Centro Universitário Fundação Santo André
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
CURSO: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MICROBIOLOGIA
Atividades Práticas
4º ANO
NOME:
Nº:
Profa. Dra. Márcia Zorello Laporta
Profa. Me. Priscila Reina Siliano da Silva
2006
4º
Índice
Normas adotadas no laboratório de Microbiologia ............................................................................ 2
Atividade 1 – Técnica da Coloração de Gram ................................................................................... 3
Atividade 2 – Coloração de Cápsula ................................................................................................ 6
Atividade 3 – Coloração de Esporos ................................................................................................ 8
Atividade 4 – Coloração de BAAR (Método de Zielh-Neelsen) ............................................................ 10
Atividade 5 – Coloração de Espiroqueta........................................................................................... 12
Atividade 6 – Preparo de Meios de Cultura ...................................................................................... 15
Atividade 7 – Técnicas de Inoculação.............................................................................................. 19
Atividade 8 – Leitura dos Experimentos de Semeadura ..................................................................... 27
Atividade 9 – Técnicas de Semeadura em Placa após Diluição ........................................................... 31
Atividade 10 – Técnica de Semeadura em Placa Pour-Plate ............................................................... 33
Atividade 11 – Isolamento e Identificação de Enterobactérias .......................................................... 35
Atividade 12-A – Leitura e Interpretação dos Testes Bioquímicos....................................................... 36
Atividade 12-B – Leitura e Interpretação dos Testes Bioquímicos....................................................... 41
Atividade 13 – Semeadura em Meio Ágar Sangue............................................................................. 43
Atividade 14 – Técnica de Semeadura em Anaerobiose..................................................................... 45
Atividade 15 – Redução do Azul de Metileno.................................................................................... 46
Atividade 16 – Antibiograma .......................................................................................................... 48
Atividade 17 – Ação de Antissépticos sobre Microorganismos ............................................................ 53
Atividade 18 – Conjugação bacteriana............................................................................................. 55
Atividade 19 - Preparação para Estudos Microscópicos de Fungos ..................................................... 56
Atividade 20 – Microcultivo de Fungos ............................................................................................ 58
Atividade 21 – Estudo dos Vírus ..................................................................................................... 61
1
MICROBIOLOGIA
NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas de microbiologia têm como objetivo ensinar ao estudante os princípios e
os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia.
Nessas aulas trabalharemos com uma variedade de bactérias, algumas patogênicas para o
homem. Portanto, é essencial seguir as normas de segurança estabelecidas para um laboratório
de microbiologia, a fim de se evitar contaminação dos estudantes, professores e funcionários.
01. Usar sempre avental.
Não utilizá-lo fora do laboratório, caso tenha sido contaminado acidentalmente.
02. Manter cabelos longos sempre presos.
03. Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática.
Para essa finalidade, utiliza-se álcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos
que poderiam contaminar as culturas na área de trabalho são removidos.
04. Lavar as mãos ao entrar e sair do laboratório e sempre que suspeitar de
contaminação.
05. Não comer, beber, fumar, aplicar cosméticos, mexer em lentes de contato ou colocar
objetos (lápis, dedo etc) na boca. Comer ou fumar são meios eficientes para uma
autocontaminação. Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados
acidentalmente com qualquer microrganismo, comunique imediatamente ao seu professor.
06. Cuidado ao utilizar o bico de gás. Ao acender, verificar se não existem substâncias
inflamáveis por perto. Ao término da aula, desligar corretamente o gás.
07. Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso. A correta flambagem dos
materiais, evita a formação de aerossóis.
08. Não utilizar pipeta sem a devida proteção de algodão. Isso evita que você seja
contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em caldo.
09. Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas etc.) sobre a bancada.
Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que serão dispostos em
cada bancada.
10. Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de trabalho
valioso e deve ser manipulado cuidadosamente.
11. Avisar ao professor em caso de contaminação acidental ou qualquer outro tipo de
acidente.
12. Cada aluno é responsável pelo material que receber.
2
ATIVIDADE 1
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM
INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é uma das principais técnicas utilizadas para a visualização microscópica da
forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactérias. Considerado um método diferencial,
permite classificar as bactérias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as
propriedades tintoriais da célula bacteriana.
MATERIAL
• material retirado da boca
• iogurte
• fermento
Fleischmann
(fermento
Sacharomyces
biológico)
ou
fungo
cerevisae
• culturas bacterianas
• corante para o Gram
• lâminas de vidro
•
•
•
•
•
•
•
alça bacteriológica
cotonetes
violeta genciana
lugol
álcool 95°
fucsina ou safranina
recipiente para a coloração de Gram
PROCEDIMENTO
a) Preparação dos esfregaços:
Para Meios Líquidos (iogurte, fermento em água, cultura bacteriana em caldo).
• Com auxílio da alça de platina estéril, colocar 2 - 3 alíquotas das amostras em meio líquido,
numa lâmina de vidro.
• Espalhar bem sobre a superfície da lâmina, fazendo movimentos circulares.
• Flambar a alça e deixar a lâmina secar à temperatura ambiente.
•
•
•
•
Para Meios Sólidos (culturas bacterianas em placa)
Com auxílio da alça de platina, colocar uma gota de solução salina na superfície de uma
lâmina de vidro.
Flambar a alça, deixar esfriar e colher crescimento bacteriano.
Misturar na gota de solução salina, fazendo uma suspensão homogênea.
Flambar a alça e deixar a lâmina secar a temperatura ambiente.
Para Material Retirado da Boca
• Friccionar a superfície da mucosa oral com um cotonete estéril. Fazer um esfregaço com o
material coletado, na superfície de uma lâmina de vidro, com movimentos circulares.
Deixar secar à temperatura ambiente.
b) Fixação dos Esfregaços
• Quando estiverem secos, os esfregaços são fixados, passando as lâminas 3 vezes pela chama
de um bico de gás.
• Deixar esfriar e corar.
c) Coloração de Gram
• Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante no
recipiente.
• Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto e desprender o corante no recipiente.
• Inclinar a lâmina, gotejar álcool etílico a 95% até que não haja desprendimento de corante.
Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.
3
• Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lâmina. Secar com papel
toalha sem esfregar a lâmina.
• Observar ao microscópio inicialmente ao menor aumento e depois colocar 1 gota de óleo
mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
• Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a forma e
o arranjo das células.
• Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
RESULTADOS
• Desenhe o que você observou
iogurte
fermento
cultura bacteriana em
caldo
cultura bacteriana em placa
material retirado da boca
• Complete a tabela abaixo.
Material
iogurte
Morfologia
Arranjo
Gram
fermento
cultura em caldo
cultura em placa
material da boca
4
5
DISCUSSÃO
1. Complete a tabela seguinte, descrevendo o que ocorre na coloração de Gram.
Bacté ria
Solução
cristal violeta
Gram +
Gram -
lugol
álcool
fucsina
2. Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?
3. As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria o
motivo?
4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixação do esfregaço, as
bactérias G+ passam a se comportar como G-. Por que isso ocorre?
5. Em geral, os corantes não penetram nas células vivas. Qual a relação entre esta informação e
as etapas que você seguiu para realizar a coloração de Gram?
6. Quem idealizou o método de Gram? Qual a primeira bactéria a ser visualizada com esta
técnica?
6
ATIVIDADE 2
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
INTRODUÇÃO
Certas bactérias Gram + e Gram - produzem cápsula, camada viscosa, externa à parede
celular.
Essa estrutura não constitui caráter morfológico permanente, aparecendo somente sob
certas condições de cultura. A cápsula constitui um dos antígenos de superfície das bactérias e é
geralmente formada por polissacarídeos e mais raramente por proteínas. A cápsula pode ser
visualizada por coloração negativa onde estruturas que não são coradas, são visualizadas contra
um fundo escuro.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
culturas recentes de bactérias
vermelho congo 25 mg/mL
ácido hidroclorídrico 0,15 mol/L-1
fucsina de Ziehl-Neelsen
lâminas de vidro
alça bacteriológica
PROCEDIMENTO (Método de White modificado)
• Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lâmina de vidro.
• Misturar uma alçada da cultura bacteriana no vermelho congo.
• Com auxílio de outra lâmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lâmina, formando uma
película fina.
• Aquecer fracamente para secar.
• Cobrir a lâmina que contém a película com ácido hidroclorídrico.
• Retirar o excesso do ácido, aquecendo rapidamente.
• Cobrir com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos.
• Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha.
• Observar ao microscópio.
RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.
Cultura A
Cultura B
7
DISCUSSÃO
1. Por que a técnica é denominada coloração negativa?
2. Qual a forma das bactérias em A? E em B?
3. Se eu fizer coloração para cápsula o que posso dizer sobre o Gram da bactéria?
8
ATIVIDADE 3
COLORAÇÃO DE ESPOROS
INTRODUÇÃO
Esta coloração baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao
corante, comparada com o resto da célula bacteriana, tornando possível sua diferenciação.
O esporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas
bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos; é
capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar, dando
origem a uma nova célula vegetativa.
O esporo é, portanto, mais resistente às condições desfavoráveis do meio que a célula
vegetativa.
A estrutura do esporo é constituída de uma primeira camada interna, próximo ao cerne do
esporo - a parede do esporo -, composta de peptidoglicano, a qual vai dar origem à parede da
célula vegetativa, por ocasião da germinação. Envolvendo a parede do esporo fica a córtex,
camada espessa, composta de um peptidoglicano existente na parede da célula que o originou.
Externamente ao córtex fica a capa do esporo, estrutura rígida composta de proteína rica
em ligações de dissulfetos intramoleculares; ela confere resistência aos agentes químicos. A
camada mais externa recebe o nome de exósporo e consiste numa membrana lipoprotéica que
contém aminoaçúcares.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
cultura bacteriana
cultura de solo em meio líquido e sólido
verde malaquita
safranina
lâminas de vidro
alça bacteriológica
PROCEDIMENTO (método de Wirtz-Conklin)
•
•
•
•
•
•
•
•
fazer um esfregaço da cultura bacteriana em lâmina e de cultura de solo em outra.
secar ao ar.
fixar pelo calor.
corar a quente durante 6 minutos, com solução aquosa de verde malaquita: aquecer até a
emissão de vapores.
lavar suavemente em água corrente.
corar com safranina, por 30 segundos.
lavar suavemente em água corrente.
secar ao ar e observar ao microscópio.
9
RESULTADO
Desenhe o observado com legendas.
Cultura bacteriana em caldo
Cultura de solo
DISCUSSÃO
1. Em qual cor é visto o esporo? E a célula vegetativa?
2. Por que a coloração com verde malaquita é feita a quente?
3. A célula vegetativa retém o verde malaquita após a 1ª lavagem com água? E o esporo?
4. Qual a função da safranina?
10
ATIVIDADE 4
COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTES (MÉTODO DE ZIEHLNEELSEN)
INTRODUÇÃO
Através desta coloração, podemos visualizar um grupo restrito de bactérias que possuem
sua parede celular constituída de grande concentração de lipídeos, devido à presença de ceras e
ácidos graxos (ácidos micólicos).
O mecanismo da coloração de Ziehl-Neelsen está relacionado com a estrutura e a
composição da parede celular de um grupo de bactérias. Estas bactérias possuem a parede
celular constituída de lipídeos complexos (ácidos graxos e ceras); é provável que sejam os
responsáveis pela propriedade de álcool ácido resistência. Quando os lipídeos são removidos pelo
éter, perde-se esta propriedade.
Durante a coloração, a fucsina se fixa firmemente a certos lipídeos da parede celular, não
sendo removida durante a lavagem com álcool-ácido. Essas bactérias ficam, portando, coradas de
vermelho. As bactérias que não contêm alto teor de lipídeos complexos na sua parede celular não
retêm a fucsina durante a lavagem de álcool ácido; portanto, adquirem a cor do corante de fundo
que é o azul-de-metileno.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis
material retirado da boca
fucsina de Ziehl-Neelsen
álcool-ácido clorídrico
azul de metileno
lâminas de vidro
alça bacteriológica
cotonete estéril
PROCEDIMENTO
•
•
•
•
•
•
•
•
cobrir esfregaço seco e fixado pelo calor com fucsina de Zielh-Neelsen;
aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos;
lavar a lâmina em água, suavemente;
cobrir com álcool-ácido clorídrico, por um minuto;
lavar a lâmina com água:
cobrir o esfregaço com azul-de-metileno (durante um minuto);
lavar a lâmina com água;
deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão.
IMPORTANTE
•
•
O aquecimento não deve ser muito drástico, a ponto de ferver o corante, mas apenas até
ligeira emissão de vapores.
A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras estruturas, descoradas prelo
álcool-ácido.
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RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.
BCG
Material retirado da boca
DISCUSSÃO
1. Complete a tabela abaixo:
Soluções em ordem de aplicação
1 - Fucsina de Ziehl
2 - álcool - ácido clorídrico
3 - azul de metileno
Reação e aspectos da bactéria
BAAR
BNAAR
Bactérias coradas em
Bactérias coradas em
______
________
A fucsina não se fixa nos
A fucsina se fixa nos lipídeos
complexos e não abandona a componentes da parede celular
e abandona a célula, que
célula, que permanece
permanece sem corante no seu
_________
interior
A célula não é afetada e
A célula adquire o corante,
permanece ___________
tornando-se ___________
2. Por que os BAAR se coram em vermelho e os outros não BAAR se coram em azul?
12
ATIVIDADE 5
COLORAÇÃO DE ESPIROQUETA (MÉTODO DE FONTANA-TRIBONDEAUX)
INTRODUÇÃO
A técnica utilizada é o método de Fontana-Tribondeaux, que não é propriamente um
processo de coloração, mas, sim, de impregnação pelo nitrato de prata.
De fato, estes microorganismos não possuem afinidade pelos corantes comumente
empregados, razão pela qual coram-se com muita dificuldade.
As espiroquetas são bactérias espiraladas, delgadas e flexíveis. As mais finas medem
aproximadamente de 0,1 a 0,2 µm de diâmetro e, assim, não podem ser vistas ao microscópio
comum, a não ser em campo escuro ou quando tratadas com sais de prata, que se deposita na
superfície da bactéria e as tornam mais espessas.
Assim as espiroquetas coram-se em marrom-escuro ou negras sobre um fundo castanhoamarelado.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
material retirado da boca
material retirado do aquário
solução fixadora
álcool absoluto
mordente (solução de tanino)
solução de nitrato de prata amoniacal
lâminas de vidro
cotonete estéril
PROCEDIMENTO
1. Coloração de espiroquetas
•
•
•
•
•
•
•
•
•
colocar material da boca na lâmina e deixar secar ao ar livre ( não fixar pelo calor );
cobrir a lâmina com algumas gotas de solução fixadora e renová-la durante 30 a 60
segundos.
cobrir com álcool absoluto e deixar evaporar;
cobrir com solução de tanino (mordente), aquecendo a lâmina até a emissão de vapores,
durante 30 segundos;
lavar em água corrente / água destilada;
tratar pela solução de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos e em seguida
aquecer ligeiramente a lâmina, até o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a
preparação deve adquire a cor marrom);
lavar bem em água destilada;
secar com papel-filtro, sem aquecer;
examinar com objetiva de imersão.
2. Preparação a fresco
•
•
Colocar 1 a 2 gotas de água de aquário numa lâmina e cubra com lamínula.
Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
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RESULTADO
•
Desenhar o observado com legendas.
Material da boca
Material retirado de aquário
DISCUSSÃO
1. Qual o princípio da coloração para espiroquetas?
2. Qual o objetivo da preparação à fresco de espirilos?
3. Após ter realizado as atividades de coloração das bactérias, monte uma tabela com os
seguintes dados:
- nome da coloração;
- microorganismo utilizado;
- corantes utilizados;
- tipo de coloração.
14
Para classificar os tipos de coloração, considere as seguintes informações:
1. Coloração simples: um único corante é aplicado sobre o esfregaço fixado, corando toda a
célula.
2. Coloração diferencial: é utilizada uma combinação de corantes, o que possibilita observar
as diferenças químicas entre os diferentes tipos de bactérias.
3. Coloração estrutural: utilizam corantes que coram apenas uma parte da célula o que
permite distingui-la das demais.
15
ATIVIDADE 6
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
INTRODUÇÃO
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microorganismos.
Estes meios fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As
exigências nutritivas estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de
sais minerais. Alguns microorganismos também necessitam de fatores de crescimento que são
substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, etc.
Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as
condições de pH, pressão osmótica e grau de umidade.
De um modo didático, podemos classificar os meios de cultura em diversos tipos, mas na
prática vemos que vários deles se enquadram em mais de um tipo.
Líquido: Thioglycollate medium (THIO),
Quanto
Brain Heart Infusion (BHI)
a
Consistência Semi-Sólido: Sulfeto Indol Motilidade (SIM)
Sólido: Manitol Salt Ágar (MSA), Ágar Sangue (AS)
Enriquecedor: BHI, AS
Quanto
Meios de Cultura
Seletivos: MSA, Mac Conkey (MC)
a
Diferenciadores: MC, AS
função
Manutenção: Nutriente Ágar (NA)
Animados: cultura celular
Quanto
à
Inanimados:
Natural: leite
Sintéticos: MSA
Semi-sintéticos: AS
Natureza
Meio Líquido: é aquele em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa e
é desprovido de ágar (polissacarídeo extraído de algas).
Meio Semi-Sólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, ágar em
porcentagem de 0,5 a 0,7%.
Meio Sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes e em torno de 15 g de
ágar.
Meio Enriquecedor: é aquele que permite o crescimento de microorganismos exigentes
que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros. Este meio,
além das fontes nutritivas usuais, citadas anteriormente, pode possuir sangue, soro ou extratos
teciduais.
Meio Seletivo: é aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos
microrganismos, porém permitem o crescimento de outros. Pode ser adicionado no meio cristal
violeta e outros.
Meio Diferenciador: este meio possui substâncias que evidenciam uma característica
que permite identificar um grupo ou uma espécie de microorganismo.
Meio de Manutenção: este meio mantém os microorganismos viáveis, sem que ocorra
uma grande multiplicação que poderia provocar morte celular, devido à eliminação de substâncias
16
tóxicas como produtos de metabolismo de microorganismos. Por exemplo, normalmente o meio
de manutenção não apresenta glicose porque sua utilização resulta na eliminação de ácidos que
podem prejudicar os microorganismos.
Meio animado: é formado de células vivas (animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo
embrionário).
Meio inanimado: não possui células vivas. O natural é aquele que contém substâncias
provenientes da natureza e o sintético é formado por substâncias químicas preparadas em
laboratório.
Semi-sintético: formado pela união de componentes naturais e sintéticos. (ex.: ágar
sangue).
É enorme a quantidade de meios recomendados para o cultivo de microorganismos e a
escolha é feita pelo laboratorista. Os meios usados devem ser frescos e, a não ser em casos
especiais, conter ainda umidade.
Ao preparar meios de cultura, deve-se ter em mente alguns fatores que podem interferir
em um resultado satisfatório de crescimento bacteriano, tal como o pH que, geralmente, é o do
meio final, pronto para inoculação e determinado à temperatura ambiente.
Outro fator que influencia na preparação é a temperatura. Ao preparar um meio de
cultura, não podemos manter à temperatura ambiente uma solução não estéril por mais de uma
hora, devido a dois problemas: possibilidade de evaporação de água e crescimento microbiano. O
meio seria contaminado com metabólitos bacterianos e teria sua composição inicial alterada:
alguns componentes são utilizados pelas bactérias e os demais, pelo efeito da evaporação, se
concentram. As soluções não estéreis, não podem também, ser mantidas em altas temperaturas
antes de serem autoclavadas, por exemplo, dentro de autoclave quente, esperando o momento
conveniente para iniciar a autoclavação, uma vez que haverá quebra de vários ingredientes do
meio.
Nesta atividade, você vai preparar quatro tipos de meios de cultura, a partir de produtos
desidratados: ágar nutriente, caldo nutriente e ágar-ágar.
MATERIAL POR GRUPO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Balança digital
2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio líquido)
2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio semi-sólido)
2 tubos de ensaio 16 x 100 mm (para o ágar inclinado)
2 placas de Petri esterilizadas
1 pipeta de 5 mL
3 pipetas de 10 mL
2 béqueres de 50 mL (meio líquido e meio semi-sólido)
1 balão de vidro (125 mL) ou erlenmeyer de 125 mL
algodão em rama para tampões
papel alumínio
1 estante para tubos de ensaio
sacos plásticos para embalar os meios de cultura em placa
3 espátulas de madeira
1 tripé e tela de amianto
frasco contendo ágar nutriente (em pó)
frasco contendo caldo nutriente (em pó)
frasco contendo ágar-ágar (pó)
água destilada
PROCEDIMENTO
Preparo do meio líquido
•
Preparar os tampões de algodão para os tubos de ensaio.
17
•
Calcular a quantidade do caldo nutriente desidratado necessário para preparar os 2 tubos de
ensaio, com 2 mL de meio líquido cada um. Indicar os cálculos no espaço abaixo.
•
Pesar o meio, transferir para o béquer, acrescentar a quantidade de água destilada
necessária.
Dissolver o meio, aquecendo-o em bico de Bunsen.
Distribuir 2 mL do meio dissolvido em cada tubo.
Tampar os tubos com os tampões de algodão.
Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
•
•
•
•
Preparo do Meio Sólido em Placa
Preparo do Meio Sólido em Tubo (ágar inclinado)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Calcular a quantidade de ágar nutriente desidratado suficiente para preparar 2 placas de
Petri, considerando que serão colocados 10 mL de meio em cada placa e, suficiente também
para preparar 2 tubos 16 x 100 mm contendo 4 mL de meio sólido (ágar inclinado).
Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo.
Pesar o meio desidratado e transferir para um erlenmeyer.
Acrescentar a quantidade de água destilada necessária para o preparo do meio sólido em
placa e em tubo.
Aquecer para completa dissolução.
Com uma pipeta, distribuir 4 mL de meio para cada tubo.
Tamponar os tubos.
Tamponar o erlenmeyer com o meio restante.
Autoclavar por 15 minutos a 121° C.
Distribuir, aproximadamente 10 mL do meio de cultura esterilizado em cada placa de Petri
estéril. Este procedimento deverá ser realizado próximo à chama de um bico de
Bunsen para evitar contaminação.
Manter as placas na posição horizontal até completa solidificação do meio.
Manter os tubos de ensaio com o meio sólido em posição inclinada, até completa solidificação
do meio.
Preparo do Meio Semi-Sólido
• Calcular a quantidade de caldo nutriente desidratado necessária para preparar 2 tubos de
ensaio, contendo 2,5 mL de meio cada.
• Calcular a quantidade de ágar necessária para obter uma concentração de 0,7% no meio a
ser preparado.
18
•
Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo.
•
•
•
•
•
•
•
Pesar o caldo nutriente desidratado e o ágar e transferir para o béquer.
Acrescentar a quantidade de água destilada necessária para o preparo do meio semi-sólido.
Aquecer para completa dissolução.
Com uma pipeta, distribuir 2,5 mL do meio em cada tubo.
Tampar os tubos com os tampões de algodão.
Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Manter os tubos em posição vertical até a completa solidificação do meio.
Identificação dos Meios
Identificar os meios de cultura com o número de seu grupo e de sua turma.
Armazenamento dos Meios
As placas serão acondicionadas em sacos plásticos.
Todos os meios serão armazenados em geladeira.
DISCUSSÃO
1. Por que a esterilização é realizada a 121°C e não a 100°C?
19
ATIVIDADE 7
TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO
Como descrito, os microorganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu
crescimento in vitro. Mas, além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem
no seu desenvolvimento: são fatores ambientais como temperatura e tensão do oxigênio.
Inoculando um microorganismo em um meio de cultura que possua todos os requisitos
nutritivos e fatores ambientais adequados, o microorganismo inicia seu desenvolvimento neste
meio, passando pelas diversas fases da curva de crescimento: latência, logarítmica, estacionária.
A fase logarítmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade ou
binária), podendo originar, em meios sólidos, um grupamento de bactérias da mesma espécie,
denominado colônia. A colônia bacteriana é visualizada sem o auxílio do microscópio, como cada
espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, as colônias podem ser analisadas quanto à
elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Denomina-se cultura pura quando é observado
um único tipo de colônia no meio, e cultura mista, quando se observam vários tipos de colônias.
Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação, dependendo do objetivo que se quer
atingir.
Nessa atividade, você vai aprender essas técnicas e para que servem.
MATERIAL
•
•
•
•
culturas bacterianas em caldo e em placa.
alça de inoculação.
agulha (fio) de inoculação.
meios de cultura líquido, sólido em tubo (ágar inclinado), sólido em placa, semi-sólido,
preparados pelos alunos.
IMPORTANTE
As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculações dos meios de cultura:
a) o fio e a alça de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer
inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com meio de
cultura:
b) os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura devem
sempre ser abertos próximos ao bico de Bunsen:
c) a boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da colocação da
tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida segura pelo
dedo mínimo da mão direita durante a inoculação.
PROCEDIMENTO
•
Identifique todos os meios semeados. Utilize as letras constantes das figuras.
20
1. Técnica de semeadura em meios líquidos
Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa em um meio líquido, com auxílio da
alça de platina.
A
B
21
2. Técnica de semeadura em meio sólido inclinado
Inocular a cultura bacteriana em caldo em um meio inclinado fazendo estrias na superfície
do ágar, utilizando a alça de platina.
C - Caldo -----> alça ------> ágar inclinado
D - placa ------> ágar inclinado
22
3. Técnica da semeadura em meio semi-sólido (picagem profunda)
Inocular a cultura de bactérias em caldo em um meio semi-sólido utilizando o fio: a
inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única
picada.
E
fio
F
4. Técnica de semeadura em meio sólido em placa (técnica de esgotamento)
A técnica do esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfície do
meio uma alíquota do material e depois espalhá-lo em dois ou três setores, por meio de alça de
platina, sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do
material.
Temos que obter rarefação suficiente do material, de modo a formar colônias
perfeitamente isoladas.
23
Esta técnica de semeadura é esquematizada a seguir:
O sucesso da semeadura está em:
a) grande número de estrias;
b) não perfurar o meio;
c) não voltar a alça sobre a estria
d) pegar pequena quantidade de material para semear.
Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa, em placas com ágar nutriente.
G
24
H
IMPORTANTE: SEMPRE DEIXE O MATERIAL PRÓXIMO À CHAMA PARA EVITAR
CONTAMINAÇÃO EXTERNO.
25
26
DISCUSSÃO
1. Qual a função dos meios de cultura?
2. Quais são as exigências básicas de um microorganismo?
3. Quanto à consistência, como estão classificados os meios de cultura?
4. O que é um meio seletivo?
5. Como se classifica um meio constituído por células vivas?
6. Após preparar um meio de cultura, é adequado deixá-lo dentro de uma autoclave aquecida,
antes da autoclavação?
7. Além dos nutrientes presentes no meio de cultura que outros fatores podem interferir no
crescimento bacteriano?
27
8. O que você entende por de crescimento bacteriano?
9. Observe o seguinte gráfico:
3
nº de bactérias
4
2
1
Tem po
Gráfico 1 – Curva de crescimento bacteriano num meio de cultura
Um aluno quer estudar a produção de uma enzima por uma bactéria. Utilizou para isso uma
cultura bacteriana na fase de crescimento 4.
Você concorda? Justifique.
10. Utilizando um cotonete estéril, um aluno recolheu bactérias da garganta de outro aluno. Qual
das técnicas de semeadura apresentadas, seria adequada para obtenção de uma cultura pura?
11. Quais as vantagens de se usar meios sólido, líquido e semi-sólido?
12. A partir do crescimento no meio semi-sólido, como poderíamos proceder para identificar a
bactéria?
28
ATIVIDADE 8
LEITURA DOS EXPERIMENTOS DE SEMEADURA
MATERIAL
•
•
•
Meios semeados na aula anterior
Alça bacteriológica
Lupas
PROCEDIMENTO
MEIO LÍQUIDO
Para realizar a leitura dos resultados desta técnica devem-se observar os seguintes itens:
a) Quantidade de crescimento: pode ser escassa, moderada ou abundante.
b) Distribuição de crescimento no meio de cultura: pode ter crescimento uniformemente
distribuído (nitidamente turvo); crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma
ou filme (película); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou
viscoso.
c) Odor: pode ser pútrido, aromático, ou desprezível.
Registrar os resultados no quadro abaixo:
A – Cultura bacteriana em meio líquido para meio líquido
Bactéria
item
a
b
c
B – Cultura bacteriana em placa para meio líquido
Bactéria
item
a
b
c
C - MEIO ÁGAR INCLINADO
Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os seguintes itens:
a) Quantidade: pode ser descrita como escassa, moderada ou abundante.
29
b) Margem ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou
mostrando várias irregularidades.
c) Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante
à de manteiga, facilmente removível com a alça de platina: viscosa ou mucóide; seca ou
quebradiça.
d) Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca, translúcida ou com pigmento.
Bactéria
item
a
b
c
d
D - MEIO SEMI-SÓLIDO
O modo de se observar um resultado quando utiliza-se esta técnica é o seguinte:
Resultado positivo: há crescimento por todo o meio de cultura, semelhante a um
"pinheiro invertido".
Resultado negativo: há crescimento somente no local da inoculação.
Registrar o resultado no quadro abaixo:
Bactéria
Resultado
Interpretação:
O meio de cultura utilizado foi o mesmo do item anterior (AN), sendo que o objetivo foi o
de verificar a locomoção das bactérias; para tal, foi colocada uma quantidade menor de ágar
(7,5 g por 1000 mL de água).
30
MEIO DE CULTURA SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA DE ESGOTAMENTO)
RESULTADO
Quando há desenvolvimento de colônias isoladas na superfície do meio, considera-se o
isolamento correto. Neste método verificam-se as características de colônias quanto aos
seguintes aspectos:
a) tamanho: o tamanho das colônias varia desde dimensões muito pequenas
(puntiformes), com apenas uma fração de milímetros de diâmetro, até colônias muito grandes,
com 5 a 10 mm de diâmetro. Outras bactérias, como, por exemplo Proteus sp espalham-se
sobre toda a superfície do ágar.
b) borda: a periferia das colônias bacterianas pode formar muitos desenhos diferentes,
dependendo da espécie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada ou franjada.
c) elevação: as colônias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta),
umbilicada, centro saliente.
d) cromogênese ou pigmentação: opaca, translúcida ou com pigmento.
e) forma: as colônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides.
f) consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência
semelhante à da manteiga, facilmente removível com a alça de inoculação: viscosa ou mucóide;
seca ou quebradiça.
Anotar seus resultados no quadro abaixo:
E – Cultura de caldo para placa
Características das colônias
Isoladas ou não
Bactéria
a
b
c
d
e
f
31
F – Cultura de placa para placa
Características das colônias
Isoladas ou não
Bactéria
a
b
c
d
e
f
32
ATIVIDADE 9
TÉCNICAS DE SEMEADURA EM PLACA APÓS DILUIÇÃO
INTRODUÇÃO
Em diversos estudos microbiológicos é necessária a determinação do número de bactérias vivas
presentes em uma amostra.
Nessa atividade você vai aprender a calcular o número de bactérias em uma amostra
previamente diluída.
MATERIAL
•
•
•
•
•
Caldos com cultura de Escherichia coli
2 placas com ágar nutriente
6 tubos contendo 9 mL de salina estéril
1 pipeta (0,1 mL) estéril
2 alças de Drigalski estéreis
PROCEDIMENTO
• Diluir a cultura em caldo de E. coli: passar 0,1 mL da cultura no 1º tubo com salina, misturar
bem; transferir 0,1 mL da suspensão do tubo 1 para o tubo 2 e assim sucessivamente até o
tubo 6.
• Colocar 0,1 mL de cada diluição feita sobre as 2 placas com ágar nutriente e espalhar por toda
a superfície, com da alça de Drigalski.
• Incubar a 37º C, por 18-24 h.
RESULTADO
Desenhe o observado em cada uma das placas.
DILUIÇÃO
1
2
• Conte o número de colônias: escolha a placa mais adequada para a contagem.
• Número total de colônias da cultura em caldo: _______________
Deixe os cálculos indicados.
33
DISCUSSÃO
1. Faça uma pesquisa sobre
a) padrões microbiológicos de balneabilidade.
b) como se determina uma infecção urinária.
c) como se classifica, microbiologicamente, leites do tipo A, B e C.
2. Relacione o que você aprendeu na atividade realizada no laboratório e as pesquisas realizadas
em 1.
34
ATIVIDADE 10
TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA POUR-PLATE
INTRODUÇÃO
A técnica da semeadura em placa pour-plate pode ser realizada com o objetivo de se
obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa
(estudo quantitativo).
MATERIAL
•
•
•
•
•
Escherichia coli cultivada em caldo nutriente
6 tubos de ensaio contendo 0,9 mL de salina estéril
1 placa de Petri estéril
20 mL de meio de cultura (ágar nutriente) fundido
pipeta estéril (0,1 mL)
PROCEDIMENTO
• Transferir 0,1 mL da cultura em caldo de E. coli para o tubo 1.
• Agitar o tubo 1 e transferir 0,1 mL dessa suspensão para o tubo 2.
• Agitar o tubo 2 e transferir 0,1 mL dessa suspensão para o tubo 3, e assim sucessivamente
até o tubo 6.
• Transferir 0,1 mL do tubo 6 para a placa de Petri estéril..
• Colocar 20 mL de ágar nutriente fundido sobre o fundo da placa, realizando movimentos
rotatórios, em forma de 8, para a perfeita mistura da cultura com o ágar nutriente (não muito
quente para não matar as bactérias).
• Esperar solidificar, inverter a placa e incubar a 37o C, por 18-24 h.
• Proceder à contagem de colônias (a placa deve ter 30 a 300 colônias no máximo, para ser
possível a contagem).
• Calcular o número de unidades formadoras de colônias / mL.
RESULTADO (deixar os cálculos indicados no espaço abaixo)
DISCUSSÃO
1. Faça uma pesquisa sobre bactérias heterotróficas, explicando
a) O que são essas bactérias.
b) Como podem ser utilizadas como padrão de higiene.
35
2. Relacione o que você aprendeu na atividade realizada no laboratório e a utilização de
bactérias heterotróficas.
36
ATIVIDADE 11
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS A PARTIR DE MATERIAL
FECAL
INTRODUÇÃO
A maioria dos estudos de bactérias geralmente envolve uma etapa de isolamento da bactéria e
sua identificação. A etapa de isolamento exige a obtenção de colônias bacterianas, de forma
isolada, pois a partir de uma delas, será feita a identificação.
A etapa de identificação geralmente envolve o cultivo da bactéria, a partir da colônia isolada, em
meios de cultura cujos componentes reagem com substâncias produzidas pela bactéria, de modo
a permitir a distinção das propriedades bioquímicas do microorganismo estudado e sua
identificação.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
1
1
1
1
1
1
1
meio de transporte Cary Blair
placa com ágar Mac Conkey
tubo com meio EPM
tubo com meio MILi
tubo com meio Citrato de Simmons
alça de inoculação
fio de inoculação
PROCEDIMENTO
1. COLETA DO MATERIAL
As fezes deverão ser mantidas em meio de transporte Cary Blair, conforme as instruções do
professor, até o momento da semeadura.
2. ISOLAMENTO
Utilizando uma alça de inoculação, semear as fezes em uma placa de ágar Mac Conkey, de
modo a obter colônias isoladas. Incubar a 36-37oC, por 24 horas.
3. SEMEADURA NOS TESTES BIOQUÍMICOS
Escolher uma colônia crescida no Mac Conkey e semear, nos seguintes meios de cultura
A. EPM - semear com fio de inoculação, picando o meio e semeando em estria na superfície.
Anote a cor inicial do meio de cultura: _________________________________
B. MILi - semear com fio de inoculação, picando apenas uma vez o meio de cultura.
Anote a cor inicial: __________________________
Este meio de cultura é transparente ou opaco? _________________
C. CITRATO DE SIMMONS - semear com alça de inoculação a superfície do meio.
Anote a cor inicial: _________________________
37
ATIVIDADE 12 - A
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS TESTES BIOQUÍMICOS
1. MEIO MAC CONCKEY
O meio MC é seletivo para bactérias Gram negativas porque possui sais biliares e cristal
violeta, que impedem o crescimento das bactérias gram positivas. O meio é também diferencial
devido à presença de lactose na sua composição, que diferencia as bactérias fermentadoras da
lactose das que não fermentam este açúcar. O meio possui como indicador de pH o vermelho
neutro, que em meio ácido é rosa e em pH alcalino é incolor.
Quando as bactérias fermentam a lactose, liberam ácido e suas colônias se tornam róseas.
Quando não fermentam o açúcar, as colônias são incolores.
RESULTADO
Crescimento
Conkey
em
Mac
Cor da colônia
Fermentação da lactose
2. Provas Bioquímicas
Enterokit B
O ENTEROKIT B consiste dos meios EPM, MILi e Citrato de Simmons.
O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás em glicose, produção
H2S, hidrólise da uréia e desaminação do triptofano.
O meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina.
O Citrato de Simmons oferece o teste de utilização do citrato como única fonte
carbono. Os três meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentação da lactose na placa
isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas
espécimes clínicos.
de
de
de
de
2.1 Meio EPM
O meio EPM permite investigar:
. fermentação da glicose;
. produção de: gás, H2S, urease, L-Triptofano Desaminase (LTD).
A. Fermentação da glicose
Bactérias que fermentam glicose produzem ácidos que acidificam a base do meio,
tornando-a amarela pela viragem do indicador azul de bromotimol (pH ácido = amarelo, pH
neutro = verde, pH alcalino = azul). A superfície do meio, que contém O2, torna-se alcalina
(azul), devido a degradação aeróbica da glicose e a utilização de peptonas, que resulta na
liberação de amônia.
Quando a bactéria não fermenta glicose, a cor da base do meio permanece inalterada
(verde).
B. Produção de gás
A formação de gás, a partir da fermentação da glicose, é verificada pela formação de
bolhas, ou rachaduras, na base do meio.
38
C. Produção de H2S
Bactérias que possuem a enzima tiossulfato redutase reagem com o tiossulfato de sódio,
produzindo H2S, que é um gás incolor. Combinando-se com compostos que contêm ferro, ou
chumbo, o H2S dá origem ao sulfeto correspondente, que tem cor preta.
Tiossulfato de sodio
Tiossulfato
redutase
H2 S (gas incolor)
H2S + íons Fe « sulfeto de ferro (precipitado preto).
D. Produção de urease
A urease cataliza a hidrólise da uréia em amônia e CO2, o que torna o meio alcalino.
Portanto, no EPM, quando a reação é positiva, a base do meio torna-se azul, ou azul-esverdeada
(reação fraca).
H 2N
C = O + 2 HOH urease
H 2N
uréia
CO2 + H2O + 2 NH3
E. Produção de L-triptofano desaminase (LTD)
A desaminação oxidativa do L-triptofano catalisada pela L-triptofano desaminase resulta
na formação de cetoácido que, em presença de ferro provoca o desenvolvimento de cor verdegarrafa na superfície do meio.
A. Cor do
EPM
base
superfície
fermentação da glicose
B. Presença de bolhas ou
rachaduras
Produção de gás
C. Presença de precipitado
preto
Produção de H2S
D. Cor da base do meio.
Produção de urease
E. Cor da superfície do meio
Produção de LTD
2.2. Meio MILi
Permite investigar:
. motilidade
. produção de: indol, lisina descarboxilase.
A. Motilidade
39
As bactérias móveis (que possuem flagelos), quando inoculadas em meio sem-sólido, se
movimentam, turvando total ou parcialmente o meio.
As imóveis só crescem no local onde foram inoculadas.
B. Produção de lisina descarboxilase
A descarboxilação da lisina resulta na formação de amina (cadaverina) que torna o meio
alcalino.
L − lisina
L - lisina
descarboxilase
cadaverina + CO 2
A enzima é formada apenas quando a bactéria é cultivada em meio ácido, na presença do
substrato.
O indicador de pH do MILi é o bromocresol púrpura, que em pH ácido vira a cor do meio
para amarelo, e em pH neutro, ou alcalino, para roxo. O MILi, além de outros componentes,
contém lisina e glicose. Quando a lisina não é descarboxilada, o meio torna-se ácido (amarelo),
devido a fermentação da glicose. Quando a lisina é descarboxilada, o meio torna-se alcalino,
passando de amarelo para roxo.
Reação positiva: O meio adquire cor roxa discreta ou acentuada.
Reação negativa: O meio adquire cor amarela nítida, nos seus 2/3 inferiores.
C. Produção de indol
A enzima triptofanase, produzida por certas bactérias, cataliza a degradação do triptofano,
o que resulta na produção de indol.
L-triptofano triptofanase
Indol + ácido pirúvico + amônia.
O indol pode ser detectado pela adição de 3 a 4 gotas de uma solução de
p-dimetilaminobenzaldeído Reativo de Kovacs) na superfície do meio. O desenvolvimento de um
anel de cor rosa, ou vermelha, indica presença de indol. Quando a reação é negativa, o anel
conserva a cor do reativo.
Nota: Só colocar o reativo de Kovacs após a leitura dos testes de motilidade e lisina.
A. Modo de
crescimento
Motilidade
B. Cor do meio
Produção
descarboxilase
da
lisina
C. Formação do anel cor de
rosa
Produção de Indol
2.3. Meio de Citrato de Simmons
Permite determinar se uma bactéria é capaz de utilizar citrato como única fonte de
carbono para o seu metabolismo. O meio também contêm sais inorgânicos de amônio. Um
microrganismo que utiliza o citrato, como única fonte de carbono, também utiliza os sais de
amônio como única fonte de nitrogênio. A utilização dos sais de amônio resulta na formação de
amônia (NH3), que provoca alcalinização do meio.
O meio contêm como indicador do pH o azul de bromotimol (pH alcalino = azul; pH
neutro = verde, pH ácido = amarelo).
40
Reação positiva: crescimento bacteriano na superfície do meio e desenvolvimento de cor azul
(pH alcalino).
Reação negativa: ausência de crescimento e a cor do meio permanece inalterada (verde).
Crescimento
Cor do meio
Utilização de citrato
Após leitura de todos os testes consultar a tabela 1 para identificar a bactéria.
Identificação da bactéria: ____________________________
41
TABELA 1 - IDENTIFICAÇÃO DE ALGUMAS ENTEROBACTÉRIAS PELOS TESTES DOS
MEIOS EPM, MILi e CITRATO
Lactose
(Mac
Conkey)
+
Va
EPM
Gás
MILi
H2S Urease
LTD Mot. Lisina
Citrato
Enterobactéri
a
Indol
E. coli
+
V
-
-
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
-
+
-
V
+
-
+
+
Enterobacter
V
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
V
-
+
+
Shigella, EIEC
Salmonella
-
-
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
Serratia
-
-
-
+
-
-
-
V
-
-
-
+
+
+
+
-
-
V
-
+
+
+
+
+
-
+
V
EIEC,outros,
E. coli
Klebsiella
pneumoniae
Citrobacter
freundii
Providencia
rettgeri
Yersinia
enterocolitica
Proteus
mirabilis
Proteus
vulgaris
DISCUSSÃO
1. Seria adequado semear o iogurte no meio de Mac Conkey? Justifique.
2. Seria adequado utilizar essa série bioquímica para identificar estafilococos? Justifique.
42
ATIVIDADE 12 - B
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS TESTES BIOQUÍMICOS
Amostra: ______________________________
1. Meio Mac Conkey
Crescimento
Conkey
em
Mac
Cor da colônia
Fermentação da lactose
2. Meio EPM
A. Cor do
EPM
base
superfície
fermentação da glicose
B. Presença de bolhas ou
rachaduras
Produção de gás
C. Presença de precipitado
preto
Produção de H2S
D. Cor da base do meio.
Produção de urease
E. Cor da superfície do meio
Produção de LTD
3. Meio MILi
A. Modo de
crescimento
Motilidade
B. Cor do meio
Produção
da
lisina
descarboxilase
C. Formação do anel cor de
rosa
Produção de Indol
43
4. Meio Citrato de Simmons
Crescimento
Cor do meio
Utilização de citrato
IDENTIFICAÇÃO DA BACTÉRIA: ________________________________
44
ATIVIDADE 13
SEMEADURA EM MEIO ÁGAR SANGUE (AS)
INTRODUÇÃO
O ágar sangue é classificado como meio enriquecedor porque é rico em nutrientes. É
também diferenciador porque indicar se a bactéria produz ou não uma proteína denominada
hemolisina.
Essa proteína hemolisa as hemácias presentes no meio. Assim, a bactéria que produz
hemolisina, forma uma colônia com um halo transparente em seu redor. A hemólise pode ser
total (halo bem transparente: β-hemólise) ou parcial (halo esverdeado: alfa hemólise). Se a
bactéria não produzir hemolisina, a colônia não forma o halo ao seu redor (gama hemólise).
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
2 cotonetes estéreis
1 tubo com salina estéril
1 placa com meio ágar sangue
1 frasco conta-gotas com água oxigenada
palitos de dente
lâminas de vidro
material para coloração de Gram
PROCEDIMENTO
•
•
•
•
Dividir a placa ao meio, utilizando caneta para retroprojetor.
Coletar, com auxílio de um cotonete, material de mucosa bucal ou nasal. Semear, por
esgotamento, numa das metades da placa.
Umedecer o outro cotonete em salina e coletar material da superfície da pele. Semear, por
esgotamento a outra metade da placa. Incubar a placa a 370 C por 18-24 h.
Observar na placa se há formação de halos de hemólise.
Teste da Catalase
Com auxílio de um palito, transferir a colônia a ser testada para uma lâmina, contendo 1
gota de água oxigenada. Observar o desprendimento de bolhas.
Coloração de Gram
Realizar a coloração de Gram nas colônias testadas (ver pág. 3).
DISCUSSÃO
1. Comparando o meio ágar sangue com o meio Mac Conkey, podemos afirmar que o
primeiro é seletivo? Justifique.
2. Por que o meio ágar sangue é considerado diferenciador?
3. Há possibilidade de identificar as bactérias isoladas neste experimento?
45
RESULTADOS
Completar a tabela com as características gerais das colônias.
Colônias (*)
Tipo de hemólise
Teste da catalase
Gram
Morfologia
(*) anotar características como cor, tamanho etc
46
ATIVIDADE 14
TÉCNICA DE SEMEADURA EM ANAEROBIOSE
INTRODUÇÃO
As bactérias apresentam diferenças a sua necessidade de O2, sendo classificadas em:
1. aeróbicas estritas: não crescem na ausência de O2.
2. microaerófila: crescem melhor em uma atmosfera com baixo teor de O2.
3. anaeróbicas estritas: crescem somente na ausência de O2.
4. anaeróbicas facultativas: crescem tanto na presença quanto na ausência de O2.
Nessa atividade você vai conhecer um método para se cultivar bactérias.
MATERIAL
•
•
•
•
1
1
1
1
cotonete estéril
placa contendo ágar chocolate
jarra de plástico com tampa
vela
PROCEDIMENTO
•
•
•
•
Com auxílio do cotonete, coletar material da mucosa nasal ou faringe.
Semear, por esgotamento, na placa com ágar chocolate.
Colocar a placa dentro da jarra, colocar a vela acesa em cima da placa e fechar a jarra.
Incubar a 37°C, por 18-24 h.
LEITURA
•
•
•
Observar a placa para visualizar colônias.
Fazer coloração de Gram.
Desenhar o observado.
RESULTADOS
1. Descrever o aspecto geral das colônias encontradas.
2. Desenhar o observado na coloração de Gram.
Morfologia: ____________________
Gram: ____________________________
DISCUSSÃO
1. Pesquisar bactérias que crescem, preferencialmente, no ambiente estudado nesta prática.
2. Relacionar o uso de vela, como feito nesta prática, com o uso de água oxigenada ao se
trabalhar com bactérias anaeróbicas estritas.
47
ATIVIDADE 15
REDUÇÃO DO AZUL DE METILENO
INTRODUÇÃO
O azul de metileno age como aceptor de hidrogênio, descolorindo-se. A rapidez da
descoloração indica a taxa de oxidação. Se o azul de metileno for colocado em contato com o ar
ou o oxigênio, será reoxidado, reaparecendo a coloração azul.
CH 3
CH 3
N
S
CH 3
N
CH 3 + 2 H
Cl
N
Azul de Metileno Colorido
CH 3
CH 3
N
S
N
N
CH 3
CH 3 + HCl
Cl
H
Azul de Metileno Incolor
MATERIAL
•
•
•
•
Azul de metileno 0,005% (conserva-se em geladeira por 1 semana)
4 tubos de ensaio estéreis
4 pipetas de 10 mL estéreis
amostras de leite (tipo A, B, C, longa vida)
PROCEDIMENTO
•
•
Agitar a amostra de leite. Colocar em um tubo estéril 10 mL de cada amostra de leite.
Acrescentar 1 mL de azul de metileno. Misturar bem. Incubar a 37°C.
Anotar a cor inicial: ___________________
48
•
Observar as amostras depois de 10 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas. Anotar a
cor na tabela abaixo.
10 min
15 min
Leitura
30 min
1 hora
2 horas
3 horas
Amostra
Leite A
Leite B
Leite C
Longa vida
nº de bactérias
INTERPRETAÇÃO
•
•
•
•
menos de 15 minutos: excessivamente contaminado
15 a 60 minutos: fortemente contaminado
1 - 3 horas: ligeiramente contaminado
mais de 3 horas: satisfatório
Na contagem, os resultados são os seguintes:
• menos de 2 h 30 min: + de 2.000.000 de germes
• 2 h 30 min a 4 h 30 min: + de 200.000 germes
• mais de 4 h 30 min: - de 200.00 germes.
DISCUSSÃO
1. De que modo a mudança de cor indica multiplicação bacteriana?
2. As amostras de leite analisadas são adequadas ao consumo?
49
ATIVIDADE 16
ANTIBIOGRAMA
INTRODUÇÃO
O antibiograma é uma prova de sensibilidade aos antimicrobianos utilizada para alguns
grupos de bactérias, principalmente para os que adquirem resistência facilmente, como
Enterobactérias, Pseudomonas, Staphylococcus, etc. O tratamento eficaz de uma infecção
por essas bactérias implica na realização do antibiograma da bactéria isolada, a partir do material
clínico.
Nesta atividade vamos realizar antibiogramas de culturas de Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Cada grupo trabalhará com uma amostra
diferente.
MATERIAL
• 1 placa com ágar Müeller-Hinton
• 2 cotonetes estéreis
• 1 tubo contendo salina estéril
• 1 pinça
• 1 frasco com álcool
• discos de antibiograma
• culturas em caldo de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus
aureus.
Escala de Mac Farland
- padrão de turvação: intensidade de multiplicação
- fórmula nefelométrica de Mac Farland
- Cloreto de bário em ácido sulfúrico
- Sulfato de bário (precipitado)
PROCEDIMENTO
1. Embeber o cotonete na cultura bacteriana e diluir salina até obter turvação similar aquela do
padrão da escala de Mac Farland (108 bactérias/mL).
2. Embeber o mesmo cotonete na cultura diluída em salina, retirar o excesso comprimindo-o
contra a parede interna do tubo e fazer uma semeadura uniforme em toda a superfície da
placa de Müller-Hinton em três direções, conforme esquema abaixo.
3. Deixar a placa secar e aplicar os discos de antimicrobianos com uma pinça, que deve ser
sempre flambada. É conveniente marcar com a caneta na base da placa de Petri os locais
onde os discos serão colocados. Pressioná-los levemente com a pinça após a aplicação.
50
4. As placas serão incubadas a 370 C por 16-20 h e lidas na próxima aula.
LEITURA DO ANTIBIOGRAMA
5. Medir o diâmetro dos halos de inibição com o auxílio de uma régua, anotar os dados e
interpretar os resultados utilizando a tabela anexa.
RESULTADOS
1. Resultados do seu grupo
Bactéria utilizada:
Bactéria
Antimicrobiano
Diâmetro do halo
Interpretação (R - I S)
_____________
__
_____________
__
_____________
__
2. Resultados da classe
Amostra
Modelo de Resistência
51
52
DISCUSSÃO
1. É possível encontrar amostras da mesma espécie com padrões de sensibilidade diferentes?
2. Uma pessoa está com uma infecção urinária. Foi identificada a bactéria Pseudomonas sp.
De acordo com os resultados obtidos, qual(is) antibiótico(s) não deveria(m) ser utilizado(s)?
Justifique.
53
TABELA I
Tabela para interpretação de halos de inibição (*) antibacterianos para organismos Gram positivos e
negativos
Conc.
Zona de Inibição em mm
Antibacterianos
Discos Código
(a)
(a) Moder.
Resistente intermediári
sensível
Sensível
o
Amicacina (b)
30 µg
AMI
≤ 14
15 - 16
-
≥ 17
Ampicilina (c)
- p/ Gram negativos entéricos
- p/ Staphylococcus (d)
- p/ Haemophilus sp (e)
- p/ enterococos (f,g)
p/ estreptococos
não enterococos (f,g)
10
10
10
10
10
µg
µg
µg
µg
µg
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
≤
≤
≤
≤
≤
11
28
19
16
21
12 - 13
-
≥ 17 (g)
22 - 29
≥ 14
≥ 29
≥ 20
≥ 30
100 µg
100 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
75 µg
30 µg
30 µg
30 µg
2 µg
30 µg
15 µg
10 µg
10 µg
30 µg
30 µg
30 µg
300 µg
CAR
CAR
CFZ
CTX
CFO
CFL
CPZ
CTZ
CRX
CLO
CLI
DOX
ERI
EST
GEN
MIN
NAL
NET
NIT
≤ 17
≤ 13
≤ 14
≤ 14
≤ 14
≤ 14
≤ 15
≤ 14
≤ 14
≤ 12
≤ 14
≤12
≤ 13
≤ 11
≤ 12
≤ 14
≤ 13
≤ 12
≤ 14
18 - 22
14 - 16
15 - 17
15 - 17
15 - 17
16 - 20
15 - 17
15 - 17
13 - 17
15 - 16
13 - 15
14 - 17
12 - 14
13 - 14
15 - 18
14 - 18
13 - 14
15 - 18
15 - 22
-
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
1µg
1µg
OXA
OXA
≤ 10
≤ 19
11 - 12
-
-
≥ 13
≥ 20
PEN
PEN
PEN
PEN
≤
≤
≤
≤
-
≥ 15 (g)
20 - 27
≥ 29
≥ 20
≥ 28
SUL
TET
TRI
SUT
TOB
VAN
≤ 12
≤ 14
≤ 10
≤ 10
≤ 12
≤9
Carbenicilina
- p/ Enterobactérias (d)
- p/ Pseudomonas
Cefazolina (h)
Cefotaxima (h)
Cefoxitina (h)
Cefalotina (h)
Cefoperazona (h)
Ceftazidima (h)
Cefuroxima (h)
Cloranfenicol
Clindamicina (j)
Doxiciclina (l)
Eritromicina
Estreptomicina
Gentamicina (b)
Minociclina (l)
Nalidixico. Ac (i)
Netilmicina (b)
Nitrofurantoina(i)
Oxaciclina
- p/ Staphyloccocus (m)
- p/ pneumococus
penicilina sensível (e)
Penicilina G
- p/ Staphylococcus (d)
- p/ N. gonorrhoeas
- p/ enterococos (f,g)
- outros Gram positivos (f,g)
Sulfonamidas (i,n)
Tetraciclina (l)
Trimetoprima (i,n)
Sulfametoxazil / Trimetoprima
Tobramicina (b)
Vancomicina
10
10
10
10
UI
UI
UI
UI
300 µg
30 µg
5 µg
25 µg
10 µg
30 µg
28
19
14
19
13
15
11
11
13
10
-
16
18
15
15
14
11
-
≥
≥
≥
≥
≥
≥
23
17
18
23
18
18
18
18
18
18
17
16
18
15
15
19
19
15
17
17
19
16
16
15
12
(*) Adaptado do NCCLS - (a, b, c,....) ver bula Cefar
54
TABELA COMPLEMENTAR II
Tabela padrão para interpretação de halos de inibição de antibacterianos não tabulados em I
Conc.
Zona de Inibição em mm
Antibacterianos
Discos Código
(a)
(a) Moder.
Resistente intermediári
sensível
o
Amoxacilina
Bacitracina
Cefalexina
Cefaloridina
Cefadroxil
Cefapirina
Cefradina
Ceftriaxona
Ciprofloxacina
Cotrimazina
Sulfadiazina + Trimetoprima
Dicloxacilina
Fosfomicina
Lincomicina
Neomicina
Norfloxacina (**)
Pefloxacina (**)
Pipemidico, Ac. (**)
Polimixina - B
Rifamicina - B
Rifampicina (**)
- p/ N. meningitidis
- p/ outros organismos
Rifampicina / Trimetoprima (**)
Sisomicina
Tianfenicol
10 µg
10 UI
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
30 µg
5 µg
AMO
BAC
CEF
CFA
CFD
CFP
CFI
CRO
CIP
25 µg
1 µg
20 µg
2 µg
30 µg
10 µg
5 µg
20 µg
300 UI
30 µg
SZT
DIC
FOS
LIN
NEO
NOR
PEF
PIP
POL
RFM
≤ 11
≤ 14
≤ 12
≤ 12
≤ 16
≤ 13
≤8
≤ 33
11 - 15
segue Oxacilina
12 - 17
15 - 16
13 - 16
13 - 16
17 - 21
14 - 18
9 - 11
-
5 µg
30 µg
35 µg
10 µg
30 µg
RIF
RIF
RIT
SIS
TIA
≤
≤
≤
≤
≤
12
12
15
13
≤8
≤ 14
≤ 14
≤ 14
≤ 14
≤ 14
≤ 13
≤ 15
≤ 10
24
11
11
14
12
segue Ampicilina
9 - 12
15 - 17
15 - 17
15 - 17
15 - 17
15 - 17
14 - 17
16 - 20
-
-
18
14
17
17
-
Sensível
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
13
18
18
18
18
18
18
21
≥ 16
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
≥
18
17
17
17
22
19
12
34
≥
≥
≥
≥
≥
25
19
15
18
18
REFERÊNCIAS:
1 - Bauer, A. W.; Kirby, W. M. M.; Sherris, J. C. and Turck, M. - Antibiotic susceptibilly testing by standardized single
disc method. Amer. J. Clin. Poth. 45: 493 - 6. 1966.
2 - Federal Register. col. 37, nº 191, September 30. 1972.
3 - NCCLS (National Commithes for Clinical Laboratory Standards). Oct. 1983. Performance Standard for Antimicrobic
Disc Susceptibility Test. Vol. 3. nº 14.
4 - Ximenes, J. Importância da padronização da prova de sensibilidade bacteriana (Antibiograma). A Folha Médica vol.
66. nº 3, p. 113 - 116. 1973.
(**) Limites fornecidos pelo laboratório detentor do antibacteriano.
55
ATIVIDADE 17
AÇÃO DE ANTISSÉPTICOS SOBRE MICROORGANISMOS
INTRODUÇÃO
Antissepsia consiste na inativação ou redução dos microorganismos presentes no organismo
humano ou de outros animais. Para ser eficiente, o agente antisséptico deve afetar diretamente o
microorganismo.
Nessa atividade, você vai investigar a ação de diversos agentes químicos sobre microorganismos
pertencentes à microbiota humana.
MATERIAL
• 1 placa de ágar sangue
• 3 placas de ágar nutriente
• 1 recipiente com cepacol
• 1 frasco com mertiolate
• 12 cotonetes estéreis
• 1 frasco com salina estéril
• iodopovidina (iodo ativo a 10%)
• 1 sabão em barra
PROCEDIMENTO
1. Ação de detergentes (cloreto de cetil peridínio-cepacol)
• Dividir a placa de ágar sangue em 3 partes e marcá-las: t0, t1 e t2.
• Friccionar um cotonete estéril na mucosa da bochecha e semear em t0, em zigue-zague.
• Bochechar com solução de cepacol, diluído 1:2 em água, durante 1 minuto. Aguardar 3
minutos, repetir a coleta de material e semear em t1.
• Repetir o procedimento anterior e semear em t2.
• Incubar a placa a 370 C por 18/24 horas.
2. Ação do mertiolate
• Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com M, sem M.
• Passar mertiolate cuidadosamente na palma de uma das mãos. Esperar secar. Umedecer um
cotonete estéril e friccionar na palma da mão, onde foi utilizado o mertiolate.
• Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com M.
• Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão onde não foi
utilizado o mertiolate.
• Semear na metade da placa marcada sem M.
• Incubar a 370 C por 18/24 horas.
3. Ação da solução de iodo ativo
• Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com I, sem I.
• Passar iodo cuidadosamente na palma de uma das mãos. Esperar secar. Umedecer um
cotonete estéril e friccionar na palma da mão, onde foi utilizado o mertiolate.
• Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com I.
• Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão onde não foi
utilizado o mertiolate.
• Semear na metade da placa marcada sem I.
• Incubar a 370 C por 18/24 horas.
4. Ação de sabão em barra
• Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com S, sem S.
• Lavar uma das mãos com sabão e enxugar com toalha de papel.
56
•
•
•
•
•
Umedecer um cotonete estéril em salina e friccionar na palma da mão lavada.
Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com S.
Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão não lavada.
Semear na metade da placa marcada sem S.
Incubar a 370 C por 18/24 horas.
RESULTADOS
Complete as tabelas com os resultados obtidos.
ÁGAR SANGUE
Sem cepacol (t0)
Com cepacol (t1)
Com cepacol (t2)
ÁGAR NUTRIENTE
Com mertiolate
Sem mertiolate
Com sabão
Sem sabão
QUESTÕES
1. Os antissépticos utilizados são eficientes? Justifique.
2. Suponha que a partir dos resultados obtidos, você quisesse comparar a eficiência dos
antissépticos testados. Como você poderia fazer?
3. Observe as colônias crescidas no ágar sangue. Alguma produziu hemolisina? Justifique.
4. Faça o teste da catalase com as colônias crescidas em ágar sangue. Quais os resultados
obtidos?
OBS.: TESTE DA CATALASE
Coloque 1 gota de água oxigenada (H2O2) na superfície de uma lâmina de vidro. Com
auxílio de um palito, retire material da colônia escolhida e misture com a água oxigenada.
Observe se ocorreu a formação de bolhas, o que corresponde à resultado positivo: a bactéria
em questão produz a enzima catalase.
5. Faça a coloração de Gram para uma colônia catalase +. Qual o resultado?
57
ATIVIDADE 18
CONJUGAÇÃO BACTERIANA
INTRODUÇÃO
Há várias maneiras pelas quais as bactérias adquirem material genético de outras bactérias.
A conjugação é um desses processos, e envolve troca de material genético entre duas células
bacterianas íntegras e em contato célula-célula.
Nessa atividade você vai investigar um processo de conjugação bacteriana que envolve a
aquisição de marcas de resistência a antibióticos.
MATERIAL
1 mL de caldo nutriente
3 placas de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (50 µg/mL) e ampicilina (50 µg/mL)
1 placa com ágar nutriente
1 alça bacteriológica
2 amostras bacterianas cultivadas em meio líquido, apresentando as seguintes características:
Amostra
Fermentação de lactose
Marcas de Resistência
cromossômica plasmidiais
s
A (E. coli J53 (pR1))
lac +
Et, Clo, Ap*
B (E. coli MA 3456)
lac NaI
*Et = estreptomicina, Clo = cloranfenicol, Ap = ampicilina
PROCEDIMENTO:
1. Em um tubo de ensaio adicionar:
- 1 mL de crescimento em caldo nutriente da amostra A
- 1 mL de crescimento em caldo nutriente da amostra B
- 1 mL de meio nutriente.
- Incubar a 37°C durante 1 hora no mínimo.
2. Semear as placas contendo meio seletivo MacConkey + NaI50 + Ap50 as amostras A, B e
a mistura M.
3. Semear com alça bacteriológica, as mesmas culturas em meio não seletivo.
Incubar as placas por 16-18 horas.
RESULTADOS
Descreva o que ocorreu nas placas contendo ágar
MacConkey e ágar nutriente.
DISCUSSÃO
1. Como você interpreta os resultados obtidos?
2. Por que você semeou as amostras em ágar nutriente?
58
ATIVIDADE 19
PREPARAÇÃO PARA ESTUDOS MICROSCÓPICOS DE FUNGOS
COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL-ALGODÃO
INTRODUÇÃO
O método com lactofenol azul-algodão é usado para preparar exame microscópico de
colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e
reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e
reprodução por brotamento de leveduras.
MATERIAL
•
•
•
•
Culturas de fungos diversos
1 frasco conta-gotas com Lactofenol azul-algodão
Lâminas e lamínulas
Alças de platina
PROCEDIMENTO
a) Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina.
b) Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura,
com auxílio de uma alça de platina estéril.
c) Colocar o fragmento da cultura sobre a gota de lactofenol ou a alíquota de levedura.
d) Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio na objetiva de 10 e 40 vezes.
RESULTADO
Visualizar e esquematizar os fungos observados ao microscópio.
Fungo:
Fungo:
Fungo:
Fungo:
59
DISCUSSÃO
1. Os fungos observados têm a mesma morfologia? Explique.
2. Há alguma classificação dos fungos baseada na morfologia? Exemplifique.
3. Um aluno escreveu que os esporos de fungos têm a mesma função daqueles encontrados nas
bactérias. Você concorda? Justifique.
60
ATIVIDADE 20
MICROCULTIVO DE FUNGOS
INTRODUÇÃO
Este método possibilita a obtenção de estruturas em boas condições para o estudo
morfológico detalhado.
1ª ETAPA: Preparo do microcultivo
MATERIAL
• 1 Placa de microcultivo esterilizada, montadas conforme o esquema, com o seguinte material
• 1 placa de Petri
• 1 pedaço de papel filtro
• 1 bastão de vidro em U
• 1 lâmina de vidro
• 1 lamínula de vidro
• placas com ágar Sabouraud com culturas de fungos diversos
• placa de Petri pequena com ágar Sabouraud estéril
• 1 pinça estéril
• 1 alça de platina
• 1 tubo de ensaio com 5 mL de água destilada estéril
PROCEDIMENTO
• Com a pinça, coletar um quadrado de aproximadamente 1 cm de lado, de ágar Sabouraud
estéril e colocar sobre a lâmina da placa de microcultivo.
• Com auxílio da alça de platina, coletar uma alíquota da cultura de fungo e semear num dos
lados do quadrado de ágar Sabouraud (veja letra g do esquema). Repetir, semeando no lado
oposto.
61
•
•
•
•
•
Cobrir o ágar semeado com lamínula.
Colocar 5 mL de água destilada na placa de Petri, embebendo o papel filtro.
Colocar as placas de microcultivo dentro de um recipiente com tampa.
Incubar a 370 C, durante o período necessário (aproximadamente 1 semana).
Incubar a temperatura ambiente, por 12 horas e, a seguir a 370C por 48 horas.
2ª ETAPA - COLORAÇÃO DO MICROCULTIVO
MATERIAL
• 1 placa de microcultivo crescida
• 1 lâmina de vidro
• 1 lamínula de vidro
• 1 pinça
• 1 frasco com formol a 10%
• 1 frasco conta-gotas com lactofenol azul algodão
• recipiente com desinfetante para desprezar o ágar Sabouraud crescido.
• 1 frasco de esmalte para unhas incolor.
• papel filtro
PROCEDIMENTO
• Após as colônias estarem crescidas, acrescentar 10 mL de formol a 10% na placa de
microcultivo. Aguardar 24 horas: todos os fungos estarão mortos.
• Numa lâmina de vidro limpa, colocar 1 gota de lactofenol azul algodão. Com cuidado e
utilizando a pinça, retirar a lamínula da placa de microcultivo e depositá-la, com a face onde
cresceram as colônias de fungos, sobre a gota de lactofenol azul algodão.
• Com a pinça, retirar o quadrado de ágar Sabouraud da placa de microcultivo e desprezá-lo no
recipiente com desinfetante.
• Colocar 1 gota de lactofenol azul algodão sobre a lâmina de vidro onde estava o quadrado de
ágar Sabouraud. Cobrir com lamínula. Temos, então, duas lâminas com as colônias crescidas.
• Com auxílio do papel filtro, secar o excesso de corante das bordas das lamínulas, dessas duas
lâminas, procure não mover as lamínulas.
• Após as bordas estarem secas, passar o esmalte cuidadosamente nas bordas das lamínulas.
Esperar secar e passar novamente o esmalte.
• Observar ao microscópio e desenhar o observado.
RESULTADOS
• Desenhe os fungos observados com legendas.
62
DISCUSSÃO
1.
2.
3.
4.
Classifique os fungos observados de acordo com sua morfologia.
Por que foi utilizado papel filtro embebido em água?
Por que o cultivo foi mantido em recipiente fechado, durante o período de incubação?
De acordo com os resultados obtidos nos diversos experimentos, o que você pode dizer a
respeito da velocidade de crescimento de bactérias e fungos? Justifique.
63
ATIVIDADE 21
ESTUDO DE VÍRUS
INTRODUÇÃO
Os vírus podem ser estudados, indiretamente, pelos efeitos que causam às células hospedeiras.
Nesta atividade, você vai investigar a ação de vírus parasitas de bactérias.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
Cultura de E. coli
1 placa de Petri com ágar nutriente
1 alça de Drigalski estéril
1 recipiente com álcool
1 pipeta de 1 mL estéril
1 cotonete estéril
PROCEDIMENTO
Embeber o cotonete na cultura de E. coli, retirar o excesso e semear na placa de ágar nutriente.
Esperar secar.
Colocar sobre essa semeadura 0,5 mL de esgoto, com auxílio de uma pipeta estéril.
Espalhar com alça de Drigalski.
Esperar secar.
Incubar a 37°C por 24 horas.
Observar cuidadosamente a placa, verificando a ocorrência de falhas no crescimento bacteriano.
RESULTADO
Número de falhas observado: _______________________
DISCUSSÃO
1. Como você explica a formação dessas falhas?
2. Por que foi utilizado esgoto?
3. A que se relaciona o número de falhas encontrado?
64