UNIVERSIDADE TIRADENTES – UNIT
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS - PEP
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE
DE KEFIR
Autor: Jackeline Andrade Gama
Orientadores: Dr. Álvaro Silva Lima
Dra. Cleide Mara Faria Soares
ARACAJU, SE - BRASIL
JUNHO DE 2011
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR
Jackeline Andrade Gama
DISSERTAÇÃO
SUBMETIDA
AO
PROGRAMA
DE
PÓS-GRADUAÇÃO
EM
ENGENHARIA DE PROCESSOS DA UNIVERSIDADE TIRADENTES COMO PARTE
DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
ENGENHARIA DE PROCESSOS
Aprovado por:
______________________________________________________
Prof. Dr. Álvaro Silva Lima
Universidade Tiradentes
______________________________________________________
Profa. Dra. Cleide Mara Faria Soares
Universidade Tiradentes
______________________________________________________
Profa. Dra. Luciana Cristina Lima de Aquino
Universidade Federal de Sergipe
______________________________________________________
Prof. Dr. Daniel Pereira da Silva
Universidade Tiradentes
ARACAJU, SE - BRASIL
JUNHO DE 2011
UNIVERSIDADE TIRADENTES – UNIT
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS - PEP
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BA
DE KEFIR
Autor: Jackeline Andrade Gama
Orientadores: Dr. Álvaro Silva Lima
Dra. Cleide Mara Faria Soares
ARACAJU, SE - BRASIL
JUNHO DE 2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Ninguém pode ser escravo de sua identidade:
quando surge uma possibilidade de mudança é
preciso mudar.
Elliot Gould
vi
Agradecimentos
Aos professores Álvaro Silva Lima e Cleide Mara Faria Soares, por ter propiciado todas as
condições para realização deste projeto e pela competente orientação no seu desenvolvimento.
A todos os funcionários e professores do ITP que, de um modo ou de outro, são parte deste
trabalho em especial Rone, Alisson e Arthur por todo o apoio.
Aos colegas conquistados durante esses dois anos de conhecimento.
Aos meus pais, Paulo e Nide, e minhas irmãs Ju e Keylla e meu irmão Thiago, pelo incentivo,
pela confiança e pelo entusiasmo de sempre.
Ao meu noivo Alexandre, por todo incentivo e companheirismo.
A DEUS, razão de nossa existência e força essencial para a caminhada da vida, sem nada
seria possível.
A Universidade Tiradentes e ao Órgão de fomento FINEP/SEBRAE, pelo apoio ao tema desta
dissertação.
vii
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia de
Processos da Universidade Tiradentes como parte dos requisitos necessários para a obtenção
do grau de Mestre em Engenharia de Processos.
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR
Jackeline Andrade Gama
Neste trabalho foram determinadas as condições de processo para obtenção de um
produto lácteo probiótico e funcional, utilizando como cultura “starter”, os grãos de kefir.
Aplicou-se a metodologia de planejamento de experimentos para otimizar o processo. Foram
realizados dois planejamentos fatoriais completos 2³ com três pontos centrais. No primeiro
delineamento experimental a variável resposta foi a viscosidade utilizando os seguintes
parâmetros: influência da concentração do leite em pó (X1), da temperatura (X2) e da
concentração dos grãos de kefir (X3) no processo de fermentação de leite de vaca utilizando
grãos de kefir. No segundo planejamento experimental foram mantidas as variáveis
independentes em condições experimentais similares; e foram expandidas as variáveis
dependentes (viscosidade, células lácticas viáveis, pH e acidez). Após a seleção da melhor
região do processo foi realizada a análise sensorial para os atributos aparência, aroma, sabor,
textura e impressão global, bem como a intenção de compra do produto desenvolvido. A
melhor condição de processo obtida para a produção de um produto com alta viscosidade e
com alto potencial probiótico foi: 12,5% de leite em pó, 10% de grãos de kefir a 45°C,
obtendo uma viscosidade de 2.840 cP, pH 3,53 e 1,83x109 UFC/mL de bactérias láticas em 24
h de fermentação.
Palavras-Chave: Kefir; produto lácteo fermentado; leite; planejamento de experimento.
viii
Abstract of Dissertation presented to the Process Engineering Graduate Program of
Universidade Tiradentes as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master
of Science (M.Sc.)
DAIRY PRODUCT DEVELOPMENT BASED PROBIOTIC KEFIR GRAINS
This work were determined the process conditions for obtainment of the probiotic milk
product and functional, using as starter culture, kefir grains. The tool used to select the best
region of the process was the methodology of experimental design. Two factorial design with
three full 2³ central points were performed. In the first experiment the response variable was
the viscosity using the following parameters: the influence of the concentration of milk
powder (X1), temperature (X2) and the concentration of kefir grains (X3) in the process of
fermentation of cow milk using kefir grains. In the second experimental design were
maintained the independent variables in similar or others conditions, and expanded to the
dependent variable, such as: viscosity, lactic viable cells, monitoring the pH value and acidity
of the medium in the different experiments. After to select the best region of the process was
sensory evaluation was conducted with intent of the purchase and acceptance of the following
parameters: appearance, aroma, flavor, texture, the best process condition obtained for the
production of a product with high viscosity and high potential probiotic was: 12.5% milk
powder, 10% kefir grains at temperature of 45 ° C, obtained has viscosity of 2840 cP, pH 3.53
and 1.83 x109 CFU / mL of lactic acid bacteria in 24 h fermentation.
Keywords: Kefir, fermented milk product, milk, experimental design.
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................ ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
2.1 EMULSÃO ................................................................................................ ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
2.1.1 Tipos de emulsões .................................................................................. Erro! Indicador não definido.
2.1.2 Mecanismos envolvidos na estabilização das emulsões ......................... Erro! Indicador não definido.
Repulsão Eletrostática ................................................................................................Erro! Indicador não definido.
Estabilização Estérica .................................................................................................Erro! Indicador não definido.
Efeito de Gibbs-Marangoni .........................................................................................Erro! Indicador não definido.
3. MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS .............................................................. 14
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................... 8
4.1 ANÁLISES E ENSAIOS EXPERIMENTAIS ..................................................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
4.1.1 Caracterização do petróleo e água produzida ....................................... Erro! Indicador não definido.
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS .................................................................................. 33
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 35
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 - Fotografia eletrônica de bifidobactérias..............................................................20
Figura 3.2 - Aspecto dos grãos de Kefir..................................................................................22
Figuras 3.3 - Fluxograma geral da fabricação de produtos lácteos..........................................24
Figura 3.4 - Molécula do kefiran.............................................................................................29
Figura 3.5 - Fluxograma do processo tradicional de fabricação de kefir.................................34
Figura 3.6 - Fluxograma do processo industrial de fabricação de kefir...................................35
Figura 3.7 - Produtos a base de grãos de kefir comercializados por uma única empresa, a
DMJ...........................................................................................................................................41
Figura 4.1 - Ficha de avaliação pelo método da aceitação......................................................46
Figura 5.1 - Perfil de viscosidade nas diferentes velocidades angulares testadas...................51
Figura 5.2 - Diagrama de Pareto no tempo de 6 h para a viscosidade.....................................54
Figura 5.3 - Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para ensaios contendo
10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes
concentrações de leite em pó....................................................................................................59
Figura 5.4 - Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para ensaios contendo
10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes
concentrações de leite em pó....................................................................................................59
Figura 5.5 - Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para as condições do
ponto central contendo 7,5% de grãos de kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite
em pó de 6,25%.........................................................................................................................60
Figura 5.6 - Diagrama de Pareto no tempo de 24 h para o crescimento de bactérias láticas...63
Figura 5.7 - Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura
de 25ºC (Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó..................66
Figura 5.8 - Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura
de 25ºC (Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó..................66
Figura 5.9 - Perfil da viscosidade para as condições do ponto central contendo 7,5% de grãos
de kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite em pó de 6,25%...................................67
Figura 5.10 - Perfil de pH para ensaios contendo 5% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC
(Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó...............................68
Figura 5.11 - Perfil de pH para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC
(Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó...............................69
xi
Figura 5.12 - Perfil de pH para as condições do ponto central contendo 7,5% de grãos de
kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite em pó de 6,25%........................................69
Figura 5.13 - Percentual de intenção de compra para os fermentados formulados e o
comercial. A – eu certamente compraria, B – eu provavelmente compraria, C – não sei se
compraria, D – provavelmente não compraria e E – certamente não compraria......................75
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 - Composição do leite bovino.................................................................................17
Tabela 3.2 - Características fisiológicas e bioquímicas das bifidobactérias e dos
lactobacillus..............................................................................................................................21
Tabela 3.3 - Principais grupos e espécies de microorganismos presentes nos grãos de kefir..23
Tabela 3.4 - Características do iogurte e do Kefir...................................................................28
Tabela 3.5 - Composição do Kefir...........................................................................................31
Tabela 3.6 - Diversos modos de obtenção de produtos lácteos................................................37
Tabela 4.1 - Condições para o planejamento de experimento prévio......................................43
Tabela 4.2 - Condições para a segunda matriz de planejamento.............................................44
Tabela 5.1 - Composição centesimal do leite fornecido pela empresa e alguns disponíveis no
mercado.....................................................................................................................................48
Tabela 5.2 - Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados no tempo de 6h...........................................................50
Tabela 5.3 - Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir sobre
a viscosidade....................................................................................................................52
Tabela 5.4 - Análise de variância para a viscosidade do iogurte obtida pelo processo
fermentativo..............................................................................................................................53
Tabela 5.5 - Composição centesimal do fermentado do ensaio 6............................................54
Tabela 5.6 Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros concentração de leite em pó, temperatura e concentração de grãos de kefir em
fermentação de 24h e variáveis respostas concentração de células viáveis e viscosidade........56
Tabela 5.7 - Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados em diferentes tempos, cuja variável resposta são células
viáveis........................................................................................................................................57
Tabela 5.8 - Valores para a cinética de crescimento de células láticas no processo de
fermentação utilizando grãos de kefir.......................................................................................60
Tabela 5.9 - Efeitos calculados para avaliação do perfil de crescimento das bactérias
láticas........................................................................................................................................61
Tabela 5.10 - Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados para a viscosidade no tempo 24 horas..................64
xiii
Tabela 5.11 - Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir
sobre a viscosidade....................................................................................................................64
Tabela 5.12 - Análise de Variância para ajuste do modelo proposto que representa a
viscosidade................................................................................................................................65
Tabela 5.13 - Perfil de pH para o desenvolvimento de um produto para os tratamentos
analisados em diferentes tempos...............................................................................................68
Tabela 5.14 - Comparação da composição centesimal da bebida kefir formulada (12,5% de
leite em pó, 10% grãos de kefir e 45°C) com a literatura.........................................................71
Tabela 5.15 - Teores de colesterol do leite e da bebida láctea.................................................71
Tabela 5.16 - Composição mineral dos produtos láteos produzidos........................................72
Tabela 5.17 - Composição mineral dos produtos láteos encontrados na literatura..................73
Tabela 5.18 - Notas sensoriais de aceitação para a bebida kefir e o iogurte comercial...........74
xiv
Capítulo 1
1. INTRODUÇÃO
Há uma nova tendência das indústrias de alimentos em produzirem iogurte e leites
fermentados funcionais. A aceitação destes produtos pela população é motivada pelo
excelente valor nutritivo, o que provoca um crescimento potencial, dos produtos probióticos.
A indústria de laticínios está empenhada em aumentar a sua competitividade no segmento de
produtos funcionais, pois necessita se adaptar as tendências de mudanças em um mercado
consumidor exigente, que se modifica rapidamente, além de ter que manter a liderança
tecnológica nas indústrias (THAMER; PENNA, 2005).
De acordo com a Associação Brasileira das Indústrias de Alimentos (ABIA, 2009), o
mercado mundial de alimentos funcionais movimentou, em 2005, em torno de US$ 60
bilhões, tendo como principais mercados a Europa, Japão e Estados Unidos. Estima-se que só
nos Estados Unidos a movimentação financeira foi de US$ 15 bilhões. No Brasil, em 2005, o
mercado de funcionais foi avaliado em US$ 600 milhões. Os produtos light e diet, disponíveis
no mercado desde o início de 1990, atingiram vendas anuais ao redor de US$ 4 bilhões, em
2005. Deste montante, o mercado de produtos funcionais representou 14% e na indústria de
alimentos 0,8%. Deste modo, juntos esses produtos (diet, light e funcionais) somam 6,3% do
volume de vendas da indústria brasileira de alimentação.
Essa explosão de interesse dos consumidores em consumir alimentos ou componentes
alimentares fisiologicamente ativos, também denominados alimentos funcionais, é justificada
pela necessidade de melhoria da saúde. No tocante aos produtos lácteos funcionais, o Estado
de Sergipe apresenta apenas uma pequena parcela destes produtos diferenciados, apesar de
uma significativa bacia leiteira, com uma produção anual de aproximadamente de 252 mil
litros de leite em 2007 (IBGE, 2009). Há atualmente 22 laticínios instalados na região, sendo
realizados diversos projetos de investimentos em desenvolvimento de tecnologias em
processos produtivos de derivados de leite.
Alimentos funcionais, são aqueles produtos alimentícios ou ingredientes que, além das
funções nutricionais básicas, quando consumidos como parte da dieta, produzem efeitos
metabólicos, fisiológicos e/ou benéficos à saúde. Estes alimentos devem ser seguros para o
consumo sem que haja a necessidade de supervisão médica. E sua eficácia e segurança devem
10
ser asseguradas por estudos científicos. Já os alimentos probióticos são alimentos que contém
microorganismos vivos que beneficiam o organismo, melhorando a microflora intestinal. Os
probióticos têm sido usados por algum tempo e estão disponíveis em alguns produtos
alimentares, como leites fermentados e alguns tipos de iogurtes (ANTUNES, 2007; GOMES e
MALCATA, 1999).
Os principais microorganismos utilizados para a produção de produtos lácteos
probióticos são: Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium spp., Lac. casei subespécie casei
biovar shirota, Lac. GG straim e os grãos de Kefir que é um consórcio microbiano de
bactérias láticas acéticas e leveduras (ZACARCHENCO e MASSAGUER-ROIG, 2006).
Esses micro-oganismos utilizados para a elaboração de probióticos utilizam em sua
maioria como substrato os constituintes do leite (vaca, cabra, búfala, soja, etc.), podendo ser
utilizado alguns tipos de aditivos como espessante (leite em pó, amido, goma xantana),
aromatizantes, saborizantes, corante. Na padronização do leite para produção dos produtos
lácteos são normalmente adicionados os seguintes espessantes para aumentar o teor de sólidos
totais no leite: leite em pó: leite concentrado, proteínas lácteas, amidos ou amidos
modificados. O uso destes espessantes é regulamentado pelo Ministério da Agricultura no
Regulamento Técnico de Padrão Identidade e Qualidade para Leites Fermentados.
Neste contexto, a fermentação é o processo no qual os micro-organismos são inseridos
em biorreatores em batelada para obtenção do produto lácteo (iogurte, bebida láctea, kefir,
queijo).
De acordo com a literatura, o alimento denominado probióticos para diferentes
derivados do leite deve conter no mínimo 107 células viáveis/ grama ou por mL. A dose
terapêutica mínima diária recomendada é de 105 células viáveis/ grama ou mL (HAULY et
al., 2005).
Atualmente, dentre as bebidas lácteas comercializadas mundialmente o consórcio
microbiano kefir é bastante utilizada nos países da Europa Oriental e Ocidental. A bebida
láctea nestes países é comercializada como o mesmo nome que o consócio microbiano, kefir.
Portnto, kefir é também definido como o produto resultante da fermentação do leite por grãos
de kefir (ORDONEZ, 2005). Contudo, no Brasil e nos demais países da América Latina ainda
não são comercializados em grande escala a bebida láctea “kefir”. Apesar da potencialidade
de mercado deste produto, possivelmente devido às condições climáticas a padronização do
processo ainda não foi realizada para atender as boas práticas de fabricação na indústria. Por
11
fim, a proposta deste trabalho foi à avaliação das condições do processo fermentativo para a
produção de kefir.
12
Capítulo 2
2 OJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento do processo fermentativo
para a obtenção de um produto lácteo probiótico utilizando grãos de kefir.
2.2. Objetivos Específicos
Os objetivos específicos foram:
(i)
Caracterizar o leite a ser utilizado como matéria prima;
(ii)
Otimizar as condições de fermentação para a produção da bebida láctea utilizando
grãos de kefir;
(iii)
Caracterizar físico-químicamente o leite a bebida láctea obtida no processo
fermentativo, e;
(iv)
Realizar a análise sensorial das bebidas lácteas obtidas na região otimizada no
processo fermentativo.
13
Capítulo 3
3. REVISÃO BIBLIOGRAFICA
Nesta revisão bibliográfica será abordado os diferentes temas relacionados ao
desenvolvimento de produtos lácteos obtidos a partir do processo fermentativo utilizando
kefir.
3.1.
Leite
O leite é um dos mais completos alimentos, contém uma grande variedade de nutrientes
essenciais ao crescimento, desenvolvimento e manutenção de uma vida saudável. Rico em
proteínas, energia e minerais, como mostra a Tabela 3.1 para leite bovino.
A composição do leite pode variar de acordo com os seguintes fatores: raça, período de
lactação, alimentação, saúde, período de cio, idade, características individuais, clima, espaço
entre as ordenhas e estação do ano. O leite deve ter o aspecto liquido, homogêneo, formando
uma camada de gordura na superfície quando deixado em repouso. Não pode conter
substâncias estranhas, devendo este sempre limpo (VERRUMA e SALGADO, 1994).
Componentes
Tabela 3.1: Composição do leite bovino
Composição1
Composição2
Composição3
Água (%)
87,0
87,5
88
Gordura (%)
3,5 – 5,5
3,6
3,7
Proteínas (%)
3,1 – 3,9
3,6
3,7
Lactose (%)
4,9 – 5,0
4,6
4,7
Sais Minerais (%)
0,7
0,7
0,7
Fonte:1ORDONEZ, 2005; 2FIRJAN, 2008; 3VERRUMA e SALGADO, 1994.
O leite fresco possui um sabor levemente adocicado e agradável, devido essencialmente
a alta quantidade de lactose. Além disso, os outros elementos do leite, inclusive as proteínas
que são insípidas, participam de alguma forma, direta ou indireta, na sensação de sabor. Pode
ocorrer mudança no sabor do leite devido a várias causas, no qual estas estão relacionadas
fundamentalmente ao manejo dos animais e como o leite é processado, pois mesmo depois da
pasteurização e embalagem, o leite ainda pode absorver sabores indesejáveis. O teor de
14
gordura também influencia no sabor do leite, pois, normalmente, quanto maior o teor de
gordura mais saboroso o leite será (VENTURINI et al., 2005).
O leite possui odor suave, levemente ácido, e lembra mais ou menos o animal que o
produziu e ele recém-ordenhado tem um odor relacionado ao ambiente de ordenha, que
desaparecem logo depois. Os principais elementos que influenciam o odor do leite são
provenientes de alimentos, meio ambiente, utensílios que entram em contato com o leite e
microrganismos (FIRJAN, 2008).
Odores desagradáveis do leite podem ser eliminados durante a pasteurização, quando o
produto passar por um equipamento denominado aerador. Neste equipamento o leite
levemente aquecido é turbilhonado de tal forma que as substâncias voláteis que conferem
odor desagradável sejam evaporadas. A cor característica do leite (branco-amarelada opaca) é
devido, principalmente, à dispersão da luz pelas micelas de caseína, sendo que glóbulos de
gordura dispersam a luz, mas pouco contribui para a cor branca do leite. A cor amarelada do
leite e devido a substancias lipossolúveis (caroteno e a riboflavina) (ORDONEZ, 2005).
Os produtos lácteos são produtos oriundos do leite como iogurte, leite fermentado,
queijo, manteiga entre outros.
3.2.
Micro-organismos Utilizados na Fabricação de Produtos Lácteos Probióticos
As bactérias são os principais microrganismos utilizados para a fabricação de produtos
lácteos dentre elas as Bifidobactérias, os Lactobacillus e os Streptococcus. Destre estas as
Bifidobactérias e os Lactobacillus são as mais utilizadas na elaboração de produtos
probióticos. Algumas leveduras também são encontradas nos produtos lácteos como é o caso
dos grãos de kefir (FERREIRA, 2001).
Além dos benefícios nutricionais, as culturas probióticas podem também contribuir
para o melhoramento do sabor do produto final, por promover acidificação reduzida durante o
tempo de prateleira (GOMES e MALCATA, 1999).
3.2.1. Bifidobactérias
As bifidobactérias são em geral, caracterizadas por serem microrganismos Grampositivos,
não
formadores
de
esporos,
desprovidos
de
flagelos
e
anaeróbios.
Moforlogicamente podem ter várias formas que incluem bacilos curtos e curvados, bacilos
com a forma de cacete e bacilos bifurcados. Das 30 espécies conhecidas do gênero
Bifidobacterium, uma é utilizada para obtenção de leite fermentado e apresenta uma boa
15
tolerância ao oxigênio, ao contrário da maior parte das outras do mesmo gênero. A Figura 3.1
mostra uma imagem das bifidobactérias (FERREIRA, 2001).
Possuem um conteúdo elevado de guanina e citosina que varia, em termos molares, de
54 a 67%. São heterofermentativos, ou seja, produzem ácidos acético e lático na proporção
molar de 3:2 a partir de 2 moles de hexose, sem produção de CO2, exceto durante a
degradação do gluconato. A enzima chave desta via metabólica fermentativa é a frutose- 6fosfato fosfocetolase, a qual pode por isso ser usada como marcador taxonômico na
identificação do gênero, mas que não permite a diferenciação entre as espécies (GOMES e
MALCATA, 1999). Utilizam como fonte de carbono (substrato): glicose, galactose, lactose e
frutose.
A temperatura de crescimento ótimo dessas bactérias se dá entre os 37 e 41 ºC,
ocorrendo máximos e mínimos de crescimento a 43-45 ºC e 25-28 ºC, respectivamente. Em
relação ao valor do pH, o ponto ótimo é verificado entre 6 e 7, com ausência de crescimento a
valores de pH ácidos (4,5-5,0) ou pH alcalinos (8,0-8,5) (GOMES & MALCATA, 1999).
Figura 3.1: Fotografia eletrônica de bifidobactérias.
Fonte: http://jarb3mjc.sites.uol.com.br/ds1723dez_07.htm
3.2.2. Lactobacillus
Os lactobacilos são geralmente caracterizados como gram-positivos incapazes de formar
esporos, desprovidos de flagelos, possuindo forma bacilar ou cocobacilar, e anaeróbios como
mostra a Tabela 3.2. O gênero compreende, em torno de 56 espécies oficialmente
reconhecidas, as mais utilizadas para fins de aditivo dietético são L. acidophilus, L.
rhamnosus e L. casei. O L. acidophilus, o que mais se destaca, é um bacilo gram-positivo com
pontas arredondadas, que se encontra na forma de células livres, aos pares ou em cadeias
curtas, com tamanho típico de 0,6-0,9 µm de largura e 1,5-6,0 µm de comprimento. Tem
como particularidades ser pouco tolerante à salinidade do meio, e ser microaerofílico, com o
16
crescimento em meios sólidos favorecido por anaerobiose ou pressão reduzida de oxigênio
(GOMES e MALCATA, 1999).
As condições ótimas para a sua multiplicação são temperaturas de 35-40 ºC e valores de
pH de 5,5-6,0. O crescimento de L. acidophilu pode ocorrer a 45 ºC, e a sua tolerância em
termos de acidez do meio varia entre 0,3 e 1,9 %(v/v) de acidez titulável (GOMES e
MALCATA, 1999).
Tabela 3.2: Características fisiológicas e bioquímicas das Bifidobactérias e dos
lactobacillus.
Características
Bifidobacterium spp.
Fisiologia
Anaeróbio
Composição da parede
Aminoácido básico tetrapeptídeo
celular
variável, ou omitina ou lisina, vários
Lac. acidophilus
Microaerofílico
Lys-D Asp
tipos de transpeptidação
Composição fosfolipídio
Poliglicerolfosfolipídio e seus liso-
Glicerol
derivados, alanilfosfatidilglicerol, liso –
derivados de difosfatidilglicerol
Composição base DNA
55-67
34-37
Configuração ácida lático
L
DeL
Metabolismo de açúcares
Heterofermentativo
Homofermentativo
(Mol % guanina + citosina)
Fonte: Adaptado de GOMES & MALCATA, 1999
3.2.3. Grãos de Kefir
Os grãos de Kefir assemelham-se a uma couve-flor, como mostra a Figura 3.2. É um
agrupamento gelatinoso polissacarídeo que tem vários micro-organismos em simbiose
(leveduras, bactérias ácido láticas, bactérias ácido acético e fungos), e sua complexidade ainda
não foi completamente decifrado pela ciência (PLESSAS, et al. 2004; GONCU e ALPKENT,
2005; PRASKEVOPOLOU et al. 2003; GARROTE et al. 1997).
17
Figura 3.2: Aspecto dos grãos de Kefir.
Fonte: Adaptado de: http://www.kefir.co.kr/eng/kefir-grain.php.
De acordo com GIACOMELLI (2004) os grãos vistos em microscópio revelam uma
estrutura complexa. A composição dos grãos de kefir é formada por: 4,4% de lipídios, 12,1%
de cinzas, 45,7% de mucopolissacarídeo, 34,3% de proteínas totais, vitaminas do complexo B,
vitamina K, triptofano, cálcio, fósforo e magnésio.
Os microrganismos presentes nos grãos de kefir variam de acordo com a sua origem,
características da região, processamento, tempo, temperatura e o leite utilizado
(FARNWORTH, 2005). Os principais grupos e espécies dos microrganismos encontrados nos
grãos de kefir, estão descritos na Tabela 3.3. Estes microrganismos produzem uma grande
diversidade de polissacarídeos e carboidratos, como mostra a Tabela 3.4 (SIMOVA, 2002).
3.3.
Produtos Lácteos
3.3.1. Leite Fermentado e Iogurte
Entende-se por leites fermentados os produtos resultantes da fermentação do leite
pasteurizado ou esterilizado, por fermentos lácticos próprios. Já o iogurte, a fermentação se
realiza com cultivos protosimbióticos de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, aos quais pede esta associado, de forma
complementar, outras bactérias ácido-lácticas que contribuem para a determinação das
características do produto final (AGRICULTURA, IN 46, 2007).
O leite acidófilo ou acidofilado é o leite fermentado cuja fermentação se realiza
exclusivamente com cultivos de Lactobacillus acidophilus (AGRICULTURA, IN 46, 2007).
Os leites fermentados são obtidos por coagulação e diminuição do valor do pH do leite,
ou do leite reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos. A coagulação ocorre
por fermentação láctica, mediante a ação de cultivo de microrganismos específicos. Estes
microrganismos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final, durante o prazo de
validade do produto.
18
Tabela 3.3: Microrganismos presentes nos grãos de kefir
Lactobacilos
Acetobacter
Leveduras
Streptococcos/Lactococcus
Lac. acidophilus
A. aceti
Kluyveromyces lactis
Lactococci lactis subsp.
Lactis
Lac. parakefir SP
A.rasens
K. marxianus
Lc. Lactis var. diacetylactis
Nov
Lac. lactis
-
K. bulgaricus
Lc lactis subsp Cremoris
Lac. casei subsp.
-
K. fragilis
Streptococci salivarius
Pseudoplantarum
Lac. paracasei
subsp. Thermo.
-
Candida kefir
S. lactis
Lac. cellobiosus
-
C. pseudotropicalis
Enterococcus cremoris
Lac. delbrueckii
-
C. rancens
Leuc. Mesenteroides
-
C. tenuis
-
Lac. fructivorans
-
Saccharomyces lactis
-
Lac. helveticus
-
S. carlsbergensis
-
-
S. subsp. Torulopsis
-
subsp. Paracasei
subsp. Bulgaricus
Lac. delbrueckii
subsp lactis.
subsp. Lactis
Lac. hilgardii
holmil
Lac. kefiri
-
S. cerevisiae
-
Lac.
-
-
-
-
-
-
Lac. brevis
-
-
-
Lac. casei subsp.
-
-
-
-
-
kefiranofaciens
Lac. kefirgranum
sp. Nov
Rhamnosus
Lac. plantarum
Fonte: SANTOS e FERREIRA, 2008
19
-
Tabela 3.4: Polissacarídeos produzidos pelos grãos de kefir
Lactobacillus
Polissacarídeo
Lac. bulgaricus
HP1 460.27d7.02
Lac. bulgaricus
HP2 147.23d6.85
Lac. bulgaricus
HP3 46.93d4.94
Lac. bulgaricus
HP4 195.37d3.97
Lac. helveticus
MP10 15.37d3.85
Lac. helveticus
MP11 19.23d3.34
Lac. helveticus
MP12 D
Lac. helveticus
MP13 10.40d1.55
Lac. brevis
B1 D
Lac. brevis
B2 D
Lac. brevis
B3 D
Lac. brevis
B4 D
Lac. thermophilus
T10 31.40d4.71
Lac. thermophilus
T11 15.77d2.93
Lac. thermophilus
T12 D
Lac. thermophilus
T13 27.80d3.38
Lac. Lactis
C11 D
Lac. Lactis
C12 D
Lac. Lactis
C13 D
Lac. Lactis
C14 D
Fonte: Adaptado de SIMOVA, 2002
Os leites fermentados envolvem as seguintes categorias de produtos: iogurte, leite
acidófilo, kefir, kumys, coalhada e leite fermentado ou cultivado (FERREIRA, 2001). A
Figura 3.3 mostra o fluxograma básico para obtenção dos produtos lácteos: iogurte leite
fermentado, leite acidófilo, kefir e kumys. Existem duas diferentes tecnologias para a
produção de iogurtes: Iogurte Tradicional ou Clássico (iogurte natural integral, fermentado na
embalagem), e; Iogurte Batido (fermentado em tanques). O iogurte tradicional tem uma
textura mais firme que o iogurte batido, pois no iogurte batido, há a quebra do gel, daí a
20
consistência menos firme e cremosa do iogurte batido. O iogurte batido é fermentado na
iogurteira em batelada (FERREIRA, 2001).
A seguir será descritas as etapas para elaboração de um produto lácteo:
Recepção de Matéria-Prima
Padronização
Pasteurização
Açúcar
Resfriamento
Adição do MO
Incubação
Agitação / Homogeinização
Adição do Aroma / Sabor
Resfriamento
Análises
Figura 3.3: Fluxograma geral da fabricação de produtos lácteos
Inicialmente, tem-se a matéria-prima utilizada, o leite, poderá ser em natureza ou
reconstituído, pasteurizado ou esterilizado, adicionado ou não de outros produtos de origem
láctea, bem como de outras substâncias alimentícias recomendadas pela tecnologia atual de
fabricação de leites fermentados, e que não interfiram no processo de fermentação do leite
pelos fermentos (cultura “starter”) empregados (AGRICULTURA IN 46, 2007; ORDONEZ,
2005). Usualmente, é utilizado o leite de vaca como matéria-prima, no entanto, torna-se cada
vez mais comum a utilização de leite de outras espécies (cabra, búfala, ovelha, soja, entre
outras), os quais deverão ser, também, passar pelo tratamento térmico de pasteurização
(FERREIRA, 2001).
21
Na etapa de padronização é realizada em relação ao teor de gordura e ao teor de
extrato seco total. Quanto ao teor de gordura, o leite é desnatado até atingir o teor de gordura
ideal para a fabricação do produto normalmente de 3,0%. Evaporação de 10-20% do volume
do leite provocando um aumento de 1,5-3% de extrato seco. Esta etapa é de extrema
importância, especialmente para iogurtes. Um aumento do extrato seco total resulta em um
produto mais firme, com menor tendência de separação de soro. Normalmente, utiliza-se leite
com extrato seco total de 12 - 15% (concentrado) e acidez inferior a 20°D (0,2% de ácido
láctico). A legislação vigente permite adicionar uma série de produtos considerados como
ingredientes opcionais (descritos acima) que podem servir para aumentar o extrato seco do
leite e melhorar a textura do iogurte (AGRICULTURA, IN 46, 2007)
A pasteurização, a etapa subseqüente, tem como objetivo evitar a competição por
bactérias não selecionadas com as bactérias do fermento e, eliminar os microrganismos
patogênicos como Salmonella e Campylobacter. O efeito redutor da pasteurização estimula o
desenvolvimento do fermento lácteo. Além disso, ele também influi no aumento da
viscosidade do iogurte e na obtenção de uma textura adequada. A desnaturação de 80-90%
das proteínas do soro (solúveis), obtidas com um binômio de 90 - 95°C por 3 - 5 min,
aumenta a firmeza do produto e o rendimento, além de prevenir a separação do soro.
Paralelamente, a pasteurização provoca uma redistribuição de íons cálcio, magnésio e fósforo
entre as formas solúvel e coloidal, que tende a reduzir o tempo de coagulação (FERREIRA,
2001).
É na agitação que ocorre a quebra do gel e a adição do aroma e sabor. Após, o produto
é resfriado a uma temperatura inferior a 7°C por 12 a 24 horas antes da comercialização onde
ele adquire sabor característico. Em seguida são realizadas análises por uma equipe de
controle de qualidade, onde avaliam o produto microbiologicamente e físico-quimicamente.
São realizados análises do teor de gordura, pH, acidez, coliformes, fungos e leveduras,
contagem de bactérias láticas (ANTUNES, 2007).
3.4.
Kefir
A palavra kefir é originada do idioma turco e significa "indolência", estando associada
a "sensação boa" ou "prazer". É também conhecida por vários nomes, dependendo da região,
tais como quépi, Kippe, kéfir, khaphin, kiaphir, keffir, e kefyr (FERREIRA, 2001).
22
De acordo com a Legislação vigente para o Padrão de Identidade Qualidade de Leites
Fermentados do Ministério da Agricultura, kefir é o produto resultante da fermentação do
leite pasteurizado ou esterilizado por cultivos acidolácticos elaborados com grãos de kefir,
Lactobacillus kefir, espécies dos gêneros Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com
produção de ácido lático, etanol e dióxido de carbono (BRITO, 2009). Já a FAO/OMS (2009)
define a bebida kefir baseada na composição microbiana dos grãos de kefir (cultura iniciadora
ou starter utilizada para produzir kefir): cultura starter preparada de grãos de Kefir,
Lactobacillus kefiri e espécies do gênero Leuconostoc, Lacococcus e Acetobacter crescendo
em um forte relacionamento específico. Os grãos de kefir constitui de ambas leveduras, as que
fermentam a lactose (Kluyveromyces marxianus) e as que não fermentam ( Saccharomyces
unisporus, Saccharomyces cerevisiae e Sacharomyces exiguus).
Com uma consistência cremosa espessa uniforme, a bebida gerada pela fermentação
do leite pelos microrganismos associados aos grãos de kefir, possui um leve gosto ácido que
refresca e um aroma moderado de levedura fresca, que se assemelha à bebidas alcoólicas
muito “leve”. Associado à efervescência do gás produzido (CO2), é um produto lácteo sem
igual e que possui cerca de 40 combinações aromáticas, podendo ser consumido fresco ou
refrigerado (ORDONEZ, 2004).
As características sensoriais do kefir diferem daquelas apresentadas pelos iogurte, com
relação a presença de uma pequena quantidade de CO2, álcool e os benefícios do
polissacarídeo (kefiran) (OTLES e CAGINDI, 2003).
Os números estatísticos da produção e consumo de kefir não são facilmente
disponíveis, desde produtos lácteos fermentados, como também não são nem sempre
discriminadas em separados por itens como iogurte e kefir (FARNWORTH, 2005).
Tanto o kefir quanto o iogurte são produtos lácteos, cultivados de vários tipos de
bactérias benéficas. O iogurte contém bactérias benéficas transitórias que mantêm o sistema
digestivo limpo, porém o kefir pode colonizar o trato intestinal. O kefir contém diversas
bactérias não comumente encontradas nos iogurtes: Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus,
Acetobacter e Streptococcus e contém também leveduras igualmente benéficas, como
Saccharomyces, Kluyveromyces Torula. O kefir controla e elimina microrganismos
patogênicos destrutivos no corpo (FARNWORTH, 2005; OTLES e CAGINDI, 2003;
GARROTE et al. 1997).
23
A vantagem mais notável do kefir em relação ao iogurte é a presença do polissacarídeo
chamado kefiran que possuem propriedades antiinflamatório e anti-tumoral (GIACOMELLI,
2004; OTES & CAGINDI, 2003; ORDONEZ, 2005). . A Tabela 3.5 faz um comparativo
entre o Iogurte e o kefir.
Tabela 3.5: Características do Iogurte e do Kefir
Característica
Kefir
Iogurte
Microrganismos
Temperatura ótima (oC)
Tempo de fermentação (h)
Produto
Grãos de kefir
25
20 - 24
Leite fermentado ácido-álcool,
CO2, kefiran
Cáucaso
Bactérias ácido láticas
37 – 42
~5
Leite fermentado ácido
Origem
Bulgária
O Kefiran é composto de duas moléculas de monossacarídeos, D-glicose e Dgalactose, em proporções iguais. A Figura 2.4 mostra a molécula do kefiran. Kefiran tem
demonstrado ter certas qualidades medicinais, sendo útil como alimento funcional para evitar
ou controlar algumas doenças comuns do trato intestinal que ocorrem (DMJ Biotech Corp,
2009).
Figura 3.4: Molécula do kefiran.
Fonte: http://www.kefir.co.kr/eng/kefiran.php.
Os grãos de kefir possui uma dinâmica e complexa microbiota que não foi
inicialmente propícia para a produção comercial de um produto uniforme e padronizado, o
que levou grupos de pesquisadores, tentar produzir kefir de uma mistura de culturas puras
combinada com uma cultura de iogurte de bactérias ácido lácticas e Saccharomyces cerevisiae
(um fermento não-lactose) para produzir um leite fermentado com características de kefir (que
produzem CO2 e etanol) sob uma variedade de condições (FARNWORTH, 2005).
24
FARNWORTH, (2005) citou também que cientistas produziram uma cultura
multistarter com quatro bactérias e duas leveduras isoladas dos grãos de kefir, com o intuito
de fabricar a bebida em um processo contínuo. Uma cultura starter foi formada por duas
bactérias (Lactobacillus helveticus e Lactococcus lactis subsp. lactis,) e uma levedura (S.
cerevisiae) também isoladas dos grãos de kefir e combinado com duas cepas de iogurte
(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus e Streptococcus thermophilus) também foi
produzida. A levedura foi acrescentada ao composto da cultura starter com sacarose, quer no
início, ou após a fermentação ácido láctica. Ambos os kefirs produzidos, foram encontrados
com um elevado número de cocos e lactobacilos viáveis e tinham propriedades químicas e
organolépticas semelhantes ao do kefir tradicional.
Um kefir comercial também está sendo produzido nos Estados Unidos, utilizando uma
mistura de microrganismos definidos em vez de grãos de kefir . Esta mistura da cultura
starter, contém: Streptococcus lactis, L. plantarum, Streptococcus cremoris, L. casei,
Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris e Saccharomyces florentinus (HERTZLER
e CLANCY , 2003).
Fermentos em pó contendo bactérias lácticas e leveduras congeladas de grãos de kefir
estão disponíveis comercialmente; alguns são complementadas com outros microrganismos
para transmitir as características desejáveis do Kefir no produto (FARNWORTH, 2005). É
evidente que o produto final, como são produzidos a partir de grãos de kefir, terão um maior
número e variedades de microrganismos que a bebida produzida a partir de uma mistura de
um pequeno número de culturas puras.
O sabor típico do kefir resulta da presença de vários compostos que são produzidos
durante a fermentação (BESHKOVA et al. 2003). Kefir produzido a partir de culturas puras
não foi bem aceito no Canadá, através de uma análise sensorial exceto as bebidas que
possuiam edulcorantes, cerca de 40% das pessoas que degustaram kefir pela primeira vez deulhe uma classificação positiva com relação ao sabor. A adição do sabor, ou modificação do
processo de fermentação (por exemplo, além de lactococci, lactobacilos e leveduras)
aumentou a aceitabilidade de kefir, em comparação com o Kefir feito tradicionalmente.
Compostos como o acetaldeído e acetoína têm recebido uma atenção especial a respeito do
seu papel durante a fabricação de kefir devido à contribuição para as características
organolépticas, pricipalmente o sabor (GIACOMELLI, 2004; FERREIRA, 2001).
25
Tanto o sabor, a viscosidade, a composição microbiológica e físico-químca do kefir
podem ser influenciados pela origem e tamanho do inóculo adicionado ao leite, pela agitação,
temperatura de processo e a duração do arrefecimento e amadurecimento das fases que
suscede a fermentação. (OTLES e CAGINDI, 2003; GARROTE, 1997; ATHANASIADIS, et
al. 2004).
O kefir é rico em ácido lático, acético e glicônico, álcool etílico, gás carbônico,
vitamina B12 e polissacarídeos. O ácido lático é o princupal metabólito produzido durante a
fermentação do kefir, esse processo é capaz de converter de 20 a 50% da lactose em ácido
lático, tornando o kefir uma bebida que pode ser consumida por pessoas com tolerancia a
lactose A Tabela 3.6 demostra a composição do Kefir (GIACOMELLI, 2004).
O ácido lático é considerado um conservante natural, o que torna o kefir um produto
biologicamente seguro (GIACOMELLI, 2004).
Tabela 3.6: Composição do Kefir
Costituinte
Água
Acidez em graus Dornic (°D)
Proteínas totais (%)
Sacarose (%)
Gordura (%)
Matérias albuminóides (%)
pH
Acidez Volátil (mL de NaOH
Caseína (%)
Albumina (%)
Lactose (%)
Peptonas (%)
Ácido Lático (%)
Álcool (%)
Gás Carbônico (%. v/v)
Minerais (%)
Diacetil (mg/L)
Acetoaldeído (mg/L)
Fonte: GIACOMELLI, 2004
Valores médios
87
80 (no final da incubação)
3,4 - 4,2
Mínimo de 4,4
0,5 – 3,0
3,1
4,2 – 4,5
3,9
2,8
0,2
2,6 – 3,75
0,06
0,7
0,23 – 1
20 – 25
0,74 – 0,8
0,49
1,30
Os benefícios do consumo de kefir são inúmeros, mas os principais são descritos
abaixo (OTLES e CAGIDI, 2003; PARASKEVOPOULOU et al., 2003; SAAD et al., 2006):

incrementa o valor biológico das proteínas do leite - as proteínas do
kefir são parcialmente digeridas e, assim, mais facilmente utilizadas pelo organismo.
26
O triptofano, um dos aminoácidos essenciais abundantes no kefir, é conhecido pelo
seu efeito relaxante do sistema nervoso;

sintetiza ácido láctico, o que diminui a intolerância a lactose e favorece
a digestibilidade do leite mesmo para pessoas que sejam sensíveis ao leite de vaca;

sintetiza vitaminas do complexo B;

aumenta a resistência à infecções;

ativa o sistema imunológico - e já foi usado, com sucesso, para ajudar
pessoas que sofrem de aids, síndrome de fadiga crónica e herpes;

efeito tranquilizador do sistema nervoso beneficia muitas pessoas que
sofrem de depressão, distúrbios do sono, entre outras;

restabelece e equilibra a flora intestinal - elimina do intestino as
bactérias e leveduras prejudiciais, e aumenta a população bacteriana benéfica e
protectora;

regulador da flora intestinal, podendo ser usado tanto em casos de
obstipação quanto diarreia, reduz a flatulência e melhora de uma forma geral todo o
sistema digestivo;

o efeito de “limpeza” que exerce em todo o corpo, ajuda a estabelecer o
equilíbrio do ecossistema interno, permitindo uma ótima saúde e aumento da
longevidade;

diminui o risco de câncer , principalmente de cólon;

diminui a fração do colesteril LDL.
Kefir é o único produto lácteo fermentado produzido a partir de uma mistura de
bactérias láticas e leveduras. Apesar de sua antiga origem e consumo em algumas regiões, no
Brasil, o consumo é recente e existem poucos estudos brasileiros a respeito dos grãos de kefir
e seus derivados. Sabe-se, que um número cada vez maior de benefícios tem sido vinculados a
esse alimento e o fato de ser probiótico, pode aumentar ainda mais seu valor agregado. Um
produto referido como simbiótico é aquele no qual um prebiótico e um probiótico estão
combinados. (OTLES e CAGIDI, 2003; GIACOMELLI, 2004; FARNWORTH, 2005;
PARASKEVOPOULOU, 2003; SAAD, 2006; GARROTE, et al. 1997).
As embalagens que são utilizadas para o acondicionamento da bebida kefir, devem ser
forte suficientes para resistir a qualquer pressão que possa criar (por exemplo, vidro), ou
27
flexível o suficiente para conter o volume de gás produzido (por exemplo, de plástico com
uma folha de alumínio superior (WITTHUN et al, 2004). Durante o armazenamento
prolongado do kefir a baixas temperaturas, a fermentação ácida e o desdobramento de
proteínas em aminoácidos cessam, enquanto que a formação de CO2, álccol e aroma continua
a ocorrer (FERREIRA, 2001).
3.5.
Processos Fermentativos
Tradicionalmente, o kefir é produzido adicionando grãos de kefir (uma massa de
proteínas, polissacarídeos, mesofílica, homofermentativa e heterofermentativa, ácido láctico,
estreptococos, lactobacilos termófilos e mesofílicos, ácido acético, bactérias e leveduras) para
uma quantidade de leite de 2 a 10% , geralmente 5%, a temperatura ambiente.O processo de
fermentação varia de 18 a 24 horas, após esse período os grãos são peneirados e refrigerados
para serem utilizados para ouitra inoculação e a bebida é acondicionada
4°C
até ser
consumida, esse processo de fabricação está descrito na Figura 3.5 (OTLES & CAGINDI,
2003).
Leite Cru
Arrefecimento (20 - 25ºC)
Inoculação
Fermentação 18 - 24 h
Separação dos Grãos
Maturação e Resfriamento 4ºC
Estocagem
Figura 3.5: Fluxograma do processo Tradicional de fabricação de kefir.
Fonte: Adaptado de OTLES e CAGINDI, 2003.
Há diferentes métodos para obtenção do kefir industrialmente, mas seguem todos os
mesmo princípios. Faz-se homogeinização do leite, em seguida, a pasteurização e
28
resfriamento do leite e a inoculação com os grãos de kefir que podem variar de 2 a 8%, o
tempo de fermentação é de em média 24 horas. A bebida é filtrada e acondicionada em
embalagens apropriadas, onde são mantidas por 24 horas a uma temperatura em torno de 12 –
14°C (onde vai adquirir as caracteristicas sensoriais) para depois ser estocada (4°C) e
comercializada (OTLES e CAGINDI, 2003, FERREIRA, 2001). O fluxograma do processo
industrial de fabicação de kefir é demonstrado na Figura 3.6.
Durante o período de fermentação do leite pelos grãos de kefir os microrganismos
homofermentativos, ácido láctico e estreptococos crescem rapidamente, provocando
inicialmente uma queda do pH. Esta queda do pH favorece o crescimento dos lactobacilos,
provocando, a diminuição dos estreptococos. A presença de leveduras na mistura, juntamente
com a temperatura de processo (21-23,8°C), incentiva o crescimento da produção de aroma
pelos microrganismos heterofermentativos, estreptococos (TRANSEK; GORSEK, 2007).
Leite Cru
Homogeinização
Pasteurização
Resfriamento
Inoculação (2 - 8%)
Fermentação 18 - 24 h
Separação dos Grãos
Embalagem
Maturação 12 - 14ºC, 24h
Estocagem 4ºC
Figura 3.6: Fluxograma do processo Industrial de fabricação de kefir.
Fonte: Adaptado de OTLES & CAGINDI, 2003.
29
As espécies que integram o gênero Bifidobacterium conseguem proliferar num meio
semi-sintético contendo apenas lactose, aminoácidos, vitaminas, nucleotídeos e alguns
minerais. Um dos fatores limitantes para o crescimento dessas bactérias, é a fonte de azoto,
que para algumas estirpes poderá estar na forma de amônia enquanto para outras, deverá ser
uma fonte orgânica. No que diz respeito ao L. acidophilus, os requisitos em nutrientes
necessários para a exibição de taxas razoáveis de crescimento são semelhantes aos das
Bifidobacterium: hidratos de carbono como fonte de energia, proteínas e respectivos produtos
de degradação, vitaminas do complexo B, derivados dos ácidos nucléicos e minerais. A
presença do grupo sulfidrilo em leites enriquecidos com proteínas do soro favorece o
crescimento de L.acidophilus. (GOMES & MALCATA, 1999)
Durante a produção de kefir, ocorrem quatro modificações importantes: formação de
ácido lático, formação de álcool, formação do “flavor” pelas leveduras, desdobramento
parcial da proteína para peptonas e aminoácidos. Essas modificações são ocasionadas devido
a temperatura. A formação de CO2 se dá a temperatura de 5 a15°C, enquanto a fermentação
lática se dá de maneira lenta. Ao invés de se escolher uma temperatura média, acidifica-se o
meio, mantendo a temperatura de 16-22°C e em seguida retorna-se para a temperatura de 515°C para que haja a produção de álcool e CO2. As proteínas se desdobram em aminoácidos
durante a fermentação lática (TRAMSEK; GORSEK, 2008).
A Tabela 3.8 mostra os diversos métos de produção dos produtos lácteos. Nosta-se que
apenas um artigo cita a fermentação contínua num bioreator CSTR, pois tradicionalmente a
produçãos desses produtos é feita em bioreator por batelada. Para o uso do método contínuohá
a necessidade de estudos sobre o sistema desse bioreator na produção de produtos lácteos.
30
Tabela: 3.8: Diversos modos de obtenção de produtos lácteos
Micro-organismos
Condições de Processo
Tipo de Reator
Grãos de kefir
Fermentação a T=24°C
Bioreator CSTR e
por 24 h, com rotação de
bioreator em batelada
90 rpm, adição de 20 g/L
de glucose
Streptococcus thermophilus, Fermentação a T= 42°C
Bioreator em batelada
Lactobacillus delbruecki
até atingir o pH 4,7 – 4,8,
subsp. Bulgaricus
com adição de leite empó,
,Bifidobacterium e
soro de leite em pó, açúcar
Lactobacillus acidophyllus
e fritoligossacarídeos
Grãos de kefir
Fermentação a T=30°C por
Bioreator em batelada
120 minutos e fabricação
de pão tradicional.
Grãos de kefir, Lac.
Fermentação a T=32°C por
Bioreator em batelada
dekbruekii spp bulgaricus,
90 minutos em seguida
Streptococcus salivarius spp. fabricação padrão de
thermophillus, Lac. lactis
queijo branco
spp. lactis, Lac. lactis spp.
cremoris
Grãos de kefir
Fermentação a T= 30°C
Bioreator em batelada
por 7 horas ou até o pH
atingir entre 3 – 4,7, em
condições aeróbicas
Grãos de kefir
Fermentação aeróbica
Bioreator em batelada
T=30° até o pH atingir 4,0.
31
Produto
Kefir
Fonte
GORSEK e TRAMSEK
(2008)
Bebida láctea
probiótica
THAMER e PENNA (2005)
Pão
PLESSAS et al. (2005)
Queijo
GONCU e ALPKENT (2005)
Bebida láctea
ATHANASIADIS et al.
(2004)
Bebida láctea
PARASKEVOPOULOU et
al. (2003)
Continuação da Tabela 3.6
Micro-organismos
Grãos de kefir
Condições de Processo
Fermentação a temperatura
ambiente (25°C) por 36
horas.
Grãos de kefir
Fermentação a uma
T=30°C até o Ph atingir
4,0, com adição de frutose.
Grãos de kefir
Fermentação a T=23°C por
18 horas com adição de
polda de morango
Grãos de kefir
Fermentanção a
Temperatura entre 20 e
25°C por 18 – 24 horas
Bifidobacterium animalis
Fermentação a T= 21°C
subsp. Lactis (BB12,
por 15 a 20 horas, com
Madri/Espanha) e Mesophilic adição de sacarose e
Aromatic Culture (MAC
cucralose.
CHN-22,
Horsholm/Dinamarca),
composta por mistura de
linhagens contendo
Lactococcus lactis subsp.
Cremoris, L. lactis subsp.
Lactis, Lactococcus lactis
subsp. Lactis biovar.
Diacetylactis e Leuconostoc
mesentoroides subsp.
Cremoris
Tipo de Reator
Bioreator em batelada
Produto
Kefir
Fonte
WITTHUHN et al. (2005)
Bioreator em batelada
Bebida láctea
OTLES e CAGINDI, (2003)
Bioreator em batelada
Kefir
ERGÖNÜL et al. (2004).
Bioreator em batelada
Kefir
PARASKEVOPOULOU et
al. (2003)
Bioreator em batelada
Buttermilk probiótico
ANTUNES et al. (2006)
32
Continuação da Tabela 3.6
Micro-organismos
Streptococcus thermophilus,
Bifidobacterium longum,
Lac. acidophilus
Streptococcus thermophilus,
Lac. Acidophilus, Lac.
delbrueckii subsp. bulgaricus
Grãos de kefir
Condições de Processo
Fermentação a T= 45°C
até o pH atingir 4,7.
Tipo de Reator
Bioreator em batelada
Produto
Iogurte probiótico
Fermentação a T=42°C até
o pH atingir a 4,7-4,8.
Bioreator em batelada
Bebida láctea probiótica THAMER e PENNA. (2006)
Fermentação a temperatura Bioreator em batelada
ambiente por 7 dias
33
Bebida fermentada
Fonte
ZACARCHENCO e
MASSAGUER-ROIG (2006)
SILVA et al. (2005)
3.6.
Potencial de Mercado
No mercado de produtos lácteos, os alimentos funcionais estão se tornando uma
realidade, onde muitas empresas estão desenvolvendo linhas de produtos tendo a promoção de
benefícios à saúde. Isso se dá ao fato dos consumidores estarem em contínua busca da melhor
qualidade de vida com uma alimentação saudável e a prática de atividades físicas
(FARNWORTH, 2005).
O consumo de kefir no Brasil se dá de maneira artesanal, pois esse produto não é
industrializado nem comercializado. Muito popular na Rússia, Hungria, Polônia por muitos
anos. Na Rússia, o kefir corresponde a mais de 80% do montante total do leite fermentado
consumidos. Também é bem conhecida na Suécia, Noruega, Finlândia e Alemanha, Grécia,
Áustria, Israel. Está atualmente disponível nos Estados Unidos, principalmente como uma
bebida étnica, e está crescendo em popularidade no Japão. Hoje, o kefir é cada vez mais
popular devido aos seus efeitos benéficos (ERGÖNÜL, 2004).
Kefir é ainda mais familiar para os consumidores na Europa Oriental, embora a
produção comercial ocorra agora na América do Norte. No entanto, podem ser encontradas
várias patentes relativas a produção comercial mundial de kefir (; GIACOMELLI, 2004).
No mercado internacional, se destacam o Actívia Kefir, comercializado na Rússia e
Kefir Liberte, no Canadá e França (SANTOS e FERREIRA, 2008). Na Figura 3.7 podemos
ver a gama de produtos comercializados por uma única empresa a DMJ Biotech Corp.
adiconando os grãos de kefir entre eles temos: requeijão cremoso, kefir dediversos sabores,
leite de kefir, fermento, queijo etc.
Figura 3.7: Prodtos a base de grãos de kefir comercializados por uma única empresa a
DMJ. Fonte: WW ://www.kefir.co.kr.
1
Capítulo 4
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Nesta seção são apresentados os materiais e a metodologia utilizada neste trabalho
visando o desenvolvimento de um produto lácteo probiótico, bem como os métodos analíticos
empregados na caracterização do leite fermentado.
4.1. Materiais
Os materiais empregados encontram-se especificados a seguir.
4.1.1. Grãos de kefir
Os grãos de kefir, utilizados no desenvolvimento do produto lácteo, foram adquiridos
junto à Pastoral da Criança, em Aracaju-Sergipe, e mantidos no Laboratório de Pesquisa em
Alimentos do Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP) em Aracaju-Sergipe.
4.1.2. Leite e iogurte
O leite pasteurizado utilizado como matéria-prima para a produção do produto lácteo
fermentado foi proveniente do Laticínio Nativille, em Nossa Senhora da Glória-Sergipe e do
Laticínio Coopeagrio, em Porto da Folha-Sergipe.
4.2. Metodologia Experimental
O procedimento experimental para o cultivo do grão de kefir, para a preparação do
leite fermentado, assim como para a sua caracterização por meio de análise físico-química,
microbiológicas e sensorial é apresentado nesta seção.
2
4.2.1. Delineamento experimental
Para a avaliação das condições do processo fermentativo foi adotada a metodologia do
planejamento experimental empregando duas matrizes de 23 com 3 repetições no ponto
central.
O primeiro planejamento avaliou as condições experimentais do processo fermentativo
com base nas informações da literatura. As variáveis independentes avaliadas foram:
concentração do leite em pó (X1), temperatura (X2) e os grãos de kefir (X3), conforme descrito
na Tabela 4.1. Os ensaios foram conduzidos, e a variável resposta selecionada foi a
viscosidade do leite fermentado produzido. Os experimentos foram efetuados de maneira
randômica por um período máximo de 6h, conforme descritos na literatura para a obtenção
convencional do iogurte.
Tabela 4.1: Condições para o planejamento de experimento prévio
Fatores
-1
0
1
X1: Leite em pó (%)
5
10
5
X2: Temperatura (˚C)
35
45
5
X3: Grãos de kefir (%)
1
3
+
1
5
5
Baseando-se nos resultados obtidos na primeira análise, verificou-se a viabilidade de
aplicar uma segunda matriz experimental, neste caso os níveis máximo e mínimo foram
modificados (Tabela 4.2).
Essa segunda matriz de planejamento experimental, como dito anteriormente, baseou-se
no melhor resultado do planejamento preliminar, e expandiu as variáveis respostas para:
viscosidade, potencial probiótico, acidez e pH. O processo fermentativo foi conduzido por
24h com amostragem a 0, 6, 18 e 24h como descrito por TRANSEK (2008).
3
Tabela 4.2: Condições para a segunda matriz de planejamento
Fatores
-1
0
+
1
X1: Leite em pó (%)
0
6,25
1
2,5
X2: Temperatura (˚C)
25
35
4
5
X3: Grãos de kefir (%)
5
7,5
1
0
Na análise dos resultados do planejamento experimental foi utilizado o programa
STATISTICA 6.0.
4.2.2. Processo fermentativo
O meio de cultura foi formulado com leite de vaca e espessante (leite em pó),
misturados na proporção de cada experimento, pasteurizado (aquecimento a 80oC por 10 min.,
e esfriamento rápido). Variaram-se as concentrações de espessante, de grãos de kefir e a
temperatura. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers de 500 mL contendo
300 mL de meio, em processo estático.
4.3. Métodos de Análise
Os métodos de análise físico-químicas, microbiológicas e sensoriais são descritos de
forma suscinta nesse item.
4.3.1. Caracterização do leite, do kefir e do iogurte
As análises físico-químicas foram realizadas segundo a metodologia do Instituto Adolfo
Lutz (2005) e constaram dos seguintes métodos: pH (potenciometria), acidez
(titulação
potenciométrica), lipídios (obtido após hidrólise ácida – ácido clorídrico – 60%, secagem e
extração com éter de petróleo), proteínas (Método de Kjedall), e carboidratos totais calculados
em glicose (Método de Lane-Eynon, após a hidrólise em meio ácido sob refluxo por 3h e 30
minutos), cinzas (determinado em forno - mufla a 550ºC).
4.3.2. Análise microbiana: qualidade higiênico-sanitária
4
A análise microbiológica do leite e do fermentado foi através da utilização do método
de determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes, de
cada diluição (10-1 a 10-6) do alimento em estudo. Utilizando cinco tubos contendo 6 ml de
caldo lauril sulfato triptose contendo um tubo de Durham invertido, para obter seis séries de
cinco tubos. Foi utilizado um tubo controle do meio de cultura e outro do diluente, em seguida
a incubação em estufa a 35-37°C, por 24-48h. Considerando positivos os tubos que
apresentarem turvação do meio e/ou produção de gás.
A contagem das bactérias foi obtida no produto final utilizando a metodologia descrita
por SILVA et al. (1997). Foram realizadas diluições em tubos contendo amostras em água
peptonada, em seguida realizou-se o plaqueamento de 1 mL de produto lácteo em placas de
petri em Agar de Man Rogosa & Sharpe (MRS), as quais foram incubadas a 30°C por 48 a 72
horas em atmosfera microaerófila.
4.3.3. Viscosidade
As curvas reológicas foram determinadas em viscosímetro Visco Star-r, Modelo
v10002, com adaptador para amostras de pequeno volume (200 mL). Utilizando-se spindle
número R2 e utilizando a velocidade angular entre 0,5 e 100 rpm permanecendo em torno de
2 min na velocidade sem controle de temperatura. A temperatura inicial das amostras foi de
aproximadamente 10°C (TELES e FLORES, 2007).
4.3.4. Análise sensorial
Os produtos lácteos produzidos foram analisados quanto aos parâmetros sensoriais. A
equipe da analise sensorial foi composta por no mínimo por 30 provadores selecionados ao
acaso, o que representa o mercado alvo. Foi realizada uma analise sensorial pelo método da
aceitação, na qual foram avaliados os parâmetros sensoriais aparência, aroma, sabor, textura e
impressão global. Cada provador atribuiu uma nota de acordo com as características dos
parâmetros sensoriais analisados. As amostras foram servidas em cabines individuais, os
provadores atribuíram uma nota a cada parâmetro analisado de acordo com uma escala
hedônica estruturada de 9 pontos, indicando a intenção de compra, como mostra a ficha de
avaliação apresentada na Figura 4.1.
5
Figura 4.1: Ficha de avaliação pelo método da aceitação
4.3.5. Análise de colesterol
Para a dosagem de colesterol do leite e das bebidas lácteas, foi necessário a
derivatização das amostras, da seguinte forma: colocou-se 10 gramas da amostra da bebida
láctea a uma solução contendo KOH e etanol, deixando-as por mais 10 minutos a 60ºC e
depois adicionou água destilada. Após o resfriamento da amostra, extraiu o sobrenadante com
hexano depois da separação das fases. A secagem da amostra foi realizada na presença de
atmosfera inerte. A amostra foi dissolvida em fase móvel (acetonitrila:isopropanol 90:10).
A curva de calibração (Apêndice A) e a dosagem de colesterol foram realizadas por
cromatografia líquida de alta eficiência utilizando o cromatógrafo Pro Star (Varian), detector
UV-visível (SPD-10 AVvp) e software (Programa Star Integrator Varian versão 4.5) para o
processamento dos dados. A coluna analítica utilizada foi a C18 (150 x 4,6mm x5μ) (Gemini,
Phenomenex), mantida a 40ºC em forno com temperatura controlada. As amostras
derivatizadas foram injetadas no equipamento. A fase-móvel utilizada foi composta de 90%
de acetonitrila e 10% de isopropanol em fluxo de 1,5 mL por minuto, sendo o tempo de
análise de 20 minutos. Os cromatogramas foram processados com o comprimento de onda de
210 nm.
6
4.3.6. Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando o STATISTICA 6.0. A análise de ANOVA foi
usada para detectar a diferença significativa (p≤ 0,05) entre as amostras. Foram utilizados os
testes de Tukey e o de Dunnet para determinar os valores médios significativos.
7
Capítulo 5
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Neste capítulo são apresentados e analisados os principais resultados obtidos durante o
desenvolvimento do trabalho.
5.1. Caracterização do Leite
Neste item são apresentados e descritos os resultados da etapa de caracterização da
matéria-prima utilizada na fabricação do fermentado lácteo, o leite. A Tabela 5.1 compara os
resultados da composição centesimal do leite fornecido pelas empresas com os dados de
composição de leite apresentado pela literatura. O leite utilizado apresentou uma acidez maior
do que aquela do leite encontrado comercialmente, e um teor de proteínas inferior ao leite
comercial (TORRES et al., 2000). A diferença dos resultados encontrados deve-se
possivelmente a raça, idade, período de lactação e alimentação do animal.
Tabela 5.1: Composição centesimal do leite fornecido pela empresa e alguns
disponíveis no mercado.
Leite utilizado
Leite comerciala
pH
6,62 ± 0,00
6,6-6,8
Acidez T.T (mg NaOH)
3,63 ± 0,15
1,82
Umidade (%)
89,06 ± 0,02
87,95
Cinzas (%)
0,69 ± 0,02
0,54
Proteína (%)
1,05 ± 0,03
3,24
Lipídios (%)
0,94 ± 0,03
3,10
Açúcares Redutores (%)
2,17 ± 0,15
-
3,6 ± 0,1
2,00
Carboidrato (%)
8,27
5,17
Energia (Kcal/ 100g)
45,74
62
Constituintes
Açúcares Totais (%)
Fonte: aTorres et al. (2000)
8
No conteúdo mineral, a porcentagem de cinzas do leite fornecido é cerca de 22%
comparado ao leite comercial da literatura. De acordo com Torres (2000), os valores
energéticos para o leite comercial são de cerca de 62Kcal/100g. Entretanto, o valor para o
leite utilizado neste trabalho fornecido foi inferior em cerca de 26%. As variações observadas
foram ocasionadas possivelmente pela composição bromatológica das pastagens dos pontos
de referência, considerando que a variação ocasiona direta ou indiretamente desequilíbrio na
relação energia/proteína na alimentação do gado e por fim no produto final (GOMES e
MALCATA, 1999).
5.2. Produção de Bebida Láctea Fermentada
Nesta seção é apresentada a região ótima dos parâmetros para o processo de
fermentação de leite de vaca utilizando grãos de kefir como iniciador do processo.
A influência da concentração do leite em pó (X1), da temperatura (X2) e da
concentração dos grãos de kefir (X3), foram primeiramente estudada por meio de um
planejamento fatorial completo 2³ com três repetições no ponto central, adotando como
variável resposta a viscosidade da bebida láctea obtida. A viscosidade foi selecionada como
variável resposta, devido ao direcionamento do mercado da região nordeste, onde se supõe
que as maiores sensibilidades gustativas do mercado regional, são para produtos lácteos com
maior consistência.
Na Tabela 5.2 são apresentados os níveis selecionados para cada variável. As variáveis
quantitativas foram representadas da seguinte forma: o sinal (+) representa o nível máximo, o
sinal (-) o nível mínimo e o sinal (0) o ponto central. Desta forma, a matriz utilizada foi
constituída por 11 ensaios, no qual três foram referentes aos pontos centrais.
A velocidade angular de 30 rpm aplicada ao spindle do viscosímetro propiciou a melhor
determinação da viscosidade do leite, conforme descrito na Figura 5.1 e, por esta razão, foi
escolhida para as determinações. A Tabela 5.2 mostra que o aumento da concentração do
espessante (leite em pó) propiciou o aumento da viscosidade do leite fermentado, o que esta
de acordo com os trabalhos da literatura, que atribui este efeito a compactação da rede de
caseína (ÜNAL et al, 2003; KOKSOY e KILICl, 2004).
Entretanto, no Experimento 2 que possui a quantidade máxima de leite em pó neste
estudo, a viscosidade foi de 45 cP, o que pode ser explicado pelo fato deste ensaio possuir
apenas 1% de grãos de kefir. O mesmo ocorre nos experimentos 1 e 3, indicando que a
9
concentração de grãos de kefir para a produção da bebida kefir influencia na viscosidade da
bebida.
Tabela 5.2: Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados no tempo de 6 h
Ordem Experimentos X1 X2 X3
Leite em
Temperatura
Kefir
Viscosidade
pó (%)
(°C)
(%)
(cp)
3
1
-1
-1
-1
5
35
1
65
2
2
+1
-1
-1
15
35
1
45
4
3
-1
+1
-1
5
55
1
60
8
4
+1 +1
-1
15
55
1
72
9
5
-1
-1
+1
5
35
5
96
10
6
+1
-1
+1
15
35
5
187
11
7
-1
+1 +1
5
55
5
87
1
8
+1 +1 +1
15
55
5
104
5
9
0
0
0
10
45
3
117
6
10
0
0
0
10
45
3
93
7
11
0
0
0
10
45
3
96
250
Ensaio1
200
Ensaio3
Cp
Ensaio4
150
Ensaio5
100
Ensaio7
Ensaio9/1
50
Ensaio9/2
0
0,5
1
2
3
5
10
20
50
100
Rpm
Figura 5.1: Perfil de viscosidade nas diferentes velocidades angulares testadas
10
A viscosidade do leite fermentado utilizando grãos de kefir variou entre 45 a 187cp,
valores superiores com a viscosidade de iogurtes comerciais líquidos (5,38 cp) e consistente
(120 cp) encontrados por Teles e Flores (2007). Observa-se que o aumento da concentração
de leite em pó e de grãos de kefir no processo fermentativo propicia o aumento da viscosidade
do leite fermentado. Já a temperatura tem efeito contrário.
A viscosidade aparente dos produtos lácteos diminuiu com o aumento da taxa de
deformação (1/s) (Teles e Flores, 2007) indicando comportamento de fluido não Newtoniano,
no qual a viscosidade permanece constante com a variação da taxa de deformação
(BORWANKAR, 1992). A viscosidade aparente decresce devido ao rearranjo e/ou
deformação das partículas, que resulta na diminuição da resistência ao escoamento (RAO,
1994). Alguns autores (PENNA et al., 2001; KOKSOY e KILIC, 2004) observaram que as
bebidas lácteas fermentadas apresentam o mesmo tipo de comportamento. Além disso,
relataram que o modelo da lei da potência tem sido utilizado na modelagem do
comportamento do fluxo desse tipo de produto.
A análise dos efeitos principais demonstrou que a concentração de grãos de kefir é
significante ao nível de 95% de confiança, pois houve um aumento na viscosidade do produto
lácteo. Os demais efeitos, leite em pó e temperatura, foram significantes ao nível de 85% em
interação. Os efeitos principais e secundários dos fatores quantidades de leite em pó,
temperatura e concentração de grãos kefir sobre a viscosidade estão detalhados na Tabela 5.3
e 5.4, confirmando o que foi apresentado na Figura 5.2 (Diagrama de Pareto), mostrando que
a concentração de grãos de kefir é significativa ao nível de 95% de confiança.
Tabela 5.3: Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir sobre
a viscosidade
Variável Independente
Estimativa
Erro padrão
p
Média Global
92,90*
 6,89*
0,000175*
X1: Leite em Pó (%)
25,00
16,15
0,196612
X2: Temperatura
-17,50
16,15
0,339580
X3: Kefir (%)
58,00*
16,15*
0,022949*
X1X2
-10.50
16,15
0,551120
X1X3
29,00
16,15**
0,146039**
X2X3
-28,5**
16,15**
0,0152440**
*Significativo ao nível de 95% de probabilidade. **Significativo ao nível de 85% de probabilidade
11
Dentre todos os tratamentos testados, a melhor condição para obter a viscosidade
(187cp) foi o ensaio 6, nas seguintes condições: 15g de leite em pó, 35°C e 5% de kefir. Por
outro lado, a mínima viscosidade (45 cp) foi obtida no ensaio 2, nas seguintes condições: 15g
de leite em pó, 35°C e 1% de kefir, que condiz com a literatura, já que os grãos de kefir
crescem melhor à temperatura ambiente e a percentagem normalmente utilizada varia de 8 a
10% de grãos de kefir (FARNWORTH, 2005; FERREIRA, 2001).
Tabela 5.4: Análise de variância para a viscosidade do iogurte obtida pelo processo
fermentativo
Variável
Soma
Graus de
Média
Independente
quadrática
Liberdade
Quadrática
X1
378,13
1
378,125
0,386939
0,567614
X2
78,12
1
78,125
0,079946
0,791399
X3
9591,13*
1
9591,125*
F**
p*
9,814688* 0,035089*
X1X2
1,12
1
1,125
0,001151
0,974559
X1X3
3240,12
1
3240,125
3,315650
0,142729
X2X3
3160,12
1
3160,125
3,233785
0,146533
Erro total
3908,89
4
977,222
Total SS
20357,64
10
2
Total (corrigido) = 20357,64. R = 0,80. **F: Teste estatístico de comparação da variância nos ensaios,
permitindo a avaliação da qualidade de ajuste. *p: Teste estatístico para estimativa do intervalo de confiança do
modelo.
12
Figura 5.2: Diagrama de Pareto no tempo de 6 h para a viscosidade
De acordo com Teles e Flores (2007), a variável leite em pó apresentou em seus
resultados menor influência na viscosidade do iogurte. Embora ambos os ensaios, 6 e 2,
contivessem a mesma quantidade de leite em pó, a viscosidade foi diferente.
5.2.1. Caracterização físico-química e microbiológica da bebida kefir
Na Tabela 5.5, encontra-se a composição centesimal do fermentado na melhor
condição do planejamento experimental (ensaio 2), considerando que o preferencial do
produto obtido é um produto com alta viscosidade, já que se supõe que no estado Sergipe há
um maior consumo deste tipo de produto lácteo, ou seja, mais consistente.
Segundo a literatura, a produção de ácido lático durante a incubação promove a
diminuição do pH do leite de 6,52 (Tabela 5.1) para 5,01 (Tabela 5.5). Porém, não há uma
concordância entre os autores, sobre a faixa de pH ideal que o iogurte ou a bebida láctea
fermentada deve atingir no final da produção. O valor obtido foi 14% a menos que o obtido
por Barbara et al. (2006) no leite fermentado com grãos de kefir.
O valor médio de proteína observado foi de 0,62%, cerca de 50% menor do que a
quantidade de proteína observada no leite, explicado pela ação dos grãos de kefir no leite, e
inferior ao valor mínimo de 1,2%, estabelecido pelo Regulamento Técnico de Identidade e
Qualidade de Bebidas Lácteas.
13
Tabela 5.5: Composição centesimal do fermentado do ensaio 6
Constituintes
Iogurte produzido
pH
5,11 ± 0,180
Acidez T,T
1,65 ± 0,070
Umidade (%)
87,60 ± 0,600
Cinzas (%)
0,82 ± 0,006
Proteína (%)
0,62 ± 0,030
Lipídios (%)
0,62 ± 0,050
Carboidrato (%)
10,350
Energia (Kcal/ 100g)
49,370
De acordo com a resolução nº 5 de 2000 – MAPA, os leites fermentados com
agregados açucarados e ou saborizados poderão ter conteúdo de proteína inferior ao
preconizado, não devendo, porém, reduzir-se a uma proporção maior do que a percentagem de
substâncias alimentícias não lácteas (BRASIL, 2000), o que pode explicar os baixos valores
de proteína encontrados na análise deste estudo.
Do ponto de vista nutricional, os lipídios têm seu papel no fornecimento de energia e
servem de veículo para vitaminas lipossolúveis, como a vitamina A, naturalmente presente no
leite integral tipo A (DANONE, 2010). No caso deste estudo, o valor de lipídios foi de 0,62%
(Tabela 5.5) inferior ao determinado para o leite mostrado na Tabela 5.1.
Quanto à contaminação, pode ser causada por diversos fatores, tais como a variação de
acidez, o processamento inadequado e ausência de controle de temperatura. Na etapa do
estudo em que foi realizada a análise de contaminação, não foi verificado a contagem de
coliformes totais, termotolerantes e salmonella.
5.3. Avaliação das Condições Experimentais do Processo Fermentativo
Com a realização da seleção da região ótima no processo de obtenção de produtos
lácteos, buscou-se melhorar a tecnologia de produção da bebida Kefir utilizando a matriz do
segundo planejamento, conforme o item 4.2.1, descrito em Materiais e Métodos.
14
5.3.1. Delineamento experimental
Foi realizada, a avaliação dos efeitos das variáveis relacionadas no processo
fermentativo para obtenção da bebida láctea kefir. Também foram ampliadas as variáveis
dependentes para viscosidade (permitindo averiguar a consistência do fermentado) e células
lácticas viáveis (identificação do potencial probiótico), além de se ter feito um
acompanhamento do valor do pH e da acidez do meio durante os ensaios), como mostrado na
Tabela 5.6.
As influências da concentração do leite em pó (X1), da temperatura (X2) e dos grãos de
kefir (X3) na produção de leite fermentado foram estudadas por meio de um planejamento
fatorial completo 2³ com três pontos centrais (condição encontrada pelo delineamento
experimental prévio e que produziu leites fermentados consistentes utilizando grãos de kefir.
Na Tabela 5.6 observa-se o potencial probiótico da bebida kefir a partir do elevado número de
células viáveis após 24 horas de fermentação.
Tabela 5.6: Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros concentração de leite em pó, temperatura e concentração de grãos de kefir em
fermentação de 24h e variáveis respostas concentração de células viáveis e viscosidade
Exp.
Leite em pó
Temperatura
Kefir
(%)
(°C)
(%)
Células Viáveis Viscosidade
(UFC/mL)
7
(cP)
1
0
25
5
1,25x10
80
2
12,5
25
5
1,20x107
187
3
0
45
5
2,59x108
1210
4
12,5
45
5
2,00x108
2580
5
0
25
10
3,43x107
57
6
12,5
25
10
1,32x107
329
9
7
0
45
10
1,40x10
2010
8
12,5
45
10
1,83x109
2840
9
6,25
35
7,5
5,80x107
890
10
6,25
35
7,5
1,15x108
810
11
6,25
35
7,5
8,70x107
880
15
5.3.2. Potencial probiótico
Nesta seção apresentam-se os resultados obtidos na contagem de células láticas
(potencial probiótico) do produto lácteo produzido a partir de grãos de kefir. A Tabela 5.7
apresenta a quantidade de células viáveis presente na bebida Kefir.
Tabela 5.7: Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados em diferentes tempos, cuja variável resposta são
células viáveis
Experimentos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Leite
em
pó
(%)
0
12,5
0
12,5
0
12,5
0
12,5
6,25
6,25
6,25
Células
Células
Células
Temperatura Kefir
Viáveis
Viáveis
Viáveis
(°C)
(%) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)
0h
6h
18h
4
5
25
5
4,30x10
1,40x10
2,20x106
25
5
3,50x104
3,06x105
1,90x106
45
5
4,91x105
2,95x106
3,90x107
5
6
45
5
4,90x10
1,21x10
1,25x107
25
10
5,90x104
1,50x105
3,29x106
25
10
3,69x104
1,64x105
4,10x106
5
5
45
10
8,90x10
9,02x10
1,43x107
45
10
8,96x105
2,75x106
3,59x107
35
7,5
1,59x105
1,86x106
2,43x107
5
6
35
7,5
1,50x10
1,80x10
2,70x107
35
7,5
1,59x105
2,07x106
2,50x107
Células
Viáveis
(UFC/mL)
24h
1,25x107
1,20x107
2,59x108
2,00x108
3,43x107
1,32x107
1,40x109
1,83x109
5,80x107
1,15x108
8,70x107
A partir de 6 horas de fermentação, o produto lácteo obtido, já pode ser considerado um
probiótico nos ensaios 8, 9, 10 e 11, atendendo os requisitos descritos na literatura e na
legislação brasileira em vigor para bebidas lácteas (BRASIL, 2000), que preconizam que
todos os micro-organismos produtores da fermentação lática devem ser viáveis e está presente
no produto em quantidades mínimas de 106 UFC/mL.
Portanto, o tempo de fermentação escolhido para o processo de fabricação da bebida
Kefir, foi o de 24 horas, pois a contagem de bactérias láticas atingiu valores na ordem de 109
UFC/mL, apresentando crescimento microbiano suficiente para atuação do mesmo no
intestino humano como um alimento probiótico. De acordo com Thamer e Penna (2005), a
obtenção de um produto lácteo com crescimento na ordem de 109 UFC/mL é boa para que se
tenha pelo menos cerca de 103 a 104 UFC atingindo o intestino, sendo que o ideal seria que
atingisse 106.
Os valores de N/No em função do tempo de processo fermentativo foram utilizados para
a construção das Figura 5.3 a 5.5, por meio da qual é possível observar uma linearidade da
16
relação do aumento do número de células láticas com o tempo. Desta forma entende-se que
este crescimento foi regido por uma cinética de primeira ordem, como mostra a Equação 01.
dN/dt = kN
(01)
onde N é o número de células láticas, t é o tempo e k é a constante de aumento de
células láticas. Integrando essa equação e sabendo-se que t0 é 0 (zero), obtém-se:
Log(N/No) = kt
(02)
Sabendo-se que o tempo de duplicação das células ocorre quando N=2N0, pode-se
determinar o tempo de duplicação das células láticas, a partir da Equação 03.
t2 = (log 2)/k
(03)
Figura 5.3: Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/N0) para ensaios
contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25oC (Exp 1 e 2) e 45oC (Exp 3 e 4) e
diferentes concentrações de leite em pó
17
Figura 5.4: Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/N0) para ensaios
contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25oC (Exp 5 e 6) e 45oC (Exp 7 e 8)
e diferentes concentrações de leite em pó
Figura 5.5: Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/N0) para as condições
do ponto central contendo 7,5% de grãos de kefir; temperatura de 35oC e
concentração de leite em pó de 6,25%
Os valores da constante de crescimento, o tempo de duplicação e o coeficiente de
regressão para a linearização são apresentados na Tabela 5.8.
18
Tabela 5.8: Valores para a cinética de crescimento de células láticas no processo de
fermentação utilizando grãos de kefir.
Exp.
K (min-1)
t2 (min)
r2
1
0,0993
3,03
0,9948
2
0,1044
2,88
0,9657
3
0,1113
2,70
0,9941
4
0,0965
3,12
0,9435
5
0,1071
2,81
0,9736
6
0,1090
2,76
0,9974
7
0,1052
2,86
0,8070
8
0,1188
2,53
0,9153
9 - 11
0,1195
2,52
0,9638
Nas Figuras 5.3 a 5.5 pode ser observado o crescimento exponencial das bactérias
láticas em todos os níveis (-1, 0 e +1). Para permitir uma melhor avaliação do potencial
probiótico, foi realizado o planejamento de experimentos da matriz proposta. Entre todas as
condições testadas, os grãos de kefir, temperatura, e a interação grãos de kefir e temperatura,
foram mais eficazes para a produção de um produto lácteo com alto potencial probiótico
(Tabela 5.8). Como é possível observar nos ensaios 7, 8 e 9 a 11 apresentaram uma contagem
de células viáveis, evidenciando assim o potencial probiótico.
Na Tabela 5.9 são apresentadas as estimativas de efeito, erros – padrão e teste t de
Student’s para os parâmetros que influenciam no número de células viáveis, como pode ser
observado pelo teste t. A temperatura, a concentração de grãos de kefir e a interação entre
temperatura e grãos de kefir apresentaram influência significativa ao nível de 95% de
confiança. Somente o leite em pó e a interação do leite em pó, temperatura e grãos de kefir
não foram significativos.
A Figura 5.6 (Diagrama de Pareto) representa os valores de efeito estimado das
variáveis e das interações, em concordância com a tabela de estimativa de efeito (Tabela 5.9),
onde é possível verificar os valores estatisticamente significativos ao nível de confiança de
95% (p<0,05). Os efeitos da temperatura e da concentração de grãos de kefir e interação
destes efeitos foram mais significativas no processo de produção de um produto lácteo
probiótico, tendo como variável resposta, a contagem de células viáveis, é quanto estiver mais
a direita da linha vermelha. O comprimento de cada barra é proporcional ao efeito da variável.
Segundo o Gráfico 5.6, a variável temperatura é a que mais interfere no processo fermentativo
19
na forma positiva, ou seja, as temperaturas mais elevadas exercem efeito positivo no processo
fermentativo.
Tabela 5.9: Efeitos calculados para avaliação do perfil de crescimento das bactérias
láticas.
Variável
Independente
Média Global
X1: Leite em Pó (%)
Estimativa
Erro padrão
p
365.545.455*
89.810.580*
0,015*
87.350.000
210.624.480
0,699
*
X2: Temperatura
904.250.000
210.624.480
0,012*
X3: Kefir (%)
698.500.000*
210.624.480*
0,029*
98.150.000
210.624.480
0,665
X1X3
117.100.000
210.624.480
0,607
X2X3
687.000.000*
210.624.480*
0,031*
*
X1X2
*
Contudo, deve-se ressaltar que a temperatura média do Estado de Sergipe é de
aproximadamente 26°C e, portanto, acredita-se que o consórcio microbiano utilizado como
cultura starter no processo fermentativo, tenha se adaptado as condições climáticas. Deve-se
salientar que a utilização do planejamento de experimentos indicou o aumento da temperatura
como fator para o aumento do número de células viáveis, mas esta ferramenta experimental
deve ser utilizada como aliada nos experimentos, pois o uso de altas temperaturas no processo
fermentativo do leite pode inibir o crescimento dos micro-organismos responsáveis pela
fermentação lática e obtenção do produto lácteo. Na literatura a temperatura de fermentação
reportada é de 25°C (WITTHUHN et al., 2005). Neste trabalho a temperatura variou entre 35
e 45°C, evidenciando-se assim a adaptação do consórcio microbiano (grãos de kefir).
Nas Tabelas 5.7 e 5.8, é possível observar que os ensaios com o nível mais alto de
grãos de kefir, quando utilizado a temperatura de 45°C, foram os experimentos que obtiveram
o maior número de células viáveis 109 UFC/mL, confirmando o que foi apresentado na Figura
5.6 (Diagrama de Pareto), que a concentração de grãos de kefir é significativa ao nível de
95% de confiança.
20
(2)T(L)
4,293186
3,316329
3,316329
(3)Kef ir(L)
3,261729
3,261729
2Lby 3L
1Lby 3L
1Lby 2L
(1)Leite(L)
,5559658
,5559658
,4659952
,4659952
,4147191
,4147191
p=,05
Ef eito padronizado (v alor de t calculado)
Figura5.6: Diagrama de Pareto no tempo de 24 h para o crescimento de bactérias
láticas.
Portanto, um dos principais objetivos quanto à avaliação do desenvolvimento de um
potencial probiótico e funcional foi verificado, o maior número de células viáveis na ordem de
109UFC/mL.
5.3.3. Estudo da viscosidade
De acordo com a literatura, o aumento da viscosidade da bebida láctea, favorece a lipólise e a
ação enzimática, diminui o tamanho dos glóbulos de gordura, estabiliza as proteínas, etc.
(ÜNAL et al., 2003; KOKSOY; KILIY, 2004). A partir destas propriedades, neste item
encontra-se avaliada a influência dos fatores na variável resposta viscosidade.
Os maiores valores de viscosidades obtidos durante quase todo o processo fermentativo,
foram utilizando a maior concentração de leite em pó (ensaio 4 e 8). A Tabela 5.8 mostra que
a viscosidade também variou conforme o teor de sólidos secos. Segundo Ünal, et al. (2003) e
Koksoy e Kilic (2004), a viscosidade aparente é influenciada pelo teor de sólidos secos,
provavelmente pela compactação da rede de caseína. A maior viscosidade obtida foi de 2840
cP, com 12,5 % de leite em pó, a uma temperatura de 45°C e 10% de grãos de kefir. Os
resultados obtidos mostram que a viscosidade foi influenciada significativamente pela adição
de leite em pó, temperatura e interação leite em pó/temperatura, a nível de confiança de 93%,
como é mostrado nas Tabelas 5.10 e 5.11.
21
Tabela 5.10: Resultados do planejamento fatorial 23 com três pontos centrais empregando os
parâmetros para os tratamentos analisados para a viscosidade no tempo 24 horas.
Experimento
Leite em pó (%)
Temperatura (°C)
Kefir (%)
Viscosidade (cP)
1
0
25
5
80
2
12,5
25
5
187
3
0
45
5
1210
4
12,5
45
5
2580
5
0
25
10
57
6
12,5
25
10
329
7
0
45
10
2010
8
12,5
45
10
2840
9
6,25
35
7,5
890
10
6,25
35
7,5
810
11
6,25
35
7,5
880
Tabela 5.11: Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir
sobre a viscosidade.
Variável Independente
Estimativa
Erro padrão
p
Média Global
937,727*
 52,88*
0,000059*
X1: Leite em Pó (%)
887,750*
124,01*
0,002015*
X2: Temperatura
1753,750*
124,01*
0,000145*
-77,250
124,01
0,567092
X1X2
827,250*
124,01*
0,002624*
X1X3
149,250
124,01
0,295133
X2X3
-7,750
124,01
0,953168
X3: Kefir (%)
*Significativo ao nível de 93% de probabilidade
À medida que o tempo de fermentação aumentou, a viscosidade também aumentou,
pois o meio foi se acidificando, e mais caseína foi sendo precipitada. Por meio de comparação
entre o pH e a viscosidade, a partir de 3,4 a viscosidade aumentou cerca de 70%. Quando não
houve o aumento da viscosidade, pode ser explicado pelo fato da variação de temperatura e
agitação.
22
As Tabelas 5.10 e 5.11 revelam também o efeito positivo da adição de leite em pó (X1)
no processo fermentativo (p<0,05), além do aumento da temperatura (X2) e a interação de
ambos (X1X2). A partir do cálculo da análise de variância (ANOVA) observa-se que o F
calculado (X1, X2 e X1X2) é maior que o F tabelado (3,59), ao nível de 95% de confiança,
indicando a validade do modelo proposto para a viscosidade (Tabela 5.12).
Deve-se salientar que o potencial probiótico (descrito no item 5.3.2) das formulações
preparadas foi determinado, e o ensaio que apresentou maior número de bactérias láticas foi o
ensaio 8 com maior viscosidade.
Tabela 5.12: Análise de variância para ajuste do modelo proposto que representa a
viscosidade.
Variável
Soma
Graus de
Média
Independente
quadrática
liberdade
Quadrática
F**
p*
X1
1576200*
1
1576200*
51,24*
0,0020*
X2
6151278*
1
6151278*
199,99*
0,00015*
X3
11935
1
11935
0,39
0,56
X1X2
1368685*
1
13686885*
44,50*
0,0026*
X1X3
44551
1
44551
1,45
0,29
X2X3
120
1
120
0,004
0,95
Erro total
123032
4
30758
Total SS
9275802
10
2
Total (corrigido) = 9275802. R = 0,98. **F: Teste estatístico de comparação da variância nos ensaios,
permitindo a avaliação da qualidade de ajuste. *p: Teste estatístico para estimativa do intervalo de confiança do
modelo.
Nas Figuras 5.7 a 5.9 podem ser observados os perfis da viscosidade em todos os
níveis (-1, 0 e +1). Nos níveis -1 e 0, observa-se o aumento da viscosidade durante toda a
fermentação, no entanto no nível a partir de 18 horas de processo fermentativo houve um
decréscimo mínimo da viscosidade nos ensaios 7 e 8 que diferem entre si pela porcentagem de
leite em pó. Esse decréscimo da viscosidade possivelmente está associado a adaptação dos
micro-organismos e pH.
23
Figura 5.7: Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir;
temperatura de 25oC (Exp 1 e 2) e 45oC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de
leite em pó.
Figura 5.8: Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir;
temperatura de 25oC (Exp 5 e 6) e 45oC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de
leite em pó.
24
Figura 5.9: Perfil da viscosidade para as condições do ponto central contendo 7,5%
de grãos de kefir; temperatura de 35oC e concentração de leite em pó de 6,25%.
5.3.4. Acompanhamento dos valores de pH nas fermentações
Nesta seção encontram-se discutidos os resultados obtidos para o pH nas diferentes
condições do processo fermentativos, conforme descrito na Tabela 5.13 e nas Figuras 5.10 a
5.12, sendo possível observar que o fermentado obtido nos ensaios 3, 4, 7, 8, 9, 10 e 11, o pH
oscilou entre 3,17 e 4,24. No caso dos ensaios 9, 10 e 11 o valor do pH é similar ao descrito
da literatura, isto é entre 4,1 e 4,5 (GIACOMELLI, 2004). Assim sendo, nota-se que os
ensaios 3, 4, 7, 8, 9, 10 apresentaram pH inferior a 4,6 considerado ideal na fabricação de
iogurte, pois o mesmo se encontra no limite de pH para o crescimento das microorganismo
presente nos grãos de kefir (GIESE et al., 2010).
O valor de pH está relacionado a atividade metabólica dos micro-organismos, podendo
favorecer um determinado grupo em detrimento de outro, que no estudo em questão,
constituem o inóculo utilizado para a fabricação do produto lácteo, os grãos de kefir que como
já foi dito na seção 5.3.2, é um consórcio microbiano.
As Figuras 5.10 a 5.13 apresentam a mesma tendência do pH, que é de diminuição à
medida que aumenta o tempo de fermentação, devido ao aumento da porcentagem de ácido
lático, pois, na medida em que ocorre a fermentação, há a transformação da lactose em ácido
lático. De acordo com a norma FIL 150:1991 (BRASIL, 2000), a porcentagem de ácido lático
25
aceita para leite fermentados é <1,00%; o valor máximo encontrado para ácido lático nesse
estudo foi de 0,2%.
Tabela 5.13: Perfil de pH para o desenvolvimento de um produto para os tratamentos
analisados em diferentes tempos.
Leite
Experimentos
em pó
(%)
Temperatura Kefir
(°C)
(%)
pH 0h
pH 6h
pH 18h
pH 24h
1
0
25
5
6,02
6,05
5,81
6,02
2
12,5
25
5
6,00
6,38
5,67
6,00
3
0
45
5
5,51
5,34
4,11
3,17
4
12,5
45
5
5,61
6,04
3,62
3,70
5
0
25
10
5,70
5,98
5,61
5,78
6
12,5
25
10
5,68
5,77
5,53
5,68
7
0
45
10
5,45
5,4
4,58
3,45
8
12,5
45
10
5,60
5,44
3,39
3,53
9
6,25
35
7,5
6,4
6,04
4,45
4,40
10
6,25
35
7,5
6,5
6,07
4,30
4,10
11
6,25
35
7,5
6,52
6,08
4,20
4,24
Figura 5.10: Perfil de pH para ensaios contendo 5% de grãos de kefir; temperatura de
25oC (Exp 1 e 2) e 45oC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó.
26
Figura 5.11: Perfil de pH para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura
de 25oC (Exp 5 e 6) e 45oC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó.
Figura 5.12: Perfil de pH para as condições do ponto central contendo 7,5% de
grãos de kefir; temperatura de 35oC e concentração de leite em pó de 6,25%.
O aumento da acidez, isto é a diminuição do pH, foi diretamente proporcional a
temperatura e ao tempo de armazenamento para o iogurte (MARTIM, 2002). O problema do
baixo valor do pH em iogurtes pode ser minimizados com o maior rigor no cumprimento da
data de validade destes produtos. Isto obrigaria a sua retirada de mercado, uma vez que esta
variação de acidez pode, em muitos casos, ser seguida de outras modificações sensoriais
indesejáveis ou mesmo favorecer o crescimento de outros microorganismos mais tolerantes a
27
acidez e muitas vezes com funções desejadas. Portanto, foi verificado em todos os ensaios
realizados neste trabalho, além do perfil de pH, o potencial probiótico e a viscosidade.
5.4. Caracterização da Bebida Kefir
A Tabela 5.14 apresenta a composição centesimal do produto lácteo selecionado, obtido
a partir dos diferentes processos fermentativos realizados neste trabalho. Segundo Torres et
al. (2000) o teor de umidade foi de 85,87% para o iogurte tradicional utilizando leite,
podendo-se notar que os valores obtidos neste trabalho foram similares. A acidez observada
chegou a 0,96 (g de ácido láctico/100g) para o leite fermentado sem adição de leite em pó e
1,29 (g de ácido láctico/100g) para o leite fermentado selecionado, com remoção, atendendo
ao estabelecido pela legislação brasileira em vigor, que é de 0,60 a 2,0 (g de ácido
láctico/100g) (BRASIL, 2000). O teor de proteína foi cerca de 20% menor ao estabelecido
pela legislação brasileira em vigor, que é de no mínimo 1,2% (BRASIL, 2000), porém
superior ao teor de proteína descrito na literatura. A formulação selecionada obteve teor
mineral semelhante ao encontrado na literatura (GIACOMELLI, 2004).
Depois de selecionada a melhor formulação (45°C, 10% de grãos de kefir e 12,5 de leite
em pó) para obtenção de um produto lácteo probiótico a partir de grãos de kefir, verificou-se o
teor de remoção do colesterol após a fermentação, conforme apresentado na Tabela 5.15.
Pode-se observar que o teor de colesterol no leite integral era de 56,33 mg/L e que, após
o processo fermentativo com grãos de kefir, reduziu para 45,41 mg/L, com uma remoção
parcial de 19,39%. De acordo com a literatura, o resultado obtido foi inferior àqueles
determinados na Iugoslávia, Hungria e na região dos Cáucasos. No processo fermentativo de
24 h, utilizando uma temperatura de 20°C, obteve-se uma redução de 62% e no tempo de 48 h
a 10°C, a redução foi de 84% do teor de colesterol (FARNWORT, 2005).
Estes resultados podem ter tido influência da origem do grão de kefir, já que os
microorganismos presentes nestes grãos podem variar de acordo com a sua origem e o
processo fermentativo. As condições do processo fermentativo e climáticas observadas nos
experimentos
deste
trabalho
diferenciam-se
daquelas
mencionadas
na
literatura
(FARNWORT, 2005). Entretanto, o resultado obtido de remoção do colesterol adiciona ao
produto obtido um potencial de mercado.
28
Tabela 5.14: Comparação da composição centesimal da bebida kefir formulada (12,5%
de leite em pó, 10% grãos de kefir e 45°C) com a literatura.
Constituintes
Produto Lácteo sem
Produto Lácteo
adição de leite em pó
Selecionado
3,45±0,17
3,53±0,03
4,2 – 4,5
0,96±0,04
1,29±0,01
--
89,63±0,21
0,6±0,03
0,81±0,02
1,09±0,42
84,54±0,4
0,82±0,33
0,74±0,01
1,4±0,13
87%
0,74 – 0,8%
3,4 - 4,2%
0,5 – 3,0%
1,64±0,04
1,92±0,06
-
3,43±0,03
4,29±0,08
-
7,87±0,43
12,5±0,59
-
44,53±0,41
65,56±0,26
-
pH
Acidez T.T (g de
ácido láctico/100g)
Umidade (%)
Cinzas (%)
Proteína (%)
Lipídios (%)
Açúcares
Redutores (%)
Açúcares Totais
(%)
Carboidrato (%)
Energia (Kcal/
100g)
Kefira
Fonte: aGiacomelli (2004
Tabela 5.15: Teores de colesterol do leite e da bebida láctea.
Descrição da amostra
Leite integral
Fermentado
Remoção
Remoção
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(%)
56,33
45,41
10,92
19,39
Produto Lácteo
Na Tabela 5.16, observa-se a composição mineral dos produtos lácteos produzidos. O
conteúdo de cinzas (material inorgânico) aumentou com a diminuição da quantidade de leite
em pó incorporada ao produto.
O conteúdo de magnésio, fosfato e potássio não sofreu alterações com a incorporação
do leite em pó, sugerindo que os outros parâmetros apresentavam teores mais elevados destes
elementos e consequentemente o aporte dado, foi significativo. Comparando com o padrão
(Tabela 5.17), esses minerais são semelhantes aos encontrados nos produtos elaborados.
Em relação aos valores para o zinco, segundo a literatura, observa-se similaridade
entre os produtos lácteos obtidos. Entretanto, para iogurte natural, os valores são maiores do
que aqueles encontrados na literatura, diferença essa que se deve à cultura ao tipo de
microorganismo utilizado para fabricação do produto lácteo e, possivelmente, também às
29
características do leite utilizado. Comparativamente aos valores encontrados para iogurte
natural na literatura, os teores de cálcio são semelhantes do encontrado neste trabalho.
Tabela 5.16: Composição mineral dos produtos láteos produzidos.
Minerais
Zn
Ca
Mg
K
Na
P
Fosfato
Carbonato
Sulfato
Amostras µg/g
7
8
9
Padrão
20,52
157,51
13,27
281,26
49,50
10,50
8,50
30,50
8,50
19,75
119,66
13,24
223,15
33,70
11,55
8,33
31,85
1,75
17,98
127,09
13,30
239,10
37,76
9,98
7,56
37,33
8,90
18,62
159,52
12,79
233,00
43,84
10,88
8,93
30,40
8,77
Tabela 5.17 Composição mineral dos produtos láteos encontrados na literatura.
Minerais
Iogurte Natural1
Na
K
Ca
Mg
P
Cu
Fe
Zn
Mn
92,70
184,3
135,5
13,1
0,018
0,047
0,46
Iogurte Natural Desnatado2
65,00
218,00
150,00
16,00
121,00
0,04
0,59
-
Iogurte Natural3
59,70
171,60
115,90
10,20
52,90
0,011
0,34
0,107
0,02
5.5. Avaliação Sensorial
A avaliação sensorial foi conduzida segundo a metodologia descrita no item 4.3.4. Os
produtos lácteos selecionados foram avaliados sensorialmente por provadores, feito um teste
sensorial de diferenças significativas entre as amostras e o padrão, como mostrado na Tabela
5.4 e na Tabela B.1 (Apêndice B).
30
Os experimentos 7, 8 e 9 foram analisados por apresentarem uma viscosidade elevada
e um potencial probiótico satisfatório. Estes produtos foram comparados com iogurte batido
fornecido pela empresa parceira no desenvolvimento deste estudo, a Coopeagril.
5.5.1. Comparação dos produtos lácteos formulados e comerciais
Os produtos lácteos comerciais foram comparados por meio de análise sensorial, e por
análises físico-químicas.
5.5.1.1. Análise e aceitação
A análise de aceitação das bebidas lácteas foi conduzida segundo a metodologia
descrita no item 4.5.3. A Tabela 5.18 e as Tabelas B.2, B.3, B.4 e B.5 do Apêndice B,
apresentam as médias e os dados obtidos na analise sensorial de aceitação, respectivamente,
dos produtos formulados e do comercial.
Pode-se observar que todas as formulações selecionadas foram estatisticamente
semelhantes, não diferindo entre si (p≤0,01), da formulação comparada (padrão), para todos
os parâmetros analisados, aparência, aroma, sabor, textura e impressão global.
Segundo Costa et al. (2009), que realizou análise de aceitação do kefir com adição de
sabor e o natural, o kefir que teve a maior aceitabilidade foi o que não apresentava adição de
outros componentes, ou seja, o kefir de leite integral parece ser o mais aceito pelos
consumidores.
O mesmo resultado ocorreu na pesquisa feita por Yilmaz et al. (2005), que preferiram
o kefir com um sabor ligeiramente ácido alcoólicas.
De acordo com os resultados apresentados, a maioria das notas encontra-se na região
negativa, categorias C, D e E, para intenção de compra, o que já poderia se prever por se tratar
de um produto novo no mercado regional e nacional, pois o mesmo apresenta características
sensoriais diferentes dos produtos lácteos consumidos, tal como a presença de CO2, etanol
resultante da fermentação do leite pelo consórcio microbiano dos grãos de kefir.
31
Tabela 5.18: Notas sensoriais de aceitação para a bebida kefir e o iogurte comercial.
Parâmetros
Padrão
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Aparência
7,57a*
5,60b*
4,67b*
4,90b*
Aroma
7,27a*
5,17b*
4,30b*
5,10b*
Sabor
7,94a*
4,90b*
4,77b*
4,40b*
Textura
8,00a*
4,37b*
5,24b*
4,27b*
Impressão Global
7,87a*
4,87b*
4,67b*
4,70b*
*Médias acompanhadas de letras iguais, na mesma linha, não diferem entre si
significativamente quanto à aceitação dos bolos (p≤0,01).
5.5.1.2. Intenção de compra
A Figura 5.13 e a Tabela B.6 (Apêndice B) mostram os percentuais para a intenção de
compra dos fermentados formulados e do comercial. Por meio da Figura 5.13 percebe-se que
o padrão obteve uma maior preferência entre os provadores, já que atribuíram uma intenção
de compra como certamente compraria. Observa-se que na categoria B o Ensaio 8 se
aproxima do padrão (provavelmente compraria).
Figura 5.13: Percentual de intenção de compra para os fermentados formulados e o
comercial. A – eu certamente compraria, B – eu provavelmente compraria, C – não sei se
compraria, D – provavelmente não compraria e E – certamente não compraria .
32
Capítulo 5
5. CONCLUSÕES Erro! Indicador não definido.
Os resultados obtidos foram bastante satisfatórios, e neste conjunto de dados pode-se
concluir que:
A composição centesimal do leite da região do semi-árido Sergipano apresenta valores
diferenciados ao descrito na literatura.
O estudo da viscosidade no primeiro planejamento mostrou que o aumento da
viscosidade ocorreu com o aumento da concentração de grãos de kefir e a interação entre a
concentração de kefir e de leite em, e que a interação da concentração de leite em pó e
temperatura encontra-se no limiar de significância.
No segundo planejamento, os experimentos apresentaram que a partir de 6 horas de
fermentação, o produto lácteo obtido, já pode ser considerado um probiótico nos ensaios 8, 9,
10 e 11, atendendo os requisitos descritos na literatura e na legislação brasileira. A contagem
de bactérias láticas atingiu valores na ordem de 109 UFC/mL, apresentando crescimento
microbiano suficiente para atuação do mesmo no intestino humano como um alimento
probiótico.
A viscosidade no segundo planejamento experimental foi superior ao encontrado no
primeiro planejamento mostrando que este fator foi influenciado significativamente por todos
os parâmetros (leite em pó, temperatura e interação leite em pó/temperatura). No segundo
planejamento a quantidade de grãos de kefir utilizada foi superior a utilizada no primeiro
planejamento. Com isso mostrou que o leite em pó e a temperatura influenciaram para
obtenção de um produto viscoso.
O produto final obtido obteve teor de proteína e lipídio superior a bebida kefir, estes
resultados pode ter tido influência da origem do grão de kefir, já que os micro-organismos
presentes nestes grãos podem variar de acordo com a sua origem e o processo fermentativo.
Neste trabalho as condições do processo fermentativo e climáticas foram diferenciadas do
mencionado na literatura Entretanto o resultado obtido de remoção do colesterol de 19,39%.
A aceitação do produto lácteo obtido não foi semelhante a do iogurte vendido
comercialmente, entretanto não diferenciou entre as formulações testadas para nenhum dos
parâmetros analisados. Não se pode comparar a bebida kefir com o iogurte vendido no Brasil,
pois ambos os produtos lácteos apresentam características físico-químicas e sensórias
diferentes.
33
O produto final obtido na condição de temperatura de 45°C, 10% de grãos de kefir e
12,5% de leite em pó, possuiu alto potencial probiótico que, m termos sensoriais foi
relativamente aceito, considerando um produto novo e de características sensoriais diferentes
dos produtos lácteos comercializados atualmente e produto com elevada consistência.
34
Capítulo 6
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA
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39
Capítulo 7
APÊNDICES
40
APÊNDICE A: DOSAGEM DE COLESTEROL
A dosagem de colesterol foi determinada a partir da curva de calibração (Tabela A.1 e Figura
A.1), conforme descrito na equação abaixo (equação A.1):
Ccolesterol  ( Área  107093) / 56026) r 2  0,998
(A.1)
em que:
Ccolesterol = concentração de colesterol, expressa em mg/mL
Área = área obtida pelo método da cromatografia líquida expressa (AU/seg)
Tabela A.1. Dados para a obtenção da curva de calibração para a dosagem de
colesterol: área em função da concentração de colesterol
C colesterol ( mg/ mL )
Área (AU/seg)
5,3
262324
10,6
494923
31,8
1285211
53
2049686
74,2
2744282
A Figura A.1 apresenta os dados experimentais em função da concentração de colesterol,
ajustados com a equação.
3000000
Colesterol
Ccolesterol = (Área-107093)/56026
2500000
2
r =0,9989
Área (AU/seg)
2000000
1500000
1000000
500000
0
0
10
20
30
40
50
C colesterol (mg/mL)
Figura A.1: Curva de calibração do colesterol
41
60
70
80
APÊNDICE B: AVALIAÇÃO SENSORIAL
Tabela B.1: Dados sensoriais da diferença do padrão para os produtos lácteos formulados
Ficha
Padrão
Ensaio 7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Soma
Média
8
6
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
7
8
7
9
9
7
7
8
8
8
7
9
7
8
7
9
8
8
6
8
236
7,87
7
4
6
2
6
3
5
4
9
7
3
3
6
6
1
7
5
5
4
6
4
6
4
4
5
7
1
6
5
5
7
4
6
146
4,87
Ensaio 8
6
2
7
4
5
8
1
2
7
7
4
4
5
4
4
9
8
6
1
3
4
1
6
5
4
7
1
5
4
6
6
2
7
140
4,67
42
Ensaio 9
5
7
5
5
3
6
6
4
6
2
9
6
2
5
3
6
6
2
5
5
4
6
5
5
3
6
6
2
2
4
5
7
5
141
4,71
Tabela B.2: Dados sensoriais de aceitação, para o parâmetro de aparência
Ficha
Padrão
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Soma
Média
6
6
8
8
6
7
8
7
8
7
8
9
8
8
7
8
8
9
9
8
7
8
4
8
8
7
8
7
9
8
227
7,57
8
7
5
5
7
5
5
6
8
7
3
7
7
7
5
8
2
2
5
7
6
6
6
8
3
7
3
1
6
6
168
5,60
5
1
7
7
5
5
2
4
6
7
2
2
7
2
5
8
8
3
4
6
3
1
7
8
4
7
1
2
3
8
140
4,67
6
8
5
4
5
5
5
5
3
2
9
6
7
3
2
3
7
5
6
3
5
6
6
2
8
6
6
4
1
4
147
4,90
43
Tabela B.3: Dados sensoriais de aceitação, para o parâmetro de aroma.
Ficha
Padrão
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Soma
Média
6
6
8
7
6
8
7
7
7
8
8
9
7
7
6
6
7
9
7
7
6
7
8
7
9
7
8
6
9
8
218
7,27
7
4
6
2
7
3
5
3
9
8
3
7
5
8
4
3
6
3
2
6
6
6
6
6
3
6
1
6
6
8
155
5,17
5
1
8
7
2
7
2
5
7
9
2
3
4
4
4
8
8
6
1
4
2
1
2
2
3
7
1
2
5
7
129
4,30
8
3
6
5
3
7
5
4
5
2
9
6
7
6
2
4
5
4
6
3
4
7
5
6
8
6
7
4
3
3
153
5,10
44
Tabela B.4: Dados sensoriais de aceitação, para o parâmetro de sabor.
Ficha
Padrão
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
1
9
6
7
6
2
7
6
2
7
3
7
6
7
4
4
7
3
4
1
5
8
5
3
3
6
8
3
7
6
7
8
4
1
6
8
8
4
2
2
9
8
9
7
7
10
8
8
7
2
11
8
2
4
8
12
8
1
2
6
13
9
7
6
7
14
8
6
3
6
15
9
1
5
3
16
7
7
9
4
17
9
6
8
4
18
9
5
6
3
19
8
5
1
4
20
7
7
2
4
21
7
4
5
3
22
8
7
1
5
23
8
5
7
4
24
7
3
5
5
25
9
6
4
2
26
7
7
7
6
27
8
1
1
5
28
7
7
8
2
29
9
4
5
3
30
8
2
7
4
Soma
238
147
143
132
Média
7,93
5,90
4,77
4,40
45
Tabela B.5: Dados sensoriais de aceitação, para o parâmetro de textura.
Ficha
Padrão
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
1
8
6
6
5
2
6
4
5
6
3
9
7
7
5
4
8
3
5
5
5
9
6
5
1
6
8
3
5
5
7
9
4
2
5
8
8
2
4
2
9
8
8
6
4
10
8
7
7
2
11
8
2
4
9
12
5
2
5
6
13
9
7
6
2
14
7
7
4
6
15
7
1
6
4
16
8
8
9
5
17
8
4
8
5
18
9
4
5
5
19
9
2
1
4
20
8
4
6
4
21
7
6
4
3
22
7
7
1
6
23
8
5
8
4
24
9
3
6
4
25
9
1
6
2
26
7
6
7
6
27
9
1
4
6
28
7
5
6
2
29
9
4
4
1
30
9
2
5
4
Soma
240
131
157
128
Média
8,00
4,37
5,23
4,27
46
Tabela B.6: Dados percentuais para a intenção de compra dos provadores.
Formulação
A
B
C
D
E
Padrão
54%
37%
3%
3%
3%
Ensaio 7
0%
13%
44%
33%
10%
Ensaio 8
3%
27%
17%
33%
20%
Ensaio 9
0%
14%
30%
40%
16%
A= Eu certamente compraria, B= Eu provavelmente compraria, C= Não sei se compraria, D= Provavelmente não
compraria e E= Certamente não compraria.
47
APÊNDICE C – LISTA DE DIVULGAÇÃO DOS RESULTADOS
Lista de divulgação dos resultados
Esta dissertação de mestrado foi realizada ao longo de 26 meses de estudo, durante os quais
publicou-se os resultados em diferentes meios de divulgação, como a seguir listadas:
- Trabalhos completos em anais de eventos:
1) GOMES, A. V. U. S; GAMA, J. A; REZENDE, S. B; SANTANA, R. F; PEREIRA, M.M;
LIMA, A. S; SOARES, C. M. F. “Avaliação das Condições de Processo de Iogurte de
Kefir”. XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos – SINAFERM, Natal-RN, 02 a 05 de
agosto de 2009.
2) GAMA, J. A; GOMES, A. V. U. S; REZENDE, S. B; SANTANA, R. F; LIMA, A. S;
SOARES, C. M. F. “ Estudo da viscosidade no processo de obtenção do produto lácteo:
kefir”. IX Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassas – SHEB, Maringá-PR, 23 a 27
de novembro de 2009.
- Resumos simples em anais de eventos:
1) GAMA, J. A; GOMES, A. V. U. S; REZENDE, S. B;SANTANA, R. F; SOARES, C. M. F;
LIMA, A. S. “Desenvolvimento de um Produto Lácteo utilizando grãos de Kefir”. 8
SIMPÓSIO LATINO AMERICANO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS, Campinas - SP,
2009.
2) GAMA, J. A; GOMES, A. V. U. S; REZENDE, S. B;SANTANA, R. F; SOARES, C. M. F;
LIMA, A. S. “Milky product using supreme of kefir: production and development”. Bio Micro
World, Lisboa, 2009.
3) GAMA, J. A; GOMES, A. V. U. S; REZENDE, S. B;SANTANA, R. F; SOARES, C. M. F;
LIMA, A. S. “Estudo do Desenvolvimento de um Produto Lácteo Probiótico e Funcional
utilizando grãos de kefir” XI Semana de Pesquisa – SEMPESq, Aracaju-SE, 2009.
48