QFL-2144
Espectrometria de massas
Aulas, exercícios e outras informações:
http://www2.iq.usp.br/docente/majokato/
Literatura básica
Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G.
S. (1996). Introduction to
spectroscopy.
2nd ed. Saunders College Publishing
Silverstein, R. M., Webster, F. X. and
Kiemle, D. J. (2005) Spectrometric
identification
Of organic compounds, 7th ed. J.
Wiley & Sons.
QFL-2144 (11/maio/2015)
Espectrometria de massas
Método analítico para medir a massa molecular ou atômica de amostras
Princípios da espectrometria de massas

Elementos
diferentes
podem
ser
identificados unicamente pela sua massa
Princípios da espectrometria de massas

Compostos diferentes podem ser
identificados pela sua massa
Butorphanol
L-dopa
N -CH2OH
Ethanol
COOH
HO
-CH2CH-NH2
CH3CH2OH
HO
HO
MW = 327.1
MW = 197.2
MW = 46.1
Espectrometria de massas
Identificação de compostos desconhecidos
quantificação de compostos conhecidos
técnica muito sensível – (10-12 g ou 10-15 mols);
 facilmente interfaceado com métodos
separação para misturas complexas;
cromatográficos
de
 pode ser utilizado para quantificação;
As massas dos fragmentos e a relativa abundância destes revelam
infirmações importantes sobre a estrutura da molécula.
Aplicações da espectrometria de massas
• Análises químicas e identificação estrutural
 Monitoramento ambiental e análises de solos, água, poluentes
atmosféricos, etc;
 Geoquímica: determinação de idade, composição de rochas e solos;
 Indústrias químicas, farmacêuticas, alimentícias e petroquímicas:
controle de qualidade;
Indústrias
farmacêuticas:
bioprospecção de novas drogas;
bioequivalência,
biodisponibilidade,
Biotechnologia:
identificar
estruturas
e
sequenciamento
macromoléculas como carboidratos, ácidos nucleicos e proteínas.
de
7
Espectrometria de massas - um breve histórico
Ganhadores de Prêmio Nobel
Espectrometria de massas
Definição IUPAC
Estudo de sistemas pela formação de íons em
fase gasosa, com ou sem fragmentação, que são
caracterizados por suas relações massa carga e
abundâncias relativas.
Espectrometria de Massas
O espectrômetro de massas mede a massa isotópica.
Não mede a massa molecular média (MW)
Para uma molécula com a fórmula empírica C60H122N20O16S2
Massa molecular média = 1443.8857
(massa média de cada isótopo)
Massa exata = 1442.8788
(massa exata do isótopo mais abundante)
Massa nominal = 1442
(massa arredondada do isótopo mais abundante)
11
Unidade em um espectro de massas
Espectro de massas
Espectro de massas
Os massas detectados serão registrados de acordo
com a sua abundância relativa
=>
Espectro de massas
Abundância
relativa
aspirina
120 m/z
Padrão isotópico
O padrão isotópico é útil na identificação
presença de certos elementos
da
Padrão isotópico com Cl
52
77
Cl
100 32
Chlorobenzene
35
77
Cl
37
35
3:1
112 114
Padrão isotópico com Br
100
77
Br
79
77
61 59
Bromobenzene
Br
81
M = 156 158 = M + 2
Espectrometria de massas
Regra do Nitrogênio para determinação da fórmula molecular
• Hidrocarbonetos como metano (CH4) e hexano (C6H14), bem como os
compostos que contêm somente átomos de C, H e O, sempre possuem os
íons moleculares com valor pares
• Um íon molecular ímpar indica a presença de número de átomos de
nitrogênio ímpares.
19
Resolução na Espectrometria de massas
• Um composto com íon molecular nominal de m/z 60,
utilizando espectrômetro de baixa resolução.
20
Resolução em Espectrometria de Massas
Resolução em Espectrometria de Massas
Componentes de um
espectrômetro de massas
Amostra – Introduçãor
da amostra no equipamento
+
_
Ionizador
Geração de ions
em fase gasosa
Analisador de massas
Separação de ions
baseados na
relação m/z
Detector
Componentes de um
espectrômetro de massas
Geração de íons
(ionização)
Impacto de
elétrons
 Ionização
química
 Electrospray
 MALDI

Separação de
íons
quadrupolo
 Ion trap
 TOF

Detecção
Esquema do Espectrômetro de Massas
Bombas
turbomoleculares
Bombas rotatórias
Sistema de alto-vácuo
Injeção
Fonte de
íons
Analisador
de massas
Placas
HPLC
GC
MALDI
ESI
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Trapeador de
íons
Detector
Foto
multiplicadores
Aquisição
de dados
programas
Esquema do Espectrômetro de Massas
Bombas
turbomoleculares
Bombas rotatórias
Sistema de alto-vácuo
Injeção
Fonte de
íons
Analisador
de massas
Placas
HPLC
GC
MALDI
ESI
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Trapeador de
íons
Detector
Foto
multiplicadoras
Aquisição
de dados
programas
Fonte de íons
A fonte de íons gera íons positivos e/ou negativos. As
formas principais de ionização são:
1) Ejeção ou captura de elétrons – fontes de íons Impacto
de elétrons (IE) e ionização química (IQ)
2) Protonação ou desprotonação – fontes de “electrospray”
(IES), APCI (Ionização química à pressão atmosférica) e
MALDI (ionização e dessorção por laser assistida por
matriz)
Ionização por Impacto de Elétrons (IE)
Bombardeamento de alta energia (70 eV) na amostra gasosa
Ionização por Impacto de Elétrons (IE)

A amostra é introduzida no equipamento
através do aquecimento até a evaporação

A amostra na fase gasosa é bombardeada
com elétrons oriundos de filamentos de
renio ou tungstênio (energia de 70 eV)

A molécula é fragmentada

Os fragmentos são enviados para o
analisador
Padrões de fragmentação

alcanos

A fragmentação geralmente ocorre com a perda
de grupos alquílicos simples:
 Perda
da metila
 Perda de etila
 Perda de propil
 Perda de butil
M+ - 15
M+ - 29
M+ - 43
M+ - 57
Padrões de fragmentação

Espectro de massas de 2-metilpentano
Impacto de elétrons
Desvantagens
1) Requer amostras na fase gasosa (limita as amostra para aquelas no
estado gasoso ou que sejam termoestáveis fáceis de serem
volatilizados);
2) Se não forem suficientemente voláteis necessitam derivatização;
3) Ionização com alta energia que causa fragmentação e muitas vezes o
íon molecular não é observado.
 Impacto de elétrons
Vantagens
 Barato, versátil e reprodutível;
 Fragmentações geram informações
estruturais;
 Banco de dados para identificação de
compostos
Desvantagens
 Fragmentação excessive;
 Limitado à amostras voláteis
Derivatização
Sililação: TMS (trimetil silano), HMDS (hexametildisilazano), TBS (tercbutildimetilsilano)
 grupo silila [-Si(CH3)3] (trimetillsilano)
Hidrogênio de hidroxilas, tióis, amina ou ácidos carboxílicos podem ser substituídos
por grupos alquil-sililas;
Reatividade frente a grupos funcionais:
álcools>fenóis>ácidos carboxílicos=aminas>amidas
Eficiente para uma grande gama de aplicações, resulta em derivados estáveis com
alta reprodutibilidade.
Desvantagens:
Sililação não é simples, rápido ou de fácil automação;
- Necessita de condições anidras;
- As amostras precisam ser aquecidas por mais de 1 hora, perdendo-se os
componentes termolábeis;
- Reagentes residuais da amostra permanecem, diminuindo-se a meia-vida da coluna
Derivatização
Alquilação ou esterificação:
Aminas e ácidos orgânicos
diazometano : ácidos carboxílicos

ácidos graxos
rápido, simples,  produtos de interferência
diazometano é altamente tóxico
derivados de cloroformiato:
Vantagens comparadas à sililação
rápido (10 – 60s)
Temperatura ambiente
Meio aquoso
barato
Fácil de automatizar
Produtos estáveis, alta reprodutibilidade
Limitação:  aplicação
Ácidos carboxílicos, amidas, amino álcoois, aas
Ionização Química





Utilizada para determinar a massa molecular;
Ionização branda;
As moléculas são ionizadas pela colisão com íons de
um gás reagente, previamente ionizado;
Reagentes comumente usados são metano, isobutano
e amônia;
O gás reagente é bombeado diretamente na câmara de
ionização e os elétrons do filamento ionizam o gás
Ionização Química
Ionização Química por metano
• Primeiro – ionização eletrônica do CH4:
– CH4 + e-  CH4+ + 2e• Formas de fragmentação CH3+, CH2+, CH+
• Segundo – reações entre ion-molécula gera
íons reagentes estáveis:
– CH4+ + CH4  CH3 + CH5+
– CH3+ + CH4  H2 + C2H5+
• CH5+ e C2H5+ são os íons reagentes dominantes do
metano
IE vs IC na análise de cocaína



Espectro de IE da cocaína
Fragmentação
Íon molecular de baixa intensidade
m/z = 303
Ionização química por metano da cocaína
gera o íon quasimolecular e fragmentos
Ionização por Electrospray (IES)

O analito na fase líquida é injetada por um capilar em alta voltagem e
um gás de nebulização é inserida para a evaporção da fase líquida.
Ionização por Electrospray (IES)
Ionização por Electrospray
Vantagens:
•
ionização branda– fragmentação limitada
•
análise de compostos de múltipla carga
(peptídeos/oligonucleotídeos)
•
Pode ser conectado á cromatografia líquida, o que permite a
identificação de componentes em misturas
Ionização por MALDI
(ionização e desorção à laser assistida por matriz)
• O analito é misturado a um excesso de matriz (moléculas de baixa massa
molecular).
• O analito com a matriz é irradiado com laser no mesmo comprimento de
onda máximo da composto da matriz.
• A matriz ionizada em contato com o analito na fase gasosa ioniza o analito
Preparação de amostra
matriz
Amosta dissolvida
Mistura e secagem
Matrizes
Matriz
Tri-idroxiantraceno
(Ditranol)
OH
OH
OH
polímeros
COOH
Ácido 2,5-di-idroxibenzoico
(DHB)
OH
proteinas, peptideos, polimeros
HO
N C C CH COOH
peptideos, polímeros
Ácido -ciano-4hidroxicinâmico
OH
OH
Ácido 4hidroxipicolínico
Ácido trans-indol-3acrílico
(IAA)
oligonucleotideos
N
COOH
COOH
N
H
polímeros
Ionização por MALDI
Ionização branda que é utilizada para analisar moléculas de alta
massa molecular com a mínima fragmentação (ex. proteínas,
polímeros, etc.);
Íons com multiplas cargas não são formadas como no modo IES
Compostos de baixa massa molecular podem sofrer interferências
da matriz
Esquema do Espectrômetro de Massas
Bombas
turbomoleculares
Bombas rotatórias
Sistema de alto-vácuo
Injeção
Fonte de
íons
Analisador
de massas
Placas
HPLC
GC
MALDI
ESI
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Trapeador de
íons
Detector
Foto
multiplicadoras
Aquisição
de dados
programas
Analisador de massas
Analisadores de massas

Quadrupolo (Q)


Time-of-Flight (TOF)


Baixa resolução, rápido, barato, permite quantificação
de compostos
Alta resolução, sem limite de detecção m/z limit
Ion Trap (IT)

Boa resolução, boa fragmentação
Analisador de massas Quadrupolo
O quadrupolo é composto de quatro barras, um par de barras é mantido em
um potencial elétrico positivo, enquanto que o outro a um potencial
negativo. Uma combinação de corrente contínua (DC) e radiofrequência
(Rf) é aplicada nas barras. somente os íons que apresentarem determinada
razão massa/carga (m/z), a qual esteja em ressonância com o campo
aplicado, irão passar pelas barras do quadrupolo e serão detectados.
Analisador de massas Quadrupolo
Analisador de massas Triplo Quadrupolo
amostra
Câmara de
colisão
Monitora os
íons precursores
Monitora a fragmentação
do íon precursor
íon pai m/z = 545
Mass spectra of CPD
O
O
HN
HO
N
N
O
H
O
O
O- P
O O
íon filho m/z = 447
Douki, T. et al. 1997 Photochem. Photobiol. 66, 171.
H
O
N
HO H
O
Mass spectra of 6-4PP
O
HN
HO
N
N
O
H
O H
H
N
O
O
O rearrangement
HO
O
HO H
[M-H]- = 545
Douki, T. et al. 1997 Photochem. Photobiol. 66, 171.
O
O
N
O
fragmentation
P
OO O
HN
H
N
O
O
P
OO O
HO H
[M-H]- = 432
+
N
C
O
O
Analisador de massas tipo
Quadrupolo
Benefícios
Limitações
Boa reprodutibilidade
Relativamente pequeno e de baixo
custo
Conversão para MS/MS
•Resolução limitada
Analisador de Massas Ion Trap

Ion trap é um captador
de íons que usa um
campo semelhante ao
quadrupolo, mas tridimensional

Foi inventado por
Wolfgang Paul (Prêmio
Nobel1989)

Possibilita o MSn
Analisador de Massas Ion Trap
• Ioniza os analitos usando o ion trap
• Captura os íons e os mantém ionizados
• O aumento da voltagem no anel de eletrodos
expulsa os ions de acordo com o tamanho da
massa.
Filament
Gate
Ring Electrode
Trapped Ions
Analytes + He
Carrier Gas
Analisador de Massas Ion Trap
Benefícios
Alta sensibilidade
Compacto
Barato e fácil
produção
Limitações
•Não possibilita quantificação
de
Analisador de massas TOF (time of flighttempo de vôo)
Drift region (flight tube)
+
+
+
+
detector
Source
V
•Ions são acelerados com uma certa energia cinética;
•Íons menores atingem o detector primeiro;
•Mede o tempo que os íons atingem o detector.
Analisador de massas TOF (time of flighttempo de vôo)
• Ionização branda – muito útil para analisar biomoléculas
intactas e polímeros;
• Abrange um intervalo de massas grande – de compostos com
massas pequenas a grandes;
•Relativamente tolerante a tampões e sais;
• Aquisição de dados rápido;
• Alta sensilbilidade e alta resolução.
Analisador de massas TOF com reflecton
•Em 1966, B. Mamyrin patenteou um “espelho” para íons para a
focalização de energia e aumento de resolução.
•O reflectron constitui-se numa série de eletrodos que cria um
campo életrico que reverte a trajetória do íon
Analisador de massas TOF com reflecton
•Íons com energias maiores ficam mais tempo retidos no
reflecton que os de baixa energia;
•Possibilita que íons com a mesma m/z mas com pequenas
diferenças na energia cinética atinjam o detector
simultaneamente.
Analisador de massas TOF com reflecton
Linear Time Of Flight tube
ion source
detector
time of flight
Reflector Time Of Flight tube
ion source
detector
reflector
time of flight
Esquema do Espectrômetro de Massas
Bombas
turbomoleculares
Bombas rotatórias
Sistema de alto-vácuo
Injeção
Fonte de
íons
Analisador
de massas
Placas
HPLC
GC
MALDI
ESI
EI/CI
TOF
Quadrupolo
Trapeador de
íons
Detector
Foto
multiplicadoras
Aquisição
de dados
programas
Detectores

Os detectores atuais (canal de íons e elétron
multiplicadoras) produzem sinais eletrônicos
secundários quando atingidos por um íon.

Necessitam de calibração constante
Técnicas hifenadas e analisadores híbridos

CG-EM – Cromatografia gasosa-espectrometria de
massas


CLAE-EM – Cromatografia líquida –
espectrometria de massas


Separa compostos voláteis na cromatografia gasosa e
identifica por massas;
Separa compostos por cromatografia líquida e
identifica por massas;
CLAE-Q-TOF
CG/EM
CG/EM
CG/EM
Vantages
Limitação
Alta resolução na separação, separa
misturas complexas;
Amostras devem ser voláteis;
Interface com EM fácil;
Derivatização é requerida;
-tempo para análise
-manipulação de amostras
Identificação de compostos automatizada
(biblioteca de compostos);
Amostras
analisáveis;
Baixo custo ;
Identificação
de
compostos
derivatizados pode ser comprometida
Alta reprodutibilidade;
Facilidade em operar;
Grande gama de compostos voláteis;
Permite derivatização
termolábeis
não
são
CLAE/EM
CLAE/EM
CLAE/EM
Identificação e quantificação de compostos polares, média
polaridade e apolares, mesmo em quantidades pequenas ou
em matrizes complexas;
Electrospray – polar and ionic compounds
APCI – less-polar and neutral chemical species
CLAE-EM: determina metabólitos selecionados em poucos
minutos, em pequenas concentrações e requer pouca
preparação de amostras
CG vs. CL
CG
•Resolução excelente
•Separa mistura de metabólitos de
classes químicas diferentes
•Amostras termoestáveis
•Compostos voláteis
•Derivatização
CL
•Resolução limitada
•Separa misturas de metabólitos
com
propriedades
químicas
semelhantes
•Separa compostos com polaridades
diferentes
•Amostras termolábeis
•Não necessita de derivatização
Diferente tipos de sistemas

IES-QTOF


Ionização por electrospray+ analisador
quadrupolo + analisador TOF
MALDI-QTOF

Ionização por MALDI + quadrupolo + TOF
Sistema IES-Q-TOF
NANOSPRAY
TIP
MCP
DETECTOR
PUSHER
HEXAPOLE
QUADRUPOLE
ION
SOURCE
HEXAPOLE
COLLISION
CELL
TOF
REFLECTRON
SKIMMER
HEXAPOLE
Siatema MALDI-Q-TOF
Próxima aula
Padrões de fragmentação por impacto de elétrons:
identificação de compostos