
novas DNA polimerases (SIMON et al., 2009), genes que conferem resistência ao
estresse salino (KAPARDAR et al., 2010), dentre outros.
Apesar do potencial biotecnológico associado à metagenômica, trabalhos
relativos à identificação de novos genes envolvidos na biodegradação de
hidrocarbonetos e na síntese de biossurfactantes por abordagem metagenômica
ainda são escassos. Desta forma a exploração da diversidade microbiana ambiental
poderá contribuir não somente quanto ao desenvolvimento de estratégias de
biorremediação dos impactos ambientais, mas também quanto à exploração e ao
refinamento de petróleo, recurso natural que ainda é a principal fonte energética
mundial.
27
O Brasil está entre os países autossuficientes em petróleo e a exploração
plena da camada pré-sal recentemente descoberta deverá impulsioná-lo cada vez
mais para as primeiras posições do ranking mundial. No âmbito estadual, no ano de
2010, o Rio Grande do Norte (RN), o maior produtor do petróleo nacional, em terra,
produziu aproximadamente 333,9 milhões de barris (terra) e 185,7 milhões de barris
(mar), tendo 3.569 poços produtores em terra enquanto no mar possui apenas 100
poços (ANP, 2011), consequentemente o estado é também um potente poluidor dos
seus ecossistemas.
Neste contexto, projetos metagenomas que busquem novos genes e
biocatalisadores de interesse biotecnológico voltados para biorremediação são
urgentes, uma vez que a utilização do petróleo com seus impactos ambientais ainda
continuarão por décadas.
3 OBJETIVO
3.1 GERAIS
O presente trabalho tem como objetivos gerais identificar novos genes
envolvidos na biodegradação de hidrocarbonetos e na síntese de biossurfactantes
por seleção funcional em duas bibliotecas metagenômicas de microbiota aquática e,
analisar a composição taxonômica e metabólica de ambos metagenomas.
3.2 ESPECÍFICOS

Construir duas bibliotecas metagenômicas utilizando DNA extraído de
amostras de água de estuário e mar;

Analisar fisico-quimicamente as amostras (pH, temperatura, oxigênio
dissolvido, condutividade / salinidade e metais );

Selecionar clones envolvidos na biodegradação de hidrocarbonetos e/ou
síntese de biosurfactantes;

Sequenciar e analisar in silico os clones selecionados;
28

Analisar comparativamente os perfis taxonômico e metabólico dos
metagenomas;

Identificar nos metagenomas o perfil de distribuição de genes e proteínas
envolvidos
em
biodegradação
de
hidrocarbonetos
e
síntese
de
biossurfactantes.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 COLETA DAS AMOSTRAS AMBIENTAIS
Os pontos de coleta foram o estuário do rio Jundiaí/Potengí – Natal/RN e a
praia de Pirangi do Norte – Parnamirim/RN. O estuário localiza-se no litoral oriental
do RN, entre a praia de Santa Rita (ao norte) e o Parque das Dunas (ao sul)
situando-se na Bacia Potengi (Secretaria de Meio Ambiente e Recursos Hídricos/RN
– SEMARH, 2009). São diversos os tipos de efluentes que o estuário recebe das
mais diversas atividades: indústrias e distritos industriais, imunizadoras, estações de
tratamento de efluentes, carcinicultura e um hospital. Assim, é um ambiente cujos
microrganismos podem apresentar capacidades metabólicas interessantes do ponto
de vista industrial. A praia de Pirangí possui águas tranquilas e transparentes e
situa-se no litoral sul do estado, à aproximadamente 20 km da capital Natal.
Com o auxílio de uma rede de fitoplâncton com malha de 22 µm de
porosidade, foram coletados, em maré alta, 4 L de água superficial filtrada de um
volume total de aproximadamente 200 L nos dois pontos de coleta: No estuário (S
05º 46.921’, W 035º 14.844’) e outro no mar (S 05º 58.856’, W 035º 07, 225’). As
amostras foram mantidas no gelo em frascos âmbar, previamente esterilizados com
uma solução contendo ácido sulfúrico 100% e ácido nítrico 50% (6:1) e depois
autoclavados, até o momento da extração do eDNA no laboratório em um período de
até 24 h.
4.2 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
Os dados de condutividade/salinidade, pH, temperatura e oxigênio dissolvido
foram obtidos em in situ usando um condutivímetro e um pH-metro. As
29
concentrações de nitrito, nitrato, chumbo, cromo, cobre, ferro, níquel e zinco nas
amostras de água foram obtidas por espectrofotometria (Espectrofotômetro Micronal
B572) utilizando o kit Vacu-vials® (CHEMetrics) segundo especificações do
fabricante.
4.3 EXTRAÇÃO DO eDNA
Para extração do eDNA foi utilizado o kit Power Water® DNA Isolation
(MoBio Laboratories), com adaptações. Antes da extração, um gradiente de 0,1 – 1
L das amostras de água foram filtradas em membranas com poro de 0,2 µm
(Millipore) com auxílio de uma bomba a vácuo (Millipore, WP6111560) para
padronização do volume mínimo necessário para extração do eDNA. Logo após, as
membranas contendo toda microbiota aderida foram submetidas aos procedimentos
especificados pelo fabricante do kit. O sucesso da extração foi verificado através de
eletroforese em gel de agarose 0,7%, 80 V, 80 mA e as concentrações dosadas em
espectrofotômetro nanovue 18V DC (GE Healthcare Bio-Sciences AB). No final do
processo, as amostras de eDNA resultante de cada extração foram precipitadas com
1/10 V de glicogênio (20 mg/mL), 1/10 V de NaOAc 3M (pH 5,2) e 2 V de etanol
absoluto, e mantidas por 1 h em freezer - 80 ºC, seguida por centrifugação a 12.100
rpm por 20 min, lavagem dos precipitados com etanol 70%, nova centrifugação a
12.100 rpm por 20 min, secadas em speed vacuum (Eppendorf AG) por 10 min a
temperatura ambiente, eluidas em TE (Tris-HCL pH 8; EDTA pH 8) e estocadas a
- 20 ºC.
4.4 CONSTRUÇÃO DAS BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS
Para construção das bibliotecas metagenômicas foram utilizados ~20 µg de
eDNA de microbiota estuarina e ~15 µg de microbiota marinha. Ambas as amostras
de eDNA foram sonicadas 4 seg, potência 10 (Vibra cell /Sonics) em volume final de
300 µl em TE, para fragmentação.
30
4.4.1 TRATAMENTO DAS EXTREMIDADES DOS FRAGMENTOS GERADOS POR
SONICAÇÃO
Visto que a sonicação é um processo de fragmentação aleatória, antes da
etapa de clonagem, foi necessário tratar as extremidades dos fragmentos de eDNA
com as enzimas T4 DNA Polimerase (Biolabs) e T4 Polinucleotídeo Quinase
(Biolabs), para gerar pontas cegas e fosforilar a extremidade 5’ dos fragmentos,
respectivamente.
Para tanto, na reação de polimerização foi utilizado: 1,5 µg de DNA
sonicado, 1X tampão NEB2 (Biolabs), 0,5 mM de dNTPs, 2 U de enzima T4 DNA
Polimerase (Biolabs) e água ultrapura autoclavada para o volume final de 80 µL. A
reação foi mantida a 12 ºC por 30 min e logo após a 75 ºC por 20 min, em
termociclador, para inativação da enzima. Na reação de fosforilação, foi adicionado
ao mesmo tubo da reação anterior: 1x tampão da quinase (Biolabs), 2 mM de ATP,
10 U de T4 Polinucleotide quinase (Biolabs) e água ultrapura autoclavada para o
volume final de 90 µL. A reação foi incubada por 10 min a 37 ºC e, para inativação
da enzima, foi mantida a 65 ºC por mais 10 min.
4.4.2 PURIFICAÇÃO DOS INSERTOS TRATADOS
Após o tratamento mencionado, foi realizada uma eletroforese em gel de
agarose 0,7%, 27 V, 27 mA, por 24 h, para purificação dos fragmentos na faixa de
1,5 a 2 kb utilizando o kit GFX PCR DNA and Gel Band (Ge Healthcare) de acordo
com as instruções do fabricante. Um nova eletroforese em gel de agarose 0,7%, 80
V, 80 mA, foi feita para confirmação da purificação.
4.4.3 PREPARAÇÃO DO VETOR PBC SK
O vetor de clonagem utilizado neste trabalho foi o plasmídeo
pBC SK
(Stratagene) o qual foi digerido utilizando a enzima EcoRV (Amersham), seguido por
desfosforilação das extremidades do vetor linearizado a fim de diminuir a
probabilidade de recircularização.
31
A reação de digestão consistiu em 20 µg de pBC, 20 U de EcoRV
(Amersham), 1x tampão H
(Amersham) e água ultrapura
autoclavada para o
volume final de 70 µL, sendo mantida por 1 h a 37 ºC. Confirmada a digestão
através de eletroforese em gel de agarose 0,7%, 80 V, 80 mA, foi realizada a reação
de desfosforilação das extremidades do vetor. Para esta reação, 6,5 µg de pBC
digerido foi desfosforilado com 5 U da enzima fosfatase alcalina CIP (Biolabs), 1X
tampão NEB2 (Biolabs) e água ultrapura autoclavada para o volume final de 60 µL,
sendo a reação mantida por 1 h a 37 ºC.
Posteriormente, foi realizada eletroforese em gel de agarose 0,7%, (20 V, 20
mA, por 24 h) do vetor desfosforilado com o fim de isolar do gel apenas o pBC em
sua forma linear, o que foi feito com o Kit GFX PCR DNA and Gel Band (Ge
Healthcare). Após purificação, uma nova eletroforese em gel de agarose 0,7%
permitiu estimar a concentração do vetor desfosforilado e linearizado.
4.4.4 CLONAGEM DO eDNA
Partindo das concentrações conhecidas de cada amostra de eDNA (65
ng/µL MAR e 70 ng/µL EST ) e do vetor desfosforilado, foi estabelecido o volume
necessário de eDNA para cada reação de ligação seguindo a razão 3:1 (eDNA :
vetor). Assim, foi utilizado 1 µL de vetor, 4U de T4 DNA Ligase (Biolabs), 1X tampão
da Ligase (Biolabs) e água ultrapura autoclavada completando o volume final para
25 µL.
As reações foram mantidas a 16 ºC por 16-18 h e, em seguida, precipitadas
para dessalinização e/ou retirada de impurezas com 1/10 V de glicogênio (20
mg/mL), 1/10 V de NaOAc 3M (pH 5,2) e 2 V de etanol absoluto, e mantidas por 1 h
em freezer - 80 ºC, seguida por centrifugação a 12.100 rpm por 20 min, lavagem
dos precipitados com etanol 70%, nova centrifugação a 12.100 rpm por 20 min e,
então, permitidas secar a temperatura ambiente antes da adição de 15 µL de água
ultrapura autoclavada para ressuspender a ligação precipitada e purificada.
Para inserir o DNA transformante na cepa bacteriana DH10B [F- endA1
recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu) 7697
32
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ-] (GRANT et al.,1990), foi necessário torná-la
eletrocompetente.
Para tanto, ela foi submetida a sucessivas lavagens com água ultrapura e
glicerol 10% gelados. Assim, uma colônia isolada da cepa foi crescida sob agitação
a 37 ºC por 16-18 h em 2 mL de meio de cultura LB (Luria-Bertani) líquido. No dia
seguinte, a cultura foi transferida para erlenmeyer de 2 L contendo 250 mL de meio
LB líquido e mantida a 37 ºC sob agitação de 180 rpm. Obtida a densidade
bacteriana entre 0,6-0,8, a cultura foi então distribuída em tubos de 50 mL, os quais
foram centrifugados a 4 ºC por 15 min a 3.200 rpm. O precipitado obtido foi
ressuspendido em 10 mL de água ultrapura autoclavada gelada e em seguida, o
volume de água foi completado para 45 mL e novamente centrifugado a 4 ºC por 15
min a 3.200 rpm, sendo o processo repetido completando, entretanto, o volume para
25 mL antes de nova centrifugação. O precipitado foi ressuspendido em 5 mL de
glicerol 10% gelado e mais uma vez centrifugado a 4 ºC por 15 min a 3.200 rpm.
Uma alíquota única de 750 μL de glicerol 10% gelado foi utilizada para ressuspender
o precipitado de um dos tubos, sendo a mesma transferida para o tubo seguinte,
ressuspendendo o seu precipitado. O procedimento foi repetido até que os
precipitados de todos os tubos estivessem unidos em um só tubo. Concluído esse
passo, alíquotas de 55 μL foram distribuídas em microtubos previamente resfriados,
e mantidos em freezer - 80 ºC até o momento do uso.
Para a transformação bacteriana, 5 µL de cada reação de ligação foi
adicionado a 55 μL de bactéria competente. A eletroporação foi realizada a 1800 V
(Multiporator, Eppendorf) sendo o volume total ressuspendido em meio líquido LB
previamente resfriado e incubado por 1 h a 37 ºC sob agitação constante de 180
rpm. A seleção dos transformantes foi realizada através de plaqueamento em meio
LB agar suplementado com 25 µg/mL do antibiótico cloranfenicol e 40 µg/mL de Xgal e incubação a 37 ºC por 22 h. As colônias brancas obtidas foram inoculadas em
placas de 96 poços contendo meio LB suplementado com 25 µg/mL de cloranfenicol
por 22 h a 37 ºC sob agitação a 200 rpm para ser feito estoque, em microplacas de
96 poços, com glicerol 50% e mantidas em freezer - 80 ºC.
33
4.5 SELEÇÃO FUNCIONAL
Montadas as bibliotecas metagenômicas, deram-se início aos ensaios
funcionais em busca dos genes de interesse para este estudo, sendo analisada
inicialmente a biblioteca contendo eDNA de microbiota estuarina (EST). Para a
realização dos testes de seleção funcional, as colônias das placas-estoque foram
inoculadas, com o auxílio de um replicador, em placas de 96 poços.
4.5.1 TESTE QUALITATIVO DE BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Para detecção da atividade de biodegradação de hidrocarbonetos do
petróleo, foi realizado teste qualitativo onde 10 µL de cada poço da cultura crescida
em placa de 96 poços foram transferidos para seu poço correspondente em placa de
96 poços (com tampa) contendo em cada um 180 µL de meio LB líquido
suplementado com 25 µg/mL de cloranfenicol, mais uma gota de óleo árabe leve
(OAL), adicionado com auxílio de uma seringa (para aplicação de insulina),
correspondendo a uma alíquota pipetada de ~6 µL de água destilada.
Para confirmação da atividade de biodegradação citada, placas de
poliestireno com 24 poços (com tampa), contendo 100 µL de cultura de cada clone,
1,8 mL de meio LB líquido suplementado com 25 µg/mL de cloranfenicol e uma gota
de óleo árabe leve (OAL), foram utilizadas. Nesse ensaio, DH10B com plasmídeo
vazio (DH10B +pBC Ø) e LB não inoculado foram os controles.
Em ambos os
ensaios, a placa-teste foi incubada em estufa a 30 ºC por 15 dias, fotografada no
primeiro e no décimo quinto dia de incubação.
4.5.2 HABILIDADE DE SINTETIZAR BIOSSURFACTANTES
Os
clones
candidatos
que
apresentaram
indício
de
atividade
de
biodegradação em placas de 96 poços foram avaliados quanto à capacidade de
sintetizar biossurfactantes usando o teste de emulsificação (IQBAL et al., 1995) com
adaptações. Então, para uma varredura preliminar, eles foram inoculados em placas
de 96 poços contendo em cada poço 1 mL de meio YPG (yeast peptone glucose) pH
34
6,5, composto por extrato de levedura 10 g/L, peptona 10 g/L e glicose 10 g/L
(ZEINALI et al., 2007), suplementado com 25 µg/mL de cloranfenicol, e crescidos por
22 horas a 37 ºC a 200 rpm. No dia seguinte, foi realizado o teste tanto com cultura
quanto com o sobrenadante do seguinte modo: em microtubos foi adicionado 0,5 mL
de querosene, 1 mL da cultura ou do sobrenadante livre de células, e para melhor
visualização 20 µL de azul de metileno 0,05%; os tubos foram agitados em vortex
por 30 seg e imediatamente após, fez-se a análise da capacidade de emulsificação
do querosene. SDS 0,1% foi usado como controle positivo e DH10B + pBC Ø foi o
controle negativo.
Os clones candidatos tidos como positivos foram retransformados em
DH10B e submetidos ao mesmo teste de emulsificação a fim de confirmar a
atividade observada. Nesse ensaio, três colônias isoladas dos clones selecionados
foram inoculadas em 2 mL de meio LB suplementado com 25 µg/mL de cloranfenicol
e crescidas por 16-18 h a 37 ºC em 180 rpm. No dia seguinte, 200 µL da cultura foi
transferida para um tubo de ensaio de 50 mL contendo 9,8 mL de YPG, mais 25
µg/mL de cloranfenicol, e permitidos crescer a 37 ºC a 180 rpm até atingirem a
densidade óptica (D.O
600nm)
de 0,4 e 0,8. Na medida em que atingiam as referidas
D.O, 2 mL da cultura ou do sobrenadante foram adicionados nos seus respectivos
tubos de ensaio de 15 mL contendo 2 mL de querosene e 200 µL de azul de
metileno
e logo submetidos a agitação em vortex por 1 min. O índice de
emulsificação (E24%) foi aferido pela razão entre a altura da camada de emulsão e
a altura total do sistema (medidas com paquímetro) multiplicada por 100. SDS 0,1%
e DH10B + pBC Ø foram os controles, como supracitado.
E24% = altura da camada emulsificada x 100
altura total do sistema
4.5.3 CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DOS INSERTOS AMBIENTAIS
O isolamento do DNA plasmideal dos clones positivos foi feito através de
miniprep (SAMBROOK; RUSSELL, 2001). A fim de verificar a presença dos insertos
clonados em pBC SK foi feita dupla digestão como segue: 0,5
µg de DNA
35
plasmideal, 3 U das enzimas XhoI e PstI (Amersham), 1X tampão NEB 2 e água
ultrapura autoclavada para o volume final de 25 µL. A reação foi mantida a 37 ºC por
2 h. Foi realizada eletroforese em gel de agarose 0,7%, 80 V, 80 mA usando o pBC
linear vazio e o marcador de peso molecular 1kb DNA ladder (Invitrogen) como
controles para visualizar a presença dos insertos e seus tamanhos relativos.
4.6 SEQUENCIAMENTOS
Os insertos ambientais dos clones positivos para os testes funcionais foram
sequenciados em ambas as extremidades com os primers T3 e T7, separadamente,
utilizando o sequenciador automático Mega-Bace 1000 e o kit DYEnamic ET dye
terminator (MegabaceTM) (Ge Healthcare). Para a reação, foram utilizados 250 ng
de DNA, 4 µL de ET Kit, 3,2 pMol de primer e água ultrapura autoclavada para o
volume final de 10 µL. A reação constituiu de uma etapa inicial de desnaturação por
2 seg a 95 ºC, seguida por 35 ciclos de 20 seg a 95 ºC para desnaturação, 15 seg
para anelamento a 45 ºC e 1 seg a 60 ºC para extensão.
Em seguida, para retirada de sais e/ou resquícios da reação anterior, foi
realizada reação de precipitação utilizando 1/10 do volume de acetato de amônio 7,5
M, 2,5 V de etanol absoluto. A placa foi agitada em vortex, mantida por 15 min a
temperatura ambiente e centrifugada a 4 ºC, 2.430 rpm por 30 min O sobrenadante
foi descartado por inversão em papel absorvente e o precipitado lavado com 150 µL
de etanol a 70% e a placa centrifugada a 4 ºC por 10 min a 2.430 rpm. A placa
invertida sobre papel absorvente foi brevemente centrifugada até 1.215 rpm e o DNA
no poço foi ressuspendido em 10 µL de tampão de amostra. A placa protegida da
luz, utilizando papel alumínio, foi mantida a 4 ºC por 16 horas, quando, ao final
desse período foi injetada no sequenciador automático Mega-Bace 1000.
Para o pirosequenciamento (Sequenciador 454/Roche) dos metagenomas
desse estudo, alíquotas de eDNA EST (354,1 ng/µL; razão 260/280 de 1,79) e MAR
(240,2 ng/µL; razão 260/280 de 1,60) foram enviadas para o Laboratório Nacional de
Computação Científica – Rio de Janeiro/RJ (LNCC).
36
4.7 ANÁLISES DE BIOINFORMÁTICA
Após montagem dos contigs usando o programa codoncode aligner 3.7.1,
estes foram comparados com sequências de proteínas na base de dados GenBank
não
redundante
utilizando
o
BlastX
do
pacote
BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). As ORFs (preditas no ORF Finder) foram
submetidas ao CLUSTALW para alinhamento com o melhor resultado do blastx de
cada uma. A composição taxonômica e o perfil metabólico dos metagenomas foram
obtidos com o programa MG-RAST 3.0 (MEYER F. et al., 2008) utilizando a
configuração padrão e análises estatísticas feitas com STAMP v.2.0.0 (PARKS e
BEIKO, 2010) desconsiderando as sequências não classificadas e usando “Fisher’s
exact test, two side, DP: Asymptotic - 0,95“. Para verificar a abundância nos
metagenomas tanto de proteínas envolvidas nos processos de biodegradação
quanto de genes conhecidos relacionados à síntese de biossurfactantes, foi feita
uma
busca
no
banco
de
dados
UniProtKB/Swiss-Prot
(http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.htmL) por sequências de referência
curadas; fez-se tblastn contra os metagenomas EST e MAR usando um e-value de
10-5 como ponto de corte e os resultados foram submetidos ao programa HMMER
3.0 (FINN R.D. et al., 2011) para verificação da presença de domínios funcionais.
Por fim, os hits redundantes foram excluídos e os demais contabilizados. A figura 2
apresenta um resumo da metodologia empregada nesse estudo.
37
Figura 2. Esquema resumindo a estratégia usada nesse estudo. Parte do mesmo eDNA usado para
construção das bibliotecas metagenômicas (abordagem funcional) também foi pirosequenciado (454) para
análises comparativas do perfil taxonômico e metabólico dos metagenomas.
38
5 RESULTADOS
5.1 BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS
Foram construídas duas bibliotecas metagenômicas contendo eDNA de
microbiota estuarina (EST) e marinha (MAR). A biblioteca EST é constituída por
1152 clones e a biblioteca MAR com 1344 clones. Os ensaios de seleção funcional
foram realizados apenas com os clones da biblioteca EST.
5.2 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DAS AMOSTRAS AMBIENTAIS
A tabela 1 mostra que os metais cobre, nitrito e níquel apresentaram-se em
quantidade superior aos níveis permitidos pelo CONAMA
em ambas amostras
considerando águas salobras de classe 2 (para EST) e águas salinas de classe 1
(para MAR).
Tabela 1. Análise Físico-química de Amostras de Água do Estuário Jundiaí/Potengí (Natal/RN)
e da Praia de Pirangí do Norte (Parnamirim/RN)
PARÂMETROS
FISICO - QUÍMICOS
UNIDADE
ÁGUAS SALINAS
CLASSE 1*
MAR
ÁGUAS SALINAS
CLASSE 2*
EST
Nitrito
Nitrato
Chumbo
Cromo
Cobre
Ferro
Níquel
Zinco
Oxigênio Dissolvido
pH
Salinidade/Condutividade
Temperatura
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L O2
0-14
MiliS/cm
ºC
0.070
0.400
0.010
0.050
0.005
0.300
0.025
0.090
≥ 6.0
6,5 – 8,5
-
0.900**
0.130
0.000
0.003
0.540**
0.240
0.200**
0.000
6.31
9.0
0π***
28,5
0.200
0.700
0.210
1.100
0.008
0.074
0.120
≥4
6,5 – 9.0
-
0.240**
0.420
0.000
0.000
0.750**
0.300
0.100**
0.000
6,5
9.0
0π***
28
* Valores máximos permitidos pela resolução 357/2005 do CONAMA
** Níveis acima dos permitidos pelo CONAMA.
*** Valor acima da capacidade de leitura do condutivímetro usado.
39
5.3 HABILIDADE DE SINTETIZAR BIOSSURFACTANTES
Os clones candidatos que já haviam apresentado indício de degradação de
OAL também foram submetidos à varredura inicial para identificar uma possível
habilidade de emulsificação, já que os biossurfactantes são moléculas adjuvantes no
processo de biodegradação (CHRISTOFI; IVSHINA, 2002). Do montante testado
quatro clones confirmaram a atividade de emulsificação de querosene em DO 600 nm
0,4 e/ou 0,8. Tanto a cultura quanto o sobrenadante livre de células dos clones
positivos para atividade de síntese de biossurfactantes foram capazes de formar
emulsão com o querosene, mas com diferenças na fase de crescimento bacteriano.
Enquanto os clones 7A4 e 1G12 produziram biossurfactante na fase lag (DO 600 0,4)
e na fase exponencial (DO600 0,8), o clone 3C2 apresentou atividade apenas na fase
exponencial e o clone 6E4 só na fase lag (Tabela 2).
Tabela 2. Clones Positivos para o Teste de Emulsificação de Querosene
TESTE DE EMULSIFICAÇÃO
Cultura
Sobrenadante
(E24 % ± dp)
Clones
DO600 0.4
(E24 % ± dp)
DO600 0.8
DO600 0.4
7A4
__
91,08 % ± 9,4 85,33 % ± 2,8
1G12
86,33 % ± 11,0
3C2
__
6E4
DH10B + pBC Ø
DO600 0.8
91,33 % ± 4,0
89 % ± 7,9
87 % ± 5
__
85,66 % ± 11,0
70,66 % ± 7,5
__
88,66 % ± 2,8
__
74 % ± 11,5
__
53,33 % ± 3,51 52,33 % ± 2,5 55,66 % ± 3,7 58,66 % ± 2,8
SDS 0,1 %
__ = sem atividade.
(E24 %= 99 %)
40
A análise BlastX das sequências dos clones positivos para síntese de
biossurfactantes indicou similaridade a uma proteína hipotética de Magnetococcus
sp. para a sequência do clone 7A4; as sequências codificadas pelos clones 1G12,
3C2 e 6E4 foram similares a mesma proteína hipotética de Candidatus Koribacter
versatilis (Tabela 3). Para inferir uma provável função dessas proteínas hipotéticas
foram feitas buscas por domínios conservados no CDD.
Tabela 3. Melhores Resultados do BLASTX dos Clones Positivos para Síntese
de Biossurfactantes
CLONES
ORF /
TAMANHO
BLASTX
E-VALUE
(Ident.)
CLUSTALW
Identidade
Forte
similaridade
Frame = -3 /
201aa
Proteína hipotética
[Magnetococcus sp.
MC-1]
0.022
(38 %)
5.15 %
3.49 %
7A4
Frame = -3 /
240aa
Proteína hipotética
Acid345_4742
[Candidatus Koribacter
versatilis Ellin345]
2e-22
(41 %)
24.48 %
12.86 %
1G12
Frame = -2 /
172aa
Proteína hipotética
Acid345_4742
[Candidatus Koribacter
versatilis Ellin345]
1e-24
(42 %)
12.86 %
16.49 %
3C2
Frame = -1 /
236aa
Proteína hipotética
Acid345_4742
[Candidatus Koribacter
versatilis Ellin345]
7e-24
(42 %)
25.59 %
11.42 %
6E4
Os resultados mostraram que a sequência do clone 7A4 tem um domínio
NADB (Rossmann-fold NAD(P)H/NAD(P)(+) binding) encontrado geralmente em
dehidrogenases de vias metabólicas tais como glicólise e em outras enzimas redox.
De modo geral, a família de proteínas que compartilham esse domínio possui
também um segundo domínio que é responsável por especificamente ligar-se a um
41
substrato e catalisar uma reação enzimática particular. As proteínas hipotéticas
codificadas pelas sequências dos clones 1G12, 3C2 e 6E4 apresentaram um
domínio de função desconhecida (DUF898), uma grande família de proteínas do
banco de dados Pfam que não foram caracterizadas. Assim, futuros ensaios
funcionais específicos permitirão a caracterização dessas novas proteínas de origem
metagenômica. A figura 3 mostra o ensaio para o teste de emulsificação usado.
SDS 0,1 %
1G12
DHA10B+pBC Ø
A
SDS 0,1 %
DHA10B+pBC Ø
7A4
B
Figura 3. Teste de emulsificação. A) Teste com a cultura do clone 1G12 (DO 600 0.8); B) Teste
com o sobrenadante do clone 7A4 (DO600 0.8). SDS 0,1 % e DH10B são os controles positivo e
negativo, respectivamente.
42
5.4 BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Nos ensaios funcionais para atividade de biodegradação de hidrocarbonetos
de OAL, do total de 1152 clones testados até o momento 14% apresentaram indício
de atividade em placas de 96 poços após 15 dias de incubação a 30 °C, dos quais 4
confirmaram a atividade em placas de 24 poços no mesmo período de incubação.
Como pode ser visto na figura 4.
A)
B)
SDS 0,1 %
1G12
DHA10B+pBC Ø
DH10B +pBC Ø
LB não inoculado
DH10B+pBCØ
5G9
7B9
6B7
5H9
7D6
DH10B+pBCØ
5G9
7B9
6B7
5H9
7D6
LB
3A9
5H10
6C8
6E1
LB
LB
3A9
5H10
6C8
6E1
LB
Clones em duplicata
As setas indicam atividade após 15
dias/30 ºc.
Figura 4. Teste de confirmação da atividade de biodegradação. a) placa no 1º dia do ensaio;
b) placa no 15º dia de incubação e mapa de localização dos clones na placa.
43
A análise por BlastX das sequências dos clones positivos para o teste de
biodegradação de OAL indicou similaridade a um receptor dependente de TonB de
Pseudomonas sp. tanto para o clone 6E1 quanto para o 6B7; já a sequência do
clone 5H9 apresentou similaridade a uma proteína hipotética de Xanthobacter
autotrophicus Py2, e a do 6C8 foi similar ao fator sigma 24 da RNA polimerase de
Roseiflexus castenholzii DSM 13941 (Tabela 4). Não foi encontrada a presença de
domínio na proteína hipotética do clone 5H9. Porém, é possível que novos domínios
que ainda não foram descritos no banco de dados estejam presentes nessa
proteína.
Tabela
4. Melhores
BLASTX dos Clones
Positivos para
Atividade
CLONES
ORF /Resultados doBLASTX
E-VALUE
CLUSTALW
de Biodegradação
TAMANHO
(Ident.)
Identidade
Forte
similaridade
Receptor dependente de
TonB [Pseudomonas
fluorescens PfO -1]
7e-15
(38 %)
5.88%
2.60%
Frame = 2/203aa
Receptor dependente de
TonB [Pseudoalteromonas
sp. BSi20311]
5e-04
(68 %)
6.02%
4.86%
5H9
Frame = 3/201aa
Proteína hipotética
[Xanthobacter
autotrophicus Py2]
5e-19
(75 %)
5.15%
3.49%
6C8
Frame = -2
/237aa
Fator sigma 24 da RNA
polimerase
[Roseiflexus castenholzii
DSM 13941]
14.88%
12.81%
6E1
Frame -1
/136aa
6B7
3e-04
(55 %)
44
5.5 DADOS GERAIS,COMPOSIÇÃO TAXONÔMICA E METABÓLICA DOS
METAGENOMAS.
Após passarem pelo controle de qualidade do MG-RAST, o metagenoma de
microbiota aquática marinha (MAR) ficou com 123.116 sequências (45.000.469 pb)
com uma média de 365 ± 118 pb e média percentual de conteúdo GC de 47 ± 11%,
ao passo que o metagenoma de microbiota aquática estuarina (EST) com 127.563
sequências (44.976.324 pb) com uma média de 352 ± 120 pb e média percentual de
conteúdo GC de
45 ± 10%. Os metagenomas apresentaram uma riqueza de
espécies praticamente idênticas com as curvas tendendo a um plateau como pode
ser obervado na figura 5.
Figura 5. Curvas de rarefação dos metagenomas EST (em azul) e MAR (em vermelho).
Conforme a figura 6, nos dois metagenomas observa-se uma predominância
do domínio Bacteria, seguido por Eukaryota, mais abundante no metagenoma MAR,
Viruses, e Archaea. Porém, nota-se uma elevada proporção de sequências não
assinadas pelo MG-RAST, as quais representam o enorme potencial genético ainda
desconhecido desses ambientes, mas que precisa ser explorado.
45
Valor de p corrigido
Intervalo de confiança 95%
Não assinado
Proporção (%)
Diferença entre as proporções (%)
Figura 6. Composição taxonômica (Domínio) dos metagenomas EST e MAR.
Proteobacteria foi o filo mais abundante em ambos metagenomas, mas com
uma proporção maior no estuário (EST), seguido de Bacteriodetes (mais abundante
em MAR), Actinobacteria (mais frequente em EST), Cyanobacteria (maior em MAR)
e Firmicutes, para o qual não se observa diferença entre as proporções de
sequências correlatas (Figura 7).
Valor de p corrigido
Intervalo de confiança 95%
Não assinado
Proporção (%)
Diferença entre as proporções (%)
Figura 7. Composição taxonômica (Filo) dos metagenomas EST e MAR.
46
Essa predominância de Proteobacteria é refletida também na composição
taxonômica em nível de classes, pois as mais abundantes pertencem a esse filo.
Como mostra a figura 8, Alphaproteobacteria foi a mais frequente, com perfis
praticamente
semelhantes
em
ambos
metagenomas,
seguido
de
Gammaproteobacteria, mais abundante em EST, Flavobacteria, mais frequente em
MAR, Actinobacteria, Betaproteobacteria, essas também mais abundantes em EST,
e Deltaproteobacteria com uma proporção ligeiramente maior em MAR.
Valor de p corrigido
Intervalo de confiança 95%
Não assinado
Não assinado
Proporção (%)
Diferença entre as proporções (%)
Figura 8. Composição taxonômica (Classe) dos metagenomas EST e MAR.
Os perfis metabólicos dos metagenomas EST e MAR em nível 1 do MGRAST são bastante similares com pequenas diferenças em poucas categorias. Por
exemplo, a presença de sequências relacionadas ao metabolismo de compostos
aromáticos, função de interesse nesse estudo, possui praticamente a mesma
proporção nos dois metagenomas como indicado pela figura 9.
47
Intervalo de confiança 95%
Phagos, Prophagos,ElementosTransponíveis e Plasmideos
Carboidratos
Aminoácidos e Derivados
Metabolismo de DNA
Metabolismo de Fósforo
Valor de p corrigido
Metabolismo de RNA
Metabolismo de Compostos Aromáticos
Parede Celular e Cápsula
Metabolismo Secundário
Fotossíntese
Transporte de Membrana
Aquisição e Metabolismo de Ferro
Resposta ao Estresse
Cofatores, Vitaminas, Grupos Prostéticos, Pigmentos
Nucleosídeos e Nucleotídeos
Ácidos Graxos, Lipídeos e Isoprenoides
Proporção (%)
Diferença entre as proporções (%)
Figura 9. Composição metabólica (Nível 1 do MG-RAST) dos metagenomas.
Do mesmo modo, nos perfis representados pelo mapa de vias do KEGG
observa-se que a maioria das vias, destacadas pelas zonas de sobreposição em
rosa, é comum a ambos metagenomas, (Figura 10).
A figura 11 indica que os perfis de distribuição de alguns genes que
codificam proteínas envolvidas na síntese de biossurfactantes conhecidos são
praticamente idênticos para os dois metagenomas. Apenas o gene rhlb do operon
rhlABRI de Pseudomonas sp. esteve presente no metagenoma EST (1,98%). Para
os demais genes desse mesmo operon não houve sequências similares em nenhum
dos metagenomas. Da mesma forma, verifica-se um padrão na distribuição das
proteínas envolvidas nos processos de biodegradação de hidrocarbonetos. Porém,
metano mono-oxigenase (7,21%) e ALKS (0,96%) estão presentes apenas.
48
Figura 10. Perfil metabólico representado pelo mapa de vias do KEGG. Em rosa a sobreposição entre
as amostras, demonstrando a ocorrência de hits similares às proteínas das vias. As áreas realçadas
em azul simbolizam resultados únicos em MAR e em vermelho as vias únicas em EST. (Figura em
paisagem).
49
HITS
A)
HITS
B)
Figura 11. Perfis de distribuição de proteínas relacionada à atividade de biodegradação de
hidrocarbonetos (a) e de genes envolvidos na síntese de biossurfactantes conhecidos (b).
50
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho aplicou abordagens metagenômicas de seleção
funcional para buscar novos genes de interesse biotecnológico envolvidos nos
processos de biodegradação de hidrocarbonetos e de síntese de biossurfactantes, e
abordagens baseadas em sequência para analisar os perfis taxonômico e
metabólico de dois metagenomas de microbiota aquática marinha e estuarina.
Os receptores dependentes de TonB consistem em uma família de proteínas
de membrana externa de bactérias Gram-negativas que atuam no reconhecimento e
internalização de complexos
Fe3+-sideróforos, bem como de grandes moléculas
(>800 Da), tais como a vitamina B12, por transporte ativo (BRAUN et al., 1998). A
biodegradação de hidrocarbonetos realizada por bactérias, um fenômeno importante
para remediação ambiental, requer a captação desses compostos através da
membrana celular sendo a primeira etapa da biodegradação (BERG et al., 2008).
Além de genes codificantes de enzimas, as vias de degradação de
hidrocarbonetos monoaromáticos tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno
(BTEX) incluem genes codificantes de proteínas de membrana externa. Visto que a
membrana externa de bactérias Gram-negativas é envolta por uma camada
lipopolissacarídica hidrofílica (NIKAIDO, 2003), essas proteínas de membrana são
necessárias para facilitar o transporte de compostos hidrofóbicos através da
membrana externa (BERG et al., 2008). Assim, as proteínas metagenômicas dos
clones 6E1 e 6B7 similares a tais receptores (Tabela 4) podem estar atuando na
captação
dos
hidrocarbonetos
tornando-os
substratos
acessíveis
às
vias
metabólicas da cepa de E. coli DH10B.
O reconhecimento dos promotores em Eubacteria é realizado pelo fator de
iniciação sigma (σ), uma subunidade que se liga a RNA polimerase e inicia a
transcrição. As células têm diversos fatores sigmas alternativos que possuem
propriedades de reconhecimento de promotores diferentes. A célula pode fazer
escolhas de seu repertório de fatores sigmas para alterar seu programa
transcricional em resposta a condições específicas de estresse e alterações
morfológicas (GRUBER et al., 2003).
51
A bactéria Gram-negativa E. coli, cujos mecanismos de resposta ao estresse
estão bem elucidados, tem dois compartimentos, o citoplasma e o envelope que
inclui a membrana interna, periplasma e a membrana externa. Sabe-se que sistemas
separados de resposta ao estresse celular atuam em cada compartimento (ALBA et
al., 2003). A regulação da resposta ao estresse de envelope, também chamada de
resposta ao estresse extracitoplasmático, difere da resposta ao estresse
citoplasmático porque os sinais de indução são gerados no envelope. Existem duas
vias de resposta ao estresse de envelope bem estudadas, uma dirigida pelo fator σE
ECF (do inglês extracytoplasmic function) ou fator sigma 24, e a outra pelo sistema
CpxAR (RAIVIO et al., 2001).
O fator σE, codificado pelo gene rpoe de E. coli, é ativado por proteínas
desenoveladas no envelope, bem como por estresse de parede celular, para
transcrever diversos genes envolvidos no restabelecimento da
integridade do
envelope, enzimas que atuam na biossíntese de lipA (um componente de
lipopolisacarídeo ou LPS) e genes codificantes de proteases (ALBA et al., 2003;
LONETTO et al., 1994). Foi mostrado que outro fator sigma 54 (σ54) é crucial para a
expressão
de
várias
vias
catabólícas
codificadas
por
plasmídeos
ou
cromossomicamente tais como aquela para o metabolismo de m-xileno codificada
pelo plasmídeo pWW0 TOL (RAMOS et al., 1997).
Visto que o petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos tóxicos, a
presença do fator σE no clone 6C8 (Tabela 4) pode contribuir para a resposta ao
estresse através da ativação transcricional de genes relacionados não apenas ao
restabelecimento da integridade do envelope, mas também daqueles possivelmente
envolvidos nos processos de biodegradação de hidrocarbonetos.
A capacidade dos sobrenadantes livres de células de emulsificar o
querosene apresentada pelos clones obtidos nesse estudo (Tabela 2) é interessante
do ponto de vista biotecnológico, uma vez que produtos liberados no meio
extracelular simplificam passos de purificação e, portanto, diminui os custos de
produção (ABOUSEOUD et al., 2008). Algumas bactérias e leveduras excretam
biossurfactantes iônicos que emulsificam o substrato de carbono no meio de
crescimento como os ramnolipídios produzidos por diferentes Pseudomonas sp. e
os soforolipídios, produzidos por várias Torulopsis sp (KARANTH, 1999).
52
No entanto, outros microrganismos são capazes de modificar a estrutura da
sua parede celular através da síntese de lipopolissacarídios ou biossurfactantes nãoaniônicos, como por exemplo, Candida lipolytica e C. tropicalis, que produzem
lipopolissacarídios ligados à parede celular quando crescem em n-alcanos, e
Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium sp. e Arthrobacter sp., que sintetizam
o biossurfactante não-aniônico trealose corinomicolatos (KARANTH, 1999). Do
mesmo modo, a formação de emulsão entre a cultura dos clones encontrados nesse
trabalho e o querosene (Tabela 2) indica também uma produção de biossurfactantes
destinados à parede celular.
Embora a habilidade emulsificante seja uma boa avaliação da produção de
biossurfactante ela não é correlacionada com a redução da tensão superficial e viceversa (YOUSSEF et al., 2004). Os biossurfactantes de baixo peso molecular como
glicolipídeos, lipopeptideos e fosfolipídios diminuem eficientemente a tensão
superficial enquanto os polímeros de alto peso molecular são melhores em
estabilizar emulsões (ROSENBERG, 1999). Emulsan, um biossurfactante polimérico
produzido por Acinetobacter calcoaceticus, é um bom bioemulsificante, porém reduz
a tensão superficial para 52 mN/m (ROSENBERG et al., 1979), quando é sabido que
um bom surfactante pode possibilitar a diminuição da tensão superficial da água
destilada de 72 mN/m para 30mN/m (MULLIGAN, 2005). Assim, a avaliação da
tensão superficial trará uma conclusão mais precisa a respeito dos biossurfactantes
produzidos pelos clones metagenômicos.
Nos testes para verificar a habilidade de emulsificação dos clones, os
índices obtidos nesse estudo (Tabela 3) foram superiores ao obtido pela cepa
produtora de biossurfactante Halomonas salaria M27, isolada de sedimento marinho
com histórico de exposição a hidrocarbonetos, a qual apresentou índice de
emulsificação (E24%) de 42.3% em óleo diesel (OLIVERA et al., 2008). Em outro
estudo que visava uma maior produtividade de biossurfactante por Pseudomonas
fluorescens Migula 1895-DSMZ, foram obtidos valores de E24% de 55% para diesel
e querosene, 50% para heptano e 45% para óleo de girassol utilizando diferentes
condições de cultura (ABOUSEOUD et al., 2008).
Foram demonstrados ainda, não apenas o efeito da fonte carbono na
produção de ramnolipidio por Pseudomonas aeruginosa EM1 refletida no índice de
53
emulsificação do querosene que alcançou valores de 9%, quando cultivado em
hexano, a 71%, quando em óleo de soja, glicose ou glicerol (WU et al., 2008), mas
também valores de E24% de 46 a 99% para querosene; 23 a 100% para gasolina e
de 40 a 95% para OAL, sendo esses valores alcançados a partir de um consórcio
bacteriano obtido a partir de amostras de sedimento com histórico de derramamento
de petróleo (KREPSKY et al., 2007).
De modo geral, têm sido relatados valores de E24% similares, bem como
inferiores e superiores aos obtidos nesse trabalho, entretanto, a maioria dos
surfactantes de origem microbiana são específicos, solubilizando ou emulsionando
hidrocarbonetos diferentes de forma distinta (KREPSKY
et al.,
2007;
ABOUSEOUD et al., 2008), o que, por conseguinte, direciona a sua aplicação,
sendo sugerido, portanto, testar os biossurfactantes obtidos pelos clones
metagenômicos em outros substratos além do querosene. Desse modo, posteriores
ensaios de caracterização funcional permitirá um maior esclarecimento de todos os
processos propostos tanto para atividade de biodegradação de hidrocarbonetos
quanto para síntese de novos biossurfactantes.
A análise da composição taxonômica dos metagenomas estudados revelou
a predominância de Proteobacteria (Figura 7), o principal filo do domínio Bacteria
que inclui uma variedade de patógenos, tais como Escherichia, Salmonella, Vibrio,
Helicobacter dentre outros gêneros. Outros gêneros são de vida-livre e responsáveis
pela fixação de nitrogênio. Possuem diversos tipos de metabolismos incluindo
bactérias aeróbias, anaeróbicas facultativas ou obrigatórias, quimioautotróficas e
heterotróficas.
Dentre as classes desse filo, Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria
foram as mais abundantes nos metagenomas analisados, mas a segunda foi
significativamente mais frequente em EST (Figura 8). Alguns Gammaproteobacteria
participam do processo de oxidação de metano,o que pode explicar sua abundancia
no estuário, visto que esse é um ambiente com intensa produção metano.
Hailian et al (2006) estudando a diversidade e distribuição de bactérias
heterotróficas pigmentadas, em águas do oceano pacífico ao sul da china e em um
estuário, usando métodos tradicionais de cultivo e analise de sequencias do gene
16S rRNA, observou uma predominância em águas marinhas de gêneros
54
pertencentes à Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria, enquanto no estuário
foram encontrados isolados bacterianos afiliados principalmente a Actinobacteria e
Firmicutes.
Embora não tenha sido mais abundante em relação aos outros filos, no
presente estudo Actinobacteria também foi mais frequente em EST do que em MAR
(Figura 8). As bactérias desse filo são fundamentalmente saprófitas, e as mais
conhecidas são de solo, onde contribuem significativamente para ciclagem de
polímeros complexos como lignocelulose, hemicelulose, pectin, queratina e quitina, e
produtoras de metabólitos secundários, portanto com elevado valor do ponto de vista
farmacológico e comercial. Porém, há evidencias de que Actinomycetes, um grupo
importante desse filo, pode ser encontrado na água e em sedimento do mar
(MORAN et al.,1995).
Um
estudo
sobre
a
diversidade
e
abundancia
de
comunidades
microbiológicas do mar argentino e do estuário do Rio La Plata usando a técnica de
pirosequenciamento foi realizado por Peressuti et al (2010). Seus resultados
indicaram que Bacteriodetes (Flavobacteria) foi dominante no mar, seguido de
Proteobacteria (Gammaproteobacteria), enquanto no estuário o segundo foi mais
abundante, como foi observado no metagenoma do estuário do Rio Potengí (EST).
Andreote et al (2012), também usou a técnica de pirosequenciamento para
analisar o potencial metabólico e taxonômico de microbiomas de sedimento de
mangues brasileiros e encontrou uma predominância de Deltaproteobacteria e
Gammaproteobacteria, o que corrobora com os dados de Dos Santos et al (2011),
que também usou pirosequenciamento e detectou a predominância desses grupos
em mangues sob condições naturais e após a simulação de um derramamento de
petróleo. Em sedimentos de mangues os organismos relacionados a redução de
sulfato são Deltaproteobacteria, os quais são abundantes indicando a importância de
tal metabolismo nesse ambiente (ANDREOTE et al., 2012)
Abordagens baseadas em sequência permitiu inferir uma semelhança no
perfil de distribuição nos dois metagenomas das proteínas e dos genes elencados.
Isso indica que esses ambientes possuem um potencial metabólico natural parecido
para síntese de biossurfactantes tais como surfactina, para biodegradação de
hidrocarbonetos aromáticos como indicado pela quantidade de sequências similares
55
a benzeno dioxigenase, naftaleno dioxigenase, bifenil dioxigenase, tolueno
dioxigenase, catecol 1,2 dioxigenase, catecol 2,3 dioxigenase e para o metabolismo
de alcanos intermediado pelas alcano-hidroxilases ALKB e CYP153 (Figura 11).
Esses enzimas atuam na clivagem do anel aromático e são responsáveis pela
capacidade de degradação de compostos aromáticos em um grande número de
espécies bacterianas (BRODERICK, 1999).
Como aromáticos são componentes reduzidos, aumentando o estado de
oxidação do núcleo aromático, esses compostos ficam mais susceptíveis a
degradação permitindo aos microrganismos usá-los como única fonte de carbono e
energia. Isso só é possível pela incorporação de oxigênio molecular mediante a
participação das oxigenases (mono e dioxigenases), visto que o oxigênio, devido a
sua estrutura química peculiar, é de baixa reatividade (HAYAISHI et al., 1955).
Um estudo de análise metagenômica de amostras de solos, contaminados e
não contaminados com diesel, do alto ártico canadense também verificou a
abundancia de sequências proteicas de referências de alcanos-hidroxilases (como
CYP153 e ALKB) e dioxigenases tais como catecol 2,3 dioxigenase e
protocatechuato 4,5-dioxigenase (extradiol), além de catecol 1,2 dioxigenase e
protocatechuato 3,4-dioxigenase (intradiol) como um indicativo da atividade de
biodegradação de sua comunidade microbiológica antes desse ambiente ter sido
submetido à tratamento de biorremediação, após um mês do início do tratamento e
após um ano em comparação com a amostra de solo não contaminado usado como
controle (YERGEAU et al., 2012).
Apesar dos perfis metabólicos serem praticamente idênticos, como mostrado
pela composição metabólica de nível 1 do MG-RAST e pelo mapa de vias do KEGG,
(Figuras 9 e 10) foi verificada a presença de sequências similares a metanooxigenase apenas no metagenoma de microbiota estuarina (Figura 11). Isso pode
ser explicado pela produção desse gás decorrente da atividade de decomposição da
matéria
orgânica
característica
do
ecossistema,
revelando
um
potencial
biotecnológico peculiar para novos bioprodutos relacionados ao metabolismo de
metano. A presença em ambos metagenomas de sequências similares aos genes e
ás proteínas conhecidas,mostra também que esses ambientes são uma rica fonte de
56
produtos potencialmente aplicáveis a biorremediação e refino de hidrocarbonetos
derivados do petróleo.
A biodiversidades da microbiota desses ambientes representam o quanto há
de inexplorado em relação aos aspectos ecológicos e biotecnológicos. O que
ressalta a necessidade de mais estudos dessa natureza que poderão permitir novos
insights sobra a dinâmica das comunidades microbianas, cuja variabilidade genética
as torna uma fonte inestimável de bioprodutos biotecnologicamente aplicáveis nas
mais diversas áreas, incluindo-se a biorremediação de ambientes impactados por
hidrocarbonetos derivados do petróleo.
7 CONCLUSÕES

A aplicação de abordagens metagenômicas de seleção funcional foi
eficiente na busca de clones portando sequências de novos genes
envolvidos na biodegradação de hidrocarbonetos e na síntese de
biossurfactantes, visto que oito clones biotecnologicamente promissores
foram encontrados a partir de uma biblioteca de eDNA de microbiota
estuarina.

As
análises
das
sequências
metagenômicas
geradas
por
pirosequenciamento indicaram perfis taxonômicos dos metagenomas
estudados com predominância do domínio Bacteria, representado
principalmente por Proteobacteria, cujas classes Gammmaproteobacteria
e Alphaproteobacteria foram as mais frequentes.

Os perfis metabólicos dos metagenoma estudados foram praticamente
idênticos com uma distribuição parecida de genes e proteínas envolvidos
com a biodegradação de hidrocarbonetos e síntese de biossurfactantes.
57
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