0
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO – MESTRADO EM TECNOLOGIA
AMBIENTAL
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GESTÃO E TECNOLOGIA AMBIENTAL
Rosana Louzada Müller
OBTENÇÃO DE MONO E DIACILGLICERÓIS VIA GLICERÓLISE ENZIMÁTICA
COMO ALTERNATIVA PARA APROVEITAMENTO DA GLICERINA OBTIDA NA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Santa Cruz do Sul, janeiro de 2013.
1
Rosana Louzada Müller
OBTENÇÃO DE MONO E DIACILGLICERÓIS VIA GLICERÓLISE ENZIMÁTICA
COMO ALTERNATIVA PARA APROVEITAMENTO DA GLICERINA OBTIDA NA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação
em Tecnologia Ambiental – Mestrado, Área de
Concentração em Gestão e Tecnologia Ambiental,
Universidade de Santa Cruz do Sul – UNISC, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Tecnologia Ambiental.
Orientadora: Prof. Dra. Rosana de Cassia de Souza
Schneider
Santa Cruz do Sul, janeiro de 2013
2
Rosana Louzada Müller
OBTENÇÃO DE MONO E DIACILGLICERÓIS VIA GLICERÓLISE ENZIMÁTICA
COMO ALTERNATIVA PARA APROVEITAMENTO DA GLICERINA OBTIDA NA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Esta Dissertação foi submetida ao Programa de Pós
Graduação – Mestrado em Tecnologia Ambiental,
Área de Concentração em Gestão e Tecnologia
Ambiental, Universidade de Santa Cruz do Sul –
UNISC, como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Tecnologia Ambiental.
Marco Flores Ferrão
Universidade Federal do Rio Grande do Sul -UFRGS
Ênio Leandro Machado
Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC
Dra. Rosana de Cassia de Souza Schneider
Professora orientadora
Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC
Santa Cruz do Sul, janeiro de 2013.
3
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço aos meus pais Otvino Müller e Gilce Louzada Müller pelo
exemplo de vida e apoio nas minhas decisões;
À orientadora Rosana de Cassia de Souza Schneider pela oportunidade concedida e
orientação deste trabalho;
Aos professores Luciano Marder e Ângela Lazzari e à bolsista do curso de Química
Industrial Fernanda Bock pelo auxílio prestado durante desenvolvimento deste
trabalho;
À bolsista do curso de Química Industrial Jéssica Thomé pela ajuda incondicional
prestada durante toda a realização deste trabalho;
Aos amigos e colegas de Mestrado em Tecnologia Ambiental Carolina Niedersberg,
Rangel Ghisleni, Alexandre Ferraz, Ezequiel Cremonese, Carla Cremonese e
Gilberto Falk, pela amizade e companheirismo durante esse período de convivência;
Às amigas e colegas de trabalho Fabiane Bartz e Kétling Lusche pela amizade e
apoio;
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de mestrado.
E a Deus, por sempre me guiar para o caminho correto.
4
RESUMO
OBTENÇÃO DE MONO E DIACILGLICERÓIS VIA GLICERÓLISE ENZIMÁTICA
COMO ALTERNATIVA PARA APROVEITAMENTO DA GLICERINA OBTIDA NA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Devido à políticas governamentais o Brasil tem centrado grandes esforços no
desenvolvimento de tecnologias para obtenção de biodiesel. A produção de
biodiesel gera como co-produto uma fase rica em glicerina, que representa cerca de
10% do volume total. A glicerólise enzimática surge como alternativa pra utilização
de glicerina na produção de monoacilgliceróis (MAG) e diacilgliceróis (DAG) a partir
de óleos vegetais. No presente estudo foi realizada a glicerólise enzimática dos
óleos de canola, girassol e tabaco com 16 condições reacionais variando quantidade
de glicerol, lipase, tempo e temperatura. Os produtos das reações foram avaliados
por
Cromatografia
Líquida
de
Alta
Eficiência
(HPLC),
Espectroscopia
de
Infravermelho (IV). Os resultados de conversão foram avaliados através da análise
de variância (ANOVA) e análise por componentes principais (PCA). Utilizando o óleo
de girassol se obteve um porcentual de conversão de cerca de 90% de triacilglicerol
(TAG) a monoacilglicerol e diacilglicerol, e utilizando o óleo de canola foi obtida
conversão de aproximadamente 71% de MAG+DAG. Foi verificado que a quantidade
de lipase é um fator que influencia diretamente a reação de glicerólise,
proporcionando o desenvolvimento de um método mais limpo e reduz os impactos
ambientais quando comparado ao método químico tradicional.
PALAVRAS CHAVE: glicerina, glicerólise enzimática, óleos vegetais, lipase
5
ABSTRACT
OBTAINING OF MONO-AND DIGLYCERIDES BY ENZYMATIC GLYCEROLYSIS
AS ALTERNATIVE FOR USE OF GLYCERINE OBTAINED ON BIODIESEL
PRODUCTION
Due to government policies, Brazil has focused great efforts in the development of
technologies to obtain biodiesel. The biodiesel production creates as a byproduct a
phase rich in glycerin, which represents about 10% of the total volume. The
enzymatic glycerolysis appears as an alternative to the use of glycerin in the
production of monoglycerides (MAG) and diglycerides (DAG) from vegetable oils. In
the present study was performed enzymatic glycerolysis of canola, sunflower and
tobacco oil with 16 reaction conditions varying amounts of glycerol, lipase, time and
temperature. The products of the reactions were analyzed by High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) and Infrared Spectroscopy (IR). The conversion
results were evaluated by variance analysis (ANOVA) and Principal Component
Analysis (PCA). Using sunflower oil it was obtained a conversion percentage of about
90% of triglycerides (TAG) in MAG + DAG, and using canola oil were obtained
approximately 71% of conversion of MAG + DAG. It was found that the amount of
lipase is a factor that directly influences the glycerolysis reaction, providing the
development of a cleaner method and it reduces environmental impacts when
compared to traditional chemical method.
KEYWORDS: glycerin, enzymatic glycerolysis, vegetable oils, lipase
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Reação de transterificação para obtenção de biodiesel............................ 14
Figura 2 - Reação de glicerólise enzimática. ............................................................. 21
Figura 3 - Fluxograma com as etapas da reação de glicerólise enzimática. ............. 30
Figura 4 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida do óleo de canola. ......... 35
Figura 5 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida de óleo girassol. ............ 35
Figura 6 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida do óleo de tabaco.......... 36
Figura 7 - Cromatogramas íon total obtido por CG-EM dos ésteres metílicos dos
óleos de canola, girassol e tabaco. ........................................................................... 37
Figura 8 – Espectros de infravermelho obtidos para os óleos de canola (A), girassol
(B) e tabaco (C). ........................................................................................................ 38
Figura 9 - Cromatogramas obtidos por CLAE dos produtos de glicerólise dos óleos
de canola (A), girassol (B) e tabaco (C) para o primeiro estudo................................ 41
Figura 10 - Cromatogramas obtidos por CLAE dos produtos de glicerólise dos óleos
de canola (A), girassol (B) para o segundo estudo. .................................................. 42
Figura 11 – Espectros das amostras após a aplicação da primeira derivada e
centralização dos dados na média. ........................................................................... 51
Figura 12 – Espectros de infravermelho sobrepostos representado área espectral
utilizada para Análise de Componentes Principais (PCA) com exclusão da amostra
outlier......................................................................................................................... 52
Figura 13 – Gráfico de diagnóstico de outliers para os 16 ensaios de óleo de canola
e girassol. .................................................................................................................. 52
Figura 14 – Gráfico de scores baixo – PC1 x PC2 para os 16 ensaios de óleo de
canola e girassol. ...................................................................................................... 53
Figura 15 – Avaliação Qualitativa de Impactos Ambientais, seguindo os critérios de
valor, ordem, espaço, tempo, dinâmica e plasticidade para a glicerólise enzimática.
.................................................................................................................................. 55
Figura 16 – Fluxograma com as etapas da reação de glicerólise enzimática. .......... 56
7
Figura 17 – Avaliação Qualitativa de Impactos Ambientais, seguindo os critérios de
valor, ordem, espaço, tempo, dinâmica e plasticidade para a glicerólise química. ... 56
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Estudos desenvolvidos para obtenção de MAG e DAG através de
reações enzimáticas. ................................................................................................. 23
Tabela 2 – Planejamento – ensaios de glicerólise enzimática utilizando os óleos de
canola, girassol e tabaco. .......................................................................................... 29
Tabela 3 - Parâmetros de análise para CLAE dos óleos de partida e produtos de
reação de glicerólise.................................................................................................. 31
Tabela 4 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG
e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de canola. ................................................ 43
Tabela 5 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG
e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de girassol................................................ 44
Tabela 6 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG
e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de tabaco. ................................................ 45
Tabela 7 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG
e AGL do segundo estudo utilizando óleo de canola. ............................................... 48
Tabela 8 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG
e AGL do segundo estudo utilizando óleo de girassol............................................... 49
Tabela 9 – Número de componentes principais, porcentagem de variância explicada
e porcentagem de variância acumulada. ................................................................... 50
9
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.............................................................................................. 11
2
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................... 13
2.1
Biodiesel ....................................................................................................... 13
2.2
Glicerol.......................................................................................................... 14
2.3
Triacilgliceróis ............................................................................................... 16
2.4
Mono e diacilgliceróis e suas aplicações ...................................................... 16
2.5
Lipases ......................................................................................................... 18
2.6
Reações de Glicerólise ................................................................................. 20
2.7
Avaliação de impactos ambientais................................................................ 26
3
METODOLOGIA ........................................................................................... 28
3.1
Materiais e reagentes ................................................................................... 28
3.2
Instrumentação ............................................................................................. 28
3.3
Glicerólise enzimática ................................................................................... 28
3.3.1
3.3.2
Primeiro estudo de glicerólise enzimática ..................................................... 30
Segundo estudo de glicerólise enzimática .................................................... 30
3.4
Analise dos óleos vegetais de partida .......................................................... 31
3.5
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ........................................... 31
3.6
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) ...... 32
3.7
Espectroscopia no Infravermelho (IV)........................................................... 33
3.7.1
Análise dos dados ........................................................................................ 33
3.8
Avaliação ambiental da reação de glicerólise ............................................... 34
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 35
4.1
Analise dos óleos vegetais de partida .......................................................... 35
4.2
Glicerólise enzimática ................................................................................... 39
4.2.1
4.2.2
Primeiro estudo de glicerólise ....................................................................... 40
Segundo estudo de glicerólise enzimática .................................................... 46
10
4.3
Analise dos resultados empregando espectroscopia /quimiometria ............. 50
4.4
Avaliação ambiental dos métodos de glicerólise .......................................... 54
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 58
6
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................ 59
7
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 60
ANEXO A - Matriz de identificação qualitativa de impactos ambientais da reação de
glicerólise enzimática................................................................................................. 65
ANEXO B - Matriz de identificação qualitativa de impactos ambientais da reação de
glicerólise química......................................................................................................66
11
1
INTRODUÇÃO
O aumento das preocupações ambientais com a qualidade do ar atmosférico
tem levado a indústria a tornar viável a utilização de combustíveis alternativos que
proporcionam uma queima mais limpa. A produção de biodiesel a partir de óleos
vegetais e gorduras animais tem se mostrado promissora como combustível
alternativo para motores diesel, obtendo melhor viscosidade e volatilidade
equiparando ao diesel. Durante o processo de produção do biodiesel uma fase rica
em glicerol é gerada como co-produto deste processo.1
Com a produção de biodiesel em escala industrial, estão sendo geradas
toneladas de glicerina por ano no processo.2 Neste contexto, surge a possibilidade
de utilização do glicerol como matéria prima para obtenção de monoacilgliceróis
(MAG) e diacilgliceróis (DAG), emulsificantes muito utilizados no ramo alimentício,
farmacêutico e de cosméticos.3
A síntese de MAG e DAG catalisada por lipases tem sido estudada como
alternativa ao método clássico, devido à seletividade das lipases e também à
utilização de condições reacionais brandas, resultando em produtos de melhor
qualidade e menor custo de energia
3
Os substratos naturais utilizados pelas lipases
são triacilgliceróis (TAG), e sob condições naturais as lipases catalisam a hidrólise
da ligação éster da molécula.2 Do ponto de vista ambiental, o processo de glicerólise
utilizando lipases é tecnicamente mais limpo e seguro.3
Considerando o exposto, o objetivo desse trabalho foi obter mono e
diacilgliceróis a partir da reação de glicerina com diversos tipos de óleos vegetais
(canola, girassol e tabaco), através da glicerólise enzimática e avaliar tais produtos.
Inicialmente foram realizados ensaios preliminares para otimizar as condições
reacionais, para testar a capacidade da enzima em converter triacilglicerol a mono e
diacilglicerol.
Os produtos da reação foram avaliados através de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) e Espectroscopia no Infravermelho com posterior tratamento
de dados por Análise de Componentes Principais (PCA).
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
12
Também se objetivou buscar novas tecnologias e/ou novos materiais obtidos
por processos mais limpos, que possam ser transferidos ao setor produtivo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
13
2
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Biodiesel
A intensiva busca por fontes alternativas de energia e processos sustentáveis
visando à redução da poluição ambiental e o aquecimento global do planeta tem
estimulado o mercado mundial de combustíveis limpos. Os biocombustíveis, como o
biodiesel, representam uma alternativa renovável e ambientalmente segura aos
combustíveis fósseis.4
O caráter renovável do biodiesel está apoiado no fato de que as matériasprimas utilizadas para a sua produção são provenientes de oleaginosas que, ao
contrário do petróleo5 que provém de fonte não renovável, pode ser derivado de
práticas agrícolas sustentáveis.
Por terem origem vegetal, os biocombustíveis contribuem para o ciclo do
carbono na atmosfera sendo assim considerados renováveis. O CO2 emitido durante
a queima do biocombustível é reabsorvido pelas plantas que irão produzi-lo,
causando diminuição do impacto no aquecimento do planeta, pois no balanço total
diminuem as emissões de CO2.6
Vários estudos têm demonstrado que a substituição do diesel por biodiesel
reduziria a quantidade de CO2 introduzida na atmosfera. A redução não se daria
exatamente na proporção de 1:1, pois cada litro de biodiesel libera cerca de 1,1 a
1,2 vezes mais CO2 na atmosfera do que um litro de diesel convencional. Todavia,
ao contrário do combustível fóssil, o CO2 proveniente do biodiesel é reciclado nas
áreas agricultáveis, que consequentemente geram uma nova partida de óleo vegetal
para um novo ciclo de produção.5
O biodiesel é um combustível biodegradável que pode substituir o diesel
fornecendo uma queima mais limpa.7 Segundo a Agência Nacional do Petróleo
(ANP)8, o biodiesel pode ser definido como “combustível composto de alquil ésteres
de ácidos graxos de cadeia longa, derivados de óleos vegetais ou de gorduras
animais”.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
14
O biodiesel é formado por ésteres alquílicos de óleos e gorduras, e pode ser
produzido a partir de diversas matérias primas, incluindo óleos vegetais, gorduras
animais, óleo de frituras e até graxas de alta acidez. O método mais comumente
utilizado para obtenção de biodiesel é a transterificação de óleos e gorduras.9 Esse
processo é geralmente utilizado para reduzir a viscosidade dos triacilgliceróis,
melhorando assim as propriedades físicas do biodiesel.7
Na reação de transterificação o óleo vegetal utilizado é um triacilglicerol, o qual,
sob ação de um catalisador básico e na presença um álcool (metanol ou etanol),
sofre uma transterificação formando três moléculas de ésteres metílicos ou etílicos
dos ácidos graxos (biodiesel), e liberando uma molécula de glicerol6 (Figura 1).
Figura 1 - Reação de transterificação para obtenção de biodiesel.
Devido à criação de programas governamentais de biodiesel, enormes
quantidades de glicerol estão previstas para serem geradas em um futuro próximo, o
que significa uma força inevitável para o desenvolvimento de novas tecnologias
dedicadas à transformação de tal subproduto em novos produtos.10
2.2 Glicerol
O glicerol (propano-1,2,3-triol) é um álcool trihidroxilado, líquido claro, viscoso,
de gosto doce, higroscópico (a temperaturas acima do seu ponto de fusão), é
completamente solúvel em água e álcool, pouco solúvel em dietil éter, acetato de
etila e dioxano, e insolúvel em hidrocarbonetos.9 Por ser um composto atóxico, é
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
15
bastante utilizado como aditivo alimentar, atuando como estabilizante, antioxidante,
sequestrante, emulsificante, e umectante.11
Após a reação de transterificação para obtenção do biodiesel, a glicerina bruta
é obtida pela lavagem com água, sendo composta por 80% ou mais de glicerol. A
qualidade da gordura usada na transterificação afeta diretamente o tratamento
exigido para que se produza um glicerol com qualidade aceitável.9
Dependendo da matéria prima utilizada na produção do biodiesel, a glicerina
remanescente pode conter diversos compostos químicos considerados como
contaminantes. Os mais comuns são metanol, sabão, compostos de fósforo,
potássio, cálcio, silício, sódio e zinco.12 Tais impurezas desvalorizam a glicerina
bruta, e a purificação adicional a um grau de 99% de pureza é necessária para a
utilização em indústrias cosméticas e farmacêuticas.13
Dessa forma, existe um grande interesse na purificação do glicerol ou no seu
reaproveitamento direto, sem tratamento, o que viabiliza o processo de produção de
biodiesel, e permite que este se torne competitivo mercado de biocombustíveis.4
Devido ao avanço do programa nacional do biodiesel, em 2011 foram
fabricados 2,6 bilhões de litros deste biocombustível e a produção estimada para
2020 é de 14,3 bilhões de litros. Consequentemente o volume de glicerina gerada no
ano de 2011 atingiu cerca de 260 mil toneladas apenas como coproduto do
biodiesel, volume muito superior à demanda brasileira, estimada em cerca de 40 mil
toneladas. Hoje se estima que 1,5 milhão de toneladas da substância são
provenientes das usinas de biodiesel instaladas no mundo.14
Com o objetivo de reduzir os futuros problemas ambientais por acumulação de
glicerol e tornar a produção de biodiesel mais rentável, a implementação de
estratégias biotecnológicas que utilizam a glicerina como fonte de carbono, para
obtenção de produtos de maior valor agregado, vem sendo estudada como uma
promissora alternativa e solução.4
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
16
2.3 Triacilgliceróis
Os triacilgliceróis (TAGs) são substâncias formadas pela ligação de uma
molécula de glicerol a três moléculas de ácidos graxos, cuja natureza física é
definida por fatores como comprimento da cadeia, grau de insaturação e distribuição
dos radicais. Os TAGs são os principais componentes das gorduras animal ou
vegetal.26
Os ácidos graxos representam mais de 95% da massa molecular dos
triacilgliceróis. Esses compostos estão presentes nos óleos e gorduras geralmente
constituídos por ácidos carboxílicos de cadeia longa.15 Os mais comuns apresentam
12, 14, 16 ou 18 átomos de carbono, embora ácidos com menor ou maior número de
átomos de carbono possam ser encontrados em vários óleos e gorduras,16 contendo
de 4 até 30 átomos.15
Nos ácidos graxos saturados, os átomos de carbono estão ligados entre si por
ligações simples e nos ácidos graxos insaturados por ligações duplas, sendo estes
denominados como mono-, di-, tri- e poliinsaturados.15
Os ácidos graxos que existem em maior quantidade na natureza são os ácidos
butírico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico (saturados) e os
ácidos oléico, linoléico, linolênico e araquidônico (insaturados).15 Quando saturados
possuem apenas ligações simples entre outros carbonos e pouca reatividade
química.17
O tipo e quantidade de triacilglicerol presente na mistura de óleos vegetais
dependem da fonte do óleo e da região onde a planta foi produzida.17 Os
triglicerídeos líquidos a temperatura ambiente são denominados óleos, sendo o seu
conteúdo de ácidos graxos insaturados elevado.16
2.4 Mono e diacilgliceróis e suas aplicações
Monoacilgliceróis (MAG) são surfactantes extensivamente utilizados devido as
suas
excelentes
propriedades
emulsionante,
estabilizante,
condicionante
e
plastificante. MAG são moléculas anfifílicas que consistem de uma cadeia de ácido
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
17
graxo ligado covalentemente a uma molécula de glicerol através de uma ligação
éster.18
Os monoacilgliceróis são moléculas com características emulsificantes, tendo,
portanto, uma larga aplicação nas indústrias farmacêuticas, de alimentos e
cosméticos, representando cerca de 70% dos emulsificantes sintéticos nessas
indústrias. Esses surfactantes são amplamente utilizados por não apresentarem
efeitos colaterais quando ingeridos ou irritações na pele.19
Na indústria farmacêutica, MAGs são utilizados como excipientes em
comprimidos e como emolientes para medicamentos de liberação programada. Na
indústria alimentar, MAGs são os emulsionantes mais comuns para produtos de
padaria, margarinas, produtos lácteos, de confeitaria, molhos, e outros. Na indústria
cosmética, eles são utilizados como agentes de texturização e para melhorar a
consistência de cremes e loções. Além disso, devido as suas excelentes
propriedades lubrificantes e plastificantes, os MAG são utilizados na indústria têxtil
de processamento, na produção de materiais plásticos e na formulação de óleo para
diferentes tipos de máquinas.20
Os MAGs também possuem aplicabilidade em sínteses orgânicas, onde são
utilizados como intermediários sintéticos e como blocos de construção para
obtenção de compostos quirais.21 Alguns efeitos benéficos e propriedades
nutricionais recém descobertas que contribuem para sua larga aplicação foram
reportados, tais como atividade antimicrobiana da monolaurina, monomiristina e
monolinoleína, função de redução de peso do 1,3-diglicerídeo.22
Diacilgliceróis (DAG) são ésteres de glicerol em que dois dos grupos hidroxila
são esterificados com ácidos graxos. Eles existem em duas formas isoméricas
diferentes: 1,2-(2,3)-DAG e 1,3-DAG, e ocorrem como componentes naturais de
glicerídeos em vários óleos e gorduras em níveis superiores a 10%.23
Mesmo que os DAGs ocorram em menor escala quando comparado com os
constituintes de gorduras e óleos comestíveis, estes tem atraído um interesse
particular recentemente devido à sua grande importância e propriedades benéficas à
sua saúde humana.24
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
18
Há afirmações recentes de que os óleos enriquecidos com DAG podem
superar problemas de obesidade e de doenças associadas ao consumo excessivo
de gordura. Devido ao seu efeito benéfico à saúde, bem como suas propriedades
emulsificantes, esforços têm sido tomados para produzir DAG de uma forma mais
rápida e econômica.25
Os DAG também são utilizados como aditivos funcionais em alimentos, na área
medicinal e em indústrias de cosméticos, muitas vezes associados com MAGs. Tais
compostos foram aprovados para uso como emulsificante e para diversas aplicações
em alimentos nos Estados Unidos.26
Os MAG e DAG são produzidos industrialmente através da glicerólise de
triacilgliceróis com glicerol, a altas temperaturas (>200 °C), na presença de
catalisadores inorgânicos. Devido às altas temperaturas utilizadas, esta reação gera
subprodutos indesejáveis, decorrentes de reações de polimerização de ácidos
graxos. Estes componentes conferem cor escura e odor desagradável ao produto.27
Os monoacilgliceróis (MAGs) e os diacilgliceróis (DAGs) são os produtos mais
valiosos que se obtém em reações de glicerólise, e devido a sua importância
mundial como aditivos ativos na superfície em uma gama extensiva de alimentos,
considerável atenção foi dada recentemente para melhorar sua síntese.26
2.5 Lipases
As lipases (triglicerol acil-hidrolases, EC 3.1.1.3) são classificadas como a/b
hidrolases e atuam sobre ligações éster presentes em acilgliceróis, liberando ácidos
graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de esterases. A diferença entre
uma lipase e uma esterase (EC 3.1.1.1) está no fato que a primeira catalisa reações
de substratos insolúveis em água, enquanto que a esterase age em substratos
solúveis.28
Estas enzimas são importantes biocatalisadores porque atuam em condições
reacionais
brandas,
são
estáveis
em
solventes
orgânicos,
apresentam
especificidade ao substrato29, não requerem cofatores, atuam em uma faixa de pH
relativamente grande, são muito estáveis neste meio, apresentam especificidade,
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
19
regiosseletividade, quimiosseletividade, enantiosseletividade. Possuem a habilidade
de
catalisar
reações
de
esterificações,
transesterificações
(acidólise,
interesterificação, alcoólise), aminólise e tiotransesterificação em solvente orgânico
anidro, sistema bifásico e em solução micelar com alta especificidade.28,30
Lipases são utilizadas para várias transformações em microemulsões, e
dependendo da natureza dos substratos e produtos, três tipos de reação podem ser
previstos. Na primeira reação, dois substratos, tais como os álcoois alifáticos de
cadeias longas e ácidos graxos, produzem um éster solúvel em óleo. No segundo
caso, um dos substratos é hidrofílico (glicerol e dióis de cadeia curta), e o outro
substrato é um ácido graxo, obtendo um produto solúvel em interfase micelar ou em
fase orgânica. No terceiro caso, o substrato é um triacilglicerol e os produtos da
hidrólise são solúveis em água (por exemplo, glicerol), ou solúveis em interfase
micelar ou em fase orgânica contínua (por exemplo, mono e diacilglicerol e/ou
ácidos graxos).31
Escolhendo a lipase adequada é possível controlar quais produtos são
gerados e minimizar as reações secundárias devido a sua especificidade. Tal
versatilidade torna as lipases interessantes para aplicações em indústrias de
alimentos, detergentes, cosméticos, papel, farmacêutica e têxtil.29
A capacidade de catalisar reações com solvente orgânico foi descrita como
uma característica pertencente principalmente às lipases.3 Neste meio as lipases
catalisam a transferência de grupos acilas de compostos doadores para uma ampla
faixa de compostos aceptores diferentes da água.32
Existem inúmeras vantagens no emprego de sistemas não-aquosos para
biocatálise, porém as enzimas geralmente mostram baixa atividade catalítica nestes
meios, em comparação com soluções aquosas. Nesse sentido, ainda existem
problemas relacionados à aplicação de enzimas em reações que utilizam solventes
orgânicos, entre estes a instabilidade da enzima em solventes e termoinstabilidade.3
Algumas lipases são muito utilizadas em reações enzimáticas, tais como:
lipase de pâncreas de porco (LPP), Candida rugosa (LCR), Rhizomucor miehei
(LRM), Candida antarctica (CAL B), Pseudomonas sp. (LPS), Thermomyces
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
20
lanuginosus (LTL), Pseudomonas fluorescens (LPF), Burkolderia cepacia (LBC) e
Penicillium camembertii (LPC).3
As plantas de reações enzimáticas podem ser construídas e operadas com
menor capital, custos de energia e baixo custo de tratamento de resíduos. As
enzimas são biodegradáveis, e quando utilizadas em quantidades entre 0,1-1,0% do
substrato, a contribuição para a DBO (demanda bioquímica de oxigênio) em efluente
é desprezível.29
2.6 Reações de Glicerólise
Nos últimos quinze anos têm surgido um crescente interesse na tecnologia de
modificação dos óleos e gorduras. Esta tendência pode ser atribuída principalmente
ao fato desses materiais serem obtidos de fontes naturais e empregados como
importantes
matérias-primas
para
as
indústrias
químicas,
farmacêuticas
e
alimentícias.32 A glicerólise é um tipo de reação de interesterificação utilizada para a
transformação de óleos e gorduras.11
Atualmente a produção de MAG em larga escala vem sendo realizada por
glicerólise química, que traz problemas como baixo rendimento de MAG, alta
temperatura de operação, alto consumo de energia e formação de subprodutos
indesejáveis. A glicerólise química não é adequada para a produção de
monoglicerídeos insaturados, pois estes não são estáveis a altas temperaturas.18
A reação de glicerólise química é acelerada pela utilização de catalisadores
inorgânicos, como NaOH ou Ca(OH)2, a temperaturas entre 220–260 ºC. Contudo,
essas condições levam a formação de produtos indesejáveis e, portanto, é
necessária a purificação extensiva desses produtos.21
A substituição de catalisadores inorgânicos por lipases na síntese de gliceróis
traz vantagens como temperaturas mais baixas, o que impede a coloração e
formação de subprodutos, e diminui o consumo de energia e geração de poluentes.
Além disso, possibilita a síntese de gliceróis com ácido graxos insaturados, que é
dificilmente alcançado pelo método químico.22
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
21
Os processos enzimáticos têm como vantagens condições reacionais brandas
e elevada pureza de MAG, em comparação com métodos químicos. Os métodos de
síntese enzimática de MAG incluem esterificação, hidrólise e glicerólise. A glicerólise
catalisada por enzimas oferece um elevado nível de conversão de substrato: 3 mol
de MAG podem ser formados a partir de 1 mol de óleo. A glicerólise enzimática para
a produção de MAG resulta em misturas de monoacilgliceróis, diacilgliceróis,
triacilgliceróis e um pouco de glicerol18 (Figura 2).
Figura 2 - Reação de glicerólise enzimática.
O conhecimento sobre o mecanismo de reação pode direcionar a glicerólise
para a formação de apenas um produto de interesse (MAG ou DAG) ou a
maximização de ambos (MAG e DAG). A partir do mecanismo de reação, pode-se
verificar que um mol de TAG reage com 1 mol de glicerol para produzir um mol de
MAG e DAG. Além disso, 1 mol de DAG pode reagir com 1 mol de glicerol, para
formar 2 mol de MAG. Se o interesse principal é a produção de DAG, um excesso de
TAG/restrição de glicerol pode favorecer essa reação.33
A composição final do meio reacional dependerá dos valores das constantes de
equilíbrio de ambas as reações (formação de mono ou diacilgliceróis), sendo que os
produtos são dependentes da temperatura e da proporção inicial de glicerol em
relação à concentração do triglicerídeo de partida.11
Vários pesquisadores têm centrado seus estudos em produção enzimática de
DAG por esterificação, glicerólise e hidrólise parcial de óleos e gorduras, devido às
vantagens de relacionadas às enzimas, tais como condições reacionais brandas,
alta seletividade e eficiência de catálise.34
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
22
Devido às desvantagens do processo convencional, o uso de enzimas como
catalisadores parece ser um potencial assim como uma alternativa para
considerações práticas.35 A temperatura muito mais baixa utilizada (menos que
80ºC) melhora a qualidade do produto, além de haver contribuição quanto ao gasto
energético.36
A minimização da degradação térmica dos produtos e a economia de energia
são provavelmente os maiores atrativos na substituição da glicerólise química pela
enzimática. Porém, apesar da aparente superioridade, os métodos enzimáticos
ainda não atingiram um nível de exploração comercial proporcional ao seu
potencial.37
Nas reações de esterificação, os DAGs são sintetizados através da
esterificação de ácidos graxos e glicerol com remoção simultânea de água. No
entanto, uma alta quantidade de ácidos graxos livres são necessários. Na hidrólise
parcial, uma grande quantidade de ácidos graxos livres é gerada e o rendimento de
DAG é relativamente baixo. Comparativamente, a glicerólise de gorduras e óleos
naturais é um processo em perspectiva para produzir produtos de DAG.34
Com o crescente interesse das indústrias alimentícias em fabricar produtos
mais saudáveis devido às exigências de mercado, ou seja, produtos livres de
reações de polimerização e de gorduras, a substituição da rota química pela
enzimática na produção de MAG e DAG vem sendo avaliada como uma alternativa
interessante.27
Diversos trabalhos podem ser destacados quanto à produção de MAG e DAG
através de reações enzimáticas. Com relação à reação de glicerólise, destacam-se
os trabalhos dos autores Cetina (2011), Ferreira-Dias (2003), Fiametti (2011),
Fregolente (2009), Freitas (2009), Gonçalves (2012), Krüger (2010), Liu (2012),
Pawongrat (2007), Valério (2009) e Wang (2011).
A Tabela 1 lista trabalhos recentes desenvolvidos através reações enzimáticas
de glicerólise, hidrólise e esterificação, descrevendo as condições reacionais e
rendimentos obtidos para MAG e DAG.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
23
Tabela 1 – Estudos desenvolvidos para obtenção de MAG e DAG através de reações enzimáticas.
Enzima / forma
Substrato
Sistema
Cândida antarctica
B
Óleo de soja
Livre de solvente
Candida antarctica
(solução aquosa)
Ácido palmítico
Acetona
Candida rugosa
imobilizada em filme
de quitosana
Trioleína
Candida rugosa
imobilizada em
poliuretano
hidrofílico
Óleo de oliva
residual da torta
Hexano
Lecitase imobilizada
em resina
polimérica
Ácido oleico
Livre de solvente
Lecitase imobilizada
em resina
polimérica
Óleo de soja
Livre de solvente
acetona:isoctano
Condições reacionais
Glicerol/TAG = 8 (razão molar)
Lipase: 2% (rel. óleo)
Água: 3,5% (rel. glicerol)
70 ºC, 300 rpm, 24h
Ácido palmítico: 0,46 g
Glicerol: 0,65 g
Acetona: 4 mL
Lipase: 50 µL
Água: 1%
50 ºC, 300 rpm, 24h
Glicerol:trioléina = 3:1 (razão
molar)
Lipase: 90 mg
banho termostatizado, 35 e 45
ºC, 300 rpm, 24h
Razão glicerol/óleo: 0,5 - 1 – 2 3 – 3,5
Óleo/hexano = 30% (m/v)
Agitação, 30 ºC, 24h
Ácido oleico:glicerol = 1:5 (razão
molar)
Enzima: 1,5%
Água: 4%
45 ºC, 200 rpm, 1,5h
Glicerol:óleo = 10:1 (razão
molar)
Enzima: 5%
Água: 5%
45 ºC, 200 rpm, 12h
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
Rendimento
Autor/Referência
MAG: 24,2%
DAG: 48,22%
Fregolente, 2009
MAG: 87%
DAG: 3,3%
Kapoor, 2012
27
38
a 35 ºC:
MAG: 68,39%
DAG: 17,53%
a 45 ºC:
MAG: 31,64%
DAG: 41,02%
Cetina, et al. (2011) 39
Relação = 1
MAG: 32%
DAG: 18%
Ferreira-Dias, 2003 40
DAG: 54,8%
Liu, 2011 41
DAG: 53,7%
Liu, 2012 52
24
Lipozyme
Novozyme 435
imobilizada em
resina aniônica
macroporosa
Óleo de palma
Óleo de oliva
Livre de solvente
Livre de solvente
Novozyme 435
Óleo de oliva
t-butanol
Novozyme 435
imobilizada
Óleo de oliva
n-butano
Novozyme 435
Óleo de soja
t-butanol
Lipase PS
imobilizada em
SiO2-PVA
Óleo de babaçu
Livre de solvente
P. cammbertii
imobilizada em
SiO2-PVA
Ácido láurico
Livre de solvente
Óleo: 10 g
Lipase: 2%
Água: 5% (rel. óleo)
Ultrassom, 30 ºC, 300 rpm
Enzima:7,5%
Surfactante AOT: 16%
Glicerol:óleo = 2:1 (razão molar)
Ultrassom, 65 ºC, 600 rpm, 2h
Glicerol:óleo = 3:1 e 0,5:1,5
(razão molar)
Enzima: 10%
70 ºC, 600 rpm, 8h
Glicerol:óleo = 2:1 (razão molar)
Solvente:óleo = 4:1 (m/m)
Enzima: 7,5%
Surfactante AOT: 7,5%
70 ºC, 600 rpm, 10 bar, 2h
Óleo:glicerol = 6,23:1 (razão
mássica – 40% de óleo em
solvente)
Lipase: 1%
50 ºC, 200 rpm, 36h
Óleo:glicerol = 1:15 (razão
molar)
Enzima: 10%
55 ºC, 200 rpm, 6h
Glicerol:ácido láurico = 8,1
(razão molar)
Lipase: 40g
Banho termostatizado, 45 a 65
ºC, 200 rpm, 12h
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
DAG: 39,77%
DAG:
25,9% (com AOT)
38,95% (sem AOT)
Gonçalves, 2012 23
Fiametti, 2011
10
MAG: 53% (razão
glicerol:óleo 3:1)
DAG: 50% (razão
glicerol:óleo 0,5:1,5)
Krüger, 2010 26
MAG: 70%
DAG: 11%
Valério, 2009 36
DAG: 48,5%
Wang, 2011 34
MAG: 25%
DAG: 63%
Freitas, 2009 2
MAG: 60%
(monolaurina)
Freitas, 2010 42
25
Pseudomonas sp.
imoblizada em
resina polimérica
Oleína de palma
acetona:isoctano 3:1
(v/v)
Pseudomonas sp
imobilizada em
polipropileno
Oleína de palma
Livre de solvente
Pseudomonas sp
imobilizada em
polipropileno
Oleína de palma
Acetona:isoctano 3:1
Pseudomonas sp
imobilizada em
polipropileno
Oleína de palma
Acetona:isoctano 3:1
Pseudomonas
fluorescence
imobilizada em
polipropileno
Óleo de atum
terc-butil metil éter
(TBME)
S. simulans
imobilizada em
CaCO3
Ácido oleico
Livre de solvente
TAG: 7,16 mM
Glicerol: 19,14 mM
Água: 9,89 mM
45 ºC, 300 rpm
Glicerol/oleína = 2,7 (razão
molar)
Lipase: 1,5 g
Água: 4%
45 ºC, 300 rpm
Glicerol:oleína = 8:1 (razão
molar)
Lipase: 50%
Água: 10% (rel. glicerol)
Solvente: 20 mL
45 ºC, 24h
Glicerol:oleína = 12:1 (razão
molar – 10% em solvente)
Lipase: 1,5 g
Água: 10%
45 ºC, 300 rpm, 24h
Glicerol:óleo = 3:1 (razão molar
– 10% em solvente)
Lipase: 30% (rel óleo)
Água: 4% (rel. glicerol)
45 ºC, 300 rpm, 24h
Ácido oleico/glicerol = 0,2 (razão
molar)
Lipase: 100 IU
Água: 5%
37 ºC, 200 rpm, 48h
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
MAG: 82%
Cheirsilp, et al. (2011)
43
MAG: 20,74%
Kaewthong, 2005 20
MAG: 55,75%
Kittikun, 2004 44
MAG: 70,1%
Kittikun, 200845
MAG: 24,6%
Pawongrat, 2007 21
MAG: 71,68%
Ghamgui, 2006 46
26
2.7 Avaliação de impactos ambientais
Os impactos ambientais são uma cadeia de efeitos que se produzem no meio
natural e social, como conseqüência de uma determinada ação.49 Considerando o
avanço tecnológico no desenvolvimento de processos produtivos, é de suma
importância avaliar quais os impactos relacionados a cada processo.
Como ferramenta de avaliação de impactos pode ser utilizada a Matriz de
Interação derivada da Matriz de Leopold, a qual objetiva identificar aspectos
ambientais e determinar os impactos ambientais associados a estes aspectos.47
A
matriz
de
Interação
qualifica
os
impactos
seguindo
critérios
com
características de valor, ordem, espaço, tempo, dinâmica e plástica. Após lançados
na matriz, as ações impactantes são multiplicadas pelos fatores ambientais
resultando em impactos identificados, os quais apresentam subsídios para adoção de
medidas ambientais minimizadoras ou potencializadoras.47
No Sistema de Gerenciamento Ambiental e Tecnologias mais Limpas adotada
pelo CNTL48, a identificação dos aspectos ambientais segue uma numeração
seqüencial conforme o fluxograma do processo produtivo e posteriormente listados
os aspectos de entrada e saída. As manifestações dos impactos ambientais são
identificadas como se não houvesse nenhuma forma de controle, exceto as que
desempenhavam funções essenciais de processo.
Os impactos aos meios físicos, bióticos e antrópicos provenientes das etapas
do processo produtivo são plotadas na matriz de integração e correlacionados com
cada elemento do meio.
Para qualificar os impactos, adotam-se os critérios apresentados por Silva49 e
estão caracterizados a seguir.
a) Características de Valor:
- Impacto positivo: quanto uma ação causa melhoria da qualidade de um parâmetro;
- Impacto negativo: quando uma ação causa dano à qualidade de um parâmetro.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
27
b) Característica de Ordem:
- Impacto direto: quando resulta de uma simples relação de causa e efeito;
- Impacto indireto: quando é uma reação secundária em relação à ação.
c) Características Espaciais:
- Impacto local: quando a ação circunscreve-se ao próprio sítio e suas imediações;
- Impacto regional: quando um efeito se propaga por uma área além das imediações;
- Impacto estratégico: o componente é afetado coletivo, nacional ou internacional.
d) Características Temporais:
- Impacto em curto prazo: quando o efeito surge no curto prazo (a determinar);
- Impacto em médio prazo: quando o efeito se manifesta no médio prazo (a
determinar);
- Impacto em longo prazo: quando o efeito se manifesta no longo prazo (a
determinar).
e)
Características Dinâmicas:
- Impacto temporário: quando o efeito permanece por um tempo determinado;
- Impacto Cíclico: quando o efeito se faz sentir em determinados períodos;
- Impacto permanente: executada a ação, os efeitos não cessam de se manifestar
num horizonte temporal conhecido.
f)
Características Plásticas:
- Impacto reversível: a ação cessada, o fato ambiental retorna às condições
originais;
- Impacto irreversível: quando cessada a ação, o fator ambiental não retorna às suas
condições originais, pelo menos num horizonte de tempo aceitável pelo homem.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
28
3
METODOLOGIA
3.1 Materiais e reagentes
-
Óleo refinado de canola
-
Óleo refinado de girassol
-
Óleo bruto de tabaco
-
Glicerina PA Synth
-
Lipase Novozymes 435
-
Água deionizada
-
Acetonitrila grau HPLC Merck
-
Metanol grau HPLC Merck
-
2-propanol grau HPLC Panreac
-
n-hexano grau HPLC Merck
3.2 Instrumentação
-
Balança analítica;
-
Câmara incubadora com agitação orbital (shaker);
-
Cromatógrafo líquido Shimadzu modelo UFLC, equipado com coluna C18 de
sílica gel de fase reversa e detector UV-VIS de arranjo de diodo;
-
Cromatógrafo gasoso Shimadzu modelo QP 2010 Plus, equipado com coluna
DB5 MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm) e detector de espectrometria de massas;
-
Espectrômetro de infravermelho Perkin Elmer modelo Spetrum 400, equipado
com acessório para refletância total atenuada universal (UATR);
-
Software Pirouette versão 3.1 para tratamento de dados;
3.3 Glicerólise enzimática
Visando otimizar as condições reacionais de glicerólise enzimática para obter o
melhor rendimento, foram planejados 16 ensaios a serem realizados com glicerina
comercial (PA) e óleos de canola, girassol e tabaco.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
29
Conforme o ensaio houve variações na quantidade de glicerol (razão mássica
glicerol/óleo), porcentagem de lipase, tempo e temperatura de reação. A quantidade
de óleo foi mantida fixa, bem como a quantidade de água (3% em relação à massa
do óleo). A relação mássica de glicerina/óleo, quantidade de água e porcentagem de
lipase foram baseadas na metodologia desenvolvida por Fregolente.27 A Tabela 2
mostra o planejamento experimental com as condições reacionais.
Tabela 2 – Planejamento – ensaios de glicerólise enzimática utilizando os óleos de
canola, girassol e tabaco.
Ensaio*
Glicerina/óleo
(m/m)
1
0,9
2
1,2
3
0,9
4
1,2
5
0,9
6
1,2
7
0,9
8
1,2
9
0,9
10
1,2
11
0,9
12
1,2
13
0,9
14
1,2
15
0,9
16
1,2
Lipase (%)**
Tempo (h)
Temperatura
(ºC)
10
24
20
45
10
36
20
10
24
20
55
10
36
20
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
A Figura 3 mostra o fluxograma das reações, nas quais os reagentes são
adicionados a um erlenmeyer com tampa e são agitados em shaker orbital a
temperatura e tempo determinados no planejamento. Após o término da reação, as
amostras são colocadas em repouso para haver a separação das fases, e em
seguida são retiradas alíquotas dos produtos para análises.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
30
TG + MAG + DAG
Glicerina/Óleo:
0,9 e 1,2 (m/m)
Água: 3%
Lipase: 10 e 20%
Glicerólise
200 rpm;
45 e 55 º C;
24 e 36h
Separação
de fases
Análises:
HPLC, IV
Lipase
Glicerina
remanescente
Figura 3 - Fluxograma com as etapas da reação de glicerólise enzimática.
3.3.1 Primeiro estudo de glicerólise enzimática
Os 16 ensaios foram realizados com os óleos de canola, girassol e tabaco
partindo da utilização de 3g de óleo Os demais reagentes e condições foram
aplicados conforme o planejamento experimental apresentado anteriormente. Todos
os ensaios ocorreram sob agitação de shaker orbital a 200 rpm. A caracterização
dos compostos obtidos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE).
3.3.2 Segundo estudo de glicerólise enzimática
Os resultados obtidos no primeiro estudo de glicerólise foram continuadas com
uma outra condição de produção, buscando melhor homogeneidade do meio
durante a glicerólise (ver 4.2). Portanto, as 16 reações foram repetidas utilizando
uma maior proporção dos reagentes e utilizando os óleos de canola e girassol. Os
ensaios foram realizados com a utilização de 25g de óleo e 3% de água (em relação
à massa do óleo), e os demais reagentes e condições foram aplicados conforme o
planejamento experimental apresentado anteriormente. Todos os ensaios ocorreram
sob agitação de shaker orbital a 200 rpm.
No decorrer das reações foram retiradas alíquotas para análise dos produtos (a
cada 12h). A caracterização dos compostos obtidos foi realizada por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) e espectroscopia de infravermelho (IV).
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
31
3.4 Analise dos óleos vegetais de partida
Os óleos vegetais (canola, girassol e tabaco) utilizados nas reações foram
analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) e espectroscopia de infravermelho
(IV), para assim determinar suas condições iniciais e posteriormente compará-los
com a mistura de produtos para confirmar a ocorrência das reações.
3.5 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
As análises por CLAE foram realizadas em um cromatógrafo líquido Shimadzu
modelo UFLC, com coluna empacotada Phenomenex Luna C18 de sílica gel ou
coluna Waters C18 e detector UV-VIS de arranjo de diodo.
As fases móveis utilizadas foram denominadas como “A” e “B”, sendo a fase “A”
acetonitrila com metanol (relação 4:1 v/v), e a fase “B” hexano com isopropanol
(relação 8:5 v/v). A eluição foi realizada em gradiente, conforme mostrado na Tabela
3, que também apresenta os demais parâmetros de análise.
Tabela 3 - Parâmetros de análise para CLAE dos óleos de partida e produtos de
reação de glicerólise.
Tempo (min)
% Eluente A
% Eluente B
0
100
0
2,5
66
34
35
66
34
40
100
0
Tempo de corrida
50 min
Fluxo FM
0,8 mLmin-1
Temperatura forno
40 ºC
Λ
275 nm
Os óleos vegetais e os produtos das reações foram preparados para análise
através de diluição em fase móvel “B” com relação 1:20 (v/v). O mesmo
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
32
procedimento foi realizado para os óleos vegetais utilizados na reação para qualificar
os produtos através de comparação com os tempos de retenção.
O processamento dos dados gerados nas análises dos produtos foi realizado
pelo software LabSolutions, o qual gerou os cromatogramas, integrou e quantificou
as áreas dos picos. Para obter o porcentual relativo de conversão de TAG em
MAG+DAG e AGL foram utilizados os valores de área quantificados em Área%
(porcentagem relativa de área de um pico com relação ao total de área de todos os
picos). O resultado valor de conversão foi calculado através da porcentagem de
MAG+DAG e AGL presente no óleo no final da reação em relação a quantidade
inicial de TAG presente no início da reação. Através da porcentagem relativa de
cada pico é possível estimar o valor de conversão do óleo de partida aos produtos
de interesse.
3.6 Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)
As amostras de óleos vegetais foram preparadas para análise de cromatografia
gasosa através do processo de derivatização pelo método BF3/metanol. As amostras
foram refluxadas com solução metanólica de NaOH, e após foi adicionada solução
de BF3/metanol deixando em ebulição. Da mesma forma foi adicionado heptano
mantendo o sistema de refluxo. Após deligado o aquecimento foi adicionada solução
saturada de cloreto de sódio para a separação das fases. Foi adicionado à fase
heptânica uma ponta de espátula de Na2SO4 anidro, e deste modo os ácidos graxos
presentes nos óleos foram convertidos a ésteres metílicos de ácidos graxos. O
extrato foi armazenado em balão volumétrico até o momento da análise.
As análises por CG-EM foram realizadas em um cromatógrafo gasoso
Shimadzu modelo QP 2010 Plus, equipado com coluna DB5 MS (30m x 0,25 mm x
0,25 µm) e detector de espectrometria de massas. O modo de injeção utilizado foi do
tipo Split (15:1), o modo de aquisição foi do tipo SCAN e o tempo de corrida foi de 50
minutos. A temperatura do injetor foi mantida em 250 ºC, a fonte de ionizacao a 280
ºC e a interface em 290 ºC. A programacao de temperatura do forno iniciou em 80 ºC
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
33
e apos foi elevada a 280 ºC com rampa de aquecimento de 5 ºC/min e mantida por
10 minutos.
3.7 Espectroscopia no Infravermelho (IV)
Os produtos obtidos pelo segundo estudo de glicerólise enzimática foram
analisados por espectroscopia de infravermelho (IV), sendo realizadas em um
espectrômetro de infravermelho do tipo FT-IR/FT-NIR (infravermelho médio com
transformada de Fourier), marca Perkin Elmer modelo Spectrum 400, equipado com
acessório para refletância total atenuada universal (UATR). A leitura foi executada
na região do infravermelho médio em faixa espectral de 650 a 4000 cm-1, com 32
varreduras com resolução de 4,0 cm-1, após ser realizada a leitura do branco.
3.7.1 Análise dos dados
Os resultados obtidos através da cromatografia líquida foram avaliados
estatisticamente pelo teste de variância (ANOVA) entre duas variáveis. A análise de
variância utilizada foi de um único fator (variável independente), sendo este,
normalmente, com dois níveis, e de uma variável de estudo (variável dependente).
Foram testadas duas hipóteses:
- H0: As médias da variável dependente nos dois níveis não diferem entre si;
- H1: As médias da variável dependente nos dois níveis diferem entre si.
A aceitação do H0 revelará que o fator considerado não acarretará mudanças
significativas na variável de estudo. Por outro lado, a rejeição de H0 indicará, com
risco α, que o fator considerado exerce influência sobre a variável de estudo.50
Mesmo que seja possível concluir se as variáveis do planejamento (glicerol,
lipase, temperatura e tempo) influenciam nos resultados, é preciso decidir se
influenciam o suficiente para poderem ser consideradas de importância prática.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
34
Os dados obtidos pelas análises IV do segundo estudo de glicerólise
enzimática foram processados utilizando o software Pirouette (3.1) para a realização
da Análise por Componentes Principais (PCA). Essa análise permite identificar a
relação entre características extraídas dos dados analisados. Neste caso, a intenção
foi verificar se há relação entre as variáveis da reação e o porcentual de conversão
de TAG em MAG+DAG.
3.8 Avaliação ambiental da reação de glicerólise
Para melhor identificação dos aspectos e avaliação dos impactos ambientais
decorrente da reação de glicerólise, foi utilizado como ferramenta uma Matriz de
Interação derivada da matriz de Leopold.
Com a intenção de obter um comparativo ao método de glicerólise enzimática,
o método de glicerólise químico também foi avaliado quanto aos impactos
ambientais. Como o processo de reação possui uma seqüência para ser executado,
utilizaram-se as etapas envolvidas nas reações para melhor identificar as atividades
impactantes.
As etapas envolvidas nos métodos enzimático e químico são listadas abaixo:
-
1ª etapa – Neutralização da glicerina: reação em batelada para controlar a
acidez da glicerina bruta e obter separação de fases.
-
2ª etapa - Reação de Glicerólise: é onde ocorre o processo propriamente dito.
-
3ª etapa – Separação do produto: separação da fase oleosa juntamente com os
produtos através de decantação para método enzimático, e separação por uso
de solvente para o método químico.
A matriz foi construída correlacionando as etapas dos métodos com os
respectivos impactos ambientais quanto às características de valor, ordem,
espaciais, temporais, dinâmicas e plásticas.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
35
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Analise dos óleos vegetais de partida
A análise realizada por cromatografia líquida revelou o perfil de cada óleo, o
qual representa os sinais referentes aos triacilgliceróis presentes nos mesmos. Essa
informação é bastante relevante, pois indica o ponto de partida das reações. As
Figuras 4, 5 e 6 mostram os cromatogramas dos óleos de canola, girassol e tabaco,
respectivamente.
Figura 4 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida do óleo de canola.
(uso de coluna C18 - 5 µm x 250 x 4.6 mm)
Figura 5 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida de óleo girassol.
(uso de coluna C18 - 5 µm x 250 x 4.6 mm)
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
36
Figura 6 - Cromatograma obtido por cromatografia líquida do óleo de tabaco.
(uso de coluna C18 - 5 µm x 250 x 4.6 mm)
A Figura 7 (A, B e C) mostra os cromatogramas obtidos por cromatografia
gasosa-espectrometria de massas para os óleos derivatizados de canola, girassol e
tabaco, respectivamente, onde pode ser observada a presença dos ácidos graxos:
palmítico (C 16:0), esteárico (C 18:0) e oléico (C 18:1), linoléico (C 18:2).
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
37
(x10,000,000)
T IC
C18:2
1.75
1.50
C16:0
1.25
1.00
C18:1
0.75
C18:0
0.50
(A)
0.25
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
(x10,000,000)
2.00 T IC
C18:2
1.75
1.50
C16:0
1.25
C18:1
1.00
0.75
0.50
C18:0
0.25
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
(B)
40.0
45.0
(x10,000,000)
2.00 T IC
C18:2
1.75
1.50
C16:0
1.25
1.00
C18:1
0.75
0.50
0.25
(C)
C18:0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
Figura 7 - Cromatogramas íon total obtido por CG-EM dos ésteres metílicos dos
óleos de canola, girassol e tabaco.
A análise por espectroscopia de infravermelho revela as principais ligações
constituintes dos triacilgliceróis dos óleos vegetais (Figura 8 - A, B e C). No
comprimento de onda de ~1740 cm-1 verifica-se as deformações axiais da ligação
C=O corresponde ao éster, entre 2800 e 3000 cm-1 as deformações axiais das
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
38
ligações C-H (CH2 e CH3), em ~1460 cm-1 a deformação angular da ligação C-H e
em 1150 cm-1 a deformação axial da ligação C-O-C éster.
(A)
(B)
(C)
Figura 8 – Espectros de infravermelho obtidos para os óleos de canola (A), girassol
(B) e tabaco (C).
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
39
4.2 Glicerólise enzimática
Primeiramente foi realizada a analise qualitativa dos cromatogramas obtidos
com base no perfil cromatográfico dos produtos de reação comparados aos
cromatogramas dos óleos de partida, conforme Figura 7. Nos cromatogramas
obtidos no decorrer das reações, se observa a diminuição do tamanho dos picos
referentes aos triacilgliceróis e consequente aparecimento de picos adjacentes.
Como não foram utilizados padrões de glicerídeos para comparação e quantificação
dos produtos, utilizou-se de conhecimento de interação dos compostos com a fase
móvel e coluna do cromatógrafo para identificar os compostos. Sabe-se que a
reação de glicerólise leva a formação de MAG, DAG e AGL, e que uma quantidade
de TAG não reagida pode também estar presente.
Os sinais correspondentes ao óleo (TAG) foram identificados através de
comparação com o perfil de cada óleo, uma vez que foram analisados por CLAE os
três óleos utilizados nas reações.
Analisando os componentes das fases móveis, se pode concluir que a Fase “A”
apresenta polaridade superior a Fase “B”, uma vez que acetonitrila e metanol são
compostos polares, e na mistura hexano:isopropanol somente o segundo composto
é polar. Na análise cromatográfica realizada nesse trabalho o gradiente de eluição
iniciou com a Fase “A” e no decorrer da análise foi inserida a Fase “B”.
Considerando o fato de os ácidos graxos livres serem compostos de alta
polaridade e de menor massa molecular, estes devem eluir primeiramente
juntamente com a fase mais polar (A). Seguindo a ordem de polaridade dos
compostos, de aumento de massa molecular, e também a diminuição de polaridade
do eluente pela adição de fase móvel B, a ordem de eluição seguinte deve ser
monoacilglicerol, diacilglicerol e triacilglicerol.
Analisando os cromatogramas das reações e dos óleos puros, e considerando
o exposto acima, foi definido que os picos apresentados logo no início da corrida
cromatográfica são os ácidos graxos formados durante a hidrólise do óleo, os
seguintes seriam os mono e diglicerídeos, e os últimos picos do óleo remanescente
da reação.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
40
Os cromatogramas que representam amostras do primeiro estudo estão
representados na Figura 9 (A, B e C), e os do segundo estudo estão na Figura 10
(A, B e C).
4.2.1 Primeiro estudo de glicerólise
Conforme descrito no item 3.5, as áreas dos picos foram quantificadas em
Área%, e o valor de conversão de triacilglicerol em mono+diacilglicerol foi calculado
relação à quantidade inicial de TAG presente no início da reação. As Tabelas 5, 6 e
7 apresentam, respectivamente, os resultados de conversão das 16 reações
realizadas para os três óleos (canola, girassol e tabaco).
Analisando os resultados se observa que houve pouca conversão dos
triacilgliceróis em mono e diacilgliceróis, e alto valor de conversão para ácidos
graxos livres. Isso pode ser explicado pelo fato de terem sido utilizadas quantidades
pequenas dos reagentes no primeiro estudo, o que dificultou a agitação e
homogeneização do meio reacional, condição esta verificada visualmente.
Desse modo, o contato entre as superfícies do glicerol e do óleo fica
prejudicado, e a lipase após quebrar a ligação éster do triacilglicerol encontra a água
como reagente disponível. A presença de água nessas circunstâncias apresenta um
problema na reação de esterificação, uma vez que favorece a reação inversa
(hidrólise do éster) de reação, formando, portanto, ácidos graxos livres51 ao invés do
produto de interesse.
Com a intenção de obter melhores resultados os 16 ensaios foram repetidos
com a utilização de maiores quantidades de reagentes. O óleo de tabaco não foi
utilizado nessa etapa, por ter apresentado resultados inferiores aos demais óleos e
ter favorecido mais a reação de hidrólise.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
41
AGL
Ensaio nº 9 (óleo de canola)
TAG
Cromatograma preto: 0h de reação
Cromatograma rosa: 24h de reação
MAG+DAG
(A)
TAG
AGL
Ensaio nº 6 (óleo de girassol)
Cromatograma preto: 0h de reação
Cromatograma rosa: 36h de reação
MAG+DAG
(B)
Ensaio nº 10 (óleo de tabaco)
AGL
Cromatograma preto: 0h de reação
Cromatograma rosa: 24h de reação
TAG
MAG+DAG
(C)
Figura 9 - Cromatogramas obtidos por CLAE dos produtos de glicerólise dos óleos
de canola (A), girassol (B) e tabaco (C) para o primeiro estudo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
42
TAG
Ensaio nº 7 (óleo de canola)
Cromatograma preto: 0h de reação
Cromatograma rosa: 12h de reação
Cromatograma azul: 36h de reação
MAG+DAG
AGL
(A)
TAG
Ensaio nº 16 (óleo de girassol)
Cromatograma preto: 0h de reação
Cromatograma rosa: 12h de reação
Cromatograma azul: 24h de reação
Cromatograma marrom: 36h de reação
AGL
MAG+DAG
(B)
Figura 10 - Cromatogramas obtidos por CLAE dos produtos de glicerólise dos óleos
de canola (A), girassol (B) para o segundo estudo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
43
Tabela 4 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de
canola.
Canola
Ensaio*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Glicerol/óleo
Lipase (%)**
(m/m)
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
Tempo (h)
Temperatura
(ºC)
10
24
20
45
10
36
20
10
24
20
55
10
36
20
TAG
22,4
26,6
14,3
15,0
21,6
26,5
13,9
15,3
24,2
20,9
18,3
14,9
15,7
17,6
16,8
18,1
Área %
MG + DG
15,7
24,2
8,1
8,2
18,6
21,7
10,3
10,7
21,9
24,3
14,3
11,2
15,8
26,5
12,5
15,0
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
AGL
61,9
49,2
77,6
76,8
59,7
51,8
75,7
74,0
53,9
54,8
67,4
74,0
68,6
58,5
70,7
66,9
Conversão
(%)
16,8
25,8
8,6
8,8
19,9
23,2
11,1
11,5
23,4
26,0
15,3
11,9
16,9
28,3
13,4
16,1
44
Tabela 5 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de
girassol.
Girassol
Ensaio*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Glicerol/óleo
Lipase (%)**
(m/m)
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
Tempo (h)
Temperatura
(ºC)
10
24
20
45
10
36
20
10
24
20
55
10
36
20
TAG
36,0
35,3
15,4
23,2
26,4
30,2
14,4
18,5
25,2
23,9
16,1
19,5
23,3
23,8
20,3
18,7
Área %
MG + DG
24,5
33,7
12,2
25,7
30,9
33,5
11,0
12,9
33,6
20,3
12,6
29,7
31,3
39,0
28,3
15,0
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
AGL
39,0
30,9
72,3
51,1
42,5
36,2
74,5
68,6
41,1
55,7
71,4
50,8
45,4
37,1
51,4
66,3
Conversão
(%)
26,9
36,9
13,3
28,2
33,9
36,7
12,1
14,2
36,8
22,3
13,8
32,6
34,4
42,8
31,0
16,5
45
Tabela 6 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG e AGL do primeiro estudo utilizando óleo de
tabaco.
Tabaco
Ensaio*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Glicerol/óleo
Lipase (%)**
(m/m)
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
0,9
1,2
Tempo (h)
Temperatura
(ºC)
10
24
20
45
10
36
20
10
24
20
55
10
36
20
TAG
11,1
14,4
8,3
9,1
11,0
12,4
7,7
6,7
9,6
12,1
8,1
8,0
9,9
8,6
4,1
7,9
Área %
MG + DG
11,5
10,0
10,8
13,4
10,4
14,9
11,9
12,0
10,1
16,8
15,9
14,4
12,1
14,6
11,9
14,2
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
AGL
77,4
75,6
80,9
77,5
78,6
72,8
80,4
81,3
80,3
71,1
74,8
77,6
78,0
76,8
84,1
77,9
Conversão
(%)
13,0
11,3
12,2
15,2
11,8
16,9
13,4
13,6
11,4
19,1
18,0
16,3
13,7
16,5
13,4
16,1
46
4.2.2 Segundo estudo de glicerólise enzimática
Os resultados de conversão de triacilglicerol em mono+diacilglicerol do
segundo estudo são apresentados nas Tabelas 8 e 9 para os óleos de canola e
girassol, respectivamente. É possível verificar que o aumento nas quantidades de
reagentes foi efetivo para melhor homogeneização do sistema reacional, pois todas
as reações tiveram um aumento significativo de conversão de TAG em MAG+DAG e
consequente redução da conversão de AGL.
Considerando o óleo de girassol, verificou-se que a reação que apresentou
melhor conversão foi a de nº 16 (glicerina/óleo = 1,2 m/m; 20% lipase; 36h; 55 ºC). O
fato de esta reação representar o ensaio com as maiores proporções dos reagentes
envolvidos e maior temperatura e tempo de reação, pode ser um precedente para
este ótimo resultado de conversão, de cerca de 90% de MAG+DAG.
Com relação ao óleo de canola, a reação que apresentou o melhor valor de
conversão em MAG+DAG foi a de nº 7 (glicerina/óleo = 0,9 m/m; 20% lipase; 36h; 45
ºC), com cerca de 71%. Assim como no ensaio 16, o ensaio 7 utilizou 20% de lipase
e tempo de reação de 36, o que pode ser um indicativo de que esses fatores
influenciam significativamente nos resultados.
Com base na análise de variância entre duas variáveis foi possível constatar
que nos resultados obtidos para a glicerólise do óleo de canola a concentração de
lipase e a temperatura são as que influenciam significativamente (p<0,05) no teor de
triacilglicerol (TG) remanescente no meio reacional. A temperatura também
influencia significativamente (p<0,05) no teor de mono e diacilgliceróis (MG +DG)
produzidos, da mesma forma que o teor de lipase influencia significativamente
(p<0,05) no teor de ácidos graxos livres (AGL).
Este resultado permite inferir que dependendo da temperatura e da
concentração de lipase há mais conversão dos triacilgliceróis, no entanto em
temperaturas maiores há mais formação de ácidos graxos livres.
Com relação à reação de glicerólise do óleo de girassol, o tempo e a
temperatura de reação influenciam significativamente (p<0,05) na produção de mono
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
47
e diacilgliceróis (MG +DG), assim como, o teor de lipase influencia (p<0,05) na
produção de ácidos graxos livres no meio.
Quanto ao teor de glicerol, não influenciou significativamente no grau de
conversão de triacilgliceróis em MG+DG, bem como não influenciou na formação de
AGL com p>0,05.
Diversos autores desenvolveram estudos através de glicerólise enzimática
utilizando óleo como substrato em meio livre de solvente, obtendo resultados
semelhantes. Fiametti e colaboradores10 utilizaram a enzima Novozymes 435
imobilizada para catalisar a reação com óleo de oliva, obtendo assim cerca de 39%
de DAG.
No estudo desenvolvido por Fregolente e colaboradores27 foi utilizado óleo de
soja como fonte de triacilglicerol, que foi catalisado pela lipase Candida antarctica
imbolilizada, resultando em 24% de MAG e 48% de DAG. Já Freitas e
colaboradores2 desenvolveram um método utilizando Lipase PS imobilizada e óleo
de babassu, obtendo rendimento de 25% de MAG e 63% de DAG.
A enzima Lipozyme foi a lipase utilizada por Gonçalves e colaboradores23 na
glicerólise do óleo de palma realizada em sistema com ultrassom, o qual resultou em
um rendimento de 39,8% de DAG. Liu e colaboradores52 obtiveram cerca de 54% de
DAG através da reação de glicerólise do óleo de soja catalisada pela enzima
Lecitase ultra imobilizada.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
48
Tabela 7 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG e AGL do segundo estudo utilizando óleo de
canola.
Canola
Ensaio*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Glicerol/óleo
Lipase (%)**
(m/m)
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
Tempo real
Tempo
previsto
24
24
Temperatura
(ºC)
45
24
36
36
24
36
24
12
36
24
55
36
TAG
49,2
48,0
15,8
15,0
21,7
18,3
16,6
12,9
17,3
16,7
12,5
13,5
14,3
15,6
14,6
11,4
Área %
MG + DG
34,8
27,3
45,1
41,4
41,0
43,9
42,9
43,1
51,3
48,0
40,6
44,0
41,4
46,3
43,9
36,6
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
AGL
10,9
13,9
37,2
36,5
27,9
32,9
37,0
39,5
29,0
29,5
43,0
37,8
42,0
35,3
38,4
48,2
Conversão
(%)
41,7
37,5
58,7
55,3
61,5
63,5
71,3
57,5
60,6
65,9
47,7
52,3
52,3
63,5
57,2
46,9
49
Tabela 8 – Condições de ensaio e resultados de conversão de TAG em MAG+DAG e AGL do segundo estudo utilizando óleo de
girassol.
Girassol
Ensaio*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Glicerol/óleo
Lipase (%)**
(m/m)
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
0,9
10
1,2
0,9
20
1,2
Tempo real
Tempo
previsto
24
24
Temperatura
(ºC)
45
24
36
36
24
24
55
36
36
TAG
44,2
40,3
18,3
17,1
23,8
19,9
18,3
19,0
22,2
22,8
17,1
19,6
21,0
21,5
3,4
3,8
Área %
MG + DG
35,0
33,7
47,7
45,6
49,3
52,4
47,7
46,4
53,2
48,2
43,8
44,6
49,8
54,2
66,1
66,1
* Utilização de quantidades fixas de óleo e água (3% em relação à massa do óleo).
** Porcentagem em relação à massa de óleo.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
AGL
16,1
15,5
30,6
32,9
20,2
23,3
30,4
31,4
21,3
25,7
36,0
27,5
27,2
21,9
27,7
29,8
Conversão
(%)
42,4
44,9
69,9
60,7
79,3
69,9
58,0
61,7
64,9
57,9
53,3
55,9
66,4
72,3
87,4
90,2
50
4.3 Analise dos resultados empregando espectroscopia /quimiometria
A espectroscopia nos permite verificar se há a presença de grupos funcionais
dos produtos finais, no entanto, a avaliação da presença de grupamentos formados
nos produtos ou reduzidos dos reagentes de partida torna-se tênue quando se trata
de amostras de triacilgliceróis submetidas a glicerólise. A análise por componentes
principais (PCA) auxilia nesta tarefa, permitindo identificar o efeito das condições de
reação a partir da espectroscopia. A análise de PCA foi realizada aplicando a
primeira derivada nos dados originais, seguido pelos dados centrados na média e
número máximo de 9 fatores.
Para cada componente principal do modelo construído foi associada uma
porcentagem de variância explicada. Na Tabela 9 é possível visualizar os
percentuais de variância explicada para cada componente principal e da variância
acumulada das 9 componentes do modelo PCA. Os resultados mostram que
somente duas componentes principais são necessárias para explicar 87,3% da
variância total do modelo.
Tabela 9 – Número de componentes principais, porcentagem de variância explicada
e porcentagem de variância acumulada.
Componente
Variância
% Variância explicada
% Variância Acumulada
1
0,002863
65,622581
65,622581
2
0,000944
21,631517
87,254097
3
0,000278
6,379033
93,633133
4
0,000101
2,314465
95,947601
5
0,000076
1,743114
97,690712
6
0,000040
0,913813
98,604523
7
0,000026
0,592681
99,197205
8
0,000015
0,337901
99,535103
9
0,000006
0,146472
99,681572
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
51
A Figura 11 mostra os sinais após o pré-tratamento dos dados conforme citado
anteriormente (primeira derivada nos dados originais, seguido pelos dados
centrados na média).
Figura 11 – Espectros das amostras após a aplicação da primeira derivada e
centralização dos dados na média.
Nas amostras analisadas inicialmente identificou uma amostra como outlier. Tal
amostra possuía a banda característica da ligação –OH com intensidade muito
superior às demais, dando o indicativo de que no momento da coleta da alíquota
para análise, pode ter sido coletada juntamente com mistura de produtos uma fração
de glicerol, que gerou o espectro outlier. Portanto a amostra outlier foi retirada do
conjunto de dados e novamente foi realizada a análise de PCA, conforme mostrado
pela Figura 12.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
52
Figura 12 – Espectros de infravermelho sobrepostos representado área espectral
utilizada para Análise de Componentes Principais (PCA) com exclusão da amostra
outlier.
A Figura 13 mostra o gráfico de diagnóstico de outlier, no qual é possível
observar que a amostra 3-girassol apresentou um maior resíduo, e as amostras 16girassol, 12-canola e 16-canola apresentaram uma maior contribuição na construção
do modelo, porém não foram removidas da análise por apresentarem rendimento
alto de MAG+DAG evidenciado pela análise cromatográfica.
3-Girassol
Sample Residual (E -05)
12
2-Girassol
2-Canola
1-Girassol
1-Canola
8
16-Girassol
7-Girassol
10-Girassol
13-Girassol
6-Girassol
3-Canola
10-Canola
14-Girassol
11-Girassol
6-Canola
14-Canola
5-Girassol
9-Canola
4-Girassol
9-Girassol
12-Girassol
5-Canola
8-Girassol
4-Canola
13-Canola
15-Canola
11-Canola
7-Canola
4
0
16-Canola
8-Canola
12-Canola
3
10
20
Mahalanobis Distance
Figura 13 – Gráfico de diagnóstico de outliers para os 16 ensaios de óleo de canola
e girassol.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
53
O gráfico dos scores (Figura 14) mostra 4 grupos distintos que podem estar
associados ao grau de conversão de triacilgliceróis em mono e diacilgliceróis. Por
exemplo: as amostras 1 e 2-girassol e 1 e 2-canola tem um menor grau de
conversão segundo a analise por HPLC, sendo em torno de 40%, e a amostra 16girassol tem o maior grau de conversão entre todas as amostras.
Figura 14 – Gráfico de scores baixo – PC1 x PC2 para os 16 ensaios de óleo de
canola e girassol.
O emprego da espectroscopia seguida de analise por PCA nos permitiu
confirmar os resultados encontrados por HPLC, onde foi observado que a PC1 tem
relação inversa com a conversão a mono e diacilgliceróis.
Com relação a proporção de reagentes remanescentes no meio de reação e
de produtos (AGL e MD+DG) é possível observar que na análise por PCA é possível
discriminar na PC1 o grau de conversão dos triacilgliceróis em mono e
diacilgliceróis. É possível visualizar também que à diferenciação quanto ao tipo de
óleo utilizado na reação, uma vez que as amostras de óleo de canola se dispõe no
gráfico acima das amostras de óleo de girassol.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
54
4.4 Avaliação ambiental dos métodos de glicerólise
Os impactos ambientais são uma cadeia de efeitos que se originam no meio
natural e social, como conseqüência de uma determinada ação.53 As avaliações de
impactos não devem ser apenas consideradas como uma técnica, mas como uma
dimensão política de gerenciamento, educação da sociedade e coordenação de
ações impactantes, pois permite a incorporação de opiniões de diversos grupos
sociais.54 Desta forma, apresenta-se a Figura 15, com os resultados referentes à
avaliação ambiental qualitativa de impactos ambientais da glicerólise enzimática a
partir da matriz de interação de Leopold.
Na Matriz de Interação foram identificadas 8 ações de impacto, sendo que as
mesmas foram multiplicadas por 8 fatores ambientais resultando em 64 possíveis
relações de impacto, sendo destas, identificadas 38. Os resultados dos 38 impactos
identificados quanto a critérios de valor, ordem, espaço, tempo, reversibilidade e
dinâmica estão representados na Figura 15.
Analisando os gráficos apresentados acima, verificou-se que cerca de 65% dos
impactos são negativos, porém a maioria das atividades impactantes são apenas
uma probabilidade de ocorrência, não sendo uma atividade intrínseca da reação.
Quanto ao critério de dinâmica, mais de 91% dos impactos foram considerados
como temporários, o que indica a possibilidade de remediação caso algum venha a
ocorrer. O critério ordem mostra que cerca de 95% das atividades impactantes são
diretas e 79% são locais, porém como no caso do critério valor, são apenas uma
probabilidade de ocorrência. Em relação ao tempo, 79% foram classificados como
de curto prazo, e quanto à plasticidade, nenhum foi considerado irreversível.
Constata-se que o impacto atribuído ao processo pode ser muito baixo como foi
atribuído a avaliação da produção de biodiesel em escala piloto por Kaercher et al,
onde a maioria pode ser evitado ou, se produzido, não causa um efeito permanente
e nem cíclico ou irreversível.55
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
55
Comparado com a glicerólise química observa-se que há menos impactos
identificados, pois a matriz de impactos foi originada a partir das etapas
apresentadas no fluxograma da Figura 16. A realização de experimentos visando o
reconhecimento das etapas e análise dos produtos por cromatografia líquida
permitiu reconhecer estas etapas, no processo de produção na mesma escala
utilizada para o método enzimático.
Valor
Temporal
20,9%
34,9%
negativo
curto prazo
positivo
longo prazo
79,1%
65,1%
Ordem
Dinâmica
4,7%
9,3%
direto
temporário
indireto
90,7%
95,3%
Plásticidade
Espacial
18,6%
permanente
2,3%
79,1%
local
reversível
regional
irreversível
e s tr a té g i
c o
Figura 15 – Avaliação Qualitativa de Impactos Ambientais, seguindo os critérios de
valor, ordem, espaço, tempo, dinâmica e plasticidade para a glicerólise enzimática.
Estas atividades são relativas ao processo de purificação parcial da glicerina,
reação de glicerólise propriamente dita e etapas de purificação do produto. A
glicerólise nestas condições ocorre em 3 horas, que comparado ao método
enzimático é uma vantagem para a formação de monoacilgliceróis totais.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
56
Figura 16 – Fluxograma com as etapas da reação de glicerólise enzimática.
Na Matriz de Interação foram identificadas nove ações de impacto, sendo que
as mesmas foram multiplicadas por oito fatores ambientais resultando em 72
possíveis relações de impacto, sendo destas, identificadas 52. Os resultados dos 52
impactos identificados quanto a critérios de valor, ordem, espaço, tempo,
reversibilidade e dinâmica estão representados na Figura 17.
Temporal
Valor
17,3%
32,7%
curto prazo
negativo
longo prazo
positivo
82,7%
67,3%
Ordem
Dinâmica
5,8%
1,9%
direto
temporário
indireto
permanente
98,1%
94,2%
Plásticidade
Espacial
17,3%
1,9%
80,8%
local
reversível
regional
irreversível
e s tr a té g i
c o
Figura 17 – Avaliação Qualitativa de Impactos Ambientais, seguindo os critérios de
valor, ordem, espaço, tempo, dinâmica e plasticidade para a glicerólise química.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
57
Os gráficos apresentados acima mostram que cerca de 67% dos impactos são
negativos, 98% são diretos, 83% são de curto prazo, 94% são temporário e 81% são
locais. Deste modo, além de a glicerólise enzimática possuir menor número de
atividades impactantes, a porcentagem de atividades negativas e diretas também é
reduzida.
Mesmo que a diferença entre dois métodos não seja muito distante, o fato de a
glicerólise enzimática não utilizar catalisador químico na reação e solvente na
separação dos produtos, gera benefícios quanto a não geração de efluentes, ao
contrário do método químico.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
58
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A metodologia de glicerólise enzimática de óleos vegetais desenvolvida neste
estudo se mostrou uma alternativa promissora na obtenção de mono e diacilgliceróis
sem uso de solvente. Os experimentos realizados provaram o potencial do uso de
enzimas como catalisadores da reação de glicerólise, neste caso a lipase
Novozymes 435, alcançando altas taxas de conversão de triacilgliceróis a mono e
diacilgliceróis.
Utilizando o óleo de girassol se obteve um porcentual de conversão de TAG a
MAG+DAG de cerca de 90%, através do ensaio de nº 16 (glicerina/óleo = 1,2 m/m;
20% lipase; 36h; 55 ºC), e com o óleo de canola se atingiu o valor de conversão de
aproximadamente 71% de MAG+DAG com o ensaio nº 7 (glicerina/óleo = 0,9 m/m;
20% lipase; 36h; 45 ºC).
A análise de variância mostrou que a quantidade de lipase é um fator
determinante na ocorrência da reação de glicerólise, porém quando associado à
maior temperatura, pode levar a formação de maior quantidade de AGL. A
homogeneização do meio e o contato óleo/glicerol também é fator determinante para
a formação de MAG+DAG, pois de outro modo a reação de hidrólise com formação
de AGL é favorecida.
A ocorrência da reação também pode ser verificada através da análise de
infravermelho utilizando a ferramenta PCA, através da distinção entre as reações
que obtiveram os maiores e menores resultados de conversão e também distinção
dos óleos utilizados nas reações.
O processo de glicerólise enzimática se mostrou menos impactante quando
comparado ao método químico, com 65% de impactos negativos que podem vir a
ocorrer, enquanto o método químico apresentou 67%. O fato de o método
enzimático não necessitar da utilização de catalisador químico e solvente para a
separação das fases é de fato um fator muito importante para a redução de impactos
ambientais relacionados à geração de efluentes.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
59
6
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
A glicerina comercial apresentou resultados satisfatórios para a glicerólise
enzimática, porém para implementar esse método com a glicerina oriunda da
produção de biodiesel deve-se realizar os mesmos ensaios com a glicerina bruta.
Outro estudo a ser realizado é o desenvolvimento de método de glicerólise
enzimática em escala piloto e verificar sua viabilidade.
Considerando o alto custo da lipase utilizada neste estudo, cabe realizar um
estudo sobre reaproveitamento da mesma, avaliando a sua capacidade de catalisar
a glicerólise após uma série de reações e determinar seu tempo de vida útil.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
60
7
REFERÊNCIAS
1 MUNIYAPPA, P. R.; et al. Improved conversion of plant oils and animal fats
into biodiesel and co-product. Bioresource Technology, 56, 19-24, 1996.
2 FREITAS, L.; et al. An integrated approach to produce biodiesel and
monoglycerides by enzymatic interestification of babassu oil (Orbinya sp).
Process Biochemistry, 44, 1068-1074, 2009.
3 FREITAS, L. Seleção de rota enzimática para produção de monoglicerídeos
empregando lipase imobilizada em matriz obtida pela técnica sol-gel. 2006, 110
f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química). Universidade de São Paulo,
Lorena, SP, 2006.
4 RIVALDI, J. D.; et al. Glicerol de Biodiesel – Estratégias biotécnicas para o
aproveitamento do glicerol gerado da produção de biodiesel. Biotecnologia
Ciência & Desenvolvimento, 37, 2007-2008.
5 RAMOS, L. P.; et al. Um Projeto de Sustentabilidade Econômica e Sócioambiental para ao Brasil. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 31,
34-35, 2003.
6 MOTA, C. J. A.; et al. Gliceroquímica: novos produtos e processos a partir da
glicerina de produção de biodiesel. Química Nova, vol. 32, n. 3, 639-648, 2009.
7 SHAHBAZ, K.; et al. Prediction of glycerol removal from biodiesel using
ammonium and phosphunium based deep eutectic solvents using artificial
intelligent techniques. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, In
Press, Accepted Manuscript, Available online 20 June 2012.
8 BRASIL. ANP (Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis)
Resolução ANP Nº 7 de 19 março de 2008. Diário Oficial da União de 20 de
março de 2008.
9 KNOTHE, G.; et al. Manual de biodiesel. São Paulo: E. Blücher, 2006. 340 p.
10 FIAMETTI, K. G.; et al. Ultrasound irradiation promoted efficient solvent-free
lipase-catalyzed production of mono- and diacylglycerols from olive oil.
Ultrasonics Sonochemistry, 18, 981–987, 2011.
11 SANTOS, J. S. Produção de diacilgliceróis a partir da glicerólise enzimática
de óleo de peixe utilizando meio com surfactante de grau alimentício.
Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos) – Programa de PósGraduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa
Catarina. Florianópolis, 2011.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
61
12 ABAD, S.; TURON, X. Valorization of biodiesel derived glycerol as a carbon
source to obtain added-value metabolites: Focus on polyunsaturated fatty acids.
Biotechnology Advances, nº 3, vol. 30, 733–741, 2012.
13 DONKIN, S. S. Glycerol from Biodiesel Production: The New Corn for Dairy
Cattle. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 37, 280-286, 2008.
14 VASCONCELOS, YURI. Resíduos bem-vindos. Revista Pesquisa FAPESP,
ed.
196,
junho
de
2012.
Disponível
em:
<http://revistapesquisa.fapesp.br/2012/06/14/residuos-bem-vindos/>.
Acesso
em: 02 nov. 2012.
15 SANTOS, N. A. Propriedades Termo-Oxidativas e de Fluxo do Biodiesel de
Babaçu (Orbignya phalerata). Dissertação (Mestrado em Química) – Programa
de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal da Paraíba. João
Pessoa, 2008.
16 GARCIA, C. M. Transesterificação de óleos vegetais. Dissertação (Mestrado
em Química) - Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade
Estadual de Campinas. São Paulo, 2006.
17 CORREIA I.M.S. Extração e pirólise do óleo de girassol (Helianthus annus
L.) visando a produção de biocombustíveis. Dissertação (Mestrado em
Engenharia Química) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, 2009.
18 ZHU, Q.; et al. A two-stage enzymatic process for synthesis of extremely
pure high oleic glycerol monooleate. Enzyme and Microbial Technology, 48,
143–147, 2011.
19 VOLL, F.; et al. Kinetic modeling of lipase-catalyzed glycerolysis of olive oil.
Biochemical Engineering Journal, 56, 107– 115, 2011.
20 KAEWTHONG, W.; et al. Continuous production of monoacylglycerols by
glycerolysis of palm olein with immobilized lipase. Process Biochemistry, 40,
1525–1530, 2005.
21 PAWONGRAT, R.; et al. Synthesis of monoacylglycerol rich in
polyunsaturated fatty acids from tuna oil with immobilized lipase AK. Food
Chemistry, 104, 251–258, 2007.
22 ZHAO, Y.; et al. Optimization of Candida sp. 99-125 lipase catalyzed
esterification for synthesis of monoglyceride and diglyceride in solvent-free
system. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 72, 157–162, 2011.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
62
23 GONÇALVES, K. M. Palm oil hydrolysis catalyzed by lipases under
ultrasound irradiation – The use of experimental design as a tool for variables
evaluation. Ultrasonics Sonochemistry, 19, 232-236, 2012.
24 MOQUIN, P. H. L.; et al. Kinetic modeling of glycerolysis–hydrolysis of
canola oil in supercritical carbon dioxide media using equilibrium data. The
Journal of Supercritical Fluids, 37, 3, 417-424, 2006.
25 PHUAH, E.-T.; et al. Kinetic study on partial hydrolysis of palm oil catalyzed
by Rhizomucor miehei lipase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 78,
91–97, 2012.
26 KRÜGER, R. L. Produção de mono e diacilgliceróis a partir da glicerólise
enzimática de óleo de oliva. Dissertação (Programa de Pós Graduação em
Engenharia Química e Engenharia de Alimentos) – Tese de Doutorado.
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2010.
27 FREGOLENTE, P.; et al. Produção de monoacilgliceróis e diacilgliceróis via
glicerólise enzimática e destilação molecular. Química Nova, vol. 32, n. 6, 2009.
28 VECCHIA, R. D.; NACIMENTO, M. G .;SOLDI, V. Aplicações sintéticas de
lípases imobilizadas em polímeros. Química Nova, vol. 27, nº4, p.623-630,
2004.
29 HASAN, F.; et al. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and
Microbial Technology, 39, 235–251, 2006.
30 CARVALHO, P. O.; et al. Aplicação de lipases microbianas na obtenção de
concentrados de ácidos graxos poliinsaturados. Química Nova, vol. 26, nº 1,
p.75-80, 2003.
31 STAMATIS, H.; et al. Bioorganic reactions in microemulsions: the case of
lipases. Biotechnology Advances 17, 293–318, 1999.
32 CASTRO, H. F.; et al. Modificação de óleos
biotransformação. Química Nova, v. 27, n. 1, 2004.
e
gorduras
por
33 KRÜGER, R. L.; et. al.; Improvement of mono and diacylglycerol production
via enzymatic glycerolysis in tert-butanol system. Eur. J. Lipid Sci.
Technol,.112, 921–927, 2010.
34 WANG, W.; et al. Production of extremely pure diacylglycerol from soybean
oil by lipase-catalyzed glycerolysis. Enzyme and Microbial Technology, 49, 192196, 2011.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
63
35 KITTIKUN, A. H.; et al. Synthesis of monoacylglycerol rich in
polyunsaturated fatty acids from tuna oil with immobilized lipase AK. Food
Chemistry, 104, 251–258, 2007.
36 VALÉRIO, A.; et al. Enzymatic production of mono- and diglycerides in
compressed n-butane and AOT surfactant. The Journal of Supercritical Fluids,
49, 216-220, 2009.
37 HASAN, F.; et al. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and
Microbial Technology, 39, 235–251, 2006.
38 KAPOOR. M..; GUPTA, M. N. Obtaining monoglycerides by esterification of
glycerol with palmitic acid using some high activity preparations of Candida
antarctica lipase B. Process Biochemistry, 47, 503–508, 2012.
39 CETINA, D. M. et al. Application of response surface design to solvent,
temperature and lipase selection for optimal monoglyceride production . Journal
of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 72, 13–19, 2011.
40 FERREIRA-DIAS, S. et al. Response surface modeling of glycerolysis
catalyzed by Candida rugosa lipase immobilized in different polyurethane foams
for the production of partial glycerides. Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 21, 71–80, 2003.
41 LIU, N. et al.Fast synthesis of 1,3-DAG by Lecitase® Ultra-catalyzed
esterification in solvent-free system. Eur.J.Lipid Sci Technol., 113, 973–979,
2011.
42 FREITAS, L. et al. Enzymatic synthesis of monoglycerides by esterification
reaction using Penicillium camembertii lipase immobilized on epoxy SiO2-PVA
composite. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 65, 87–90, 2010.
43 CHEIRSILP, B. et al.Kinetic study of glycerolysis of palm olein for
monoacylglycerol production by immobilized lipase. Biochemical Engineering
Journal 35, 71–80, 2007.
44 KITTIKUN. A. H. et al. Glycerolysis of palm olein by immobilized lipase PS in
organic solvents. Enzyme and Microbial Technology, 35, 218–222, 2004.
45 KITTIKUN. A. H. et al. Continuous production of monoacylglycerols from
palm olein in packed-bed reactor with immobilized lipase PS. Biochemical
Engineering Journal, 40, 116–120, 2008.
46 GHAMGUI, H. et al. Production of mono-olein by immobilized
Staphylococcus simulans lipase in a solvent-free system: Optimization by
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
64
response surface methodology. Enzyme and Microbial Technology 39, 717–
723, 2006.
47 KAERCHER, J. Produção de biodiesel em escala piloto e avaliação dos
impactos ambientais. Dissertação (Programa de Pós Graduação em Tecnologia
Ambiental) – Tese de Mestrado. Universidade de Santa Cruz do Sul, 2009.
48 CNTL - Centro Nacional de Tecnologias Limpas SENAI-RS, Sistema de
Gestão Ambiental e Produção mais Limpa - Série Manuais de Produção mais
Limpa, 2003.
49 SILVA, E. Apostila do Curso de Engenharia Florestal 685- Análise e
Avaliação de Impactos Ambientais. Viçosa: Universidade Federal de ViçosaMG, 1996. 68p.
50 FONSECA, J. S.; MARTINS, G. A. Curso de Estatística. São Paulo: Atlas,
2010.
51 YAHYA, A. R. M.; et al. Ester synthesis in lipase-catalyzed reactions.
Enzyme and Microbial Technology, 23, 438–450, 1998.
52 LIU, N.; et al. Immobilisation of lecitase® ultra for production of
diacylglycerols by glycerolysis of soybean oil. Food Chemistry, 134, 301–307,
2012.
53 MOTA, S.V. Urbanização e Meio Ambiente. 3 ed. Rio de Janeiro, ABES,
2003.
54 SILVA, Elias. Apostila do Curso de Engenharia Florestal 685 - Análise e
Avaliação de Impactos Ambientais. Viçosa: Universidade Federal de ViçosaMG, 1996. 68p.
55 KAERCHER, J.A., et al., Optimization of biodiesel production for selfconsumption: considering its environmental impacts, Journal of Cleaner
Production (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.jclepro.2012.09.016.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
65
ANEXO A - Matriz de identificação qualitativa de impactos ambientais da
reação de glicerólise enzimática
CARACTERÍSTICAS AMBIENTAIS RELEVANTES
Meio
Biótico
Meio Físico
glicerolise
separação de
fases
Contaminação do Solo
Diminuição da
Diversidade
Saúde
Desenvolvimento Regional
Qualid. Prod. Final
Flora/
Fauna
Contaminação
neutralização
da glicerina
Recurso
Edáfico
consumo
Etapas
Recurso Hidrico
Gases e Vapores
Ar
Meio Antrópico
uso glicerina bruta
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
NDLCTV
uso de ácido fosfórico
-
NDLCAV
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLMTV
PDROTV
PDLCTV
uso de óleo
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
Atividades Impactantes
uso de glicerina
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
uso água
-
NDRCAV
-
-
NILCTV
-
NDROTV
PDLCTV
uso lipase
-
NDLCAV
NDLCTV
NDLCTV
-
-
PDEOTV
PDLCTV
consumo de energia eletrica
NIECAV
-
-
-
-
-
PDROTV
PDLCTV
obtenção de produto
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
separação de lipase
-
-
NDLCTV
NDLCTV
-
NDLOTV
PDLCTV
Legenda: P - positivo; N - negativo; D - direto; I - indireto; L - local; R - regional; E - estratégico;
C - curto prazo; M - médio prazo; O - longo prazo; T - temporário; Y - cíclico; A - permanente; V
- reversível; S - irreversível.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC
66
ANEXO B - Matriz de identificação qualitativa de impactos ambientais da
reação de glicerólise química
CARACTERÍSTICAS AMBIENTAIS RELEVANTES
Meio
Biótico
Meio Físico
Diminuição da
Diversidade
Saúde
Desenvolvimento Regional
Qualid. Prod. Final
separação de
fases
Contaminação do Solo
glicerolise
Flora/
Fauna
Contaminação
neutralização
da glicerina
Recurso
Edáfico
consumo
Etapas
Recurso Hidrico
Gases e Vapores
Ar
Meio Antrópico
uso glicerina bruta
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
NDLCTV
uso de ácido fosfórico
-
NDLCAV
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLMTV
PDROTV
PDLCTV
uso de óleo
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
uso de glicerina
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
uso CaCO3
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLMTV
PDROTV
NDLCTV
uso N2
-
-
-
-
-
-
PDROTV
PDLCTV
consumo de energia eletrica
NIECAV
-
-
-
-
-
PDROTV
PDLCTV
obtenção de produto
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
-
PDROTV
PDLCTV
uso de solvente
NDLCAV
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLMTV
PDROTV
PDLCTV
geração efluente
-
-
NDLCTV
NDLCTV
NDLCTV
NDLMTV
NDLCTV
PDLCTV
Atividades Impactantes
Legenda: P - positivo; N - negativo; D - direto; I - indireto; L - local; R - regional; E - estratégico;
C - curto prazo; M - médio prazo; O - longo prazo; T - temporário; Y - cíclico; A - permanente; V
- reversível; S - irreversível.
Rosana Louzada Müller - Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental - UNISC