Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universitária de Dourados
Programa de Pós- Graduação em Recursos Naturais
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPIA
ÓPTICA VIBRACIONAL EM COMPOSTOS QUÍMICOS E
BIOLÓGICOS
Francylaine Silva de Almeida
Dourados – MS
Março/2012
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universitária de Dourados
Programa de Pós- Graduação em Recursos Naturais
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPIA
ÓPTICA VIBRACIONAL EM COMPOSTOS QUÍMICOS E
BIOLÓGICOS
Francylaine Silva de Almeida
Orientador: Luis Humberto da Cunha Andrade
Co-orientador: Antonio Rogério Fiorucci
“Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação
em Recursos Naturais, área de concentração em
Recursos Naturais, da Universidade Estadual de Mato
Grosso do Sul, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais”.
Dourados – MS
Março/2012
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver.”
Martin Luther King
ii
Dedico este trabalho aos meus avôs FRANCILINA CORREIA CARDOSO, FLORIANO
CARDOSO e MANOEL ALVES DA SILVA, que apesar de não termos tido tempo de ter
um convívio continuo, estarão sempre presentes em minha memória. (in memorian)
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a DEUS todo poderoso, que me acompanha em todos os
momentos. Presente nas minhas vitórias e principalmente nos momentos difíceis.
Aos meus pais Altair e Maria Aparecida, que sempre me apoiaram e me ajudaram, nos
momentos mais complicados. Aos meus irmãos Francielle e Francy Helder, que são meus
companheiros para toda hora. E principalmente por me aguentar, pois sou um ‘osso duro
de roer’ quando quero. AMO MUITO VOCÊS.
As minhas melhores amigas Camila Cristina, Natalia, Enedable, Sorraila e Hevillin, que
estão sempre presentes em minhas lutas.
Aos meus amigos Maryleide e Alex que me acompanham desde graduação, que não foi
fácil, mas estavam sempre presentes, nos momentos de choros por causa de seminários, ou
por bolsas que não eram bem vindas. Vou levá-los sempre em meu coração. Que nossa
amizade continue existindo apesar da distancia, que vira com o tempo.
A uma amiga que me acompanha desde o ensino médio e que está sempre presente, ,
Camila Brum obrigada por toda sua ajuda.
Aos amigos de mestrado Ana Letícia, Débora, Euripedes, Paula, Phamilla, Letícia e Bruno.
Desejo a vocês tudo de bom, que continuemos a nos falar.
Aos meus amigos de laboratório, Carla, Daisy, Renata, Marcio, Fabio, Paulo Renato e
Nicolas.
Ao meu companheiro de pesquisa Eliel, obrigado por me ajudar neste trabalho.
Aos meus sogros Regiane e Aparecido, por todo apoio e pela disponibilidade em me
ajudar. E ao meu cunhado Rafael, pelas copias de graça.
iv
Não posso deixar de agradecer uma pessoa que entrou na vida da minha família mais tarde,
meu padrasto Josemir, por sempre me ajudar quando precisei.
Aos professores Sandro Marcio Lima, Antonio Rogério Fiorucci e Yzel Rondon Súarez.
E principalmente ao Luis Humberto da Cunha Andrade pela paciência de me orientar.
Ao Fundect por ter me financiado nesta empreitada.
E agradeço a uma pessoa em especial, por me escolher para compartilhar uma vida, por seu
companheirismo, amor, carinho, paciência e dedicação. TE AMO MUITO RODRIGO!
v
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................................ viii
ABSTRACT .......................................................................................................................... x
CAPÍTULO 1 -– Introdução .................................................................................................. 1
CAPÍTULO 2 – Revisão Bibliográfica ................................................................................. 2
2.1 - Espectroscopia Vibracional ....................................................................................... 2
2.1.1- Absorção no Infravermelho .................................................................................. 3
2.1.2- Espalhamento Raman ........................................................................................... 5
2.1.3- SERS................................................................................................................... 10
2.2- Técnicas Voltamétricas ............................................................................................. 11
2.3 - Referências Bibliográficas ....................................................................................... 15
CAPÍTULO 3 - Differentiation of neotropical fish species with statistical analysis of
Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy data ............................................ 18
ABSTRACT ..................................................................................................................... 18
3.1 - INTRODUCTION ................................................................................................... 19
3.2 - MATERIALS AND METHODS ............................................................................. 20
3.2.1 - Fish collection.................................................................................................... 20
3.2.2 - Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy (FTIR-PAS) ............. 22
3.2.3 - Statistical analysis.............................................................................................. 22
3.3 - RESULTS AND DISCUSSION .............................................................................. 23
3.4 - CONCLUSION ........................................................................................................ 26
3.5 - ACKNOWLEDGEMENTS .......................................Erro! Indicador não definido.
3.6 - REFERENCES ........................................................................................................ 27
CAPÍTULO 4 - Desempenho de Eletrodos de Pastas de Carbono Modificados com Ácidos
Húmicos na Detecção Voltamétrica de Thiram ................................................................... 29
Resumo ............................................................................................................................. 29
4.1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 29
4.2 - MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 32
4.2.1 - Voltametria de Onda Quadrada (SWV)............................................................. 32
4.2.1.1 - Equipamentos utilizados ............................................................................. 32
4.2.1.2 - Reagentes e preparo das soluções ............................................................... 32
4.2.1.3 - Preparo dos Eletrodos de Pasta de Carbono ................................................ 33
4.2.1.4 - Procedimento Experimental Voltamétrico .................................................. 33
4.2.2 - Espectroscopia Fotoacústica no Infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR-PAS)................................................................................................................... 34
4.3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 34
4.4. - CONCLUSÃO ........................................................................................................ 40
4.5. – REFERÊNCIAS BIBLIO GRAFICA .................................................................... 40
CAPÍTULO 5 - Aplicação da técnica SERS em análises do fungicida Thiram .................. 45
Resumo ............................................................................................................................. 45
5.1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 45
5.2 - MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 47
5.2.1 - Experimentos de absorção óptica no infravermelho médio PAS-FTIR ............ 47
5.2.2 - Experimentos de RAMAN e SERS ................................................................... 47
5.2.3 - Síntese dos substratos para os experimentos de SERS ...................................... 48
5.3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 49
5.4 - CONCLUSÃO ......................................................................................................... 58
vi
5.5 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 58
CAPÍTULO 6 – Considerações Finais ................................................................................ 61
vii
RESUMO
As diferentes técnicas que englobam a espectroscopia vibracional foram empregadas em
diversos materiais. Primeiramente, a técnica de espectroscopia de absorção no
infravermelho com a detecção fotoacústica (FTIR-PAS) foi empregada na diferenciação de
dezenove espécies de peixes do Alto da Bacia do Rio Paraná, baseando-se na diferenciação
da composição química das escamas. A análise canônica discriminante foi utilizada para
indicar os picos de absorção mais relevantes para a diferenciação entre as espécies
estudadas. Foram encontradas diferenças significativas na composição química das
escamas entre as espécies, com wilk’s lambda=5,2 e p<0,001, indicando que a flexão do
CH em 1396 cm-1 pode ser utilizada como bioindicador deste grupo de espécies. As
espécies foram categorizadas em 4 grupos de acordo com o habitat, sugerindo que o CH
esta relacionado com as características biológicas de cada espécie. Este procedimento
também pode ser utilizado para complementar estudos evolutivos. O segundo trabalho
utilizou a mesma técnica no infravermelho para a análise química de diferentes ácidos
húmicos para posterior comparação com seu desempenho como modificador de eletrodos
de pasta de carbono aplicados na detecção voltamétrica do fungicida Thiram. Foram
analisados o desempenho de ácidos húmicos extraídos naturalmente (AH-G e AH-D) e
ácido húmico comercial (AH-C) para detecção do agrotóxico em diferentes pHs. O
desempenho foi comparado com eletrodos sem modificações. O eletrodo que teve melhor
desempenho foi o AH-G, sendo este natural extraído do Guiraí. Este eletrodo além de se
manter constante nos diferentes pH, obteve corrente de pico (Ip= 5,9) maior que o sem
modificação (Ip=3,7) com uma boa resolução do pico anódico. A correlação com as suas
características espectroscópicas revelaram que este ácido húmico apresenta menores
índices de ácidos carboxílicos do que os demais, assim esta característica pode ser
atribuída ao seu melhor desempenho na detecção voltamétrica do Thiram. O último
trabalho analisou as vibrações do fungicida Thiram obtidas pelas técnicas FTIR-PAS e
Raman para comparação com os modos vibracionais gerados pela técnica SERS, a fim de
aperfeiçoá-la, e assim desenvolver uma metodologia simples e eficaz para detecção de
agrotóxicos. Para obtenção dos espectros SERS do Thiram foram confeccionadas
superfícies nanometricamente rugosas de prata, sendo obtidas através da oxidação do
nitrato de prata em superfícies de cobre. As análises revelaram que o espectro SERS tem
viii
vários picos semelhantes aos das demais técnicas. Apresentando diferenças significativas
quando comparado com o Raman, revelando picos que são provenientes das ligações
formadas entre a superfície de prata e o agrotóxico. Além disso, existem vários picos que
são amplificados no SERS devido à ressonância plasmo-ionica favorecida pela superfície.
Analisando diferentes tempos de formações das nanoestruturas em comparação com os
espectros SERS, observa-se que para o tempo de 15s obtém os melhores sinais SERS.
Assim, as imagens MEV revelam que isso se deve a formação de nanofolhas nestas
superfícies que favorecem a amplificação do sinal Raman.
Palavras-chave: FTIR-PAS; Raman; SERS; escamas de peixe; ácido húmico; Thiram.
ix
ABSTRACT
The different techniques which include vibrational spectroscopy were employed in various
materials. First, the technique of infrared absorption spectroscopy with photoacoustic
detection (FTIR-PAS) was employed in the differentiation of nineteen species of fish from
the Upper Paraná River Basin, based on the differentiation of the chemical composition of
the scales. Canonical discriminate analysis was used to indicate the absorption peaks are
most relevant to the differentiation between the species. There were significant differences
in the chemical composition of scales between species, with Wilk's lambda = 5.2 and p
<0.001, indicating that the bending of CH in 1396 cm-1 can be used as a bioindicator
species of this group. The strains were categorized into four groups according to the
habitat, suggesting that CH is related to the biological characteristics of each species. This
procedure can also be used to complement evolutionary studies. The second study used the
same technique in the infrared for chemical analysis of different humic acids to be
compared with its performance as a modifier of carbon paste electrodes applied to the
voltammetric detection of the fungicide Thiram. We analyzed the performance of humic
acids naturally drawn (AH-C and AH-G) and commercial humic acid (AH-C) for detecting
the pesticide at different pHs. The performance was compared with unmodified electrodes.
The electrode that performed best was the AH-G, which is extracted from Guiraí River.
This electrode also remains constant at different pH, obtained peak current (Ip = 5.9) than
the unmodified (Ip = 3.7) with a good resolution of the anodic peak. The correlation with
their spectroscopic characteristics showed that humic acid has lower rates of carboxylic
acids than others, so this feature can be attributed to its better performance in voltammetric
detecting of Thiram. The last study analyzed the vibrations of the fungicide Thiram
obtained by FTIR-PAS techniques and for comparison with the Raman vibrational modes
generated by the SERS technique in order to perfect it, and so develop a simple and
effective for detection of pesticides. To obtain the SERS spectrum of Thiram
nanometricamente rough surfaces were made of silver is obtained by oxidation of the silver
nitrate on copper surfaces. The analysis revealed that the SERS spectrum has several peaks
similar to those of other techniques. Significant differences compared with the Raman peak
revealing that are derived from the linkages formed between the surface of silver and
pesticides. Furthermore, there are several peaks that are amplified due to resonance in the
SERS Plasmodium favored by ionic surface. Looking at different times formation of
x
nanostructures in comparison with the SERS spectra, it is noted that for obtaining the time
of 15 seconds the best signal to SERS. Thus, SEM images reveal that this is due to
formation of nanosheets on these surfaces which favor the amplification of the Raman
signal.
Keyworks: FTIR-PAS; Raman; SERS; scale of fish; humic acid; Thiram.
xi
CAPÍTULO 1 -– Introdução
A espectroscopia vibracional é uma técnica que fornece informações sobre a estrutura
molecular do material, por meio dos níveis vibracionais das moléculas presentes no mesmo.
As vantagens desta técnica, além das informações sobre a estrutura molecular, incluem o
curto tempo utilizado para preparo da amostra, estimados em alguns minutos, sendo que
algumas não necessitam de preparo. A utilização de apenas pequenas quantidades do material
em estudo, também é uma dos seus benefícios. Além disso, em muitos casos, a amostra
utilizada não é destruída nas análises.
Neste trabalho utilizou-se das técnicas vibracionais para caracterização e análise de
diferentes materiais, cada um com suas particularidades. Assim, esta pesquisa divide-se em 4
partes. A primeira se destina a descrever, de forma sucinta, as diferentes técnicas empregadas
ao longo deste trabalho. As demais estão em forma de artigos, os quais abordam a
importância, os métodos utilizados, e os dados adquiridos em cada pesquisa. Assim o capítulo
2 intitula-se “Differentiation of neotropical fish species with statistical analysis of Fourier
Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy data”, o qual teve como objetivo identificar
diferenças entre espécies de peixes utilizando a técnica de infravermelho, sendo este
submetido à revista Applied Spectroscopy. O capítulo 3 intitula-se “Desempenho de
Eletrodos de Pastas de Carbono Modificados com Ácidos Húmicos na Detecção Voltamétrica
de Thiram”, utilizou-se da técnica de Voltametria para a detecção do fungicida Thiram e a
espectroscopia no Infravermelho como meio de caracterização dos ácidos húmicos, para
posterior correlação com os dados da Voltametria. E, por último, o capítulo 4 intitulado
“Aplicação da técnica SERS em análises do fungicida Thiram”, desenvolve um meio de se
utilizar a espectroscopia SERS como ferramenta de caracterização de agrotóxicos.
1
CAPÍTULO 2 – Revisão Bibliográfica
2.1 - Espectroscopia Vibracional
As técnicas de espectroscopia óptica estudam os diferentes mecanismos da interação
da radiação eletromagnética com a matéria, dentre estas a espectroscopia de espalhamento
Raman e Absorção na região do Infravermelho são utilizadas para analisar os tipos de
vibrações moleculares, que são específicos para cada molécula. Estas técnicas geram
informações sobre a composição e estrutura química de um material, por isso são muito
utilizadas na caracterização e identificação de amostras, muitas vezes desconhecidas.
(MENDHAM et al., 2002)
A espectroscopia vibracional fundamenta-se na ideia das moléculas serem
constituídas de átomos e possuírem certa massa, e que estes estão conectados entre si por
ligações elásticas. Desta forma, eles podem executar movimentos, ou seja, vibrar de acordo
com seu grau de liberdade vibracional. A quantidade de vibrações que cada molécula pode
executar é definida pela quantidade de átomos envolvidos. Assim se uma molécula possui n
átomos, então esta molécula possuirá 3n-5 vibrações, se for uma molécula linear. Caso
contrário, terá 3n-6 vibrações. Esta diferença está no fato das moléculas lineares não
possuírem vibração rotacional em torno do seu eixo. Porém não é somente isso que define um
espectro vibracional, que depende também das massas dos átomos envolvidos, do arranjo
geométrico da molécula e das forças das ligações químicas.
As moléculas podem vibrar de várias formas como no exemplo representado na
Figura 1.
2
Figura 1 - Representação dos modos vibracionais de uma molécula como, por exemplo, CH 2, NH e CO
(a) Deformação angular, tipo tesoura; (b) deformação angular, tipo sacudida; (c) deformação angular simétrica;
(d) deformação angular; (e) Estiramento simétrico; (f) Estiramento assimétrico; (g) Estiramento. Os sinais + e –
representam movimentos perpendiculares ao plano do papel.
A espectroscopia no Infravermelho e a Raman são as técnicas vibracionais mais
utilizadas para o estudo dessas vibrações. Estas técnicas são complementares, pois
dependendo da natureza da vibração esta pode ser ativa ou proibida para o espectro
Infravermelho ou Raman sendo isso discutido no item a seguir.
2.1.1- Absorção no Infravermelho
A radiação infravermelha corresponde a região de 14000 a 200 cm-1 do espectro
eletromagnético, sendo que a região compreendida de 4000 a 400 chamada de infravermelho
médio. Esta radiação foi primeiramente observada em 1800 e, somente no século XX,
despertou o interesse no meio cientifico, pois foi quando Abney e Festing obtiveram o
espectro de absorção de mais de 50 compostos. Hoje esta técnica é uma das mais valiosas
para a caracterização e identificação de materiais. (BARBOSA, 2008)
A espectroscopia no Infravermelho (IR- do inglês infrared) é o estudo da interação da
radiação infravermelha com a matéria. A absorção no IR ocorre quando uma das freqüências
da radiação incidente é igual a uma das transições entre níveis vibracionais da molécula.
Porém, esta interação deve gerar uma modificação no momento de dipolo da molécula, se
isso não ocorrer a molécula não absorverá a radiação e não será detectada no IR. Por isso que
nem todas as moléculas têm vibrações no infravermelho.
Para exemplificar esse efeito do momento de dipolo pode-se considerar os átomos de
uma molécula como partículas carregadas. A carga de uma molécula pode mudar durante
3
uma vibração molecular, pois neste caso ocorre a mudança na geometria da molécula
podendo afetar a redistribuição de elétrons. Na molécula de ácido clorídrico (HCl), o átomo
de cloro tem eletronegativida maior, assim tem excessos de carga negativas, e o hidrogênio
tem excesso de carga positivas. Assim a ligação de HCl é considerada um dipolo. Deste
modo, quando a luz incide nesta molécula o campo elétrico oscilante irá exercer sobre o
átomo positivo uma força em um sentido e sobre o átomo negativo uma forca no sentido
contrário. Ocorrendo a mudança no dipolo, assim a vibração nesta molécula é IR ativa.
(COLTHUP et al.)
A molécula de hidrogênio (H2) tem um centro de simetria, quer dizer que para cada
átomo de hidrogênio existe outro em sentido oposto e equidistante. Deste modo este arranjo
garante que a carga positiva coincida com a negativa exatamente no centro da molécula,
assim o momento de dipolo é zero. Sendo que em sua vibração é mantido o centro de simetria
de modo que o momento de dipolo não mude. Portanto, essa vibração é inativa em IR., pois o
campo elétrico não pode atrair os dois hidrogênios envolvidos em direções opostas, como é
exigido em vibrações diatômicas. Assim, moléculas iguais ao H2, ou seja, moléculas
diatômicas mononucleares, não têm vibrações no IR. (COLTHUP et al.)
Isso ocorre também com os quatros átomos de hidrogênio do metano quando vibram
simetricamente, pois esta vibração não resulta em variação no dipolo e assim não absorve no
IR, assim como as vibrações simétricas dos C  C e C  C de grupos alquenos e alquinos
(BARBOSA, 2008).
A espectroscopia IR é geralmente acoplada com outra técnica para detecção, a qual
depende do material a ser analisado como por exemplo, a de refletância total atenuada (ATR)
e a Fotoacústica (PAS). Esta última é muito utilizada para caracterização de materiais sólidos
opacos.
A técnica fotoacústica (PAS- do inglês photoacoustic) baseia-se no efeito observado
pela primeira vez em 1880 por Alexandre Graham Bell. Este efeito consiste em irradiar a
amostra,onde suas moléculas vibram gerando ondas de calor, que perturbam o meio no qual a
amostra esta inserida. Assim a vibração é detectada por um microfone sensível e
transformadas em sinal eletrônico, como exemplificado na Figura 2.
4
Figura 2 – Representação de uma célula fotoacústica. A radiação modulada incidente na amostra gera
ondas de calor que perturbam o meio gerando sinal captado pelo microfone.
A espectroscopia IR acoplada com a detecção PAS vem sendo muito utilizadas para a
caracterização de uma vasta gama de materiais. Na literatura encontram-se diversos estudos
com estas técnicas juntas, como por exemplo, em análise de fungos (GORDON et al., 1997),
proteínas (SADLER et al., 1984), polímeros (DELPRAT & GARDETTE, 1992)
2.1.2- Espalhamento Raman
O espalhamento Raman ocorre quando um meio é excitado em um comprimento de
onda específico de forma que uma pequena parte da luz seja espalhada de forma inelástica, ou
seja, a radiação espalhada possui comprimentos de ondas diferentes da fonte de excitação,
que são dependentes da estrutura química das moléculas responsáveis pelo espalhamento.
Esse efeito foi postulado primeiramente em 1923 por Smekal, mas somente em 1928 que foi
observado experimentalmente por C. V. Raman quando percebeu que a luz espalhada era
diferente da fonte de excitação (SMITH & DENT, 2005). Por esta descoberta Raman ganhou
o Prêmio Nobel de Física em 1931, e o efeito leva seu nome.
O espalhamento ocorre quando a luz interage com as moléculas induzindo uma
modificação em sua polarizabilidade. Em termos de energia pode-se dizer que a molécula
passa para um estado de energia virtual, o qual não é estável e a molécula volta a seu estado
fundamental emitindo um fóton de radiação.
A Figura 3 representa esta interação com a molécula. As linhas 1 e 2 representam os
estados vibracionais da molécula, sendo 1 o estado fundamental, o qual é de menor energia, e
o 2 um estado excitado. O estado X é um estado virtual, que são criados quando o feixe de
luz interage com os elétrons e causa uma variação em sua polarizabilidade. Assim a energia
desses estados é determinada pela fonte de luz utilizada. Esta figura representa os tipos de
5
espalhamentos que podem ocorrer em uma molécula. Quando a molécula absorve um fóton
incidente é elevado ao estado virtual e imediatamente retorna ao estado fundamental,
emitindo um fóton espalhado com mesma freqüência (  ) do incidente, este espalhamento é
chamado de espalhamento elástico (ou Rayleigh), este efeito ocorre com maior incidência por
isso, este sempre será mais intenso (COLTHUP et al.). O espalhamento inelástico, chamado
de Raman, é resultado da perda de energia devido às vibrações moleculares, e pode ocorrer
de duas maneiras, uma quando a molécula está no estado fundamental e ao absorver a energia
é elevada para um estado virtual e ao espalhar decai para o estado 2, ou seja, espalha-se com
freqüência menor do que a incidente. Este tipo de espalhamento é chamado de Stokes. A
segunda maneira é quando a molécula já está no estado excitado 2 por influencia de energias
térmicas, por exemplo, e é elevada ao estado virtual, e assim ao espalhar decai ao estado
fundamental, espalhando assim com uma freqüência maior que a incidente, esse processo é
chamando de Anti-Stokes.
Figura 3 - As diversas interações da radiação com a molécula que gera vibrações. (adaptado de
COLTHUP et al.)
6
É bom salientar, que as mesmas linhas geradas pelo Stokes são geradas no AntiStokes, mas em energias opostas em sinal, como representado na Figura 4, a qual mostra o
espectro de espalhamento do tetracloreto de carbono (CCl4), excitado em 488 nm. A
temperatura ambiente, as linhas geradas no espalhamento Anti-Stokes são menos intensas que
os Stokes, por isso normalmente se utiliza somente as linhas Stokes. Vale salientar que a
intensidade do Anti-Stokes é aumentada conforme se aumenta a temperatura, pois assim
ocorrerão mais moléculas no estado excitado. (SKOOG et al., 2002)
Figura 4 - Espectro do CCl4 excitado em 488nm. Observa-se todas as linhas do espalhamento gerado
por esta molécula. (adaptado de SKOOG et al., 2002)
Os espectros Raman são independentes do comprimento de onda de excitação, assim
o espectro mostrado na Figura 4 será o mesmo qualquer que seja sua excitação (BOWEN et
al., 2010; FROST et al., 2007; KORNATH et al.,2003; SHARMA et al., 2011).Os resultados
fornecidos pelo espalhamento Raman se assemelham aos da Absorção Infravermelha por
resultar também em alterações vibracionais na molécula. Porém há diferenças suficientes
entre estas técnicas, que faz com que sejam complementares e não competitivas. A principal
diferença está na forma de interação com a molécula, enquanto no espalhamento Raman deve
ocorrer uma mudança na polarizabilidade da molécula, no Infravermelho deve gerar uma
variação no momento de dipolo. No entanto, essas técnicas dependem dos mesmos modos
vibracionais da molécula. Por isso, podem existir vibrações que são ativas nas duas técnicas,
porém há outras que são ativas no Raman e não são no Infravermelho, e vice-versa. Por isso
que existe a complementaridade das técnicas.
7
A maioria das vibrações moleculares é tanto Raman ativa quanto Infravermelho ativo
como, por exemplo, as do dióxido de enxofre (SO2). Porem existe aquelas que não são
Raman ativa e são Infravermelho ativo, e vice-versa. . Por exemplo, a molécula de dióxido de
carbono (CO2) em seu modo vibracional de estiramento simétrico não ocorrem variações de
momento de dipolo (Infravermelho inativo), já sua polarizabilidade varia, pois a distorção das
ligações dos átomos de oxigênios fica mais fácil à medida que elas esticam e mais difícil
quando elas encolhem, e assim é Raman ativa. Porém quando esta molécula vibra em modo
assimétrico seu momento de dipolo varia e se torna Infravermelho ativo, por outro lado, à
medida que a polarizabilidade da molécula aumenta quando um dos oxigênios se estica-se, de
outro esta diminui quando o outro oxigênio se contrai, assim nenhuma variação efetiva
ocorre. Deste modo, a vibração assimétrica do dióxido de carbono é Raman inativo. A Figura
5 representa estas diferentes vibrações do dióxido de carbono e o que acontece com o
momento de dipolo (  ) e com sua polarizabilidade (  ). Quando a variação do momento de
dipolo em relação a uma coordenada é zero (  / r  0 ) a vibração correspondente não
aparece no espectro IR, e quando a polarizabilidade é zero (  / r  0 ) esta não aparecera no
Raman.
8
Figura 5 – Representação das vibrações e do momento de dipolo e da polarizabilidade. (adaptado de SMITH &
DENT, 2005)
Como o IR e o Raman são técnicas complementares, em certos momentos o IR leva
vantagem sobre o Raman principalmente por se obter uma intensidade maior no sinal. Porém,
o Raman leva vantagens na análise de soluções aquosas, pois a água não interfere na detecção
Raman, como no IR.
Outra interferência na obtenção de espectros Raman é a fluorescência. Esse processo
que ocorre nas moléculas quando são irradiadas por luz visível induzindo luminescência que
sobrepõe ao espectro Raman, e assim as vibrações das moléculas não são evidenciadas,
devido à intensidade de luminescência ser muitas vezes superior ao sinal Raman. Por isso, os
pesquisadores desde que este efeito foi descoberto tentam sua minimização, varias técnicas já
foram desenvolvidas com sucesso. Uma destas técnicas foi descoberta recentemente e está
em desenvolvimento, que é a chamada de espalhamento Raman por intensificação de
superfície (SERS- do inglês Surface Enhanced Raman Spectroscopy), que será discutida
9
adiante. Ainda assim a técnica Raman ainda é muito utilizada, como para análises em
sistemas celulares (RUSCIANO et al., 2010), em aminoácidos (ZHU et al., 2011), em estudos
de pele (VRABIE et al., 2007), análises de câncer (TU et al., 2011), estudos de vidros
(OIKONOMOU et al., 2008), entre outros.
2.1.3- SERS
A técnica SERS (do inglês surface enhanced Raman Spectroscopy) consiste na
amplificação do sinal Raman devido à interação da amostra com uma superfície
nanometricamente rugosa ou com nanopartículas metálicas. Este efeito foi descoberto ao
acaso em 1974, quando Fleischmann e outros estudavam uma maneira de aumentar a área
superficial eletroquimicamente, através da aplicação de vários ciclos de óxido-redução em
um eletrodo, permitindo uma maior adsorção das moléculas. Desta forma utilizaram uma
solução aquosa de piridina e aplicaram vários ciclos em um eletrodo de prata, e obtiveram um
espectro Raman da piridina com excelente sinal/ruído. Na época eles consideraram que este
efeito ocorreu por causa do aumento da superfície de contato do eletrodo. Porem, em 1977 foi
descoberto que o fator de intensificação observado era muito maior que o esperado pelo
simples aumento de área. No caso da piridina observou-se uma intensificação de 106
comparado com a técnica Raman sendo que se a intensificação fosse somente devido a área
observar-se-ia uma intensificação de apenas duas ordens de grandeza. Assim estava
descoberto um novo efeito. (FARIA et al., 1999)
Desde a descoberta do efeito SERS muitos modelos teóricos foram propostos, e ainda
não se tem uma teoria que descreva fielmente este efeito. De todos os modelos propostos
apenas dois foram bem aceitos até hoje, que são chamados de teoria do aumento
eletromagnético (EME) e do químico (CE). O EME é dependente das características da
superfície utilizada, enquanto o CE envolve as mudanças que ocorre quando o analito é
absorvido. Cada autor utiliza a teoria que melhor se encaixe em suas descobertas. O problema
de interpretação deste efeito está em entender como uma ligação ou adsorção de uma
substância em um material metálico pode intensificar suas vibrações moleculares. O campo
de investigações sobre uma teoria única ainda está bem ativo. (RU & ETCHEGOIN, 2009)
Devido a probabilidade do espalhamento Raman ocorrer ser muito menor do que o do
espalhamento elástico, seu sinal é fraco. Assim a descoberta do SERS, o qual compensa esta
baixa intensidade, representa um grande avanço na pesquisa de materiais. Além disso, foi
evidenciado mais tarde que o SERS não apenas amplifica o sinal do espalhamento, como
10
também inibe a luminescência gerada por alguns materiais quando excitado com luz na faixa
do visível. Esta é uma das principais razões de se utilizar esta técnica.
O SERS gera uma resposta de ressonância do substrato, estes, ao contrário do Raman
clássico, são dependentes do comprimento de onda de excitação. Um substrato que aumente o
sinal Raman em uma determinada faixa de comprimento de onda, pode não revelar as
mesmas vantagens em outro comprimento de onda. Assim, um substrato excitado com um
comprimento de onda errado pode se revelar um substrato SERS ruim para o sinal Raman. A
maioria dos substratos opera no visível e no infravermelho (aproximadamente 400 a 1000
nm), sendo esta escala típica para o espalhamento Raman. Ainda para um substrato ser SERS
ativo sua estrutura deve ser nanometrica, entorno de 100 nm. (RU & ETCHEGOIN, 2009)
As estruturas de ouro, prata e cobre são as mais utilizadas para fazer substrato SERS,
isso porque eles têm as propriedades ópticas certas para obter-se ressonâncias na faixa do
visível e do infravermelho (CAI et al., 1998; HAO et al., 2010; KUDELSKI et al., 1998;
SANCI & VOLKAN, 2009; YAO et al., 2004; ZHANG et al., 1998). O SERS está ainda em
grande desenvolvimento, e existem varias pesquisas sobre este assunto que envolve o
tamanho de partícula ideal e as melhores estruturas.
2.2- Técnicas Voltamétricas
As técnicas voltamétricas fazem parte de um grupo de métodos eletroanalíticos, que
baseiam-se nas propriedades elétricas para analisar uma solução. Essa técnica utiliza medidas
de corrente em função do potencial, feitas durante a eletrólise da amostra em uma cela
eletroquímica. O gráfico gerado é chamado de voltamograma. (HARRIS, 2011)
Figura 6 - Cela voltamétrica consistem em 3 eletrodos: eletrodo de trabalho, eletrodo de referencia, e contraeletrodo, submersos Na solução contendo o analito.(adaptado de Aleixo, 1996)
11
A cela eletroquímica é constituída de três eletrodos imersos na solução-amostra, como
mostrado na Figura 6. O primeiro eletrodo é chamado de eletrodo de trabalho ao qual um
potencial é aplicado e variado em função do tempo. Este eletrodo tem dimensões pequenas
para que sua polarização seja favorecida, por isso também é chamado de microeletrodo. O
segundo é o eletrodo de referência, no qual o potencial é mantido constante. Geralmente se
usa eletrodos de calomelano saturado ou de prata/cloreto de prata. O terceiro é chamado de
contra-eletrodo que serve simplesmente para conduzir eletricidade da fonte de sinal através
da solução para o eletrodo de trabalho, que geralmente é um fio de platina ou um poço de
mercúrio. (SKOOG et al., 2002)
Figura 7 -Representaçao de um eletrodo de trabalho, o qual é formado por um disco condutor, um
terminal elétrico e um tubo de material inerte. (adaptado de SKOOG et al., 2002)
O eletrodo de trabalho é onde ocorrem as reações de oxido–redução, estes tem
diversos tamanhos e formatos, e geralmente é um disco pequeno de um condutor que é
prensado em um tubo feito de material inerte no qual se tem um fio para contato com o disco
(Figura 7). Os potenciais que podem ser aplicados a estes eletrodos variam com o tipo de
material e com o tipo de solução o qual estará imerso. A Figura 8 mostra os intervalos de
potenciais que alguns tipos de eletrodo podem variar, de acordo com as soluções nas quais
estão imersos.
12
Figura 8- Intervalos de potencial para diferentes eletrodos e amostras. (adaptado de SKOOG et al.,
2002)
Existem na voltametria vários tipos de sinais de excitação de potencial (Figura 9).
Sendo que os tipos de voltametria variam de acordo com o tipo de sinal de excitação.
Figura 9 - Tipos de sinais de excitação usados em voltametria.(a) varredura linear; (b) pulso diferencia;
(c) triangular. O nome da voltametria se refere ao mesmo do sinal. (adaptado de SKOOG et al., 2002)
Uma técnica muito utilizada é a chamada voltametria de onda quadrada, que surgiu
em 1957 pelos estudos de Baker. Esta técnica baseia-se no sinal de excitação de onda
quadrada (Figura 10). Este sinal é a junção de duas ondas de excitação, uma de degrau na
qual o potencial é crescente, e a outra é um ciclo quadrado de potencial. Essa técnica é muito
13
mais sensível e tem melhor resolução, por isso é indicada para estudos de soluções com
baixas concentrações. (DICK, 1997)
Figura 10- Sinal usado na voltametria de onda quadrada. Junção de duas ondas, uma de degrau, e a
outra em um trem de pulsos.
A Figura 11 (de um voltamograma) mostra o gráfico da corrente (I) pela voltagem (E)
aplicada ao eletrodo de trabalho. Neste gráfico analisa-se a corrente de pico (Ip), que é
proporcional a concentração da espécie eletroativa (que se oxida ou reduz sobre o eletrodo de
trabalho) e o potencial de pico (Ep), que é característico para cada espécie de interesse em
uma amostra. Cada espécie tem um potencial característico no qual se oxida ou reduz sobre
um tipo de eletrodo e meio (aquoso, por exemplo), e a largura de meio pico (W 1/2), estes
parâmetros são importantes também
a determinar a resolução do voltamograma, que a
divisão do Ip pela largura W1/2. Assim neste gráfico observa-se que o voltamograma c não
terá uma boa resolução por sua Ip é baixa, e sua W1/2 é grande. Esta técnica possui variadas
aplicações analíticas, dentre as quais podem ser citados o estudo da cinética e mecanismos
das reações químicas.
14
Figura 11 - Exemplo de alguns voltamogramas e a forma de se obter a corrente de pico (Ip) e a largura
de meio pico (W1/2) a partir da linha de base (em vermelho), estes parâmetros juntos darão a resolução do
pico.(adaptado de PEDROSA et al., 2003)
2.3 - Referências Bibliográficas
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17
CAPÍTULO 3 - Differentiation of neotropical fish species with statistical
analysis of Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy data
F. S. Almeidaa, S. M. Limaa, L. H. C. Andradea and Y. R. Súarezb
a
Grupo de Espectroscopia Óptica e Fototérmica, Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais,
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, C.P. 351, Dourados, MS, Brazil.
b
Laboratório de Ecologia, Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais, Universidade Estadual de
Mato Grosso do Sul, C.P. 351, Dourados, MS, Brazil.
ABSTRACT
Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy (FTIR-PAS) was applied to nineteen
fish species in Brazil’s Upper Paraná River basin to identify differences in the structural
composition of their scales. To differentiate the species, a canonical discriminant analysis
was used to indicate the most important absorption peaks in the mid-infrared region.
Significant differences were found in the chemical composition of scales among the studied
fish species, with Wilk's lambda = 5.2 × 10-6, F(13,18,394) = 37.57, P <0.001, indicating that CH
bending at 1396 cm-1 can be used as a biomarker of this species group. The species could be
categorized into four groups according to phylogenetic similarity, suggesting that the CH
1396 cm-1 absorbance is related to the biological traits of each species. This procedure can
also be used to complement evolutionary studies.
Keywords: Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy, Neotropical fish biomarker, Canonical
discriminant analysis.
18
3.1 - INTRODUCTION
Underlying the diversity and patterns of biological trait occurrence, the flow study is
multi-scale, including individuals, populations and independent lineages. It is well known
that the expression of traits (morphological, molecular or physiological) in different
individuals, populations or lineages, depends on the degree of common origin. Moreover,
during the evolutionary process, different individuals and species perceive the environment in
spatial and temporal views, resulting in independent changes from their common origin.
These two aspects, due to common origin and unrelated changes, determine the necessity of
understanding the evolution of biological traits in a comparative context.1
In the last few years, multivariate morphometric techniques have been used to detect
and interpret differences in body shape with respect to fish size, allowing for a better
elucidation of the relationship between individuals and groups.2 Morphological differences
can also be used to indicate intraspecific variation among geographical regions3 and
osteological differences, which are usually used in fish phylogenetic studies. Nevertheless,
complementary methods for the study of biological systems must be applied to better explain
changes in traits.
Recently, spectroscopic techniques have been used for analyzing different biological
systems.4, 5 These techniques involve measuring optical absorption in the visible, near- and
mid-infrared regions. When applied in the mid-infrared range, spectroscopic methods allow
for the distinction of chemical species through the specific frequencies and intrinsic
vibrational modes of each chemical bond. This technique allows the identification, or
fingerprinting of each chemical bond in a sample.
Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy (FTIR-PAS) is a useful
technique that can be applied to different systems due to the versatility of its photoacoustic
detection form, which allows optical absorption analysis for materials opaque in the infrared
region. This technique, as well as conventional infrared optical absorption spectroscopy,
19
allows the qualitative and quantitative identification of chemical functional groups. It has
been applied in fungi,6 bacteria7,
8
and in another approach, in the identification of some
diseases, such as diabetes.9 More recently, our group has used FTIR-PAS combined with
multivariate analysis in different biological systems. This combined methodology
demonstrated the ability to discriminate the castes and sex of ants in the same colony.10 It was
also able to distinguish different ant species by measuring the cuticular hydrocarbon level,11
and was used to diagnose the soy bean rust (Asian rust contamination) on soy leaves caused
by the fungi Phakopsora pachyrhizi.12 In another application, transgenic and conventional
soybean pairs were distinguished in a comparative analysis by measuring the grain directly.13
Despite a number of studies using FTIR-PAS, its application to animal biodiversity is
rare. In this paper FTIR-PAS was combined with canonical discriminant analysis to identify
differences between fish species and the differences correlated with the phylogenetic
proximity among them.
3.2 - MATERIALS AND METHODS
3.2.1 - Fish collection
Fish were collected in the Upper Paraná River basin, between the Southeast and West
Central regions of Brazil. The nineteen collected species, together with their families and
quantities, are listed in Table I. A total of 143 fish were captured. For the infrared analysis,
three scales of the humeral portion were removed from each fish, a total of 429 specimens.
Before the infrared experiments, scales were desiccated in a stove under vacuum for at least
12 hours.
20
Table I: Species, taxonomic position and number of individuals analyzed.
Species
Number of individuals
Order Characiformes
Family Characidae
Sub-family Aphyocharacinae
Aphyocharax dentatus
08
Sub-family Cheirodontinae
Serrapinnus notomelas
10
Serrapinnus sp.
08
Insertae sedis species
Astyanax altiparanae
10
Astyanax fasciatus
05
Astyanax paranae
06
Bryconamericus stramineus
08
Hemmigramus marginatus
10
Moenkhausia forestii
09
Piabina argentea
05
Family Curimatidae
Cyphocharax modestus
05
Steindachnerina brevipinna
05
Family Crenuchidae
Characidium zebra
07
Family Lebiasinidae
Pyrhulina australis
06
Family Parodontidae
Parodon nasus
06
Family Prochilodontidae
Prochilodus lineatus
10
Order Cyprinodontiformes
Family Poeciliidae
Phalloceros harpagos
05
Phallotorynos pankalos
10
Order Perciformes
Family Cichlidae
Crenicichla britskii
10
21
3.2.2 - Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy (FTIR-PAS)
FTIR-PAS was performed using a spectrophotometer Nexus 670 Thermo Nicolet with
the photoacoustic detection in the spectral range from 4000 to 400 cm-1, covering the region
known as the fingerprint (1500 and 400 cm-1). Throughout the experiment, the
spectrophotometer was purged with dry air to remove any water vapor. The photoacoustic
cell was purged with helium gas. A reference carbon black was used to collect the spectrum
of the infrared source for standardization. New reference spectra were taken for each of the 9
fish spectra. The spectra were obtained with 8 cm-1 resolution and 128 scans for each sample.
3.2.3 - Statistical analysis
The existence of some inter-species difference was verified using a discriminant
function analysis, in which the selected spectral peak intensities were used as variables. This
is a highly efficient method and is used to find a linear combination of variables that best
explain the differentiation between analyzed species.14
Phylogeny of species between the studied fish was obtained by comparing taxonomic
distance. In this case, if two species are of the same genus, then a distance of 1 is assigned to
this species pair. If both are of different genus, but the same sub-family, a distance of 2 is
assigned to the species pair, and so on. The phylogeny adjustment was obtained following the
procedures described by Buckup et al.15 and Mirande16 to incorporate recent information
about complex taxonomic groups.
The similarity pattern of species determined by the mid-infrared spectra was
represented by a dendrogram, using a Mahalanobis distance to measure the difference among
analyzed species and Unweighted Pair Group Method Average (UPGMA) as connection
method. The cophenetic correlation was used as the measurement of the dendrogram fidelity
22
to the original distance matrix, with a value of 0.75 as minimal fidelity of the correlation
measurement.17
The influence of phylogeny in the observed pattern of species distance (Mahalanobis
distance) was quantified by a Mantel test, with 999 permutations.
3.3 - RESULTS AND DISCUSSION
Figure 1 presents a representative mid-infrared average photoacoustic spectrum
obtained by the C. modestus specie. In the spectrum, 13 peaks were identified between 4000
and 500 cm-1 using the literature data18 and the correspondent functional groups with the
vibrational modes are listed in Table II. The peaks 3, 4, 5, 6 and 8 are due to asymmetric and
symmetric stretching and scissor vibrational modes of the hydrocarbons. The secondary
amide groups were identified in peak 7. Although the intensities of these peaks could provide
useful information, visual inspection of the spectra did not reveal obvious visible differences
between them (not shown). Further interpretation and examination of this similarity requires
application of multivariate statistical analysis.
Our results show significant inter-specific variation in the spectroscopic pattern
between the analyzed species (Wilk's lambda = 5.2×10-6, F(13, 18, 394) = 37.57, P <0.001). The
two canonical roots explain 83.8% of data variation and all selected peaks were significant in
species differentiation. By the F values, the four most relevant variables are NH2, CH, COC
and OH, as indicated in Table II.
23
Photoacoustic signal ( arb. units )
25
7
6
20
11
8
2
15
13
9
10
1
12
3
4
10
5
5
0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
500
-1
Wavenumber ( cm )
Figure 1: Average mid-infrared photoacoustic spectra of C. modestus scales.
Despite the phylogenetic influence suggested by the statistical analyzes of the
spectroscopic results, Mantel’s test does not corroborate this notion (Mantel r = 0.125; p =
0.204): pairs of species with greater known phylogenetic distances (different taxonomic
orders) are closely related in FTIR results (eg. P. pankalos and S. notomelas), as shown in the
dendogram in Figure 2. However, the observed clusters of species suggest that the feeding
habitat and spatial distribution can explain this similarity in the FTIR results. In this case, P.
argentea and B. stramineus are strongly associated by their shared fast water habitat and their
diet, mainly terrestrial insects that are adrift in the water (group A). On the other hand, H.
marginatus, P. australis, P. lineatus, M. forestii and C. modestus inhabit larger streams or
rivers, with slow water velocity and rich organic matter sediment (group B). Despite the
presence of three families, P. lineatus and C. modestus are close phylogenetically.
Phallotorynus pankalos, S. notomelas and Serrapinnus sp. use mainly periphytic algae in
their diet, while C. britskii is a common predator in the habitats occupied by these species
24
(group C), so of the four species in this group, two are strongly phylogenetically related
(same genus), whereas others represent different orders. Characidium zebra, S. brevipinna
and P. nasus (group D) feed upon benthonic invertebrates, sediment organic matter and
periphytic algae associated with rocks, respectively. Complementarily, A. paranae, A.
fasciatus and A. altiparanae are omnivorous, with a preference for insects because the first
two occur mainly in streams with fast water flow and the third species occurs mainly in
streams with slow water velocity (group D).
Table II: Selected peaks of the spectrum, their functional group, vibration type and importance in canonical
discriminant analysis of stream fish species collected in the Upper Paraná River Basin, Brazil. The bolded Fvalues indicates the most significative peaks.
Peak
Wavenumber
Functional
Mode of vibration
Root 1
Root 2
F-value
(cm-1)
group
1
3452
NH2
Stretching asymmetric
0.644
0.375
20.846
2
3297
NH2
Stretching symmetric
-0.268
-0.745
8.051
3
3070
CH
Stretching
0.020
0.042
8.248
4
2919
CH2
Stretching asymmetric
-1.206
0.214
9.988
5
2854
CH2
Stretching symmetric
1.439
0.096
17.618
6
1670
C=C
Stretching
0.415
0.736
5.869
7
1542
N-H
Stretching asymmetric
0.005
-0.892
4.504
8
1454
C-CH2
Scissor
-0.410
2.017
18.392
9
1396
C-H
Bending
1.054
-4.154
77.730
10
1338
O-H
Bending in-plane
-0.746
1.863
19.800
11
1238
C-C-O
Stretching
0.339
-1.344
18.587
12
1083
C-O-C
Stretching asymmetric
0.728
0.254
41.180
13
671
O-H
Bending out of plane
0.517
1.093
46.831
The aforementioned species have great variation in feeding behavior, or little
information is known about their diet composition. However, our data permit us to
25
hypothesize that carbon sources differ among the studied species, suggesting the differences
in diet as photosynthetic origin of the food (terrestrial superior plants, periphytic algae) or by
aquatic microorganisms defining the chemical composition of the analyzed scales.
Figure 2: Similarity dendrogram of analyzed scales (Mahalanobis distance) using absorption peak intensity
from scales of fish species collected in the Upper Paraná River basin, Brazil.
By comparing this work with other studies with different biological groups, we
observed that there is a different number of relevant absorption peaks in the mid-infrared
spectrum that can be used to differentiate species. For example, ant species were
distinguished by considering the peaks at 2962 and 2931 cm-1.10 This suggests that each
biological group can be identified by a collection of peaks, which constitutes a biomarker for
that group. So, for our analysis, the C-H bending peak at 1396 cm-1 (peak 9), with F =
77.730, can be defined as a biomarker of this species group.
3.4 - CONCLUSION
In conclusion, FTIR-PAS combined with statistical analysis was applied for the first
time, to our knowledge, to explore the phylogenetic similarity in different species of fish.
26
Nineteen fish species were separated into four groups by the chemical composition of the
scales, which is related to the biological traits of each fish species. Our results reinforce
previous studies that showed that FTIR-PAS is an powerful tool for the differentiation of
species and biological populations. FTIR-PAS could be a method for verification of the
influence of environmental characteristics on the metabolism of different species.
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10. W. F. Antonialli Junior, S. M. Lima, L. H. C. Andrade, and Y. R. Súarez, Genetics and
Molecular Research 6, 492 (2007).
11. W. F. Antonialli Junior, Y. R. Súarez, T. Izida, L. H. C. Andrade, and S. M. Lima,
Genetics and Molecular Research 7, 559 (2008).
27
12. L. H. C. Andrade, P. G. Freitas, B. G. Mantovani, M. S. Figueiredo, R. A. Lima, S. M. Lima, M. A. S.
Rangel, and R. M. Mussury, Eur. Phys. J. Special Topics 153, 539 (2008).
13. A. R. L. Caires, M. R. O. Teixeira, Y. R. Súarez, L. H. C. Andrade, and S. M. Lima,
Applied Spectroscopy 62, 1044 (2008).
14. G. P. Quinn and M. J. Keough, Experimental design and data analysis for biologists
(Cambridge University Press, Edinburgh, 2005), Chap. 16, p.425.
15. P. A. Buckup, N. A. Menezes, and M. S. Ghazzi. Catálogo das espécies de peixes de
água doce do Brasil (Museu Nacional, Rio de Janeiro, 2007) p. 195.
16. J. M. Mirande, Neotropical Ichthyology 8, 385 (2010).
17. K. McGarigal, S. Cushman, and S. Stafford. Multivariate statistics for wildlife and
ecology research (Springer-Verlag, New York, 2000), p. 283.
18. B. C. Smith, Infrared Spectral Interpretation: a systematic approach (CRC, New York,
1999), p. 265.
28
CAPÍTULO 4 - Desempenho de Eletrodos de Pastas de Carbono
Modificados com Ácidos Húmicos na Detecção Voltamétrica de Thiram
F. S. Almeidaa, E. G. S. Barrosb, A. R. Fioruccib, L. H. C. Andradea
a
Grupo de Espectroscopia Óptica e Fototérmica, Programa de Pós-Graduação em Recursos
Naturais, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, C.P. 351, Dourados, MS, Brasil.
b
Grupo de Pesquisa em Recursos Naturais Análise de plantas, medicamentos e
contaminantes, Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais, Universidade Estadual
de Mato Grosso do Sul, C.P. 351, Dourados, MS, Brasil.
Resumo
Este estudo avaliou o desempenho de eletrodos de pasta de carbono modificados com ácidos
húmicos diferentes (AH-C, AH-D, AH-G) na detecção do pico anódico do fungicida Thiram
por voltametria de onda quadrada em diferentes pH. Este desempenho foi comparado com
eletrodos sem modificações. O eletrodo que teve melhor desempenho foi o AH-G, sendo este
natural extraído do Guirai. Este eletrodo além de se manter constante nos diferentes pH,
obteve corrente de pico (Ip= 5,9) maior que o sem modificação (Ip=3,7) com uma boa
resolução do pico anódico. A correlação com as suas características espectroscópicas revelou
que este ácido húmico apresenta menores índices de ácidos carboxílicos do que os demais,
assim esta característica pode ser atribuída ao seu melhor desempenho na detecção
voltamétrica do Thiram.
Palavra - chave: fungicida; voltametria de onda quadrada; FTIR-PAS.
4.1 - INTRODUÇÃO
Nos últimos anos houve um grande avanço nas atividades agrícolas, o que gerou uma
ampliação na utilização dos insumos, principalmente de agrotóxicos, que são produtos
químicos especificamente desenvolvidos e produzidos para uso no controle de pragas
29
agrícolas e de saúde pública, para aumentar a produção de alimentos e fibras, e para facilitar
os modernos métodos agrícolas (PARHAM & RAHBAR, 2010). Devido a sua toxicidade,
persistência e acumulação no meio ambiente os agrotóxicos necessitam ter seus resíduos
monitorados e seus processos de degradação melhor compreendidos (HERNANDEZ et al.,
1998; ZHOU et al., 2006). Um insumo muito utilizado é o fungicida Thiram (dissulfeto de
tetrametilthiuram) (Figura 1) utilizado como protetor de sementes, frutas, vegetais, e plantas
ornamentais (QUEFFELEC et al., 2001; SHARMA et al., 2003).
Figura 1 – Fórmula estrutural do fungicida Thiram.
Existem vários métodos de análise do Thiram como, por exemplo, a cromatografia,
espectrofotometria, polarografia e métodos voltamétricos (AULAKH et al., 2005;
FERANNDEZ et al., 1995; MALIKA & RAO, 1990; MALIKA et al., 1998; MANSILHA et
al., 2010; RUPP et al., 1992; SEVILLA et al., 1990; SHARMA et al., 1998; SHARMA et al.,
2005; ZHAO et al., 2003). A voltametria vem se mostrando uma técnica altamente sensível,
rápida e útil para análise de resíduos e, em alguns casos, é capaz de ser utilizada sem as
etapas trabalhosas de pré-tratamentos e/ou purificação das amostras, o que leva vantagem
quando comparada com a cromatografia. Dentre as técnicas voltamétricas, destaca-se a
voltametria de onda quadrada, por ser uma das técnicas voltamétricas mais rápidas e
sensíveis, a qual seus limites de detecção podem ser comparados aos das técnicas
cromatográficas (CODOGNOTO et al., 2008).
Alguns métodos voltamétricos para análise de agrotóxicos, inclusive para Thiram,
utilizam-se de eletrodos de mercúrio, porém o seu uso está sendo evitado, devido aos efeitos
toxicológicos deste material (LAWRENCE et al., 2002; MICARONI et al., 2000). Desta
forma, os eletrodos de pasta de carbono (EPCs) vem sendo bastante utilizados, pois além de
serem adequados para detecção de processos de oxidação de uma variedade de substâncias
orgânicas, também apresenta uma corrente residual extremamente baixa, o que favorece
determinações com menor limite de detecção (MCCREERY, 1991;SVANCARA et al.,
2001). A base das pastas de carbono é geralmente uma mistura de grafite em pó e um líquido
aglutinante não eletrolítico. Um constituinte que vem sendo bastante incorporado à pasta é o
agente modificador, que é geralmente uma só substância ou uma mistura de dois
30
modificadores (PEREIRA & KUBOTA, 2004; VIEIRA et al., 2003). No geral, a principal
razão de se modificar quimicamente um eletrodo é a obtenção qualitativa de um novo sensor
com propriedades desejáveis, freqüentemente pré-definidas. As principais funções do
modificador são: captura de espécies preferencialmente desejadas (por exemplo, para préconcentração em análise por redissolução, stripping) na superfície do eletrodo; mediação das
reações do eletrodo através de moléculas imobilizadas ou de seus fragmentos; atuação em
processos catalíticos (repostas eletroquímicas catalíticas); e alteração das características da
superfície de um EPC. Quando consideradas as possibilidades de combinação destas funções
e a flexibilidade na preparação das pastas de carbono, não é surpreendente que na última
década o número e a diversidade de substâncias usadas para a preparação dos EPCs
modificados cresceram em uma ordem geométrica.
Um modificador que vem sendo estudado são os provenientes das substâncias
húmicas como, por exemplo, o ácido húmico (AH). O ácido húmico é a parte solúvel em
álcali e insolúvel em ácido das substancias húmicas, suas moléculas de ácido húmico são
extremamente volumosas e reconhecidas como trocadores iônicos efetivos de origem natural.
Embora não haja um modelo definido sobre a estrutura dos ácidos húmicos, (CRESPILHO &
REZENDE, 2004; PEÑA-MÉNDEZ et al., 2005) existe um fato que muito interessa àqueles
que trabalham com eletroanalítica: os ácidos húmicos são compostos com grande capacidade
de complexação de metais e possuem grande afinidade por compostos orgânicos
(LANDGRAF et al., 1998; SARGENTINI et al., 2001; SENESI et al., 1986). Apesar da
maioria dos trabalhos utilizando EPCs modificados com ácido húmico terem como objetivo a
determinação de metais em solução e/ou o estudo da interação entre íons metálicos e ácidos
húmicos, (SILVA et al., 2002; THOBIE-GAUTIER et al., 2003), a utilização dos EPCs
modificados com ácido húmico vem crescendo para a determinação de outros compostos,
como por exemplo, os agrotóxicos (AIROLDI et al., 2007; CAVALCANTE et al., 2010;
CRESPILHO et al., 2002).
Assim, a partir de estudos preliminares verificou-se ser possível a detecção do pico de
oxidação do agrotóxico Thiram usando o EPC sem modificação química (SILVA et al., 2006).
Contudo, a obtenção de picos com boa resolução requer procedimentos de pré-concentração
com tempos elevados, o que estimulou a modificação química da pasta de carbono com
Ácido Húmico (AH) para obtenção de resultados mais satisfatórios.
Porém, os ácidos húmicos são moléculas que variam em sua composição, tendo como
composição elementar C, H, O, N e S. Esses elementos são sempre encontrados nos ácidos
húmicos independente da origem (PEÑA-MÉNDEZ et al., 2005). Apesar disso, seus grupos
31
funcionais podem variar, existindo vários modelos para sua estrutura molecular (SCHULTEN
& SCHNITZER, 1993; SEIN et al., 1999). Desta forma, faz-se necessário uma caracterização
de sua estrutura química. A espectroscopia Infravermelha por Transformada de Fourier com
detecção Fotoacústica (do inglês Fourier Transform Infrared Photoacoustic Spectroscopy FTIR-PAS) é uma técnica que permite a determinação do modo de vibração de grupos
funcionais presentes em vários tipos de materiais como plantas e solos (CAIRES et al., 2008;
DU et al., 2008; DU et al., 2009; HABERHAUER & GERZABEK, 2001) Vários estudos
mostraram que esta técnica é rápida e não destrutiva e uma poderosa ferramenta analítica para
oferecer informações sobre a absorção do espectro infravermelho médio (GORDAN et al.,
1999; SIVAKESAVA & IRUDAYARAJ, 2000).
Desta forma, o presente trabalho visa avaliar a resposta de EPCs modificados com
diferentes AH na detecção voltamétrica do fungicida Thiram. Além disso, caracterizar por
técnicas espectroscópicas os principais grupos funcionais químicos das amostras de AH,
correlacionando com as respostas dos eletrodos na detecção do agrotóxico.
4.2 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.2.1 - Voltametria de Onda Quadrada (SWV)
4.2.1.1 - Equipamentos utilizados
Para realização das medidas eletroquímicas utilizou-se o potenciostato/galvanostato
AUTOLAB PGSTAT 30 (Eco Chemie), acoplado a um computador que dispõe do programa
AUTOLAB SOFTWARE ECOCHEMIE. Um pHmetro (HANNA – pH 21 pH/mV meter) foi
utilizado para o ajuste do pH no preparo das soluções tampão Briton-Robinson (BR) com
valores de pH 5, 7 e 9.
4.2.1.2 - Reagentes e preparo das soluções
Foram preparados como eletrólito de suporte soluções tampão BR em três pH (5, 7 e
9). Para estas soluções foram utilizadas soluções de ácido bórico (H3BO3) 0,2 mol.L-1, ácido
fosfórico (H3PO4) 0,2 mol.L-1, ácido acético (CH3COOH) 0,2 mol.L-1 e hidróxido de sódio
(NaOH) 0,2 mol.L-1. Com o auxílio do pHmetro, o pH a ser trabalhado foi obtido
adicionando o mesmo volume dos ácidos e ajustando o pH com a adição do hidróxido, todo o
processo foi realizado sob agitação magnética.
32
Foram preparadas soluções de Thiram 5 mmol L-1 em uma solução de 28% (v/v) de
acetona e 72% (v/v) de álcool etílico. Esta solução foi diluída com a solução do eletrólito de
suporte tampão BR de pH conhecido, obtendo concentrações do fungicida de 10 µmol L-1 e
50 µmol L-1.
4.2.1.3 - Preparo dos Eletrodos de Pasta de Carbono
Confeccionou-se dois tipos de eletrodos, um com pasta de carbono sem modificador, e
outro de pasta de carbono modificado quimicamente com diferentes amostras de ácidos
húmicos. O eletrodo de pasta de carbono não modificado foi construído usando uma pasta de
carbono com a composição: 75% (m/m) de grafite (Aldrich®) e 25% (m/m) de óleo mineral
Fluka® como líquido aglutinante. Para homogeneização das pastas adicionou-se aos reagentes
20 mL de hexano. A mistura foi submetida à agitação magnética no interior da capela para a
total volatilização do hexano. Cada pasta foi empacotada em uma seringa com fio de cobre
por sucessivas inserções até atingir a marcação de 0,04 mL na seringa.
Para a confecção dos eletrodos modificados foram utilizados os seguintes ácidos
húmicos (AH): Ácido Húmico Comercial (AH-C), marca FLUKA ®; Ácido Húmico Natural,
extraído do solo da região do Rio Guiraí (AH-G); e Ácido Húmico Natural, extraído de solos
da região de Dourados-MS (AH-D). Os ácidos húmicos naturais foram extraídos utilizando a
metodologia empregada para separação de substâncias húmicas dos solos, padronizada pelo
“Internacional Humic Substances Society” (IHSS) (IHSS, 2008). Cada EPC modificado com
ácido húmico foi preparado de forma análoga ao não modificado, sendo a pasta composta de
25% (m/m) de Óleo Mineral, 72% (m/m) de grafite e 3% (m/m) de uma amostra de ácido
húmico.
4.2.1.4 - Procedimento Experimental Voltamétrico
A técnica de voltametria de onda quadrada (SWV) foi aplicada com a cela
eletroquímica de 3 eletrodos, composta de um contra-eletrodo de platina, de um eletrodo de
referência Ag/AgCl, KCl 3 M e de um EPC como eletrodo de trabalho. Os voltamogramas
dos eletrólitos foram registrados após adição de 30 mL da solução eletrólito de suporte
(solução tampão BR de pH 5; 7 ou 9) a cela eletroquímica.
Os voltamogramas do fungicida Thiram foram registrados após contato do EPC com
um volume de solução de aproximadamente 30 mL sob agitação por 45 segundos com auxílio
33
de barra magnética e agitador magnético. As superfícies dos eletrodos foram renovadas
empurrando uma pequena quantidade de pasta para fora da seringa pelo movimento do fio de
cobre dentro da seringa e a superfície da pasta foi tornada plana sobre uma folha de papel
sulfite, com movimentos circulares antes de cada obtenção do voltamograma do eletrólito. Os
voltamogramas foram obtidos com os seguintes parâmetros: tempo de equilíbrio (teq) = 15s;
frequencia (f)= 75 Hz; amplitude (a)= 25 mV; altura de degrau (ΔE)= 4 mV; em um
intervalo de potencial de 0,2 V – 1,1V.
4.2.2 - Espectroscopia Fotoacústica no Infravermelho por Transformada de
Fourier (FTIR-PAS)
Esta foi empregada para obtenção dos espectros dos diversos ácidos húmicos.
Primeiramente, os AH foram armazenados em dissecador sobre vácuo por 12 horas para
retirar o máximo de umidade, para posterior obtenção dos espectros. Os experimentos de
FTIR-PAS foram realizados usando o espectrofotômetro com transformada de Fourier
(Nexus 870 - Nicolet) com o acessório de detecção fotoacústica na faixa espectral de 400 a
4000 cm-1, atingindo assim a região conhecida como impressão digital (400 e 1500 cm -1).
Durante todo o experimento o espectrofotômetro foi purgado usando ar comprimido a fim de
eliminar o vapor de água e o CO2 do interferômetro. A célula fotoacústica foi purgada com
gás hélio. Uma referência de carbono negro foi usada para coletar o espectro da fonte
infravermelha para a normalização. Assim coletados os espectros de cada AH. Os espectros
foram obtidos com 8 cm-1 de resolução pela média de 128 varreduras para cada amostra.
4.3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
O desempenho dos EPCs na detecção do pico anódico do Thiram foi analisado em
eletrólitos com diferentes valores de pH. Para esta primeira análise, os voltamogramas foram
obtidos com solução de Thiram 10 µmol L-1. Nos voltamogramas obtidos o potencial de pico
(Ep) foi em torno de 0,809 V, o que é esperado para o pico de oxidação do Thiram
(HERNANDEZ-OLMOS et al., 2000). A Tabela 1 mostra os parâmetros de pico destes
voltamogramas.
34
Tabela 1 - Médias e erro-padrão (n=6) de parâmetros de pico dos voltamogramas de solução
de Thiram 10 µmol L-1 registrados com eletrodos modificados com diferentes amostras de
ácido húmico.
Modificador
pH
Ip (µA)
Ip (µA) / W1/2 (V)
Ausente
0,9±0,2
7,4
AH-C
0,36±0,05
3,2
5
AH-G
0,63±0,09
5,8
AH-D
0,14±0,04
1,1
Ausente
0,61±0,05
4,8
AH-C
0,42±0,07
3,3
7
AH-G
0,61±0,09
4,4
AH-D
0,25±0,09
2,2
Ausente
AH-C
AH-G
AH-D
9
0,53±0,06
0,34±0,06
0,64±0,05
0,37±0,05
4,3
2,5
4,7
2,7
Pela análise da Tabela 1 e Figura 2 (a), constata-se que em pH 5 os eletrodos
modificados com AH não se mostraram eficientes quando comparado com o eletrodo sem
modificador, pois este obteve a melhor resolução do pico anódico, estimada pela razão
corrente de pico/largura de meio-pico (Ip/W1/2).
Os voltamogramas obtidos da solução em pH 7 e 9 estão representados na Figura 2 (b)
e (c), respectivamente. Apesar do pico anódico ocorrer em todos os voltamogramas, a
resolução do pico e linha de base muda bastante dependendo do eletrodo estudado. Deste
modo, o eletrodo modificado com AH-G obteve melhor resolução comparado aos demais.
Além disso, em pH 9 este eletrodo obteve uma corrente de pico maior que o obtido com o
eletrodo não modificado.
35
I (A)
3
8
2
1
6
4
2
0
0,2
Sem modificador
AH-C
AH-G
AH-D
10
Sem Modificador
AH-C
AH-G
AH-D
I (A)
4
0
0,4
0,6
0,8
1,0
0,2
0,4
E (V)
0,6
0,8
1,0
E (V)
(a)
(b)
10
I (A)
8
Sem Modificador
AH-D
AH-G
AH-C
6
4
2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E (V)
(c)
Figura 2 - Voltamogramas de soluções de Thiram 10 µmol L-1 registrados com intervalo de
potencial de trabalho: +0,2 a +1,1 V (vs. Ag/AgCl), f = 75Hz, ΔE = 4mV, a = 25mV, teq. =
15s, em (a) pH 5; (b) pH 7; (c) pH 9.
A Figura 3 apresenta os resultados de corrente de pico obtido para os diferentes ácidos
húmicos nos diferentes pH. Quando se confronta todas as correntes de pico das soluções de
Thiram nos diferentes pH, o acido húmico extraído do Guirai (AH-G) mostrou-se o melhor
modificador para a pasta de carbono, pois com este AH obteve a melhor repetibilidade da
corrente de pico. Ainda, nota-se que em pH 9 obteve-se os menores desvios padrões em todos
os eletrodos estudados, assim faz-se necessário uma melhor análise dos EPCs neste pH. Para
isso, utilizou-se uma solução de Thiram mais concentrada (50 µmol L-1). A Tabela 2 mostra
os dados obtidos a partir dos voltamogramas adquiridos nesta análise.
36
Sem Modificador
AH-C
AH-G
AH-D
1,2
1,0
Ip ( A)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
5
6
7
8
9
pH
Figura 3 – Gráfico referente à média das correntes de pico de cada eletrodo estudado em
eletrólitos do tipo tampão BR com diferentes valores de pH. Barras de erro referem-se ao
desvio padrão das medidas em cada condição.
A Figura 4 mostra os voltamogramas obtidos com os diferentes eletrodos. Observa-se
que na detecção do pico anódico do Thiram o eletrodo sem modificador obteve uma corrente
de pico média de 3,7 µA, havendo um aumento de aproximadamente, sete vezes comparada a
registrada com a solução de Thiram na concentração 10 µmol L-1 e no mesmo pH. Resultado
este esperado, pois na técnica voltamétrica o sinal da corrente de pico relaciona-se
linearmente com a concentração (ALEIXO, 2003).
Tabela 2 - Médias e erro-padrão (n=6) de parâmetros de pico dos voltamogramas de solução
de Thiram 50 µmol L-1 registrados em pH 9 com eletrodos modificados com diferentes
amostras de ácido húmico.
Modificador
Ip (µA)
Ip/W1/2(µA/V)
ausente
AH-C
AH-G
AH-D
3,7±0,3
2,2±0,1
5,9±0,9
1,6±0,2
25,9
14,3
45,3
12,2
Em relação aos eletrodos modificados, e assim como no estudo realizado com Thiram
10 μmol L-1, o eletrodo AH-C ainda se mostrou ineficiente na detecção do agrotóxico, tendo
também uma resposta inferior ao sem modificador, porém melhorou sua resolução de pico.
Para o AH-D obteve-se a menor corrente de pico, se mostrando o menos eficiente na detecção
do agrotóxico e obtenção de um pico com razoável resolução. Ocorre para este eletrodo um
deslocamento da linha de base na solução do agrotóxico, que pode ter sido causada por
37
diversas razões como processos de adsorção dos componentes do eletrólito (tampão BR) com
o AH-D incorporado na pasta que podem alterar a corrente capacitiva que compõe a corrente
residual registrada pelo eletrodo. Uma outra possível razão é a detecção de processos
faradáicos (no caso uma onda de oxidação em torno de +0,5 V) devido a oxidação do próprio
AH incorporado na pasta ou em solução por sua dissolução na forma de sal (humato) no
eletrólito durante a medida.
10
Sem Modificador
eletrolito
8
AH-C
eletrolito
6
4
I (A)
2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
A
AH-G
eletrolito
1,0
0,2
10
8
0,4
0,6
0,8
1,0
A
AH-D
eletrolito
6
4
2
0
E (V)
Figura 4 - Voltamogramas registrados em soluções de Thiram 50 µmol L-1 e do eletrólito em
solução tampão BR pH 9 obtidos com EPC. Condições: intervalo de potencial de trabalho:
+0,2 a +1,1 V (vs. Ag/AgCl), f = 75Hz, ΔE = 4mV, a = 25mV, teq. = 15s.
Com o modificador AH-G obteve-se uma corrente de pico superior ao obtido com o
eletrodo sem modificador, mesmo resultado obtido no estudo realizado com Thiram em baixa
concentração. Sendo este modificador o que apresentou melhores resultados na detecção do
agrotóxico, com um aumento de 62% na corrente de pico média em relação ao eletrodo sem
modificador no pH 9. Comparado com os demais modificadores, este apresenta melhor
resolução do pico de oxidação do Thiram (45,26 μA/V), desta forma este modificador se
mostrou o melhor dentre os estudados para detectar o pico anódico do fungicida Thiram
usando a técnica de SWV em condições instrumentais estabelecidas anteriormente com EPC
não modificado.
Os espectros das amostras de ácidos húmicos estão representados na Figura 5, os
quais são semelhantes aos encontrados na literatura (ANDJELKOVIC et al., 2006;
38
ANDJELKOVIC et al., 2006; CALACE et al., 2004; ROVIRA et al., 2003) Observa-se nos
ácidos húmicos naturais uma banda larga na região entre 3029 e 2746 cm-1 isso ocorre devido
ao estiramento do O-H dos grupos carboxílicos presentes nestas amostras (SMITH, 1999).
Estes grupos são característicos por terem uma das maiores banda nesta região, em torno de
300 cm-1. Porém, na amostra comercial, nesta mesma região, aparecem dois picos (2923 e
2850 cm-1) proveniente da combinação dos grupos funcionais C-C e C-H também
pertencentes aos grupos carboxílicos. Estes picos aparecem devido um efeito chamado
ressonância de Fermi, que ocorre quando grupos funcionais combinados roubam a energia de
vibração de outros grupos, que neste caso é o estiramento do O-H. Isso é muito comum
ocorrer nas vibrações dos grupos carboxílicos. Nesta região, apresenta ainda picos entre 3691
e 3617 cm-1 que são característicos de materiais que contém argila, (DONINI &
MICHAELIAN, 1986; MICHAELIAN, 2003) verificando-se que nas amostras naturais esses
picos são mais intensos. Este material, portanto deve ter sido incorporado a amostras de ácido
húmico no processo de sua extração do solo.
1037
1006
914
1697
1650
1114
3691
3648
20
AH-C
AH-D
AH-G
3617
2919
1558
1508
1457
1419
15
2850
Sinal Fotoacustico (unit. arb.)
25
10
5
0
3500
3000
2500
2000
1500
1000
-1
Numero de onda(cm )
Figura 5- Espectros dos ácidos húmicos utilizados na detecção voltamétrica do agrotóxico Thiram
Os picos (1114, 1037, 1006 e 914 cm-1) também são provenientes da argila,
(MICHAELIAN, 2003) e reflete o ocorrido na região de 3600 cm-1. Desta forma, pode-se
aferir que os ácidos húmicos naturais têm maior quantidade de argila que o comercial. A
região entre 1700 e 1400 cm-1 envolve a região de impressão digital dos materiais e, dessa
forma, é a mais complexa de se estudar. Nesta região aparecem muitos picos de diferentes
39
grupos funcionais, os principais foram em 1697 cm-1 (C=0 estiramento dos peptídeos), 1650
cm-1 (C=C aromático ou C=O de quinonas), 1558 cm-1 (NH ou C-N da amida secundária),
1508 cm-1 (O-H dos ácidos carboxílicos), 1447 cm-1 (estirameno e/ou deformações de grupos
alifáticos), 1419 cm-1 (C-H deformação de grupos alifáticos ou/e estiramento simétrico do
COO-).
Estudando estas regiões observa-se que há um grande número de vibrações referentes
aos grupos carboxílicos, sendo o AH-D o que apresenta maiores intensidades nessas regiões.
Em estudos recentes revelou, a partir da determinação potenciométrica da acidez, que o AHD apresenta maiores quantidades destes compostos quando comparado com o AH-G (SILVA,
2006). Para o AH-C os picos são de intensidades intermediárias. Comparando com o
resultado da voltametria, pode-se aferir que o AH-G possibilitou melhor detecção do pico de
oxidação de Thiram devido seus baixos índices de ácidos carboxílicos, permitindo uma maior
interação de outros grupos pertencentes a composição dos AH com a molécula de Thiram nas
superfícies dos EPCs modificados.
4.4. - CONCLUSÃO
Esse trabalho mostra que nem todos os ácidos húmicos tem a propriedades para
melhorar eletrodos de pasta de carbono para a detecção do pico anódico do Thiram. Por isso
os estudos para este tipo de detecção devem ser feitas. Os estudos revelam ainda que somente
um tipo de modificador é eficiente na obtenção do pico anódico do Thiram, que é o AH-G,
pois devido às características espectroscópicas este contém menos índices de ácidos
carboxílicos.
4.5. – REFERÊNCIAS BIBLIO GRAFICA
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44
CAPÍTULO 5 - Aplicação da técnica SERS em análises do fungicida
Thiram
F. S. Almeidaa, S. M. Limaa, A. R. Fioruccib, M. L. Baessoc, L. H. C. Andradea
a
Grupo de Espectroscopia Óptica e Fototérmica, Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais,
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Dourados, MS, Brasil.
b
Grupo de Pesquisa em Recursos Naturais Análise de plantas, medicamentos e contaminantes, Programa de
Pós-Graduação em Recursos Naturais, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Dourados, MS, Brasil.
c
Grupo de Estudos dos Fenômenos Fototérmicos, Universidade Estadual de Maringá, Maringá- PR, Brasil.
Resumo
Para obtenção dos espectros SERS do Thiram foram confeccionadas superfícies
nanometricamente rugosas de prata, sendo obtidas através da oxidação do nitrato de prata em
superfícies de cobre. Foram obtidos os espectros do fungicida Thiram através das técnicas de
FTIR-PAS e Raman, para comparação com o espectro obtido por SERS. As análises
revelaram que o espectro SERS tem vários picos semelhantes aos das demais técnicas.
Apresentando diferenças significativas quando comparado com o Raman, revelando picos
que são provenientes das ligações formadas entre a superfície de prata e o agrotóxico. Além
disso, existem vários picos que são amplificados no SERS devido à ressonância plasmoionica favorecida pela superfície. Analisando diferentes tempos de formações das
nanoestruturas em comparação com os espectros SERS, observa-se que para o tempo de 15s
obten-se os melhores sinais SERS. Assim, as imagens MEV revelam que isso se deve a
formação de nanofolhas nestas superfícies que favorecem a amplificação do sinal Raman.
Palavra-chave: agrotóxico; Raman; MEV.
5.1 - INTRODUÇÃO
O interesse por análises de agrotóxicos vem crescendo, devido ao seu alto consumo na
agricultura, e também no uso doméstico. A utilização crescente destes compostos é
45
preocupante, principalmente com os impactos ambientais gerados, como por exemplo,
quando são persistentes na água e no solo (GRÜTZMACHER et al., 2008; RIBEIRO et al.,
2007). Além disso, os possíveis resíduos deixados por esses agrotóxicos nos alimentos é
outra questão preocupante, pois os metabólitos produzidos a partir da degradação também
podem representar sérios riscos à saúde, já que muitas vezes, seus metabolitos são mais
tóxicos que os produtos de origem. Os principais agrotóxicos utilizados são fungicidas, no
qual está o Thiram (dissulfeto tetramethylthiuram), o qual é utilizado no controle de diversas
doenças. Este agrotóxico é sensibilizador da pele, causando irritações moderadas, provocando
também irritações nos olhos (KESARI & GUPTA, 1998; MALIK et al., 1998). Porém a
maior preocupação esta em sua degradação, pois pode causar hepatotoxidades (DALVI et al.,
2003). Desta forma, é importante o desenvolvimento de análises eficientes de agrotóxicos.
Assim, uma técnica recente e que vem mostrando um grande potencial na análise
química bastante utilizada na caracterização de compostos é chamada SERS (do inglês:
Surface Enhanced Raman Spectrscopy), ou seja é um efeito da amplificação do já conhecido
sinal Raman através de uma interação da espécie química em estudo com uma superfície
nanometricamente rugosa. Desde sua descoberta o SERS vem se mostrando como uma
ferramenta poderosa devido à informação estrutural que proporciona em compostos com uma
baixa concentração (ADDISON & BROLO, 2006; CAMPION & KAMBHAMPATI, 1998;
STOKES & VO-DINH, 2000). A observação deste efeito exige o contato da espécie química
com uma superfície metálica condutora, com rugosidade da ordem de nanômetros ou seu
contato com nanopartpiculas metálicas que pode ser na forma de colóides (BAO et al., 2008;
KAWABATA et al., 2007; LI et al., 1999; VO-DINH et al., 1998; VOLKAN et al., 2005). A
literatura traz vários estudos sobre este fenômeno com diferentes metais que formam
nanoestruturas, sendo que o Au, Ag, e Cu são os mais utilizados devido a maior amplificação
conseguida com esses metais (BHATTACHARRYA et al., 2000; CEPAK & MARTIN,
1998; PEREZ-JUSTE et al., 2004; ZHU et al., 2000). Alguns dos principais avanços do
SERS incluem a inibição da luminescência, que é uma limitação do Raman clássico, e um
aumento significativo do sinal de espalhamento. Devido a estas vantagens, vários métodos
vêm sendo estudados para o aperfeiçoamento desta técnica. As suas aplicações são variadas,
porém poucos trabalhos relatam a caracterização de agrotóxicos (ALAK & VO-DINH, 1907;
VO-DINH et al., 1988).
Desta forma, o presente trabalho objetivou otimizar substratos contendo superfície
nanometricamente rugosa de prata e empregar estes para a caracterização de SERS do
agrotóxico Thiram.
46
5.2 - MATERIAIS E MÉTODOS
5.2.1 - Experimentos de absorção óptica no infravermelho médio PAS-FTIR
As amostras de Thiram foi caracterizada pelo experimento de Absorção Óptica (PASFTIR), na faixa espectral do infravermelho médio de 4000 a 400cm-1 através do
espectrofotômetro por Transformada de Fourier (Nexus 870 - Nicolet) com o acessório de
detecção fotoacústica (PAS), para posterior comparação com as demais técnicas. Durante
todo o experimento o espectrofotômetro foi purgado usando ar comprimido a fim de eliminar
o vapor de água e o CO2 do interferômetro e a célula fotoacústica foi purgada com gás hélio
para aumentar a propagação do sinal fotoacústico no interior da mesma. Uma referência de
carbono negro foi usada para coletar o espectro da fonte infravermelha para a normalização.
E assim coletados os espectros do Thiram em pó. Os espectros foram obtidos com 8 cm-1 de
resolução pela média de 128 varreduras para cada amostra.
5.2.2 - Experimentos de RAMAN e SERS
Para as analises Raman e SERS foi realizada uma montagem experimental conforme
Figura 1. Para estes experimentos, as amostras foram excitadas em 514,5 nm por um laser de
Ar+ (Coherent innova 300C). A fonte laser foi filtrada por um filtro tipo “notch”, e colimado
por um grupo de lentes acromáticas com 4mm de distancia focal. O espalhamento inelástico
foi separado do espalhamento Rayleigh através de um filtro tipo “degrau”, sendo
posteriormente e focalizado em uma fibra óptica acoplada a um monocromador (Horiba Jobin
Yvon iHR 320). O sinal foi coletado por uma CCD (Sygnature Hamamatsu S3903-1024Q
PDA). O espalhamento Raman foi coletado das amostras sem preparo algum, em forma de
pó, prensadas em um suporte de grafite.
47
Figura 1- Esquema do aparato experimental utilizado nas medidas de Raman e SERS.
5.2.3 - Síntese dos substratos para os experimentos de SERS
Foram fabricadas superfícies ativas de prata com base em NIE & FENG (2002),
utilizando placas de circuito impresso folhas de cobre, com espessuras de 1 cm, e AgNO3
(CennaBras P.A., 99.8% de pureza). Primeiramente, a placa foi lavada com solução de 1% de
ácido sulfúrico, em seguida lavadas com água bidestilada, para retirar possíveis impurezas.
Após este procedimento, as folhas de cobre foram aquecidas por 2h a 80ᵒC para produzir uma
fina camada de óxido de cobre na superfície a fim de atrasar a reação de deposição da prata
da solução de AgNO3. Para formar a superfície nanometricamente rugosa de Ag, as placas
foram mergulhada em solução aquosa de 1 x10-1 mol L-1 AgNO3 em diferentes tempos, que
variaram de 5s a 60s. Este procedimento permitiu verificar o tempo ideal para a formação da
camada nanometricamente rugosa a qual permitiria obter o sinal SERS mais intenso. As
estruturas formadas em cada placa foram analisadas por Microscopia eletrônica de varredura
(MEV).
Foram utilizadas soluções de Thiram (Tetramethylthiuramdissulfide, ALDRICH®,
97%;) com concentração de 1mmol L-1.
48
5.3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 2 mostra os espectros do Thiram obtido com as técnicas de FTIR-PAS (a),
Raman (b) e SERS (c). Os espectros obtidos em todas as técnicas são semelhantes aos
encontrados na literatura (KANG et al., 2002; SÁNCHEZ-CORTÉS et al., 1998). A Tabela 1
apresenta as principais bandas com suas respectivas vibrações. O Thiram pertence ao grupo
dos compostos Dithiocarbamatos (DTC) e nos espectros destes grupos encontram-se váarias
vibrações de grupos metilas (ALVERDI et al., 2004). Estes grupos apresentam bandas nas
regiões de aproximadamente 1041 cm-1 (  (CH3),  (CH3-N)), 1149 cm-1 ( (N-CH3),
2885
1375
1460
959
1079
1134
829
RAMAN
2959
(b)
SERS
1000 1500 2000 2500
-1
Número de onda (cm )
2891
1633
1138
921
1383
1517
500
(a)
2955
1699
2850
2931
FTIR-PAS
532
358
409
326
404
541
648
Intensidade (u. a.)
790
439
563
848
971
1041
1149
1234
1380
1492
 (CH3)), 1376 cm-1 (  S (CH3)), 2850 cm-1 ( (N-CH3)) e 2931 cm-1 ( (CH3)).
3000
(c)
3500
Figura 2- Análise do Thiram por FTIR-PAS, Raman e SERS
O espectro infravermelho apresenta diversas bandas que também são Raman ativa,
como em 1496 cm-1 ( (C-N)) e 848 cm-1 (S-S). Os picos em 1234 e 439 cm-1 apresentam
vibrações do CH3-N-C, que no Raman aparece em 358 cm-1. As vibrações IR e Raman ativas
incluem ainda, 563 cm-1 (  (SCS)) e 971 cm-1 ( (C-S)).
49
Tabela 1- Picos selecionados em cada espectro, e seus respectivos grupos funcionais.
PAS-FTIR (cm-1)
RAMAN (cm-1)
SERS (cm-1)
Grupo Funcional
326
Ag-S
 (CH3-NC) ou  (C=S)
358
409
404
 ((CH3)2-N)
439
 (CH3NC) ou  (C=S)
563
790
848
971
1041
532
829
959
1079
541
648
921
-
1149
1134
1138
1234
-
1380
1375
1383
1496
1699
2850
1464
2878
1517
2931
2955
2959
1633
2891

(SCS)
S-C-S
C-S
(S-S)
 (CH3N) ou  (C-S)
 (CH3) ou  (CH3-N)
 (N-CH3),  (CH3)
 CH3-N-C
 S (CH3)
 C-N
 (C=N)
 C-N
S-C=N
N-CH3 or N-(CH3)2
 S CH3
O espectro SERS do Thiram revela significantes mudanças quando comparado com o
Raman. Primeiramente ocorre o aparecimento de uma nova banda em 326 cm-1, a qual é
atribuída à ligação do Thiram com a superfície de prata, esta ligação é reportada na literatura,
variando de 226 a 341 cm-1 (KANG et al., 2002; SÁNCHEZ-CORTÉS et al., 1998). O
Thiram, assim como outros DTC, tem alta afinidade com superfícies metálicas,
principalmente com a Ag (GUERRINI et al., 2009; TONG et al., 2006; VICHERS et al.,
2006). E, por esse motivo, as medidas de SERS realizadas neste composto, apresentou uma
boa relação sinal ruído até em concentrações abaixo de unidades de µmol L-1. A banda em
541 cm-1 está relacionada à vibração de dobra S-C-S e aparece de forma menos intensa no
SERS em comparação aos espectros de Raman e IR. Essa diminuição ocorre devido à quebra
da molécula do Thiram para a adsorção na superfície metálica, formando uma nova ligação
Ag-S. Já a banda em 1383 cm-1 está relacionada com as vibrações de dobra dos grupos
metilas. Sendo assim pode-se supor que com a quebra da molécula de Thiram, cada metade
interage diretamente com o metal presente na superfície. A principal mudança no espectro do
SERS é o aparecimento da banda em 1517 cm-1 atribuída a vibração de estiramento do C  N
também observada por outros autores (KANG et al., 2002; PAGES et al., 1985; SÁNCHEZCORTÉS et al., 1998). O Thiram, quando diluído, se ioniza na forma de tioureida, como
ilustrado na Figura 3. Essa forma é produzida pelo equilíbrio tautomerico dos íons DTC.
50
Além disso, o desaparecimento da banda 829 cm-1 correspondente a ligação S-S, evidencia
mais uma vez a presença da ligação bidentada com o metal.
(a)
(b)
Figura 3– (a) estrutura molecular do Thiram; (b) equilíbrio tautomerico do íon DTC.
Figura 4- Diferentes formas da ligação do Thiram com Ag.
Quando ocorre a complexação do Thiram com o metal, os pares de elétrons livres do S se
ligam ao metal, este processo ocorre comumente nos grupos dos compostos DTCs
(FRIGERIO et al., 1989; ARAIN et al., 2009; ARAINet al.,2002). Assim a banda em
326 cm-1 pode ser atribuída a ligações das partículas de prata com o S pertencente ao Thiram
(Ag-S). Neste caso, a intensidade da banda em 1517 cm-1 pode ser usada para estimar a
interação do ligante com o metal (BROWN et al., 1976). A ligação da molécula de Thiram
com a superfície de prata, após sua quebra, pode ocorrer de duas formas: monodentada e
bidentada, como apresentado na Figura 4. Essa banda aparece mais intensa que a de 1464 cm51
1
que é relacionada a vibração de estiramento do C-N mostrada no espectro Raman da Figura
1b. Na Figura 1c esta banda parece estar sobreposta as bandas de 1383cm-1 e 1517cm-1 sendo
assim, como esta ultima aparece mais intensa no espectro, sugere uma interação
predominante do Thiram com a prata na forma bidentada. Ademais, a ligação C-S que
aparece em 921 cm-1 para compostos dithiocarbamatos também é atribuída a forma
bidentada. (STERGIOUA et al., 1994)
Intensidade (u. a.)
BORDA
600
400
200
0
600
400
200
0
600
400
200
0
600
400
200
0
MEIO
600
600
400
400
200
200
0
0
600
400
200
0
600
600
400
400
200
200
0
0
600
400
200
0
600
600
400
400
200
200
0
0
600
400
200
0
600
600
400
400
200
200
0
0
600
400
200
0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
05s
10s
15s
25s
30s
40s
50s
60s
-1
Número de Onda (cm )
Figura 5- Espectros do Thiram 1mmol L-1 em relação ao tempo de mergulho no AgNO3 e a diferenciação do
sinal SERS obtido no meio e na borda das placas.
A fim de aperfeiçoar o preparo dos substratos de prata e cobre que melhor amplificam o
sinal SERS do Thiram, foram testados diferentes tempos de deposição de prata e para cada
um deles foi realizado os experimentos de SERS para amostras de Thiram. A Figura 5 mostra
os espectros do Thiram obtidos para os diferentes tempos de deposição de prata. Em nossas
medidas observou-se uma diferença de sinal entre os espectros medidos no meio e nas bordas
do substrato SERS. Na maioria das medidas os melhores espectros foram obtidos na borda ,
sendo que em algumas posições da placa encontramos pontos onde o sinal SERS é
52
substancialmente amplificado comparado outras posições do substrato. Estas regiões são
conhecidas como “hot-spots”. A qualidade dos substratos pode ser definida pelo número de
“hot-spots” encontrados na sua superfície e pela média de amplificação conseguida pelo
efeito SERS em toda sua superfície. Devido a este efeito a reprodutividade da intensidade do
sinal SERS para muitos casos é um dos fatores limitantes da técnica (RU & ETCHEGOIN,
2009). Pode-se observar na Figura 5 que as bordas foram as regiões onde conseguimos uma
maior amplificação do sinal SERS, e um maior número de “hot-spots”, conforme aumenta o
tempo de deposição de prata. Entretanto um comportamento distinto é observado quando a
mesma análise é realizada no meio da placa. Nesta região pode-se observar um aumento do
sinal até 15s, seguida de uma queda de intensidade para os tempos subsequentes. A Tabela 2
mostra a relação sinal ruído (SR) do sinal SERS do Thiram para os diferentes tempos de
deposição de prata. Pode-se notar que o único espectro que não teve diferenças significativas
para o valor de SR entre o seu meio e sua borda foi o das placas mergulhadas por 15s.
Tabela 2- Relação sinal/ruído das bordas e meios das placas com diferentes tempos no AgNO 3.
Tempo no AgNO3
S/R borda
S/R meio
05
9,91
3,73
10
8,67
7,34
15
15,06
10,67
25
9,36
4,29
30
19,00
2,81
40
11,22
5,76
50
16,57
4,92
60
18,29
4,53
Como já se sabe o sinal SERS depende do tipo do material metálico e também das
estruturas rugosas formadas por este metal (RU & ETCHEGOIN, 2009; VO-DINH etal.,
1984). Assim as diferenças encontradas devem estar relacionadas com o crescimento das
nanopartiuclas de prata formadas na superfície (RU & ETCHEGOIN, 2009). Para verificar
essas estruturas formadas nos diferentes tempos de deposição foi feito a Microscopica
eletrônica de varredura (MEV). A Figura 6-13 mostra as imagens obtidas para as placas nas
regiões da borda e do centro. As estruturas encontradas são semelhantes aos vistos na
literatura (SONG et al., 2006; YI et al., 2011). Observa-se que para o tempo de 5s as
nanoparticulas estão ainda em formação, encontradas em baixa densidade superficial, tanto
53
para o meio quanto para a borda (Figura 6) somente em sua borda ocorre a formação de
aglomerados de nanocristais de prata que se arranjam na forma alinhada, formando nano fios,
similar a nano folhas, enquanto que seu meio ainda esta em formação, assim observa-se que
estas nanoestruturas são formadas primeiramente nas bordas (Figura 7). Pode-se observar na
Figura 8 que para o tempo de 15s ocorre um aumento na formação das estruturas de nano
folhas e consequentemente um aumento na densidade superficial de nanopartículas de prata.
Em tempos superiores a 15s são observados as mesmas nano folhas do de 15s porem ocorre
uma sobreposição destas estruturas e o sinal SERS piora gradativamente como consequência
do aumento das nanopartículas (Figuras 9-13). Porém este efeito só é observado no meio das
placas de 25 a 60 s, em suas bordas o sinal SERS aumenta com o tempo, isso ocorre devido à
tensão superficial que proporciona a formação de hot-spots.
54
Figura 6- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO3 por 05 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
Figura 7- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO 3 por 10 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500nm.
54
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500nm; e MEV da
Figura 8- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO3 por 15 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
Figura 9- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO3 por 25 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
55
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
Figura 10- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO 3 por 30 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
Figura 11- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO 3 por 40 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
56
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
Figura 12- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO 3 por 50 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
Figura 13- (a) Foto da placa de circuito impresso mergulhada em AgNO3 por 60 s; MEV do meio desta placa com (b) 10
da borda com (f) 10  m; (g) 05  m; (h) 1  m; (i) 500 nm.
57
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500 nm; e MEV
 m; (c) 05  m; (d) 1  m; (e) 500nm; e MEV
5.4 - CONCLUSÃO
A superfície de prata feita a partir de AgNO3 é própria para obter-se estruturas SERS ativas, e
obter o espectro do fungicida Thiram. Sendo que para adquirir um melhor sinal SERS a
superfície deve ser mergulhada por apenas 15s em solução de AgNO3, devido as namofolhas
de prata formadas na superfície metálica favorecendo a amplificação do sinal.
5.5 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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60
CAPÍTULO 6 – Considerações Finais
As diversas técnicas que compõe a espectroscopia vibracional com o intuito de
caracterização se mostrou eficiente em todos os estudos deste trabalho. O primeiro estudo
revelou que se utilizando da técnica de FTIR-PAS é possível explorar a similaridade
filogenética para diferenciação de espécies de peixes a partir da simples análise química das
escamas, revelando a influência das características ambientais sobre o metabolismo de
espécies diferentes. Este trabalho abre portas para mais pesquisas que incluem a
diferenciação de espécies e de indivíduos com análises rápidas e não destrutivas, quando
comparadas com a hoje utilizada como a análise multivariada que exige muito tempo de
pesquisa.
A caracterização por FTIR-PAS de alguns ácidos húmicos revelou que a principal
diferença entre estes materiais estão na quantidade de ácidos carboxílicos e na presença de
caulinita, proveniente da argila, presente somente nos ácidos húmicos extraídos naturalmente.
Devido a estas diferenças foi possível a correlação com o desempenho destes ácidos como
modificador de pastas de carbono para ser utilizado como eletrodo na detecção voltamétrica
do fungicida Thiram, revelando que somente o ácido húmico que contem maior índices de
ácidos carboxílicos é um bom detector deste agrotóxico. Este estudo mostra que a
caracterização de novos materiais é importante para explicar as suas reações de acordo com a
aplicação.
A utilização da técnica SERS como método de caracterização de pesticidas revelou
eficiente. Sendo que o método utilizado revelou que superfícies nanometricamente rugosas de
prata feitas a partir de AgNO3 é própria para obter-se estruturas SERS ativas, e obter o
espectro do fungicida Thiram. E para adquirir um melhor sinal SERS a superfície deve ser
mergulhada por apenas 15s em solução de AgNO3, devido as namofolhas de prata formadas
na superfície metálica favorecendo a amplificação do sinal. Este estudo mostra que a pesquisa
pelo aperfeiçoamento de técnicas já existentes tem grande importância para a evolução dos
estudos.
61