CONTRIBUIÇÃO
PARA
A
CARACTERIZAÇÃO
RECEPTORES SEROTONINÉRGICOS
E
“IN
VIVO”
DE
NEUROPEPTIDÉRGICOS
E DO SISTEMA DO ÓXIDO NÍTRICO EM VASOS PERIPAPILARES
RETINIANOS
DO
COELHO:
IMPORTÂNCIA
VASCULARES DA DOENÇA ISQUÉMICA
NAS
ALTERAÇÕES
3
Dissertação de Doutoramento apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de Coimbra
4
A Faculdade de Medicina de Coimbra não aceita qualquer responsabilidade em
relação à doutrina e à forma desta dissertação
(Reg. da Fac. de Med. de Coimbra, 1931. Art.108º § único)
5
“Mas deixarei o pouco que aprendi ser divulgado para que alguém possa
melhor do que eu adivinhar a verdade, e com o seu trabalho provar e rebater o
meu erro. Então sentirei a satisfação de saber que foi através de mim que essa
verdade chegou à luz do dia”
Albrecht Dürer citado por K. Popper
6
Trabalho efectuado em Coimbra, durante a vigência de uma Bolsa de
Doutoramento concedida pela Junta Nacional de Investigação Científica
(JNICT), nos seguintes locais:
- Instituto de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de
Medicina da Universidade de Coimbra, Coimbra (Directora: Profª Doutora Tice
Macedo).
- Centro de Oftalmologia do Instituto Biomédico de Investigação da Luz e
Imagem (IBILI), Coimbra (Director: Prof. Doutor José Cunha-Vaz).
Apoio científico de treino e supervisão nos Estados Unidos da América
no:
- Departamento de Oftalmologia (Physiology and Pharmacology Research
Unit) do The Mount Sinai Medical Center, Nova Iorque (Director: Prof. Doutor
Oscar Candia).
- Departamento de Vítreo-Retina do Wilmer Eye Institute (Johns Hopkins
School of Medicine) – Baltimore (Director: Prof. Doutor Morton Goldberg).
7
Aos meus Pais, aos meus Tios Manuel Gaspar M. da Rosa e Jesuína Ascensão
Nunes Rosa e aos meus filhos Alexandra Sofia e Francisco Maria. Foi por eles e
com eles que realizei este trabalho.
8
A todos os meus Mestres, com profunda gratidão. Sem eles nada seria possível.
9
PREFÁCIO
Sendo tradicional apresentar na dissertação de doutoramento um
preâmbulo que engloba as motivações do estudo concretizado, as determinantes
da sua forma e o reconhecimento a todos quantos contribuíram para a sua
execução, não nos escusaremos naturalmente a esta tarefa.
Desde cedo nos entusiasmou a análise interpretativa dos fenómenos
biológicos e a sua integração no campo da fisiologia, circunstâncias essenciais
para uma melhor percepção da patologia e necessariamente para uma profícua
utilização da técnica terapêutica.
O facto de termos ingressado numa especialidade médico-cirúrgica
(Oftalmologia) dum Serviço (Hospitais da Universidade de Coimbra) com larga
tradição no estudo dos vasos retinianos em condições normais e patológicas, e
pela sua complexidade fisiológica aliada às dificuldades de tratamento das
patologias vasospásticas, que apresentam na sua maioria, um envolvimento
também neuronial de significativa importância e ainda sem solução terapêutica
de eficácia comprovada, acicatou o desejo de conhecer mais profundamente a
natureza da complexa fenomenologia vascular retiniana. Situam-se, a este nível,
patologias como as oclusões da artéria e veia centrais da retina, a neuropatia
óptica glaucomatosa (onde se enquadra o glaucoma normotenso, referenciado
por alguns autores como coincidente com outro tipo de patologia vasospástica
como a enxaqueca), a neuropatia óptica da pré-retinopatia diabética e outras
vasculopatias retinianas.
Quando, em 1993, procurámos desenvolver os estudos de caracterização
farmacológica dos vasos da retina na sequência do desenvolvimento da
metodologia e técnica necessárias a este estudo, concretizadas com uma tese de
10
Mestrado em Oftalmologia entitulada “Estudos da permeabilidade dos vasos
retinianos in vivo por técnicas de micropunção - desenvolvimento da
metodologia e técnica”, considerámos então a área bastante atractiva e
merecedora de um estudo interessante, mais alargado, que possibilitasse um
melhor conhecimento e a caracterização destes vasos sob o ponto de vista
farmacológico e de eventuais perspectivas terapêuticas oftalmológicas. O
presente trabalho representa ainda o prolongamento de ensaios experimentais
anteriores integrados no mesmo domínio, nomeadamente nos que eclodiram na
citada tese de Mestrado. Os meus Mestres, Professores Doutores Tice Macedo e
José Cunha-Vaz, incentivaram o desenvolvimento do plano de actividades que a
concessão de uma Bolsa de Doutoramento, possibilitou. A execução do trabalho
experimental decorreu em Portugal com deslocações frequentes a diversos
países europeus e em particular aos Estados Unidos da América para
apresentação e discussão dos resultados parciais, onde trabalhámos com grupos
de investigação da mesma área.
Assim, para o desenvolvimento da técnica cirúrgica necessária ao trabalho
experimental, foi de capital importância o contacto directo com a equipa de
investigação da secção de retina cirúrgica superiormente dirigida pelos
Professores Doutores Eugene De Juan Jr. e Peter Campochiaro, no Wilmer Eye
Institute da Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore (Estados Unidos
da América).
Também a prestimosa colaboração do Professor Doutor Oscar CandiaMount Sinai School of Medicine e Mount Sinai Hospital, Nova Iorque- também
nos Estados Unidos da América, nas vertentes de fisiologia, farmacologia e
terapêutica oftalmológicas, foi-nos particularmente gratificante, dada a sua
longínqua experiência no campo, de reconhecimento internacional.
A motivação inerente à execução de tão árduo e vasto trabalho decorrido
durante uma década (com interrupções pontuais decorrentes do trabalho
11
profissional em geral e especificamente na área do glaucoma), foi além do
entusiasmo e do fascínio que este campo das ciências fisiológicas sempre nos
despertou, o desejo de contribuir, ainda que de forma modesta, para o desvendar
de algumas interrogações que a Natureza ainda nos reserva no dealbar do
terceiro milénio.
Na prática, a investigação não constitui motivo de revolução no âmbito da
farmacoterapia. Contudo, as conclusões procedentes da análise crítica dos
resultados obtidos, permitirão, admitimos, ilustrar certos dados essenciais à
melhor compreensão dos sistemas de regulação vascular retiniana e fornecem
elementos para estudos complementares de índole fisiológica, de natureza
farmacológica e com repercussão terapêutica.
Apesar dos apoios citados que possibilitaram o trabalho exequível, quer
de ordem humana quer material, não foi sem dificuldades que o desenvolvemos
e concluímos, já que as dúvidas, por vezes, sobrelevaram as certezas, os
materiais, de elevado custo, nem sempre estiveram à nossa inteira disposição e a
ocupação clínica e o dever familiar retiraram-nos algum desse precioso tempo.
No entanto, não poderíamos terminar este preâmbulo sem uma palavra de
reconhecimento a quantos contribuíram, directa ou indirectamente, para que esta
pequena obra se concretizasse. Em particular:
À Senhora Professora Doutora Tice Macedo, que desde sempre orientou a
nossa formação em Farmacologia com o saber de Mestre insigne e com
reconhecida competência na área, e a quem devemos, como homem, o exemplo
de um labor sério e contínuo e a Amizade que sempre nos honrou e que
desejamos merecer;
Ao Senhor Professor Doutor José Cunha-Vaz que nos orientou para esta
área das ciências da visão e nos concedeu todas as facilidades para maior
12
aproveitamento do trabalho, prestando apoio incondicional desde o princípio,
com o seu conhecimento científico e Amizade;
Ao Senhor Professor Doutor Fontes Ribeiro, e de forma especial, por
todos os ensinamentos que nos ministrou, pelo seu incentivo e paciência
constantes desde a primeira hora, apesar dos nossos atarefados trabalhos na área
clínica oftalmológica, pela sua inteira disponibilidade e ajuda preciosa na
elaboração dos artigos científicos, a quem ficamos devedores de elevado apoio
científico e também grande testemunho de Amizade;
Ao Senhor Professor Doutor Oscar Candia que nos concedeu todas as
facilidades para maior aproveitamento do trabalho aquando das nossas
deslocações ao seu Serviço nos Estados Unidos da América, pelas revisões dos
trabalhos publicados, e a quem ficamos a dever provas inestimáveis de calor
humano, acolhimento generoso e rigor científico;
Ao Senhor Professor Doutor Eugen De Juan Jr, nosso Mestre em cirurgia
intraocular e grande humanista, pelos conhecimentos que nos transmitiu na
metodologia aplicada a nível intraocular para o desenvolvimento deste trabalho;
À Junta Nacional de Investigação Científica (JNICT) agradeçemos a Bolsa de
Doutoramento que nos concedeu graças à qual foi possível este trabalho.
13
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
14
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
O fluxo sanguíneo na microcirculação oftálmica que se processa
através da artéria oftálmica para as artérias ciliares anteriores e
posteriores (curtas e longas), alimenta a circulação coroideia e uveal. A
artéria central da retina e as cílio-retinianas asseguram a circulação
retiniana. Neste leito vascular é essencial um controlo regulador do
fluxo sanguíneo para a circulação normal da retina. A circulação
coroideia exerce um papel importante no suporte metabólico da retina,
em condições normais e patológicas, em particular no descolamento
exudativo da retina e nas situações de isquémia como a degenerescência
macular relacionada com a idade, o glaucoma e a retinopatia diabética
(Albert et al., 1993; Jarajapu et al., 2004). É, porém, conhecida a
dificuldade de acesso experimental da coróide e a sua interferência na
circulação retiniana, que não têm permitido um melhor conhecimento
dessa interrelação entre a coróide e a retina.
Não existindo inervação nos vasos retinianos e no sistema
vascular que alimenta a cabeça do nervo óptico, a circulação da retina é
maioritariamente
controlada
por
mecanismos
auto-reguladores,
desempenhando as células endoteliais um papel importante na regulação
do tónus vascular, pela secreção de factores contracturantes e relaxantes
(Hardy
et
al., 2001; Okuno et al., 2002). Outros factores
locais libertados por células vizinhas adjacentes (Yu et al., 2003), tais
como o óxido nítrico (NO) (Donati et al., 1997), prostaglandinas
(Pournaras et al., 1997), endotelina-1 (Polak et al., 2003), histamina
15
(Prieto et al., 1991), adenosina (Blazynski e Perez, 1998), lactato (Wang
et al., 2001), neuropéptidos (Ye et al., 1998) e o factor relaxante
endotelial da retina, estariam de igual modo envolvidos.
Persiste alguma controvérsia sobre os mecanismos de controlo da
circulação coroideia porque o fluxo sanguíneo nestes vasos sofre a
influência da inervação autónoma perivascular, que depende: do sistema
simpático com origem no gânglio cervical superior; do sistema
parassimpático com origem no gânglio ciliar; e ainda, do sistema
sensorial proveniente do gânglio trigémio (Silva-Carvalho et al., 2008).
A estimulação do nervo parassimpático induz vasodilatação mediada
pelo óxido nítrico, que parece ser selectiva para os vasos da coróide
anterior,
e
a
estimulação
dos
nervos simpáticos desencadeia
vasoconstrição nos vasos coroideos, por mecanismos noradrenérgicos.
Os nervos do sistema nervoso autónomo exercem, porém, efeito
regulador de curta duração no fluxo sanguíneo coroideo, por alteração
do tónus do músculo liso vascular, tornando-se necessário o
conhecimento dos outros mecanismos auto-reguladores locais de
controlo da circulação sanguínea ocular.
A microcirculação retiniana é a primeira a ser afectada em
doenças vasculares. O estudo da reactividade dos vasos da retina, quer
no estado normal quer no diabético ou no glaucomatoso, reveste-se,
assim, da maior importância para a compreensão da fisiologia da retina e
das alterações precoces que ocorrem na Barreira Hemato-Retiniana
nas fases iniciais da neuropatia óptica diabética e glaucomatosa e no
desenvolvimento de medidas terapêuticas apropriadas.
16
A importância dos estudos que têm vindo a ser desenvolvidos
sobre as alterações isquémicas da Diabetes resulta desta afecção
representar a principal causa de cegueira mundial (150 milhões de
pessoas), através da Retinopatia Diabética (RD). Em Portugal, um
estudo populacional realizado no Cartaxo (1991) indica que 28,5% de
casos de cegueira ocorreram em indivíduos com retinopatia nãoproliferativa na Diabetes Tipo I e em 10,7% dos portadores de
retinopatia proliferativa. Nos Estados Unidos, por exemplo, 12% da
população de cegos perdeu completamente a visão devido à Diabetes
Mellitus. A nível mundial estima-se que esta doença é ainda responsável
por cerca de 20% de todos os novos casos de cegueira que ocorrem entre
os 45 e os 74 anos de idade (Klein, 1974) e que 91% dos diabéticos com
doença de evolução superior a 21 anos, apresentam retinopatia diabética
(Jerneld, 1980). A prevalência da doença em Portugal é de cerca de 57%. Calcula-se em cerca de 200.000 o número de doentes portugueses
em risco de desenvolver complicações oculares potencialmente graves,
de entre os cerca de 500.000 diabéticos existentes no país.
Todas as medidas terapêuticas de que dispomos actualmente são
dirigidas às fases tardias da doença e impedem apenas a sua progressão.
Existe, portanto, necessidade urgente de entender a fisiopatologia da RD
logo nas fases iniciais de pré-retinopatia, de modo a poder modificar o
seu prognóstico com medidas preventivas e novas terapêuticas (CunhaVaz, 2005). Sendo assim, o conhecimento dos mecanismos envolvidos
nas alterações da permeabilidade da Barreira Hemato Retiniana (BHR)
na fase de pré-retinopatia, através da análise morfofuncional dos vasos
retinianos, quando sujeitos a variações quantitativas e qualitativas de
17
substâncias endógenas e de síntese, permitirá, num futuro próximo,
sugerir possíveis aproximações terapêuticas.
O actual estado de conhecimentos sobre as lesões anatómicas e
funcionais que existem a nível vascular retiniano, em modelos de
diabetes experimental de mamíferos é já considerável. Para a sua
indução utilizam-se normalmente dois tipos de substâncias: a
estreptozotocina e a aloxana (Christiansson et al., 1958). A ruptura da
BHR (transporte através de vesículas pinocíticas e interendotelial via
tight junctions) em coelhos com diabetes induzida pela aloxana, foi
avaliada pela perda de substância de contraste vascular por análise de
imagem. Trata-se de um modelo reprodutível, principalmente quando
usado na fase de pré-retinopatia diabética (Herse, 1994).
Alterações a nível endotelial, pericítico e muscular liso foram já
amplamente demonstradas por vários autores nas últimas quatro décadas
(Flage, 1977; Riva, 1981; Kaiser, 1997; Orgul, 2007). Existe, de facto,
uma degenerescência selectiva dos pericitos retinianos, típica da RD,
bem como o espessamento da membrana basal em múltiplos tecidos
humanos e animais, neste modelo de diabetes experimental (Osborne,
1990). Foi ainda comprovado que o estado permanente de hiperglicémia
durante 2-3 meses após indução de diabetes com aloxana (100 mg/Kg)
em dose única durante 3 meses, provoca modificação selectiva da
expressão de receptores para as endotelinas, por exemplo, em pericitos
retinianos de bovinos, o que se traduz por modificações do fluxo
sanguíneo retiniano na hiperglicémia e na diabetes, por vasodilatação
das arteríolas retinianas (Herse, 1994). A hiperglicémia moderada e
permanente (mimetizando uma diabetes do tipo I) produz alterações do
fluxo sanguíneo retiniano (com vasodilatação) cuja fisiopatologia
18
permanece por esclarecer (Skimmer, ISOPT, 2006). O estado induzido
corresponde a um stress hipóxico, através de um aumento da relação
NADH/NAD+ (Williamson et al., 1997). A proteína ZO-1 existente na
BHR interna encontra-se substancialmente reduzida nas tight junction de
ratos diabéticos, aumentando a permeabilidade da BHR (Khin et al.,
1997). A diabetes como doença neurovascular compreende: leakage
(exudato) vascular, apoptose neuronal das celulas ganglionares,
inflamação e disfunção astrocitária (células de Muller) (Gardener,
2004).
O aumento da dilatação arteriolar e venosa ocorre bastante cedo
na diabetes, um fenómeno atribuído, em parte, ao efeito do óxido nítrico
(NO) sintetizado no endotélio vascular pela sintetase respectiva e depois
libertado para os pericitos e células musculares lisas. Recorda-se que
nos últimos anos foi possível confirmar este efeito modulador in vivo do
óxido nítrico (Stitt e McDonald, 1997; Pournaras et al., 1997). Convém,
no entanto, recordar que as células endoteliais de diferentes espécies
apresentam normalmente uma grande heterogeneidade in vitro nos
aspectos morfológico, funcional e bioquímico com resultados distintos,
não homogéneos, de qualquer estudo funcional efectuado nestas
condições (Yan et al., 1998). Este mediador endógeno está implicado
nas alterações verificadas entre as células de suporte retiniano e o
endotélio vascular da retina na patologia isquémica.
A retinopatia diabética (RD) nos seus múltiplos estadios, continua
a ser um problema grave de saúde pública, como já foi referido, e os
métodos terapêuticos usados no seu tratamento são ainda paliativos e
bastante agressivos, como a laserterapia, não se prespectivando ainda a
possibilidade de uso de fármacos ideais para a sua prevenção e
tratamento e desconhecendo-se a melhor via de administração dos
19
disponíveis (tópica, intravítrea, retrobulbar ou outras), face à dificuldade
de acesso ao meio intraocular. A existência das duas barreiras (BHR e
BHE) semelhantes do ponto de vista funcional e anatómico, reporta-nos
também para os fenómenos de natureza vasospática, relacionados com
patologia do tipo migraine.
Conhecem-se
hoje
alguns
dos
fenómenos
inflamatórios
subjacentes à patologia diabética. Do ponto de vista clínico o maior
interesse dirige-se ao tipo de patologia intraocular que envolve as
alterações vasculares, como as oclusões vasculares retinianas, com a sua
problemática hiperpermeabilidade e neovascularização, presentes na
neuropatia óptica isquémica. Admite-se que as respostas aos mediadores
envolvidos no controlo do tónus vascular estão alteradas na diabetes tipo
I: o aumento da permeabilidade consecutivo ao maior transporte inter e
paracelular (através da abertura das tight junctions) e intra e transcelular
(pelas vesículas intracitoplasmáticas e das fenestrações) justificaria
essas alterações (Murta, 1990; Flammer, ISOPT, 2006). Na retinopatia
diabética as células endoteliais apresentam um número reduzido de
vesículas pinocitóticas e de transportadores específicos. Duas classes de
moléculas transmembranares estão aí presentes: as ocludinas e as
claudinas (Grieshaber, 2007), com funções de barreira (gate). Por outro
lado, as células murais microvasculares, referidas como pericitos, são
cruciais para a sobrevivência das células endoteliais em situações de
stress oxidativo, como acontece na diabetes. Esta patologia, mesmo de
início recente, acelera a morte das células endoteliais por um processo
semelhante à apoptose, admitindo-se a necessidade da presença de um
substracto genético para a sua concretização, como o TP53 ou outros
(MYC, BCL2 e RAS) (Ridley M, 1999).
20
A diminuição de NO e de VEGF são os responsáveis pelas
oclusões arteriolares na doença diabética, com perda de pericitos
anterior à perda de células endoteliais, vasodilatação subsequente e
espessamento da membrana basal. Desconhece-se a causa da sua perda,
já que nenhum deles necessita de insulina para o transporte da glicose.
Posteriormente verifica-se um aumento do VEGF, da proliferação
endotelial compensatória e ainda da permeabilidade, com diminuição da
Tensão
Intraocular
(TIO),
edema
macular
compensatório
e
neovascularização. No diabético a resposta surge com um aumento da
insulina, da L-Arginina e do NO. Porém, a NG-nitro-L-arginina, um
inibidor da sintetase do óxido nítrico, reduz também o fluxo coroideu 60
e 120 minutos depois da administração do fármaco mas não aumenta,
todavia, o fluxo na retina, na íris e no corpo ciliar (Chiou, 1995).
O Glaucoma é, como se referiu, a segunda causa de cegueira no
mundo. A sua incidência é de 1-2% da população com mais de 45 anos
correspondendo a cerca de 70 milhões de pessoas envolvidas, das quais
aproximadamente 7 milhões já cegaram. Os dados disponíveis na
literatura estimam que, só nos USA, 2,22 milhões de pessoas sofrem de
Glaucoma. Cerca de 12% cegam aos 20 anos de doença. A redução das
TIOs abaixo dos 22-25 mmHg (dependendo dos critérios) têm sido a
única solução terapêutica. O Glaucoma apresenta alterações vasculares
retinianas
importantes
(Flammer
et
al.,
2005).
A
abordagem
hemodinâmica em relação à sua etiologia vascular passou nos últimos
vinte anos da simples medição de diâmetros vasculares em doentes
glaucomatosos (ainda sem conclusões consistentes à vista) até às
avaliações directas quantitativas do fluxo sanguíneo.
21
Na sua vertente congénita com a descoberta do gene CYP1B1,
OPTN e o MYOC, na vertente inflamatória com o pseudoesfoliativo, ou
ainda no glaucoma de ângulo fechado ou o de pressão normal (todos de
difícil solução clínica e de prognóstico reservado), tem-se procurado
solucionar estes padrões patológicos pelo recurso a novos fármacos
baseados no RNA curto de transferência ou utilizando células mãe
(estaminais), multiplicando-se os estudos multicêntricos internacionais e
protocolos terapêuticos com algoritmos de tratamento médico-cirúrgico,
com base na análise clínica e em provas funcionais e morfológicas para
a sua avaliação (Fernandez Vila, 2008).
Os doentes com glaucoma de pressão normal relacionado com a
migraine (Corbett, 1985) ao contrário do glaucoma primário de ângulo
aberto, têm um risco elevado de perda de visão e apresentam
vasospasmo periférico (Alon Harris, Mónaco, ISOPT, 2004).
Nas doenças vasculares que se iniciam com vasospasmo, são as
artérias com menos de 200 µm as que mostram maior resistência (Riva,
1987). Verifica-se uma grande variabilidade inter-individual, em termos
de resistência arteriolar, provavelmente pela dificuldade de avaliar em
simultâneo este parâmetro em dois pontos distintos do vaso, e ainda
porque a medida dos fluxos e volumes sanguíneos na retina e nervo
óptico está limitada a vasos de pequeno calibre (Flammer et al., 1996).
De entre os factores de risco mais importantes na redução do
fluxo sanguíneo ocular salientam-se: a migraine, a diabetes e as
síndromes designadas outrora de vasospásticas, entre as quais a
Síndroma de Raynaud. No glaucoma o fluxo também é reduzido,
provavelmente por vasoconstrição (Flammer, 2005). Durante o período
nocturno a pressão arterial diastólica baixa, o que induz um aumento da
tensão intraocular com um valor de pico cerca das 24 horas. Só 50% dos
22
glaucomatosos (glaucoma de pressão normal) têm problemas vasculares
(Greve et al., 1995). Existe evidência directa de que factores vasculares
contribuem para o desenvolvimento da neuropatia óptica glaucomatosa
(Harris, 2005). Nesta neuropatia, a redução de fluxo compromete
naturalmente o fornecimento de oxigénio e de glicose à célula
endotelial. Este fluxo pode ser alterado por modificação da produção de
ATP e da actividade da ATPase Na+, K+ responsável pelo controlo
iónico intracelular. O excesso de sódio intracelular conduz, como é
conhecido, à entrada directa de cálcio para o interior da célula e
indirectamente, à activação do sistema excitatório de aminoácidos
(glutamato-aspartato) ou à desactivação do inibitório (GABA/Glicina)
(Miller, 2008). A presença exagerada de cálcio intracelular activa várias
enzimas com formação de radicais livres, subsequente autodigestão
celular e morte por apoptose (Flammer et al., 2005).
A vasoconstrição no glaucoma hipertenso, com diminuição da
permeabilidade, hipoxia, morte das células ganglionares e perda de
pericitos é compensada com um aumento da adenosina, conduzindo a
vasodilatação compensatória (via receptores A1). A vasodilatação
produz um aumento da permeabilidade com uma reposição dos níveis da
TIO que diminuem e, depois, estabilizam (Osborne, ISOPT, 2006).
1.1-Importância da componente interna da Barreira HematoRetiniana nos mecanismos de auto-regulação intrínseca da
vascularização retiniana e da componente extrínseca, através de
mediação por fármacos.
23
A BHR está localizada a dois níveis, formando uma barreira
externa, o epitélio pigmentar retiniano (responsável pela maior parte da
produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)) cujos
polimorfismos se responsabilizam pelos fenómenos de angiogénese e de
isquémia retinana através de factores de transcrição como o MEF2C,
presente nas células endoteliais (Churchill et al., 2008; Maiti et al.,
2008), utilizado em terapia génica; e uma barreira interna, o endotélio
dos vasos retinianos (Cunha-Vaz, 1978). Existem numerosos estudos de
investigação sobre a primeira, pelo que nos decidimos debruçar sobre a
última, uma vez conhecida a origem neurológica comum das células
vasculares e de suporte da retina e do Sistema Nervoso Central (SNC).
O VEGF é um factor mitogénico das células endoteliais de
elevada potência e está implicado na retinopatia diabética proliferativa e
outras doenças isquémicas retinianas neovasculares (Elliot et al., 1996).
Induz vasodilatação capilar retiniana e quebra da BHR em primatas
(Ozaki et al., 1996), comprovados em estudos in vitro (Caldwell e Feng,
1996) e in vivo (Duh et al., 1996). Os receptores desta glicoproteína (fit1 e fik-1) foram já identificados a nível das células endoteliais (Chen et
al., 1996). Porém, os resultados até ao presente, com recurso a
antagonistas do VEGF na neovascularização não foram encorajadores
(Ozaki et al., 2000; Campochiaro, 2004).
O ácido glutâmico (glutamato) tem sido mais recentemente
implicado na patogénese de múltiplas doenças do SNC e na isquémia
retiniana. O estudo do seu efeito sobre a integridade da BHR foi já
efectuado, com recurso a injecção intraocular e radioisótopos. Os
resultados apontam para uma ruptura da BHR através de uma acção
directa sobre as células endoteliais ou, por efeito indirecto, através das
24
populações neuronais e/ou gliais constituintes da retina humana
(Greenwood et al., 1996). Os fenómenos de apoptose após a isquémia
retiniana e envolvimento do N-metil-D-aspartato (NMDA) com
expressão do gene pró-apoptose p53 estão largamente documentados
(Joo et al., 1999). O glutamato, actuando sobre o receptor NMDA,
aumenta o sódio intracelular que promove a morte celular directa por
lise celular e indirecta por estimulação de enzimas intracelulares, como a
proteina cinase C, cinases dependentes do sistema da calmodulina,
proteases, fosfolipases, sintetases do óxido nítrico, endonucleases,
xantinoxidase e descarboxilase da ornitina. Todas promovem apoptose,
por inibição da translação ou transcrição. No entanto, é o glutamato o
neurotransmissor que estabelece a ligação entre o neurónio e a glia.
Surgiram, consequentemente, várias questões: será a isquémia
consequência ou origem da patologia citada? Serão os fenómenos
vasospásticos nestas patologias devidos maioritariamente a processos de
natureza
inflamatória
ou
de
origem
multifactorial?
Será
a
neuroprotecção no glaucoma uma utopia ou passa também pela
resolução dos fenómenos isquémicos com subsequente aporte directo
retiniano de substâncias antioxidantes e/ou nutritivas que minimizem a
apoptose das celulas ganglionares via stress oxidativo? O agente
neuroprotector é, como se sabe, uma substância que reduz ou impede a
morte (apoptose) neuronal provocada pelo stress oxidativo. Existe
actualmente abundante bibliografia sobre os processos subjacentes à
morte celular: traumáticos, doenças degenerativas e isquémicas (Joo et
al., 1999).
Resultados recentes publicados por diversos autores (Flammer,
Harris, Jonas, 2007) indicam uma resposta afirmativa às duas últimas
questões. E foi esse o desafio que nos foi colocado quando iniciámos o
25
nosso
projecto.
Acreditámos
que,
ao
contribuirmos
para
o
esclarecimento dos fenómenos isquémicos, por deposição peri ou justapapilar de moléculas de sinalização, na proximidade dos vasos e células
das estruturas envolvidas e usando como medida os diâmetros
vasculares à distância de um disco, com a análise da variação desses
diâmetros e da dinâmica de perfusão ocular em estudos clínicos,
poderíamos concretizar algumas das respostas as estas questões.
De entre as substâncias já estudadas, com capacidade reactiva a
nível dos vasos retinianos e possuidoras de um efeito vasomotor
imediato, em estudos fundamentalmente in vitro situam-se a
Noradrenalina e a Adrenalina, o Carbacol, a Histamina, a Vasopressina,
a Angiotensina II, as Prostaglandinas, o Óxido Nítrico e Endotelinas
(Lutty et al., 1998, Gaspar et al., 2001). Algumas destas substâncias são
secretadas pelo endotélio vascular (óxido nítrico e endotelinas) e os seus
efeitos a nível dos vasos retinianos têm sido objecto de estudo em
experimentação, recorrendo a animais normais e com patologias
diversas como a obstrução da artéria e veia centrais da retina (Osborne
et al., 1988).
Alguns receptores adrenérgicos do tipo β2, α1 e α2 e também
colinérgicos foram identificados no ser humano a nível ocular (Sole et
al., 1992; Furukawa, 1987; Denis et al., 1989; Hoste et al., 1989) e,
recentemente, também no coelho in vivo, em modelo experimental
validado (Delgado et al., 2008). O sistema serotoninérgico mereceu
alguma atenção dos investigadores relativamente a alguns dos seus
receptores, tendo sido encontrados resultados curiosos a nível da artéria
oftálmica (Jarapaju et al., 2004). A opção de estudar a expressividade de
alguns receptores do sistema serotoninérgico a nível dos vasos
retinianos baseou-se no facto de pretendermos esclarecer a sua
26
participação nos fenómenos vasospásticos e não se encontrar descrito na
literatura, à data do início do trabalho experimental, nenhum estudo
equivalente, utilizando metodologia e técnica in vivo, a que se associou
o facto de ainda ser discutível a existência de inervação sensorial
(avaliada pelo sistema neuropeptidérgico) a nível dos vasos retinianos,
bem como da inervação simpática (vasoconstrictora) e parassimpática
(vasodilatadora).
Das aminas libertadas localmente, a histamina encontra-se
armazenada nos mastócitos ou basófilos e noutras células não
mastocitárias que se encontram em vários tecidos, incluindo o cérebro.
Como neurotransmissor endógeno, participa em algumas funções
cerebrais como o controlo neuroendócrino, regulação cardiovascular,
térmica, do peso corporal e do sono. A participação nos processos
imunológicos constitui, no entanto, a função fisiopatológica mais
importante da histamina após a sua libertação a partir dos mastócitos e
basófilos, não se conhecendo uma função de relevo no controlo
vascular.
A serotonina é uma amina biológicamente activa com efeitos
fisiológicos e patológicos complexos através de múltiplos subtipos de
receptores é um neurotransmissor importante, uma hormona local no
intestino, um componente plaquetar do processo de coagulação, um dos
mediadores dos sinais e sintomas do sindrome carcinóide e é aceite
como agente importante na enxaqueca. Conjuntamente com peptídeos
endógenos, prostaglandinas, leucotrienos e citocinas, designados como
substâncias autacoides (do grego “auto-curativo”) ou hormonas locais,
devido a estas propriedades, ocupam hoje um lugar de relevo no
controlo de funções diversas nos tecidos (Comtois e Katzung, 2008).
27
Também os derivados do endotélio, incluindo substâncias com
actividade vasodilatadora (PGI2 e Óxido Nítrico) e vasoconstritora
(família das endotelinas) mereceram a atenção dos investigadores na
área ocular, por actuarem localmente de modo parácrino ou autócrino,
mais do que como hormonas circulantes.
Receptores serotoninérgicos e neuropeptidérgicos responsáveis
por fenómenos isquémicos, via NO, já foram detectados em vasos não
retinianos de coelhos normais. A comparação com a sua expressividade
in vivo em coelhos diabetizados nunca foi realizada. Assim, a
necessidade de identificar este tipo de receptores a nível vascular
retiniano prende-se também com o facto da maioria das lesões
vasculares na diabetes e no glaucoma serem irreversíveis. Dos
fenómenos mais importantes que ocorrem, as dilatações arteriolar,
venosa e capilar em terrenos coroideus e principalmente retinianos, são
as mais características da diabetes. O glaucoma, hoje rotulado como
uma uma neuropatia isquémica, apresenta-se com duas vertentes: a
isquémica, com vasoconstrição e redução do fluxo sanguíneo arteriolar
que conduz à atrofia óptica com lesões nos axónios da lamina cribosa e
à apoptose das células ganglionares (Yoshida et al., 2008) e a
traumática, por aumento de pressão intraocular (Harris, Jonas, ISOPT,
2006).
No processo de análise de sistemas auto-reguladores, o sistema
serotoninérgico pareceu-nos da maior importância. Jonas et al. (ISOPT,
2006), citam-no como um dos sistemas que pretensamente se encontra
envolvido na fisiopatologia vascular do glaucoma, graças às
semelhanças entre as duas barreiras anátomo-fisiológicas anteriormente
referidas (BHR e BHE). Sheriff et al. (ARVO, 2008) apontam-no como
promissor de entre os antiglaucomatosos, com base em experiências em
28
macaco, pela facilitação do escoamento do humor aquoso a nível da
malha trabecular que os seus derivados proporcionam.
Partindo do conhecimento de que a 5-HT é um dos principais
moduladores da função sináptica na retina, Nilsson et al. (1996) em
experiências in vivo com fármacos agonistas 5-HT1B/1D conseguiram
bloquear o efeito vasodilatador cerebral provocado por activação do
sistema nervoso trigemial, em ratos (Osborne et al., 1990; Pierce et al.,
1996). A activação deste sistema parece ter importância na
fisiopatologia da enxaqueca: recorda-se que o factor de risco de
desenvolvimento de glaucoma em doentes com este tipo de cefaleia é de
2,58 vezes superior ao dos indivíduos sem enxaqueca, levando a que a
associação glaucoma / enxaqueca se revele interessante do ponto de
vista vascular (Harris, 2005).
O núcleo supraquiasmático, responsável pelo relógio biológico
circadiano nos mamíferos e, indirectamente, pelas variações circadianas
da tensão intraocular, possui o mais denso complexo terminal
serotoninérgico do cérebro. Este núcleo recebe ramos aferentes
glutaminérgicos e serotoninérgicos da retina e do cérebro médio. A
demonstração da existência de receptores serotoninérgicos a nível
arteriolar retiniano seria interessante, nomeadamente pela possibilidade
de se comparar o seu papel modulador em afecções oculares com a
patogenia da enxaqueca.
O efeito vasoconstrictor da 5-HT processa-se através de
receptores localizados morfológicamente a três níveis: terminais
nervosos simpáticos, endotélio vascular e células musculares lisas da
rede vascular dos mamíferos.
Estudos in vitro levaram a admitir que a 5-HT pode actuar através
do “endotelium derived relaxing factor “ (EDRF) quando provoca, por
29
vezes, relaxamento vascular (Hoyer et al., 1996), inclusivamente no
coelho (Leff et al., 1987). É também um vasoconstrictor relativamente
potente, em particular nas vénulas pós-capilares e nos vasos do pulmão
(Hoyer et al., 1996).
Presente no SNC e com uma distribuição localizada às áreas
cerebrais filogeneticamente mais arcaicas, o seu comportamento a nível
dos vasos retinianos nunca foi estudado. Sabe-se que as concentrações
cerebrais do seu precursor, o triptofano, dependem das suas
concentrações
plasmáticas,
existindo
variações
circadianas.
Do
triptofano ingerido, apenas cerca de 1% será transformado em 5-HT. O
seu papel na génese da enxaqueca está demonstrado, existindo uma
abundante rede de receptores 5-HT nos vasos extracranianos, sendo aí
mais potente que a noradrenalina. Os agonistas dos receptores 5-HT
possuem verdadeiro efeito profiláctico e curativo na enxaqueca
(Pauwels et al., 1998). A 5-HT apresenta também uma ligação estreita
com as perturbações do sono e as depressões. Os núcleos dos neurónios
serotoninérgicos estão maioritariamente localizados no tronco cerebral;
um segundo grupo distribui-se pelo bolbo raquidiano e um terceiro, nas
áreas dorsais da protuberância e do tegmen dorsalis. Conhece-se a
capacidade destes neurónios influenciarem as características afectivas
dos fenómenos dolorosos, “pela integração de estímulos sensitivos de
proveniência medular com a actividade de centros superiores, como os
do sistema límbico” (Hoyer et al., 1996).
O interesse crescente pelas substâncias que medeiam as acções
dos neurotransmissores e hormonas tem vindo a ressurgir nos estudos de
reactividade vascular e é visível nas frequentes actualizações da
nomenclatura destes receptores por parte de peritos da International
Union of Pharmacologists (IUPHAR). A classificação proposta em 1986
30
por Bradley et al. e que incluia a existência de três famílias de receptores
5-HT designados por 5-HT1-“like”, 5-HT2 e 5-HT3, com base em
critérios funcionais, constituiu o ponto de partida para a classificação
actual. O uso crescente de técnicas de radioligandos em membranas e
células, a auto-radiografia de fatias de tecido cerebral e o estudo dos
segundos mensageiros em células e tecidos conduziu à descrição de
subtipos de receptores 5-HT1. Tornou-se também evidente que o
receptor 5-HT1C, encontrado no plexo coroideo, está mais próximo da
família do receptor 5-HT2 pela semelhança de perfis farmacológicos e de
características do segundo mensageiro (estímulo da produção de fosfato
de inositol e sinalização pelo cálcio) o que levou também à sugestão da
existência de subtipos de receptores 5-HT2 (Hannon e Hoyer, 2008).
Uma vez iniciada a biologia molecular (1986-1988) com a clonagem do
receptor 5-HT 1A, rapidamente se chegou à clonagem dos receptores 5HT. Este trabalho levou à identificação de “outros” receptores
tentativamente designados 5-ht1E, 5-HT1F, 5-HT2F, 5-HT5A, 5-HT
5B,
5-
HT6 e 5-HT7, os quais “requeriam integração num esquema de
classificação aceitável” (Hannon e Hoyer, 2008). Como é conhecido
agora, todos os receptores 5-HT pertencem à família de tipo A dos
Receptores Acoplados à Proteína G (GPCR), mostram sequência
homóloga significativa com a rodopsina, e também com os receptores
adrenérgicos e dopaminérgicos e contêm o “DRY motif” na terceira
região em parafuso transmembranar. Com base na informação
operacional, estrutural, transducional e nos novos achados, a Comissão
de Nomenclatura de Receptores do Clube da Serotonina (Humphrey et
al.,1994) propôs um novo sistema de nomenclatura. Os princípios atrás
enunciados foram posteriormente aplicados a um número de famílias de
receptores pela Comissão de Nomenclatura de Receptores da União
31
Internacional de Farmacologia (NC-IUPHAR). A última publicação
indica que os receptores 5-HT podem ser classificados em 7 classes: 5HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-ht 1E, 5- HT1F), 5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B
e 5-HT2C), 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5 5-HT6, 5-HT7 e recombinantes (5ht5A,5-ht5B) e ainda outros receptores, designados por “órfãos”.
(Alexander et al., 2008). Para quase todas as classes é possível hoje
dispor de agonistas e antagonistas com maior ou menor especificidade,
possibilitando a caracterização dos subtipos de receptores existentes nas
diversas estruturas celulares.
Os peptídeos, elevados à categoria de neurotransmissores no final
do século XX com base em técnicas de imunocoloração, encontram-se
na retina em diferentes tipos de células, com funções a nível dos
neurónios e da rede vascular (Brecha et al., 1984). Aplicados por
iontoforese ou adicionados ao meio do banho, numa preparação de
retina perfundida de coelho, mostraram contribuir para a regulação do
fluxo sanguíneo da retina e influenciar as funções das células
ganglionares e vasculares, após libertação a partir de neurónios
retinianos, ao funcionar como neuromediadores / neurotransmissores ou
estabelecendo contacto com outros mecanismos de comunicação de
sistemas diferentes: metabólico, glial e neuronal, de modos ainda não
totalmente conhecidos (Miller, 2008).
A libertação de mediadores peptídicos pelas terminações nervosas
sensitivas
vasculares,
modificam
o
fluxo
sanguíneo
local,
a
permeabilidade vascular e a actividade do músculo liso adjacente e,
também, a inflamação intraocular (Saria et al., 1985; O’Saughnessy,
1994; Lee et al., 1997; Schmid et al., 2005). Em papilas de coelho
32
perfundidas, foi possível confirmar a sua existência e utilidade em
neurónios retinianos distribuidos em rede (Zalutsky et al., 1990).
As taquicininas são uma família de peptídeos que partilham o
mesmo grupo carboxilo terminal na sequência aminoácida (Erspamer,
1981). Pertencem a esta família a Substância P (SP), a Neurocinina A
(NKA) e a Neurocinina B (NKB) cujas acções são mediadas por três
receptores: NK1, NK2 e NK3 acoplados a proteínas G (Kimura et al.,
1993; Tatemoto, 1985).
A SP, um dos péptidos presentes no SNC onde é um
neurotransmissor, é um dilatador arteriolar potente, cujo efeito
hipotensor foi descrito por Euler e Gaddum há sessenta anos, traduzida
por uma vasodilatação generalizada. Este efeito não é bloqueado pela
atropina, o que pressupõe a sua co-libertação não associada a agonistas
colinérgicos, como acontece como o péptido vasoactivo intestinal (VIP)
(Uddman et al., 1987), embora o efeito vasodilatador do VIP possa não
envolver receptores colinérgicos nem adrenérgicos, uma vez que locais
de ligação específicos, de alta e baixa afinidade, saturáveis e reversíveis,
foram detectados em artérias cerebrais bovinas por Suzuki et al., em
1985. A SP, cujo efeito vasodilatador é dependente da dose, tem a
propriedade de aumentar a permeabilidade capilar por activação directa
da fibra muscular lisa, ou por libertação indirecta de catecolaminas, já
que este efeito é revertido pela fentolamina (Eklund, 1977). Outra
hipótese sugerida quanto ao seu mecanismo de acção foi a proposta por
Kimura
em
1993,
que
identificou
através
de
estudos
de
imunorreactividade, dois genes diferentes para a SP e a NKA, parecendo
serem libertadas simultaneamente (Mishuaddin e Nakanishi, 1986). A
acção vasodilatadora ocorre via AMPc e é mediada pela libertação de
NO a partir do endotélio. Este péptido tem maior afinidade para o
33
receptor NK1, o receptor que predomina no cérebro humano, e as
neurocininas A e B mostram também afinidade para o mesmo receptor;
a NKA é um ligando preferido para o receptor NK2 e a NKB para o
receptor NK3. A NKA e o CGRP estimulam as fibras primárias
aferentes do trigémio com sensibilidade para a capsaicina, libertando
neuropeptídeos que, por sua vez, activam receptores NK1 (McClellan e
Hazlett, 2008). A sua coexistência com outras neurocininas e com o
CGRP foi demonstrada por Stjarne em 1989 e, posteriormente, por
Wharton em 1994. Quando libertados por agentes químicos ou por
impulsos eléctricos, estes neuropeptídeos produzem vasodilatação e
aumentam o fluxo sanguíneo (Stjarne, 1989). Além de ser bastante
potente, o efeito vasodilatador da SP é de curta duração quando
comparado, por exemplo, com o do CGRP (Uddman, 1983). Prevê-se
para a SP, que continua numa fase preliminar de estudo, um papel
relevante nos mecanismos de comunicação dos diferentes sistemas,
incluindo o metabólico, glial, neuronial e vascular (Miller et al., 2008).
O peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), um
membro da família da calcitonina que também inclui a calcitonina,
adrenomedulina e amilina; está largamente distribuído nas células C da
glândula
tireóide,
nos
sistemas
cardiovascular,
gastrointestinal,
urogenital, sistema nervoso central e periférico. As suas acções são
mediadas por dois receptores designados CGRP1 e CGRP2. Têm-se
acumulado provas de que o CGRP se liberta dos nervos trigémios,
desempenhando um papel central na fisiopatologia da enxaqueca. O
péptido é libertado durante uma crise de enxaqueca, que pode ser
aliviada com antagonistas selectivos da serotonina, os quais normalizam
também os teores de CGRP intracranianos (Olesen et al., 2006). Quando
34
injectado na circulação sistémica causa hipotensão e taquicardia, por
vasodilatação acentuada, sendo conhecido como o vasodilatador mais
potente descoberto até ao presente. Efeitos relaxantes acentuados foram
observados nas artérias retinianas isoladas de bovino (Prieto et al., 1991)
e é capaz de causar uma vasodilatação acentuada nas arteríolas
retinianas do coelho in vivo (Gaspar et al. 2004), encontrando-se entre
os peptídeos que podem ser libertados pelos nervos sensoriais, porque os
seus efeitos são reproduzidos pela Capsaicina (Boussery et al., 2005).
A libertação deste tipo de mediadores peptídicos, SP, NKA,
CGRP e glutamato (GLU) a partir das fibras sensoriais do nervo
trigémio que inerva o globo ocular (ramo sensitivo oftálmico) capacita
as células neuronais a exercer o seu efeito in loco, tais como variações
no fluxo sanguíneo retiniano, alterações da permeabilidade vascular
retiniana e aumento da actividade muscular lisa (Holzer et al., 1991;
Maggi et al., 1992). Estas células que existem a nível cerebral de várias
espécies de mamíferos, incluindo o cobaio, o cão, o porco, o coelho e o
Homem (Heuring e Peroutka, 1987; Maura et al., 1993) têm os corpos
celulares na medula espinal e outros gânglios viscerais e enviam ramos
periféricos para os diversos orgãos e tecidos com arborizações varicosas
próximas das células efectoras. Reside aqui uma base anatómica para as
respostas reflexas com libertação destes peptídeos, face a agentes e
situações patológicas como a isquémia, a inflamação, a infecção, o
trauma e outras agressões.
Os ramos centrais destes neurónios sensoriais projectam-se para o
cérebro onde estabelecem sinapses com os neurónios sensoriais de
segunda ordem. Apesar dos receptores AMPA e NMDA serem aí os
mais comuns, os NK1 e NK2 facilitam a transmissão nervosa. A
presença de grandes quantidades de cálcio activa o sistema da sintetase
35
do óxido nítrico e a COX-1 no SNC, com formação subsequente de NO
e prostaglandinas, respectivamente, que se difudem nos tecidos. A
activação pré-juncional de receptores opióides, alfa-2 e GABAB inibe a
libertação destes mediadores a nível sensorial. As células neuronais
sensoriais periféricas podem serem activadas também por substâncias
endógenas como a histamina, o óxido nítrico, protões H+, ATP,
bradicinina e inúmeras prostaglandinas que são formadas nos tecidos
atingidos ou/e libertadas por células inflamatórias. Esta activação leva à
despolarização, formação do potencial de acção e propagação do
impulso nervoso aos axónios reflexos e finalmente ao SNC (Lundberg et
al., 1996). Alguns fenómenos oculares de natureza isquémica e
inflamatória, poderão ser assim explicados.
O óxido nítrico (NO), designado anteriormente por Factor
Relaxante Derivado do Endotélio (EDRF), é uma molécula de
sinalização gasosa altamente reactiva gerada no meio endógeno, que se
difunde rapidamente através das membranas celulares e participa em
variadas acções fisiológicas e patológicas (Jaffrey, 2007). É sintetisado
nas células neuroniais, endoteliais, algumas células imunitárias e outras,
por uma das três isoformas da sintetase relacionada com o NO: 1.a
sintetase neuronal, nNOS ou NOS-1; 2. a macrofágica ou indutível,
iNOS ou NOS-2; e 3. a sintetase endotelial, eNOS ou NOS-3. Estas
isoformas originam NO a partir do aminoácido L-arginina, numa
reacção dependente de O2- e de NADPH e que envolve vários cofactores enzimáticos (heme, tetrahidropterina e o dinucleótido adenina
flavina). No caso do nNO e eNO, a síntese é evocada por agentes e
processos que aumentam a concentração citosólica de cálcio. Muitas
células neuronais e particularmente as células da glia são capazes de
36
expressar a iNOS em quanidades até 1000 vezes as produzidas pela
nNOS e eNOS. Uma vez formado tem vários alvos: liga-se à
guanililciclase solúvel (sGC), activa a enzima e estimula a produção de
guanosina monofosfato cíclico (cGMP); este segundo mensageiro
fosforila a proteína cinase G (PKG) que tem várias funções celulares,
incluindo a fosforilação de canais iónicos, com redução consecutiva do
cálcio intracelular. Nas células do músculo liso vascular o NO exerce
relaxamento e efeitos vasodilatadores e nos neurónios tem funções
variadas (Olesen, 2006).
Apesar de possuir um electrão livre, o NO não é tóxico por si
mesmo. É inactivado pela oxihemoglobina que catalisa a oxidação do
NO até nitrato, que é transportado através dos vasos; também é
inactivado pelo superóxido, formando peroxinitrito, um radical livre
altamente reactivo, com efeitos lesivos nos tecidos, um mecanismo
usado na defesa contra a infecção, quando a iNO é activada e produz
níveis elevados do neurotransmissor. As substâncias que captam o anião
superóxido, como a superóxido dismutase, podem aumentar a sua
potência e prolongar a sua duração de acção.
A manipulação farmacológica do NO é conseguida com
inibidores da síntese do NO ou com dadores do NO. Além dos efeitos
significativos no tónus do músculo liso vascular e na pressão sanguínea,
por aumentar os níveis de cálcio intracelular que induz a sua síntese, o
NO é conhecido por proteger ainda contra a trombose e aterogénese,
através de vários mecanismos. Tem um papel importante na protecção
da retina e da coroide na doença isquémica, pelas suas acções
vasodilatadoras, ao prevenir a hipoperfusão pós-isquémica, via GMPc
no músculo liso e por aumento da PGI2 (endotelial) que abre os canais
de Ca2+/K+, via AMPc.
37
Como mediador entre a inflamação e as patologias de natureza
isquémica, o NO é parte integrante do sistema de auto-regulação do
fluxo sanguíneo ocular. Implicado na vasodilatação, após administração
de inibidores da anidrase carbónica, de bloqueadores dos canais de
cálcio ou da inalação de carbogénio, o NO apesar de importante na
isquémia retiniana é, por outro lado, prejudicial quando libertado de
forma anómala (Harris et al., 2003). Parece que o efeito vasoconstritor
do O2 predomina sobre o efeito do CO2, vasodilatador na arteríola
retiniana, ao contrário do que ocorre
na artéria cerebral média
(Kisilevsky et al., 2008). Experiências efectuadas por Kotikoski et al.
(2002) levaram a admitir que a sintetase induzível do NO, a isoforma
encontrada nos astrócitos do nervo óptico de pacientes com glaucoma,
poderia produzir NO em excesso, modificar a pressão intraocular e
induzir a morte selectiva das células ganglionares retinianas.
As características referidas para o NO levaram-nos a induzir
experimentalmente
no modelo animal escolhido, uma simulação de
glaucoma agudo (ou talvez melhor, hipertensão intraocular) e efectuar
estudos com modificadores da libertação de NO, tentando recolher
alguns dados que fossem sugestivos de eventual utilização
na
terapêutica antiglaucomatosa.
Já foi referido que as células neuronais expressam a iNOS em
quantidades consideráveis. Esta isoforma é independente do cálcio e
exerce efeito citotóxico e citostático, não somente nas células
patológicas, mas também nas células saudáveis. Induzida em diversas
células como fibroblastos, macrófagos e no epitélio do corpo ciliar,
especialmente após libertação de TGF-B2 e estimulação por citocinas
como a interleucina-1, o TNF-α e lipopolissacarídeos (LPS), a iNOS
38
conduziria a níveis elevados de NO (Berger et al., 2008). Alguns estudos
são sugestivos de que a iNOS se encontra nos astrócitos do nervo óptico
de pacientes com glaucoma, podendo aí conduzir à superprodução de
NO, vasodilatação associada com a inflamação aguda ou crónica,
alterando a pressão intraocular, agravamento das lesões dos tecidos com
morte selectiva de células ganglionares e degenerescência dos axónios
destas células (Liu e Neufeld, 1999). Somos levados a admitir que um
inibidor selectivo da iNOS teria um efeito protector nos astrócitos, por
reduzir a actividade enzimática, criando condições para desempenhar
um efeito protector, ao baixar a pressão intraocular (TIO), relaxar o
músculo ciliar e aumentar o fluxo ocular do sangue. A dificuldade
advém do facto de não dispormos de isoformas selectivas da iNOS.
A iNOS é sómente induzida em circunstâncias patológicas por
endotoxinas, inflamação, e determinadas citocinas, tais como a
interleucina-1 (IL-1), IL-6 e o TNFα. Uma vez induzida, a iNOS
produzirá grandes quantidades de NO por períodos de tempo longos,
levando a que seja convertido em NO2, nitritos, peroxinitritos e radicais
livres que induzem acções patofisiológicas como a atrofia do nervo
óptico e lesões da retina posterior, com degenerescência e reacções
inflamatórias crónicas, que estão associadas ao glaucoma, à doença
macular relacionada com a idade, a miopia, cataratas senis e uveites
(Chiou, 1995).
A interrelação entre o NO e o glaucoma establece-se desta forma:
sendo o glaucoma uma neuropatia óptica com “cupping” do disco
óptico, degenerescência das células retinianas ganglionares, e perda
característica do campo visual (Neufeld et al., 1999) relacionado com a
hipertensão ocular e/ou mau funcionamento do fluxo ocular do sangue,
particularmente na retina, na coróide e no nervo óptico, o seu tratamento
39
médico tem utilizado os tradicionais antihipertensores oculares, agentes
que facilitam o fluxo sanguíneo ocular. Alguns resultados indicam que
ambas as sintetases do NO e os dadores de NO poderiam ser usados para
o tratamento do glaucoma, através da redução do processador de
entrada/saída e/ou da melhoria do fluxo ocular do sangue (Nathanson,
1992; Liu, 1995, 1997; Chiou, 1995; Varma, 1995). Posteriomente
ganhou relevo a hipótese de que o glaucoma podia estar associado aos
efeitos neurotóxicos directos do NO na papila e áreas adjacentes
retinianas do nervo, com perda celular e do campo visual. Este novo
conceito do tratamento do glaucoma poderia recorrer ao uso dos
inibidores da iNOS e/ou da sua actividade (Chiou, 1995). Estamos
empenhados na definição do papel do NO na patogénese do glaucoma,
através da administração intra-ocular de inibidores da sintetase do NO
ou de dadores do NO, por medição da pressão intraocular, com base na
hipótese de que o NO possa estar envolvido na formação do humor
aquoso a nível os processos ciliares (Fleischhauer et al., 2000).
A toxicidade retiniana causada pela aplicação intravítrea de
dadores de NO tem sido referida também em coelhos. O tónus vascular é
principalmente regulado pela eNOS, e é conhecido que uma deficiência
na nNOS previne a morte celular retardada dos neurónios após
isquémia, enquanto uma deficiência na eNOS agrava o dano neuronal
isquémico. Por outro lado, a activação da NOS constitutiva com um
aumento do Ca2+ intracelular é seguida por um aumento tardio da
actividade da iNOS (Okuno et al., 2002). As alterações patofisiológicas
dos níveis de NO na retina interna poderiam afectar directamente a
sinalização do cálcio nas células ganglionares. Se a actividade do canal
de cálcio estiver suficientemente aumentada que possa conduzir à
40
acumulação de níveis destrutivos de cálcio intracelular, talvez em
conjunto com outras acções que levam à despolarização das células
ganglionares, a consequência desta sobrecarga pode ser a perda de
função das células ganglionares e dano visual a longo termo (Hirooka et
al., 2000).
Nas doenças oculares, como a RD e as oclusões venosas e
arteriais, o envolvimento vascular tem sido largamente estudado, não
acontecendo o mesmo com o glaucoma e a doença macular relacionada
com
a
idade
(DMI),
onde
a
compreensão
dos
fenómenos
hemodinâmicos está a emergir lentamente (Harris, 2005; Flammer,
2008). Factores como as necessidades metabólicas, a cedência de
nutrientes, os produtos do metabolismo, a pressão de perfusão e os gases
do sangue, bem como a diminuição do O2, do metabolismo oxidativo e
aumento da glicólise anaeróbica estão sendo cada vez mais apontados
como determinantes da doença (Rechtman, 2005), aos quais se devem
acrescentar as modificações bioquímicas retardadas consecutivas a
produtos da hidrólise de fosfolípidos (ácidos gordos polinsaturados,
eicosanoides, etc), de monoaminas (5-HT), neuropeptídeos, radicais
livres , catiões e aminoácidos, com um papel autodestrutivo nos tecidos
nervosos da retina, de modo análogo ao que ocorre em todo o SNC
(Bartlett,1994). A neuroprotecção, objectivo primário nestas patologias,
terá de assentar sobre os dados a conseguir com o estudo aturado de
todos estes intervenientes.
A terapêutica experimental já utilizou numerosos compostos que
abarcam praticamente fármacos de todos os grupos de uso comum
incluindo
esteróides,
modificadores
do
metabolismo
do
ácido
araquidónico, anti-oxidantes e inibidores de radicais livres (Mesilato de
41
Tirilazad, e Melatonina), moduladores das monoaminas (Clonidina),
agonistas de receptores opióides, gangliosídeos, hormona lbertadora de
tirotropina (TRH), antagonistas dos receptores NMDA (Memantina,
Cetamina, Dextromorfano, Fenciclidina, MK-801), antagonistas dos
canais de cálcio Flunarizina, Nimodipina) e do PAF, sem resultados
notáveis. Alguns destes agentes possuem propriedades neuroprotectoras
documentadas, como os inibidores da libertação pré-sináptica do
glutamato (Riluzol e Idrocilamida) e ainda outros são moduladores das
monoaminas (Clonidina) ou agonistas selectivos alfa2 (Brimonidina) e
beta 1 (Betaxolol), todos já usados como anti-glaucomatosos, sem
vantagens evidenciáveis.
1.2 - REVISÃO ANATÓMICA ACTUALIZADA DA INERVAÇÃO
AFERENTE, SIMPÁTICA E PARASSIMPÁTICA DO GLOBO
OCULAR.
Para uma melhor compreensão da importância da inervação
interna do globo ocular a nível interno e sua correlação com os fármacos
a utilizar em investigação, descreve-se sumariamente a sua inervação.
O olho mantém-se como um orgão especializado, de difícil acesso
sistémico dada a existência das Barreiras Hemato-Retiniana, HematoAquosa e Hemato-Vítrea já referidas. (Cunha-Vaz, 1972; Raviola,
1977). Este isolamento anatómico confere-lhe a propriedade de um
óptimo “laboratório farmacológico” de estudo, por exemplo, do sistema
nervoso autónomo.
42
O sistema nervoso simpático desce ao longo da medula espinal
nas colunas celulares médiolaterais (D1 a L2). Os axónios destes
neurónios saem da coluna por via anterior, através dos ramos
comunicantes brancos, sobem e fazem sinapse no gânglio cervical
superior, depois de passarem pelas artérias subclávias. Estas fibras, ao
deixarem o gânglio, seguem no plexo carotídeo interno ou ao longo da
artéria oftálmica no seu plexo periarterial. Ao caminharem desta forma,
entram na órbita através da fissura superior e formam a via simpática do
gânglio ciliar. Passam por este, sem estabelecerem sinapse, e
incorporam-se nos 7-10 nervos ciliares curtos. Outras fibras juntam-se
ao nervo oftálmico (divisão do nervo trigémio) ou ao seu ramo
nasociliar e inervam o músculo dilatador da íris, através dos ramos
ciliares longos. As fibras longas e curtas contêm fibras aferentes da
córnea, íris e coróide. Algumas fibras dos nervos ciliares curtos passam
do gânglio ciliar para o nervo nasociliar (via sensitiva do gânglio ciliar).
Estudos de Nilsson (1996) em coelhos, confirmam a inervação
trigeminal e ganglionar cervical superior da artéria oftálmica interna.
O
sistema
parassimpático
inclui
fibras
pré-ganglionares
provenientes dos núcleos de Edinger-Westphal e de Perlia, que entram
no olho conjuntamente com as fibras do terceiro (III) par craniano e
estabelecem sinapses na via motora do gânglio ciliar. As fibras pósganglionares caminham junto ao nervos ciliares curtos que inervam a
íris, o músculo ciliar e vasos sanguíneos (Mauger, Craig, 1994). A
activação do núcleo de Edinger-Westphal, via III par craniano, provoca
dilatação também nos vasos coroideus de algumas aves, como foi
demonstrado no pinto (Murray e Fitzgerald, 1990).
43
A inervação aferente do olho e da face, depende de um complexo
centrípeto de receptores, neurónios aferentes, núcleos do tronco cerebral
e de um conjunto de conexões com o tálamo e o córtex cerebral. O nervo
trigémio (V par craniano), com a sua raíz sensitiva, é a principal via
aferente somática. Tem a sua origem no primeiro arco braquial.
Toda a sensibilidade converge da face e do olho para o gânglio de
Gasser e depois para o cérebro, através dos ramos sensitivos do nervo
trigémio: ramo oftálmico, ramo maxilar superior e ramo maxilar
inferior. O ramo oftálmico é o mais pequeno, sendo responsável pela
inervação sensitiva de todo o globo ocular, região frontal, glândula
lacrimal e saco lacrimal, pálpebras superiores, seios frontais e região
nasal da face lateral (Kerr, 1963). Nasce do lado antero-interno do
gânglio de Gasser, entra no seio cavernoso, abaixo do nervo patético,
dando ramos para os nervos motor ocular comum, patético e motor
ocular externo. Ainda a este nível dá ramos recorrentes para o tectorium
cerebelli e para a duramater que cobre o polo occipital (Ryan et al.,
1994) e divide-se em três nervos: lacrimal, frontal e nasociliar, os quais
penetram na órbita através da fenda órbitária superior. Como já descrito,
ramos simpáticos juntam-se ao nervo oftálmico, a partir do plexo
cavernoso em redor da artéria carótida interna.
É o nervo nasociliar aquele que tem um especial interesse na
nossa investigação, por ser o nervo responsável pela inervação sensitiva
do globo ocular. São ramos deste nervo: a raíz longa (sensitiva) que
caminha para o gânglio ciliar e os nervos ciliares longos que rodeiam o
nervo óptico e se dirigem para a íris, corpo ciliar e córnea. Não existem,
até ao presente, referências quanto à inervação vascular retiniana,
própriamente dita.
44
O núcleo motor do trigémio está situado na zona média da
protuberância, junto aos núcleos dos III, IV e VI pares, a meio dos
núcleos sensitivos principais. Os centros sensitivos trigemiais formam
um conjunto de núcleos que se estende ao longo do tronco cerebral,
desde os pedúnculos cerebrais e medula até à extremidade rostral do
mesencéfalo. Dividem-se normalmente em três partes: superior, com o
núcleo mesencefálico; médio, com o núcleo sensitivo superior e
principal; inferior, com o núcleo do feixe espinhal do trigémio. É no
gânglio semilunar (Gasser) que as fibras aferentes sensitivas do trigémio
têm os seus corpos celulares. Após entrada na protuberância, caminham
em direcção dorsomediana e a sua maior parte dicotomiza-se,
originando ramos curtos ascendentes e ramos longos descendentes. Este
conjunto de fibras descendentes constitui o feixe espinhal do trigémio,
que termina numa coluna de células, longitudinal e medial ao feixe, o
núcleo do feixe espinhal do trigémio.
O núcleo principal do V par craniano recebe ramos ascendentes
curtos do gânglio semilunar e constitui a continuação rostral do núcleo
do feixe espinhal, embora com uma estrutura diferente.
Em último lugar, o núcleo mesencefálico, cuja função ainda se
encontra mal esclarecida, é constituído por uma pequena coluna celular
situada em posição imediatamente rostral em relação ao núcleo principal
(Brody, 1996).
A região mais inferior do núcleo do feixe espinhal parece ser a
que se encontra mais relacionada com a transmissão álgica (e térmica)
do nervo oftálmico (Armstrong et al., 1986). Aliás, a designada
teratomia medular, aplicada no tratamento da nevralgia do trigémio,
parece basear-se neste esquema de distribuição de fibras.
45
1.3 - INERVAÇÃO E VASCULARIZAÇÃO DA RETINA
HUMANA E DA RETINA DO COELHO.
A retina é uma estrutura fina, transparente, extraordinariamente
bem organizada, constituída por neurónios, foto-receptores, células
gliais e vasos sanguíneos. De todas as estruturas do globo ocular, a
retina neurosensorial é, sem dúvida, aquela a que se dedicou maior
número
de
estudos.
neurotransmissores
Não
como
obstante
a
já
serotonina
terem sido
detectados
e
tipos
diversos
de
neuropeptídeos, desconhece-se a sua função a este nível (Brody, 1996;
Hayreh, 1999). Fig.I
A retina vascular continua sendo um campo de estudo aberto a um
vasto conjunto de iniciativas que tenham como objectio principal
esclarecer o papel dos neurotransmissores, e o modo como poderão ser
modificados nas suas funções. Só então esse conhecimento permitirá, no
futuro, grandes expectativas no domínio da terapia localizada para
algumas das doenças hereditárias retinianas) em relação à retina
neurosensorial, e, no campo das doenças isquémicas, em relação à retina
vascular (Miller et al., 2008).
46
Fig.1 Estrutura da retina dos mamíferos e sua conexão com os vasos retinianos e
coroideus (notar o posicionamento dos vasos peripapilares em relação à divisão
topográfica das células retinianas, nomeadamente ganglionares e de suporte).
47
A inervação sensitiva (nervo trigémio), simpática (gânglio
cervical superior) e parassimpática (gânglio ciliar) no coelho, encontrase largamente estudada (Nilsson et al., 1996). A interacção entre estes
três sistemas está demonstrada através da plasticidade indutiva dos seus
neuromediadores / neurotransmissores (Kitamura, 1993). A substância P
(SP) tem sido utilizada como índex da inervação sensorial trigemial em
estudos in vivo, na íris de ratos. Furukawa et al. (1987) em vasos
retinianos do coelho e com recurso a técnicas enzimáticas, indiciaram a
presença de terminais nervosos ao longo e em redor destas arteríolas até
9 mm a partir do centro do disco óptico (única região vascularizada da
retina do coelho) e estão descritas combinações de inervação simultânea
sensorial e simpática para estruturas oculares diversas (Kitamura, 1993).
Deve-se,
todavia,
acrescentar
que a
existência
de
diferenças
morfológicas e funcionais entre diferentes espécies de mamíferos, no
que respeita à inervação vascular retiniana, é uma realidade comprovada
(Nilsson, 1996).
No coelho albino adulto, da raça Nova Zelândia, o sistema
vascular retiniano possui uma arquitectura especial (Fig.2): pertence ao
grupo dos Merangióticos, isto é, apenas parte da retina é vascularizada,
segundo a classificação de Leber (1903). Os vasos não se distribuem
uniformemente por toda a retina, antes se confinam a duas áreas de
tecido nervoso mielinizado, espalhando-se horizontalmente para o lado
nasal e temporal do disco óptico. A parte restante desta estrutura parece
ser avascular (De Juan Jr, 1987).
48
De entre as espécies de mamíferos mais frequentemente utilizadas
como modelos experimentais diabéticos situam-se o Homem, o gato, o
cão, o coelho e o rato (Guérin et al., 1996).
Fig.2- Retinografia digital (preto e branco) de coelho albino.
A artéria central da retina e a veia dividem-se em dois ramos
principais que se deslocam para a periferia das áreas referidas em forma
de asa; por vezes cruzam-se ou correm paralelas, apresentando calibres
diferentes entre si e ao longo das regiões mielinizadas. Ambas dão
49
ramos dicotómicos na área central, equatorial e periférica (Davis, 1929).
Estes ramos tornam-se finos à medida que se caminha para a periferia.
Formam redes capilares terminais, com tamanhos e configurações
diferentes do disco para a periferia. Os capilares não se apresentam
como uma rede uniforme, variando em tamanho, forma, origem e
terminação. Por exemplo, a nível central são tortuosos, mas à periferia
são paralelos, alguns formando anastomoses entre si.
No coelho, a principal fonte de nutrientes do globo ocular e da
órbita deriva de um ramo maxilar interno da carótida externa. A artéria
oftálmica externa divide-se em vários ramos que, além de nutrirem os
músculos e os tecidos orbitários, comunicam com as artérias ciliares
longas e curtas que entram no globo ocular.
A artéria visada no presente estudo é a artéria oftálmica interna
que é pequeníssima e que, derivando do círculo de Willis e
indirectamente da carótida interna, corre através do foramen óptico para
o interior do olho, enviando um ramo anastomótico para a artéria ciliar
nasal longa e entra no disco óptico para nutrir a retina, como artéria
central da retina (Krause, 1868; Davis, 1929).
50
Fig.3- Pormenor da arquitectura neurovascular da hemiretina temporal
esquerda do coelho albino (salienta-se a visualização na retinografia de vasos
peripapilares, retinianos e coroideus).
1.4- EMBRIOGÉNESE E ESTRUTURA DOS VASOS RETINIANOS
NO HOMEM E NO COELHO.
A embriogénese da retina do coelho tem sido estudada através de
microscopia de luz e electrónica a partir do 16 º dia de gestação,
utilizando amostras entre lâmina e lamela do polo posterior central da
retina (Greiner,1982). Neste grau de diferenciação, o disco óptico
encontra-se já formado assim como o neuroepitélio e todas as estruturas
vasculares, podendo-se observar diversas figuras mitóticas entre massas
de células neuroblásticas e de futuros fotoreceptores.
51
No Homem, cerca da 4ª semana de vida, a artéria hialoide que
deriva da artéria carótida interna, penetra na cúpula óptica para ir
vascularizar o cristalino. Dela se originam as células angioformadoras
de origem mesenquimatosa que irão dar origem aos capilares retinianos.
Vão proliferar e migrar para a zona do disco óptico para,
secundariamente, se diferenciarem em artérias e veias. Dá-se de seguida
a atrofia de alguns capilares primitivos, de forma a manter uma pressão
positiva dentro dos novos vasos. Pelo 7º mês de gestação, a
vascularização retiniana já se encontra a nível do equador. A maturação
secundária dos capilares dá-se ao nascimento, com o aparecimento dos
primeiros pericitos, e a formação definitiva de membranas ocorre apenas
ao 3º ano de vida (Greiner, 1982).
No presente trabalho desenvolveu-se uma técnica onde a
substância farmacológica a estudar se coloca periarteriolarmente (cerca
de 30µm do vaso) e entre um a dois diâmetros de disco, com difusão
obrigatória para o vítreo adjacente (que serve de suporte mecânico e de
nutrição às arteriolas retinianas), pelo que nos pareceu pertinente,
apresentar ainda que sumariamente, algumas características desta
substância (vítreo).
O vítreo é um hidrogel com um volume aproximado de 3,9 ml no
adulto humano jovem (Tolentino et al., 1976), rico em colagénio, ácido
hialurónico e água (99% do seu peso). As duas primeiras substâncias são
responsáveis pela sua viscosidade e consistência, formando o colagénio
uma malha densa que dá suporte ao ácido hialurónico. Hamburg, em
1959, teria já descrito estas fibrilhas de colagénio do vítreo, sendo mais
finas e sem a estriação característica de outros tecidos. A sua
concentração em glicoproteínas (Jaffe, 1969) é diferente do colagénio
habitual, podendo ser degradadas por enzimas proteolíticas (Hogan e
52
Zimmerman, 1962). A neutralização do ácido hialurónico pode originar
o colapso do colagénio e, em consequência, a diminuição do volume do
vítreo. Além destes três constituintes encontram-se ainda, no vítreo,
glicoproteínas e albumina, glicose, aminoácidos livres e electrólitos que,
dentro da cavidade vítrea, estão em contacto directo com as arteríolas
retinianas.
A composição do humor vítreo apresenta bastantes semelhanças
com a do humor aquoso e parece existir uma difusão relativamente livre
quer entre estas estruturas e através do vítreo (Cunha-Vaz e Maurice,
1967). A sua estreita relação morfológica com a retina, o cristalino e o
humor aquoso, leva à existência de trocas de substâncias que são, em
última instância, determinantes da sua composição química (Adler,
1998).
O humor vítreo do coelho apresenta analogias morfo-funcionais
com o do ser humano do qual difere apenas por se encontrar em contacto
directo com os vasos retinianos (Cunha-Vaz, 1967).
A componente principal das arteríolas retinianas são as células
endoteliais. Histologicamente, no Homem, o seu núcleo varia em
tamanho e forma. As células são, de um modo geral irregulares, ovais ou
planas com partículas de cromatina, e coram de azul. Outro tipo celular,
as células murais, são indiferenciadas: o seu núcleo não é esférico e
varia em forma, podendo ser oval e alongado. Observadas em
microscopia óptica são mais escuras, mais pequenas que as endoteliais e
com partículas cromatínicas mais grossas. Não se encontram distribuídas
regularmente pelas paredes capilares. Como os vasos coroideus, as
arteríolas retinianas apresentam três túnicas: íntima, média e adventícia.
A íntima é formada por uma membrana basal na qual assenta o
53
endotélio. A média, próximo da papila, apresenta 5-7 camadas de células
musculares lisas, com miofilamentos bastante desenvolvidos, rodeadas
também de uma membrana basal. Entre as células musculares
encontramos numerosas fibras de colagénio. A adventícia é uma camada
espessa de fibras de colagénio, em contacto directo com a membrana
basal (Adler et al., 1998).
O endotélio vascular retiniano do coelho foi comparado ao
humano em estudos de microscopia de varrimento e, mais recentemente,
utilizando Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com contraste em
tempo real (real-time contrast). Este endotélio é estrutural e
funcionalmente diferente dos restantes do organismo. Os estudos com
recurso à RMN (De Juan et al., 1987) confirmam outros anteriores,
informando que o endotélio dos vasos retinianos do coelho é do tipo não
fenestrado que resiste à passagem de pequenas moléculas como a
albumina, inulina e fluoresceína para o vítreo (fenómeno idêntico ao que
ocorre na espécie humana) (De Juan, 1992). As células endoteliais dos
vasos retinianos e do cérebro demonstraram apresentar características
histoquímicas diferentes de outras células endoteliais vasculares: as
membranas abluminais do endotélio cerebral contém grande quantidade
de Na+/K+ ATPase e elevada concentração de mitocôndrias, cerca de 56 vezes mais do que no músculo esquelético (Murta, 1990).
As arteríolas humanas apresentam um calibre inferior a 300µm,
sem lâmina elástica interna, com uma camada muscular descontínua e
com uma íntima reduzida à camada endotelial (Friendwald et al., 1952).
De salientar que a noção da existência, na retina, apenas de arteríolas e
não de artérias, embora contestada por Hogan e Feeney (1963) e outros
autores, é de especial importância para uma interpretação mais correcta
54
da patologia arteriolar retiniana no estudo que nos propomos
desenvolver.
Localizadas na camada de fibras nervosas e células ganglionares,
as arteríolas retinianas, quando examinadas ao microscópio electrónico,
apresentam: uma camada interna de células endoteliais orientadas de
modo paralelo ao eixo do vaso; uma camada de células musculares lisas
orientadas circular e longitudinalmente; uma adventícia composta por
fibras colagénicas dispostas obliquamente ao eixo do vaso. No lado
externo, as arteríolas estão separadas da camada de células nervosas
pelas membranas basais das células da glia e de Muller (Hogan e
Feeney, 1962; Missoten, 1964). Aparecem com frequência células
musculares lisas na adventícia. As células endoteliais encontram-se
separadas da primeira camada de células musculares por uma membrana
basal comum, que apresenta pequenos aglomerados de fibras
colagénicas, mas são isentas de elastina. As restantes camadas de células
musculares encontram-se separadas umas das outras por membranas
basais com quantidades crescentes de fibras de colagénio, e uma
espessura crescente à medida que se caminha para a adventícia. A
laminação e a cavitação da membrana basal são evidentes para o lado do
lúme do vaso, apresentando-se alguns agregados osmiofílicos em
algumas destas cavitações (Murta, 1990).
As células musculares lisas que envolvem as arteríolas não
apresentam estrutura diferente das restantes de outros tecidos orgânicos.
De entre os animais mais frequentemente utilizados em estudos
experimentais (macaco, coelho, gato e rato), as suas arteríolas retinianas
apresentam uma estrutura bastante semelhante à do Homem, à excepção
de uma menor quantidade de camadas de células musculares,
membranas basais de menor espessura e menor número de cavitações,
55
sem depósitos densos, e adventícias mais finas; no rato, por exemplo,
não se encontra qualquer camada adventicial (Hogan e Feeney, 1962).
56
CAPÍTULO II
OBJECTIVOS
57
CAPÍTULO II
2.1- JUSTIFICAÇÃO E DEFINIÇÃO DOS OBJECTIVOS
Fundamentos para a definição dos objectivos
A circulação retiniana é uma complexa estrutura de artérias,
arteríolas, veias, vénulas e capilares provenientes do disco óptico, que
nutre a retina desde a camada nuclear interna até às fibras do nervo
óptico (Leber, 1903). Apresenta valores tensionais elevados, existindo
valores idênticos entre a artéria oftálmica e a artéria carótida interna
(Pournaras, 1999). A retina é uma estrutura muito vulnerável a
obstruções de fluxo, traduzidas por isquémia. Este fluxo é regulado pelo
sistema nervoso autónomo, com excepção dos vasos retinianos. A
artéria oftálmica é ricamente enervada por fibras simpáticas até à lâmina
crivosa. A partir desta estrutura, não existe controlo da circulação
retiniana através do sistema nervoso. Apenas a coróide apresenta
controlo simpático, embora com uma flutuação de respostas a agonistas
simpáticos que, paradoxalmente, não é sempre idêntica (Dollery, 1963;
De Laye, 1998). No entanto, a administração sublingual de
nitroglicerina, por exemplo, aumenta o calibre das arteríolas retinianas.
O orgão efector do controlo autonómico é o músculo liso, cujo tónus
controla os diâmetros vasculares retinianos e a circulação sanguínea
(Alm, 1992). A falência deste mecanismo de auto-regulação é
responsável pela maior parte das doenças, como a RD e a retinopatia
58
hipertensiva (RH). A reactividade vascular vai-se degradando,
diminuindo com o avançar da idade, o que condiciona uma evolução
mais rápida da patologia citada nos idosos (Alm, 1992).
O efeito negativo de algumas doenças, como a Diabetes Mellitus,
sobre a BHR é ainda objecto de alguma polémica (Cunha-Vaz, 1979,
2004; Klein, 1980). As modificações no fluxo sanguíneo retiniano
associadas a este tipo de Diabetes são controversas e a relação destas
modificações de fluxo entre artérias, veias e capilares retinianos sempre
permaneceu também algo confusa (Blair, 1983; Grunwald, 1986;
Flammer, 2008).
O terço externo da retina, o corpo ciliar e algumas porções do
nervo óptico são irrigados pela circulação coroideia (Flammer, 2008). O
fluxo para a coróide provém das artérias longas e curtas posteriores, que
são ramos directos da artéria oftálmica, por sua vez ramo da carótida
interna (Chambers, 1994).
Na RD e nas oclusões venosas e arteriais, o envolvimento
vascular está razoavelmente estudado, não acontecendo o mesmo para o
glaucoma e a doença macular relacionada com a idade (DMI), onde a
compreensão dos fenómenos hemodinâmicos está a emergir só
lentamente (Harris, 2005; Flammer, 2008). Factores como as
necessidades metabólicas, a cedência de nutrientes, os produtos
metabólicos de passagem, a pressão de perfusão, os gases do sangue, a
diminuição do O2 e do metabolismo oxidativo com aumento da glicólise
anaeróbica estão sendo cada vez mais apontados como determinantes da
doença (Rechtman, 2005). No mesmo sentido operam as modificações
bioquímicas retardadas que ocorrem na sequência de produtos
resultantes da hidrólise de fosfolípidos (ácidos gordos polinsaturados,
eicosanoides, etc.), de monoaminas (5-HT), neuropeptídeos, radicais
59
livres, catiões e aminoácidos que têm um papel autodestrutivo nos
tecidos do SNC e na retina (Bartlett, 1994).
Os estudos in vivo no olho procuram esclarecer o comportamento
vasomotor e modulador de um conjunto de substâncias vasoactivas
endógenas e de outras exógenas sobre a circulação retiniana, em
condições de normalidade e em situações patológicas onde estarão
eventualmente modificadas qualitativa e quantitativamente (Pardridge,
1977; Brazitikos, Pournaras, 1996). Numa primeira fase recorremos a
um modelo experimental normal e, posteriormente, a modelos de
diabetes aloxânica e de glaucoma, para comparar as diferenças
encontradas.
A identificação dos mediadores com papel na regulação desta
homeostase é de capital importância para a estabilização numa fase
precoce, ou mesmo reversão das patologias já indicadas, através de
fármacos administrados por via sistémica ou aplicados in situ, mediante
o recurso a técnicas de micropunção vítrea e vascular. Embora o
interesse do estudo da circulação coroideia na diabetes pareça ser de
valor relativo, uma vez que a esse nível as alterações são inespecíficas
(Cunha-Vaz, 2004), justifica-se a nossa preocupação em estudar a
reactividade vascular retiniana. Os produtos das células endoteliais são
os principais responsáveis pela auto-regulação em resposta ao stress
fisiológico, na retina e na coróide.
As tentativas de tratamento farmacológico de várias doenças
retinianas provocadas por condições de isquémia com agentes
vasodilatadores administrados por via sistémica, têm sido infrutíferas.
Existem, no entanto, estudos sugestivos de que os fármacos
60
administrados por via endovenosa e intraocular podem ter algum efeito
sobre a circulação retiniana (Alon Harris, 2008) e é conhecida a
possibilidade de se induzir um espasmo arteriolar retiniano através da
aplicação tópica (intraocular) e endovenosa de papaverina, tolazolina e
benzoato sódico de cafeína (De Santis, 1994). Estes factos adquirem
maior consistência quando se sabe que pequenas moléculas, de peso
molecular entre 400-500 daltons, podem passar a BHR (Flammer,
2008). Parece importante referir que o peptídeo relacionado com o gene
da calcitonina (CGRP) dilatou as arteríolas retinianas, um dado obtido
em estudos experimentais in vivo (Prieto et al., 1991).
A maioria dos receptores vasculares, em grande parte dos órgãos,
situa-se a nível das células musculares lisas. No entanto, a nível dos
vasos retinianos, alguns autores situam-nos nos pericitos (Khoner,
1994), células que apresentam uma semelhança morfo-funcional com as
células musculares contrácteis. Não obstante os pericitos serem células
contrácteis análogas às do músculo liso, o estímulo fisiológico para a
sua contracção permanece desconhecido (Kohner, 1994). Estudos autoradiográficos demonstraram a existência de receptores adrenérgicos β2
nos vasos retinianos humanos (Denis, 1990) bem como a presença de
receptores histaminérgicos H1. Alm, em 1992, fazendo uma revisão
teórica sobre a regulação fisiológica e farmacológica do fluxo sanguíneo
do nervo óptico, afirmou que o endotélio dos vasos retinianos e dos que
se situam em redor do disco óptico, produzem substâncias
vasoconstritoras potentes e vasodilatadoras e que a BHR protege os
receptores do músculo liso de agentes não dependentes do endotélio.
61
Estudos de Ressonância Magnética Nuclear com ácido gadolinium
dietilenetriaminopenta-acético
(Gd-DTPA)
como
traçador,
demonstraram a ruptura da BHR em coelhos in vivo (Eugen de Juan,
1992; Berkowitz, 1992; Sato, 1993). A retina vascular do coelho
apresenta, segundo estes estudos, uma BHR análoga à dos humanos,
constituída por endotélio com tight junctions de tipo não fenestrado, que
restringe a passagem de pequenas moléculas, como a albumina e a
fluoresceína para o vítreo. É nutrida pela circulação coroideia, da qual
está separada pelas tight junctions do epitélio pigmentar retiniano
(RPE), de maneira idêntica à BHR externa no homem (Vinores et al.,
1992).
Já em 1966, Shakib et al. haviam demonstrado que as junções
interendoteliais dos vasos da retina eram diferentes daquelas
encontradas em outros vasos. Foram descritas como zonulae occludens
que, pela sua extensão, selavam o espaço intercelular; seriam mais tarde
confirmadas no cérebro e na retina, utilizando a peroxidase (Reese,
1967; Shiose, 1970) e a microperoxidase (Abdel e Smith, 1975) como
substâncias marcadoras. Estas junções estabelecem gradientes de
concentração através das membranas em que se localizam e estão
geralmente
associadas
a
mecanismos
de
transporte
activo
extraordinariamente selectivos, através das membranas celulares, que
contêm ocludinas e claudinas. Os aniões orgânicos e a glicose, por
exemplo, são transportados activamente através do endotélio retiniano,
um aspecto importante para a homeostase retiniana (DiMattio, 1981). As
características morfofuncionais da componente vascular da BHR são de
importância elevada, pois a alteração funcional desta barreira
desempenha um papel fundamental na fisiopatologia das doenças da
retina (Cunha-Vaz, 1979; Tornquist, 1979).
62
A utilização da fluorofotometria do vítreo (método quantitativo e
sensível de avaliação da permeabilidade da BHR) demonstrou alterações
da permeabilidade desta barreira, antes do aparecimento das alterações
patológicas retinianas, nomeadamente na Diabetes Mellitus (DM). Este
conhecimento foi determinante porque direccionou as atenções da
investigação para as alterações precoces nesta patologia. Ficou
demonstrado que doentes com DM tipo I e RD não detectável
clinicamente, mostravam alterações funcionais da BHR, que podia ser
revertida pelo controlo rigoroso da hiperglicémia com insulina
(Waltman, 1979). Ficou ainda cientificamente comprovado que a
deterioração progressiva da BHR nos diabéticos em fase inicial de
retinopatia diabética poderia ser estabilizada pela administração de
novos fármacos (Cunha-Vaz et al., 1992; 2004; Nilsson, 1996).
A regulação do fluxo sanguíneo retiniano, quando sujeito a
varições metabólicas e iatrogénicas, foi estudado com recurso ao
“Heidelberg Retina Flowmeter” em adultos jovens, após exercício
moderado, por Lanzl et al. (1996; 1999) que confirmaram a existência
de mecanismos de auto-regulação a nível da retina e disco óptico. Zheng
e Kanamoto (1996) mostraram que o bloqueio do gânglio ciliar em
humanos aumenta o fluxo sanguíneo retiniano, mas não altera o
diâmetro vascular e Rosenblatt et al. (2005) demonstraram que o CGRP
aumenta o fluxo sanguíneo retiniano através de mecanismos
vasodilatadores.
Diversos outros trabalhos, versando a influência dos factores
metabólicos sobre o débito sanguíneo retiniano têm já comprovado as
alterações
morfofuncionais
que
aí
ocorrem.
Estas
alterações
vasomotoras traduzem assim, indirectamente, a acção da BHR com o
seu papel regulador da homeostase retiniana (Tsacopoulos, 1997).
63
Na Diabetes a velocidade de fluxo está aumentada, por
vasodilatação; no Glaucoma diminuída, por vasoconstrição; o
estreitamento vascular foi inclusivé demonstrado, além da hipertensão
ocular, como factor preditivo do glaucoma (Angélica et al., 2001). É a
desregulação vascular (que precede o aparecimento do glaucoma) que
leva à diminuição da pressão de perfusão e à auto-regulação, já
insuficiente na doença. Esta instabilidade de perfusão conduz à isquémia
e danos de reperfusão, o designado síndrome primário de desregulação
vascular que ocorre no glaucoma, segundo este autor e que deve ser
substituido pela anterior designação de síndrome vasospástico. O
síndroma secundário resulta de uma desregulação geral sistémica,
devido a patologia diversificada como acontece na esclerose múltipla, a
arterite de células gigantes e outras (Flammer et al., 2005, 2007).
2.2- OBJECTIVOS ESPECÍFICOS
A contribuição da farmacologia clássica para o estudo da
reactividade vascular retiniana, pelo recurso a métodos baseados em
respostas contrácteis ou relaxantes das arteríolas a vários agonistas,
utilizando o clássico banho de órgãos e registador acoplado para a sua
avaliação, não é exequível, dada a fragilidade e reduzidas dimensões dos
vasos retinianos. Também a obtenção de dados in vivo no olho tem sido
limitada por problemas anatómicos associados à dificuldade de acesso
aos vasos, sem lesar estruturas adjacentes nem perturbar o equilíbrio
homeostático dos modelos, apesar dos vasos retinianos do coelho serem
64
particularmente indicados para este tipo de estudo, porque as suas
paredes estão completamente livres de tecido glial e em contacto directo
com o vítreo (Cunha-Vaz, 1967). Estudos ultraestruturais e de
permeabilidade
demonstraram
que
estes
vasos
apresentam
as
características próprias dos vasos humanos (Murta, 1990).
O estudo que pretendemos efectuar sobre os vasos retinianos
justa-papilares in vivo no coelho, em condições normais e em duas
patologias
subjacentes,
a
Diabetes
Mellitus
e
o
Glaucoma,
respectivamente a primeira e segunda causa de cegueira no Mundo, foi
desenvolvido com recurso a metodologia que considerámos adequada à
satisfação dos objectivos. Propusémo-nos desenvolver um modelo de
avaliação do diâmetro arteriolar que permitisse o estudo do efeito
vasoactivo de substâncias endógenas e de síntese, aplicadas por via
intra-vítrea, junto aos vasos da retina, com a finalidade de apreciar as
possíveis modificações arteriolares e a capacidade de modulação do
tónus vascular. Uma das dificuldades da concretização deste método
assenta no modo de execução das medidas vasculares, que acreditamos
ter conseguido ultrapassar. A identificação de mediadores com papel na
regulação desta homeostase vascular seria de grande importância para a
tentativa de estabilização ou reversão das patologias referidas
anteriormente, numa fase inicial da doença, mediante o recurso a
fármacos eventualmente aplicados por micropunção vítrea ou vascular.
Os resultados obtidos com técnicas orientadas para o cálculo do
débito circulatório retiniano têm sido contraditórios, porque as
condições de observação foram sendo modificadas pelos diferentes
investigadores (Pournaras et al., 1996). Aos vários tipos de medida
65
propostos como o método de diluição com fluoresceína (Kohner, 1992),
o laser doppler (LDV)- Riva et al., (1986), o oftalmoscópio de
varrimento por laser (SLO), entre outros, que permitem também a
avaliação rigorosa dos diâmetros vasculares (Canon, 2004), associaramse técnicas quantitativas e qualitativas de análise morfológica e
fisiológica em vasos retinianos de que se destacam:
- Fotografia do fundo ocular directa (simples) com retroprojector
de imagem (após utilização de angiógrafo para angiografia
fluoresceínica simples ou após processamento de imagem);
- Videomicroscopia com sistema de processamento de imagem
digitalizada;
- Utilização de lipossomas (incorporação e encapsulamento de
corantes fluorescentes como medida da velocidade eritrocitária);
- Calorimetria;
- Desintegração radioactiva de Krypton-85;
- Microsferas marcadas com isótopos radioactivos;
- Polarografia (clearance de hidrogénio);
- Laser Doppler Flowmetry;
-Oftalmoscópio de Varrimento (Scannig Laser OphthalmoscopeSLO) simples ou associado a vídeo;
- Tomografia de Varrimento por Laser Confocal (Confocal
Scanning Laser Tomography);
- Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com partículas de óxido
de ferro;
- Heidelberg Retinal Flowmeter (HRF);
- Color Doppler Image (CDI);
- GDX-VCC polarometria.
66
As duas primeiras desta listagem têm permitido, a um vasto grupo
de investigadores na área, medir e comparar diâmetros vasculares.
Todavia, a falta de exactidão nestas medições, originando erros de
leitura estatisticamente significativos, fizeram-nos optar, numa primeira
fase, pelo sistema digitalizado angiográfico (IMAGEnet 1024 da
TOPCON e do modelo 450 IFR ZEISS) que, além da sua alta
sensibilidade, permite decompor e efectuar um tratamento e análise da
imagem obtida em vasos retinianos sob diversos ângulos e de formas
diversas (por exemplo, em relevo), aumentando a especificidade do
método, a sua reprodutibilidade e, consequentemente, uma maior
exactidão nestas medições (Bursell et al., 1992). Oferece ainda a
possibilidade de optar por uma de duas formas de quantificação dos
diâmetros vasculares: em pixeis ou em escala aritmética (milimicras).
O desenvolvimento de um modelo experimental que permitisse a
manipulação directa dos vasos retinianos in vivo teve um interesse
básico e clínico imediatos. Com recurso a técnicas de microinjecção
perivascular nos vasos da retina em coelhos normais, diabéticos e
glaucomatosos, procurou-se estudar in vivo, pelo recurso a técnica desenvolvida no nosso laboratório, a reactividade vascular a fármacos
específicos, no coelho albino. A acessibilidade directa aos vasos da
retina e a exequibilidade desta técnica foi já reproduzida em publicações
anteriores (De Juan Jr et al., 1987; Tornquist et al., 1979; Gaspar et al.,
1992; 2004). Os vasos retinianos do coelho são particularmente
apropriados para este estudo em virtude da sua localização, ao nível da
superfície da retina, em contacto directo com o vítreo, permitindo assim
o
acesso
fácil,
visualização
directa
e
consequente
análise
67
morfofuncional (sem alterar o meio fisiológico), quando expostos a
variações qualitativas e quantitativas de diversos compostos.
A identificação farmacológica de receptores processou-se pelo
recurso a agonistas e antagonistas selectivos para os diferentes subtipos
de receptores. A análise do sistema do segundo mensageiro pelo recurso
a fármacos activos a nível das proteínas G e enzimas ligadas às
membranas não foi efectuada (Movahedi et al., 1997).
O sistema serotoninérgico, recentemente implicado na regulação
vascular de patologias como o glaucoma normotenso, bem como o
sistema neuropéptidérgico, pela sua acção vasodilatadora ainda pouco
conhecida em certos domínios oculares, mas com funções na regulação
vasomotora cerebral, incluindo os fénomenos de isquémia (Cohen et al.,
1999; Brust et al., 2000, Flammer et al., 2008) constituiram o ponto de
partida do nosso trabalho experimental. Com base na evidência
funcional de que o relaxamento das artérias cerebrais induzido pela
estimulação de nervos não adrenérgicos e não colinérgicos é mediado
pelo NO (Toda e Okamura, 1993) e do conhecimento, por
imunohistoquímica, de que a NOS está concentrada nas fibras nervosas
autonómicas na retina e vasos sanguíneos (Bredt et al., 1990),
pretendemos identificar qual a sintetase (NOS) responsável pelo
controlo da tensão intraocular (TIO) em animais com glaucoma
experimental induzido, associando o uso de inibidores da NOS.
Estudámos:
1. O efeito da Serotonina (5-HT) e de agonistas dos vários
subtipos de receptores 5-HT e recorremos ao uso de antagonistas
68
específicos para a identificação dos vários subtipos de receptores
envolvidos;
2. A presença de receptores para os componentes do grupo das
Taquicininas (péptidos vasoactivos que regulam a função neuronal
sensorial) e incluimos: a Substância P (SP), um transmissor importante
nos neurónios sensoriais; a Neurocinina A (NKA) e a Neurocinina B
(NKB), ambas responsáveis pela mediação neurogénica sensorial em
vários orgãos e em processos de natureza inflamatória (Flammer et al.,
2005; Wong et al., 2006); o Peptídeo Relacionado com o Gene da
Calcitonina (CGRP) que se encontra com a SP em fibras nervosas
sensoriais e cuja libertação do nervo trigémio desempenha um papel
central na fisiopatolgia da enxaqueca.
3. A participação do Óxido Nítrico na patogenia do glaucoma;
4. Em animais diabetizados com aloxana tentámos reproduzir o
efeito dos neurotransmissores e comparar os resultados obtidos com os
de estudos indicados em alíneas anteriores;
5. Após criação de um modelo experimental de glaucoma,
registámos as alterações observadas comparativamente aos dos animais
controlo;
6. Tendo presente que os estudos de vasomotricidade ocular
através da medição de diâmetros vasculares, implicam também estudos
hemodinâmicos de fluxo sanguíneo em paralelo (Flammer et al., 1996,
2005, 2008; Harris et al., 2004, 2005) propusémo-nos analizar as
69
diferenças de fluxo retiniano em algumas arteriolas estudadas, com
recurso a um dos meios de cálculo das velocidades de fluxo em
experimentação básica, o Ecodopler Oftálmico, utilizando o Color
Dopller Image (CDI) (Pourcelot, 1975; Harris, Arend, 1994), que
continua a ter relevância clínica em estudos como o ”Baltimore Eye
Survey-2007/2008”. A investigação clínica analiza já velocidades e
resistências, além de diâmetros vasculares retinianos a um ou dois
discos de diâmetro em crianças, adultos e em diferentes etnias (Harris e
Schimetterer, ISOPT, 2006).
70
CAPÍTULO III
MATERIAL E MÉTODOS
71
CAPÍTULO III
3.1 MATERIAL E MÉTODOS
Todas as experiências foram conduzidas em respeito pelas
normas da Comunidade Europeia para a Experimentação Animal,
Normas Nacionais (publicadas em Diário da República- DR, Série I,
nº145 de 26.06.95) e ainda da Association for Research on Vision and
Ophthalmology (ARVO) dos Estados Unidos da América, para a
utilização de Animais em Experimentação Oftálmica e da Visão. As
experiências decorreram segundo as normas citadas e ouvida a
Comissão de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de
Coimbra.
3.1.1- Modelo animal utilizado e avaliação de parâmetros
Para a concretização dos objectivos referidos servimo-nos de um
animal
largamente
utilizado
em
farmacologia
oftalmológica
(Oryctolagus cuniculus)- o coelho albino, raça Nova Zelândia (Candia et
al., 2005; Herok et al., 2008; Paulus et al., 2008; Chang et al., 1999;
Cong et al., 2008) de ambos os sexos, da mesma ninhada (foram usados
pelo menos 6 animais para cada dose de fármaco a ser avaliado), com
72
peso inicial variando entre o 2 e os 3 Kg (atingindo após a indução de
diabetes aloxânica valores de 4,5 Kg), fornecido por um criador dos
mesmos.
A manutenção e preparação dos animais foram efectuadas em
Biotério que possui instalações e meios adequados para o efeito. Para as
experiências a efectuar dispusemos de um laboratório de cirurgia
experimental com excelentes condições, encontrando-se equipado para
realizar este tipo de ensaios e usado, em cada experiência,
exclusivamente para este tipo de estudo.
Utilizou-se um sistema de microeléctrodos sensíveis ao pH
ArrowLabb (TM) Systems que foi colocado intraocularmente em
posição justa arteriolar, possibilitando a medição do pH antes e após as
experiências, com intenção de manter os valores fisiológicos exigidos na
área a avaliar. Quando estes foram utilizados conjuntamente com o
sistema de microinjecção vítrea dos fármacos a testar, fez-se uma
segunda esclerotomia para a sua inserção dentro do globo ocular (a
primeira esclerotomia é a que se realiza para introdução do sistema de
microinjecção com pipetas de diferentes calibres, descrita em pormenor
mais adiante). Esta intervenção não foi isenta de riscos (o trabalho
executado in vivo assim o determina), mas permitiu-nos assegurar a
vigilância estreita de todos os parâmetros fisiológicos, facto necessário
para a reprodutibilidade da técnica. Todas as experiências foram
realizadas entre as 9:00 e as 12:00 horas.
Colheram-se amostras de sangue arterial dos animais para
gasometria:
pH:7,40±0,03
PaO2:104,2mmHg
PaCO2:41±0,2mmHg
73
HCO3:28±0,5mEq/L
SaO2: igual ou superior a 95%
antes e após cada experiência, no sentido de observar eventuais
variações destes valores. Os coelhos em que os valores observados se
situavam fora do intervalo de valores considerados normais para a idade
e peso dos animais segundo tabelas estandartizadas, eram rejeitados. O
registo de ECG foi obtido por colocação de eléctrodos nos membros. A
pressão arterial foi avaliada continuamente após canulação da artéria
carótida sob sedação do animal (valores médios: 110 mmHg sistólica e
60 mmHg diastólica).
3.1.2- Preparação e experimentação de vários tipos de micropipetas
de microinjecção
A preparação das micropipetas para a realização das experiências
foi executada no nosso laboratório, utilizando sofisticadas técnicas
micrométricas
sob
visualização
microscópica.
As
pipetas
de
micropunção foram preparadas a partir de pipetas de vidro "Pirex" não
filamentoso, com cerca de 1,2 mm de diâmetro externo e 1,0 mm de
diâmetro interno (Drummond Scientific, Broomall Pa.). Estas pipetas
foram inicialmente estiradas numa extremidade até ficarem com cerca
de 80 µm de diâmetro, num estirador de micropipetas (Stoelting Co,
Chicago lll), para que pudéssemos aproximar em segurança do vaso
pretendido sem lesionar qualquer estrutura adjacente e para que a sua
progressão no interior do humor vítreo fosse facilitada.
Depois, com o auxílio de uma microforja (Stoelting Co, Chicago
lll) foram moldadas as pontas e as formas das micropipetas. As pontas
dessas pipetas com diâmetros externos compreendidos entre 20 e 30 µm
74
podem conter cerca de 10-20 µl de solução a injectar. A pressão de ar a
utilizar é cerca de 50 psi aplicada conjuntamente com a substância a
injectar em 5 segundos (bólus).
A pressão intraocular foi medida recorrendo a tonómetro de
Schiotz (tonometria de indentação) com 3 medições consecutivas
intercaladas por períodos de trinta minutos. Parece importante referir
que não houve variação da pressão intraocular (média±erro padrão:
22mmHg±0,3) durante todas as experiências, apesar do somatório de
líquido injectado atingir valores entre os 50 e os 100 µl. O volume
intraocular do humor vítreo (100 µl) manteve-se constante, dada a
rapidez de autoregulação verificada nos coelhos normais e a execução
técnica. Na necessidade de aumentar o número de doses crescentes a
injectar a nível do vítreo, optou-se por realizar uma vitrectomia
localizada junto ao local da ferida escleral, para diminuir o conteúdo
vítreo a nível da pars plana mantendo, contudo, o vítreo justaarteriolar íntegro, sem modificar o meio interno do globo ocular,
qualitativa e quantitativamente. Foram realizadas paquimetrias antes
das avaliações de TIO com aparelho portátil
PachPen® da
Accoutome (valores médios de 457±2 µm).
3.1.3- Padronização das técnicas de microinjecção intraocular in
vivo, a nível dos vasos retinianos
Os coelhos foram anestesiados com Cetamina, 25 mg /Kg por via
intramuscular, suplementando posteriormente a anestesia geral, sempre
que necessário, sem ultrapassar 50 mg / Kg. Após imobilização do globo
75
ocular com um dispositivo estereotáxico a uma distância fixa da lente da
câmara, as pupilas foram dilatadas através da instilação tópica de duas
gotas de ciclopentolato (0,5%) uma por cada olho, que proporciona uma
midríase por tempo suficiente, uma vez que cada experiência, após
visualização dos vasos retinianos, se desenrola num espaço de tempo
curto (30 minutos). Fixou-se a cabeça a suporte adequado (Stoelting Co,
Chicago lll) com grampos de apoio mandibulares. Uma vez exposta a
esclera, foi efectuada uma incisão na pars plana, para permitir a
introdução de micropipetas que possibilitaram a administração das
substâncias em estudo.
A temperatura corporal foi mantida entre os 38-39º (temperatura
rectal) com o auxílio de uma manta térmica colocada sobre o animal,
durante todas as experiências. O coelho foi, depois, posicionado no
suporte estereotáxico já referido (que pode ser movimentado
independentemente em três planos XYZ) e fixo a nível mandibular
através de grampos, de modo a que o globo ocular fique voltado para o
operador e imobilizado a distância fixa da lente da câmara que procederá
à obtenção de imagens (Fig. 6).
A microinjecção intravítrea e perivascular de fármacos nos vasos
da retina foi conseguida através de um sistema de micropipetas
concêntricas, fixado num microavançador mecânico especialmente
concebido para o efeito, e que se encontra acoplado a um
micromanipulador inclinado do tipo "Prior". O microavançador contém
dois suportes circulares de micropipetas e permite realizar movimentos
micrométricos independentes de cada pipeta.
76
Fig.4-Fotografia do sistema de micropipetas a inserir intraocularmente.
77
Fig.5- Esquema do “locus” de microinjecção dos fármacos a testar.
O suporte mais anterior, montado mais próximo do globo ocular,
segura uma pipeta externa que é usada como manga protectora daquela
que efectua a microinjecção. Esta pipeta é montada no suporte seguinte
e pode ser movimentada independentemente, no interior da pipeta
externa. A pipeta de microinjecção é, então, introduzida dentro do globo
ocular após incisão cirúrgica, via pars plana, e colocada, mediante
visualização por angiógrafo, junto à arteríola que se pretende estudar,
sendo depois fixada e mantida nessa posição a uma distância sempre
78
idêntica para cada conjunto de experiências. Uma terceira pipeta
concêntrica, fixada no último suporte, pode mover-se no interior da
pipeta de microinjecção, podendo ser utilizada para a recolha de
amostras do vítreo nela contido. Utilizou-se apenas na avaliação
qualitativa do humor vítreo. Este sistema permitiu inicialmente uma
maior segurança na execução experimental. Contudo, com o
desenvolvimento da técnica impondo precisão de movimentos da parte
do operador, as micropipetas externas deixaram de ser necessárias.
Foram efectuadas de seguida duas incisões esclerais a cerca de 24 mm do limbo. A distância horizontal de 2 mm entre as duas suturas,
uma vez cauterizada com diatermia, foi aberta com a ponta de um
bisturi. Após a incisão da esclerotomia (sempre inferior, de forma a
facilitar o acesso à medição de fluxos por doppler) foi colocada uma
pequena pipeta dentro do globo ocular, através da abertura escleral, e
posicionada manualmente para visualizar o melhor ângulo para a
microinjecção. A pipeta externa do sistema de micropipetas foi então
alinhada de modo a ficar paralela à pipeta introduzida manualmente.
Esta última é posteriormente removida e substituída pelo sistema de
micropipetas já anteriormente referido, fixas ao micromanipulador.
A pipeta de microinjecção é então avançada cuidadosamente sob
visualização do angiógrafo, usando o movimento fino do mecanismo de
avanço do micromanipulador. Os ajustes mais finos da sua posição são
realizados com o micromanipulador que suporta o sistema de
micropipetas. A restante circulação retiniana e coroideia, facilmente
visualizada sob o angiógrafo, é evitada. É possível, então, o estudo
directo, objectivo, in vivo, da microcirculação retiniana.
79
Após um período de equilíbrio de aproximadamente quinze
minutos procedeu-se à avaliação do efeito dos diferentes agentes
farmacológicos sobre o tónus arteriolar. Curvas de dose-resposta para
estes agentes foram obtidas pela injeção cumulativa de doses crescentes
de agonistas em bólus, aplicadas com pressão e sempre no mesmo
volume (10 µl), via pars plana, através da micropipeta de vidro com a
ponta localizada 10-30 µm do vaso a ser avaliado. Com agonistas
vasodilatadores as curvas só foram efectuadas após contracção prévia do
vaso com sumatriptano (SUM; 1 mmole/l) por via intravítrea. Quinze
minutos antes da administração do SUM, foi administrado o antagonista
ou
o
seu
solvente.
cumulativamente.
Em
Depois
todas
as
cada
agonista
experiências
foi
foi
adicionado
efectuada
a
microinjecção (bólus de 10 µl de cada vez) da solução polielectrolítica
estéril, no olho adelfo de cada coelho, como controlo.
3.1.4- Análise de fluxos com CDI (collor doppler image)
As experiências foram efectuadas com o recurso ao aparelho
doppler Siemens/Sonoline G50-MCMDO 1AA, com transducer de 6.0
Hz.
As velocidades de fluxo nas arteríolas (com diâmetro médio de
50±6 µm) foram efectuadas em áreas de 10X10 pixéis (área necessária
para o cálculo da velocidade). Foi necessário optimizar todas as
medições através da calibração e análise de intervalos de confiança. O
que se mediu foram valores relativos e não absolutos de fluxos (Alm,
2004 e Flammer, 2005) afirmam, por exemplo, referindo-se a este tipo
de estudos que o que se mede é o índice de resistência e não
80
propriamente fluxos; a velocidade, o fluxo, calculado a partir desta, e a
pressão de perfusão são os dados mais importantes a obter.
O estudo com o doppler (CDI) permite, em acréscimo, a análise
morfológica (pulsatilidade, calibre, espessamento, preenchimentos
endoluminais e assimetrias de calibres), além da medição de fluxos e sua
orientação, espectros laminares, zonas de turbulência e aceleração de
velocidades.
No coelho normal os estudos espectrais com triplo varrimento
(scan-triplex) revelam normalmente fluxos bifásicos normais, arteríolas
permeáveis e de calibre normal, sem alterações hemodinâmicas; o fluxo
costuma ser laminar, sem alteração da espessura da parede e das
velocidades arteriolares em condições de repouso. A velocidade de fluxo
(em coelhos a nível das arteríolas peripapilares da retina) é em média de
15,1±2,3 cm/s. Por exemplo, após a administração de Indometacina i.v.
(20 mg/Kg) na veia marginal da orelha do coelho para inibição de
agentes pró-inflamatórios (concretizada em algumas experiências por
alguns autores), a velocidade ou se reduz por vasoconstrição (Bill, 1984)
ou se mantém, não existindo um consenso. No Homem os valores
genéricos das velocidades sistólicas são: artéria oftálmica: 45-31 cm/s;
artéria central da retina: 15 cm/s (que é similar, por extrapolação
algorítmica, às retinianas justapapilares (Cantaloube, 1996; Lee, 2000)
ou ainda (de difícil medição) às ciliares curtas posteriores (Barbosa et
al., 2004).
O fluxo = distância/ tempo (velocidade) x diâmetro (área)
volume
81
O calibre só deve ser valorizado até aos 30 primeiros minutos,
tempo necessário para a auto-regulação imediata que se inicia logo nos
primeiros minutos (Quaranta, 1994). Por ser difícil a medição
volumétrica precisa, utilizam-se os valores das velocidades (Alm, 1992).
3.1.5- Análise de Imagem
As imagens foram registadas cinco minutos antes de cada
experiência e depois cada sessenta segundos, utilizando um angiógrafo
digital de alta resolução para vasos retinianos e coroideus: de início o
angiógrafo IMAGEnet H 1024 da TOPCON e, posteriormente, o
angiógrafo 450 IFR da Zeiss, com resultados sobreponíneis. O registo
das imagens foi obtido a uma distância de três milímetros do local da
injecção. O sistema IMAGEnet contém múltiplos componentes
integrados, incluindo câmaras de filmagem e de vídeo, monitores de
imagem, aparelhos de registo e armazenagem e processamento em
computador. Mais de 90% das experiências foram capturadas em vídeo.
O sistema melhorou a claridade da retina, com modificação das
aberturas para aumentar a clareza e a sensibilidade e um sinal luminoso
sincronizado para imobilizar os movimentos oculares do animal, reduzir
a falta de clareza com o movimento, aumentar a resolução visual dos
diâmetros dos vasos e prolongar a duração dos estudos (Yannuzzi et al.,
1992). As características deste sistema de imagem digital proporcionam
um maior grau de resolução da imagem arteriolar, contraste e
sensibilidade e ainda a oportunidade para uma avaliação mais extensa
das imagens captadas. A câmara é capaz de obter fotografias do fundo
82
ocular a preto-e-branco e a cores, e registo digital e estandartizado de
angiografias com fluoresceína. Este aparelho encontra-se programado
para a medição de diâmetros vasculares após tratamento prévio de
imagem, recorrendo a software do mesmo (Weinberger et al., 1999). As
variações dos diâmetros dos vasos foram analizadas separadamente por
dois observadores para a mesma imagem de retinografia à distância de
dois diâmetros do disco óptico. O registo vídeo de cada segmento
arteriolar foi tomado durante 15 minutos por uma câmara de alta
resolução (Sony; ampliação 2 x 25) incorporada no sistema IMAGEnet.
As imagens foram registadas em videotape (registador U-matic; Sony).
As medidas do diâmetro arteriolar foram efectuadas a partir de um
segmento seleccionado por um analizador de extensão semi-automático,
que digitalizava gravuras cinzentas, na ordem de 1,024 x 1,024 píxeis.
Foi seleccionada uma janela na imagem por um cursor guiado pelo rato
para incluir a arteríola e parte da retina adjacente. O computador
calculou o perfil médio do cinzento para incluir a arteríola e parte da
janela pré-seleccionada e a área calculada e a largura média do segmento
arteriolar escolhido nas figuras sequenciais. É normal um coeficiente de
variação < 5% quando se comparam medidas de vasos da retina obtidos
por computador ou por observador (Newsom et al.,1992). A
variabilidade intra-observadores foi sempre de 5%.
83
Fig.6 – Imagem do angiógrafo IMAGEnet 1024
3.1.6- Indução da diabetes experimental
A indução da diabetes foi efectuada pela injecção de aloxana (Herse et
al., 1994). O fármaco foi dissolvido em tampão citrato-fosfato 0,05 M
(pH=4,5) imediatamente antes da sua administração. Os coelhos em
número de 12, após 12 horas de jejum e indução anestésia inalatória com
éter embebido em algodão, foram injectados na veia marginal da orelha,
com a dose única de 100mg/kg de peso. Coelhos não injectados, com a
84
mesma idade e da mesma ninhada, mantidos sob as mesmas condições,
serviram como controlo. Nos dois dias que se seguiam à injecção de
aloxana foi adicionada dextrose a 5% na água de beber dos animais. Os
animais foram alimentados com rações para coelhos e beberam água ad
libidum. Observou-se uma baixa mortalidade (≤ 3%) com a utilização
deste protocolo (morreram quatro coelhos e dois deles não se
conseguiram diabetizar).
QuadroI- Relação entre o peso e os níveis de glicémia em coelhos normais e
diabéticos ao longo de 12 semanas.
O peso corporal, a glicémia, a glicosúria e a diurese foram avaliadas
às 24 horas, 4 dias, 1 semana, 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas após
85
administração da aloxana. A glicémia foi determinada a partir de amostras
sanguíneas colhidas na veia marginal da orelha e a glicosúria determinada
por métodos colorimétricos. O princípio básico da maioria das medidas
colorimétricas consiste na comparação, sob condições definidas, da cor
produzida pela substância em quantidade desconhecida com a mesma cor
produzida por uma quantidade conhecida do material a ser determinado. A
comparação quantitativa dessas duas soluções pode, em geral, ser conduzida
por um ou mais de seis métodos. Não é essencial preparar-se uma série de
padrões com o espectrofotómetro; o coeficiente de absorção molar pode ser
determinado de uma das medidas da absorvância ou transmitância da
solução padrão, para se fazer a determinação da concentração desconhecida
com o auxilio deste coeficiente de absorção molar e o valor obtido da
absorvância ou transmitância da amostra. O método utilizado foi o da
Diluição: a amostra e a solução padrão estão contidas em tubos de vidro do
mesmo diâmetro e são observadas horizontalmente através dos tubos. A
solução mais concentrada é então diluída até que as cores fiquem idênticas
em intensidade quando observadas horizontalmente através da mesma
espessura de solução. As concentrações relativas das soluções originais são
então proporcionais às alturas das soluções comparadas nos tubos. A
variação da cor de um sistema, com a modificação da concentração de um
certo componente, constitui a base do que os químicos denominam análise
colorimétrica. A cor é provocada pela formação de um composto corado,
resultante da adição de um reagente apropriado, ou pode ser intrínseca ao
constituinte analisado. A intensidade da cor pode ser comparada com a que
se obtém pelo tratamento idêntico de uma quantidade conhecida da
substância. A colorimetria visa determinar a concentração de uma substância
pela medida da absorção relativa de luz, tomando como referência à
absorção da substância numa concentração conhecida. Na colorimetria
86
visual usa-se, em geral, como fonte de luz, uma fonte natural ou artificial de
luz branca. As de terminações são feitas num instrumento simples,
denominado colorímetro, ou comparador de cores. Quando a observação
directa for substituída por uma célula fotoeléctrica (o que elimina em grande
parte os erros devidos às características pessoais de cada observador), o
instrumento é um colorímetro fotoeléctrico. Neste instrumento emprega-se a
luz que está numa banda estreita de comprimentos de onda, que se consegue
pela passagem da luz através de filtros, isto é, de materiais coloridos na
forma de placas de vidro, ou de gelatina, etc., que só transmitem a luz numa
região espectral limitada. A principal vantagem dos métodos colorimétricos
e espectrofotométricos, é a de proporcionarem um meio simples para
determinar quantidades diminutas de substâncias. O limite superior dos
métodos colorimétricos é, em geral, a determinação dos constituintes que
estão presentes em quantidades relativas inferiores a 1 ou 2%. A
sensibilidade pode ser, no entanto, aumentada mediante a técnica da
espectrofotometria derivada.
O
estado
diabético
foi
estabelecido
pela
existência
de
hiperglicémia persistente (> 350 mg/100ml), glicosúria, poliúria,
polidipsia (medidos através da quantidade de urina eliminada e água
ingerida) e perda de peso. Os animais foram mantidos diabéticos durante
um período de 3 meses, após o qual se iniciaram os estudos descritos
com animais diabéticos.
87
3.1.7- Indução de glaucoma experimental
Estudos com modelos animais têm-nos ajudado a compreender os
mecanismos de formação e de drenagem do humor aquoso, bem como
a manutenção da homeostase da pressão intraocular. Muitas vezes,
esses estudos levaram ao conhecimento da etiologia do glaucoma e no
desenvolvimento de terapêutica adequada. Através da diversidade da
estrutura e função do ângulo de drenagem de cada espécie animal, os
estudos comparativos com o homem permitiram estender os conceitos
limitados
ao
segmento
anterior,
na
doença
humana.
No
desenvolvimento da hipertensão e glaucoma espontâneo ou induzido,
os modelos animais têm conduzido a estratégias terapêuticas que, de
outra forma, teriam sido difíceis de implementar.
Ao longo do tempo foram observados vários modelos de
glaucoma espontâneo em diferentes animais. Numa forma precoce
Kolker descreveu um grupo de 60 coelhos albinos da raça Nova
Zelândia
que,
naturalmente,
mostraram
uma
alteração
no
desenvolvimento da malha trabecular (Kolker et al., 1999). A
descrição das anomalias anatómicas que apresentaram (redução no
número de lamelas, aumento do espaço intercelular entre as lamelas,
vacuolização das células endoteliais e fragmentação da lâmina basal),
permitiu levantar a hipótese de que a causa da elevação da pressão
intra-ocular podia ter sido uma redução do apoio estrutural das
trabéculas. Também foram encontrados níveis elevados de fibrina no
88
humor aquoso, o que sugere que a fibrina poderia dificultar a
evacuação do humor aquoso e, assim, aumentar a pressão intra-ocular.
No entanto, a ausência de lâmina crivosa e mielinização parcial das
células ganglionares da retina em estudos ultraestruturais, juntamente
com a existência de uma proeminente rede vascular fizeram do coelho
um modelo animal adequado para estudar alterações na retina ou
vascularização do glaucoma.
No
final
das
60
observações
feitas
por
veterinários
oftalmologistas em cães com glaucoma espontâneo, descobriu-se a
existência de determinadas raças (Beagles, Cocker, BaseT e
caçadores) mais suscetíveis para esta patologia. Todavia como
acontece nos coelhos, é o tipo de glaucoma de ângulo aberto o critério
que prevalece, enquanto que os cães mostram glaucoma de ângulo
fechado.
A elevação crónica da TIO de 30 a 40 mmHg, utilizando estes
animais com hipertensões espontâneas ou induzidas por cauterização
das veias perilímbicas, pode levar a escavação patente da cabeça do
nervo óptico. O glaucoma nestes animais é susceptível ao tratamento
farmacológico com vários medicamentos usados em seres humanos.
Em 1993, foi descrita pela primeira vez uma colónia de macacos,
localizado em Cayo Santiago. Em nove famílias destes macacos tem
sido descrita uma herança materna, com uma incidência de 40% da
elevação da pressão intra-ocular. Nos animais afectados foi a perda de
células ganglionares da retina, a escavação do nervo óptico e provas
eletrofisiológicas que poderam provar a existência de danos na retina
periférica. Recentemente, o aparecimento do rato DBA/2J, que
desenvolve um aumento gradual da TIO por induzir a morte de células
89
ganglionares, tem gerado inúmeros estudos para estabelecer a
existência de homologias com algum tipo de glaucoma em seres
humanos. A elevação da pressão intraocular nestes animais parece ter
início na idade de 6 meses ficando cronicamente elevada até à sua
morte. No entanto, existem factores, como o tamanho reduzido do
globo ocular ou a ausência de lâmina crivosa que limitam a utilização
dos animais para esses estudos. Os modelos experimentais agora
referidos, com a elevação crónica da pressão intra-ocular, por si só,
são ideais para o estudo do glaucoma. No entanto, com excepção dos
ratos DBA/2J, outros animais com glaucoma espontâneo, são difíceis
de obter comercialmente e ainda mais difícil de obter grupos com a
mesma fase da doença. Portanto, a fim de facilitar os testes e o
desenvolvimento de conhecimentos de glaucoma, ao longo da história
foram
desenvolvidos
modelos
glaucoma
induzidos
experimentalmente.
Assim, em 1974, Gaasterland e seus colegas desenvolveram o
primeiro modelo de laser em primatas, o que tem sido amplamente
utilizado posteriormente por outros autores. Como no homem, após
uma trabeculoplastia laser argon, produz-se uma elevação transitória
da pressão intra-ocular que parece ser causada pela formação de
fibrina obstruindo a malha trabecular. As grandes flutuações da
pressão intraocular determinam que na maioria dos casos, sejam
necessárias várias sessões de laser, com inflamação grave no globo
ocular. Embora estes problemas existam, este modelo experimental de
glaucoma em primatas têm sido amplamente utilizado para melhorar o
quadro clínico inicial de indicadores das lesões da papila no
glaucoma.
90
Em nossa opinião, o estudo do glaucoma tem sido impulsionado
pela possibilidade de desenvolvimento desta patologia em coelhos.
Estes animais são de custo reduzido e mais acessíveis na manutenção
e causam menor impacto relativamente aos problemas éticos. Em
1995, o grupo de Shareef et al., desenvolveu o modelo epiescleral
com cauterização das veias do rato e do coelho como processo de
desencadear aumento da pressão intra-ocular crónica. Este modelo
permite manter a completa estrutura trabecular, não afectando os
nervos ciliares, como no modelo laser. Além disso, a pressão intraocular pode ser mantida até 6 meses, o que para o tempo de vida do
coelho representa muito. O desenvolvimento deste modelo animal
permitiu o estudo de diferentes combinações e concentrações de
fármacos hipotensores e neuroprotectores como um prelúdio para o
estudo em animais de maior porte antes de ensaios clínicos. O mesmo
grupo, no mesmo ano, descreveu pela primeira vez a morte por
apoptose das células ganglionares da retina no glaucomatoso. Isto
permitiu-nos realizar estudos em artérias retinianas, usando a mesma
tecnologia a que se recorre em oftalmologia humana.
Os progressos no diagnóstico do glaucoma têm sido
acompanhados pela evolução tecnológica e o seu tratamento
associado ao desenvolvimento de modelos animais.
O glaucoma experimental foi obtido através da cauterização dos
vasos perilímbicos, com cautério descartável (Bovie, AAron medical,
Florida, USA), num dos olhos do coelho, servindo o olho adelfo como
controlo. Este procedimento induz uma hipertensão ocular alta,
estável e duradora (até 30 dias), sem inflamação ou infecção
91
induzidas (apenas se observou ligeira hiperémia conjuntival em dois
animais) de forma a possibilitar a experimentação.
Sequencialmente
foram
registados
os
valores
de
tensão
intraocular (TIO), diâmetros vasculares e fluxos sanguíneos (picos
sistólicos e diastólicos; expressos apenas os sistólicos uma vez que os
segundos acompanharam as variações dos primeiros de forma
homogénea) das arteríolas justa-papilares, num processo de quinze
minutos consecutivos (fluxos e diâmetros foram avaliados a cada
minuto). Não se registaram velocidades venulares, conforme descritas
por alguns autores, por não apresentarem expressividade.
3.1.8- Protocolo experimental
1. Avaliação do efeito de diferentes agentes farmacológicos sobre
o tónus miogénico de arteriolas retinianas, justapapilares. Para os
fármacos vasoconstritores foram obtidas curvas de dose-resposta (CDR)
pela adição cumulativa destes agentes, por microinjecção intravítrea de
volumes de 10µl cada, contendo a substância farmacológica vasoactiva
em concentração logarítmica crescente (peri-retinal, peripapilar, 1-2
diâmetros de disco, justa-arteriolar (30µm da arteríola) e análise cada 60
segundos depois de atingir o “steady-state” (15 minutos); duração total
= 30 minutos. Para os agentes vasodilatadores a curva de dose-resposta
foi obtida após contracção prévia do vaso com 10 nmol de sumatriptano
intra-vítreo, justa-arteriolar; uma vez atingido um patamar, os
vasodilatadores foram injectados de modo idêntico e com a mesma
ordem de grandeza e sequência indicada para as curvas de contracção.
92
2. Realização das curvas de dose-resposta in vivo, contrácteis ou
relaxantes, 15 minutos após injecção de um antagonista específico para
o agonista respectivo; de novo, para os agonistas relaxantes foi
administrado sumatriptano (10 nmol), para contrair o vaso sanguíneo
antes da obtenção da curva dose-resposta para agonistas do sistema
neuropéptidérgico.
3.Repetição
de
algumas
experiências
anteriores
(com
modificadores da 5-HT e neuropeptídeos), utilizando animais com
diabetes aloxânica.
4. Com a mesma metodologia, utilizando os agonistas respectivos
em coelhos com glaucoma experimental para o estudo dos
modificadores do NO e sua correlação com os resultados obtidos com
coelhos normais.
3.1.9- Fármacos utilizados e soluções
A aloxana e a indometacina foram obtidas através da Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO; U.S.A.); a Cetamina foi obtida da ParkeDavis Inc. (Don Mills, Canada) e o ciclopentolato 0.5% foi obtido da
Edol-Portugal. Todos os restantes fármacos:
93
3.1.9.a-Modificadores do Sistema Serotoninérgico:
Agonistas / Nome químico / Receptores / Referências
a) Serotonina (5-HT) (agonista da maioria dos receptores 5-HT) (em
anexo)
b) Sumatriptano (SUM) 3-[2-(Dimethylamino)ethyl]-N-methyl-1H-indole5-methanesulfonamide succinate (5-HT1B/1D);
Peroutka and McCarthy (1989)
Sumatriptan (GR 43175) interacts selectivity with 5-HT1B and 5-HT1D binding sites.
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c) α-metil-5-hidroxitriptamina (5-HT2);
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d)2-metil-serotonina (5-HT3, 5-ht6);
Wilson et al (1990) 5-Hydroxytryptamine3
receptors mediate tachycardia in conscious instrumented dogs. J.Pharmacol.Exp.Ther. 252 683.
Ismaiel et al (1990) 5-HT1 and 5-HT2 binding profiles of the serotonergic agents
serotonin
and
2-methylserotonin.
Methoxytryptamine
and
J.Med.Chem. 33
755.
Craig
2-methyl-5-hydroxytryptamine-induced
et
-methyl
al (1990)
desensitization
as
5a
discriminative tool for the 5-HT3 and putative 5-HT4 receptors in guinea pig ileum.
Naunyn.Schmied.Arch.Pharmacol. 342 9. Glennon et al (2000) 2-substituted tryptamines:
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94
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(S)-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin on hippocampal serotonin release and induction of
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f)Cisapride(±)-4-Amino-5-chloro-N-[1-[(3R*,4S*)-3-(4fluorophenoxy)propyl]-3-methoxy-4-piperidinyl]-2-methoxybenzamide
(5-HT4);
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g) L-694,247 2-[5-[3-(4-Methylsulfonylamino)benzyl-1,2,4-oxadiazol-5yl]-1H-indol-3-yl]ethanamine (5-HT1B/1D);
Street et al (1993) Synthesis and
serotonergic activity of 5-(oxadiazoyl)tryptamines: potent agonists of 5-HT1D receptors.
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Antagonistas / Nome químico / Receptores / Referências
a) Cetanserina (5-HT1D/5-HT2/5-HT2A); (ver anexo)
95
b) Espiperona (5-HT1A//1B/1D/2A/2B); (ver anexo)
c)
BRL15572
3-[4-(4-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]-1,1-diphenyl-2-
propanol hydrochloride (5-HT1D) (agonista parcial 5-HT2B);
Hagan et al
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d)
GR127935
N-[4-Methoxy-3-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]-2'-
methyl-4'-(5-methyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)-1,1'-biphenyl-4-carboxamide
hydrochloride (5-HT2; 5-HT1B/1D) (agonista parcial 5-HT2B);
Clitherow et al
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as the first selective 5-HT1D antagonists. J.Med.Chem. 37 2253. De Vries et al (1996)
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e) SB 224,284 (5-HT1B /2B); (ver anexo)
____________________________________________________
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3.1.9.b-Péptidos:
Agonistas / Receptores / Referências
a) Substância P, Trp-Arg-Gln-Ala-Ala-Phe-Val-Asp-Ser-Tyr (SP)
(NK1); (em anexo)
b) Péptido relacionado com o gene da calcitonina, (CGRP);
Poyner et al
(2002) International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related
peptides, adrenomedullin, amylin, and calcitonin receptors. Pharmacol.Revs. 54 233.
c) Neurocinina A (NKA) (NK2);
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Bronchoconstrictor
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Antagonistas / Nome químico / Receptores / Referências
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b) L659,877 (NK2); (ver anexo)
c) CGRP8-37 (CGRP);
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3.1.9.c- Modificadores do Óxido Nítrico:
a) L-Arginina (substracto endógeno para as NOS) (Sigma Aldrich
Company, St Louis, MO, USA),
b) SNAP (análogo endógeno) (S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine,
WPI, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA),
102
c) L-NAME (inibidor não selectivo da eNOS, nNOS e iNOS) (NG-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride, Sigma Aldrich Company, St Louis,
MO, USA),
d) L-NNA (inibidor não selectivo também de todas as isoformas de NOS)
(NG-nitro-L-arginine, Tocris, Bristol, UK),
e) Aminoguanidina (inibidor irreversível da iNOS) (Sigma Aldrich
Company, St Louis, MO, USA); utilizados em soluções preparadas com
água destilada e desionizada.
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A solução salina polielectrolítica (mmol/l) colocada nos olhos
controlo apresentava a seguinte composição: NaCl 118,7; KCl 4,7; Ca
Cl2 1,8; KH2PO4 1,2; NaHCO3 24,8 e glucose 10,1; pH 7,4; a
concentração da solução-mãe (10-5M), a sua solubilidade (100mM
água, 1eq. NaOH ou DMSO); todas as soluções permaneceram
estáveis.
3.1.10- Análise dos Dados e Estatística
A eficácia dos diferentes agonistas foi expressa como a resposta
máxima, quer se tratasse de uma resposta contráctil ou de relaxamento.
Foram calculados os valores de Emax que representam a resposta
máxima obtida por um agonista.
A potência dos diferentes agonistas foi expressa como pED50 (o
logaritmo negativo na base 10 da concentração do agonista que produz
104
50% do efeito máximo). Os valores de pED50 foram calculados pela
análise das curvas dose resposta. No estudo do efeito contracturante do
sistema da 5-HT, utilizou-se como referência o diâmetro basal após
estabilização com indometacina em algumas experiências.
A quantificação do efeito relaxante foi expresso em percentagem do
diâmetro vascular basal após prévia contracção com SUM (100%). A
dose que produz 50% do efeito máximo a um fármaco (ED50) também
foi calculada.
Os resultados foram expressos em percentagens (média ± erro padrão)
e para análise das diferenças estatísticas os valores médios foram
analizados, utilizando o teste-t de Student. Uma probabilidade de 0,05
ou inferior foi considerada significante. A variabilidade média
interobservador foi de 5%. O valor de n indica o número de
experiências independentes, que é igual ao número de animais usado
para cada tratamento, sempre ≥ 6. Na análise estatística utilizou-se o
programa informático GraphPad Prism 5.0.
105
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
106
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Demonstrou-se através do estudo dos dois sistemas diferentes
(contracturante e relaxante), mas interligados na resposta neurogénica
(serotoninérgico
e
neuropeptidérgico)
que,
após
microinjecção
intravítrea dos diferentes agonistas ou após a sua administração com
microinjecção prévia de antagonista, existe um efeito arteriolar
dependente da dose. Ao contrário de Pietscher et al., (1996) antes de
iniciarmos estes estudos, não foram encontradas variações circadianas
do diâmetro vascular no nosso modelo experimental.
107
4.1- Estudos com vasoconstritores
Estudo do Sistema Serotoninérgico
Efeito da 5-HT e de agonistas selectivos dos subtipos de receptores antes
e após tratamento prévio com antagonistas
A constricção produzida por diferentes agonistas da 5-HT nas
arteríolas retinianas foi expressa em percentagem da eficácia ou
contracção máxima produzida pelos diferentes agonistas após injecção
periarteriolar.
Injectou-se dentro do humor vítreo 10µl de solução (10 nmol/l) de
Serotonina (5-HT), observando-se um aumento do tónus arteriolar com
redução do diâmetro (efeito vasoconstritor) com doses crescentes;
obteve-se uma contracção dependente da dose. O efeito contráctil
máximo (Emax), expresso em % de variação do diâmetro basal, obtido
com 10 nmol, foi de 29,4±1,5%, (média±erro padrão) (n=6) (Fig.7). No
entanto, após administração endovenosa na veia marginal da orelha do
coelho (n=4) a 5-HT originou apenas uma contracção muito discreta,
traduzida numa ligeira elevação da linha basal.
O Sumatriptano (SUM), 10 nmol, agonista dos receptores 5HT1B/1D, induziu o efeito vasoconstrictor mais potente (Emax ± erro
padrão 44,8 ± 1,0%).
O efeito contráctil produzido pela 5-HT ou SUM foi inibido por
10 nmol de GR127935, 10 nmol de BRL15572 e 10 nmol de SB
224289, respectivamente antagonistas dos receptores 5-HT1B/1D, 5-HT1B
e 5-HT1D. O antagonista 5-HT1D, BRL15572, desviou para a direita as
curvas contrácteis da 5-HT e do SUM.
108
O L694247, outro agonista potente dos receptores 5-HT1B/1D,
produziu uma contracção significativa (Emax± erro padrão=39,0±2,5)
antagonizada pelo BRL15572.
A alfa-metil-5-HT (α-Me-5-HT), agonista 5-HT2, adicionado
cumulativamente até 10 nmol, desencadeou efeito contráctil mais
reduzido (Emax ±erro padrão 19,4±1,9%) que foi parcialmente
antagonizado pela cetanserina (que também inibiu a resposta contráctil
induzida pelo SUM). A espiperona, um antagonista dos receptores 5HT2, quase inibiu a resposta contráctil da α-Me-5-HT (Fig.8).
Foram ainda estudados o 8-OH-DPAT, um agonista 5-HT1A,
injectado cumulativamente até 10 nmol, não provocou um efeito
significativo (Emax ± erro padrão 2,8±0,7%), o mesmo ocorrendo com a
2-Me-5-HT, agonista parcial 5-HT3 (classificação anterior) (Emax ±
erro padrão 2,1±0,8%) ou o cisapride, agonista parcial 5-HT4
(Emax±erro padrão 8,9±1,5%) (Fig.).
Todos os efeitos contrácteis induzidos pelos agonistas 5-HT
diminuíram a hemodinâmica ocular, com redução estatisticamente
significativa da velocidade sanguínea (ver quadros).
109
Fotografia a cores a) - Fundo ocular normal de coelho albino, com
visualização do disco óptico, vasos retinianos e coroideos, no início de uma
experiência.
Fotografia a cores b)- O mesmo olho, após injecção intravítrea de Sumatriptano
110
(note-se a extensa vasoconstrição, sobretudo arteriolar papilar e justapapilar).
A Fig.7 mostra traçados representativos das variações no diâmetro
externo da arteriola oftálmica de coelhos após injecção cumulativa dos
volumes de fármacos agonistas, reproduzindo curvas dose-efeito.
50
2-ME-5-HT
% variação do diametro vascular (contração)
45
5-HT
SUM
40
ALPHA-ME-5-HT
CISAPRIDE
35
L694,247
30
8-OH-DPAT
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
-log dose (nm oles)
Fig.7- Curvas dose-resposta de todos os agonistas testados em coelhos
normais. Os valores são expressos em termos de média ± erro padrão; n≥6 para
cada agonista testado. Valores de p < 0,05 em relação ao controlo.
111
Procurámos de seguida testar outros agonistas serotoninérgicos
uma vez que já possuíamos uma resposta satisfatória à 5-HT. Um outro
agonista a α-Metil-5-hidroxitriptamina (α-Metil-5-HT), na dose de 10
nmol, contraíu todas as arteríolas nas quais foi testado, induzindo,
contudo, uma contracção menor do que a do SUM. Este efeito foi
parcialmente antagonizado por 10 nmol de Espiperona, o que permitiu
concluir sobre a possível existência de receptores 5-HT2 (Fig.8).
ESPIPERONA+ALFA-ME-5HT
% variação do diâmetro vascular (contracção)
CETANSERINA+ALFA-ME-5HT
50
SUM
45
ALFA-ME-5-HT
40
CETANSERINA+SUM
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
-log dose (nm oles)
Fig.8- Curvas dose-resposta para a α-Metil-5-HT em administração isolada e
após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1/2 na dose de 10
nmol e de Cetanserina (antagonista não selectivo de receptores 5-HT2 / 5-HT1D) na
112
mesma concentração. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥
6.Valores de p < 0,05 em relação ao controlo.
Um dado importante para a análise que vimos realizando foi o
facto de o Sumatriptano (SUM), um agonista dos receptores 5-HT1D,
quando administrado por via intravítrea (10 nmol) apresentar o maior
efeito de vasoconstrição de todos os agonistas serotoninérgicos (média±
erro padrão = 44,8±1,0% do diâmetro basal), inclusivé em relação à 5HT (Fig.8). Porém, administrado por via sistémica na mesma
concentração modificou só ligeiramente (com vasoconstrição) o
diâmetro vascular das arteríolas retinianas do coelho normal (dados não
apresentados). O efeito contráctil quer do SUM quer da 5-HT foi
revertido pela administração intravítrea de GR127935 em doses
semelhantes (Fig.9).
113
5-HT
50
SUM
% variação do diâmetro basal (contracção)
45
L-694,247
40
BRL15572+5-HT
35
*
BRL15572+L694,247
30
*
BRL15572+SUM
25
20
15
*
10
5
0
1
2
3
4
5
6
-log dose (moles)
Fig.9- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT e L-694,247 em administração
isolada e após pré-injecção de antagonista selectivo dos receptores 5-HT1D (BRL15572),
na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6.
Valores de p <0,05 em relação ao controlo.
114
50
GR127,935+SUM
% variação do diâmetro basal (contracção)
45
SUM
40
SB224,284+5-HT
35
5-HT
30
SB224,284+SUM
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
-log dose (moles)
Fig.10- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT em administração isolada e
após pré-injecção de
antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1B (GR127,935 e
SB224,284), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de média±erro
padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao controlo.
Em algumas experiências utilizaram-se antagonistas diferentes para o
mesmo receptor com a intenção de enfatizar a presença desse receptor, uma
vez que não foram efectuados estudos de imunohistoquímicos.
Foram também realizadas experiências em coelhos diabéticos, testando a
expressividade dos receptores serotoninérgicos e sem a influência de
indometacina. Como se pode observar na Fig.11, os resultados não foram
115
semelhantes aos encontrados para os coelhos normais: respostas débeis ou
mesmo ausentes e paradoxais face às diferentes doses avaliadas.
7
%variação do diâmetro basal
6
2-Me-5-HT
5
5-HT
4
SUM
Alfa-Me-5-HT
3
CISAPRIDE
2
METERGOLINA
1
8-OH-DPAT
0
1
2
3
4
5
6
log dose (nm ol)
Fig.11- Curvas dose-resposta de todos os agonistas 5-HT testados em coelhos diabéticos.
Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6 para cada agonista
testado.
116
4.2- Estudos com vasodilatadores
Estudo do Sistema Neuropeptidérgico
No estudo do sistema neuropeptidérgico procurámos envidenciar
a presença de receptores NK1, NK2, NK3 e NK4 de acordo com a
classificação mais recente da International Union of Pharmacology
(IUPHAR, 2008).
Após contracção com 10 nmol de SUM, a microinjecção
intravítrea de SP induziu um relaxamento arteriolar dependente da dose,
com um efeito dilatador máximo (Emax) obtido com 10 nmol (média±
erro padrão 21,3±2,3% (Fig.12). O pED50 foi de 12,5 ±0,11 (Quadro II).
A curva dose-efeito foi deslocada para a direita após pré-tratamento,
seguido de um período de estabilização de 15 minutos, com 10 nmol L668,169, um antagonista dos receptores NK1 (Maggi, 1992); as mesmas
doses de L-733,060, também um antagonista NK1, de L659,877, um
antagonista NK2 (Mcknight, 1990), ou de CGRP8-37, um antagonista do
receptor CGRP (Poyner, 1992), também inibiram a resposta induzida
pela SP, mas com menor intensidade.
A NKA induziu o efeito relaxante mais potente de todos os
neuropeptídeos (após contracção com SUM), com efeito dilatador
máximo de 53,3 +2,5% e com um valor de pED50 de 12,52+ 0,31. A
administração prévia de antagonistas dos receptores NK2, L-659,877 e
GR159897, fez deslocar a curva dose-efeito para a direita, sendo os
valores
de
pED50
evocados de
10,60+
2,5
e
10,26+
1,1,
respectivamente. Ambos, CGRP8-37 e L-668,169, também inibiram o
efeito da NKA (Fig. 13); valores de Emax 48,0+3,5 e 45,3+2,5%,
117
respectivamente, mas de novo em menor grau. Este efeito foi
antagonizado pela injecção prévia do antagonista dos receptores NK1,
L668,169, 10 nmol (média±erro padrão 15,2±1,2%) do diâmetro basal e,
de forma menos acentuada, pelo antagonista de receptores NK2
L659,877, bem como pelo antagonista dos receptores CGRP, o CGRP837. (Fig.14)
-log dose (mol/l)
% variação
do diâmetro
vascular
(relaxamento)
Fig.12- Curvas de dose-resposta para a SP (10 nmol), um agonista dos receptores
NK1, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L-733,060 (ambos antagonistas
selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol); após tratamento com L659,877
e GR159,897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2, na dose de 10
nmol) e de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP) na dose de 10 nmol.
Os dados referem-se a médias±erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de
experiências e relativamente ao controlo <0,05.
118
Doses cumulativas de CGRP, até 10 nmol desencadearam uma
vasodilatação arteriolar marcada (média±erro padrão = 41,1±0,4% do
diâmetro basal; pED50 11,88±0,04) antagonizada pela pré-injecção
perivascular de CGRP8-37 (média±erro padrão 2,4±0,7% do diâmetro
basal). Ambos os antagonistas NK1 e NK2 demonstraram um
antagonismo fraco e relativo (Fig.13).
-log dose (mol/l))
% variação
do diâmetro
vascular
(relaxamento)
Fig.13- Curvas dose-resposta cumulativas para o CGRP (10 nmol) após contracção
prévia por 10 nmol/l de SUM e pré-tratamento com 10 nmol de L668,169 , L-733,060
ou de ambos (antagonistas selectivos dos receptores NK1); após tratamento prévio com
L659,877 , GR159,897 ou ambos ( antagonistas selectivos dos receptores NK2, na dose
de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista dos receptores do CGRP- na dose de 10 nmol).
119
Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de
experiências e relativamente ao controlo <0,05.
Obtivemos a maior expressividade em termos de vasodilatação
com a NKA, em doses cumulativas também na dose máxima de 10 nmol
(média ± erro padrão 53,3 ± 2,5% do diâmetro basal; pED50 11,96 ±
0,10). Este efeito foi antagonizado pela administração prévia de
L659,877 (média±erro padrão 19,2±1,0% do diâmetro basal). Nem o
CGRP8-37 ou o L668,169 reduziram significativamente o efeito
vasodilatador da NKA (Fig.14).
120
% variação
do diâmetro
vascular
(relaxamento)
Fig.14- Curvas dose-resposta para a NKA (10 nmol), um agonista dos
receptores NK2, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L733,060 (ambos
antagonistas selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol), de CGRP8-37
(antagonista de receptores para o CGRP- na dose de 10 nmol) e de L659,877 e
GR159897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2). Os dados referemse a médias ± erro padrão; n≥6 ; * valor de p entre cada conjunto de experiências e
relativamente ao controlo <0,05.
O efeito relaxante arteriolar provocado pela NKB (agonista NK3)
foi bastante menor (média ±erro padrão 5,3 ± 1,2% do diâmetro basal)
(Fig.15) do que os obtidos com as outras neurocininas. Como
pretendíamos confirmar a inexistência de receptores NK3 na parede
arteriolar dos vasos retinianos do coelho, utilizámos ainda outro
agonista NK3, o Senquetide. Os resultados foram similares aos obtidos
com a NKB. O efeito de relaxamento máximo foi de 3,8±1,0% (Fig.15).
121
% variação do diãmetro basal
(relaxamento)
-log dose (m oles/l)
0 1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
13
12
11
10
9
NKB
SENKTIDE
Fig.15- Curvas dose-resposta cumulativas para a NKB e Senquetide (10 nmol),
agonistas dos receptores NK3. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ; *valor
de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo <0,05.
A eficácia da Capsaicina (CAPS) como vasodilatador foi
significativamente mais elevada do que a de todos os outros fármacos
dilatadores usados (média ± erro padrão 43,0 ± 2,9% do diâmetro basal).
Como o gráfico mostra, o efeito antagonista máximo foi obtido com a
pré-injecção em conjunto de todos os antagonistas anteriormente
ensaiados (Fig.16).
122
% variação
do diâmetro
vascular
(relaxamento)
Fig.16- Curvas dose-resposta para a CAPS (10 nmol), antes e após pré-injecção de
L668,169 e de L733,060 (ambos os antagonistas selectivos dos receptores NK1, na dose
de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP, na dose de 10 nmol),
de L659,877 e de GR159897 (antagonistas dos receptores NK2) e combinações dos
antagonistas das taquicininas isolados ou associados ao CGRP8-37. Os dados referem-se a
médias ± erro padrão; n ≥ 6 ; *valor de p entre cada conjunto de experiências e
relativamente ao controlo <0,05.
.
123
Neuropeptídeos
Valor de pED50
Quadro II- Sustância P (SP), Neurocinina A (NKA), Péptido relacionado
com o gene da Calcitonina (CGRP) e Capsaicina (CAPS) antes e após administração
intraocular de antagonista (1 nmol/l). Valores expressos em média ± erro padrão
(n=7-x). *p <0,05.
124
Nas experiências realizadas em coelhos diabetizados, todas as
taquicininas, o CGRP e a CAPS revelaram um efeito vasodilatador
inferior a 4% em relação ao diâmetro basal (Fig.17). Perante um
endotélio disfuncional, o efeito relaxante destas substâncias foi quase
nulo.
-log dose(m oles/l)
0
13
12
11
10
9
% variação do diâmetro basal (relaxamento)
0
-1
CGRP
SP
-2
CAPS
NKA
-3
-4
-5
Fig.17- Curvas dose-resposta para todas as taquiquininas, CGRP e a CAPS (10
nmol), em coelhos diabetizados pela aloxana. Os dados referem-se a médias ± erro
padrão; n≥6.
125
4.3- Resultados obtidos com os modificadores do óxido nítrico
(NO).
Determinação do diâmetro arteriolar
(% de variação do diâmetro basal)
Fármaco
Max
±
s.e.m.
(intraocular)
Aminoguanidina
34,0 ± 1,1% *
L-NAME
22,7 ± 0,7% *
L-NNA
8,3 ± 0,2% *
SNAP
47,0 ± 1,6% *
L-arginina
65,2 ± 0,8% *
BSS(controlo)
±0,0
Quadro III– Determinação do diâmetro arteriolar para os diferentes
fármacos estudados quando aplicados intraocularmente. Verificou-se uma
constrição, e diminuição do diâmetro do vaso com a aminoguanidina (inibidor da
iNOS), o L-NAME (inibidor da nNOS) e o L-NNA ( inibidor da eNOS ). A
administração isolada de SNAP ou de L-arginina induziu vasodilatação com
aumento do diâmetro arteríolar. Este estudo ocorreu em simultâneo com a
determinação da TIO pelo que as concentrações utilizadas são as referidas para esse
estudo.* p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo (BSS).
A aminoguanidina (um inibidor da iNOS)
e o inibidor da
sintetase do NO, L-NAME, produziu uma constrição sustentada,
reversível e dependente da concentração, até 10 nmol dos segmentos
arteriolares, com um valor máximo de 34,0± 1,1%. A indometacina, um
126
inibidor da cicloxigenase (COX), reduziu o tónus dos segmentos
arteriolares.
De acordo com os resultados da TIO, o L-NAME, a
aminoguanidina e o L-NNA promoveram vasoconstrição, enquanto a Larginina e o SNAP originaram vasodilatação.
Após administração tópica destes fármacos nos olhos dos animais,
não se verificou alteração dos diâmetros arteriolares.
127
Determinação do diâmetro arteriolar
(% variação do diâmetro basal)
Fármacos
BSS+L-arginina
L-NAME+Larginina
Aminoguanidina+L
-arginina
Max ± s.e.m.
(intraocular)
21 ± 1,6
3,6 ± 1,6 *
6 ± 0,5 *
L-NNA+L-arginina
19,5 ± 2,1
BSS+SNAP
19,4 ± 5,2
Aminoguanidina+SNAP
L-NNA+SNAP
2,7 ± 0,5 #
28,2 ± 2,2
Quadro IV– Determinação do diâmetro arteriolar após administração
sucessiva de dois fármacos por via intraocular.* p < 0,05 (teste t de Student)
em relação ao controlo (BSS+L-arginina)# ; p < 0,05 (teste t de Student) em
relação ao controlo (BSS+SNAP).
Com o L-NAME (inibidor das três NOS), registou-se uma menor
vasodilatação quando comparada com a aminoguanidina (inibidor
relativamente selectivo da iNOS).
% TIO
128
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
Aminoguanidine
BSS
Snap
L-NNA
L-arginine
L-Name
0
50
100
150
tempo (minutos)
Quadro V- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após
% TIO
administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO.
120
100
80
60
40
20
0
L-arginina 100 nmol
L-NAME 100 nmol
BSS
0
20
40
60
80
100
tempo (minutos)
Quadro VI- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após
administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO em coelhos com
glaucoma induzido.
129
0
60 min
BSS+L-Arg
L-NNA+L-Arg
20
L-NAME+L-Arg
40
Aminoguanidine+L-Arg
60
BSS
80
L-NNA
% TIO
100
L-NAME
120
Aminoguanidine
140
135 min
tempo (minutos)
Quadro VII- Quadro comparativo da variação percentual da TIO em função
do tempo (minutos), após administração intraocular de 100 nmoles de cada
modificador do NO e da sua associação com L-Arginina.
4.3.1- Resultados com EcoDoppler
Os resultados seguintes exprimem os estudos complementares
com ecodopler em algumas das experiências com os agonistas e
antagonistas 5-HT e das taquicininas (não se efectuaram estudos de
fluxos com os modificadores do NO por estarem amplamente difundidos
em trabalhos da área).
130
Fármacos
CAPS
Max ± s.e.m.
(veloc:cm/s)
32 ± 0,8
CGRP
39 ± 1,0 *
SP
2 6 ± 2,5
NKA
49,5 ± 0,1*
NKB
13,4 ± 1,7
CGRP8-37 + CGRP
22,9 ± 0,6
L659,877 + NKA
28,1 ± 1,2*
Quadro VIII- Determinação da velocidade de fluxo(Emax ± sem) após administração
sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema neuropeptidérgico, por via intravítrea,
em coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo.
131
Fármacos
.
Max
±
s.e.m.
(veloc:cm/s)
2-Me-5-HT
13,7 ± 0,3*
5-HT
8,0 ± 0,6
SUM
5,1 ± 0,2 *
Alfa-Me-5-HT
9,5 ± 1,1
8-OH-DPAT
1,1±0,4
SB224,289+SUM
11,0 ± 0,5 *
Espiperona+ Alfa-Me-5-HT
12,1 ± 0,1
Cetanserina+SUM
13,2 ± 0,8*
BRL15572 + SUM
12,2 ± 0,3
Quadro XIX– Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após administração
sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema serotoninérgico por via intravítrea, em
coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo.
132
Observando o Quadro XIX podemos constatar que, concomitantemente com
a vasoconstrição provocada pelos agonistas 5-HT, a velocidade de fluxo
também diminuiu. Com a administração intraocular prévia de antagonistas
5-HT as velocidades de fluxo não se alteraram significativamente em relação
aos valores de origem. Paralelamente, os resultados esperados com a
adminstração de vasodilatadores (sistema neuropeptidérgico) indicaram uma
resposta previsível de aumento franco das velocidades de fluxo nas
arteriolas do coelho (Quadro VIII).
Não se registaram alterações nas medições de fluxos nos coelhos
diabetizados e com glaucoma experimental pela inconsistência dos
resultados que atribuímos a uma dificuldade de execução técnica.
Fig. 18- Exemplo de imagem obtida por CDI na análise de fluxos da artéria
central da retina
133
CAPÍTULO V
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
134
CAPÍTULO V
DISCUSSÃO
Pareceu-nos importante detectar um número elevado de
receptores 5-HT nos vasos da retina do coelho uma vez que, face ao
actual desenvolvimento da farmacologia, poderemos futuramente
empreender estudos com mais de um tipo de antagonistas (ou agonistas)
no controlo da vasomotricidade retiniana. A medição dos diâmetros
vasculares retinianos com recurso ao retinógrafo digital proporcionou
uma melhor precisão do trabalho experimental e também a resolução das
variações de diâmetro, o que constitui a principal vantagem deste
dispositivo. A escolha do coelho albino de raça neo-zelandesa justificouse pela facilidade de visualização dos vasos retinianos (Osborne, 1993).
5.1-Respostas vasoconstritoras
Os resultados apresentados mostram, in vivo, evidência qualitativa
das propriedades miogénicas da arteríola retiniana do coelho por
autorregulação, isto é, pela capacidade intrínseca do tecido vascular de
manter o seu fluxo sanguíneo em resposta às variações da pressão de
perfusão, dentro de uma margem relativamente larga. Esta resposta
reside principalmente nas células do músculo liso da parede vascular
(autorregulação miogénica) e é posteriormente modulada pelas
necessidades do tecido (autorregulação metabólica) e por factores
neurohumorais. A autorregulação assegura a constância da perfusão, não
135
obstante as variações da pressão intra e extraocular (Jarajapu et al.,
1994).
O estudo efectuado sobre o papel da serotonina na autorregulação
miogénica da arteríola retiniana in vivo, em coelho saudável, mostrou
evidência de que a arteríola possibilita a manutenção de uma perfusão
constante, uma vez que a pressão sanguínea se manteve dentro dos
valores normais. Esta propriedade oferece protecção frente à exposição a
valores superiores da pressão sistémica que poderiam causar
hemorragia. A anatomia única do leito vascular intraocular, em
particular a transição súbita da artéria oftálmica para as arteríolas
retinianas requer uma autorregulação fisiologicamente eficiente do fluxo
sanguíneo dentro das arteríolas retinianas. Embora esta autorregulação
miogénica na arteríola retiniana seja essencial para uma perfusão
constante e para o músculo liso arteriolar, não é necessariamente
indicativa das suas propriedades autorreguladoras, que podem variar ou
operar a um nível mais elevado (por ex. em resposta ao exercício
dinâmico), uma vez que recebem apenas uma porção do fluxo sanguíneo
da artéria oftálmica (Nemeth et al., 2002).
Relativamente aos resultados obtidos na avaliação do sistema
serotoninérgico,
encontrámos
algumas
surpresas
face
ao
comportamento dos diferentes agonistas in vivo, nas arteríolas
retinianas do coelho, quando comparados com os resultados obtidos in
vitro por outros investigadores, e em arteríolas de outros tecidos do
globo ocular, nomeadamente as da íris e do corpo ciliar (Osborne et al.,
1990, 2008).
136
De todos os receptores 5-HT, talvez os subtipos 5-HT1D, 5-HT1B
sejam os que melhor se encontram caracterizados (Bradley et al., 1986;
Saxena and Villalon, 1990), especialmente a nível das células
musculares lisas perivasculares (Feniuk et al., 1983; Trevethick et al.,
1984, 1986; Connor et al., 1997; Martin et al., 1994). Encontram-se
distribuídos por regiões vasculares bastante diversificadas, entre as
quais a artéria carótida e seus ramos (Saxena et al., 1986, 1989) e a veia
jugular do coelho (Martin et al., 1994).
Os receptores 5-HT1D existem a nível do SNC de vários
mamíferos como o cobaio, o cão, o porco, o coelho e o ser humano
(Maura et al., 1993). A título de exemplo refira-se que o relaxamento da
artéria coronária do porco é mediado por este tipo de receptores
(Schoeffter e Hoyer, 1990; Hamel et al., 1990). Hamel e seus
colaboradores confirmaram também a sua presença a nível das artérias
cerebrais bovinas e humanas.
Os nossos resultados demonstram a existência provável de
receptores 5-HT1B a nível arteriolar, uma vez que houve uma resposta
vasoconstrictora à 5-HT, ao SUM, confirmada pelo antagonismo
verificado com a administração prévia de GR127,935 e de SB224,284.
Os receptores 5-HT2 que se encontram descritos no músculo liso da
aorta do coelho (Hoyer, 1994) e no corpo ciliar do macaco (Sheriff,
2008), existem também em múltiplas áreas do córtex cerebral do
Homem (Pazos et al., 1985). Escolhemos a cetanserina, de entre os
agentes selectivos, por apresentar uma selectividade razoável, segundo
Teitler (1990). Ao encontrarmos uma reactividade vascular para a αmetil-5-HT, associado a um antagonismo nítido pela cetanserina e pela
espiperona, podemos inferir sobre a presença daqueles receptores, nos
137
vasos retinianos do coelho. É possível que a resposta menos acentuada
deste tipo de receptores se deva a uma menor percentagem dos mesmos
a esse nível, ao contrário do corpo ciliar onde são abundantes.
As
respostas
contrácteis
obtidas
com
os
agonistas
serotoninérgicos em coelhos normais foram, por vezes, quase nulas
quando comparadas com as obtidas em coelhos diabéticos. É que, além
do endotélio vascular, toda a restante estrutura morfo-funcional da
parede arteriolar retiniana e das células gliais se encontra alterada em
patologia como na diabetes (Valentin et al., 1998).
Não encontrámos respostas significativas para a 2-metil-5-HT
nem para o cisapride, o que exclui a presença de receptores 5-HT4. Não
encontrámos uma resposta nítida para outro agonista 5-HT, o 8-OHDPAT, (pA2=8.2 na ordem de potência).
Como a cetanserina é uma antagonista de ambas as substâncias 5HT e SUM, embora a sua potência de bloqueio seja menor que para os
receptores 5-HT2A, comprova a existência de receptores 5-HT1D que
medeiam a contracção, embora haja diferenças de espécie para espécie
(Martin, 1994; Humphrey et al., 1994).
Os receptores 5-HT2B são, segundo Hoyer extraordinariamente
difíceis de detectar em material vascular. A ordem de potência é a
seguinte:
5-HT=α-Metil-5HT>2-Metil-5-HT>SUM>8-OH-DPAT
(Hoyer et al., 1996).
Os trabalhos desenvolvidos para a detecção de 5-HT2A indicam
a necessidade de um efeito antagonista (mesmo que não selectivo) entre
a espiperona e a α-metil-5-HT e a cetanserina e este mesmo agonista.
Encontrámos uma resposta favorável no primeiro caso mas que não se
repetiu no segundo, o que, face à exiguidade de resultados, nos permite
138
confirmar apenas que nas respostas vasculares os receptores serão do
tipo 5-HT2.
Os fármacos com actividade vasoconstritora usados, todos
agonistas dos receptores 5-HT1 e 5-HT2 mostraram uma regulação
heterogénea do tónus da arteríola retiniana em condições normais. O
receptor 5-HT1B e o receptor 5-HT1D têm características estruturais
muito semelhantes e comportamento farmacológico idêntico. Alguns
receptores pré-sinápticos que inibem a libertação de 5-HT no cérebro de
roedores têm propriedades farmacológicas de um agonista 5-HT1B,
inibem a produção de cAMP na substância nigra e foram originalmente
definidos de acordo com critérios operacionais, admitindo-se serem
receptores específicos dos roedores. Quanto aos receptores 5-HT1D,
limitados
aos
não-roedores,
teriam
variações
do
seu
perfil
farmacológico e uma localização divergente da dos receptores 5-HT1B
(Hannon e Hoyer, 2008). Contudo, as semelhanças nas características
transducionais, nas funções e na distribuição levaram à aceitação de que
os receptores 5-HT1B e 5-HT1D eram espécies homólogas (Hoyer, 1989
e Middlemiss, 1998). Com recurso a agentes de deslocação adequados e
um novo radioligando 5-HT1B/1D, [3H] GR-125743, foi possível
discriminar os locais de ligação sináptica 5-HT1B e 5-HT1D em roedores
e não roedores (Meneses, 2007). Os receptores 5-HT1B estão
localizados a nível pré-sináptico e pós-sináptico, especulando-se que
possam estar ainda em terminais não nervosos onde seriam sintetisados
e depois transportados de corpos celulares para outras regiões. Além de
tudo a localização anatómica dos receptores 5-HT1B proporciona forte
evidência de que possam ter um papel de ambos, autorreceptor e
heterorreceptor, isto é, de controlo da libertação de transmissor. Nos
não roedores exibem características farmacológicas de 5-HT1D (Hannon
139
e Hoyer, 2008). Os receptores 5-HT1B também foram encontrados nas
artérias cerebrais e outros tecidos vasculares. Por outro lado, admite-se
que o receptor possa estar silencioso, tornando-se capaz de responder
em condições como a ateroesclerose. A nível periférico os receptores 5HT1B medeiam a contracção das artérias caudais de rato.
Todos os fármacos antimigraine da série dos triptanos actuam via
receptor 5-HT1B. O sumatriptano (SUM), não distingue entre os
receptores 5-HT1B e 5-HT1D, mas o agonista dos receptores 5-HT1D,
PNU109291, desempenha um papel significativo na supressão da
inflamação meníngea neurogénica e nocicepção do trigémio no cobaio,
sugerindo o envolvimento do receptor 5-HT1D nas cefaleias da
migraine. Estes resultados estão de acordo com a detecção deste
receptor nas fibras do trigémio e no feixe espinhal do trigémio. Estudos
de imunorreactividade destes dois receptores permitiu localizá-los no
gânglio trigémio humano onde co-localizam com o CGRP, SP e NOS.
Todavia os agonistas selectivos 5-HT1D são destituídos de actividade
vascular, confirmando que é o receptor 5-HT1B que medeia a
vasoconstrição produzida pelo SUM. Em conjunto, estes dados são
sugestivos de que ambos, o componente vascular e neuronal são
necessários para os triptanos actuarem na migraine, mas não explicam
tudo (Hannon e Hoyer, 2008). Os receptores 5-HT1B e 5-HT1D têm sido
descritos serem modulados pela modulina 5-HT (um tetrapéptido,
LSAL) (Roussele et al., 1998). Os receptores 5-HT1B e 5-HT
1D
podem
formar homo ou heterodímeros (Lee et al., 2000) o que não é
surpreendente dada a forte co-localização que tem sido referida a nível
do mRNA de várias espécies, embora com expressão muito mais
reduzida para o 5-HT1D. A serotonina (5-HT) induziu uma contracção
arteriolar dependente da dose, mas foi menos eficaz que o SUM uma
140
vez que correspondeu apenas a cerca de 60% do efeito máximo do
SUM. Estando os receptores 5-HT1 presentes tanto nas arteríolas como
nos neurónios do trigémio (Poyner, 1992) é improvável que o
sumatriptano na retina do coelho actue apenas na vasculatura.
5.2-Respostas vasodilatadoras
Também foram estudados diferentes péptidos vasodilatadores. A
existência de inervação peptidérgica já havia sido demonstrada nos
vasos oftálmicos de rato, em estudos de Ye et al., (1990) bem como as
respostas de vasodilatação induzidas pelo CGRP na artéria da retina de
boi in vitro (Prieto et al., 1991) e pelos VIP e SP na artéria oftálmica de
porco (Vincent, 1997). Até à presente data de entre os neuropeptídeos
identificados em fibras nervosas perivasculares aferentes, os que
apresentam maior distribuição são o CGRP e as taquicininas (FrancoCereceda et al., 1989, 1999, 2000); do ponto de vista funcional,
algumas destas substâncias possuem um papel de transmissor e/ou
modulador (Franco-Cereceda et al., 1988; Holzer, 1988).
A SP foi descoberta inicialmente no cérebro e no intestino por
Von Euler e Gaddum (1931). Existe praticamente em todos os vasos
sanguíneos do organismo humano nas fibras nervosas terminais.
Substâncias P-like estudadas por imunorreactividade estão presentes
numa pequena porção de células endoteliais (Milner et al., 1988).
141
Tendo presente este conceito, a justificação duma resposta
vascular à SP poderia aqui encontrar alguma explicação. No entanto,
parece-nos mais provável a sua libertação a nível das terminações
nervosas sensitivas trigemiais do músculo liso arteriolar retiniano.
A presença de neurocininas em vasos cerebrais humanos
(Uddman, 1983), apoia a hipótese da libertação de neuropeptídeos na
musculatura lisa ou a nível da adventícia média das arteriolas e vénulas,
permitindo a sua acção a nível endotelial ou a nível das fibras
musculares lisas (Regoli, 1998) e tendo um importante papel no
controlo vasoactivo do fluxo retiniano e na inflamação de origem
neurogénica.
Pareceu-nos
por
isso
importante
a
análise
do
comportamento vascular retiniano em situação patológica que
comprometesse a rede vascular da retina. Por exemplo, o CGRP parece
ser importante na formação de neovasos durante patologia isquémica
(caso
da
diabetes
experimental),
inflamatória
e
cicatrizante
(Haegerstrand et al., 1990). Estas substâncias podem actuar a nível do
local de libertação, que para os grandes vasos se situa ainda longe do
endotélio, mas que está bastante perto em vasos como os da retina com
diâmetros menores (Regoli, 1998).
Os neuropeptídeos estudados encontram-se já descritos em
diversos segmentos vasculares (arteriolares e venulares) do nosso
modelo experimental (coelho). Assim, em alguns segmentos vasculares
arteriais do coelho (artéria pulmonar e aorta) foi descrito um efeito
bifásico dos neuropeptídeos (Constantine, 1990; DÓrléans-Juste, 1986)
– relaxamento e contracção. A remoção do endotélio deixou uma
resposta contráctil sensível à NKA. A veia jugular do coelho, por
exemplo, contrai na presença de SP. O motivo da opção experimental
por segmentos arteriolares e não venosos ou venulares deveu-se ao
142
facto da densidade de fibras musculares lisas em redor das artérias ser
superior às das veias (Furness et al., 1970; Barja et al., 1983; Uddman
et al., 1988; Gibbins et al., 1988). Sabendo que Edvinsson et al. (1988),
não encontraram diferenças de respostas de relaxamento (em potência e
em eficácia máxima) para o CGRP, a SP e a NKA na circulação
mesentérica, os nossos resultados, pelo contrário, demonstraram alguma
diferença que nos pareceu significativa.
Relativamente ao conjunto de hipóteses formuladas por outros
autores quanto ao mecanismo de acção dos neuropeptídeos estudados,
poderemos apenas afirmar com eles, que o efeito relaxante da SP em
artérias isoladas do coelho é devido à activação do receptor NK1
presente nas células endoteliais, o que por sua vez estimula a libertação
de Ca2+ e o sistema da calmodulina, levando à síntese e libertação de
um factor vasodilatador derivado do endotélio (EDRF), identificado
com o óxido nítrico (NO) (Busse et al., 1990). O NO por sua vez
penetra no músculo liso e activa uma guanilatociclase solúvel e a
produção de GMPc (Ignarro, 1986), relaxando as fibras musculares
lisas e favorecendo então a vasodilatação.
O neuropeptídeo CGRP é composto por 37 aminoácidos
codificados pelo gene da calcitonina. Estudos recentes parecem indicar
a presença de diferentes tipos de receptores. Duas das suas formas que
derivam de genes alfa e beta (CGRPα e CGRPβ) foram identificadas no
rato (Amara et al., 1985) e no ser humano (Steenbergh et al., 1985).
Foram também identificados fragmentos de CGRP que possuem efeitos
antagonistas (Donoso et al., 1990). A SP e o CGRP coexistem em
populações de neurónios sensoriais na circulação coronária e da aorta
(Gulbenkian et al., 1990). Em 1994 este mesmo investigador
demonstrou que a SP e a NKA derivam do mesmo percursor molecular.
143
Lesões do nervo trigémio produzem diminuição dos stocks de CGRP e
SP (estudos de imunoreactividade), nas terminações nervosas
perivasculares dos vasos cerebrais (Matsuyama et al., 1986; Wanaka et
al., 1986). O α-CGRP humano demonstrou ser um potente
vasodilatador em artérias mesentéricas humanas e do coelho. A resposta
a esta substância parece ser mais potente do que inclusivamente a
demonstrada pelo nitroprussiato de sódio (Helke et al., 1990). Todos
estes factos nos parecem verosímeis quando aplicados aos vasos
retinianos do coelho.
Dada a semelhança estrutural e funcional do endotélio vascular
retiniano e do SNC, poderemos, sem exagerar, mencionar alguns
estudos neuropeptidérgicos em vasos do SNC. Assim, a maioria das
artérias cerebrais (anteriores, médias, posteriores, vertebrais e
basilares), e as arteríolas da piamater na superfície do córtex cerebral,
são revestidas por finas varicosidades de fibras nervosas contendo
CGRP (Rosenfeld et al., 1983; McCulloch et al., 1988). A sua
colibertação pode ser explicada mais facilmente pelo facto do CGRP e
da SP serem dois neuropeptídeos que demonstraram ser vasodilatadores
cerebrais em muitas espécies animais (Edvinsson et al., 1987; Jansen et
al., 1992).
A potência do CGRP varia consideravelmente com a espécie
estudada: no gato, o CGRP provoca maior relaxamento vascular que a
SP em células musculares lisas dos vasos cerebrais. No entanto os
valores de EC 50 são similares. No Homem, estes valores também são
similares, mas o CGRP dilata apenas em baixas concentrações (Jansen,
1992). Por outro lado, não tem praticamente algum efeito nas veias da
piamater humana em estudos in vivo.
144
Os locais de ligação para o CGRP foram encontrados na média
e íntima das artérias coronárias do rato e na aorta (Sigrist et al., 1986).
Esta noção está de acordo com a hipótese de que o CGRP está
implicado no controlo do tonus vasomotor coronário. Sugere-se ainda
que esta substância pode exercer este controlo circulando nos vasos
(Matsuyama et al., 1986). De facto, ele foi detectado no plasma
sanguíneo
humano,
proveniente
das
terminações
nervosas
perivasculares (Zaide et al., 1985). Estudos diferentes sugerem que esta
resposta vasodilatadora esteja não só associada ao NO como às
prostaglandinas (Brain et al., 1985) e até às catecolaminas (Fisher et al.,
2003), através da acção directa sobre a média com a activação da
adenilciclase (Edvinsson et al., 1987). Se, de facto, a vasodilatação
induzida pelo CGRP é dependente de endotélio intacto ou não,
permanece controverso. A sua potente acção vasodilatadora quer in vivo
quer in vitro não é modificada por bloqueio adrenérgico, colinérgico ou
histaminérgico (Edvinsson et al., 1988).
Os estudos sobre o comportamento farmacológico do CGRP
parecem indicar que, quer a vasodilatação (Brain e Williams, 1985),
quer a inibição da degradação da SP (Lee Greves et al., 1985), quer
ainda o aumento da sua libertação (Okuno et al., 1987) podem
constituir parte dos mecanismos segundo os quais o CGRP potencia a
resposta às taquicininas. Este comportamento pode, sem dúvida ser
extrapolado para a fenomenologia reguladora do tónus vascular
arteriolar retiniano.
A ordem de potência que encontrámos para as taquicininas
estudadas foi a seguinte: NKA≥SP>>NKB. Para a caracterização NK1
de receptores a ordem de potência é a seguinte: SP>NKA>NKB; e para
os receptores NK2: NKA>NKB>>SP (IUPHAR, 2008). A explicação
145
para os resultados encontrados é provavelmente a coexistência de
receptores NK1 e NK2, uma hipótese com base no antagonismo
selectivo do L668,169 e do L659,877.
É, no entanto, interessante verificar o diferente comportamento
de cada antagonista de per si, seguido da injecção perivascular de
CAPS (este antagonismo misto foi já descrito em outros tecidos
vasculares do coelho (veia safena, artéria pulmonar) por
Osborne
(1990).
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram um efeito
vasodilatador evidente e mensurável da SP, CGRP e NKA neste leito
vascular no coelho normal. Obteve-se uma resposta relaxante menos
acentuada após a injecção intra-vítrea periarteriolar de NKB e
senquetide. Uma vez que as fibras neuroniais que contêm CGRP estão
presentes no gânglio trigémio de todas as espécies já estudadas,
incluindo o homem e o coelho (Stjernschantz, 1984), alguns estudos
são sugestivos de que o CGRP e a SP ocorrem em subpopulações
específicas de nervos aferentes que vão prover o sistema vascular dos
mamíferos. Nas nossas experiências o CGRP e a SP produziram
respostas semelhantes, o que leva a admitir poderem ser libertadas pelas
mesmas terminações nervosas. De facto exitem provas de que uma
taquicinina pode ser sintetisada e libertada juntamente com o CGRP
pelo mesmo neurónio sensorial (Holzer, 1988; 1991). As lesões do
gânglio trigémio induzem diminuição da imunorreactividade de ambos,
CGRP e SP, nas fibras nervosas que vão inervar os vasos sanguíneos
cerebrais. Além disso, o CGRP e a SP, mas também a NKA estão
expressas e são possivelmente libertadas pelos mesmos neurónios
146
(D´Orleans-Juste et al., 1986; Holzer, 1988). Estudos anteriores revistos
por Holzer (1988) haviam demonstrado que a SP e a NKA são
derivadas de uma molécula precursora comum. A hipótese desta colibertação é confirmada pelos resultados das experiências que
realizámos, uma vez que os antagonistas dos receptores destes
neuropeptídeos inibiram a resposta à capsaicina.
Foi demonstrado ainda que a SP é mais potente que a NKA, mas
de duração de acção mais curta que o CGRP (Holzer, 1991). No nosso
modelo, a NKA pareceu ser menos potente do que a SP (pED50 12,52
+ 0,31 e 12,50+ 0,11) para valores de Emax de 53,3 + 2,5% e 21,3+
2,3%, respectivamente. A SP e taquicininas relacionadas podem actuar
perto do localda sua libertação, que pode ser bastante afastado do
endotélio, como acontece nos grandes vasos ou talvez não muito longe,
nos vasos pequenos, como os retinianos (D`Orleans-Juste et al., 1986).
Têm sido identificados três receptores das taquicininas, NK1,
NK2 e NK3 (IUPHAR, 2008). A SP mostra maior afinidade para o
receptor NK1, a NKA para o receptor NK2, a NKB e o Senquetide para
o receptor NK3 (Holzer, 1991). Os resultados que descrevemos
anteriormente são demonstrativos de que na circulação retiniana do
coelho NZW, a ordem de potência das taquicininas é NKA > SP >>
NKB. Uma vez que este último neuropeptídeo e senquetide exibem
baixa eficácia, é possível que exista apenas uma baixa densidade de
receptores NK3. O reduzido efeito obtido com a NKB e o senquetide
podem ser também explicados através de outros receptores: NK1 e/ou
NK2. A ordem de potência para os receptores NK1 deve ser SP > NKA
> NKB e, para o receptor NK2 seria NKA > NKB >> SP ( IUPHAR,
2008). Os resultados que obtivemos nas experiências efectuadas são
sugestivos da coexistência de receptores NK1 e NK2, uma hipótese
147
sustentada pelo antagonismo selectivo evidenciado pelos compostos L668,169, GR 159897 e L-659,877 (Saria et al. 1985; Mcknight,1990;
Maggi et al., 1992). O antagonista do CGRP, CGRP8-37, reduz o efeito
da SP e da NKA, tornando plausível a possibilidade de que o CGRP
endógeno esteja desempenhando um papel na resposta. A injecção
periarteriolar do antagonista isolado (dos não mostrados) suportam esta
hipótese.
Dos resultados que apresentámos podemos concluir, pela
existência de receptores NK1, NK2 e CGRP nas artériolas retinianas do
coelho. Os resultados com a capsaicina após o uso de antagonistas dos
receptores NK1, NK2 e do CGRP são também sugestivos da existência
de terminações nervosas sensitivas adjacentes às artériolas retinianas
que contêm SP, CGRP e NKA. Além disso, estes péptidos podem ter
um papel relevante na homeostasia vascular, de modo idêntico a outros
agentes como o óxido nítrico, endotelinas e prostaglandinas. Muito
embora diversos estudos anteriores tenham comprovado a presença de
receptores de neuropeptídeos na circulação retiniana, bem como os seus
efeitos em vasos sanguíneos oculares isolados, este estudo parece ser
significativo porque proporciona a primeira evidência in vivo dos
efeitos dos neuropeptídeos na retina.
A importância clínica do conjunto dos nossos resultados leva a
aceitar que a microinjecção dos antagonistas selectivos dos receptores
das taquicininas e do CGRP poderá providenciar um modo de alívio da
dor, inflamação e degradação do endotélio (em doentes com diabetes ou
outras doenças isquémicas da retina), que ocorrem sob actividade
excessiva de fibras sensoriais do trigémio.
148
5.3-Respostas aos Inibidores da NOS
É bem conhecido que o endotélio pode mediar a regulação do
tónus vascular através da libertação de óxido nítrico (NO) e de outros
relaxantes do músculo liso. Ambos, o inibidor da NOS, a L-NNA, e o
inibidor da guanililciclase solúvel, ODQ, têm um efeito inibidor sobre o
relaxamento induzido pelo CGRP nas artérias retinianas isoladas de
bovino (Boussery et al., 2005).
O aspecto que nos pareceu mais importante deste trabalho,
reside, sem dúvida, na identificação de respostas a um conjunto de
substâncias vasoactivas a nível do Sistema Nervoso Central (SNC) e
que ainda não foram alvo de estudo a nível vascular retiniano,
concretamente a nível arteriolar e justa-papilar, através da análise
metódica da variação do diâmetro vascular e velocidades de fluxo
destes vasos quando são submetidos in vivo a concentrações crescentes
destas substâncias.
Parece relevante salientar que, ao contrário de Pietscher et al.,
(1996), antes de iniciarmos estes estudos, não encontrámos variações
circadianas do diâmetro vascular no nosso modelo experimental, o que
facilitou a execução do mesmo.
Não parece existir expressividade de receptores NK3, o que
corresponde ao achado de outros investigadores de uma percentagem
baixa de presença deste tipo de receptores nas espécies de mamíferos.
Os resultados sugerem ainda um envolvimento preferencial de
receptores NK2 versus NK1 e provavelmente a sua estimulação
simultânea na parede das arteríolas retinianas. São necessários estudos
149
imunocitoquímicos, para evidenciar a sua presença a nível endotelial ou
a nível das células musculares lisas que revestem o endotélio.
Em algum momento do nosso estudo averiguámos a reactividade
das vénulas a estas substâncias (dados não mencionados). Ao contrário
de outros investigadores encontrámos respostas do mesmo tipo nestes
vasos retinianos, embora muito menos intensas (de tal forma que
decidimos não as incluir neste trabalho).
Em conjunto, os resultados parecem indicar que aparentemente,
microinjecções de antagonistas selectivos NK e do CGRP poderão
diminuir os processos inflamatórios, a dor e a disfunção endotelial (na
diabetes e outras doenças isquémicas) que ocorrem sob uma actividade
excessiva das fibras sensoriais do trigémio. Além disso, podemos
inferir outras conclusões: tal como Hoyer (1994) havia demonstrado, a
SP possui apenas um efeito moderado sobre os pequenos vasos como as
arteríolas.
Não foi propósito do nosso estudo detectar a presença de
inervação serotoninérgica ou neuropeptidérgica (sensorial) a nível das
arteríolas retinianas justa-papilares do coelho. Procurámos sim, poder
sugerir que a esse nível existem, de facto, receptores para estes dois
sistemas, e que poderão contribuir para a regulação do tonus vasomotor
da circulação retiniana, além de poderem participar em fenómenos de
natureza inflamatória, álgica e espástica.
Na diabetes e no glaucoma experimentais, procurámos estudar o
comportamento destes receptores, de forma a poder contribuir
experimentalmente, de alguma forma, para o desenvolvimento de novas
abordagens na terapêutica. A via(s) de administração a utilizar, invasiva
150
(intravítrea), tópica em colírio ou por via transescleral através de
sistema de libertação prolongado, será um critério posterior a
equacionar de acordo com as características farmacodinâmicas da
substância a ensaiar. Sob a forma de colirio ou utilizando dispositivos
polimerizados para implante subconjuntival, a difusão do segmento
anterior para o posterior, incluindo os processos ciliares e os vasos
retinianos, é, como se sabe, bastante rápida (Havener, 1994). Os
resultados obtidos pareceram-nos esclarecedores quanto à disfunção
endotelial induzida pela diabetes e o glaucoma. Como se observou, toda
a resposta à estimulação de receptores se encontrou prejudicada,
questionando-nos se existem diferenças de membrana ou dos
mecanismos transdutores/efectores.
Sabendo, no entanto, da possibilidade de extrapolação destes
resultados experimentais para o ser humano (mencionado por vários
autores em estudos comparativos anátomo-fisiológicos entre o coelho e
o Homem), trabalhos posteriores nossos (não publicados) de
estimulação
directa
do
gânglio
de
Gasser
(n=3)
induziram
vasodilatação ainda que discreta a nível das arteríolas retinianas do
coelho, o que confirma de algum forma a presença de capsaicina nas
terminações nervosas sensitivas do nosso modelo experimental,
conforme demonstrado. Especula-se se, apesar dum endotélio
disfuncional, a acção farmacológica de substâncias serotoninérgicas ou
neuropeptidérgicas com relativa selectividade para determinados
receptores localizados na célula muscular lisa arteriolar, do próprio
endotélio ou da glia que o circunda, poderá ter efeitos benéficos na
patologia referenciada.
Não injectámos todos os agonistas por via endovenosa pela
elevada toxicidade (taxa de mortalidade alta) observada no decurso
151
deste tipo de experiências mesmo quando administrados em doses não
letais. Conseguímos concretizá-lo, no entanto, com o SUM, que revelou
parcial inibição da contracção o que poderá reforçar talvez o conceito
de Barreira Hemato-Retiniana (BHR) interna (endotélio dos vasos
retinianos) e|ou associado ao conceito de inexistência de receptores
sensitivos ao SUM (Saxena et al., 1998). Como a injecção sistémica de
SUM
não
alterou
os
diâmetros
vasculares,
conclui-se
que,
possivelmente esta substância, como aliás todos os agonistas 5-HT
testados no conjunto de experiências, não atravessa a BHR. Este facto
poderá indicar que os receptores não se localizam a nível endotelial mas
a nível miogénico liso.
Em análise, provavelmente a teoria trigémio-vascular da
migraine e do glaucoma normotenso poderá ter a mesma origem: um
aumento do CGRP com a colaboração da SP e da NKA provocam
vasodilatação e inflamação locais (por aumento do NO), através da
estimulação de receptores 5-HT 1B/1D e 5-HT2.
O NO é um mediator importante das funções homeostáticas do
olho, incluindo a regulação da dinâmica do humor aquoso,
processamento neuronial visual, modulação local do fluxo ocular do
sangue e controle da morte, por apoptose, das células ganglionares. As
mudanças na quantidade de NO podem contribuir para patologia
diversa como a uveite, retinite e o glaucoma (Kotikoski et al., 2002).
Alguns resultados indicam que o NO possui um papel no
autorregulação da circulação no nervo óptico durante o processamento
de entrada/saída elevada de humor aquoso. Isto significaria que o NO
fornece alguma neuroprotecção durante uma fase aguda da doença
152
isquémica do nervo (Okuno, 2002). É crescente a evidência de que o
NO seja um agente antiproliferativo e citotóxico para as células
retinianas. Diversos estudos experimentais recentes indicam que NO
medeia as acções neurotóxicas do glutamato que são responsáveis pela
doença isquémica retinana. Em acréscimo, a neurotoxicidade do
glutamato foi demostrada ser atenuada pela inibição da actividade das
NO sintetases (Hattenbach et al, 2000). Este gás endógeno possui um
papel na regulação de funções vasculares retinianas contribuindo assim
para a patofisiologia da retinopatia. As células endoteliais vasculares
retinianas e os pericitos (de origem monocítica) sintetizam a iNOS sob
circunstâncias estimuladas, e níveis elevados de L- Arginina são
observados no humor aquoso de pacientes diabéticos. Demostrou-se
este acontecimento pela administração de aminoguanidina a ratos
diabéticos e consequente inibição do desenvolvimento de retinopatia
diabética. O NO tem um intermediário altamente reactivo, o
peroxinitrito, que está ligado à lesão na diabetes.
Os modificadores do NO (L-NAME e a aminoguanidina), ao
inibirem as NOS promovem um aumento da pressão intraocular. Este
facto leva a supor que a iNOS é responsável pelo controlo da TIO
através da produção de NO: pela inibição da iNOS (com a
aminoguanidina) e aplicação de L-arginina há redução da TIO, o que
pode significar que as outras isoformas estão activas ou que não houve
uma inactivação total da iNOS (neste caso, com base nos resultados
observados, parece não ter ocorrido uma inibição completa desta
enzima). Pelo contrário, a inibição da eNOS e da nNOS (com L-NNA)
não impede a diminuição da TIO pela L-arginina pelo que a iNOS está
a produzir NO. O L-NAME (inibidor das três isoformas), é o que se
153
mostra mais eficaz dado que a L-arginina não consegue sobrepor esta
inibição.
Outros autores aplicaram por via intravitrea SNAP (20 nmol) e
verificaram que este farmaco aumentava o calibre da artéria retiniana na
margem da cabeça do nervo óptico 60 a 120 minutos mais tarde e o
fluxo capilar na cabeça do nervo óptico 90 a 135 minutos mais tarde.
Verificou-se a existência de uma relação dose-resposta entre 2 a 20
nmol. O SNAP reduziu inicialmente a resistência dos vasos sanguíneos
na cabeça do nervo óptico e a pressão de perfusão na cabeça do nervo
óptico, seguida de um aumento do fluxo sanguíneo capilar na cabeça do
nervo óptico (Lapa, 2004)).
A
administração
tópica
de
nitrovasodilatadores
reduz
marcadamente a TIO em coelhos e macacos por um mecanismo que
envolve principalmente o aumento do fluxo de humor aquoso do olho.
A menor produção de NO foi observada em pacientes com glaucoma
primário de ângulo aberto. O L-NAME tem efeito bloqueador
muscarínico (Oswald et al., 1995) e provoca redução da inflamação.
Em relação à aminoguanidina, a sua relação com a entidade diabética
baseia-se no facto de ser um composto que é um inibidor potente da
formação do produto final da glicação avançada induzida por
hiperglicémia associada à diabetes (Lapa, 2004).
Uma vez que o fluxo sanguíneo retiniano está diminuído em
condições de TIO elevada, é possível que a pressão elevada despolete a
actividade da NOS que se destina a restaurar o fornecimento basal de
sangue. Além disto, Neufeld et al. (1999) mostraram que a aplicação de
aminoguanidina (inibidor da iNOS) reduziu o dano nas células
ganglionares retinianas em retinas com elevada TIO para menos de
154
10% em 6 meses (Lapa, 2004).
No estudo presente, o óxido nitrico parece ser um regulador
importante do fluxo ocular do sangue, provavelmente pela via da iNOS.
De acordo com estes resultados, a L-Arginina, um precursor do NO,
diminuiu provavelmente o processador de entrada/saída do humor
aquoso. O L-NAME, inibidor de todas as isoformas das NO sintetases,
aumentou o processador de entrada/saída do mesmo, de um modo
significativo.
O mesmo aconteceu com a aminoguanidina, um inibidor do
iNOS, mas não com o L-NNA, um inibidor da eNOS e da nNOS.
Assim, neste modelo experimental, a iNOS pode ser envolvida na
produção e/ou drenagem do humor aquoso. No modelo experimental do
glaucoma, a L-arginina podia diminuir o processador de entrada/saída.
O L-NAME indicou uma tendência para diminuir o processador de
entrada/saída, embora este efeito pudesse ser devido ao facto deste
processo se encontrar num nível tão elevado que este composto não o
poderia aumentar mais. Consequentemente, o NO contribui para a
diminuição do processador de entrada/saída, embora em excesso, como
demonstrado em outros estudos experimentais, pode conduzir à
degenerescência das células gaglionares no glaucoma.
Algumas observações inferem que a produção de NO parece
estar aumentada nos olhos de doentes diabéticos embora sem
retinopatia. Este dado suporta a hipótese que os efeitos mediados pela
citoquina ocorrem antes do início das mudanças morfológicas da
vasculatura. Há uma probabilidade razoável que situações patológicas
tais como a diabetes mellitus em que a expressão da iNOS depende da
existência de concentrações elevadas do NO podem ser um factor
155
significante no regulamento das funções vasculares retinianas e nas
modificações proliferativas intraoculares (Hattenbach et al., 2000).
Uma vez que a iNOS é induzida, pode também ser inibida
directamente por inibidores da iNOS, tais como a L-arginina ou
análogos (L-NMMA, NG- amino-hemo-arginina, NG- amino-Larginina, arginina- dimetil, oxihemoglobina, azul de metileno e NGnitro-L-arginina), aminoguanidina e a S-metilisotiourea (Chiou, 2001).
O L-NAME, como se sabe, inibe as três NOS, sendo apenas a iNOS
inibida pela aminoguanidina (as outras duas estão disponíveis para
sintetizar NO e, assim, promoverem um efeito vasodilatador).
Constatou-se que a L-arginina, o percussor da formação de NO,
dose-dependente, baixa o processador de entrada/saída de humor
aquoso. Este estudo mostra claramente que os NO-dadores e os cGMPactivadores baixam a pressão intraocular quando são absorvidos ou
injectados directamente no olho (Kotikoski et al., 2002)
Chiou e seus colaboradores patentearam e publicaram o uso da
L-arginina e seus análogos para baixar a TIO, baixando os níveis do
processador de entrada/saída de humor aquoso e aumentando o fluxo
ocular do sangue nos olhos do coelho. Sugeriram ainda mais: que estes
percursores de NO podem também ser utilizados para tratar retinopatias
isquémicas e mesmo patologia isquémica cerebral. Ao mesmo tempo,
Nathanson (1992) relata que os dadores de NO, como o nitroprussiato,
o isossorbido, o minoxidil, a hidralazina, o nitrato de sódio e a
nitroglicerina, baixam também o processador de entrada/saída sem
produzir efeitos sistémicos cardiovasculares. Estes resultados indicam
que ambos os percussores e dadores de NO podiam ser usados para o
tratamento do glaucoma através da redução do processador de
156
entrada/saída de humor aquoso e/ou melhoria do fluxo ocular do sangue
(Chiou, 2001).
Como em outros formulários da neurodegenerescência, um
desenvolvimento do tratamento neuroprotector eficaz
no glaucoma
parece ser complicado devido às interações complexas de diversas
linhas celulares que determinam o destino final da célula neuronal. É
provável que mesmo se um dos caminhos identificados que possa se
encontrar associado à neurodegenerescência glaucomatosa estiver
obstruído, a morte da célula endotelial possa ser mediada ainda por
outros
circuitos
alternativos.
Consequentemente,
as
estratégias
neuroprotectoras podem passar por impedir uma escala larga de
circuitos para a apoptose e não apenas um único ou alguns.
Alternativamente, as estratégias de neuroprotecção podem ser dirigidas
realçando os mecanismos protectores intrínsecos (Harris, 2008).
Parece que há um denominador comum, o NO, na etiologia das
doenças oculares e no seu tratamento, impedindo a sua manifestação.
Propõe-se que a produção maciça de NO em consequência da indução
da iNOS poderia minimizar lesões posteriores retinianas centrais
degenerativas que podem conduzir ao glaucoma, inflamação ocular,
degenerescência macular, retinopatia, miopia e catarata senile. É
altamente possível que o uso dos inibidores da actividade da iNOS e da
indução da iNOS possa resultar na prevenção/tratamento da maioria, se
não todas, estas doenças oculares (Chiou, 2001).
Estudos recentes apresentados em congressos (ARVO, 2008)
atribuem um futuro promissor à terapêutica oftalmológica que
preconiza, além de técnicas de terapia génica de que é exemplo a
utilização do CD59 por adenovirus humano para o tratamento da fase
precoce da doença macular relacionada com a idade (DMI), outras
157
abordagens terapêuticas, tendo como alvos selectivos receptores
específicos em vasos retinianos, que, uma vez estimulados, alterem uma
função tecidular específica, já anteriormente postulado por Moroi e
Lichter
(1999).
Considera-se
assim da
maior
importância
o
desenvolvimento de técnicas de administração intraocular com
dispositivos médicos “medical devices”, associada à microinjecção ou
microimplante de fármacos in vivo (Juhl et al., 2006), com o propósito
terapêutico ou profiláctico, no sentido da neuroprotecção (Kwan et al.,
2006), como a aplicação recente de um promotor retiniano (VMD2) que
impede a neovascularização coroideia. A utilização `a posteriori de
dispositivos
activas,
médicos,
com
suporte
contendo
da
substâncias
engenharia
farmacológicamente
biomédica
na
área
da
nanotecnologia (em concreto com polímeros), será uma consequência
imediata desejável.
CONCLUSÕES
1. Os nossos resultados demonstram a existência provável de receptores 5HT1B/1D a nível arteriolar retiniano, dada a resposta vasoconstrictora à 5HT, ao SUM, confirmada pelo antagonismo verificado com a
administração prévia de GR127,935 e de SB224,284.
2. A reactividade vascular para a α-metil-5-HT, associada a um antagonismo
nítido pela cetanserina e pela espiperona, pode inferir sobre a presença de
receptores 5-HT2, nos vasos retinianos do coelho.
3. Sugere-se também a coexistência de receptores NK1 e NK2, uma hipótese
com base no antagonismo selectivo do L668,169 e do L659,877. Conclui-
158
se ainda da existência de receptores CGRP nas artériolas retinianas do
coelho. Os resultados com a capsaicina após o uso de antagonistas dos
receptores NK1, NK2 e do CGRP são também sugestivos da existência de
terminações nervosas sensitivas adjacentes às artériolas retinianas que
contêm SP, CGRP e NKA.
4. Os resultados obtidos pareceram-nos esclarecedores quanto à disfunção
endotelial induzida pela diabetes e o glaucoma experimentais. Como se
observou, toda a resposta à estimulação de receptores se encontrou
prejudicada.
5. Nestes ensaios, o L-NAME mostrou uma tendência para diminuir a IOP,
relativamente ao controlo BSS; neste caso a pressão intraocular está
eventualmente no máximo pelo que este fármaco não tem qualquer efeito.
A L-arginina mostrou ser capaz de diminuir a IOP em coelhos
“glaucomatosos”. No modelo experimental do glaucoma, a L-arginina
podia diminuir o processador de entrada/saída. O L-NAME indicou uma
tendência para diminuir o processador de entrada/saída alterando a TIO,
reduzindo o fluxo sanguíneo arteriolar. Consequentemente, o NO parece
contribuir para a diminuição do processador de entrada/saída. Pode
concluir-se que o L-NNA (mesmo em alta concentração) não tem efeito.
A curva é muito semelhante à do ensaio com BSS e L-arginina.
6. O L-NAME e a aminoguanidina, ao inibirem as NOS promovem um
aumento da pressão intraocular; nestes casos a L-arginina teve um efeito
parcial uma vez que o abaixamento provocado não foi semelhante ao do
BSS + L-arginina.Após administração intraocular dos vários compostos
em estudo,verificou-se que o L-NAME e a aminoguanidina, inibidor das
159
três NOS e da iNOS, respectivamente, aumentaram a pressão intraocular
enquanto o SNAP (dador de NO) e a L-arginina (precursor de NO)
tiveram um efeito hipotensor ocular. O L-NNA (inibidor da cNOS)
provocou apenas um ligeiro aumento da IOP.
7. Os
receptores
para
estes
dois
sistemas
(serotoninérgico
e
neuropeptidérgico) poderão contribuir para a regulação do tonus
vasomotor da circulação retiniana via NO entre outras, além de poderem
participar em fenómenos de natureza inflamatória, álgica, espástica e
isquémica existente na diabetes e no glaucoma.
160
CAPÍTULO VI
RESUMO, BIBLIOGRAFIA, ÍNDICE
161
CAPÍTULO VI
6.1-RESUMO
O conhecimento farmacológico das substâncias relacionadas com o
sistema serotoninérgico e neuropeptidérgico é presentemente bastante
vasto, embora ainda controverso (Osborne, ARVO, 2008). Concretamente,
em relação à serotonina (5-HT), conhecemos bem a sua origem bem como
a sua distribuição no organismo humano, assim como a sua degradação
enzimática e as suas acções farmacológicas mesmo em situações de
patologia. No entanto, novos conceitos se vão abrindo quanto ao seu papel
fisiológico, nomeadamente a nível vascular cerebral e retiniano.
A existência de uma barreira hemato-retiniana (BHR) interna e externa
pressupõe uma regulação do fluxo sanguíneo e por consequência do aporte
nutricional para a retina, que é autoregulado nos vasos retinianos. A
implicação secundária deste dado é a da alteração dos mecanismos
fisiológicos do endotélio vascular que constitui a BHR-interna, em
situações normais ou patológicas (como na pré-retinopatia diabética ou o
glaucoma, por exemplo). É de extrema importância compreender quais as
substâncias envolvidas nestes mecanismos, quer em situações normais quer
162
patológicas, e de que forma elas poderão influenciar os resultados
espectantes.
Neste contexto decidiu-se estudar os sistemas serotoninérgico e
neuropeptidérgico in vivo no coelho albino da raça Nova Zelândia, em
arteríolas
retinianas
justa-papilares,
através
da
quantificação
da
reactividade vascular avaliada pela variação de diâmetros vasculares
(captada por angiografia digitalizada e por vídeo) e de fluxos arteriolares
(através do sistema doppler), em coelhos normais e diabéticos.
Os resultados permitiram concluir da existência de receptores 5-HT
1B/1D
e 5-HT2 a este nível, responsáveis por fenómenos de vasoconstrição
arteriolar retiniano com diminuição de fluxos sanguíneos, assim como
receptores NK1, NK2 e do CGRP (classificação da NC-IUPHAR -União
Internacional
de
Farmacologia-
de
2008)
com
expressividade
vasodilatadora e consequentemente aumento dos fluxos arteriolares
retinianos.
Permitiram ainda sugerir a existência de inervação sensitiva a nível das
arteríolas retinianas do coelho, com implicação provável na resposta
neurogénica e inflamatória a este nível, além da falta de expressividade
vascular dos receptores citados perante um endotélio retiniano
disfuncional quer em coelhos diabetizados pela aloxana quer em coelhos
com hipertensão ocular.
Conclui-se ainda, da possível importância de alguns mediadores do
óxido nítrico (NO) como agentes na expressividade dos receptores
descobertos em patologias como o glaucoma e a diabetes.
Para o tratamento sintomático de algumas doenças oculares de origem
vascular, um doador de NO ao ser administrado por uma determinada via,
aumentaria quantidades pequenas de NO que activariam a guanilciclase na
163
produção de GMPc, baixando o processador de entrada/saída do humor
aquoso, aumentando o fluxo ocular do sangue, relaxando o músculo ciliar,
etc. (Chiou, 2001). De acordo com os resultados obtidos, a terapêutica antiglaucomatosa, por exemplo, visaria a associação de um dador de óxido
nítrico (que promove a diminuição do processador de entrada/saída de
humor aquoso) com um inibidor da iNOS que impede efeitos nocivos do
excesso de NO na neurodegenerescência retiniana.
6.2-SUMMARY
The characterization of retinal vessel receptors as well as their specific
function is not completely clarified. The serotonergic system is one of the
systems that are not completely characterized on retinal vessels.
Controversy still also exists for the neuropeptidergic system which is not
completely characterized on retinal vessels of some mammalian species.
This work studied in vivo the retinal serotonergic, neuropeptidergic and NO
modifier systems by studying the vascular response (vasodilation and/ or
vasoconstriction) of New Zealand White (NZW) rabbit retinal vessels.
Data was obtained by direct measure of vascular diameters (retinal
arterioles at 2 discs of ONH) using digital angiography after intravitreous
perivascular microinjection of drugs into the eye ball (n≥6 for each
experience), as well as measurements of arteriolar blood flows with a CDI
device. Quantification is expressed in percentage relaxation (increase) or
contraction of basal vascular diameter (%).
After the intravitreal microinjection of 10 nmol serotonin (5-HT), an
initial slight vasodilator effect was observed, followed by a dose-dependent
164
arteriolar constriction; the maximal contractile effect was obtained with 10
nmol 5-HT (the maximal vascular diameter reduction (Emax±SEM) was
29.4±1.5% at the arteriolar level. Sumatriptan, a 5-HT1B/1D receptor
agonist, when given by intravitreal injection (10 nmol) had the most potent
vasoconstrictor effect at the arteriolar (Emax±SEM =44.8±1.0%) level with
a strong decrease of blood flow. No significant effect was verified when the
same doses of sumatriptan were administered intravenously. The
contractile effect induced by 5-HT or sumatriptan was reversed by the
intravitreal injection of all serotonergic antagonists.
nmol), a 5-HT1 receptor agonist, also caused
α-Methyl-5HT
(10
vasoconstriction, an effect
antagonized by 10 nmol of ketanserin. 8-OH-DPAT, a 5-HT1A receptor
agonist, did not show a significant effect and neither did 2-Methyl-5HT (5HT3 agonist) and cisapride (5-HT4 agonist). Rabbits diabetized with
alloxane showed no response to 5-HT modifiers and neuropeptides.
Our results also suggest the presence of 5-HT2 and 5-HT1B/1D
receptors on the arteriolar retinal circulation of the rabbit.
They also
suggest that sumatriptan probably does not cross the blood-retinal barrier
(endothelium of retinal vessels) and that there is no specific response to 5HT agonists on alloxan-induced diabetic rabbits.
The characterization of retinal vessel responses to specific
compounds such as calcitonin gene-related peptide (CGRP) and related
tachykinins as well as their specific function at this level has not been yet
unequivocally identified. This work also aimed to study in vivo the
response to Substance P (SP), Neurokinin-A (NKA), Neurokinin-B (NKB),
Senktide, Capsaicin (CAPS) and CGRP. Microinjection of Substance P
(NK1 receptor agonist) induced a dose-dependent arteriolar dilating effect,
being Emax obtained with 1 nmol (the maximal vascular diameter
enlargement (means ± SEM) was 21.3± 2.3% at the arteriolar level). After
165
perivascular preinjection of 1 nmol L-668,169, a NK1 antagonist, the
vascular diameter enlargement was 15.2+3.2% at the arteriolar level. As
for CGRP, doses up to 10 nmol induced a marked vasodilation (means±
SEM: 41.1±0.4% at the arteriolar level). The same type of response was
obtained with 10 nmol of NKA (NK2 receptor agonist) which induced the
most potent effect of all neuropeptides used (means±SEM: 53.3±2.5% for
arterioles). After perivascular preinjection of the NK2 antagonist L654,877 (10 nmol) the vascular diameter enlargement was 37.0±0.7% at the
arteriolar level.
Capsaicin, a vanilloid agonist responsible for the release of
neuropeptides from peripheral endings of afferent neurons, showed a
marked vasodilating effect (means±SEM: 43.0±2.9%) with an increase of
arteriolar blood flow. After perivascular microinjection of NK3 agonists
(senktide and NKB) a less prominent vasodilating effect was observed
(means±SEM: 6.8±0.7%; 14.3±1.2%, respectively).
These results suggest the presence of neuropeptide receptors (NK1,
NK2 and CGRP receptors) on the ONH of the retina vascular wall of the
rabbit, probably contributing to the vasomotor auto regulation and
neurogenic inflammation at this level. They also suggest the existence of
endothelial dysfunction on diabetic retinal vessels, characterized by an
impaired response to all tested neuropeptides.
A possible approach to neuroprotection and reduction of IOP may
be accomplished by NO modulators which were also characterized in the
studies (iNOs), especially in our experimental glaucoma model. A
correlation between these three group of modulators (serotoninergic,
neuropeptidergic and NO) may be possible to establish and be useful for
knew therapeutic challenging approaches to the isquemic ocular diseases.
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234
ÍNDICE
pag.
Prefácio……………………………………………………………………9
Capítulo I
I-Introdução……………………………………………………...............13
1.1-Importância da componente interna da Barreira Hemato-Retiniana nos
mecanismos de auto-regulação intrínseca da vascularização retiniana e da componente
extrínseca, através da mediação por fármacos...............……………………………..22
1.2-Revisão anatómica actualizada da inervação aferente,
simpática e parassimpática do globo ocular…………………………………….........41
1.3-Inervação e vascularização da retina humana e da retina do coelho..........45
1.4-Embriogénese e estrutura dos vasos retinianos no Homem e no coelho....50
Capítulo II
II-Objectivos………………………………………………………….…56
2.1-Justificação e definição dos objectivos………………………………......57
2.2-Objectivos específicos…………………………………… ………......….63
Capítulo III
III-Material e Métodos………………………………………………......70
3.1.1-Modelo animal utilizado e avaliação de parâmetros……………….......71
3.1.2-Preparação e experimentação de vários tipos de micropipetas de
microinjecção…………………………………………………………………………73
235
3.1.3-Padronização das técnicas de microinjecção intraocular in vivo a nível
dos vasos retinianos………………………………………………..............................74
3.1.4-Análise dos fluxos com CDI………………………...............................79
3.1.5-Análise de Imagem…………………………………………..................81
3.1.6-Indução de Diabetes experimental……………………………………..83
3.1.7-Indução de Glaucoma experimental……………………………….......87
3.1.8-Protocolo experimental……………………………………...................91
3.1.9-Fármacos utilizados e soluções…………………………………….......92
3.1.9a-Modificadores do Sistema Serotoninérgico……………..........93
3.1.9b-Peptídeos…………………………………………..................97
3.1.9c-Modificadores do NO…………………………….................101
3.1.10-Análise dos dados e estatística………………………………............103
Capítulo IV
IV-Resultados…………………………………….................................105
4.1-Estudos com vasoconstrictores…………………………………………107
4.2-Estudos com vasodilatadores…………………………………………...116
4.3-Estudos com os modificadores do NO………………………………….125
4.3.1-Resultados com CDI………………………………………….129
Capítulo V
V-Discussão e Conclusões ……………………………….....................133
5.1-Respostas vasoconstrictoras.....................................................................134
5.2-Respostas vasodilatadoras........................................................................140
5.3-Respostas aos inibidores da NOs.............................................................148
236
Capítulo VI
6.1- Resumo………………………………………………………........161
6.2- Summary…………………………………………..........................163
6.3- Bibliografia………………………………………………………..166
6.4- Publicações relevantes…………………………………………….228
6.5- Índice………………………………………………………….......234
ADENDA
Índice de Figuras e Quadros
ADENDA
Índice de Figuras e Quadros
Pág
Fig.1 Estrutura da retina dos mamíferos e sua conexão com os vasos retinianos e
coroideus (notar o posicionamento dos vasos peripapilares em relação à divisão
topográfica
das
células
retinianas,
nomeadamente
ganglionares
e
de
suporte)…………………………………………………………………………………….46
Fig.2- Retinografia digital (preto e branco) de coelho albino…………………..….48
Fig.3- Pormenor da arquitectura neurovascular da hemiretina temporal esquerda
do coelho albino (salienta-se a visualização de vasos peripapilares, retinianos e
coroideus)…………………………………………………………………………………50
Fig.4-Fotografia do sistema de micropipetas a inserir intraocularmente……….76
Fig.5- Esquema do “locus” de microinjecção dos fármacos a testar…………....77
Fig.6- Imagem do angiógrafo IMAGEnet 1024……………………………………..83
Fotografia a cores a) - Fundo ocular normal de coelho albino com visualização do
disco
óptico,
vasos
retinianos
e
coroideos,
no
início
de
uma
experiência……………….......................................................................................109
Fotografia a cores b)- O mesmo olho, após injecção intravítrea de Sumatriptano
(note-se
a
extensa
vasoconstrição,
sobretudo
arteriolar
papilar
e
justapapilar)……...................................................................................................109
Fig.7- Curvas dose-resposta de todos os agonistas testados em coelhos normais.
Os valores são expressos em termos de média ± erro padrão; n≥6 para cada
agonista testado. Valores de p < 0,05 em relação ao controlo. ……………......110
Fig.8- Curvas dose-resposta para a α-Metil-5-HT em administração isolada e
após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1/2 na dose de 10
nmol e de Cetanserina (antagonista não selectivo de receptores 5-HT2 / 5-HT1D) na
mesma concentração. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão;
n≥6.Valores de p < 0,05 em relação ao controlo……………………………………111
Fig.9- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT e L-694,247 em
administração isolada e após pré-injecção de antagonista selectivo dos receptores
5-HT1D (BRL15572), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de
média±erro padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao controlo…………113
Fig.10- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT
em administração
isolada e após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1B
(GR127,935 e SB224,284), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em
termos de média±erro padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao
controlo………………….......................................................................................114
Fig.11- Curvas dose-resposta de todos os agonistas 5-HT testados em coelhos
diabéticos. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6 para
cada agonista testado…………………………………………………………............115
Fig.12- Curvas de dose-resposta para a SP (10 nmol), um agonista dos receptores
NK1, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L-733,060 (ambos antagonistas
selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol); após tratamento com
L659,877 e GR159,897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2, na
dose de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP) na dose
de 10 nmol. Os dados referem-se a médias±erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre
cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo <0,05……………....117
Fig.13- Curvas dose-resposta cumulativas para o CGRP (10 nmol) após
contracção prévia por 10 nmol/l de SUM e pré-tratamento com 10 nmol de
L668,169 , L-733,060 ou de ambos (antagonistas selectivos dos receptores NK1);
após tratamento prévio com L659,877 , GR159,897 ou ambos ( antagonistas
selectivos dos receptores NK2, na dose de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista dos
receptores do CGRP- na dose de 10 nmol). Os dados referem-se a médias ± erro
padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao
controlo <0,05.……………………………...............................................................119
Fig.14- Curvas dose-resposta para a NKA (10 nmol), um agonista dos receptores
NK2, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L733,060 (ambos antagonistas
selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de
receptores para o CGRP- na dose de 10 nmol) e de L659,877 e GR159897 (ambos
antagonistas selectivos dos receptores NK2). Os dados referem-se a médias ± erro
padrão; n≥6 ; * valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao
controlo <0,05……………………………………………………………….................120
Fig.15- Curvas dose-resposta cumulativas para a NKB e Senquetide (10 nmol),
agonistas dos receptores NK3. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ;
*valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo
<0,05.………………………………………………….................................................121
Fig.16- Curvas dose-resposta para a CAPS (10 nmol), antes e após pré-injecção
de L668,169 e de L733,060 (ambos os antagonistas selectivos dos receptores NK1,
na dose de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP, na
dose de 10 nmol), de L659,877 e de GR159897 (antagonistas dos receptores NK2)
e combinações dos antagonistas das taquicininas isolados ou associados ao
CGRP8-37. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n ≥ 6 ; *valor de p entre
cada
conjunto
de
experiências
e
relativamente
ao
controlo
<0,05……………………........................................................................................122
Fig.17- Curvas dose-resposta para todas as taquiquininas, CGRP e a CAPS (10
nmol), em coelhos diabetizados pela aloxana. Os dados referem-se a médias ± erro
padrão; n≥6………………………………………………………………………............124
Fig.18- Exemplo de imagem obtida por CDI na análise de fluxos da artéria central
da retina………………………………………………………………………….............132
Quadro I- Relação entre o peso e os valores de glicémia………………………84
Quadro II- Sustância P (SP), Neurocinina A (NKA), Péptido relacionado com o
gene da Calcitonina (CGRP) e Capsaicina (CAPS) antes e após administração
intraocular de antagonista (1 nmol/l). Valores expressos em média ± erro padrão
(n=7-x). *p <0,05……………………………………………………………..…123
Quadro III– Determinação do diâmetro arteriolar para os diferentes fármacos
estudados quando aplicados intraocularmente. Verificou-se uma constrição, e
diminuição do diâmetro do vaso com a aminoguanidina (inibidor da iNOS), o LNAME (inibidor da nNOS) e o L-NNA ( inibidor da eNOS ). A administração
isolada de SNAP ou de L-arginina induziu vasodilatação com aumento do diâmetro
arteríolar. Este estudo ocorreu em simultâneo com a determinação da TIO pelo que
as concentrações utilizadas são as referidas para esse estudo.* p < 0,05 (teste t de
Student) em relação ao controlo (BSS)……………………………………..…..125
Quadro IV– Determinação do diâmetro arteriolar após administração sucessiva de
dois fármacos por via intraocular.* p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao
controlo (BSS+L-arginina)# ; p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo
(BSS+SNAP)…………………………………………………………………....127
Quadro V- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após
administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO………....128
Quadro VI- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após
administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO em coelhos
com glaucoma induzido………………………………………………………....128
Quadro VII- Quadro comparativo da variação percentual da TIO em função do
tempo (minutos), após administração intraocular de 100 nmoles de cada
modificador do NO e da sua associação com L-Arginina………………………129
Quadro VIII- Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após
administração sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema neuropeptidérgico,
por via intravítrea, em coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação
ao controlo………………………………………………………………………130
Quadro XIX– Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após
administração sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema serotoninérgico por
via intravítrea, em coelhos normais.
*
p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao
controlo………………………………………………………………………….131