UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE
SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO ALU COMO
MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO CASOCONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA
BAHIA
Feira de Santana, BA.
2010
JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO ALU COMO
MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO CASOCONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA
BAHIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Lázaro Souza Rios
Co-orientadora: Prof.ª. Dra. Sandra Mara Bispo Sousa
Feira de Santana, BA.
2010
Aos meus pais,
Arnaldo e Elizabete
Pelo
incentivo
ao
estudo,
enfatizando
sempre que o conhecimento é a maior
riqueza entre os seres humanos, pelo
carinho,
dedicação,
incondicional.
amor
e
apoio
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida e por toda força renovada nos momentos de
fraqueza.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Domingos Lázaro Souza Rios pela confiança
em mim depositada, pelos ensinamentos, pelo apoio, e paciência.
A Prof.ª Dr.ª Sandra Mara Bispo Sousa, que sempre está disponível em me
ajudar e por todos os ensinamentos compartilhados.
A Prof.ª Dr.ª Ana Angélica Leal Barbosa que tornou possível a execução
deste trabalho, por está sempre presente, muito obrigada!
A Prof.ª Dr.ª Kiyoko Abé Sandes por fazer parte da banca examinadora e
pela disponibilidade em avaliar esse trabalho.
Aos meus pais Arnaldo e Elizabete, as pessoas mais importantes da minha
vida, que mesmo sem entender muito bem o que eu faço (rsrs...), me apóiam de
forma incondicional.
Á Luciana Araújo, pela amizade, por dividir comigo a rotina no laboratório, as
disciplinas, as viagens (que foram muitas... rsrs!), as angústias, incertezas e as
alegrias desses dois anos.
Ao meu amigo Getúlio Bomfim por ser tão prestativo e companheiro,
obrigada por tudo!
Ao meu amigo Ricardo Brito, pela amizade sincera, e mesmo estando
distante torce por mim.
Aos colegas do Laboratório de Genética Molecular da UESB, Elder, Bruno,
Dani, Caio, Jamile Oliveira, pelas horas de descontração.
A UEFS que através do programa de Pós-graduação em Biotecnologia,
permitiu a realização deste trabalho.
A Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia pela oportunidade de
realização dos trabalhos práticos.
Ao CNPq – pela concessão da bolsa de estudos.
Estou convencido de que o mundo não é um mero pântano para onde
homens e mulheres se atiram... e morrem. Alguma coisa magnífica
está ocorrendo aqui no meio de crueldades e tragédias, e o desafio
supremo à inteligência é fazer prevalecer o que há de mais nobre e
melhor na nossa curiosa herança.
(C.A.Beard).
RESUMO
Os polimorfismos de seqüência Alu podem ser usados para estimar
ancestralidade, pois apresentam alelos com freqüências muito diferentes entre
grupos populacionais etnicamente distintos. A análise destes polimorfismos foi
realizada com intuito de quantificar a mistura étnica em amostras casos-controles
visando verificar a presença de estruturação populacional. 30 marcadores foram
analisados em 539 pacientes coronariopatas (364 euro-brasileiros e 175 afrobrasileiros) e em 302 controles (164 euro-brasileiros e 138 afro-brasileiros). O DNA
genômico foi amplificado utilizando-se o método de PCR-multiplex. Os fragmentos
amplificados foram separados em PAGE 8% não desnaturante/coloração por Nitrato
de Prata. As análises estatísticas foram realizadas com o uso dos programas
GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Dos 30 loci analisados, sete
apresentaram freqüência alélica similar às encontradas em populações africanas em
todas as amostras deste estudo. Foram observados desvios significativos para o
equilíbrio de Hardy-Weinberg em todas as amostras analisadas sendo que a maioria
pode ser explicada por déficit de heterozigotos. Nas associações alélicas par-a-par,
a amostra casos euro-brasileiros apresentou associações significativas. A
diversidade gênica intrapopulacional variou de 0,415 nos casos afro-brasileiros no
locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus Ya5ACA866. A
estimativa de mistura foi consistente para o modelo di-hibrído (Afro-americanos e
Europeus). Em todas as amostras a contribuição afro-americana foi maior, o que
era esperado devido à história de formação da população baiana. Porém essa
contribuição foi similar em todas as amostras, não diferenciando afro-brasileiros de
euro-brasileiros.
Palavras-chaves: Polimorfismos, sequência Alu, ancestralidade, estruturação
populacional.
ABSTRACT
The polymorphisms of Alu sequence can be used estimate ancestry,
therefore they present alleles with very different frequencies between ethnicity
distinct population groups. The analysis of polymorphisms of Alu insertion was
carried through with intention to quantify the ethnic mixture in samples case-control
being aimed at to verify the presence of population stratification. 30 markers were
analyzed in 539 patients with coronary artery disease (364 Euro-Brazilians and 175
african-Brazilians) and 302 controls (164 Euro-Brazilians and 138 african-Brazilians).
Genomic DNA was amplified using the PCR-multiplex. The amplified fragments were
separated on 8% PAGE not denaturing / color by Silver Nitrate. Statistical analysis
was performed using the programs GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Of
the 30 loci examined, seven showed allele frequencies similar to those found in
African populations in all samples in this study. Significant deviations were observed
for the Hardy-Weinberg equilibrium in all samples analyzed and most can be
explained by a deficit of heterozygotes. Allelic associations in pair-the-pair, the
sample cases Euro-Brazilians showed significant associations. The intrapopulation
diversity ranged from 0.415 in cases african-Brazilians in Ya5_541F locus to 0.503 in
cases african-Brazilians in Ya5ACA866 locus. The estimated mixture was consistent
with the model di-hybrid (African-Americans and Europeans). In all samples the
african-American contribution was higher, which was expected due to the formation
history of the Bahian population. But this contribution was similar in all samples, not
differing african-Brazilian of the Euro-Brazilians.
Word-keys: Polymorphisms, Alu sequence, ancestry, population stratification.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS..................................................................................................10
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................11
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................12
2 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................13
2.1 POPULAÇÃO BRASILEIRA..............................................................................13
2.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS .....................................................................15
2.3 ORIGEM E EVOLUÇÃO DAS INSERÇÕES ALU.............................................18
2.4 DOENÇA ATEROSCLERÓTICA CORONARIANA...........................................19
2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO DO TIPO CASO-CONTROLE..........................21
2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL .......................................................................22
3 OBJETIVO...............................................................................................................25
3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................25
4 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................26
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA.................................................................26
4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS.....................................................................26
4.3 ANÁLISE LABORATORIAL...............................................................................28
4.3.1 Extração de DNA.......................................................................................28
4.3.2 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)................................................28
4.3.3 Análise do Produto Amplificado.............................................................31
4.3.4 Coloração com Nitrato de Prata e Secagem do Gel..............................31
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...............................................................................33
4.4.1 Frequências Alélicas e Equilíbrio de Hardy-Weinberg.........................33
4.4.2 Associação Par-a-Par entre Loci.............................................................34
4.4.3 Diferenciação genética das populações................................................34
4.4.4 Diversidade gênica...................................................................................35
4.4.5 Mistura Étnica............................................................................................35
5 RESULTADOS.........................................................................................................36
5.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS ..............................................................................36
5.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG..............................................................44
5.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR .........................................................46
5.4 DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA ENTRE POPULAÇÕES..................................47
5.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)..................................................50
5.6 MISTURA ÉTNICA............................................................................................51
6 DISCUSSÃO............................................................................................................53
6.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS ..............................................................................53
6.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG..............................................................54
6.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR .........................................................55
6.4 DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA ENTRE POPULAÇÕES..................................57
6.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)..................................................57
6.6 MISTURA ÉTNICA............................................................................................58
7 CONCLUSÕES........................................................................................................60
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................62
ANEXO I......................................................................................................................69
ANEXO II.....................................................................................................................72
ANEXO III....................................................................................................................74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Loci genéticos, sequência dos iniciadores, localização cromossômica e
tamanho do fragmento dos polimorfismos que foram estudados...............................27
Tabela 2 - Componentes da mistura de reação de PCR............................................29
Tabela 3 - Programa utilizado para amplificação das sequências Alu.......................30
Tabela 4 - Frequências alélicas dos 30 polimorfismos de inserção Alu analisados em
casos e controles e nas populações parentais...........................................................37
Tabela 5 - Probabilidades obtidas com o teste exato para a verificação da aderência
ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg nas amostras analisadas.......................................45
Tabela 6 - Probabilidades obtidas com o teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg para
verificar o déficit de heterozigotos...............................................................................46
Tabela 7- Diferenciação gênica baseada nos 30 loci entre as quatro populações,
caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros
(COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)................................................................48
Tabela 8 - Diferenciação genotípica baseada nos 30 loci entre as quatro populações,
caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros
(COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)................................................................50
Tabela 9 - Diversidade gênica (HS) dos loci nas populações analisadas.................51
Tabela 10 - Estimativa de mistura étnica nas amostras analisadas, segundo o
método de identidade gênica, considerando os 30 polimorfismos analisados..........52
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais origens e destinos de tráfico de escravos para o Brasil...........13
Figura 2 – Diagrama esquemático da evolução da integração recente de subfamílias
Alu................................................................................................................................19
Figura 3 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Eurobrasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.....................................................40
Figura 4 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Afrobrasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.....................................................41
Figura 5 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Eurobrasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.....................................................42
Figura 6 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Afrobrasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.....................................................43
Figura 7 - Estimativas de mistura étnica, africana e européia, a partir dos 30 loci nas
amostras CEB (casos euro-brasileiros), CAB (casos afro-brasileiros) COEB
(controles euro-brasileiros) COAB (controles afro-brasileiros)...................................52
1 INTRODUÇÃO
A população brasileira se caracteriza por apresentar alta heterogeneidade
genética, formada a partir de diversos grupos étnicos diversificados entre si. Os
estudos casos-controles que investigam a associação entre polimorfismos em genes
candidatos e doenças têm sido amplamente empregados. Entretanto, em
populações miscigenadas como a brasileira, a existência de estruturação
populacional pode levar a resultados espúrios. Tornando o controle deste fator, um
passo imprescindível nestes estudos populacionais.
O estado da Bahia é caracterizado por uma população tri – híbrida com forte
ascendência africana tornando de fundamental importância caracterizar a sua
estrutura populacional.
A estrutura genética de amostras de casos e controles para doença
aterosclerótica coronariana foi examinada usando um conjunto de polimorfismos de
seqüências Alu para avaliar as contribuições africana, européia e ameríndia em
indivíduos desta amostra. Estas sequências Alu são excelentes marcadores étnicos,
que investigam a composição genética de diferentes populações e poderão ser
utilizados para controle da estruturação populacional em estudos genéticos
utilizando a metodologia caso-controle.
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 POPULAÇÃO BRASILEIRA
A população brasileira é bastante peculiar em relação a outras populações do
mundo por ter sido formada a partir da miscigenação de vários povos que passaram
a co-habitar o Brasil desde 1500, especialmente ameríndios, africanos e europeus
(CALLEGARI-JACQUES e SALZANO, 1999). Na época da chegada dos
portugueses, o Brasil era habitado por vários povos indígenas, que se distribuíam ao
longo de toda a costa. Devida a drástica diminuição da população indígena,
provocada pelo extermínio, epidemias e o trabalho escravo, foi necessário à
utilização de uma nova mão-de-obra escrava, os africanos.
A origem dos africanos que foram trazidos para o Brasil foi bastante variada,
tendo envolvido pessoas vindas do ocidente, oriente e sudoeste da África, bem
como da região do atual Moçambique (em número bem menor), sendo que a
maioria originou-se das regiões dos atuais, Congo e Angola (KLEIN, 2002). As
cidades Salvador, Recife e Rio de Janeiro constituíam na época os principais
destinos dos africanos que foram trazidos para cá (GATTÁS et al., 2004), conforme
pode ser observado na figura 1.
Figura 1 - Principais origens e destinos de tráfico de escravos para o Brasil (Fonte: SOUSA, 2001).
14
Além dos africanos, ameríndios e portugueses, a população brasileira
recebeu também influência de outros povos na sua formação. Durante o século XIX
e início do século XX, outros imigrantes vieram juntar-se aos grupos já existentes,
como italianos, espanhóis e alemães, além dos japoneses e chineses (CALLEGARIJACQUES e SALZANO, 1999). A população brasileira é, assim, caracterizada por
grande diversidade étnica e intensa miscigenação.
Em 1800, os negros constituíam 47% da população brasileira, contra 30%
de mulatos e 23% de brancos (IBGE, 2000). Fatores como, por exemplo, a proibição
do tráfico de escravos (1850), a elevada mortalidade da população negra, o forte
estímulo à imigração européia (expansão cafeeira), além da intensa miscigenação
entre brancos e negros, alteraram profundamente a composição étnica da
população brasileira. Em 1880, os negros estavam reduzidos a 20% da população,
contra 42% de mulatos e 38% de brancos.
Assim como o Brasil, a Bahia foi à primeira área de colonização deste país e
possui uma população altamente heterogênea, baseada em três grupos principais,
ameríndios, africanos e europeus. No entanto, este estado teve uma miscigenação
mais intensa por parte de africanos e europeus. A chegada dos negros na Bahia se
confunde com a história dos mesmos no Brasil, tendo em vista que o porto de
Salvador foi um dos mais importantes do início até o fim do tráfico escravo
(TAVARES, 2001).
Nos dias atuais a população baiana consiste de 75% de indivíduos de origem
Africana (GATTÁS et al., 2004), constituindo-se assim uma das populações que
melhor caracterizam os afro-descendentes no Brasil.
Recentemente, Callegari-Jacques et al. (2003) analisaram mais de mil
indivíduos pertencentes às cinco regiões brasileiras. A contribuição européia foi
maior na região Sul (81%) e menor na região Nordeste (68%). Ao contrário, na
região Sul, a contribuição africana é menor (11%), enquanto os maiores valores
foram encontrados nas regiões Sudeste e Centro-Oeste (18%). E por fim, a
contribuição ameríndia foi menor no Sul e Sudeste do país (7%) e maior para a
região Nordeste (17%). Portanto, foi observado um gradiente crescente, norte-sul de
contribuição Européia em concordância com a história da formação da população
brasileira (PEDROSA, 2006).
Dados
de marcadores genéticos
autossômicos
e uniparentais em
populações especiais, afro-descendentes remanescentes de quilombos, mostram
15
grande contribuição africana 53% a 81% nas amostras analisadas de São Gonçalo,
Bananal e Barra (SOUSA, 2001; ABE-SANDES, 2002 e BARBOSA et al., 2006). No
entanto não há dados com marcadores moleculares em amostras representativas
do estado da Bahia.
2.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS
Um polimorfismo genético refere-se à variação em um gene, cromossomo,
ou proteína resultando na existência de duas ou mais formas, cada uma das quais
tem freqüência maior que a que poderia ser mantida apenas por mutação
recorrente.
Como primeiro passo para associar etnia e herança genética, é necessário
agrupar as populações humanas de acordo com suas respectivas ancestralidades
(BAMSHAD, 2003). Para determinar diferenças entre grupos populacionais utilizamse pequenas variações no DNA, ou polimorfismos que se caracterizam por
representar
uma
seqüência
de
DNA
localizada
num
determinado
locus
cromossômico, que difere de indivíduo para indivíduo, e cujo alelo menos comum
possui freqüência de pelo menos 1%.
A variabilidade de marcadores polimórficos de DNA é bem maior do que a
encontrada em seus produtos e estão distribuídos por todo genoma, sendo utilizados
para estudos populacionais e na identificação individual (CAVALLI-SFORZA, 1994).
Grande parte dos loci marcadores que apresentam alelos com freqüências
muito diferentes entre grupos populacionais definidos geográfica e/ ou etnicamente,
os quais se configuram como ótimos marcadores de individualidade, são
denominados de PSAs (do inglês Population Specific Alleles, SHRIVER, et al.,
1997). Estes marcadores apresentam elevado potencial para discriminar grupos
populacionais e são, portanto, ferramentas eficientes quando se quer estabelecer o
grau de mistura entre as populações a serem estudadas.
Com a caracterização dos PSAs tornou-se possível gerar estimativas mais
precisas das proporções ancestrais de uma população miscigenada (PARRA et al.,
1998; PARRA et al., 2001; SHRIVER et al., 2003). Esses marcadores são
atualmente denominados de AIMs (do inglês Ancestry Informative Markers;
16
BONILLA et al., 2004). Os AIMs podem ser usados para estimar ancestralidade
biogeográfica em nível de população, subgrupo e individual (SHRIVER et al., 2003).
Pequenos fragmentos do DNA conhecidos como polimorfismos de inserção
Alu são amplamente utilizados (BATZER & DEININGER, 2002). As inserções Alu
fazem parte da família de DNA repetitivo SINE (short interspersed nuclear elements)
e são originárias de um retrotransposon. Ocasionalmente, as seqüências Alu
replicam-se e as cópias resultantes se dispersam aleatoriamente para novas
posições no cromossomo de origem, ou em outro cromossomo, geralmente em
áreas que não provocam efeitos no funcionamento dos genes que estão próximos
(BATZER & DEININGER, 2002). Segundo Batzer e Deininger (1994), se duas
pessoas têm a mesma seqüência Alu no mesmo local do seu genoma, elas
descendem de um antepassado comum que lhes forneceu aquele segmento
específico de DNA. Isto porque, é improvável que o evento de inserção ocorra duas
vezes em um mesmo locus.
Estas inserções poderiam ser excelentes marcadores étnicos e, então, de
grande uso para estimar a composição étnica de populações híbridas como a
população brasileira (MENDES – Jr. & SIMÕES, 2001). Estes polimorfismos são
altamente informativos em estudos de genética de populações, permitindo sua
utilização como instrumento de investigação para caracterizar a composição
genética de diferentes povos, uma vez que possui freqüências diferenciadas para
cada etnia (RAY et al., 2005).
Um estudo realizado com três marcadores de inserção Alu (TPA25, PV92 e
APO) mostrou um grande diferencial de freqüências alélicas no locus PV92 entre
Ameríndios/Africanos
e
Ameríndios/Europeus,
e
no
locus
APO
entre
Africanos/Europeus. O locus TPA25 foi o único que mostrou homogeneidade na
distribuição das freqüências alélicas em todos os grupos analisados. As freqüências
gênicas na amostra exibiram valores que são intermediários entre aqueles descritos
para Europeus e Africanos refletindo a contribuição destes dois grupos étnicos na
formação da população brasileira (MENDES – JR. & SIMÕES, 2001).
Cotrim et al. (2004) analisaram quatro loci polimórficos Alu (APO, ACE, TPA
e FXIIIB), em uma amostra de indivíduos de seis populações derivadas de Africanos
(remanescentes de quilombos) do Vale do Rio Ribeira, e uma amostra de indivíduos
do estado de São Paulo. As quatro inserções Alu foram polimórficas em todas as
populações. O número de heterozigotos observados e esperados foi maior nos
17
remanescentes de quilombos do que na amostra de indivíduos do Estado de São
Paulo, segundo estes autores é possível que esta população tenha sofrido um
significante grau de fluxo gênico. Para Silva - Jr. et al. (1999), a eventual diversidade
perdida pelo isolamento pode ter sido compensada pela miscigenação de diferentes
grupos étnicos (Africanos, Europeus e Ameríndios) no momento de fundação dos
quilombos. Além da miscigenação dos três grupos étnicos formadores, outra
possível explicação seria a diversidade de grupos Africanos que foram trazidos
juntos em navios como escravos para o Brasil.
Com o objetivo de investigar a variação genética entre populações ameríndias
foi analisada uma amostra composta por 193 indivíduos de quatro tribos Ameríndias,
utilizando 12 polimorfismos de inserções Alu (cinco deles nunca estudados nestas
populações) e um grupo de 22 proteínas sanguíneas. Os testes padrões de
diferenciação intertribal e outros aspectos de sua variação foram congruentes nos
dois grupos (Alu; grupo protéico). Considerando a heterozigose as inserções Alu e
as proteínas sanguíneas mostram essencialmente o mesmo padrão com valores
similares. A variabilidade total devido a diferenças inter-populacionais foram
similares considerando os polimorfismos Alu e grupos protéicos (0,26; 8%; 0,23;
10%, respectivamente) (BATTILANA et al., 2002).
Estudos feitos utilizando os marcadores informativos de ancestralidade que
apresentam um alto diferencial de freqüência alélica (maior que 45%) entre
Africanos e Europeus mostraram que em nível populacional era possível estimar de
forma precisa, o grau de mistura africana e européia em uma população norte
americana (PARRA et al., 1998).
Com o objetivo de verificar se o grau da aparência física dos indivíduos está
relacionado à sua ancestralidade genômica africana, PARRA et al. (2003) utilizaram
o mesmo conjunto de AIMs descritos por PARRA et al. (1998) e descreveram o
índice individual de ancestralidade genômica africana permitindo a estimativa de
ancestralidade genômica africana em nível individual. Mostraram também que todas
as
estimativas
em
amostras
brasileiras,
baseadas
em
auto-classificação,
apresentaram índice de ancestralidade africana (IAA) intermediário entre Europeus
e Africanos (PARRA et al. 2003).
Os maiores valores de ancestralidade africana foram encontrados nas
regiões Nordeste e Sudeste, entretanto as regiões Norte e Sul mostraram valores
menores para o IAA. Os resultados obtidos para amostras de brasileiros brancos
18
das quatro regiões do país mostraram contribuição africana superior a 10% em mais
de 75% da amostra de brancos das regiões do Norte, Nordeste ou Sudeste. No Sul,
apesar da forte imigração européia o percentual de brancos com IAA acima de 10%,
mostrou-se alto (49%). Em termos comparativos os dados fornecidos por Shriver et
al (2003) para brancos norte-americanos, apenas 11% deles apresentaram IAA
superior a 10%. A conclusão desse estudo é de que pelo menos 77 milhões de
pessoas em nosso país apresentam mais de 90% de contribuição africana, sendo
esta de enorme significância para a constituição da população brasileira.
Os polimorfismos de inserção Alu escolhidos neste trabalho apresentam
poucos dados em populações mundiais (WANG et al., 2006, RAY et al., 2005), mas
mostram um amplo diferencial de freqüência (>40%).
2.3 ORIGEM E EVOLUÇÃO DAS INSERÇÕES ALU
As subfamílias Alu originaram-se como um resultado de mutações que
ocorreram na existência de elementos ‘master’ ou novos elementos de origem
capazes de uma amplificação significante (ROY-ENGEL et al., 2001).
O termo 'elemento repetitivo' descreve várias seqüências de DNA que estão
presentes em múltiplas cópias nos genomas em que eles se encontram. Sendo que
as inserções Alu estão incluídas no grupo dos elementos repetitivos (BATZER e
DEININGER, 2002).
Durante os últimos 65 milhões de anos, os elementos Alu têm propagado
mais do que um milhão de cópias em genomas primatas, e isto tem resultado na
geração de uma série de subfamílias Alu de diferentes idades (BATZER &
DEININGER, 2002). Com isso, quase todas as subfamílias da recente integração
dos elementos Alu dentro do genoma humano são chamadas de subfamílias
“jovens”, são elas: Y, Yc1, Yc2, Ya5, Ya5a2, Ya8, Yb8 e Yb9, (compreendendo
menos de 10% dos elementos Alu presente no genoma) a maioria existente são
membros da subfamília Ya5 e Yb8 (ROY et al., 2000).
A recente integração dos elementos serve como marco temporal na evolução
do genoma, e muitos deles provaram ser úteis no estudo da evolução humana e no
estudo da história natural de diferentes regiões do genoma (CARROL et al., 2001).
19
As jovens subfamílias Alu são comumente ativas no que diz respeito à
retrotransposição, diferentemente das velhas subfamílias Alu (Sx, J e Sg1).
Ressalta-se que as velhas subfamílias compreendem a maioria dos elementos Alu
presente no genoma (ROY et al., 2000).
A relação e a evolução das subfamílias Alu são apresentadas e descritas na
figura 2.
Figura 2 – Diagrama esquemático da evolução da integração recente de subfamílias Alu. Todas as
origens das subfamílias Alu. Todas as origens das jovens subfamílias Yb9, Yc1 e Yc2 são mostradas
depois a divergência das subfamílias Yb8 e Y, respectivamente. O tamanho da fonte é relativo ao
número de elementos dentro de cada subfamília, o maior representante possui 100.000-200.00
cópias; o médio 1.000-2.000 cópias; e o menor 50-500 cópias. O número total de elementos de cada
subfamília ligados à doença é indicado à direita. A proporção de elementos polimórficos dentro de
cada família é representado por: ± elementos polimórficos raramente encontrados; +, baixa
percentagem de elementos polimórficos; ++, 50% dos elementos são polimórficos; +++, quase todos
elementos são polimórficos. (Adaptado de: ROY-ENGEL et al, 2001).
2.4 DOENÇA ATEROSCLERÓTICA CORONARIANA
A amostra utilizada no presente estudo é constituída por pacientes que
realizaram o exame de cineangiocoronariografia. A amostra foi dividida em amostras
caso/controle de acordo com a presença da doença arterial coronariana.
Aterosclerose é um processo dinâmico, evolutivo, a partir de dano endotelial
de origem multifatorial, com características de reparação tecidual. Entretanto, o
20
processo tem início numa idade bastante precoce, tanto assim que, ao atingir a
idade adulta, a maioria dos homens (e as mulheres em menor escala) apresenta
evidência de aterosclerose das artérias coronárias (BATISTA, 2000).
Os fatores de risco são capazes de predispor e/ou causar lesões diretamente
no endotélio vascular levando a disfunção endotelial (ROSS, 2000). A partir do dano
vascular, ocorre a expressão de moléculas de adesão que mediarão à entrada de
monócitos em direção ao espaço intimal.
Estes, por sua vez, englobarão
lipoproteínas modificadas [predominantemente lipoproteínas de baixa densidade
(LDL)
oxidadas
originando
as
células
espumosas.
Diferentes
mediadores
inflamatórios são liberados no espaço intimal, perpetuando e ampliando o processo,
levando finalmente à formação da placa aterosclerótica (ROSS, 2000).
Durante os últimos 30 anos se tem presenciado um declínio razoável da
mortalidade por causas cardiovasculares, em países desenvolvidos, enquanto que
elevações relativamente rápidas e substanciais têm ocorrido em países em
desenvolvimento, dentre os quais o Brasil é um dos representantes (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 1996). No Brasil, a doença aterosclerótica
coronariana é uma das principais causas de morte (Serviço de Informação sobre
Mortalidade – Ministério da Saúde, 2001).
De acordo com as projeções da Organização Mundial de Saúde, essa
tendência de elevação na doença cardiovascular tende a persistir, agravando ainda
mais
o
quadro
de
morbidade
e
mortalidade
elevadas
nos
países
em
desenvolvimento.
O perfil lipídico desfavorável e elevação da pressão arterial, particularmente
em conjunto a outros fatores de risco como a obesidade, diabetes e a predisposição
genética estão associados ao maior desenvolvimento da aterosclerose (Ministério
da Saúde, 2001).
A maioria das doenças humanas são poligênicas e multifatoriais, ou seja, são
governadas por muitos genes e são causadas por um conjunto de fatores que agem
conjunta e simultaneamente. Genes individuais têm papel sutil na expressão de
qualquer patologia poligênica. Além disso, existem variáveis não genéticas, quer
individuais (gênero, origem, etnia, entre outras.) ou ambientais (tabagismo, consumo
de álcool, entre outras.) que são de grande importância nos estudos de associação
entre fatores genéticos e o risco destas patologias (KATO, 2002).
21
Devido ao caráter tri – hibrido da população brasileira e da forte influência
afro - descendente no estado da Bahia é de fundamental importância caracterizar a
sua estrutura populacional, uma vez que estudos de associação realizados entre
indivíduos não-aparentados em populações miscigenadas podem ser susceptíveis a
erro devido à estratificação populacional. Nesses casos é necessário, quantificar o
efeito da mistura recente na estrutura da população e fazer a correção utilizando
modelos estatísticos populacionais (HINDS et al., 2004).
2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO DO TIPO CASO-CONTROLE
Estudos de Associação permitem determinar se uma variante genética
específica é mais comum em pessoas com a doença do que em pessoas sem a
doença. Muitos estudos de associação utilizam o tradicional método caso-controle
em que a presença da variante genética é comparada entre as pessoas com a
disordem (casos) e aquelas pessoas que não têm a disordem (controles).
Dependendo da característica sob investigação, os estudos de associação
podem ser do tipo populacional ou baseado em famílias.
Estudo de associação baseado na população compara as diferenças das
freqüências alélicas de genes candidatos entre indivíduos afetados e controles, nãoafetados e não-relacionados (RISCH, 2000).
Já os estudos baseados em famílias levam em conta a transmissão da
característica dos pais para um filho afetado, ou seja, os alelos não-transmitidos são
usados como controle (CARDON & PALMER, 2003).
Segundo Pritchard e Rosenberg (1999), um dos maiores problemas dos
estudos de associação é a estratificação genética que pode ocorrer devido à
utilização de indivíduos miscigenados ou de diferentes grupos continentais.
A consequência seria a obtenção de resultados espúrios em estudos de
associação genética. Em situações como esta, tem-se uma maior representação de
indivíduos com ancestralidade para um determinado grupo entre os casos e, assim,
alelos mais frequentes neste grupo populacional aparecerão espuriamente
associados à doença em questão (KNOWLER et al., 1988). Na população brasileira
22
esse fato deve ser levado em consideração para os estudos de associação genética
a fim de se evitar esse erro.
Entretanto, se casos e controles são adequadamente igualados para
potenciais confundidores, tal como idade, sexo, etnia ou origem geográfica, e
também outros fatores confundidores específicos de doenças, então é justo assumir
que a estratificação populacional não é suficiente para explicar a associação
observada (ARDLIE et al, 2002).
2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL
Um modelo de população estratificada pode ser definido, como aquele que
contém vários subgrupos que permaneceram, em sua maior parte, geneticamente
distinto durante a evolução. Muitos distúrbios genéticos são caracterizados por
mutações alélicas que variam em freqüência entre populações de diferentes grupos,
provavelmente porque um pequeno número de mutações ancestrais tornou-se
prevalecente em determinadas populações devido à estratificação (MARCHINI et
al., 2004).
A existência de variantes alélicas específicas de populações tem um
significado para a compreensão das origens das doenças genéticas e também cria
oportunidades para o diagnóstico de alelos específicos em uma população de risco.
Estudos de associação têm sido amplamente utilizados para ajudar no
entendimento da base genética de traços quantitativos, tal como a susceptibilidade
para doenças complexas (ZEMBRZUSKI et al., 2006).
Entretanto, essas diferenças podem, muitas vezes, não ser detectadas.
Assim, a não-detecção de estratificação populacional pode levar a associações
espúrias entre um marcador candidato e um determinado fenótipo (RISCH, 2000;
HINDS et al., 2004). Isto significa que tanto o distúrbio quanto o alelo
aparentemente associados são comuns na população que está sendo estudada
A possibilidade de associações falsas deve-se, principalmente, à população
amostrada, à característica em estudo e/ou ao marcador que está sendo testado
(ZIV & BURCHARD, 2003). Talvez o fator mais importante que leva a tais
associações esteja relacionado às características da população, principalmente a
etnia (RISCH, 2000; SANTOS et al., 2002)
23
Diferenças sistemáticas na ancestralidade entre casos e controles podem
ser encontradas quando subgrupos populacionais distintos geneticamente têm uma
prevalência diferente do fenótipo alvo (HINDS et al., 2004).
Dez marcadores informativos de ancestralidade (AIMs) foram investigados
em 101 pacientes com doença arterial coronariana e em 102 controles saudáveis de
uma população da região sul do Brasil, a fim determinar a ocorrência de
estratificação nesta população. O grau de miscigenação africana detectado nesta
população foi estimado sendo maior que 6%, mas nenhuma diferença entre casos e
controles foi observada. Usando o índice de ancestralidade africana (IAA) foi
possível detectar níveis individuais de ancestralidade africana e remover da amostra
aqueles indivíduos com evidencia de contribuição africana, pois este seria um fator
confundidor.
Conseqüentemente,
mostrou-se
que
é
possível
controlar
a
estratificação da população escolhendo indivíduos, sem a perda do poder estatístico
que ocorre com o uso de outros métodos do controle genômico (ZEMBRZUSKI et
al., 2006).
Um estudo realizado por Seldin et al. (2007) mostra a estrutura genética da
população da Argentina examinada usando um conjunto de 78 AIMs para avaliar as
contribuições européia, ameríndia e africana em 94 indivíduos desta população. O
programa utilizado para os cálculos estatísticos foi o STRUCTURE, as contribuições
médias européia, ameríndia e africana foram de respectivamente, 78%, 19,4% e
2,5%. Resultados similares foram encontrados quando se utilizou o método do
quadrado
médio:
europeu,
ameríndio
e
africano
80,2%,
8,1%
e
1,7%,
respectivamente. Consistente com os estudos anteriores os resultados atuais
mostraram muito poucos indivíduos (quatro de 94) com miscigenação africana não
superando 10%. Notavelmente, quando se utilizou o índice de miscigenação
individual, os ameríndios e os europeus mostraram uma variação muito grande com
uma contribuição individual de ameríndios que variou de 1,5 a 84,5% nos 94
indivíduos argentinos. Estes resultados indicam que índices de miscigenação devem
ser considerados quando estudos casos-controle são realizados nestas populações.
Além disso, o estudo atual mostra que um conjunto de SNPs informativos possam
ser usados para verificar ou para controlar potenciais estruturações que estão
ocultas. Além disso, a variação da miscigenação em indivíduos argentinos sugere
que esta população é apropriada para futuros estudos de miscigenação.
24
Para Enoch et al. (2006), a probabilidade de detectar a estratificação
aumenta com o número de marcadores analisados, visto a probabilidade que um
marcador tem de variar entre duas populações que serão testadas.
25
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar as freqüências de 30 polimorfismos de inserção Alu em casos e
controles de uma amostra populacional de coronariopatas do estado da Bahia.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Estimar as freqüências alélicas e genotípicas dos marcadores estudados
nestas amostras;
•
Estimar parâmetros de diversidade genética intrapopulacional;
•
Quantificar a mistura étnica;
•
Verificar as associações alélicas par - a - par entre pares de loci não ligados;
•
Investigar marcadores informativos de ancestralidade africana, ameríndia e
européia nas amostras estudadas, no intuito de avaliar a possibilidade de
estruturação da população.
26
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra estudada foi previamente coletada pelo grupo do Prof. Domingos
Lázaro Souza Rios no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz/ Fundação Osvaldo Cruz,
Bahia. A amostra é composta de 841 indivíduos que procuraram o serviço de
Hemodinâmica do Hospital Santa Izabel em Salvador – BA para a realização de
cineangiocoronariografia devido a sintomas relacionados a doença arterial
coronariana. Na época da coleta (2004-2005) este serviço era o único na Bahia a
realizar este exame pelo Sistema Único de Saúde, recebendo a demanda de todo o
estado. Da amostra coletada 500 indivíduos apresentaram lesões ateroscleróticas
significantes (obstrução da luz arterial > 50%) em coronárias e 341 não
apresentaram lesões visíveis no exame. Dos 841 indivíduos estudados 312 foram
classificados como Afro-descendentes e 529 como Caucasóides de acordo com os
critérios morfológicos descritos por Azevêdo (1980) com modificações. Foram
considerado Euro-descendentes (brancos e mulatos claros) e Afro-descendentes
(mulatos médios, mulatos escuros e negros). Então, as amostras foram
consideradas casos (euro-brasileiros e afro-brasileiros) e controles (euro-brasileiros
e afro-brasileiros).
O protocolo de pesquisa foi avaliado e liberado pelo comitê de Ética do
Hospital Santa Isabel. Todos os pacientes foram informados dos riscos e benefícios
potenciais da pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido
(Anexo III).
4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS
Foram estudados 30 polimorfismos de seqüência Alu (Tabela 1), estes
foram escolhidos por apresentarem altos diferenciais de freqüências entre as
populações
asiáticas,
(http://falcon.roswellpark.org:9090/).
afro-americanas
e
européias
27
Tabela 1 - Loci genéticos, seqüência dos iniciadores, localização cromossômica e tamanho do
fragmento dos polimorfismos que foram estudados.
Loci
Seqüência dos Iniciadores
Localização
cromossômica
Tam. dos fragmentos (pb)
Del / Ins
Ya5ACA647
5’ACGTAAGCCTCAAAAAGGCA3’
3’GGCACTGCAGATACAGTGTGA5’
1p31.1
58 / 375
Ya5ACA733
5'TAGGGTAAGGAATATGTGCTGCTTTAG3’
3'GTCTCTGAACGACTATGTGAGCAG5’
1q24.2
175 / 500
Ya5NBC45
5'TATGGTTCTCAGCCATCACG3’
3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5’
20q11.23
265 / 591
Ya5ac1982
5'TCTGGGTTTCTCTGGTGGAC3’
3'CTGGCAAATGCTACCCAAGT5’
10q11.22
148 / 470
Ya5ACA917
5’TGGCCTGTTTTCACACCTTT3'
3'CCAAAGCAACTTGCACCTTT5’
2p13.1
171 / 500
Ya5ACA1400
5’TTCCTCTGAAAGGCTGGAAA3'
3'AAACTGAAAATGCAGGTGCC5’
5q31.1
379 / 677
5’TGGAAAGCAGAGAAATGCTG3'
3'GCTGTTATATGAAGTGTTCACCTTG5’
13q14.2
167 / 498
6q15
541 / 849
Ya5ac2282
Ya5ACA1441
5’CAAATGCAATTGGAGTGTTCA3'
3'ATTGGGCTAAGCACAGGATG5’
Ya5NBC132
5’CTCGTGATTCACAGAAGTGTTGTAAG3'
3'CGGGGTTCATCCTTAATACATACAT5’
6p22.2
228 / 458
Ya5ac2670
5’TGGGCAGAGTGAATATCCTTTAG3'
3'GACCTTGGTCCTTATTGTCTTCC5’
19p12
159 / 476
Ya5ACA1555
5’TTTGTTGATCCAGTTTTATATGGC3'
3'CGGTTGGTTTCAATGTCCTT5’
6q12
103 / 446
Yb8NBC157
5’TATGGTTCTCAGCCATCACG3'
3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5’
10p11.22
423 / 712
Ya5NBC150
5’AAATGGAGACACAGAGGTGTAAAGA3'
3'CCCAAACTGCATATTTAAAGGGTAG5’
19q13.41
169 / 491
Ya5ACA1002
5’GGGGTTGGAGAACCCTGTTA3'
3'AAGGAGTAGATTGTGATGGCCT5’
3p24.3
132 / 457
Ya5NBC327
5’AGGCAGGTTCAATGTTCAAA3'
3'TTGTCTTATTGTGCTGGCTAGA5’
6p12.3
339 / 668
Ya5ACA1242
5’GCGAGGGCCTTATAAAAGATG3'
3'ATTGGGTTTCACATCCGTGT5’
4q26
151 / 471
Ya5_531F
5’GCAAACACAGTGCCACAAGT3'
3'TGGGGATGTGACCCAAGTAT5’
16p12.1
195 / 502
Yb8NBC93
5’AAGTGAGTCCCAGGGCCTTCT3'
3'CACACAGGCACTTGTTTGGT5’
20p12.3
274 / 601
Ya5ACA928
5’TTTCATCTTTCTAGGCTTCACG3'
3'TCCTAGCCATAAATCACAAATCA5’
2q31.1
125 / 445
Ya5ACA1100
5’GCATCCTACAAAGCCATT3'
3'GCCTGGGCAATAATTTTCAA5’
3q25.2
170 / 492
5’CATGCTTCAAGAGAACATCAGG3'
3'TCTGGTTGCTTGCAGAGAGTAA5’
7q34
630 / 1401
Ya5ACA1184
5’TGGCTCTAATGACCAAAAGGA3'
3'CCCAGGTGATTCATTCCATC5’
4p13
150 / 467
Ya5ACA866
5’GAAAACCACACCAAATTGCAT3'
3'CCGCTCTGTAGAAAATGCGT5’
2p22.3
106 / 426
H7_F_148
28
Loci
Ya5NBC241
PV92
Seqüência dos Iniciadores
5’GGTTCCAATAGAGAGCAACAGAA3'
3'ACCTTAAGCTTTCCCCCAGA5’
5’AACTGGGAAAATTTGAAGAAAGT3'
3'TGAGTTCTCAACTCCTGTGTGTTAG5’
Localização
cromossômica
Tam. dos fragmentos (pb)
Del / Ins
66 / 392
15q15.3
122 / 437
16
141 / 471
Ya5_541F
5’GGATTGGGAAAGGTGTTGAA3'
3'TGGCTGAGAAAACCTGCAAT5’
10p11.21
Yb8NBC67
5’TCTCTACCCAGCTTTACCAA3'
3'GAGGACCAGCTTAGTTTGTG5’
6p22.2
Ya5ACA862
5’TCAGAGTAATGCACACAGATGCT3'
3'TGCATTAAGTGCTCCAGAAGG5’
2q11.2
Ya5NBC354
5’GTAGCTTGGCCTGTGCTCTT3'
3'CCTCTGGGCTGAGAAACTCTT5’
7q32.1
Ya5ACA1611
5’ TTTTGGTAAAGATGCCACAGAA3'
3' TCCTAAACATAATACGTACAGGTGA5’
7q31.1
375 / 503
149 / 485
148 / 466
184 / 496
4.3 ANÁLISE LABORATORIAL
4.3.1 Extração de DNA:
O DNA foi extraído no Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação
Oswaldo Cruz, Bahia. A extração do DNA foi realizada com a técnica de salting-out
(Anexo I), segundo Lahiri e Nurnberger (1991). O método de salting out utiliza
solução saturada de cloreto de sódio para a precipitação de proteínas.
Posteriormente as moléculas de DNA que se encontram no sobrenadante são
precipitadas pela adição de etanol absoluto.
4.3.2 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
O DNA genômico foi amplificado utilizando a técnica da PCR-multiplex,
segundo as condições padronizadas no Laboratório de Genética Molecular da
UESB. Em cada multiplex foram amplificados três marcadores simultaneamente. A
reação da PCR foi feita utilizando um microtubo tipo eppendorf de 0,5 ml contendo
os componentes descritos para cada locus (Tabela 2). Em seguida a mistura de
PCR foi distribuída em microtubos para cada amostra de DNA, sendo estes
29
numerados corretamente. Por fim, 3µL de DNA genômico foi adicionado nos
microtubos contendo a mistura da PCR.
Tabela 2- Componentes da mistura de reação de PCR
Loci
Água deionizada
Tampãoa
DNTPsb
Primers (2,5 uM)
MgCl2 (2,0 Mm)
Taq Polimerase
(1U/µL)
Ya5ACA647
Ya5ACA733
1,0µL
13,2µL
2,5µL
0,2µL
1,0µL
Ya5NBC45
1,0µL
Ya5ac1982
0,5µL
Ya5ACA917
11,2µL
2,5µL
0,2µL
0,5µL
Ya5ACA1400
0,5µL
Ya5AC2282
1,0µL
Ya5ACA1441
11,2µL
2,5µL
0,2µL
1,0µL
Ya5NBC132
1,0µL
Ya5AC2670
1,0µL
Ya5ACA1555
11,2µL
2,5µL
0,2µL
Yb8NBC157
11,2µL
2,5µL
0,2µL
11,1µL
2,5µL
0,2µL
Ya5ACA86
0,1µL
2,0µL
0,1µL
1,0µL
2,0µL
0,1µL
1,0µL
2,0µL
0,2µL
1,0µL
Ya5ACA928
Ya5ACA1184
2,0µL
1,0µL
Yb8NBC93
H7_F_148
0,1µL
1,0µL
Ya5ACA1242
Ya5ACA1100
2,0µL
1,0µL
Ya5NBC327
Ya5_531F
0,1µL
1,0µL
Ya5NBC150
Ya5ACA1002
1,0µL
2,0µL
1,0µL
11,2µL
2,5µL
0,2µL
1,0µL
1,0µL
1,0µL
1,0µL
2,0µL
0,1µL
30
Loci
Água deionizada
Tampãoa
DNTPsb
2,5µL
2,5µL
Ya5_541F
11,1µL
2,5µL
0,2µL
1,0µL
0,2µL
1,0µL
0,2µL
1,0µL
Ya5ACA862
0,2µL
11,1µL
1,0µL
2,5µL
Ya5ACA1611
b
2,0µL
2,0µL
0,2µL
0,2µL
2,0µL
0,2µL
1,0µL
Ya5NBC354
a
Taq Polimerase
1,0µL
9,1µL
9,1µL
Yb8NBC67
MgCl2 (2,0 Mm)
(1U/µL)
Ya5NBC241
PV92
Primers (2,5 uM)
2,0µL
0,2µL
1,0µL
Tris HCL 75 mM ph 9,0; KCL 50 mM; 20 mM (NH4)S04
0,25 µL de solução (10 mM de cada base)
A solução da PCR juntamente com o DNA genômico foram submetidos a um
programa específico no termociclador para a realização da amplificação (Tabela 3).
Tabela 3- Programa utilizado para amplificação das seqüências Alu
Quantidade de ciclos
1 ciclo
Temperatura/ Tempo
94º C por 5 minutos;
94º C por 30 segundos;
5 ciclos
58º C por 45 segundos;
72º C por 90 segundos;
94º C por 30 segundos;
5 ciclos
56º C por 45 segundos;
72º C por 90 segundos;
94º C por 30 segundos;
25 ciclos
54º C por 45 segundos;
72º C por 90 segundos;
1 ciclo
72º C por 10 minutos
1 ciclo
20º C indefinidamente;
31
4.3.3 Análise do Produto Amplificado
Depois do término da PCR, as amostras foram submetidas à eletroforese em
gel não desnaturante de poliacrilamida a 8%. O preparo dos reagentes e soluções
são descritos no Anexo II. Para a montagem do gel foi utilizado um tubo falcon, onde
foi colocado primeiramente 5ml de poliacrilamida; 5ml de TBE 5x; 15ml de água.
Os catalisadores da reação de polimerização do gel, TEMED e persulfato de
potássio foram adicionados à mistura do gel imediatamente antes de verter a mistura
em um cassete previamente montado, composto de duas placas de vidro separadas
por espaçadores de teflon e presas com grampos. Logo após a mistura de gel ter
sido vertida, um pente de teflon foi colocado na borda superior, formando poços no
gel, onde posteriormente foram aplicadas as amostras de DNA amplificado.
Aguardou-se a polimerização por no mínimo 30 minutos.
Após a polimerização do gel o pente foi retirado e os poços foram lavados
com água. O gel polimerizado foi montado em cuba de eletroforese vertical contendo
tampão TBE, para cubas, em ambos os pólos (porção superior e inferior). Esta cuba
foi conectada a uma fonte de voltagem, Amershan Pharmacia Biotech (EPS 1001),
ajustada à voltagem ou corrente constante necessária para uma boa separação dos
fragmentos amplificados e as amostras amplificadas foram aplicadas nos poços.
4.3.4 Coloração com Nitrato de Prata e Secagem do Gel
Reagentes e soluções:
Solução de nitrato de prata: 10 g nitrato de prata; 100 ml de H2O.
Dissolver a prata em uma parte da água e depois completar com o
restante, manter a solução ao abrigo da luz (volume final 100 ml).
Solução fixadora: 160 ml etanol (PA) e 7 ml de ácido acético glacial (PA);
833 ml de H2O (volume final 1l).
Solução reveladora: 22,5 g de NaOH; 1l de H2O. Dissolver em um agitador
o hidróxido de sódio em uma parte da água e depois completar com o
restante (volume final 1l). Na hora da coloração adicionar 1 ml de
formaldeído para cada 100 ml da solução.
32
Procedimento:
A coloração do gel foi feita de acordo com protocolo adaptado de Sanguinetti
et al. (1994):
Fixação: Após a retirada das placas de vidro e dos espaçadores o gel foi
colocado em um recipiente de vidro contendo 100 ml de solução fixadora.
Impregnação com Nitrato de prata: Adicionou-se 2,0 ml de solução de
nitrato de prata, e agitou-se por 5 minutos. A solução foi então descartada
e o gel lavado em água por cerca de 10 segundos, agitando levemente e,
ao final, descartando a água.
Revelação: A solução reveladora foi despejada cuidadosamente no
recipiente contendo o gel, que foi submetido à agitação por alguns
minutos até que as bandas aparecessem nitidamente. Esta solução foi
pré-aquecida em estufa, para facilitar a reação de coloração, que no frio
fica mais lenta.
Bloqueio da reação: Após ter sido revelado, a solução reveladora foi
descartada e a reação bloqueada com a lavagem direta do gel em 100 ml
de solução fixadora. No caso de géis maiores (22 cm) adicionou-se o
dobro das soluções.
Secagem do gel: Após a leitura, todos os géis passaram por um simples
processo de secagem para que pudessem ser armazenados para
análises e confirmações posteriores. Duas folhas de papel celofane foram
molhadas; uma placa de vidro, com a área maior que a do gel, foi coberta
com uma das folhas; o gel foi colocado sobre a placa com o celofane sem
deixar bolhas; o gel foi então bem molhado e coberto com a outra folha de
celofane, também com cuidado de não deixar bolhas; este gel foi deixado
secando a temperatura ambiente por dois ou três dias até a secagem
completa, sendo então devidamente identificado e arquivado.
33
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
4.4.1 Freqüências Alélicas e Equilíbrio de Hardy-Weinberg
As freqüências alélicas foram obtidas por contagem gênica direta a partir da
leitura dos géis de poliacrilamida, sendo então utilizadas para a estatística
descritiva, utilizando o programa GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET, 1995). A
freqüência alélica é dada por:
Xi =
2nii + nij
2n
Em que:
Xi= freqüência alélica;
nii e nij = correspondem ao número de homozigotos e heterozigotos para o
alelo i;
n = número de indivíduos observados;
A aderência das freqüências genotípicas observadas às proporções teóricas
de Hardy-Weinberg foi verificada com o emprego do programa GENEPOP
(RAYMOND e ROUSSET, 1995b) versão 2.0 para Windows. Foram realizados
três testes baseados na hipótese nula de união aleatória dos gametas: teste de
probabilidade, teste para detecção da deficiência e para detecção do excesso de
heterozigotos.
No teste de probabilidade, o valor de P corresponde à soma de
probabilidades de todas as tabelas com probabilidade menor ou igual ao observado.
O segundo e o terceiro são testes mais sensíveis do que o de probabilidade e
utilizam uma hipótese alternativa (H1) de excesso ou de deficiência de
heterozigotos, respectivamente.
O nível de significância foi estabelecido em 0,05, mas foram incluídos
também os resultados da correção de Bonferroni, que consiste em dividir o α
pretendido
pelo
número
de
testes
independentes
realizados
(WEIR
e
34
COCKERHAM, 1996). Considerando todos os loci analisados, o novo α (αBonf) foi
estabelecido em 0,05/31-1= 0,001.
4.4.2 Associação Par-a-Par entre Loci
A análise de associações par-a-par entre loci foi realizada utilizando-se o
programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). A hipótese nula é de
que a distribuição genotípica em um locus é independente da distribuição em outro
locus. Esta análise foi aplicada para verificar desvios do esperado pela regra de
multiplicação entre pares de loci localizados em diferentes cromossomos. A palavra
“ligação” neste caso não está relacionada com associação física entre alelos de loci
de um mesmo cromossomo.
Com a realização de múltiplos testes, no caso um para cada par de loci sendo
testado, sob a mesma H0 utilizando os mesmos loci, aumentam as chances de se
cometer um erro do tipo I (Ha, 2008) e, com isso, um aumento no α real em
aproximadamente o número de testes independentes realizados.
O nível de significância foi estabelecido em 0,05, mas foram incluídos também
os resultados da correção de Bonferroni, que consiste em dividir o α pretendido pelo
número de testes independentes realizados (WEIR e COCKERHAM, 1996). Para as
quatros amostras analisadas, o novo α (αBonf) foi estabelecido em 0,05/465-1=
0,00018.
4.4.3 Diferenciação genética das populações
Os testes exatos para diferenciação populacional foram realizados com o
uso do programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). Este utiliza
tabelas de contingência RxC geradas automaticamente para cada locus, em que R
é o número de populações e C é o número de alelos no locus.
Este procedimento compara cada locus em pares de populações, para
determinar se existem diferenças nas freqüências alélicas observadas, onde a
hipótese nula testada é a de que a distribuição alélica é idêntica entre as
populações (RAYMOND & ROUSSET, 1995a) .
35
A diferenciação genotípica para os loci autossômicos foi realizada pelo teste
exato G (GOUDET, 1996) que tem o mesmo princípio e testa a hipótese nula onde a
distribuição genotípica é idêntica entre as populações.
4.4.4 Diversidade gênica
A análise de diversidade genética foi estimada usando o parâmetro HS (NEI,
1987) usando o programa FSTAT 2.8 (GOUDET, 1996).
Em que:
HS = a heterozigose média dentro das populações, ou diversidade gênica;
A diversidade gênica média ( H S ) com o respectivo erro padrão foi calculada
para cada amostra utilizando o programa DISPAN (OTA, 1993) , conforme a
equação 8.6 apresentada em Nei (1987).
4.4.5 Mistura Étnica
As estimativas de mistura étnica foram obtidas por meio do método de
identidade gênica (CHARKRABORTY, 1985) com o auxílio do programa ADMIX2. O
ajuste a este modelo é avaliado pelo coeficiente de correlação múltipla (R 2) entre as
freqüências alélicas nas populações híbridas e aquelas das populações ancestrais
(CHARKRABORTY, 1986).
Para o cálculo das estimativas de mistura étnica foram utilizadas as
freqüências
das
populações
parentais
descritas
na
literatura
(http://falcon.roswellpark.org:9090/) e estas se encontram disponíveis na tabela 4.
A utilização simultânea de diversos loci genéticos, no cálculo de mistura
étnica, teve por objetivo minimizar os efeitos dos fatores limitantes, inerentes ao
método de investigação, tais como desvios de amostragem, freqüências ancestrais
representadas por médias ponderadas, forças microevolutivas atuando junto com a
mistura (BORTOLINI, 1991)
36
5 RESULTADOS
5.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS
Todos os alelos identificados para estes loci foram encontrados na amostra
do presente estudo (Tabela 4). Todos os marcadores utilizados são caracterizados
como informativos de ancestralidade por apresentarem um alto diferencial de
freqüência.
Os
loci
Ya5AC1982,
Ya5ACA1400,
Ya5ACA1441,
Ya5ACA1555,
Ya5ACA1184, Ya5_541F e Ya5NBC354 foram os que apresentaram maior
freqüência alélica para ausência da inserção Alu em todas as amostras analisadas.
Já o locus Ya5ACA733 apresentou menor freqüência para ausência da inserção nos
controles euro-brasileiros (Figura 5). Os loci Ya5_541F, Ya5NBC354 estão com
maior freqüência alélica nas amostras de controles afro-brasileiros (Figura 6). Os loci
Ya5ACA647 e Ya5ACA1400 foram mais frequentes nos controles euro-brasileiros e
os loci Ya5ACA1555 e Yb8NBC157 foram mais frequentes nos casos afro-brasileiros
(Figura 4), enquanto que o locus Yb8NBC157 teve maior frequência alélica em
controles afro-brasileiros (Figura 6).
37
Tabela 4 - Freqüências alélicas dos 30 polimorfismos de inserção Alu analisados em casos e
controles e nas populações parentais.
Casos
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
Inserções
Alu
Controles
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
Afroamericanos1
Europeus1
Asiáticos1
138
16
18
18
Ya5ACA647
n
364
175
164
*
-
0, 576
0, 595
0, 678
0, 622*
0, 406
0, 833
1, 000
+
0, 424
0, 405
0, 322
0, 378
0, 594
0, 167
0, 000
n
364
175
164
138
20
20
19
-
0, 454
0, 460
0, 397
0, 492
0, 775
0, 700
0, 158
+
0, 546
0, 540
0, 603
0, 508
0, 225
0, 300
0, 842
Ya5ACA733
Ya5NBC45
**
n
364
175
164
138
20
20
20
-
0, 519
0, 555
0, 531
0, 489
0, 500
0, 950
1, 000
+
0, 481
0, 445
0, 469
0, 511
0, 500
0, 050
0, 000
Ya5AC1982
n
364
175
164
138
20
20
20
-
0, 615
0, 624
0, 644*
0, 643*
0, 225
0, 300
0, 725
+
0, 385
0, 376
0, 356
0, 357
0, 775
0, 700
0, 275
n
364
175
164
138
20
20
20
-
0, 546
0, 590
0, 586
0, 590
0, 225
0, 700
0, 675
+
0, 454
0, 410
0, 414
0, 410
0, 775
0, 300
0, 325
364
175
164
Ya5ACA917**
Ya5ACA1400
n
138
19
14
12
-
0, 653
*
0, 636
*
0, 663
*
0, 545
0, 474
0, 893
0, 875
+
0, 347
0, 364
0, 337
0, 455
0, 526
0, 107
0, 125
n
364
175
164
138
20
20
20
-
0, 533
0, 536
0, 509
0, 542
0, 300
0, 850
0, 900
+
0, 467
0, 464
0, 491
0, 458
0, 700
0, 150
0, 100
Ya5AC2282
Ya5ACA1441
**
n
364
175
164
138
16
20
18
-
0, 625*
0, 605
0, 595
0, 636*
0, 469
0, 850
0, 889
+
0, 375
0, 395
0, 405
0, 364
0, 531
0, 150
0, 111
Ya5NBC132**
n
364
175
164
138
08
13
09
-
0, 517
0, 563
0, 479
0, 496
0, 500
1, 000
1, 000
+
0, 483
0, 437
0, 521
0, 504
0, 500
0, 000
0, 000
n
364
175
164
138
17
13
13
-
0, 576
0, 599
0, 552
0, 534
0, 441
0, 000
0, 000
+
0, 424
0, 401
0, 448
0, 466
0, 559
1, 000
1, 000
364
175
164
Ya5AC2670**
Ya5ACA1555
n
138
15
16
17
*
0, 648
*
0, 630
0, 467
0, 562
1, 000
0, 352
0, 370
0, 533
0, 438
0, 000
-
0, 629
0, 683
+
0, 371
0, 317
38
Casos
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
Inserções
Alu
Controles
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
Afroamericanos1
Europeus1
Asiáticos1
Yb8NBC157
n
364
175
164
*
138
20
18
12
*
-
0, 596
0, 665
0, 586
0, 664
0, 950
0, 417
0, 708
+
0, 404
0, 335
0, 413
0, 336
0, 050
0, 583
0, 292
n
364
175
164
138
17
20
18
-
0, 564
0, 509
0, 482
0, 470
1, 000
0, 950
0, 361
+
0, 436
0, 491
0, 518
0, 530
0, 000
0, 050
0, 639
364
175
Ya5NBC150
Ya5ACA1002
**
n
164
138
20
21
20
-
0, 609
*
0, 623
*
0, 561
0, 496
0, 000
0, 452
0, 575
+
0, 391
0, 377
0, 439
0, 504
1, 000
0, 548
0, 425
Ya5NBC327
**
n
364
175
164
138
20
19
20
-
0, 544
0, 553
0, 537
0, 615*
0, 325
1, 000
0, 800
+
0, 456
0, 447
0, 463
0, 385
0, 675
0, 000
0, 200
Ya5ACA1242**
n
364
175
164
138
16
11
15
-
0, 548*
0, 586*
0, 562*
0, 578*
0, 668
0, 000
0, 167
+
0, 452
0, 414
0, 438
0, 422
0, 332
1, 000
0, 833
364
175
164
138
Ya5_531**
n
*
07
20
15
*
-
0, 572
0, 633
0, 543
0, 574
0, 286
1, 000
1, 000
+
0, 428
0, 367
0, 457
0, 426
0, 714
0, 000
0, 000
n
364
175
164
138
14
14
14
-
0, 513
0, 491
0, 469
0, 515
0, 179
0, 571
0, 679
+
0, 487
0, 509
0, 531
0, 485
0, 821
0, 429
0, 321
364
175
164
138
Yb8NBC93
**
Ya5ACA928
n
20
20
20
-
0, 551
*
0, 610
*
0, 515
*
0, 613
*
0, 500
0, 425
0, 025
+
0, 449
0, 390
0, 485
0, 387
0, 500
0, 575
0, 975
Ya5ACA1100
**
n
364
175
164
138
20
18
20
-
0, 587
0, 567
0, 565
0, 564
0, 450
1, 000
0, 900
+
0, 413
0, 433
0, 435
0, 436
0, 550
0, 000
0, 100
H7_F_148
n
364
175
164
138
20
20
20
-
0, 607*
0, 601*
0, 630*
0, 556
0, 425
0, 375
0, 000
+
0, 393
0, 399
0, 370
0, 444
0, 575
0, 625
1, 000
364
175
164
138
19
16
20
Ya5ACA1184**
n
*
0, 619
*
-
0, 581
0, 603
0, 632*
0, 158
0, 688
0, 950
+
0, 419
0, 397
0, 381
0, 368
0, 842
0, 312
0, 050
364
175
164
138
20
20
20
0, 496
0, 025
0, 700
0, 275
Ya5ACA866
n
-
**
0, 536
*
0, 539
*
0, 575
*
39
Casos
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
0, 464
0, 461
Inserções
Alu
+
Controles
EuroAfrobrasileiros
brasileiros
0, 425
0, 504
Afroamericanos1
Europeus1
Asiáticos1
0, 975
0, 300
0, 725
Ya5NBC241
n
364
175
164
138
17
18
19
-
0, 559*
0, 536*
0, 506*
0, 541*
0, 441
0, 194
0, 605
+
0, 441
0, 464
0, 494
0, 459
0, 559
0, 806
0, 395
PV92
n
364
175
164
138
43
32
49
-
0, 524*
0, 552*
0, 566*
0, 598*
0, 209
0, 141
0, 860
+
0, 476
0, 448
0, 434
0, 402
0, 791
0, 859
0, 140
Ya5_541F**
n
364
175
164
138
17
20
19
-
0, 607*
0, 593
0, 641*
0, 709*
0, 059
0, 550
0, 105
+
0, 393
0, 407
0, 359
0, 291
0, 941
0, 450
0, 895
364
175
164
138
Yb8NBC67
n
18
15
19
0, 591
0, 659
*
0, 583
0, 933
0, 632
0, 409
0, 341
0, 417
0, 067
0, 368
175
164
138
19
20
19
0, 574
0, 560
0, 578
0, 550
0, 711
0, 300
0, 132
0, 426
0, 440
0, 422
0, 450
0, 289
0, 700
0, 868
-
0, 600
*
0, 584
+
0, 400
0, 416
n
364
+
Ya5ACA862
**
Ya5NBC354
n
364
175
164
138
20
19
18
-
0, 636*
0, 618*
0, 601*
0, 663*
0, 700
0, 632
0, 278
+
0, 364
0, 382
0, 399
0, 337
0, 300
0, 368
0, 722
Ya5ACA1611**
n
364
175
164
138
19
18
19
-
0, 473
0, 530
0, 585
0, 572
0, 211
0, 611
0, 737
+
0, 527
0, 470
0, 415
0, 428
0, 789
0, 389
0, 263
Nota: *alelos mais freqüentes.
**
Loci que diferenciam exclusivamente afro-americanos de europeus e asiáticos.
1
(BENNETT et al. 2004; CARTER et al. 2004; MAMEDOV et al. 2005; OTIENO et al. 2004; RAY et al.
2005; ROY et al. 2000; WANG et al. 2006; WATKINS et al. 2001).
Nas Figuras a seguir, podemos observar a comparação gráfica das amostras
analisadas com as frequências das populações parentais, afro-americanos,
europeus e asiáticos. Pode-se observar à alta frequência européia e asiática para a
maioria dos loci analisados. Dos 30 loci analisados, apenas sete (Ya5ACA733,
Yb8NBC157, Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354)
apresentam uma frequência maior que 50% para o componente afro-americano.
Porém, do total de loci analisados, 16 diferenciam exclusivamente os afroamericanos dos europeus e asiáticos.
Ya
5A
Y a CA6 4
5A
7
C
Y a A7 33
5N
BC
Ya
45
5A
Y a C198
5A
2
C
Ya
5A A9 17
CA
14
Ya
00
5A
C2
Ya
2
5A
82
C
Y a A1 44
5N
1
BC
Ya
1
3
5
2
Y a A C26
5A
7
0
C
Y b A1 55
8N
5
BC
Ya
1
5
5N
7
B
Ya
5A C1 50
C
Y a A1 00
5N
2
B
Ya
5A C3 27
CA
12
42
Ya
5
Y b _5 31
8N
B
Ya
5A C93
C
Ya
5A A9 28
CA
11
H7
00
Y a _F_1
5A
48
C
Y a A1 18
5A
4
CA
Ya
8
6
5N
6
BC
24
1
P
Y a V9 2
5_
Y b 5 41F
8N
B
Ya
5A C67
CA
Ya
5N 8 62
B
Ya
5A C3 54
CA
16
11
40
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
Casos Euro-brasileiros
Afro-americanos
Europeus
Asiásticos
0,3
0,2
0,1
0
Figura 3 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.
Ya
5A
CA
Ya
5A 6 47
C
Y a A7 33
5N
BC
Ya
45
5A
C
1
Ya
5A 98 2
C
Ya
5A A9 17
CA
14
Ya
00
5A
C2
Ya
2
5A
82
C
Y a A1 44
5N
BC 1
Ya
13
5
2
Y a A C26
5A
7
0
C
Y b A1 55
8N
5
BC
Ya
1
5
5N
7
B
Ya
5A C1 50
C
Y a A1 00
5N
2
B
Ya
5A C3 27
CA
12
42
Ya
5_
5
Yb
8N 31
B
Ya
5A C93
C
Ya
5A A9 28
CA
11
00
H7
_
F
Ya
_
14
5A
CA 8
1
Ya
5A 184
CA
Ya
5N 8 66
BC
24
1
PV
92
Ya
5_
Y b 5 41F
8N
B
Ya
5A C67
C
A
Ya
5N 8 62
B
Ya
5A C3 54
CA
16
11
41
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Casos Afro-brasileiros
Afro-americanos
Europeus
Asiáticos
0,2
0,1
0
Figura 4 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.
Ya
5A
Ya CA6
5A
47
C
Ya A73
5
3
Ya NBC
45
5A
Ya C19
5
8
Ya ACA 2
91
5A
7
C
Ya A14
5A
00
C
Ya
5A 228
2
Ya CA14
5N
41
Ya BC1
32
5A
C
Ya
5A 267
0
C
Yb A15
8N
5
Ya BC1 5
5
5
Ya NBC 7
15
5A
0
C
Ya A10
5N
02
Ya BC
3
5A
CA 27
1
Ya 242
Yb 5_53
8
1
Ya NBC
5A
93
C
Ya
5A A92
CA 8
11
H
0
Ya 7_F_ 0
5A
1
C 48
Ya A11
5A
84
Ya CA8
5N
6
BC 6
24
1
Ya PV92
5
Yb _541
8N
F
Ya BC
5A
67
Ya CA8
5
6
Ya NBC 2
3
5A
CA 54
16
11
42
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Controles Euro-brasileiros
Afro-americanos
Europeus
Asiáticos
0,2
0,1
0
Figura 5 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das
populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.
Ya
5A
Ya CA6
5A
47
Ya CA73
5N
3
Ya BC4
5A
5
Ya C19
5A
8
2
C
Ya
5A A91
7
C
Ya A14
5A
0
0
C
Ya
5A 228
2
C
Ya A14
5N
41
Ya BC1
32
5A
Ya
C
5A 267
C
Yb A15 0
8N
5
Ya BC1 5
5
5
Ya NBC 7
15
5A
0
Ya CA10
5N
0
Ya BC 2
32
5A
CA 7
1
Ya 242
5
_
Yb
8 531
Ya NBC
5
9
Ya ACA 3
92
5A
CA 8
H7 110
Ya _F_ 0
14
5A
8
Ya CA11
5A
8
Ya CA8 4
5N
6
BC 6
24
1
Ya PV92
5
Yb _541
8N
F
Ya BC
5A
67
Ya CA8
5
6
Ya NBC 2
35
5A
CA 4
16
11
43
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
Controles Afro-brasileiros
0,4
Afro-americanos
0,3
Europeus
Asiáticos
0,2
0,1
0
Figura 6 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das
populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos.
44
5.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG
As estimativas de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)
encontram-se na Tabela 5. Todos os desvios do EHW observados se encontram em
negrito nesta tabela. Foram observados 21, 11, 13 e 8 desvios do EHW nas
amostras de casos euro-brasileiros, casos afro-brasileiros, controles euro-brasileiros
e controles afro-brasileiros, respectivamente (Tabela 5). Testes mais sensíveis de
déficit e excesso de heterozigotos foram aplicados com o objetivo de explicar os
desvios encontrados. Os loci H7_F_148 e Ya5_541F em casos euro-brasileiros,
embora estivessem em desequilíbrio, não apresentaram déficit nem excesso de
heterozigotos (Tabela 5).
Todas as amostras analisadas apresentaram déficit de heterozigotos nos
loci
Yb8NBC157,
Ya5ACA1242,
Yb8NBC93,
Ya5ACA928,
Ya5ACA1184
e
Ya5ACA866 (Tabela 6). Os loci Ya5ACA1400, Ya5ACA1441 e Ya5AC2670
apresentaram déficit de heterozigotos nas amostras casos euro-brasileiros, casos
afro-brasileiros e controles euro-brasileiros.
O locus Ya5NBC241 apresentou déficit de heterozigotos para os casos
euro-brasileiros
e
afro-brasileiros.
Já
os
loci
Ya5AC2282,
Ya5NBC132,
Ya5ACA1002, PV92 e Ya5ACA1611 apresentaram déficit de heterozigotos para a
amostra de casos euro-brasileiros. Para as amostras de casos euro-brasileiros e
controles
euro-brasileiros,
os
loci
Ya5ACA733,
Ya5NBC327,
Ya5_541F
e
Yb8NBC67 apresentaram valores significativos (Tabela 6). Os loci Ya5ACA862
apresentou valores significativos para o déficit de heterozigotos nas amostras casos
euro-brasileiros e controles afro-brasileiros, e o Ya5ACA1100, em controles afrobrasileiros.
Apesar de não ser observados desvios para o EHW, nos loci Ya5ACA647,
Ya5NBC150, Ya5_531F, Yb8NBC93, Ya5ACA1100, Ya5ACA1184, Ya5NBC241,
Ya5ACA862 apresentaram déficit de heterozigotos para os controles eurobrasileiros, assim como, Ya5ACA866 e Ya5_541F apresentaram déficit de
heterozigotos para os controles afro-brasileiros (Tabela 6). Isto ocorre porque estes
dois testes são mais sensíveis que o teste global do EHW, indicando a falta (ou o
excesso) de heterozigotos mesmo que estes não afetem o equilíbrio calculado
45
(ROUSSET & RAYMOND 1995). Quanto ao teste para verificar excesso de
heterozigotos, nenhum loci apresentou valores significativos.
Tabela 5 - Probabilidades obtidas com o teste exato para a verificação da aderência ao Equilíbrio de
Hardy-Weinberg nas amostras analisadas.
Teste P
Loci
Casos
Controles
EuroAfroEuroAfrobrasileiros
brasileiros
brasileiros
brasileiros
Ya5ACA647
0, 018
0, 001
0, 001
0, 009
Ya5ACA733
0, 000
0, 031
0, 000
0, 036
Ya5NBC45
0, 001
1, 000
0, 875
0, 606
Ya5AC1982
0, 004
1, 000
0, 863
0, 122
Ya5ACA917
0, 003
0, 029
0, 000
0, 099
Ya5ACA1400
0, 000
0, 000
0, 000
0, 001
Ya5AC2282
0, 000
0, 346
0, 007
0, 724
Ya5ACA1441
0, 000
0, 000
0, 000
0, 001
Ya5NBC132
0, 000
0, 012
0, 004
0, 022
Ya5AC2670
0, 000
0, 000
0, 000
0, 002
Ya5ACA1555
0, 014
0, 013
0, 089
0, 577
Yb8NBC157
0, 000
0, 000
0, 000
0, 000
Ya5NBC150
0, 040
0,164
0, 002
0, 299
Ya5ACA1002
0, 000
0, 074
0, 002
1, 000
Ya5NBC327
0, 000
0, 086
0, 000
0, 003
Ya5ACA1242
0, 000
0, 000
0, 000
0, 000
Ya5_531F
0, 051
0, 002
0, 001
0, 008
Yb8NBC93
0, 000
0, 000
0, 001
0, 000
Ya5ACA928
0, 000
0, 000
0, 000
0, 000
Ya5ACA1100
0, 003
0, 012
0, 196
0, 000
H7_F_148
0, 000
0, 000
0, 000
0, 000
Ya5ACA1184
0, 000
0, 000
0, 001
0, 000
Ya5ACA866
0, 000
0, 000
0, 000
0, 001
Ya5NBC241
0, 000
0, 000
0, 012
0, 001
PV92
0, 000
0, 007
0, 004
0, 007
Ya5_541F
0, 000
0, 001
0, 000
0, 001
Yb8NBC67
0, 000
0, 005
0, 000
0, 054
Ya5ACA862
0, 000
0, 029
0, 001
0, 000
Ya5NBC354
0, 001
0, 151
0, 032
0, 003
Ya5ACA1611
0, 000
0, 044
0, 008
0, 053
Obs., *Os valores em negrito são diferenças estatisticamente significativas αBonf = 0,001.
46
Tabela 6 - Probabilidades obtidas com o teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg para verificar o déficit
de heterozigotos.
Déficit de
Heterozigotos
Loci
Casos
Controles
EuroAfroEuroAfroBrasileiros
brasileiros
brasileiros
brasileiros
Ya5ACA647
0,009
0,001
0,000
0,005
Ya5ACA733
0,000
0,018
0,000
0,021
Ya5NBC45
0,001
0,623
0,433
0,331
Ya5AC1982
0,002
0,586
0,495
0,092
Ya5ACA917
0,002
0,017
0,000
0,057
Ya5ACA1400
0,000
0,000
0,000
0,001
Ya5AC2282
0,000
0,186
0,005
0,377
Ya5ACA1441
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5NBC132
0,000
0,006
0,001
0,015
Ya5AC2670
0,000
0,000
0,000
0,002
Ya5ACA1555
0,009
0,009
0,059
0,813
Yb8NBC157
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5NBC150
0,022
0,084
0,000
0,173
Ya5ACA1002
0,000
0,044
0,001
0,601
Ya5NBC327
0,000
0,044
0,000
0,002
Ya5ACA1242
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5_531F
0,029
0,001
0,000
0,005
Yb8NBC93
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5ACA928
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5ACA1100
0,002
0,007
0,000
0,000
H7_F_148
0,000
0,000
0,102
0,000
Ya5ACA1184
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5ACA866
0,000
0,000
0,000
0,000
Ya5NBC241
0,000
0,000
0,000
0,001
PV92
0,000
0,003
0,008
0,005
Ya5_541F
0,000
0,001
0,001
0,000
Yb8NBC67
0,000
0,003
0,000
0,039
Ya5ACA862
0,000
0,020
0,000
0,000
Ya5NBC354
0,001
0,100
0,001
0,001
Ya5ACA1611
0,000
0,024
0,019
0,028
Obs., Os valores em negrito são diferenças estatisticamente significativas αBonf = 0,001.
5.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR
Associações (desvios) significativas entre os loci foram analisadas no intuito
de investigar a existência de estrutura genética nas amostras analisadas, o que é
sugerido pela presença de associações (desvios) significativas entre loci não
ligados.
Para cada uma das quatro amostras foram realizadas 465 comparações
entre os 30 loci. As amostras analisadas apresentaram desequilíbrio de ligação entre
pares de loci não ligados quando se considerou α = 0,05. Destas 465 combinações,
47
277 foram significativas, 98 em casos euro-brasileiros (21,1%), 58 em casos afrobrasileiros (12,5%), 63 em controles euro-brasileiros (13,5%), 58 em controles afrobrasileiros (12,5%).
Ao considerar αBonf = 0,0018, apenas uma amostra apresentou associação
significativa. Sendo, 84 associações significativas, 35 em casos euro-brasileiros
(7,5%), 18 em casos afro-brasileiros (3,9%), 15 em controles euro-brasileiros (3,2%)
e 16 em controles afro-brasileiros (3,4%). A amostra de casos euro-descendentes
apresentou associações significativas, pois nesta amostra o número de pares que
apresentaram associações significativas são superiores a 5%, caso contrário, às
associações seriam atribuídas ao acaso.
Devido ao número elevado de associações par-a-par (465 para cada
amostra) só foram descritos aqui os resultados que foram significativos.
5.4 DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA ENTRE POPULAÇÕES
O teste de diferenciação gênica par-a-par entre os loci foi testado com o
objetivo de verificar se há diferença significativa entre as populações analisadas,
considerando o valor de p < 0,05.
Das 186 comparações par-a-par possíveis para os 30 loci analisados, 11
foram significativas e nove altamente significativas (Tabela 7). Todas as amostras
apresentaram valores significativos para algum loci. Em todos loci analisados, 19
não apresentaram diferenças (Tabela 7).
Entre as amostras controles euro-brasileiros x controles afro-brasileiros
(COEB X COAB), os loci Ya5ACA733 e Ya5ACA928 apresentaram valores
significativos e o locus Ya5ACA1400 apresentou valor altamente significativo.
Quando se comparou controles euro-brasileiros x casos euro-brasileiros (COEB X
CEB), os loci Ya5ACA647, Ya5NBC150 e Ya5ACA1611, apresentaram valores
significativos, 0, 003, 0, 015 e 0, 002, respectivamente. Para o par de populações
controles euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (COEB X CAB), cinco loci
(Ya5ACA647, Ya5NBC132, Ya5_531F, Ya5ACA928 e Ya5_541F) apresentaram
valores significativos.
Assim como, COEB X CAB, os controles afro-brasileiros x casos eurobrasileiros (COAB X CEB) também apresentaram cinco loci (Ya5ACA1400,
48
Ya5NBC150, Ya5ACA1002, PV92 e Ya5ACA1611) com valores significativos. Já
nos controles afro-brasileiros x casos afro-brasileiros (COAB X CAB) três loci
(Ya5ACA1400, Ya5ACA1002 e Ya5_541F) tiveram valores significativos. Entre as
amostras casos euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (CEB X CAB) apenas o
locus Yb8NBC157 apresentou valor significativo (Tabela 7). No entanto, ao
considerar αBonf = 0,0016, nenhum valor significativo foi observado.
Tabela 7- Diferenciação gênica baseada nos 30 loci entre as quatro populações, caso euro-brasileiros
(CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afro-brasileiros
(COAB).
Populações
COEB
x
COAB
0, 152
Ya5ACA647
Ya5ACA733
0, 015
Ya5NBC45
0, 328
Ya5AC1982
1, 000
Ya5ACA917
0, 932
Ya5ACA1400
0, 003
Ya5AC2282
0, 466
Ya5ACA1441
0, 312
Ya5NBC132
0, 672
Ya5AC2670
0, 682
Ya5ACA1555
0, 666
Yb8NBC157
0, 060
Ya5NBC150
0, 809
Ya5ACA1002
0, 121
Ya5NBC327
0, 053
Ya5ACA1242
0, 742
Ya5_531F
0, 454
Yb8NBC93
0, 278
Ya5ACA928
0, 018
Ya5ACA1100
1, 000
H7_F_148
0, 074
Ya5ACA1184
0, 802
Ya5ACA866
0, 074
Ya5NBC241
0, 415
PV92
0, 447
Ya5_541F
0, 087
Yb8NBC67
0, 097
Ya5ACA862
0, 553
Yb8NBC419
0, 533
Ya5NBC354
0, 151
Ya5ACA1611
0, 804
Obs.: αBonf = 0,0016
Loci
COEB
x
CEB
0, 003
0, 097
0, 729
0, 347
0, 259
0, 789
0, 505
0, 361
0, 249
0, 509
0, 572
0, 788
0, 015
0, 143
0, 831
0, 668
0, 407
0, 191
0, 302
0, 541
0, 496
0, 270
0, 237
0, 122
0, 245
0, 316
0, 781
0, 947
0, 409
0, 298
0, 002
COEB
x
CAB
0, 031
0, 125
0, 584
0, 620
0, 937
0, 510
0, 549
0, 819
0, 030
0, 239
0, 367
0, 050
0, 474
0, 122
0, 697
0, 574
0, 021
0, 609
0, 018
1, 000
0, 479
0, 683
0, 392
0, 473
0, 757
0, 006
0, 105
0, 683
0, 802
0, 680
0, 142
COAB
x
CEB
0, 214
0, 300
0, 426
0, 438
0, 234
0, 001
0, 826
0, 754
0, 557
0, 272
1, 000
0, 055
0, 010
0, 002
0, 050
0, 429
1, 000
1, 000
0, 103
0, 569
0, 167
0, 167
0, 283
0, 656
0, 044
0, 216
0, 872
0, 508
0, 109
0, 420
0, 006
COAB
x
CAB
0, 499
0, 453
0, 088
0, 669
1, 000
0, 033
0, 935
0, 435
0, 108
0, 124
0, 197
1, 000
0, 386
0, 001
0, 132
0, 868
0, 169
0, 568
1, 000
1, 000
0, 317
0, 502
0, 313
0, 935
0, 289
0, 006
0, 074
0, 867
0, 329
0, 277
0, 287
CEB
x
CAB
0, 599
0, 898
0, 272
0, 776
0, 182
0, 634
0, 946
0, 573
0, 164
0, 490
0, 106
0, 032
0, 084
0, 687
0, 803
0, 258
0, 067
0, 542
0, 080
0, 612
0, 884
0, 493
0, 947
0, 531
0, 421
0, 676
0, 625
0, 677
0, 574
0, 574
0, 956
Total
0, 021
0, 137
0, 439
0, 763
0, 367
0, 014
0, 868
0, 716
0, 147
0, 385
0, 413
0, 043
0, 021
0, 006
0, 190
0, 633
0, 124
0, 539
0, 017
0, 855
0, 323
0, 449
0, 275
0, 493
0, 226
0, 010
0, 271
0, 898
0, 427
0, 438
0, 004
49
A diferenciação genotípica foi realizada para cada par de populações,
considerando os loci analisados. Dos 30 loci analisados, 23 não apresentaram
valores significativos para as amostras analisadas (Tabela 8).
Das comparações par-a-par possíveis para os 30 loci analisados, 10 foram
significativas e quatro altamente significativas. Os resultados mostraram valores
significativos para o locus Ya5ACA647 quando os controles euro-brasileiros foram
comparados com casos euro-brasileiros e casos afro-brasileiros. Quando se
comparou COEB X COAB apenas o locus Ya5ACA1400 se mostrou significante.
Este mesmo locus foi significante para COAB X CEB. O locus Ya5NBC150
apresentou significância entre os pares de populações COEB X CEB e COAB X
CEB (Tabela 8).
Os
loci
Ya5ACA1002
e
Ya5_541F
apresentaram
valores
altamente
significativos e significativos, respectivamente, para os controles afro-brasileiros
comparados com casos euro-brasileiros e casos afro-brasileiros. O locus Ya5_531F
mostrou significância para a população COAB X CEB. O locus Ya5ACA1611
apresentou alta significância para a população COEB X CEB e significância para a
população COAB X CEB. Apenas a população casos euro-brasileiros comparada
com casos afro-brasileiros não apresentaram significância para nenhum dos loci
analisados (Tabela 8). No entanto, ao considerar αBonf = 0,0016, nenhum valor
significativo foi observado.
50
Tabela 8 - Diferenciação genotípica baseada nos 30 loci entre as quatro populações, caso eurobrasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afrobrasileiros (COAB).
Populações
Loci
Ya5ACA647
Ya5ACA733
Ya5NBC45
Ya5AC1982
Ya5ACA917
Ya5ACA1400
Ya5AC2282
Ya5ACA1441
Ya5NBC132
Ya5AC2670
Ya5ACA1555
Yb8NBC157
Ya5NBC150
Ya5ACA1002
Ya5NBC327
Ya5ACA1242
Ya5_531F
Yb8NBC93
Ya5ACA928
Ya5ACA1100
H7_F_148
Ya5ACA1184
Ya5ACA866
Ya5NBC241
PV92
Ya5_541F
Yb8NBC67
Ya5ACA862
Ya5NBC354
Ya5ACA1611
Obs.: αBonf = 0,0016
COEB
x
COAB
0, 223
0, 050
0, 329
1, 000
0, 939
0, 015
0, 482
0, 397
0, 711
0, 718
0, 675
0, 120
0, 824
0, 141
0, 101
0, 787
0, 520
0, 364
0, 055
1, 000
0, 134
0, 822
0, 107
0, 462
0, 510
0, 162
0, 139
0, 614
0, 186
0, 819
COEB
x
CEB
0, 007
0, 129
0, 752
0, 391
0, 298
0, 817
0, 549
0, 427
0, 329
0, 563
0, 597
0, 824
0, 027
0, 208
0, 863
0, 754
0, 451
0, 285
0, 410
0, 565
0, 575
0, 368
0, 318
0, 209
0, 273
0, 417
0, 813
0, 950
0, 330
0, 002
COEB
x
CAB
0, 049
0, 153
0, 443
0, 637
0, 946
0, 600
0, 558
0, 837
0, 060
0, 330
0, 410
0, 092
0, 520
0, 150
0, 085
0, 652
0, 039
0, 635
0, 154
1, 000
0, 535
0, 735
0, 450
0, 520
0, 777
0, 325
0, 894
0, 712
0, 708
0, 200
COAB
x
CEB
0, 239
0, 363
0, 586
0, 487
0, 265
0, 013
0, 835
0, 792
0, 611
0, 354
1, 000
0, 118
0, 014
0, 002
0, 728
0, 513
1, 000
1, 000
0, 046
0, 603
0, 239
0, 249
0, 346
0, 722
0, 068
0, 012
0, 156
0, 559
0, 461
0, 019
COAB
x
CAB
0, 536
0, 487
0, 119
0, 675
1, 000
0, 064
0, 936
0, 512
0, 153
0, 204
0, 205
1, 000
0, 382
0, 002
0, 165
0, 893
0, 212
0, 631
1, 000
1, 000
0, 400
0, 574
0, 401
0, 944
0, 325
0, 012
0, 091
0, 877
0, 306
0, 351
CEB
x
CAB
0, 605
0, 905
0, 296
0, 798
0, 222
0, 688
0, 951
0, 635
0, 246
0, 568
0, 132
0, 078
0, 127
0, 708
0, 800
0, 356
0, 087
0, 628
0, 142
0, 622
0, 908
0, 577
0, 955
0, 580
0, 463
0, 726
0, 668
0, 726
0, 595
0, 132
Total
0,036
0,223
0,463
0,793
0,445
0,068
0,878
0,805
0,269
0,538
0,444
0,133
0,033
0,016
0,295
0,785
0,180
0,693
0,121
0,895
0,526
0,586
0,431
0,628
0,274
0,062
0,352
0,923
0,508
0,005
5.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)
A diversidade gênica intrapopulacional variou de 0,415 nos casos afrobrasileiros no locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus
Ya5ACA866. A heterozigose média variou de 0,484 ± 0,004 em controles afrobrasileiros a 0,488 ± 0,002 em casos euro-brasileiros (Tabela 9). A heterozigose
média observada para as quatro amostras (casos euro-brasileiros 0,488 ± 0, 002,
casos afro-brasileiros 0,485 ± 0, 003, controles euro-brasileiros 0,486 ± 0,003 e
controles afro-brasileiros 0,484 ± 0,004) (Tabela 9).
51
Tabela 9 - Diversidade gênica (HS) dos loci nas populações analisadas.
Loci
Ya5ACA647
Ya5ACA733
Ya5NBC45
Ya5AC1982
Ya5ACA917
Ya5ACA1400
Ya5AC2282
Ya5ACA1441
Ya5NBC132
Ya5AC2670
Ya5ACA1555
Yb8NBC157
Ya5NBC150
Ya5ACA1002
Ya5NBC327
Ya5ACA1242
Ya5_531F
Yb8NBC93
Ya5ACA928
Ya5ACA1100
H7_F_148
Ya5ACA1184
Ya5ACA866
Ya5NBC241
PV92
Ya5_541F
Yb8NBC67
Ya5ACA862
Ya5NBC354
Ya5ACA1611
Heterozigose
média
Erro Padrão
Casos
EuroAfrobrasileiros brasileiros
0, 438
0, 472
0, 481
0, 502
0, 500
0, 502
0, 460
0, 461
0, 487
0, 486
0, 449
0, 498
0, 502
0, 498
0, 484
0, 465
0, 501
0, 502
0, 497
0, 500
0, 458
0, 468
0, 487
0, 449
0, 501
0, 500
0, 494
0, 502
0, 500
0, 476
0, 495
0, 491
0, 498
0, 491
0, 500
0, 502
0, 502
0, 477
0, 493
0, 494
0, 468
0, 496
0, 473
0, 468
0, 491
0, 503
0, 502
0, 499
0, 493
0, 483
0, 463
0, 415
0, 486
0, 452
0, 490
0, 498
0, 482
0, 449
0, 487
0, 492
Controles
EuroAfrobrasileiros brasileiros
0, 489
0, 484
0, 497
0, 499
0, 500
0, 495
0, 475
0, 471
0, 497
0, 485
0, 454
0, 465
0, 499
0, 499
0, 470
0, 480
0, 500
0, 494
0, 489
0, 483
0, 467
0, 435
0, 483
0, 448
0, 493
0, 501
0, 477
0, 471
0, 497
0, 496
0, 496
0, 487
0, 490
0, 466
0, 501
0, 502
0, 496
0, 478
0, 486
0, 493
0, 478
0, 482
0, 488
0, 481
0, 498
0, 499
0, 494
0, 499
0, 500
0, 497
0, 478
0, 484
0, 481
0, 488
0, 490
0, 494
0, 464
0, 474
0, 499
0, 500
0, 488
0, 485
0, 486
0, 484
0, 002
0,003
0, 003
0, 004
5.6 MISTURA ÉTNICA
A estimativa de mistura étnica foi testada para caracterizar as contribuições
das populações parentais nas amostras aqui estudadas. Inicialmente utilizamos o
programa ADMIX3, porém os resultados apresentados se mostraram inconsistentes
para o modelo trihíbrido. Portanto, as estimativas foram obtidas utilizando o
programa ADMIX2 e os valores de freqüências das populações ancestrais européias
e afro-americanas.
Todas as populações apresentaram valores consistentes para o modelo
dihíbrido (Tabela 10). Em todas as amostras a contribuição afro-americana foi maior,
52
porém essa contribuição foi similar em todas as amostras, não diferenciando afrobrasileiros de euro-brasileiros (Figura 7). A contribuição européia variou entre 38, 6 ±
7,1 nos casos euro-brasileiros e 39, 5 ± 7,7 nos controles euro-brasileiros.
Tabela 10 - Estimativa de mistura étnica nas amostras analisadas, segundo o método de identidade
gênica, considerando os 30 polimorfismos analisados. Valores em percentuais.
Freqüências dos Marcadores (%)
Casos
Controles
POP
EuroAfroEuroAfrobrasileiros
brasileiros
brasileiros
brasileiros
Afro-americanos
61,4 ± 7,3
60,5 ± 7,3
60,5 ± 7,7
60,8 ± 7,4
Europeus
38,6 ± 7,1
39,4 ± 7,3
39,5 ± 7,7
39,2 ± 7,4
* 2
R
71,8
70,2
67,7
69,9
*
valor de adaptação ao modelo da mistura
70
60
50
40
30
20
10
0
CEB
CAB
Africanos
COEB
COAB
Europeus
Figura 7 - Estimativas de mistura étnica, africana e européia, a partir dos 30 loci nas amostras CEB
(casos euro-brasileiros), CAB (casos afro-brasileiros) COEB (controles euro-brasileiros) COAB
(controles afro-brasileiros).
53
6 DISCUSSÃO
O estudo da ancestralidade do indivíduo utilizando marcadores genéticos
pode ser útil por fornecer informações, por exemplo, sobre mapeamento por
mistura, predição de riscos médicos, estudos de dispersão de populações, fluxo
gênico e história evolutiva (MACIEL, 2007).
O que torna a população brasileira tão peculiar é o fato de que durante a
formação da população os povos não se mantiveram isolados, interagiram e
miscigenaram entre si. Devido a sua história de formação, a população brasileira é
um modelo ideal para o estudo genético de populações, tendo como principal
objetivo estimar a composição do conjunto gênico da população atual. Os
marcadores moleculares são as ferramentas mais utilizadas, sendo que diversos
desses já foram utilizados em estudos na população brasileira, dentre eles:
inserções Alu, microssatélites e marcadores uniparentais.
6.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS
A análise de dados de frequências alélicas, ou seja, o estudo da variabilidade
genética auxilia no conhecimento da história evolutiva de uma dada população, tais
como endogamia, deriva genética, efeito do fundador e gargalos populacionais.
Todos os marcadores utilizados no presente estudo são caracterizados como
informativos de ancestralidade por apresentarem alto diferencial de freqüência entre
as populações.
Com a formação de uma população miscigenada, espera-se que a frequência
de qualquer locus, e em especial de loci AIMs, definidos como marcadores que
apresentam frequências extremas e distintivas entre populações diferenciadas por
fatores étnicos ou geográficos, atinja valor intermediário ao encontrado nas
populações parentais (GONTIJO, 2008).
Dentre os 30 marcadores analisados, 11 apresentaram diferencial de
freqüência alélica superior a 50% para ausência da inserção em populações
54
asiáticas/europeus, três em populações européias/africanas. Seis foram exclusivos
de afro-americanos, sete exclusivos de asiáticos e três de europeus (Tabela 4).
Pode-se observar à alta frequência européia e asiática para a maioria dos loci
analisados. Dos 30 loci analisados, apenas sete (Ya5ACA733, Yb8NBC157,
Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354) apresentam
frequência maior que 50% para o componente afro-americano.
Apesar de apresentar alta frequência européia e asiática para a maioria dos
loci, mas de 50% (16) dos loci, diferenciam exclusivamente os africanos dos
europeus e asiáticos.
Podemos salientar que as amostras foram selecionadas no Hospital Santa
Izabel onde recebe pacientes vindos de todas as partes da Bahia não sendo,
portanto, indivíduos necessariamente da cidade de Salvador na qual a contribuição
africana é maior.
6.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG
Foram observados 21, 11, 13 e 8 desvios do EHW nas amostras de casos
euro-brasileiros, casos afro-brasileiros, controles euro-brasileiros e controles afrobrasileiros, respectivamente (Tabela 5). Dos 53 desvios observados 51 podem ser
explicados por déficit de heterozigotos.
A falta de heterozigotos pode ser gerada por um sistema regular de
endocruzamento ou por estrutura populacional (ROUSSET & RAYMOND 1995).
Lins et al (2009), realizou um estudo para avaliar o conteúdo da informação
genética de um painel de 28 SNPs aplicados, para investigar a composição genética
de uma amostra da população brasileira. A população parental selecionada para
este trabalho compreendeu amostras de Africanos (Botsuana, Camarões, Gana, e
Senegal), Europeu-americanos (Baltimore e Chicago) e Ameríndios nativos
(Mexicanos Zapoteca). Quando se realizou o calculo para EHW, as populações
parentais estavam em equilíbrio, desvios de EHW foram observados apenas em
brasileiros, sugerindo miscigenação recente nesta população. Segundo Falush et al.
(2003) se a estratificação da população for real, desvios de Hardy-Weinberg em
alguns ou vários loci são detectados.
55
Apesar do seu potencial de vantagem em estudos populacionais as
sequências repetitivas do DNA podem aumentar a incidência de erros de
genotipagem. A principal causa desses erros pode ocorrer devido a amplificação
preferencial de alelos pequenos, onde os alelos maiores falham na amplificação
(OOSTERHOUT et al., 2004). Tais erros de genotipagem podem causar desvios no
EHW, em particular uma deficiência de heterozigotos (SHAW et al., 1999).
Quanto ao teste para verificar excesso de heterozigotos, nenhum loci
apresentou valores significativos.
6.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR
As associações par–a–par têm o intuito de investigar a presença de
estrutura populacional entre os loci que apresentaram valores significativos de
associações e que não estão ligados fisicamente. Esse desequilíbrio de ligação é
interessante porque pode revelar a origem das populações humanas, pois a
distribuição do desequilíbrio de ligação é determinado em parte, pela história
populacional (HARTL E CLARK, 2007).
O número de associações significativas quando se considerou α = 0,05, em
casos euro-brasileiros foi de 21,1% (98 em 465), nos casos afro-brasileiros o valor
foi de 12,5% (58 em 465). A amostra de controle euro-brasileiros obteve valor de
13,5% (63 em 465) e os controles afro-brasileiros foi de 12,5% (58 em 465).
Porém, ao considerar αBonf = 0,0018, apenas uma amostra apresentou
associação significativa. Sendo, 84 associações significativas, 35 em casos eurobrasileiros (7,5%), 18 em casos afro-brasileiros (3,9%), 15 em controles eurobrasileiros (3,2%) e 16 em controles afro-brasileiros (3,4%). A amostra de casos
euro- brasileiros apresentou associações significativas, pois nesta amostra o número
de pares que apresentaram associações significativas são superiores a 5%.
Portanto, o número de associações significativas entre loci não ligados está acima
dos 5% admitidos pela casualidade (LINS et al. 1998; BUDOWLE et al. 1999), com
isto estas associações podem ser indicativas de estrutura populacional (PARRA et
al. 2001).
A estruturação populacional pode ser causada por vários fatores como, fluxo
gênico contínuo, subestrutura populacional e acasalamento preferencial (PARRA et
56
al. 2001). Estudos de associação genética procuram diferenças entre frequências de
alelos em uma amostra populacional constituída de pessoas com a doença e outro
grupo sem a doença (BURTON, 2005).
A aterosclerose é uma doença multifatorial, com fatores de risco
estabelecidos genéticos e ambientais. Há várias provas convincentes de
envolvimentos das concentrações sanguíneas de lipídeos na aterosclerose. Por
exemplo, depois de ajuste para fatores socioeconômicos, Afro-americanos em geral,
têm níveis mais saudáveis de lipídeos, do que as pessoas de ascendência européia
(COHEN et al., 2005), visto que ambos têm níveis de lipídeos mais saudáveis do
que Sul - asiáticos (PAIS et al., 1996). Isto ressalta a importância de estudos casoscontroles das populações com diferentes origens étnicas.
O desequilíbrio de ligação entre alelos no mesmo cromossomo resulta de
vários processos evolucionários e desta forma descreve a história das populações
(DELVIN et al. 2001). Por isso populações miscigenadas facilitam o mapeamento de
genes complexos devido ao desequilíbrio de ligação que é criado quando duas ou
mais populações previamente separadas interagem (NEI e LI, 1973).
Segundo Pritchard e Przeworski (2001), a miscigenação recente de uma
população com diferentes frequências alélicas é um fator conhecido na geração do
desequilíbrio de ligação. No entanto, um ponto que emerge claramente é que, para
entender desequilíbrio de ligação em humanos, nós precisamos ter um melhor
entendimento da demografia humana. Isto inclui as histórias de mudanças no
tamanho populacional e outras formas de acasalamento ao acaso. Nós também
precisamos ter mais dados sobre as taxas de recombinação através do genoma.
Outro fato é que esta amostra não é completamente aleatória, são
indivíduos de uma faixa etária com um risco cardíaco. Não devemos tratá-la como
amostra populacional da Bahia sem considerar o risco da doença e principalmente
se existe uma propensão maior devido à etnia e a fatores de risco ambiental.
Portanto, em teoria, acredita-se que os níveis de desequilíbrio de ligação
entre alelos na população brasileira atual deva ser um produto resultante dos efeitos
de migração e miscigenação principalmente, mas não exclusivamente, das
populações européias, africanas e indígenas (MARRERO et al, 2005).
57
6.4 DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA ENTRE POPULAÇÕES
O teste de diferenciação gênica par-a-par entre os loci foi testado com o
objetivo de verificar se há diferença significativa entre as populações analisadas,
considerando o valor de p < 0,05. Das 186 comparações par-a-par possíveis para os
31 loci analisados, 11 foram significativas e nove altamente significativas (Tabela 8).
Todas as amostras apresentaram valores significativos para algum loci.
As amostras que apresentaram maior diferenciação foram controles eurobrasileiros x casos afro-brasileiros (COEB X CAB) e controles afro-brasileiros x
casos euro-brasileiros (COAB X CEB). Enquanto que a menor diferenciação foi entre
casos euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (CEB X CAB). As comparações entre
COEB x COAB, COEB X CEB e COAB X CAB, foram diferenciadas pelo mesmo
número de loci.
A diferenciação genotípica foi realizada para cada par de populações,
considerando os loci analisados (Tabela 9). Dessas comparações 10 foram
significativas e quatro altamente significativas. A amostra que apresentou maior
diferenciação foram controles afro-brasileiros x casos euro-brasileiros (COAB X
CEB). COEB X COAB apresentaram a menor diferenciação. As amostras COEB X
CAB e COAB X CAB, foram diferenciadas pelo mesmo número de loci. Na amostra
CEB X CAB não houve diferenciação genotípica.
No entanto, ao considerar αBonf = 0,0016, nenhum valor significativo foi
observado, nas diferenciações gênicas e genotípicas.
6.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)
A diversidade gênica esperada (HS) variou de 0,415 nos casos afrobrasileiros no locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus
Ya5ACA866. A heterozigose média variou de 0,484 ± 0,004 em controles afrobrasileiros a 0,488 ± 0,002 em casos euro-brasileiros (Tabela 10).
Uma maior diversidade genética era esperada ser encontrada entre os afrobrasileiros, pois populações africanas apresentam altos valores de diversidade. Os
afro-americanos
apresentam
altos
valores
de
heterozigose,
provavelmente
58
resultante do processo de miscigenação envolvendo estas populações (PARRA et
al. 2001). O tamanho efetivo populacional e a mobilidade das populações são
fatores importantes que influenciam o padrão de diversidade.
6.6 MISTURA ÉTNICA
Inicialmente utilizamos o modelo trihibrido, porém este se mostrou
inconsistente, pois as freqüências obtidas estavam no sentido decrescente de
contribuição, africanos – asiáticos – europeus, enquanto o esperado seria africanos
– europeus – asiáticos. A segunda maior contribuição do componente asiático foi
inesperada vista a história de formação da população baiana (TAVARES, 2001).
Portanto, as estimativas foram obtidas utilizando o programa ADMIX2 e os valores
de freqüências das populações ancestrais européias e afro-americanos.
O que mais dificulta os cálculos de mistura étnica é a falta de informações
das freqüências alélicas destes marcadores nas populações consideradas
ancestrais (RAY et al. 2005; WANG et al. 2006).
Todas as populações apresentaram valores consistentes para o modelo
dihíbrido (Tabela 10). Os resultados demonstram maior contribuição africana para
todas as amostras (Figura 7). Este resultado corrobora com a história de formação
da população baiana, pois a Bahia foi o principal foco de distribuição dos escravos
que vinham de várias regiões da África.
Em todas as amostras a contribuição africana foi maior, porém essa
contribuição foi similar em todas as amostras, não diferenciando afro-brasileiros de
euro-brasileiros (Figura 7).
A utilização simultânea de diversos loci genéticos no cálculo de mistura
étnica teve por objetivo minimizar os efeitos dos fatores limitantes inerentes ao
método de investigação, tais como: desvios de amostragem, freqüências ancestrais
representadas por médias ponderadas e forças micro evolutivas atuando junto com
a mistura (BORTOLINI, 1991) . Desta forma procurou-se utilizar o maior número de
loci em cada estimativa, desde que estes não tivessem um grande impacto nos
desvios das freqüências.
A diferença nas estimativas de mistura étnica nas amostras também pode
ser explicada pelos diferentes tipos de problemas, tais como a determinação da
59
população. Dessa maneira, se verifica que existe falta de informações sobre alguns
grupos étnicos formadores da população brasileira (africanos do Oeste, europeus
principalmente portugueses e ameríndios).
A escolha das populações parentais é uma etapa crucial nesse tipo de
analise. Essa escassez de dados na literatura restringiu as possibilidades de seleção
de populações parentais adequadas para a análise de composição genética, e,
portanto, alguma variação nos resultados provavelmente seria observada caso
essas parentais fossem diferentes. O ideal seria que as populações parentais
utilizadas fossem as mesmas para os tipos de marcadores.
A avaliação dos estimadores de erro constitui outro problema nas análises
de mistura (SANS, 2000). O valor de R2 obtido foi baixo sendo que o esperado é que
estes valores se aproximem de 100% o que indicaria uma boa adaptação ao modelo
de mistura. Os valores variaram de 67,7% nos controles euro-brasileiros a 71,8%
nos casos euro-brasileiros (Tabela 10). Estas amostras também apresentaram
estimativas de mistura com erros padrão elevados. Isso pode ter acontecido porque
os europeus tomados como parentais são populações alemãs e a amostra que
representa os africanos são indivíduos afro-americanos com elevado grau de
mistura. Outro fator a ser considerado, é que, para todos os parentais o número de
indivíduos analisados para a obtenção das freqüências não é superior a 20
indivíduos (http://falcon.roswellpark.org:9090/). É provável que estas discrepâncias
sejam causadas pelas freqüências das populações consideradas ancestrais e/ou
pelo método utilizado para estimar a mistura.
60
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na genotipagem dos marcadores de inserção Alu nas
amostras deste estudo mostraram que a informação sobre ancestralidade
apresentada, depende totalmente da informação e taxa de atribuição correta do
marcador e da utilização conjunta de vários marcadores em uma população
miscigenada.
Os marcadores analisados nesse estudo se mostraram eficientes para
atribuição de ancestralidade em uma amostra di-hibrída, composta por parentais
europeus e afro-americanos. Para atender ao modelo tri-hibrído, estes polimorfismos
estão sendo genotipados em uma amostra Afro-brasileira a fim de complementar e
aprimorar as estimativas de ancestralidade nestas amostras. Uma vez que, estes
polimorfismos de inserção Alu já foram genotipados para amostras ameríndias e
euro-brasileiras.
 Foram observados desvios do EHW, mesmo após a correção de
Bonferroni, sendo que a maioria deles pode ser explicado por déficit
de heterozigotos. Talvez estes desvios ocorreram pela presença de
estruturação populacional presente em populações miscigenadas.
 Em todas as amostras analisadas para Associações alélicas par-a-par
entre loci não-ligados, os resultados foram significativos. Porém ao
considerar o α para a correção de Bonferroni, apenas a amostra
casos euro-brasileiros apresentou valores significativos, com isto
estas associações podem ser indicativas de estrutura populacional.
 As estimativas de mistura foram obtidas utilizando o programa
ADMIX2 e as populações parentais, européia e afro-americana. Os
resultados apresentaram maior contribuição africana para todas as
amostras, o que era esperado devido à história de formação da
população baiana. Porém, a contribuição africana foi similar em todas
61
as amostras, não diferenciando euro-brasileiros de afro-brasileiros.
Efetivamente, isso demonstra que, na amostra analisada, o alto índice
de mistura faz com que características de aparência física como cor
da pele, olhos, cabelos, formatos dos lábios e do nariz sejam pobres
indicadores da origem geográfica dos ancestrais de um individuo.
 A contribuição do componente asiático (representando a contribuição
ameríndia) seria esperado, porém, houve inconsistência para o
modelo tri-hibrido. Isto pode ser explicado, - pela escolha das
populações parentais; - pela dificuldade de comparar dados genéticos
tanto entre a população brasileira com a européia, quanto com a
africana ou indígena, pois a população brasileira possui diferentes
frações de ancestralidade e assim, um padrão de desequilíbrio de
ligação diferente das populações base.
 Sugerimos que seja obtida a freqüência alélica deste conjunto de
polimorfismos em amostras de afro-brasileiros, euro-brasileiros e
ameríndios no intuito de minimizar os erros de efeito de amostragem
dos parentais na detecção do efeito de estruturação populacional real
e possa ser realizado o controle genômico.
62
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Endereço eletrônico:
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ESTATÍSTICA. Disponível na Internet via www.URL: www.ibge.gov.br/. Acesso em
agosto de 2005.
DbRIP- a database of retrotransposon insertion polymorphisms in humans. Disponível
em: http://falcon.roswellpark.org: 9090/. Acesso em: 18 jun. 2007.
69
ANEXO I
EXTRAÇÃO DE DNA
70
Extração de DNA
•
Transferir 500µl do creme leucocitário para um tubo de microcentrífuga, (1,5ml de
capacidade) e acrescentar 700µl de tampão lise para as células vermelhas (RCLB) e
centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
•
Desprezar o sobrenadante e repetir a lise de glóbulos vermelhos, adicionando
1ml de tampão RCLB, até obter um sobrenadante límpido;
•
Ressuspender o botão de glóbulos brancos em 1 ml de água ultra-pura e
centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
•
Desprezar o sobrenadante e adicionar 80µl de tampão da proteinase K 5x, 40µl
de proteinase K (10mg/ml), 20µl de SDS 20% e 240µl de água ultra - pura.
Homogeneizar em agitador tipo vortéx;
•
Incubar em bloco de aquecimento ou banho-maria a 60ºC por 40 min. Deixar
atingir a temperatura ambiente antes de prosseguir;
•
Adicionar 100µl de solução saturada de NACl (6M);
•
Centrifugar a 13.000 rpm por cinco minutos para precipitar toda a proteína
restante e o que não for DNA;
•
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5ml e
centrifugar novamente a 13.000 rpm por cinco minutos;
•
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5ml,
acrescentar 700µl a 1 ml de etanol absoluto, e inverter gentilmente, várias vezes,
para precipitar o DNA e centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
•
Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol 70% e centrifugar a 13.000
rpm por dois minutos;
•
Desprezar o sobrenadante e deixar secar à temperatura ambiente;
•
Ressuspender a amostra de DNA em 50µl de água ultra-pura e armazenar a
amostra de DNA a – 20ºC.
71
•
No método de extração com Chelex 100 seguimos as etapas descritas:
•
Transferir 5µl de cada amostra para o respectivo tubo;
•
Agitar no vortex por 10 segundos;
•
Deixar em repouso por 20 minutos à temperatura ambiente;
•
Retirar o máximo possível de sobrenadante com auxílio de pipeta automática e
ponteiras com filtro;
•
Colocar 100µl de Chelex em cada tubo;
•
Agitar no vortéx por 10 segundos;
•
Incubar no termobloco a 56ºC por 30 minutos;
•
Agitar no vortéx por 10 segundos;
•
Incubar no termobloco a 105ºC por 10 minutos;
•
Agitar no vortéx por 10 segundos;
•
Centrifugar a 14.000 rpm por 3 minutos;
•
Armazenar a amostra no freezer a –20ºC.
72
ANEXO II
REAGENTES E SOLUÇÕES DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
73
Reagentes e Soluções da Reação em Cadeia da polimerase
DNA polimerase (Taq): 1 U/µL de tampão de estocagem (BIOTOOLS – B &
M Labs, AS).
dNTP solução estoque: quatro soluções separadas de 100mM de cada
base (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), pH 8,3 (BIOTOOLS – B & M Labs, AS).
dNTP (20 mM): foi obtida diluindo-se com água a solução estoque (100mM)
de cada dNTP para uma solução única de concentração 20mM (20 µl de
água de MiliQ autoclavada mais 20 µL da solução estoque de cada
dNTP).
Iniciadores (Primers) específicos: os primers liofilizados A e B específicos
para cada locus foram diluídos em 50 µL de água autoclavada, ficando à
50 mM (Bio-Synthesis).
Iniciadores (Primers) – solução estoque: 50 mM foram diluídos com água
autoclavada para 2,55 mM, os primers A e B são estocados
separadamente.
Iniciadores (Primers) – solução trabalho: 10 µL do primer A, 10 µL do
primer B e 180 µL de água autoclavada.
MgCl2: Concentração de 50 mM (BIOTOOLS – B & M Labs, AS).
Tampão de estocagem da DNA polimerase: 10 mM de Tris/HCl (pH 8,0),
50 mM KCl, 1 mM EDTA, 01% Triton x-100, 50% de glicerol (BIOTOOLS
– B & M Labs, AS).
Tampão PCR livre de MgCl2: Tris/HCl 75 mM pH 9.0; KCl 50 mM;
(NH4)2SO4 20 mM. (BIOTOOLS – B & M Labs, AS).
Tampão PCR com MgCl2 (20 mM): 4 mL de Tris/HCl 0,5M; 2,5 mL KCl 2 M;
0,2 mL MgCl2 1 M (feito no laboratório).
74
ANEXO III
TERMO DE CONSENTIMENTO DOS PACIENTES PARA ESTUDO DE FATORES
GENETICOS NA DOENÇA CARDIOVASCULAR ISQUÊMICA
ATEROSCLERÓTICA
75
“Variabilidade em genes envolvidos no processo inflamatório arterial:
Implicações no risco e gravidade da aterogênese coronariana em amostra
da população de Salvador – Bahia”
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fundação Oswaldo Cruz – Bahia
Hospital Santa Isabel
TERMO DE CONSENTIMENTO DOS PACIENTES PARA ESTUDO DE
FATORES GENETICOS NA DOENÇA CARDIOVASCULAR ISQUÊMICA
ATEROSCLERÓTICA
A doença aterosclerótica coronariana apresenta uma série de fatores que
estão associados com a proteção ou aumento no risco de se ter esta doença.
Alguns destes fatores já são bem conhecidos, como é o caso dos níveis altos de
colesterol, pressão arterial alta, fumo, entre outros. No entanto, outros fatores
são menos conhecidos e precisam ser mais estudados. Mudanças no nosso
material genético, o DNA, podem ter algum efeito no risco para se ter esta
doença e poucos estudos analisaram estas mudanças em nossa população. A
presença destas variações no material genético em conjunto com outros fatores
externos (hábitos de vida, tabagismo, inatividade física, dieta rica em gorduras,
etc) podem aumentar o risco de desenvolver infarto e/ou angina (dor no peito). O
conhecimento de quais destas variantes genéticas são importantes para prever
o risco de se ter essa doença permitirá que os indivíduos que as possuem sejam
aconselhados, quando ainda jovens, a mudarem seus hábitos de vida não
saudáveis, diminuindo desta forma o risco de vir a desenvolverem esta doença
em idades mais avançadas. O nosso trabalho estudará algumas destas
mudanças genéticas, procurando verificar quais delas podem ser usadas para
prevenir o risco de desenvolvimento da doença cardíaca aterosclerótica em
nossa população.
Eu__________________________________________________________consi
nto, voluntariamente, em participar do presente estudo sobre fatores genéticos
envolvidos com a doença isquêmica cardíaca. Eu permito ser entrevistado por
um médico sobre fatores associados ao risco de doença cardíaca durante o
período de espera para realização do exame de cateterismo cardíaco. Concordo
em doar 15 (vinte) ml. de sangue a serem coletados através do cateter utilizado
para realização do exame.
Não serei submetido a nenhum desconforto ou risco adicional, além dos já
previstos pela realização do exame de cateterismo cardíaco. O sangue doado vai
ser utilizado para dosagens de lipídeos e de marcadores inflamatórios
associados ao risco para a doença aterosclerótica. Este sangue também será
utilizado para extração de material genético (DNA) e investigação de alterações
que podem estar associadas à doença cardíaca.
Permito também que os responsáveis por este estudo tenham acesso aos
resultados do meu exame de cateterismo cardíaco. Meus direitos de não
fornecer informações a pessoas não-médicas e de receber sigilo pelos
profissionais serão respeitados.
As informações genéticas a serem analisadas neste estudo não me
beneficiarão diretamente no diagnóstico de minha doença, mas no futuro, com o
acúmulo de informações vindas de estudos como este, outras pessoas serão
beneficiadas na prevenção e tratamento da doença cardíaca.
76
Entretanto, os resultados das dosagens bioquímicas e das variações no meu
DNA estarão a minha disposição, assim que estiverem prontos. Se for da minha
opção ser informado sobre os resultados destes exames deverei entrar em
contato com o médico pesquisador responsável pelo projeto (Dr. Domingos
Rios) no telefone que consta neste termo de consentimento e marcar uma data
para recebimento destes resultados no endereço que consta no rodapé deste
documento. Neste caso, as informações sobre os exames de DNA não serão
utilizadas para aconselhamento genético pois este estudo ainda é um estudo
preliminar em nossa população carecendo de mais informações para que estes
dados possam servir para aconselhamentos genético e clínico. Quando da
entrega dos resultados receberei esclarecimentos científicos a respeito dos
exames de DNA e no caso dos exames bioquímicos, caso haja alguma
alteração, serei encaminhado ao cardiologista que me acompanha e que
solicitou o exame de cateterismo cardíaco.
Permito aos pesquisadores armazenar os dados e material biológico/genético
coletado para futuros estudos envolvendo genes candidatos a associação com
doença cardíaca. O sigilo sobre estas informações será mantido e as amostras
com material biológico não serão identificados com o meu nome de tal forma
que meu anonimato será mantido. Se estes dados forem utilizados em outros
projetos no futuro, os pesquisadores responsáveis pelo projeto deverão entrar
em contato comigo para solicitarem nova autorização para incluir meu material
genético nestes estudos. Quando não for possível contactar-me, o fato será
justificado ao comitê de ética em pesquisa. Tenho a liberdade de recusar-me a
participar deste estudo ou retirar as informações e materiais fornecidos a
qualquer momento sem qualquer penalização.
Os resultados deste estudo serão publicados em revistas científicas,
respeitando o direito ao sigilo sobre as informações individuais fornecidas. Em
caso de descontinuidade do projeto, tal fato será comunicado ao Comitê de Ética
em Pesquisa do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz.
Salvador,
/
/
.
Assinatura do Paciente
Pesquisador responsável:
Dr. Domingos Lázaro Souza Rios
CRM BA 15073 Tel: 71 – 356-8822 ramal 213
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
Laboratório Avançado de Saúde Pública
R. Waldemar Falcão, 121
Brotas – Salvador –Bahia
CEP 40290-001