UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TICIANA FRANCO PEREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO ANDROLÓGICA, MÉTODOS DE COLETA E TECNOLOGIA
DO SÊMEN DE GATOS DOMÉSTICOS UTILIZANDO ÁGUA DE COCO EM
PÓ (ACP-117®)
FORTALEZA, CEARÁ
2008
TICIANA FRANCO PEREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO ANDROLÓGICA, MÉTODOS DE COLETA E TECNOLOGIA
DO SÊMEN DE GATOS DOMÉSTICOS UTILIZANDO ÁGUA DE COCO EM
PÓ (ACP-117®)
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do Grau de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Orientadora: Profa.
Machado da Silva
FORTALEZA, CEARÁ
2008
Dra.
Lúcia
Daniel
S586a Silva, Ticiana Franco Pereira
Avaliação andrológica, métodos de coleta e tecnologia
do sêmen de gatos domésticos utilizando água de coco em
pó (ACP-117®)/Ticiana Franco Pereira da Silva.
__Fortaleza, 2008.
164p. ; il.
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da
Silva.
Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Gato. 2. Sêmen. 3. Água de coco em pó.
I.Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de
Veterinária.
CDD: 636
TICIANA FRANCO PEREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO ANDROLÓGICA, MÉTODOS DE COLETA E TECNOLOGIA
DO SÊMEN DE GATOS DOMÉSTICOS UTILIZANDO ÁGUA DE COCO EM
PÓ (ACP-117®)
Tese submetida à Coordenação do Curso de PósGraduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do Grau de
Doutor em Ciências Veterinárias.
Aprovada em 17/04/2008
BANCA EXAMINADORA:
_____________________________________
_____________________________________
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva
Orientadora
Examinador
_____________________________________
_____________________________________
Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo
Profa. Dra. Maria Denise Lopes
Examinador
Examinadora
_____________________________________
_____________________________________
Prof. Dr. Marcos Renato Franzzosi Mattos
Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
Examinador
Examinadora Suplente
_____________________________________
Dra. Ana Kelen Felipe Lima
Examinadora Suplente
Aos animais ameaçados de extinção pela ganância do homem,
dedico.
AGRADECIMENTOS
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP) pela bolsa de estudos concedida e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro, sem os
quais os experimentos não teriam sido possíveis.
Ao Centro de Controle de Zoonoses do Município de Fortaleza pelas vacinas antirábicas concedidas aos animais experimentais.
À Universidade Estadual do Ceará, que ao longo de 11 anos se tornou a minha
segunda casa. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará pela oportunidade
de realização de mais este sonho.
Ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino da Universidade
Estadual do Ceará na pessoa do Prof. Dr. José Ferreira Nunes e da Dra.Cristiane
Clemente de Mello Salgueiro, pelo uso do analisador computadorizado de sêmen e de
suas instalações. À Dra. Cristiane, em nome da ACP® Biotecnologia, em especial, pela
disponibilização do ACP-117® e também por sua participação na banca.
À Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, não só pela orientação há
tantos anos, mas por sua paciência, compreensão, fé e disponibilidade; pelo seu
exemplo, carinho, dedicação e incentivo; por ter aberto os meus olhos quando
necessário; pelo seu ombro amigo, e por tudo mais que é não é possível expressar em
palavras!
Ao Dr. Ronaldo Gonçalves Morato, meu co-orientador, por sua atenção em
vários momentos de desespero mesmo à distância, pelo apoio, incentivo e exemplo.
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado participar desta
defesa, pelas sugestões, críticas e questionamentos. À Profa. Dra. Maria Denise Lopes,
por sua disponibilidade em ajudar sempre que necessário. Ao Prof. Dr. Airton Alencar
de Araújo, pelo apoio e incentivo, mas também por sua crítica sempre aguçada e
precisa. Ao Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva, meu amigo e companheiro na
“odisséia ejaculatória”, não só pela sua amizade que só se fortalece a cada dia, mas pelo
exemplo na pesquisa e por todas as suas considerações na Tese. À Dra. Ana Kelen
Felipe Lima, pela sua participação na banca, mas também por todas as vivências
divididas no doutorado (cirurgias, noites de cultivo de folículos, experimentos que não
deram certo, etc), e pela ajuda valiosa prestada com os “números” na fase final da Tese.
Ao Prof. Dr. Marcos Renato Franzzosi Mattos, meu amigo, ex-“chefe” e
incentivador, por ter aguçado a minha vontade de trabalhar com felinos e ter
possibilitado a realização deste sonho, meu eterno e terno agradecimento.
Aos Professores, funcionários e colegas do PPGCV, em especial às
secretárias Adriana Maria Sales Albuquerque e Ana Cristina Sabóia do Nascimento pela
paciência com minhas múltiplas interrupções e perguntas na coordenação; e aos colegas
de doutorado Marcelo José da Ascensão Feitosa Vieira pela ajuda no analisador de
sêmen computadorizado e Michelline Maciel, representando todos os outros, pelas
conversas rápidas no corredor e pelas angústias de teses compartilhadas!
Ao funcionário Selmar Alves da Silva, não só pelo seu trabalho diário na
limpeza do gatil, mas por todas as atividades extras que realizou sempre com muita
alegria de viver, fosse carregando a ração ou subindo no telhado para caçar os gatos que
fugiam!
Ao meu funcionário José Aparecido Dias de Oliveira, por toda ajuda com as
tarefas domésticas, aliviando a minha carga, mas principalmente por ter tratado os meus
animais com todo carinho, fossem os de casa ou os da UECE que insisti tantas vezes em
levar para o “Spa de engorda Casa da Tia Tici” (como minha casa foi apelidada no
laboratório!) para que arrumassem um lar ou para um tratamento personalizado. Pela
alegria contagiante e pelo pensamento sempre positivo quando mais estava angustiada.
A todos os colegas do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC) ao
logo desses 4 anos fossem estagiários de outras universidades (a quem agradeço em
especial à Cibele Cavalcante Souza de Melo, pela ajuda com as fotografias que eu não
consegui realizar!), bolsistas, estagiários voluntários, mestrandos e doutorandos pelos
momentos bons e ruins compartilhados e pelas vivências trocadas de domingo a
domingo. Em especial, aos meus “co-orientandos” e “eternos” estagiários: Camila
Louise Ackermann e Francisco Tiago Silva Pinheiro, por toda amizade e ajuda prestada,
sem a qual os experimentos seriam ainda mais difíceis de serem realizados; ao amigo e
“terapeuta”: Carlos Gabriel Almeida Dias, pela disponibilização não só do aparelho de
anestesia, mas também do seu ombro, tempo, conhecimento e amor aos felinos. Ao
Leonardo Tavernezi, Raimundo Diones Carneiro, Daniel Falcão Menezes Brilhante,
Iran Águila Maciel, Janaína de Fátima Saraiva Cardoso, Antônio Cavalcante Mota Filho
e Cláudia Cunha Barbosa por toda ajuda no gatil e nos experimentos. À Henna Roberta
Quinto, não só por poder confiar plenamente o gatil em suas mãos quando foi
necessário, não só pela sua ajuda na execução da Tese, mas pelos bolos, filmes, textos e
conversas partilhadas. À Cynthia Levi Baratta Monteiro e Barbara Sucupira Pereira,
pelo apoio neste último ano, pela velha amizade e pela segurança em saber que sempre
posso contar com vocês. Aos demais membros da “grande família LRC” que se
confundi e que se tornou parte da minha família durante mais de 7 anos. A todos que
tiveram seu sobrenome modificado para TRABALHO!!
À amiga e colega veterinária Ana Cristina Paulino Braga, pela ajuda
imprescindível nas anestesias para eletrojaculação, transmistindo a segurança necessária
não só a mim, mas a toda a equipe.
À ex-colega de laboratório e amiga Rita de Cássia Soares Cardoso, exemplo
de pesquisadora, pelo companheirismo no laboratório e fora dele, pelas conversas e
choros e por toda a ajuda inestimável prestada nas duas partes do experimento.
Aos amigos Joaquim Hélder Teixeira Pinheiro, Lucilene Simões Mattos e
Alline Ferreira Brasil pelo pensamento positivo mesmo à distância e por todos os
momentos que já compartilhamos dentro e fora da universidade.
À colega veterinária Rochele Bezerra de Araújo, e ao Instituto Ababy de
Conservação- Eco Point pela parceria na coleta paralela de dados biométricos e
reprodutivos de felídeos silvestres, mostrando que o estudo da reprodução de felinos faz
sentido e vale à pena!
À minha fisioterapeuta Mônica Leonardo, pelo seu profissionalismo que nos
últimos meses tem transformado e dizimado as dores de braços, punho e ombros
cansados de digitação e do gatil.
Ao Daniel Couto Uchoa, meu marido, não só pelo seu amor e cumplicidade,
mas por compreender as minhas prioridades durante esses últimos e longos 4 anos.
Pelos trabalhos divididos no laboratório e no gatil, e pelos quase 10 anos de
companheirismo na pesquisa. Por ter sido o responsável pela logística da alimentação
dos animais e dos frascos de anestésicos que sempre faltavam na hora errada! Em
especial, pelo incentivo, pela paciência, por ter sido meu ponto de equilíbrio nos mais
diversos momentos de desespero e desânimo, por não ter me deixado desistir nas tantas
vezes que pensei, e por me fazer sorrir logo após uma crise de choro.
Aos meus animais experimentais, pelos momentos de conflito, com
arranhaduras, mordidas, sustos e fugas, mas também pelos momentos de brincadeira e
carinho que me fizeram voltar a ser criança, apesar da seriedade do dia-a-dia. Tudo que
fizeram me ensinaram ainda mais a respeitá-los. Aos meus “filhos felinos” por me
ensinarem também sobre manejo e comportamento diariamente, em especial à “caçula”,
Isabel Cristina, pelo exemplo de superação dos limites, mostrando que a natureza nos
faz, mas que o resto é por nossa conta. Por ser minha companheira nas muitas horas de
leitura e digitação, não deixando que me sentisse só.
Aos meus pais: Vilany Franco Pereira da Silva e João de Deus Pereira da
Silva, pelo apoio incondicional necessário para a realização de mais este sonho, pelos
exemplos de caráter, e por todos os sacrifícios que fizeram em nome da minha
educação, saúde e felicidade. Espero não tê-los decepcionado.
A Deus, primeiro por ter me feito uma “gateira” assumida. Agradeço
também por ter me permitido chegar até este ponto, por ter me dado vários obstáculos,
mas principalmente por ter dado a força necessária para superá-los colocando pessoas e
seres especiais em minha vida. A Ele, o meu muito obrigada!
“Sábio não é aquele que dá as respostas corretas,
mas o que faz as perguntas certas.”
Claude Levi-Strauss
RESUMO
O objetivo do trabalho foi avaliar: 1) protocolos anestésicos (cetamina/xilazinaprotocolo A, tiletamina/zolazepam- protocolo B, tiletamina/zolazepam e tramadolprotocolo C e isoflurano- protocolo D) empregados para coleta de sêmen
eletroejaculação (EEJ) de gatos domésticos em relação à analgesia e segurança; 2) e em
relação à obtenção de ejaculado; 3) os parâmetros seminais e biometria da genitália
externa de gatos domésticos submetidos ao fotoperíodo equatorial natural e verificar a
ocorrência de correlações entre eles; 4) o uso do ACP-117® como diluidor do sêmen de
gatos domésticos para inseminação artificial intravaginal; 5) o uso do ACP-117® na
criopreservação de sêmen de gatos domésticos. Para alcançar o primeiro e o segundo
objetivo, quatorze gatos foram anestesiados e submetidos a 3 séries de choques elétricos
(2-6 mA). Os parâmetros de freqüência cardíaca, respiratória temperatura, sensibilidade
dolorosa e reflexo palpebral foram aferidos antes e após a indução da anestesia e
durante e após a eletroejaculação. Os parâmetros volume, qualidade seminal, a presença
de espermatozóides e a contaminação por urina foram avaliados para todos os
protocolos após eletroejaculação. A de fim de alcançar o terceiro objetivo, sêmen de 7
gatos coletados por vagina artificial foram avaliados quanto aos parâmetros de volume e
qualidade seminal. Foi realizada aferição do peso corporal, da consistência e do volume
testicular, do comprimento peniano, verificação do aspecto e do grau de espículas
penianas, para correlacionar com a qualidade seminal. Para alcançar o quarto objetivo,
11 ejaculados foram coletados por vagina artificial, analisados quanto aos parâmetros de
qualidade seminal e diluído em ACP-117®. Fêmeas em estro natural foram inseminadas
no 2° e 4° dia do estro pela via intravaginal com o sêmen diluído em ACP-117®. E para
alcançar o último objetivo, o sêmen coletado por vagina artificial foi avaliado quanto ao
volume, coloração, motilidade e vigor espermático, concentração espermática,
funcionalidade de membrana plasmática, e porcentagem de alterações morfológicas e
espermatozóides vivos e mortos. O sêmen foi diluído em ACP 117®-gema de ovo (50 x
106 sptz/mL), submetido ao resfriamento e acrescidos de glicerol (concentração final de
6%). Os ejaculados foram congelados em vapor de nitrogênio líquido e armazenados a 196 °C. O sêmen foi descongelado (37 °C/ 1 min) e os parâmetros espermáticos foram
avaliados. Parte dos ejaculados também foram submetidos ao teste de termorresistência
e análise computadorizada de sêmen (CASA). Conclui-se que: 1 e 2) o protocolo D foi
o que melhor promoveu analgesia, segurança e rapidez recuperação dos animais, e que
este protocolo permite uma melhor coleta de sêmen por EEJ em gatos domésticos; 3) o
volume testicular não é um parâmetro preditivo de outros parâmetros reprodutivos; 4) a
diluição do sêmen fresco de gatos domésticos com ACP-117® não altera a motilidade e
o vigor espermático, mas o protocolo utilizado para inseminação artificial intravaginal
necessita ser modificado; 5) e que, o protocolo utilizado para criopreservação de sêmen
de gatos domésticos em ACP-117® permite baixa viabilidade in vitro dos
espermatozóides pós-descongelação.
Palavras-chave: gato, sêmen, água de coco em pó.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate: 1) the security and analgesia of anesthetics
protocols (ketamine/xylazine- protocol A, tiletamine/zolazepam- protocol B,
tiletamine/zolazepam and tramadol- protocol C, and isofluorane- protocol D for
electroejaculation (EEJ) in domestic cats; 2) and for semen collection; 3) sperm
parameters and the genital biometrie of domestic cats under natural equatorial
photoperiod and verify the existence of correlation among then; 4) the use of powdered
coconut water (ACP-117®) as seminal extender for intravaginal artificial insemination;
5) the use of ACP-117® for the preservation of domestic cat sperm. To reach the first
objective, fourteen toms were anesthetized and submitted to a 3 series of electric stimuli
(2-6 mA). The heart rate, respiratory rate, temperature, pain sensibility and eyes blink
were analyzed prior and after induction, and during and after electroejaculation. The
parameters of semen quality, volume, spermatozoa presence and urine contamination
were analyzed for all protocols after electroejaculation. To reach the third objective, the
semen of the seven cats were collected by artificial vagina and were analyzed for the
parameters of volume, and quality. The analyses of body weight, testicular consistence
and volume, penis length and degree of penis spines were used to correlate with semen
quality.To reach the fourth objective, queens in natural estrus were submitted to
intravaginal artificial insemination in the second and forth day of estrus with semen
diluted in ACP-117®. To reach the last objective, the semen colleted by artificial vagina
was analyzed for the parameters of volume, color, motility, vigour, sperm concentration,
acrosomal status, percentual of abnormal spermatozoa, functionality of membrane and
the percentual of alive or dead spermatozoa. The semen was initially extended in ACP117®- egg yolk (50 x 106 sptz/mL) and submitted to cooling and glycerol addition (final
concentration of 6%) The ejaculates were submitted to frozen in nitrogen vapor and
stored in liquid nitrogen (-196 °C). The samples were thawed (37 °C/ 1 min) and the
spermatic parameters were analyzed. Part of the ejaculates was also submitted to
thermoresistance tests and computer aided semen analysis (CASA). In conclusion: 1
and 2) the protocol D was the best for analgesic parameters, security, speed of
recuperation and semen collection by electroejaculation in domestic cats; 3) testicular
volume is not trustful to predict another reproductive parameters; 4) the dilution of
domestic cat semen in ACP-117® did not affect motility and vigour, but the protocol for
intravaginal artificial insemination must be changed; 5) and the protocol used for
domestic cat semen criopreservation in ACP-117® allow low in vitro post-thaw
viability.
Key Words: cat, semen and powdered coconut water.
SUMÁRIO
Pág.
Lista de Abreviaturas e Símbolos........................................................................
..............i
Lista de Ilustrações...............................................................................................
............iii
1. Introdução..........................................................................................................
.............1
2. Revisão de Literatura.......................................................................................
2.1. Anatomo-Fisiologia da Reprodução do Gato Doméstico........................
3
2.1.1. Fotoperíodo e Controle Hormonal ...................................................
3
2.1.2. Morfologia e Comportamento Sexual...............................................
4
2.2. Tecnologia do Sêmen.................................................................................
8
2.2.1. Métodos de Coleta Seminal................................................................
8
2.2.1.1. Eletroejaculação............................................................................
8
2.2.1.1.1. Conceito e Histórico...................................................................
8
2.2.1.1.2. Tipos de aparelho.......................................................................
10
2.2.1.1.3. Anestésicos utilizados.................................................................
11
2.2.1.1.4. Controle dos parâmetros fisiológicos durante a anestesia e
15
EEJ...............................................................................................................
2.2.1.1.5. Posicionamento do animal para EEJ.......................................
16
2.2.1.1.6. Protocolos de estímulos elétricos..............................................
17
2.2.1.1.7. Contaminação do ejaculado por urina...................................
18
2.2.1.1.8. Falha na obtenção do ejaculado e ejaculação
19
retrógrada....................................................................................................
2.2.1.2. Vagina artificial..............................................................................
21
2.2.1.3. Lavagem vaginal............................................................................
23
2.2.1.4. Lavagem Epididimária..................................................................
23
2.2.1.5. Lavagem da bexiga urinária.........................................................
24
2.2.2. Características Seminais ....................................................................
24
2.2.3. Meios e Métodos de Conservação Seminal........................................
26
2.2.3.1.Água de Coco............................................................................
28
2.2.4. Inseminação Artificial .........................................................................
30
3. Justificativa........................................................................................................
34
4. Objetivos............................................................................................................
36
5. Experimentos Realizados...........................................................................
37
5.1. Capítulo 1.............................................................................................
37
5.2. Capítulo 2.............................................................................................
54
5.3. Capítulo 3.............................................................................................
77
5.4. Capítulo 4.............................................................................................
97
5.5. Capítulo 5.............................................................................................
110
6. Conclusões....................................................................................................
131
7. Perspectivas ......................................................................................................
132
8. Referências Bibliográficas................................................................................
133
9. Apêndices...........................................................................................................
159
10. Anexos..............................................................................................................
163
i
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%:
porcentos
®
marca registrada
μL:
microlitros
μm/s
micrômetros por segundo
°:
graus
°C:
Graus Celsius
A:
amperes
ABP:
proteína transportadora de andrógenos
ACP®:
água de coco em pó
CASA:
análise computadorizada da motilidade espermática
CITES:
Convenção sobre o Comércio Internacional das Espécies da Fauna e da
:
Flora Selvagens Ameaçadas de Extinção
cm:
centímetros
eCG:
gonadotrofina coriônica eqüina
EDTA:
ácido etilenodiamino tetra-acético
EEJ:
eletroejaculação
FeLV:
vírus leucemia felina
FIV:
vírus da imunodeficiência felina
FSH:
hormônio folículo estimulante
G:
gaus
GnRH:
hormônio liberador de gonadotrofinas
h:
horas
hCG
gonadotrofina coriônica humana
Hz:
Hertz
IA:
inseminação artificial
IUCN:
União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos
Naturais
Kg:
quilogramas
LH:
hormônio luteinizante
mA:
miliamperes
ii
min:
minutos
mL:
mililitros
mm:
milímetros
mOsmol/L: miliosmoles por litro
MP:
motilidade progressiva
mrm:
movimentos respiratórios por minuto
MT:
motilidade total
n°:
número
pH:
potencial hidrogênio
SCA:
Sperm Class Analyser®
sptz:
espermatozóides
T4:
testosterona
Tes:
N- Tris- metil 2- ácido sulfônico aminometano
TesT:
hidroximetil aminometano e N- Tris- metil 2- ácido sulfônico
aminometano
Tris:
hidroximetil aminometano
V:
Volts
VAP:
velocidade média da trajetória do espermatozóide
μg:
microgramas
iii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Revisão de LiteraturaFigura 1: Pênis Felino. FONTE: PARAGON e VAISSAIRE (2001).
Figura 2: Ritual de acasalamento de felinos domésticos. FONTE: FOGLE (2001).
Quadro 1: Protocolos de inseminação artificial em gatas domésticas relatados na
literatura. FONTE: ZAMBELLI e MARCO, 2005-modificado.
Capítulo 1Tabela 1: Descrição do número de animais, fármacos, doses e via de administração dos
protocolos anestésicos utilizados.
Tabela 2: Freqüência cardíaca (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tabela 3: Freqüência respiratória (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tabela 4: Temperatura retal (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tabela 5: Saturação de oxigênio (SpO2) de gatos submetidos à eletroejaculação após
anestesia com 4 diferentes protocolos antes, durante e nos intervalos da EEJ.
Capítulo 2Tabela 1: Volume médio (± DP) do ejaculado (com ou sem espermatozóides), máximos
e míninos obtidos na eletroejaculação em gatos domésticos utilizando quatro diferentes
protocolos anestésicos.
Capítulo 3Tabela 1: Média ± desvio padrão do peso corporal e da biometria dos testículos,
comprimento e grau de espículas do pênis de gatos domésticos mantidos em fotoperíodo
equatorial natural (n=15).
Tabela 2: Média ± desvio padrão dos parâmetros seminais obtidos de ejaculados de
iv
gatos domésticos mantidos em fotoperíodo equatorial natural coletados por vagina
artificial (n= 7).
Tabela 3: Tamanho da amostra (N), valores de correlação (r) e de probabilidade (P)
obtidos na aplicação da correlação de Sperman entre parâmetros seminais e biométricos
de gatos domésticos mantidos em fotoperíodo equatorial natural coletados por vagina
artificial.
Capítulo 4Tabela 1: Valores (média ± desvio padrão) obtidos para o sêmen fresco de gatos
domésticos e diluído em ACP-117® (n= 11 ejaculados).
Capítulo 5Tabela 1: Avaliação (média ± desvio padrão) do sêmen fresco dos gatos domésticos
utilizados (n= 23 ejaculados).
Tabela 2: Motilidade e vigor (média ± erro padrão) durante os tempos de avaliação do
teste de termorresistência do sêmen dos gatos domésticos após criopreservação em água
de coco em pó (ACP-117®).
Tabela 3: Avaliação do sêmen de gatos domésticos a fresco e após criopreservação em
água de coco em pó (ACP-117®) em relação aos parâmetros de percentual de
espermatozóides vivos, com funcionalidade de membrana, e alterações morfológicas
(integridade acrossomal, percentual de normais e anormais e alterações primárias e
secundárias; n= 10 ejaculados).
Tabela 4: Análise computadorizada (CASA) do sêmen de gatos domésticos após
criopreservação em água de coco em pó (ACP-117®) em relação aos parâmetros de
motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %), velocidade média da
trajetória do espermatozóide (VAP, μm/s) e sub-populações de espermatozóides rápidos
e lentos (%; n= 10 ejaculados).
Gráfico 1: Motilidade média do sêmen fresco de gatos domésticos e nas etapas de
criopreservação (diuição inicial, a 15°C, a 4°C, após a glicerolização, e descongelação)
utilizados (n= 23 ejaculados) com água de coco em pó (ACP-117®).
Gráfico 2: Vigor médio do sêmen fresco de gatos domésticos e nas etapas de
criopreservação (diuição inicial, a 15°C, a 4°C, após a glicerolização, e descongelação)
utilizados (n= 23 ejaculados) com água de coco em pó (ACP-117®).
v
ApêndicesAPÊNDICE 1: Anel de pêlo na base do pênis de um gato doméstico.
APÊNDICE 2: Vagina artificial para coleta de sêmen de gatos domésticos. AMontagem da vagina com tubo plástico de 1,5 mL sem tampa e borracha de conta-gotas.
B- Amostra de seminal.
APÊNDICE 3: Coleta de sêmen de um gato doméstico com uso da vagina artificial.
APÊNDICE 4: Biometria do pênis de um gato doméstico com paquímetro.
APÊNDICE 5: Eletroejaculação. A- Aparelho para eletroejaculação utilizado nos
experimentos (Eletrojet®, Electrovet®, Brasil). B- Exposição peniana para colocar o
tubo de coleta de sêmen antes da aplicação dos choques elétricos em um gato doméstico
anestesiado.
APÊNDICE 6: Monitoração da saturação de oxigênio durante a eletroejaculação,
utilizando oxímetro de pulso digital através de sensor localizado na língua do animal
(Oxifast 9504®, Takaoka®).
APÊNDICE 7: Esfregaço de sêmen felino a fresco corado com azul de bromo fenol.
Seta amarela- espermatozóides corados totalmente ou parcialmente corados (mortos).
Seta verde- espermatozóides descorados (vivos). Aumento de 400x.
APÊNDICE 8: Análise computadorizada (Sperm Class Analiser®) após descongelação
do sêmen de gato doméstico criopreservado em ACP-117® acrescido de 20% de gema
de ovo e 6% de glicerol. Pontos amarelos- espermatozóides imóveis. Traçados
vermelho, verde e azul: trajetória de espermatozóides rápidos, médios e lentos,
respectivamente. Pontos brancos- grumos de gema de ovo. Aumento de 100x.
AnexosANEXO 1: Composição e modo de preparo do corante Rosa de Bengala.
ANEXO 2: Composição e modo de preparo do corante Azul de Bromofenol.
ANEXO 3: Composição da água de coco anão maduro. FONTE: NUNES e
COMBARNOUS, 1995.
1. INTRODUÇÃO
A criação doméstica de gatos vem se expandindo e, em muitos países e nas
maiores capitais do mundo, o número de gatos superou já o de cães (FUNEZ, 1998;
SOUZA, 2000). No Brasil, espera-se que em 2020, a população felina igualar-se-á à
canina (SOUZA, 2000). Atribui-se a esta expansão mundial, o fato dos gatos
necessitarem de menor espaço e menos cuidados do que os requeridos pelos cães
(CORRADA e GOBELLO, 2000). O aumento da criação alavanca um mercado de
produtos e serviços especializados, além de criar uma demanda por biotecnologias, em
especial as reprodutivas, já que muitos criam não só por hobby, mas também como uma
atividade comercial. Isto gera a necessidade dos criadores em potencializar a capacidade
reprodutiva de seus animais (SILVA JÚNIOR, 2002).
Em comparação aos cães, há menos pesquisas sobre características
reprodutivas a serem disponibilizadas aos técnicos e proprietários de gatos
(GRUFFYDD-JONES,
1988).
Embora
diversas
biotécnicas
já
tenham
sido
desenvolvidas para gatos domésticos, são encontrados poucos trabalhos sobre machos
felinos, principalmente no que se refere às pesquisas sobre características reprodutivas,
fisiológicas e biotécnicas aplicadas. Entre as biotecnologias já desenvolvidas para gatos
domésticos estão, a sincronização de estro e superovulação (SILVA et al., 2001), a
transferência de embriões (MATTOS et al., 2001), a manipulação e criopreservação de
folículos ovarianos pré-antrais (LIMA et al., 2006), a clonagem (SHIN et al., 2002) e a
conservação de sêmen (ZAMBELLI et al., 2002).
Além de serem animais de companhia, os gatos têm importante papel como
modelo experimental, permitindo o aperfeiçoamento do conhecimento dos processos
biológicos e reprodutivos a serem aplicados aos felídeos selvagens (LUVONI et al.,
1999; LUVONI et al, 2003). Entretanto, diferenças entre as diversas espécies são
perceptíveis na biologia reprodutiva de felídeos e devem ser consideradas na
extrapolação de protocolos experimentais (SILVA, 2003). A Família Felinae é
composta de duas subfamílias, 13 gêneros, 36 espécies das quais 10 são neotropicais, e
destas, oito são encontradas no Brasil. Apesar de sua larga distribuição natural por
quase todos os biótipos, com exceção da Austrália, Madagascar e da Antártica, apenas o
gato doméstico (Felis silvestris catus), uma subespécie do gato selvagem europeu,
apresenta distribuição cosmopolita. As 36 espécies de felídeos estão classificadas nos
Apêndices I e II da Convenção sobre o Comércio Internacional das Espécies da Fauna e
da Flora Selvagens Ameaçadas de Extinção (CITES) em diferentes graus de ameaça de
extinção. As espécies que ocorrem no território brasileiro estão classificadas desde a
categoria de aproximadamente ameaçado a ameaçado de extinção na categoria
vulnerável, segundo a IUCN- União Internacional para a Conservação da Natureza e
dos Recursos Naturais (OLIVEIRA, 1994; CITES, 2007; IUCN, 2007; SILVA e
ADANIA, 2007). Esses animais são ameaçados pela caça furtiva para troféu, a caça
predatória para comércio de peles e comércio de animais vivos (GASPARINI e
PRADA, 1997). A ação deletéria do homem, além de caçá-los, destrói o hábitat natural,
criando ilhas de matas, causando um isolamento genético destes animais.
Conseqüentemente, esta perda de variabilidade genética afeta a espermatogênese, a
ovulação, aumenta a susceptibilidade desses animais a doenças e aumenta a mortalidade
perinatal. Há um consenso geral que a manutenção da diversidade genética de uma
espécie é dependente da reprodução. Neste contexto, a aplicação de técnicas de
reprodução assistida surge como importante ferramenta na conservação de espécies
selvagens ameaçadas de extinção, na medida em que pode minimizar a perda da
variabilidade genética por meios de programas reprodutivos (MORATO e BARNABE,
1998). Uma alternativa bastante discutida para a preservação de espécies e da
variabilidade genética é o banco de genoma, o qual armazenaria à longo prazo, material
genético criopreservado, incluindo gametas e embriões de espécies ameaçadas de
extinção (MORAIS, 1999).
Além disto, percebe-se atualmente uma demanda dos criadores comercias
de gatos domésticos pelos serviços de avaliação andrológica e inseminação artificial
(IA- STORNELLI e STORNELLI, 2001). Para o uso comercial da IA em gatos, um dos
entraves são os protocolos de conservação do sêmen felino. A conservação de sêmen,
seja pelo resfriamento ou pela congelação, permite o transporte de material genético de
animais de alto valor comercial por longas distâncias, facilitando significativamente a
criação comercial e possibilitando, também, a troca de sêmen entre populações
selvagens geograficamente isoladas, restaurando o vigor genético (LUVONI et al.,
2003).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Anatomo-Fisiologia da Reprodução do Gato Doméstico
2.1.1. Fotoperíodo e Controle Hormonal
A estacionalidade reprodutiva observada em outras espécies animais ainda é
controversa nos machos de felinos domésticos. Esta está diretamente relacionada com o
número de horas de luz diárias (fotoperíodo) a quais os animais estejam submetidos em
localizações geográficas onde exista marcada variação da duração do dia durante o ano
(STORNELLI, 2007). Entretanto, há divergências entre os trabalhos realizados ao longo
do ano em diferentes localizações. Há quem afirme não haver variação na qualidade ou
quantidade de espermatozóides recuperados de epidídimo de gato doméstico (38° de
latitude Norte - SPINDLER e WILDT, 1999) até a ocorrência de moderada
sazonalidade (52° de latitude Norte - BLOTTNER e JEWGNOW, 2007). Trabalhos
realizados na cidade de La Plata - Argentina, localizada a 34° de latitude Sul, com
recuperação de espermatozóides de epidídimo de gato doméstico demonstraram a
presença de variação na quantidade e na qualidade espermática em diferentes épocas do
ano (STORNELLI et al., 2004; TITTARELLI et al., 2004). O número de
espermatozóides recuperados e o percentual de espermatozóides vivos é maior em
epidídimos de gatos castrados submetidos a mais de 11h de luz/dia (STORNELLI et al.,
2004; TITTARELLI et al., 2004). Reyna et al. (2006c) observaram concentração
espermática significativamente superior em epidídimos de gatos castrados na primavera
que no inverno. Estudos histológicos dos testículos por microscopia óptica
demonstraram também uma significativa quantidade de células de Leydig e de túbulos
seminíferos em estágio de amadurecimento avançado em amostras obtidas na primavera
que as obtidas em outono-inverno (REYNA et al, 2005bc e 2006ab). À observação por
microscopia eletrônica, testículos de gatos castrados no verão possuíam uma grande
quantidade de túbulos seminíferos com muitas espermátides maduras e espaço
intersticial com numerosas células de Leydig com grande quantidade de gotas lipídicas
citoplasmáticas. Estas imagens foram relacionadas à maior produção espermática e
hormonal, tomando-se por base a estação reprodutivas das fêmeas felinas (REYNA et
al, 2005a).
Assim como nas demais espécies domésticas, o aumento da testosterona
(T4) no sangue periférico, quer por produção endógena pelas células de Leydig ou
aplicação exógena durante um tratamento, promove feedback negativo sobre o eixo
hipotalâmico hipofisário, bloqueando a descarga pulsátil de hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH), fato que também suprime a liberação de hormônio luteinizante
(LH), suprimindo também a liberação da T4 pelas células de Leydig. Os estrogênios são
produzidos pelas células de Leydig e de Sertoli. A relação estrogênios e testosterona
possuem uma ação moduladora na secreção de LH e hormônio folículo estimulante
(FSH) na hipófise anterior. A inibina pode bloquear a secreção de FSH pela hipófise. As
células de Sertoli produzem também a ABP (proteína transportadora de andrógenos),
que se liga a T4, o que permite uma taxa elevada deste hormônio nos túbulos
seminíferos e epidídimo (MIALOT, 1988). As concentrações de testosterona podem ser
acompanhadas através de dosagens sangüíneas seriadas em gatos domésticos
(TSUTSUI et al., 1990). A excreção de mais de 70% dos hormônios esteróides,
incluindo a testosterona, nas fezes e na urina destes animais facilita as interações
reprodutivas, assim como possibilita o monitoramento das concentrações fisiológicas
destes hormônios de forma não invasiva tanto do gato doméstico como de outros
felídeos em cativeiro ou em vida livre (MORAIS et al., 2002).
Considera-se que aproximadamente 4,5 ciclos são necessários para o
processo de espermatogênese seja completado. Assim, estima-se a espermatogênese em
46,8 dias (FRANÇA e GODINHO, 2003).
2.1.2. Morfologia e Comportamento Sexual
No gato doméstico, o pênis encontra-se na posição ventral ao escroto,
normalmente voltado para trás, mas fazendo uma reversão após a ereção, penetrando de
cima para baixo (JOHNSTON et al., 1996). Pode haver um osso peniano vestigial
(PARAGON e VAISSAIRE, 2001). Cerca de dois terços de sua superfície encontra-se
recoberto de papilas córneas (100 a 200), variando de 0,75 a 1mm de comprimento e
direcionadas à base peniana (JOHNSTON et al., 1996 - Figura 1). Estão
completamente desenvolvidas na maturidade sexual, aproximadamente aos 9 meses, e
são andrógeno-dependentes, podendo ser classificados em uma escala de 0 a 3, onde
zero é ausência de espículos e três são espículos no tamanho máximo para a espécie
(MORAES et al, 2002; SILVA et al., 2003). Nas espécies comprovadamente de ovulação
induzida, incluindo-se os gatos domésticos, a ovulação ocorre na dependência da cópula
(BAKKER e BAUM, 2000). Isso ocorre devido à estimulação de mecano-receptores
(somato-sensoriais) presentes na vagina através do contato com as centenas de espículas
penianas (BANKS, 1986; CHRISTIANSEN, 1988).
Os testículos estão na bolsa escrotal ao nascimento, mas só serão mais
facilmente palpáveis as 6 a 8 semanas de vida. As células de Leydig estão maduras aos
5 meses de idade, sendo encontrados espermatozóides no ejaculado logo após este
período (FELDMAN e NELSON, 1996). Os testículos possuem em média de 1,5 x 1 x
1 cm cada (JOHNSTON et al., 2001).
Para identificação de parceiros e facilitação das interações sexuais, os
felinos utilizam os sinais olfativos (glândulas de cheiro na cabeça, pescoço, cauda e
almofadas das patas), visuais (arranhaduras) e sonoros, com um vasto repertório de
vocalizações (MORAIS, 1999; MORATO, 2001). Os feromônios e outras substâncais
alelomiméticas são substâncias químicas voláteis deixadas por fezes e urina ou
secretadas por glândulas cutâneas que são perceptíveis ao sistema olfatório e que
iniciam respostas endócrinas ou comportamentais em indivíduos da mesma espécie
exercendo o seu efeito sobre a atividade reprodutiva via sistema hipotalâmico, gerando
pulsos de GnRH (REKWOT et al., 2001). Na fase pré-cópula o gato doméstico observa
a fêmea a uma certa distância e só se aproxima quando sente segurança do momento
ideal, pois uma fêmea no cio pode ser extremamente agressiva antes e após o coito. Ele
monta sobre a fêmea, morde sua nuca, fixando-a, e a gata só permite a intromissão
peniana quando está plenamente receptiva (FUNEZ, 1998- Figura 2). Na maior parte
das espécies felinas, a ovulação é induzida pela cópula através da estimulação exercida
pelos espículos penianos nos mecano-receptores vaginais. Entretanto, fêmeas de gato
maracajá não submetidas à cópula apresentaram dosagens de progesterona fecais
compatíveis com a ocorrência de ovulação, além de corpos lúteos visíveis à
laparoscopia (MOREIRA et al., 2001). Os machos desta mesma espécie não possuem
espículos penianos (MORAIS et al, 2002).
Figura 1: Pênis Felino
1- Orifício uretral externo;
2- Espículos penianos;
3- Osso peniano;
4- Prepúcio.
FONTE: PARAGON e VAISSAIRE (2001).
D
Figura 2: Ritual de acasalamento de felinos domésticos. Na seqüência, o macho:
A- Observa o interesse da fêmea;
B- Cheira a genitália da fêmea;
C- Aproxima-se da nuca da fêmea;
D- Realiza a tentativa de monta na fêmea;
E- Realiza fixação na nuca da fêmea;
F- Realiza a penetração (cópula) e ejaculação;
G- Afasta-se após a cópula.
FONTE: FOGLE (2001).
2.2. Tecnologia do Sêmen
2.2.1. Métodos de Coleta Seminal
2.2.1.1. Eletroejaculação
2.2.1.1.1. Conceito e Histórico
A eletroejaculação (EEJ) teve sua primeira aplicação prática em 1936 por
Gunn para ovinos na Austrália, mas teve uso científico relatado para felídeos somente
no final da década de 60 para onça pintada (CARVALHO, 1968) e de 70 para gatos
domésticos (PLATZ e SEAGER, 1978; MIES FILHO, 1982). A técnica original de EEJ
consistia em fazer passar uma corrente elétrica pela medula ao nível da 4ª vértebra
lombar, sendo o aparelho provido de dois pólos, um deles introduzido no reto do animal
e o outro adaptado à região lombar depois de raspados os pêlos. Somente em 1945,
Laplaud e Cassou modificaram para bovinos e suínos o primitivo sistema de Gunn,
introduzindo o eletrodo bipolar em anéis. Esta modificação reduziu significativamente a
extensão das excitações necessárias à coleta de sêmen, além de não haver mais a
necessidade da forte amarração do animal, podendo-se realizar a EEJ na posição de
estação, diminuindo os riscos de acidentes e fraturas (MIES FILHO, 1982).
A EEJ é considerada o método de eleição para obtenção de sêmen felino,
especialmente para felídeos silvestres, já que possibilita o manuseio do animal vivo
(MORAIS et al., 2002). Este método possibilita análises andrológicas em animais de
alto valor genético ou animais silvestres que não permitem avaliação sem anestesia
devido à sua agressividade ou por não serem treinados para ejaculação em vagina
artificial (MORATO e BARNABE, 1998). Baseia-se na indução do reflexo ejaculador
através de estímulos elétricos, com a introdução de uma sonda trans-retal lubrificada
conectada a um estimulador elétrico, no assoalho da ampola retal do animal anestesiado
(SILVA et al., 2004a). É considerado o método ideal para aplicação clínica em casos de
questionamento por parte de criadores e proprietários do status reprodutivo de seus
animais. É utilizada não só para avaliação andrológica, mas principalmente para
obtenção de sêmen para estudos de conservação e inseminação artificial, eliminando o
contato físico necessário no momento da cópula ou coleta por vagina artificial e
reduzindo risco de transmissão de doenças; bem como, possibilitando o fracionamento
do ejaculado para utilização em mais de uma fêmea em gatis comerciais (PLATZ e
SEAGER, 1978; TEBET et al., 2006).
Os estudos de eletroejaculação em animais domésticos como cães e
camundongos, além de serem úteis para o desenvolvimento e uso da técnica na própria
espécie, são utilizados para o desenvolvimento de protocolos em seres humanos nos
casos de problemas neurogênicos decorrente de injúria espinhal, cirurgias
retroperineais, esclerose múltipla ou neuropatias diabéticas que resultam na ausência de
ejaculação (PINEDA et al., 1987; PINEDA e DOOLEY, 1991; OHL et al., 1994;
CAZES, 2006; MUNO et al., 2006). A EEJ é realizada também em uma ampla gama de
espécies não domésticas, entre elas lobos - Canis rufus (GOODROWE et al., 1998;
GOODROWE et al., 2001), cães selvagens africanos - Lycaon pictus (WARD et al.,
2006), raposas voadoras selvagens - Pteropus spp.(JONG et al., 2005), panda gigante Ailuropoda melanoleuca (SPLINDER et al., 2004), urso marrom de Hokkaido - Ursos
arctos yesoensis (ISHIKAWA et al., 2002), cateto - Tayassu tajacu (COSTA e PAULA,
2005), chinchila - Chinchilla lanigera (BUSSO et al., 2005), macaco-prego- Cebus
apella (ARAÚJO et al., 2007), quatis - Nasua nasua (PIRES FILHO et al., 2005;
QUEIROZ, 2007; VIANA et al., 2007) e irara- Eira barbara (MORGADO et al., 2007).
Em felídeos, já foi realizada, entre outras espécies, em leões - Panthera leo
(SWANSON, 2003), onças-pintadas - Phantera onca (MORATO et al., 1998;
MORATO et al., 2001; PAZ et al., 2000; PAZ et al., 2003), pumas - Puma concolor
(WILDT et al., 1988), guepardos - Acinonyx jubatus (WILDT et al., 1983; HOWARD
et al., 1993; ROTH et al., 1995), tigres - Panthera tigris (DONOGHUE et al., 1992;
BYERS et al., 1989) e tigres siberianos - Panthera tigris altaica (SCHMEL et al.,
1990), leopardos - Phantera pardus (JAYAPRAKASH et al., 2001), leopardos das
neves - Uncia uncia (ROTH et al., 1994), gatos leopardo - Felis bengalensis
(HOWARD e WILDT, 1990), leopardos nebulosos - Neofelis nebulosa (WILDT et al.,
1986; PUKAZHENTHI et al., 2006), jaguatiricas - Leopardus pardalis (MORAIS et al.,
2002; QUEIROZ, 2003; TEBET, 2004), gatos-do-mato pequeno - Leopardus tigrinus
(MORAIS et al., 2002; TEBET, 2004; ERDMANN et al., 2005), gatos maracajás -
Leopardus wiedii (MORAIS et al., 2002) e gatos de Palla - Otocolobus manul
(SWANSON et al., 2006).
2.2.1.1.2. Tipos de aparelho
Existem vários modelos de aparelhos de EEJ, alguns utilizam corrente
elétrica contínua, outras alternada (WILDT, 1996). O aparelho pode ser fabricado sob
medida para uso em felinos (PLATZ e SEAGER, 1978; DOOLEY et al., 1983) ou
pode-se adquirir o mesmo tipo utilizado para bovinos (MORATO e BARNABE, 1998).
A sonda deve possuir o tamanho adequado ao porte da espécie, sendo aproximadamente
do diâmetro das fezes do animal (WILDT, 1996). Para carnívoros, a que permitiu
melhores respostas ejaculatórias foi as que possuíam tiras longitudinais ao invés de
circulares (HOWARD, 1999). Em geral, a sonda trans-retal possui três eletrodos, um
positivo, um negativo e um neutro em tiras longitudinais dispostas paralelamente
(MORATO e BARNABE, 1998; SILVA et al., 2004). Platz e Seager (1978)
descreveram a manufatura de uma sonda para gatos domésticos de 1 cm de diâmetro por
12 cm de comprimento e 3 eletrodos inoxidáveis ventrais de 5 cm.
Os mostradores podem expressar tensão elétrica (voltagem) e intensidade de
corrente (amperagem), mas recomenda-se o uso do mostrador de voltagem para facilitar
o procedimento, já que os protocolo de estímulos elétricos para felídeos são descritos
nesta unidade (PLATZ e SEAGER, 1978; DOOLEY et al., 1983; MORATO e
BARNABE, 1998). Em geral, aparelhos com mostradores de voltagem e amperagem
não estão facilmente disponíveis no mercado nacional brasileiro. A maior parte das
descrições nacionais se referem a aprelhos portáteis com monitor em miliamperagem.
Um opção para utilização de aparelhos com os dois mostradores é a aquisição de
aparelho importado (ERDMANN, 2005), ou nos nacionais a solicitação para inclusão de
mais um mostrador. Entretanto Pineda et al. (1984) descrevem para gatos domésticos
certa correspondência da tensão elétrica aplicada com a intensidade de corrente,
utilizando uma onda elétrica sinusoidal de 60Hz de freqüência. Segundo estes autores,
uma descarga de 2V corresponde ao intervalo de 20 a 30 mA, e de 3V de 30 a 40 mA.
Os aparelhos adquiridos podem ser manuais, automáticos ou podem possuir
as duas opções de estimulação. Os automáticos, desencadeam a sequência de choques
sem a ação do operador, necessitando-se de um único operador para todo o
procedimento de EEJ, além de fornecem maior precisão na aplicação dos choques
(DOOLEY et al., 1983; SILVA et al., 2003; ERDMANN et al., 2005; LIMA et al.,
2007). Os aparelhos atuais possuem alimentação através de cabos ligados a tomadas
elétricas ou por baterias portáteis e automotivas. Antigos aparelhos possuíam
alimentação por dínamos, produzindo energia eletromagnética através de uma manivela
(MIES FILHO, 1982).
2.2.1.1.3. Anestésicos utilizados
A EEJ é um procedimento simples, rápido e prático (MORAIS et al., 2002).
Embora os primeiros estudos em felinos domésticos e silvestres tenham sido realizados
somente com a contenção física sem auxílio de anestesia (CARVALHO, 1968; SCOTT,
1970; MIES FILHO, 1974), aos moldes do realizado para animais de produção, a EEJ
em felinos, seja em domésticos ou silvestres necessita da aplicação de anestésicos para
contenção do animal, evitando riscos à equipe, mas implicando ao animal os riscos
envolvidos no procedimento anestésico. Assim, a qualidade da anestesia deve ser
suficiente para executar a colheita de sêmen com eficácia e promover analgesia ao
animal durante o procedimento (ERDMANN, 2005).
Há um variável número de combinações farmacológicas e variações de
doses entre autores. Tiletamina, zolazepam e três doses distintas de xilazina foram
testadas para gato-do-mato (ERDMANN, 2005). As combinações de cetamina e
midazolam, e cetamina, midazolam e butorfanol foram testadas para jaguatirica e gatodo-mato pequeno (TEBET, 2004). Dentre os protocolos anestésicos mais utilizados para
EEJ em gatos domésticos e felídeos silvestres estão: cloridrato de cetamina (PLATZ e
SEAGER, 1978; ZAMBELLI et al., 2002; PUKAZHENTNI et al., 2006) e as
associações de cloridrato de cetamina e xilazina (MORAIS et al., 2002) e tiletamina e
zolazepam (PUKAZHENTNI et al., 1999; MORAIS et al., 2002; MORATO et al.,
2002; TEBET et al., 2006). Outras associações também já foram utilizadas com este
propósito para gatos domésticos como: tiletamina, zolazepam e morfina; tiletamina,
zolazepam, butorfanol e acepromazina (TEBET et al., 2006), cetamina e medetomidina
(AXNÉR et al., 1998; ZAMBELLI et al., 2007), propofol (CHATDARONG et al.,
2006), propofol e buprenofina (CHATDARONG et al., 2006), indução anestésica com
propofol e anestesia epidural com lidocaína (LEITE et al., 2006), metoxamina
(DOOLEY et al, 1991) ou anestesia inalatória com a indução anestésica à base
cetamina, diazepam, tiopental sódico, tramadol e manutenção anestésica com isoflurano
(SILVA et al., 2004b).
Tebet (2004) realizou EEJ com dois diferentes protocolos para gato
doméstico, obtendo melhores resultados com a associação de tiletamina, zolazepam e
um opióide, a morfina, para gatos domésticos. Isto provavelmente se deveu à analgesia
mais profunda promovida pelo opióide que a associação da tiletamina, zolazepam à
acepromazina e butorfanol. Em resultados preliminares bastante satisfatórios, SILVA et
al. (2004b) utilizaram a anestesia inalatória com a indução anestésica à base de
cloridrato de quetamina, diazepam, tiopental sódico e manutenção anestésica com
isoflurano por EEJ em gatos domésticos.
Uma desvantagem do uso de determinados fármacos é a diminuição do
volume seminal. Quando a atropina é utilizada para diminuir a sialorréia comum na
anestesia com tiletamina e zolazepam, este fato pode ser observado (PLATZ e
SEAGER, 1978; MORATO et al., 2002).
As características de alguns fármacos utilizados para contenção química e
anestesia para EEJ em felídeos estão abaixo relacionadas:
Cetamina: é um anestésico dissociativo, ou seja, que promove interrupção
do fluxo de informações para o córtex sensitivo e depressão seletiva de alguns centros
cerebrais, com concomitante estímulo de áreas límbicas (ANDRADE, 2002).
Tiletamina: é utilizada exclusivamente em combinação ao zolazepam.
Produz analgesia intensa no sistema muscular esquelético e os sinais clínicos obtidos
são semelhantes à cetamina. Na recuperação da anestesia podem ocorrer delírios e
alucinações (FANTONI e CONTOPARSSI, 2002).
Isoflurano: é um agente anestésico inalatório geral administrado e eliminado
por via inalatória que promove analgesia, relaxamento muscular e inconsciência. Uma
grande vantagem do seu uso frente aos anestésicos dissociativos é a alta potência e o
maior controle do plano anestésico, a indução e recuperação rápidas, além do fato do
efeito tempo não ser um limitante, já que devido à sua baixa solubilidade somente 0,2%
deste fármaco é biotransformado, gerando ausência de efeitos cumulativos e
conseqüente baixa toxicidade renal e hepática (ANDRADE, 2002).
Xilazina: relaxante muscular que apresenta efeitos cardio-pulmonares que
incluem bradicardia, bloqueio átrio-ventricular de primeiro, segundo e terceiro grau,
redução do débito cardíaco e aumento inicial da pressão arterial, seguido de hipotensão
duradoura, devido aos seus efeitos sedativos de α-2 agonista (ANDRADE, 2002). O
efeito do uso da xilazina na EEJ já foi estudado em cães (DOOLEY et al., 1990) e bodes
(MARTIN et al., 2003), mas em relação ao aspecto de produção de ejaculação
retrógrada.
Medetomidina: é um agonista α2-adrenérgico com importante ação sedativa
e analgésica, mais potente que xilazina e que pode produzir, por si só, anestesia. Este
agente tem sido empregado para promover analgesia e sedação no período pósoperatório e nas unidades humanas de tratamento intensivo, sendo seguro para uso
também em felinos (BREARLEY, 1994; AXNÉR et al., 1997 e 1998; VILLELA e
NASCIMENTO JR., 2002; ZAMBELLI et al., 2006).
Zolazepam: benzodiazepínico de efeito anti-convulsivante, ansiolítico,
hipnótico e relaxante muscular, sendo utilizado somente em combinação com a
tiletamina (ANDRADE, 2002).
Diazepam: promove depressão respiratória de pequena monta, e embora seja
bastante comum e útil como medicação anti-convulsivante, é amplamente usado na
indução anestésica, promovendo redução da dose anestésica em até 50% (ANDRADE,
2002).
Morfina: analgésico opiáceo usado no tratamento da dor aguda e crônica e
na medicação pré-e pós-operatória. Amplamente utilizada em gatos, e segura na doses
recomendadas, não promovendo excitação (ANDRADE, 2002; ROBERTSON, 2007).
Tramadol: agente analgésico de ação central, estruturalmente relacionado à
morfina e codeína (CASSU e LUNA, 2003) e de uso relativamente recente na Medicina
Veterinária quando comparado à morfina. É conhecido por não causar a depressão
respiratória comumente causada pela morfina, nem tampouco efeitos cardiovasculares
graves (ANDRADE, 2002).
Propofol: anestésico intravenoso, classsificado como um alquil-fenol, é um
agente hipnótico com período de latência curta e duração de efeito ultracurta. Promove
rápida perda de consciência (20 a 40 segundos) após administração. Em bolus mostrouse eficiente para EEJ e diferentemente da cetamina, promove uma diminuição das
concentrações séricas de cortisol, e demonstrou não indução de dor ou estresse durante a
EEJ (CARTER et al., 1984; CHATDARONG et al., 2006).
Os protocolos dissociativos mais utilizados (cetamina e xilazina; tiletamina
e zolazepam) são descritos como seguros e eficazes para EEJ de diversas espécies de
felídeos (MORAIS et al., 2002; MORATO et al., 2002). Algumas combinações
farmacológicas apresentam a vantagem de possuírem antagonistas específicos. Nestas
duas combinações anestésicas citadas, a xilazina pode ser revertida por antagonistas
como a ioimbina (ANDRADE et al., 2000; EMÍLIO et al., 2004) e o zolazepam pelo
flumazenil, acelerando o tempo de retorno anestésico e inibindo os efeitos indesejados
desses fármacos. Outra anestesia relatada, com o uso da medetomidina pode ser
revertida com o atipamezol (AXNÉR et al., 1997). As anestesias que utilizam opiódes
podem ser revertidas com naloxona ou ioimbina (ANDRADE, 2002; CASSU e LUNA,
2003).
PLATZ e SEAGER (1978) relatam que a EEJ com anestesia utilizando-se a
cetamina pode ser executada rotineiramente uma vez por semana sem efeitos causados
pela anestesia ou pela inserção da sonda no reto do animal. A capacidade de ejaculação
do gato não é afetada pela estimulação elétrica e anestesias repetidas (PINEDA et al.,
1984).
2.2.1.1.4. Controle dos parâmetros fisiológicos durante a anestesia e EEJ
Para o procedimento de eletroejaculação, os animais monogástricos devem
ser mantidos em jejum de 12 a 24 h, recebendo anestésico até atingir estágio de
anestesia cirúrgica, ou estágio 3 de Guedel (HOWARD, 1999). Com o transcurso da
EEJ, os animais devem ser monitorados para serem mantidos no plano I deste estágio
(QUEIROZ, 2003). Os estágios de Guedel valorizam a verificação dos reflexos
interdigital, palpebaral, pupilar, laringotraqueal e anal; a freqüência e o padrão
respiratório e cardíaco. O plano I do estágio 3 corresponde ao plano de anestesia
superficial com desparecimento do reflexo interdigital, respiração regular e automática,
no qual é possível realizar a intubação do animal. No plano II do 3 de Guedel, a
respiração torna-se gradativamente menos profunda, há perca do reflexo palpebral com
rotação do globo ocular (sinal patognomônico em cães, gatos e ruminantes). No plano
III do mesmo estágio, a respiração é preferencialmente abdominal com esforço
inspiratório, estímulos dolorosos de qualquer intensidade não promovem estimulação
simpática e o reflexo corneal está ausente (ANDRADE et al., 2002). A presença de
reflexo palpebral é esperada para anestesias dissociativas mesmo em plano anestésico,
mas o reflexo palpebral deve estar ausente na anestesia inalatória quando o plano
anestésico é alcançado (ANDRADE et al., 2002).
O acompanhamento do ritmo e da freqüência cardíaca é extremamente
importante, já que o conhecimento do seu valor a cada instante permite estabelecer
comparações entre as médias consideradas fisiológicas para a espécie e aquelas
apresentadas pelo indivíduo antes e após a anestesia. Esta avaliação pode ser realizada
mesmo por profissional menos treinado através da estetoscopia, ou de forma mais
apurada, através da eletrocardiografia. A contínua observação da freqüência respiratória
também é imprescindível, já que a simples contagem dos movimentos respiratórios
pode dar idéia da profundidade da anestesia. Outras avaliações podem ser realizadas
para um melhor o acompanhamento anestésico, entre elas, pressão arterial e oximetria
de pulso (NUNES, 2002). Para EEJ em felídeos, relata-se o uso de oximetria de pulso
com sensor na língua dos animais, embora no uso de anestesias dissociativas,
movimentos da língua possam causar interferência na aferição (MORATO et al., 2002).
Nestes casos, outros posicionamentos para avaliação da oximetria podem ser tentados,
como patas (BRAGA, 2007) ou orelhas (NUNES, 2002). Alguns equipamentos
fornecem o traçado da onda pletismográfica e o valor da freqüência de pulso que deve
ser virtualmente a mesma da freqüência cardíaca. Os valores aferidos de oximetria e
freqüência são confiáveis desde que o aparelho reconheça uma onda pletismográfica
válida e de boa intensidade. O traçado pletismográfico não deve substituir a
eletrocardiografia (NUNES, 2002). Para felídeos, a eletrocardiografia é procedida, em
geral, após a EEJ (CORTEZE, 2006). Os monitores eletrocardiográficos sofrem
interferências de fontes diversas, inclusive do próprio paciente como tremores
musculares (NUNES, 2002).
Uma avaliação já utilizada para avaliação do grau de analgesia do protocolo
anestésico empregado em EEJ de felídeos é reflexo por compressão do periósteo de
falanges dos membros pélvicos e torácicos em substituição à compressão interdigital
(ERDMANN, 2005).
A temperatura retal também deve ser avaliada e uma diminuição é esperada
com o uso das associações de cetamina e xilazina; e tiletamina e zolazepam (SANTOS
et al., 2004; MORATO et al., 2002).
2.2.1.1.5. Posicionamento do animal para EEJ
Para coleta de sêmen, após anestesia, o animal é colocado em decúbito
lateral e o pênis é exposto aplicando-se uma suave pressão na sua base e um frasco, em
geral pré-aquecido, é colocado sobre o pênis, tomando-se o cuidado de substituí-lo em
cada série ou subsérie (10 estímulos elétricos sucessivos), evitando a contaminação por
urina da amostra obtida nos estímulos anteriores (PLATZ e SEAGER, 1978; PLATZ et
al, 1978; HOWARD et al., 1986; MORAIS, 1999; MOREIRA e MORATO, 2007).
Recomenda-se o uso destes frascos pré-aquecidos (22 a 37°C - PLATZ e SEAGER,
1978; MOREIRA e MORATO, 2007), podendo ser aquecido na mão do manipulador
(MORATO et al., 1998). Bons resultados de qualidade após EEJ foram obtidos por
Tebet et al. (2006), utilizando tubos mantidos à temperatura ambiente para recolhimento
dos ejaculados obtidos nas séries e processamento do sêmen de forma conjunta após a
EEJ.
2.2.1.1.6. Protocolos de estímulos elétricos
Diferentes protocolos de estímulos elétricos já foram desenvolvidos em
felinos. Platz e Seager (1978) utilizaram para coleta por EEJ de gatos domésticos, 180
estímulos de 2 a 7V. Nesta descrição, foram procedidos três blocos de 60 estímulos.
Cada bloco foi dividido em 4 séries de 15 estímulos, no qual para cada série houve um
acréscimo de 1V sem intervalo entre séries. No primeiro bloco foram procedidos 15
estímulos de 2, 3, 4 e 5V; no segundo 5 estímulos de 2, 10 de 3 e 15 de 4, 5 e 6V; e no
terceiro 5 estímulos de 2, 5 de 3, 5 de 4, 15 de 5, 6 e 7. Outros trabalhos que avaliaram o
efeito da voltagem na coleta de sêmen de gatos domésticos foram realizados com
estímulos de 1 a 8V (PINEDA et al., 1984; PINEDA e DOOLEY, 1984 DOOLEY e
PINEDA, 1986). Porém, atualmente os mais utilizados são o método de Wildt et al.
(1983), inicialmente descrito para chitas, e o de Howard et al. (1984), descrito para 28
espécies de felídeos. Os dois métodos são utilizados para gato doméstico e em ambos os
casos, após anestesia (AXNÈR et al., 1997; SILVA et al., 2004b). No primeiro, são
aplicados 80 estímulos elétricos divididos em três séries. Na primeira série, é procedida
a administração de 10 estímulos de 2, 3 e 4 V, sucessivamente. Na segunda, 10
estímulos de 3, 4 e 5 V e, na terceira, 10 estímulos de 5 e 6 V. Entre cada série, há 5
minutos de intervalo. Já no protocolo definido por Howard et al. (1984), são aplicados
também 80 estímulos elétricos divididos em três séries, onde somente a terceira série
diferencia-se do anteriormente descrito, com 10 estímulos de 4V e 10 de 5 V e
intervalos entre séries variando de 5 a 10 minutos. Cada estímulo que é aplicado vai de
0V até a voltagem desejada em 1 segundo e permanece nela cerca de 2 a 3 segundos,
seguido de um retorno abrupto a 0V, no qual permanece por 2 a 3 segundos. Para a
coleta de animais de produção, excitações de 3 a 5 segundos e pausa igual de tempo são
promovidas (MIES FILHO, 1982). Deve-se lubrificar a sonda antes da introdução no
reto para manter o contato elétrico entre eletrodos e a parede retal, podendo o
lubrificante ser um enema comercial, carboxi-metil-celulose, lubrificante íntimo
humano ou água (PLATZ e SEAGER, 1978; PLATZ et al., 1978; MIES FILHO, 1982;
MORATO et al., 1998).
Um protocolo padronizado, no qual o macho recebe o mesmo número de
estímulos elétricos na mesma voltagem é interessante para comparar as características
do ejaculado entre machos e resultados de diferentes locais (HOWARD, 1993).
2.2.1.1.7. Contaminação do ejaculado por urina
Coletas por EEJ, em geral, são seguidas por centrifugação quando se
suspeita que a amostra esteja contaminada por urina (TEBET, 2004). A contaminação
por urina no ejaculado após EEJ em gato doméstico é pouco observada e mais
freqüentemente relatada com uso de voltagens superiores a 8V (PINEDA e DOOLEY,
1984) ou com o uso de combinações anestésicas contendo acepromazina (MARTIN,
1978). O protocolo anestésico combinando tiletamina, zolazepam, butorfanol e
acepromazina foi considerado insatisfatório para EEJ em gatos domésticos por induzir
contaminação por urina, quando comparado ao tiletamina, zolazepam e morfina
(TEBET, 2004). Para outros felídeos não domésticos, protocolos à base de tiletamina e
zolazepam, ou combinações contendo cetamina, associada à xilazina, diazepam e/ou
butorfanol propiciaram obtenção de ejaculados contaminados por urina em 26,9 a 53% e
59 a 69% das EEJ, respectivamente para gato-do-mato pequeno e jaguatirica (MORAIS,
1999; TEBET, 2004). No gato-maracajá, relata-se a contaminação de uma única subsérie (10 estímulos elétricos suscessivos) em 41 ejaculado obtidos (MORAIS, 1999).
Procedimentos de EEJ em gato-do-mato-pequeno mostraram que em planos anestésicos
muito profundos ou muito superficiais a incidência de contaminação por urina é maior
(TEBET, 2004). De acordo com Howard (1993), o uso de anestésicos inalatórios pode
relaxar a musculatura ao redor da bexiga, facilitando a ejaculação com urina. Entretanto,
a contaminação do ejaculado por urina na EEJ de jaguatiricas utilizando tiletamina,
zolazepam não diferiu das anestesiadas com a mesma combinação suplementadas com
isoflurano (QUEIROZ et al., 2004). O mecanismo fisiológico da ejaculação e da
prevenção da contaminação por urina é controlado pelo sistema nervoso simpático
eferente. Aumentar as concentrações de anestésicos inalatórios pode reduzir
marcadamente a resposta dos nervos eferentes, tanto centrais, como periféricos,
decrescendo as chances de sucesso na EEJ (SHORT, 1987 apud QUEIROZ et al., 2004;
HOWARD, 1993). Para gatos domésticos, na EEJ com o uso da anestesia inalatória
com isoflurano a contaminação do ejaculado por urina não foi observada (SILVA et al.,
2004b).
O posicionamento muito cranial da sonda no momento da ejaculação pode
resultar em ejaculado com urina, uma vez que parece haver maior proximidade entre a
inervação controladora da micção e a da ejaculação na Família Felidae (MARTIN,
1978). O reflexo de micção requer uma integração complexa e coordenada entre três
sistemas nervosos: simpático, parassimpático e o somático. A integração destes sistemas
resulta em contração do músculo destrusor da bexiga urinária e o relaxamento da
musculatura lisa e estriada da uretra. As vísceras pélvicas possuem três pontos
principais de inervação: nervo pélvico, o pudendo e o hipogástrico, ou seja, os mesmos
nervos envolvidos no processo ejaculatório. O músculo destrusor da bexiga relaxa-se
pela estimulação simpática e contrai-se por estimulação parassimpática. O esfíncter
uretral interno contrai pela estimulação simpática e o externo contrai via nervo pudendo
(CAZES, 2006; TUDURY et al., 2006). A contaminação por urina, portanto, parece ser
independente da escolha do anestésico e ser conseqüência da proximidade das vias
neurais que controlam as funções da bexiga e da ejaculação (HOWARD, 1999).
2.2.1.1.8. Falha na obtenção do ejaculado e ejaculação retrógrada
Para felídeos, os relatos de obtenção de ejaculado na coleta por EEJ vão de
60,6 a 80% no gato doméstico e 100% dos procedimentos de EEJ na onça pintada e no
gato-do-mato-pequeno (PLATZ e SEAGER, 1978; MORATO et al, 1998; ERDMANN
et al., 2005; LEITE et al., 2006). Em guepardos, de 22 animais, 18 ejacularam (WILDT
et al., 1983). Em gatos domésticos, 20% dos animais não ejacularam em nenhuma das
séries (LEITE et al., 2006). Embora a obtenção de ejaculado seja freqüente, a presença
de espermatozóides no ejaculado, nem sempre é observada. Erdmann et al. (2005)
relatam que em gato-do-mato-pequeno, todas as coletas resultaram em ejaculado
contendo espermatozóides, mas a obtenção de somente plasma seminal foi relatada em
20% dos procedimentos EEJ para onças pintadas (MORATO et al., 1998).
A ejaculação retrógrada é freqüentemente observada durante ejaculação
natural ou EEJ no gato doméstico, com percentuais de 15 a mais de 90% (DOOLEY et
al., 1991). A realização de cistocentese com a visualização de células espermáticas na
urina colhida é a forma de determinar a ocorrência deste tipo de ejaculação. A
visualização de pequena quantidade de espermatozóides na urina colhida por
cistocentese é normal mesmo sem o uso de qualquer contenção farmacológica ou
estímulo ejaculatório (DOOLEY et al., 1991; TEBET, 2004; ZAMBELLI et al., 2007).
O uso da xilazina comprovadamente induz uma maior freqüência de ejaculação
retrógrada em cães (DOOLEY et al., 1990) e suínos (MARTIN et al., 2003). Um α-2
agonista semelhante à xilazina, a medetomidina, sem uso de qualquer estímulo
copulatório induziu em gatos domésticos a ejaculação retrógrada semelhantemente à
cetamina isolada (ZAMBELLI et al., 2007).
Na ejaculação antrógrada observa-se três eventos: a emissão seminal, o
fechamento do colo da bexiga e a expulsão seminal pela uretra peniana. Na ejaculação
retrógrada, há o fechamento inadequado do colo da bexiga. Assim, não há aumento de
pressão dentro da uretra prostática e o sêmen segue o caminho de menor resistência,
indo para o interior da bexiga. Qualquer processo que interfira na inervação simpática
do sistema reprodutor e da bexiga pode resultar em retroejaculação (ROMAGNOLI et
al., 1999).
O sucesso de uma coleta de sêmen em felídeos por EEJ envolve a
combinação de múltiplos fatores (QUEIROZ et al., 2004). As variações na obtenção de
ejaculados, com ou sem espermatozóides, podem estar vinculadas a vários fatores, como
os diferentes procedimentos anestésicos realizados entre autores. Além das variações
promovidas pelas combinações anestésicas utilizadas para as diferentes espécies e
protocolo de voltagens utilizado, deve-se considerar a variação individual, o
posicionamento e tamanho da sonda, a presença de fezes no reto. Para gatos domésticos,
deve ser inserido cerca de 7 a 9 cm no reto tomando-se o cuidado para que fiquem
voltados em sentido ventral, a fim de promoverem adequada estimulação do plexo
pélvico (PLATZ e SEAGER, 1978; MOREIRA eMORATO, 2007). Na EEJ é esperado
o reflexo de extensão das patas traseiras e exposição das unhas. Se o reflexo nas
primeiras sub-séries não é observado, ou a reação for exacerbada, a posição da sonda
pode não estar sendo adequada ou há interferência no estímulo elétrico pela presença de
fezes no reto (SILVA et al., 2004a; PLATZ JR. e SEAGER, 1978). No momento da
aplicação dos estímulos elétricos, a contração simétrica dos membros posteriores deve
ser observada como indicativo da aplicação dos estímulos elétricos de forma satisfatória
(HOWARD et al., 1984). A sonda deve ser pressionada contra o assoalho da ampola
retal e o aprofundamento ou a exteriorização dessa não deve ocorrer. No intervalo das
séries, a sonda deve ser retirada, as fezes da sonda devem ser limpas e uma nova
lubrificação dos eletrodos feita a cada nova inserção (PLATZ e SEAGER, 1978).
Para gatos domésticos Platz e Seager (1978), descreveram que em alguns
casos ejaculados não eram obtidos antes do terceiro bloco de estímulos. Segundo o
descrito para animais de produção, a emissão do sêmen se produz geralmente depois do
terceiro ou quarto choque. O animal tanto pode ejacular com pênis flácido, como fazê-lo
em ereção, dependendo do alcance dos estímulos. A excitação mais posterior (região
lombo-sacra) implica em resposta de ereção, e excitações dirigidas para a área mais
anterior (região lombar propriamente dita) produzem um efeito mais acentuado de
ejaculação. A excitação da região sacra ou lombo-sacra produz além do efeito eretivo, a
expulsão das secreções das glândulas acessórias. Os nervos eretores possuem origem
exatamente nesta região, constituindo-se pelo 1°, 2°, e 3° pares sacros, e dependem do
plexo hipogástrico. O plexo mesentérico posterior se relaciona de um lado com o
hipogástrico, e de outro com o espermático, desempenhando seu papel na ejaculação. A
disposição destes nervos explica porque se pode obter sêmen com pênis flácido, o que
ocorre freqüentemente; com pênis em ereção ou semi-ereção; apenas ereção sem
ejaculação ou simplesmente ejaculação de glândulas anexas. Assim, a EEJ possibilita
um resultado falso na avaliação andrológica, ou seja, falha na coleta de um macho fértil
que poderia fornecer ejaculação integral se coletado por vagina artificial (MIES FILHO,
1982). A ausência de ejaculação em um procedimento isolado não deve, no entanto,
caracterizar a incapacidade de produção espermática pelo animal. Dois procedimentos
de EEJ são necessários para uma boa avaliação andrológica de um animal pelo
procedimento de EEJ (PLATZ e SEAGER, 1978).
2.2.1.2. Vagina artificial
A coleta de sêmen por vagina artificial não é considerada um método
prático de avaliação andrológica de animais em ambiente clínico, já que há necessidade
do treinamento de 2 a 3 semanas do animal, e este treinamento é bem sucedido em
somente 60 a 70% dos casos (PLATZ e SEAGER, 1978). O gato mesmo que treinado,
se colocado em ambiente que não é o seu usual, provavelmente não ejaculará (AXNÉR
e LINDE-FORSBERG, 2002). Este método é útil para gatos domésticos de colônias
(AXNÉR e LINDE-FORSBERG, 2002) e nestas condições já foi utilizado por vários
autores (SOJKA et al., 1970; PLATZ et al., 1978; PLATZ e SEAGER, 1978; TANAKA
et al., 2000ab; TSUTSUI et al., 2000a; 2000b; 2001; SÁNCHEZ e TSUTSUI, 2002;
VILLAVERDE, 2007), entretanto, em alguns gatos com temperamento mais agressivo e
em felídeos selvagens, esta é uma prática que oferece inúmeros riscos às pessoas que
irão manipular o animal (MORATO et al., 1998; STORNELLI e STORNELLI, 2001;
AXNÉR e LINDE-FORSBERG, 2002). Uma exceção foi a coleta relatada de guepardos
por Watson em 1978 (WATSON e HOLT, 2001).
A vagina artificial para gatos domésticos é manufaturada a partir da parte
superior de borracha de um conta-gotas, cuja ponta bojuda é cortada e acoplada a um
tubo de ensaio ou coleta, podendo este ser plástico do tipo Eppendorf® sem tampa. O
tubo com a borracha deve ser encaixado em uma garrafa de polietileno de 60 mL
contendo água a 52°C, permitindo uma temperatura interna de trabalho de 44 a 46°C.
Na entrada da vagina artificial é espalhado lubrificante íntimo de uso humano. O macho
é posto em contato com uma fêmea em estro natural ou induzido e no momento da
ereção do pênis para a cópula, encaixa-se a vagina artificial, onde o ejaculado será
depositado (SOJKA et al., 1970). A coleta se completa em 1 a 4 minutos (ZAMBELLI e
CUNTO, 2006).
O mesmo resultado também é obtido sem o uso da garrafa (AXNÉR, 1998;
TANAKA et al., 2000ab; VILLAVERDE e LOPES, 2007), tornando o procedimento
mais prático. Neste caso sem a garrafa, a vagina artificial é fixada entre os dedos
indicador e médio (TANAKA et al., 2000a). TANAKA et al. (2000a) descrevem a
colocação da borracha na região interna com a fixação ao tubo com parafilme. Quando a
cobertura aquecedora (garrafa) é utilizada, o cuidado deve ser redobrado no momento
de desencaixe do tubo, afim de que a água não entre em contato com o sêmen (SOJKA
et al., 1970). Alguns autores sugerem que a vagina artificial mesmo sem a cobertura
aquecedora, deva estar aquecida a 36 °C (STORNELLI e STORNELLI, 2001), ou ainda
utilizar o tubo plástico diretamente, sem borracha, contendo 100 μL de diluidor
aquecido (STORNELLI, 2007- comunicação pessoal). STORNELLI e STORNELLI
(2001) consideram a coleta por vagina artificial um procedimento dificultoso, já que
mesmo treinados previamente e já coletados por vagina, os gatos podem não aceitá-la
em um novo procedimento. Assim, indica-se a sociabilização e o treinamento do gato
desde a puberdade para um melhor sucesso na coleta (STORNELLI e STORNELLI,
2001). Coletas com manequins inanimados (bichos de pelúcia) já foram relatadas em
machos bem treinados (VILLAVERDE, 2007).
A coleta por vagina artificial apresenta a vantagem de permitir a sua
realização de forma diária, ou em intervalos curtos regulares, diferentemente da EEJ.
Intervalos de coleta dupla (2 coletas consecutivas intervaladas por 5 a 10 minutos) por
vagina artificial de 24, 48 e 72 h foram testadas quanto ao seu efeito na qualidade
seminal, e demonstrou-se que a qualidade seminal não é afetada por até 10 dias de
coletas diárias (TANAKA et al., 2000a).
2.2.1.3. Lavagem vaginal
A lavagem vaginal para obtenção de sêmen é um método pouco prático na
rotina clínica, já que poucos gatos copulam em ambientes diferentes dos seus
domicílios. Após a cópula, é realizada a sedação da fêmea e a lavagem da vagina do
animal é feita com solução fisiológica a 37 ºC (AXNÈR, 1998). A lavagem com 1 mL
de solução salina permite a recuperação de 4 x 105 a 10 x 106 espermatozóides
(STORNELLI e STORNELLI, 2001). Este método não é muito eficiente, já que os
espermatozóides coletados podem ter sofrido alterações relacionadas à técnica utilizada.
Somente é uma boa alternativa quando os métodos de vagina artificial e
eletroejaculação não possam ser realizados ou foram realizados com insucesso
(AXNÈR, 1998).
2.2.1.4. Lavagem Epididimária
A lavagem epidimária é uma boa alternativa para obtenção de gametas de felídeos
domésticos e selvagens post-mortem (AXNÈR, 1998; AXNÈR e LINDE-FORSBERG,
2002). Este método é muito eficaz e útil, principalmente para animais de alto valor
genético e de felídeos selvagens, já que garante uma boa conservação do material
gênético dos mesmos. Este método consiste na obtenção dos espermatozóides logo após
a castração ou morte do animal, lavando o epidídimo com um diluente seminal (300 a
500 µL) para obtenção de espermatozóides da cauda ou pelo sistema de fatiamento
(AXNÈR, 1998; AXNÈR e LINDE-FORSBERG, 2002; TIRARELLI et al., 2004).
2.2.1.5. Lavagem da bexiga urinária
Pode-se também fazer a recuperação de espermatozóides da bexiga
determinando a produção espermática do animal, já que os gatos apresentam entre 15 e
90% de ejaculação de forma retrógrada (STORNELLI e STORNELLI, 2001).
Uma alternativa, ainda em estudo no gato doméstico, ao uso da EEJ é o uso
de cateter uretral associado à contenção farmacológica com medetomidina sem uso de
qualquer estímulo ejaculatório (ZAMBELLI, et al., 2007 e 2008). O contato das células
espermáticas com a urina ácida deve ser considerado a depender do destino do sêmen a
ser coletado.
2.2.2. Características Seminais
A avaliação do sêmen em gatos é normalmente superficial devido à
dificuldade de obtenção do sêmen e de seu baixo volume (JOHNSTON et al., 2001).
Apesar do volume do ejaculado obtido por EEJ ser maior (média de 0,22 mL) quando
comparado à coleta por vagina artificial (média de 0,04 mL), a concentração
espermática média obtida é de 1,68 x 108/ mL por EEJ e de 1,73 x 109/ mL por vagina
artificial, o que dificulta o fracionamento do ejaculado quando este é coletado pelo
primeiro método (AXNÈR e LINDE-FORSBERG, 2002). Portanto, o aumento da
secreção de glândulas acessória é acompanhado do decréscimo da concentração
espermática (PLATZ et al., 1978). Os valores de concentração espermática relatados na
literatura são de 9 a 198,88 x 106 sptz/mL (PLATZ et al., 1978; ZAMBELLI et al.,
2006) e de 867 x 106 sptz/mL (SILVA et al., 2004b) para coleta de sêmen por EEJ em
gatos domésticos e de até 1730 x 106 sptz/mL por vagina artificial (SOJKA et al.,
1970).
Redução no volume do ejaculado por EEJ é observado com uso da atropina
na pré-anestesia (MARTIN, 1978), e o aumento do volume pode ser observado com a
repetição das coletas (PINEDA et al., 1984), ou contrariamente, a repetição pode causar
redução no volume (AXNÈR et al., 1997). Alguns autores não incluem o volume do
ejaculado na estatística, já que o método pode afetá-lo (AXNÈR et al., 1997). O volume
do ejaculado é um dado bastante variável entre autores, protocolos de coleta e anestesia,
encontrando-se valores de 42,5 μL para isoflurano (SILVA et al., 2004b) a 738 μL no
uso da cetamina isolada (PLATZ et al., 1978).
A motilidade e o vigor espermáticos são parâmetros muito variáveis em
relação ao tempo de abstinência sexual (AXNÈR e LINDE-FORSBERG, 2002) e entre
métodos de coleta. Após EEJ, são descritos valores de 47 a 55,7% (PLATZ et al., 1978;
AXNÈR et al., 1997) de 70 a 91% (SILVA et al., 2004b; LEITE et al., 2006; TEBET et
al., 2006; ZAMBELLI et al., 2006) com grande variação entre os animais. Já o vigor
espermático médio, em geral, é descrito com valores de 3 a 5 (PLATZ et al., 1978;
AXNÈR et al., 1997; SILVA et al., 2004b; LEITE et al., 2006; TEBET et al., 2006;
ZAMBELLI et al., 2006). Com vagina artificial, relata-se de 75 a 92% de motilidade
(TANAKA et al., 2000a).
O sêmen coletado por EEJ apresenta pH mais elevado do que o coletado por
vagina artificial, provavelmente devido à maior estimulação da próstata, cujo conteúdo
é mais alcalino (DOOLEY e PINEDA, 1986). O pH varia de 6 a 9 (AXNÈR E LINDEFORSBERG, 2002; LUVONI et al., 2003). Pode-se conseguir uma melhor qualidade
com relação à morfologia e motilidade do ejaculado quando uma segunda EEJ também
composta de 3 séries é procedida dentro do mesmo período anestésico após um curto
intervalo (AXNÈR et al., 1997). Relatos comprovam que a EEJ altera a osmolaridade
do sêmen (DOOLEY e PINEDA, 1986), O sêmen felino apresenta osmolaridade em
torno de 290 a 320 mOsmol/L (AXNÈR e LINDE-FORSBERG, 2002; LUVONI et al,
2003).
O percentual médio de alterações morfológicas observado é de <2 a 59,1%
encontrado após para EEJ em gatos domésticos (PLATZ et al., 1978; AXNÈR et al.,
1997). Gatos com percentual de alterações morfológicas de 40% são considerados
normospérmicos. Entretanto, gatos com alterações morfológicas acima deste patamar
podem ainda possuir boa fertilidade após monta natural (PUKAZHENTHI et al, 2001;
AXNÈR e LINDE-FORSBERG, 2002). Quanto maior a voltagem, maior é a proporção
de líquido das glândulas acessórias no ejaculado (DOOLEY e PINEDA, 1986). A
diminuição da qualidade e o aumento de alterações morfológicas parecem estar mais
vinculadas ao aumento da secreção das glândulas acessórias (AXNÉR et al., 1998), já
que o uso da EEJ causa aumento do volume do plasma seminal quando comparado à
vagina artificial (PLATZ et al., 1978). Sabe-se que a presença do plasma seminal afeta
negativamente a habilidade de fertilização no gato doméstico (LUVONI et al., 2003).
2.2.3. Meios e Métodos de Conservação Seminal
O sêmen felino vem sendo conservado segundo o padrão adotado para
outras espécies carnívoras, com grande variação nos tipos de protocolos entre os
autores. Sabe-se que quando não diluído, o sêmen felino pode ser incubado a 37 °C
mantendo boa motilidade por 60 minutos. Este período é prolongado para 140 minutos
quando a temperatura é de 23 °C. O sêmen felino pode ser também resfriado a 5 °C ou
congelado em vapor de nitrogênio líquido e estocado a –196°C (AXNÈR, 1998;
SÁNCHEZ e TSUITSUI, 2002; LUVONI et al., 2003).
A 5 °C, o sêmen pode manter-se com boa qualidade por até 14 dias
(LUVONI et al., 2003). Os diluidores de sêmen ainda mais empregados são o Tes (NTris- metil 2- ácido sulfônico aminometano) e o Tris (hidroximetil aminometano),
isolados, seja adicionado de frutose ou glicose (HAY e GOODROWE, 1993), ou em
conjunto (Tris e Tes), constituindo o TesT (AXNÈR, 1998; SÁNCHEZ e TSUITSUI,
2002). Hay e Goodrowe (1993) também utilizaram a lactose com meio diluidor.
Sánchez e Tsuitsui (2002) utilizaram Tris adicionado de citrato de sódio e gema de ovo
na conservação a 4 °C com boa manutenção de motilidade e vigor (acima de 50%) por
até 72 horas. Grande parte dos trabalhos apresenta também diluidores acrescidos de
antibióticos como a penicilina e a estreptomicina (AXNÈR, 1998; SÁNCHEZ e
TSUITSUI, 2002; LUVONI et al., 2003), a amicacina (TEBET, 2004).
A adição do Equex® ao Tris, formando o Tris-Equex®, vem sendo testada. O
duodecil sulfato de sódio, presente no Equex®, possue função de detergente biológico
(TEBET, 2004). Novos diluidores como o MP-50, composto por rafinose, glicose,
lactose, citrato de sódio, e de potássio, EDTA, gema de ovo, leite em pó desnatado,
meios de cultivo (Meio Hepes, Meio de Dubelco’s e Meio Eagle’s Modificado),
antibiótico (amicacina) e crioprotetores (glicerol e dimetilformamida -TEBET, 2004)
também vêem sendo testados.
Para o sêmen felino resfriado, o agente crioprotetor mais comumente
utilizado é a gema de ovo, embora se afirme que sua adição não aumenta a
sobrevivência dos espermatozóides felinos quando conservados à 5°C. A sua ação
protetora se deve às lipoproteínas de membrana incluídas na sua fração de baixa
densidade, protegendo a célula por interação com a membrana plasmática. A inclusão
de monossacarídeos adiciona substrato energético, porém não representa vantagem real
na estocagem de espermatozóides felinos (LUVONI et al., 2003).
Uma grande importância é atribuída ao ajuste da osmolaridade dos
diluidores. Glover e Watson (1985) relataram turgência celular e ruptura de membrana
quando submeteram os espermatozóides felinos à solução hiposmótica, tendo sido esta
resposta mais danosa que quando células espermáticas felinas foram submetidas à
solução hiperosmótica que promoveram enrugamento celular.
A presença do plasma seminal também é relatada como danosa à célula
espermática, afetando a fertilidade. Assim, é indicada a centrifugação das amostras a
baixa rotação (300g) e subseqüente remoção do plasma seminal para prolongar o tempo
de vida da célula (LUVONI, 2003; MOREIRA e MORATO, 2007).
Nos protocolos de conservação, estes diluidores são em geral adicionados de
20% de gema de ovo (HAY e GOODROWE, 1993) e nos casos de congelação de 3%
(HAY e GOODROWE, 1993) a 4% de glicerol (ZAMBELLI et al, 2002).
Concentrações de 8% de glicerol são consideradas tóxicas aos espermatozóides felinos
(ZAMBELLI et al., 2002).
O sêmen felino inicialmente era congelado em pellets (PLATZ e SEAGER.,
1978), evoluindo para congelação em frascos (LENGWINANT e BLOTNNER, 1994),
até chegar ao protocolo padrão atual de congelação em palhetas (HAY e GOODROWE,
1993; ZAMBELLI et al., 2002, TEBET, 2004). Entretanto, a velocidade de congelação
ainda continua sendo alvo de estudos e comparações. Para tentar estabelecer a melhor
taxa de congelação, ZAMBELLI (2002) testou as taxas de 3,85; 9; 22,8; 36; 43 °C/ min
com descongelação a 37 °C/ 30 segundos, onde a taxa de 3,85 °C/ min foi superior as
demais com 61,55% de motilidade pós-descongelação.
Após a descongelação, de 25 a 50% da motilidade é mantida em leões
(Panthera leo), onças (Panthera onca), leopardo nebuloso (Neofelis nebulosa), chitas
(Acinonyx jubatus) e gatos leopardos (Prionailurus bengalensis- GRAHAM et al., 1978
apud SILVA et al., 2004a). Os mesmos autores relatam baixos índices de motilidade
após descongelação (1 a 20%) para tigres (Panthera tigris), gato do mato grande
(Oncifelis geoffroy), e jaguatirica (Leopardus pardalis). Os espermatozóides do gato
dourado africano (Felis aurata) não sobreviveram à criopreservação. Para gatos
domésticos, são relatados resultados de motilidade pós-descongelação de: 24% para
sêmen epididimário (TSUTSUI et al., 2003); 26% (TSUTSUI et al., 2000), 52,8%
(VILLAVERDE, 2007) e 70,6% (PLATZ et al., 1978) para sêmen coletado por vagina
artificial; e 70% por eletroejaculação (CHATDARONG et al.,2007).
2.2.3.1. Água de Coco
A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da
família Palmae) é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais,
açúcares, vitaminas (Anexo 3), fatores de crescimento (fitormônios) e muito pouco
fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). A água de coco contém ainda outros compostos que
mostram atividades semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas
(difeniluréia), possuindo atividades biológicas consideradas excelentes para as células
(NUNES e SALGUEIRO, 1999). O isolamento da citocinina na água de coco foi
realizado por Letham (1974) apud NUNES e COMBARNOUS (1995) e depois de
várias pesquisas, verificou-se que a auxina principal era o ácido 3-indol-acético
(LETHAM, 1974 apud NUNES e COMBARNOUS, 1995) que foi então isolada (Nunes
e Combarnous, 1995). O ácido 3-indol-acético apresentava uma ação benéfica sobre a
motilidade do sêmen de caprinos e ovinos incubado a 37 °C, e já foi empregado no teste
de termoresistência em cães (UCHOA et al., 2002).
A água de coco sofre mudanças na sua composição durante o
desenvolvimento do fruto. Fatores como grau de maturação, variedade, região e época
do ano de produção têm influência sobre as suas características físico-químicas
(JAYALEKSHMY et al., 1984, MACIEL et al., 1992 - apud MAGALHÃES et al.,
2005). Os açúcares, no início da maturação, encontram-se sob a forma de redutores
(glicose e frutose), próximo ao 6° e 7° mês, alcançando níveis máximos de 5%. Com a
maturação do fruto, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém são
formados os não redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de açúcares
totais de, aproximadamente, 2% (CAMPOS et al., 1996; JAYALEKSHMY et al., 1984
apud MAGALHÃES et al., 2005). A água de coco in natura proveniente de frutos com
idade de seis meses (variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de
500 mOsmol/L e um pH de 4,5 a 5,0 (NUNES e COMBARNOUS, 1995). Para uma
perfeita compatibilização da água de coco in natura como diluente para o sêmen, deve
ser feita uma correção da osmolaridade e pH. Para tal correção, após filtrar a água de
coco, adiciona-se água destilada e uma solução de citrato de sódio a 5% (NUNES,
1995). Em carnívoros, esta solução contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol já
foi utilizada com eficiência na congelação de sêmen canino (CARDOSO, 2001). Apesar
da água de coco ser um diluente eficiente na conservação do sêmen de diversas
espécies, é necessário preparar a solução para cada utilização. Acima de dois dias, a
água de coco apresenta um aumento de osmolaridade e diminuição do pH (dados não
publicados), não estando dentro dos padrões fisiológicos para o uso adicionado ao
sêmen das mais diversas espécies.
A fim de solucionar os problemas relacionados à estocagem e impulsionado
pelos excelentes resultados obtidos com os primeiros estudos com a água de coco in
natura na conservação, principalmente, de células espermáticas, levou-se à elaboração,
o meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP®), sendo este um produto
genuinamente nordestino. O coco é obtido numa seqüência de procedimentos iniciada
pela rigorosa seleção e higienização do produto, seguida de colheita da água de coco de
forma asséptica. Então, é realizada a filtração e o líquido é bombeado de forma contínua
para o sistema de secagem, denominado de spray dryer. A amostra seca é transformada
em pó fino e uniforme, amorfo, destituído de água livre, com alta solubilidade (NUNES
et al., 2005). A uniformidade do produto, obtida mediante rigoroso controle de
processamento, em condições específicas, leva à manutenção dos valores agregados do
endosperma líquido do coco (NUNES et al., 2005). O pó resultante final, registrado
como ACP® (ACP Biotecnologia®, Fortaleza - Ceará, Brasil), é ajustado quanto ao pH e
osmolaridade a cada espécie a ser utilizado, recebendo uma denominação numérica de
acordo com a espécie e sua utilização, que para o uso como diluidor de sêmen de felinos
é o ACP-117®. Assim, para felinos ele é formulado com pH e osmolaridade de
aproximadamente 310 mOsm/L e 8,2 respectivamente. Ele deve ser reconstituido em
água destilada, segundo as recomendações do fabricante.
O ACP® foi testado com diferentes aplicações para o sêmen de diversas
espécies, como: em eqüinos para a refrigeração (SAMPAIO-NETO et al., 2002),
diluição para inseminação artificial em caprinos caprinos (SALGUEIRO et al., 2002), e
ovinos (BRAZ et al., 2003), e também em peixes (VIEIRA et al., 2007). Em cães, para
congelação com variações nos protocolos (CARDOSO, 2005; BARBOSA, 2007;
MADEIRA, 2007), resfriamento a 4°C (MADEIRA et al., 2004; CARDOSO, 2006) e
na inseminação artificial com sêmen a fresco (UCHOA et al., 2004) e refrigerado
(UCHOA et al., 2007). Apesar dos resultados já obtidos para criopreservação de sêmen
de cães pela Equipe do Laboratório de Reprodução de Carnívoros da Universidade
Estadual do Ceará por Cardoso (2005) e de sua utilização em várias espécies, para gatos
domésticos, o ACP® ainda não havia sido utilizado.
2.2.4. Inseminação Artificial
Na década de 70 surgiram os primeiros relatos de coleta e conservação de
sêmen de gatos domésticos (PLATZ e SEAGER, 1978) e de inseminação artificial
(SOJKA, et al., 1970; PLATZ et al., 1978). Desde então, a tecnologia de sêmen vem
ganhando espaço cada vez mais crescente nos estudos de reprodução. A IA é utilizada
principalmente nos casos de problemas em acasalamentos naturais por não aceitação do
macho pela fêmea, ou o inverso, limitações físicas ou, em animais selvagens, pela
agressividade natural da espécie (LUVONI et al, 2003). Esta técnica evita o contato
entre os animais, diminuindo o risco de transmissão de doenças sexualmente
transmissíveis ou infecto-contagiosas, como vírus da imunodeficiência felina (FIV),
leucemia felina (FeLV), coronavirose, clamidiose, calicivirose, entre outros (STRÖMHOLST, 2002), inclusive a brucelose (Brucella canis) já identificada sorologicamente
em felinos domésticos (LARSSON et al., 1984).
Até os dias atuais, a coleta de sêmen de felídeos já foi realizada em pelo
menos 28 espécies (HOWARD et al., 1984), e a utilização da inseminação artificial a
partir de diferentes formas de coleta e conservação e vias de inseminação já foi
realizada em chitas (Acinonyx jubatus- HOWARD et al., 1992), na pantera nebulosa
(Neofelis nebulosa- HOWARD et al., 1996), tigres (Phantera tigris- DONOGHUE et
al., 1992), gatos leopardo (Prionailurus bengalensis- WILDT et al., 1992), pumas
(Puma concolor- BARONE et al., 1994), jaguatirica (Leopardus pardalis- SWANSON
et al., 1996), leopardo das neves (Uncia uncia- ROTH et al., 1997) e em gatos
domésticos (TSUTSUI et al., 2000a; TSUTSUI et al., 2000b; TSUTSUI et al., 2001;
VILLAVERDE, 2007; CHATDARONG et al., 2007). Entretanto um maior
desenvolvimento desta técnica está na dependência dos métodos de coleta e
conservação seminal. As inseminações artificias são na maior parte realizadas com
sêmen a fresco, muitas vezes, diluído em solução salina fisiológica (SANCHEZ e
TSUTSUI, 2002) e em poucos relatos com sêmen congelado. Por via intravaginal com
sêmen a fresco, SOJKA et al. (1970) obtiveram 50% de taxa de concepção, contra 78%
de TANAKA et al. (2000b) e 10% de PLATZ et al. (1978), neste último caso com
sêmen congelado. Por via intrauterina, foi obtida uma taxa de 50% de concepção por
HOWARD et al. (1992) e 80% por TSUTSUI et al. (2000a). Uma taxa de 57 % de
concepção foi alcançada com sêmen congelado via intrauterina por TSUTSUI et al.
(2000b). Também é relatada concepção em gatas domésticas com inseminação artificial
por via laparoscópica injetando-se o sêmen diretamente no corno uterino (MATTOS et
al, comunicação pessoal).
A IA pode ser realizada com a fêmea em estro natural ou induzido por
hormônios como o FSH (homonio folículo estimulante) ou eCG (gonadotrofina
coriônica equina). Para ambos os casos, estro natural ou induzido, faz-se uso de hCG
(gonadotrofina coriônica humana) para indução de ovulação, já que nesta espécie a
ovulação é induzida pela cópula (ZAMBELLI e MARCO, 2005). Mas apesar da gata
doméstica ser de ovulação induzida, há relatos que comprovaram a ocorrência de
ovulação sem estímulo coital nesta espécie (LAWLER et al., 1993; GUDERMUTH et
al., 1997; MADEIRA et al., 2002). Ovulações na ausência de cobertura freqüentemente
ocorrem em fêmeas de gatas domésticas criadas em grupo (POPE, 2000). A ovulação
pode ser induzida também de forma artificial durante a manipulação vaginal, como na
inseminação artificial e na colpocitologia (SCHMIDT, 1986; VERSTEGEN, 1998;
POPE, 2000). No caso de estímulo artificial com o intuito de cessar a manifestação
estral, a indução pode ser realizada com o auxílio de um swab introduzido
cuidadosamente na vagina (FELDMAN e NELSON, 1996).
Para determinar o momento adequado da IA, assim como da cobertura, os
sinais de comportamento sexual necessitam ser observados para caracterização do
momento ideal. Os sinais de estro observados são: vocalização, lateralização de cauda,
patinar de patas posteriores, rolamento, secreção vaginal , tremor de corpo e cauda,
permissão da fixação pela mordedura da nuca e penetração peniana, momento este no
qual a fêmea exarceba a patinação das patas e lateralização da cauda (SILVA et al.,
2006). O estro comportamental pode não ser observado (cio silencioso). Casos de estro
silenciosos nesta fase podem ocorrer (SCHMIDT, 1986), onde sinais de proestro e estro
não são exibidos, porém características do epitélio vaginal e a permissão da cópula
evidenciam a fase estral (ROOT et al., 1995). A inseminação artifcial na espécie felina
pode ser realizada pelas vias intravaginal e intra-uterina (cirúrgica e não cirúrgica):
a) Intravaginal: por deposição do sêmen na vagina com uma agulha 20G longa
de 9 cm contendo um bulbo e acoplado a uma seringa de 0,25mL (SOJKA et al., 1978)
ou uma sonda de nylon de 9 cm x 1,5 mm de diâmetro conectada a uma seringa de 1mL
(TANAKA et al., 2000b). É também recomendada nesta espécie a elevação do trem
posterior por 15 a 20 minutos após a inseminação a fim de minimizar o refluxo seminal.
b) Intauterina cirúrgica: por deposição do sêmen no lumen do corno uterino
atavés de laparotomia (TSUTSUI et al., 2000ab) ou laparoscopia (HOWARD et al,
1992; MATTOS et al., 2002 - comunicação pessoal). Na laparotomia o corno uterino é
exposto para injeção de sêmen por um catéter endovenoso de 20G acoplado a uma
seringa de 1mL. Para a laparoscopia, os cornos são aproximados a região ventral do
animal e a injeção pode ser realizada de forma percutânea. Tsutsui et al., em 2001,
através de sêmen fresco, realizaram a inseminação intratubárica bilateral a
aproximadamente 2 cm das fímbrias ovarianas.
c) Intrauterina não cirúrgica: por deposição do sêmen no corpo do útero de forma
transcervical usando uma sonda urinária modificada proposta por CHATDARONG et
al. (2001) ou por uma adaptação também de uma sonda urinária, acoplando-se uma
seringa de ponta romba de 0,65 mm de diâmetro por 30 mm de comprimento na
extremidade da sonda e injetando-se o sêmen aproximadamente a 2 cm cranial a cérvix,
proposto com sucesso por ZAMBELLI et al. (2001).
Em relação ao suceso da IA nas diferentes vias e pelos diferente tipos de
sêmen utilizado, o Quadro 1 traz uma compilação de dados dos da literatura,
demonstrando o percentual de gestação nos casos obtidos.
Quadro 1: Protocolos de inseminação artificial em gatas domésticas.
Tipo de estro
Método de
Tipo de
Taxa de
Autor
inseminação
sêmen
Concepção
Induzido
Laparoscopia
Fresco
34,4%
HOWARD et al, 1992
(eCG)
(intrauterino)
Natural
Laparotomia
Fresco
80,0%
TSUTSUI et al, 2000a
Congelado
57,1%
TSUTSUI et al, 2000b
(intrauterino)
Natural
Laparotomia
(intrauterino)
Natural
Intravaginal
Fresco
42,9%
SOJKA et al., 1978
Natural
Intravaginal
Fresco
77,8%
TANAKA et al., 2000b
Induzido
Intravaginal
Congelado
10,6%
PLATZ et al., 1978
Natural
Intratubárica
Fresco
42,9%
TSUTSUI et al, 2001
--------
Laparotomia
Congelado
27,3%
TSUTSUI et al.,2003
(intrauterino)
Epididimário
Transcervical
Fresco/
75 e 100%
ZAMBELLI et al., 2001
(FSH)
Induzido
Congelado
Intravaginal
Congelado
0%
VILLAVERDE, 2007
Induzido
Laparotomia
Congelado
75%
VILLAVERDE, 2007
(eCG)
(intrauterino)
Natural
Intravaginal
Fresco
33,3%
CHATDARONG et al., 2007
Natural
Transcervical
Congelado
41,7%
CHATDARONG et al., 2007
Natural
Intravaginal
Congelado
0%
CHATDARONG et al., 2007
Induzido
(eCG)
FONTE: ZAMBELLI e MARCO, 2005-modificado.
3. JUSTIFICATIVA
Nos Estados Unidos, na década de 70, segundo FRANTI et al. (1974), já
havia relatos da existência de animais de estimação, a maioria cães e gatos, em até 77%
das residências das áreas investigadas. O Brasil é o segundo país do mundo com maior
população de animais domésticos, só perdendo para os Estados Unidos. Em 2004, eram
27,9 milhões de cães, 12 milhões de gatos e 4 milhões de outros pets, com uma relação
de um cão para cada seis habitantes e um gato para cada 16 habitantes. Em 2005, eram
29 milhões de cães e 13 milhões de gatos. Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE) apontam que nos últimos quatro anos houve um aumento de 17,6%
no número de cães e gatos no Brasil. Segundo estimativas do Instituto Brasileiro de
Opinião Pública e Estatísitica (IBOPE), cerca de 59% dos domicílios possuem algum
animal de estimação, sendo que em 44% deles há pelo menos um cachorro e em 16%
pelo menos um gato. Conforme a mesma fonte, 63% das famílias das classes A e B
possuem animais de companhia. Já na classe C, este número é de 64%, e na classe D
este percentual cai para 55% (PARRA, 2007). No Nordeste, existem poucos dados
sobre a população felina, destacando-se um estudo na cidade de Recife-PE que
demonstrou que os gatos são criados em 20% dos domicílios (LIMA JÚNIOR, 1999).
Percebe-se atualmente uma demanda cada vez mais crescente dos criadores
comerciais de gatos domésticos pelas biotécnicas da reprodução, principalmente
envolvendo problemas de acasalamento natural. Entretanto, um dos maiores entraves
para a difusão destas práticas, são os protocolos de coleta e conservação de sêmen
felino. A conservação de sêmen, seja por resfriamento ou por congelação, viabiliza o
seu transporte com manutenção da qualidade seminal, facilitando significativamente a
criação comercial. Além disto, o desenvolvimento de protocolos de coleta e
conservação de sêmen utilizando o gato doméstico como modelo experimental, visa sua
a utilização em programas de conservação de espécies felídeas ameaçadas de extinção.
Para felídeos selvagens é importante que existam biotécnicas que simplifiquem a troca
de material gênico, possibilitando rápido crescimento populacional e, principalmente,
propiciando a formação de bancos de gametas e embriões nos quais este material
genético é resguardado. A tecnologia de sêmen permite também a reprodução de
animais com deficiências reprodutivas, físicas ou comportamentais quando os animais
envolvidos representam linhas genéticas que não podem ser perdidas (MORATO e
BARNABE, 1998).
Como o ACP® vem sendo utilizado com sucesso para conservação de sêmen
em diferentes espécies (SALGUEIRO et al., 2002; SAMPAIO-NETO et al., 2002;
BRAZ et al., 2003; BARBOSA, 2007; MADEIRA, 2007; VIEIRA et al., 2007), este
diluidor pode constituir-se em uma boa alternativa para conservação de sêmen de gatos
domésticos. Além disto, o aperfeiçoamento dos protocolos de coleta (vagina artificial ou
EEJ) e informações sobre a qualidade seminal de gatos domésticos mantidos sobre
fotoperíodo equatorial são necessárias para a melhor compreensão da fisiologia
reprodutiva dos animais de zonas equatoriais e aplicação de biotécnicas.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
Avaliar a andrológia, os métodos de coleta e a tecnologia do sêmen de gatos
domésticos utilizando água de coco em pó (ACP®-117).
4.2. Objetivos Específicos
•
Avaliar a analgesia e segurança da anestesia empregada na eletroejaculação;
•
Avaliar protocolos de anestesia empregada na coleta de sêmen por
eletroejaculação;.
•
Determinar possíveis relações entre a biometria da genitália externa e os
parâmetros seminais de gatos domésticos;
•
Avaliar o efeito in vitro e in vivo sobre a qualidade espermática da diluição do
sêmen felino diluído em ACP117®.
•
Avaliar in vitro o efeito sobre a qualidade espermática da congelação e
descongelação do sêmen felino diluído em ACP117®.
5. EXPERIMENTOS REALIZADOS
5.1. Capítulo 1:
Artigo enviado para publicação na Revista Ciência Animal Brasileira
Avaliação de quatro protocolos anestésicos para eletroejaculação em gatos
domésticos (Felis catus)
[Evaluation of four anesthetics protocols for electroejaculation in domestic cats (Felis
catus)]
Ticiana Franco Pereira da Silva1*, Carlos Gabriel Almeida Dias1, Janaína de Fátima
Saraiva Cardoso1, Daniel Couto Uchoa1, Ana Cristina Paulino Braga2, Camila Louise
Ackermann1, Francisco Tiago Silva Pinheiro1, Daniel Falcão Menezes Brilhante1,
Raimundo Diones Carneiro1, Leonardo Tavernezi1, Henna Roberta Quinto1, Lúcia
Daniel Machado da Silva1
1
Laboratório de Reprodução de Carnívoros-FAVET, PPGCV, UECE , Av. Paranjana,
1700, Cep 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil, Fone: (85) 31019860; Fax: (85)31019840
2
Médica Veterinária Autônoma
e-mail: * [email protected]
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança e analgesia dos protocolos
anestésicos usualmente empregados para eletroejaculação (EEJ) de gatos domésticos.
Quatorze gatos foram anestesiados com 4 protocolos e submetidos a 3 séries de choques
elétricos (2-6 mA). Os parâmetros de freqüência cardíaca, respiratória, temperatura,
sensibilidade dolorosa e reflexo palpebral foram aferidos antes e após a indução da
anestesia e durante e após a eletroejaculação. O protocolo de anestesia com isoflurano
foi o que melhor promoveu analgesia, segurança e rapidez na recuperação para EEJ em
gatos domésticos.
Palavras-chave: Eletroejaculação, gato, anestesia.
Abstract
The objective of this study was to evaluate the security and analgesia of
anesthetics protocols usually used for electroejaculation (EEJ) in domestic cats.
Fourteen toms were anesthetized with 4 protocols and submitted to a 3 series of electric
stimuli (2-6 mA). The heart rate, respiratory rate, temperature, pain sensibility and eyes
blink were analyzed prior and after induction, and during and after electroejaculation.
The anesthesia protocol that used isoflurane was the best for analgesic parameters,
security and speed of recuperation for electroejaculation in domestic cats.
Key Words: Electroejacutation, cat, anesthesia.
Introdução
A eletroejaculação (EEJ) foi desenvolvida em 1936 para ovinos, mas teve uso
científico relatado para gatos domésticos somente na década de 70 (PLATZ e SEAGER,
1978; MIES FILHO, 1982), sendo considerado o método de eleição para obtenção de
sêmen felino, especialmente para felídeos silvestres, já que permite o manuseio do
animal vivo (MORAIS et al., 2002). Este método possibilita análises andrológicas em
animais de alto valor genético ou animais silvestres que não permitem avaliação sem
anestesia devido à sua agressividade ou por não serem treinados para ejaculação em
vagina artificial (MORATO e BARNABE, 1998) e baseia-se na indução do reflexo
ejaculador através de estímulos elétricos, com a introdução de uma sonda trans-retal
conectada a um estimulador elétrico, no assoalho da ampola retal do animal (SILVA et
al., 2004a).
Diferentes protocolos de estímulos elétricos já foram desenvolvidos, porém os
mais utilizados são o método de Wildt et al. (1983), inicialmente descrito para chitas, e
o de Howard et al. (1984), descrito para 28 espécies de felídeos. Os dois métodos são
utilizados para gato doméstico e, em ambos os casos, após anestesia são aplicados 80
estímulos elétricos divididos em três séries, fornecendo-se de 2 a 6V.
A EEJ é considerada pela maior parte dos autores um procedimento simples,
rápido e prático (PLATZ e SEAGER, 1978; MORAIS et al., 2002; MORATO et al.,
2002). Embora os primeiros estudos em felinos silvestres tenham sido realizados
somente com a contenção física sem auxílio de anestesia (CARVALHO, 1968; MIES
FILHO et al., 1974), aos moldes do realizado para animais de produção, a EEJ em
felinos, seja em domésticos ou silvestres, necessita da aplicação de anestésicos para
contenção do animal, evitando riscos à equipe, mas implicando ao animal os riscos
envolvidos no procedimento anestésico.
Dentre os protocolos anestésicos mais utilizados para EEJ em gatos domésticos e
felídeos silvestres encontram-se o uso de cloridrato de cetamina (PLATZ e SEAGER,
1978) e as associações de cloridrato de cetamina e xilazina (MORAIS et al., 2002) e
tiletamina e zolazepam (MORAIS et al., 2002; MORATO et al., 2002; TEBET et al.,
2006). Outros fármacos utilizados isoladamente ou em associações também já foram
utilizadas com este propósito para gatos domésticos, tais como: tiletamina, zolazepam e
morfina; tiletamina, zolazepam, butorfanol e acepromazina (TEBET et al., 2006);
cetamina e medetomidina (AXNÉR et al., 1998; ZAMBELLI et al., 2007); propofol
(CHATDARONG et al., 2006); propofol e buprenofina (CHATDARONG et al., 2006);
indução anestésica com propofol e anestesia epidural com lidocaína (LEITE et al.,
2006) ou anestesia inalatória com indução anestésica à base cetamina, diazepam,
tiopental sódico e manutenção anestésica com isoflurano (SILVA et al., 2004b). Além
do variável número de combinações farmacológicas, observam-se também variações de
doses entre autores. O uso de diferentes associações em diferentes doses torna difícil a
comparação da eficiência entre os protocolos mais utilizados, bem como dos efeitos
fisiológicos causados pelas combinações farmacológicas utilizadas.
Após constatar-se que há grande variedade nos protocolos anestésicos utilizados
para EEJ em gatos domésticos, o objetivo deste trabalho foi avaliar quatro diferentes
associações anestésicas, em relação à manutenção dos parâmetros fisiológicos
promovendo analgesia, segurança e rapidez de recuperação para EEJ em gatos
domésticos.
Material e Métodos
1. Animais
Foram previamente selecionados para a etapa 1 do experimento 14 gatos machos
púberes sem raça definida (SRD), com peso entre 3 e 5 Kg, provenientes do gatil
experimental da Universidade Estadual do Ceará (3º 44’ de latitude Sul e 38° 34’ de
longitude Oeste), submetidos a 12 horas diárias de luz natural. Os animais foram
mantidos em gaiolas individuais e alimentados com ração comercial de manutenção
para gatos (Kitekat®- Éffem®, Brasil), recebendo água potável à vontade.
2. Protocolos anestésicos
Etapa 1:
Os mesmos animais foram submetidos a uma coleta por EEJ para cada protocolo
anestésico testado, respeitando-se intervalo mínimo de 15 dias entre cada coleta do
mesmo animal. Os animais foram previamente submetidos a jejum alimentar de 24h e
hídrico de 12h e, após serem pesados, foram contidos farmacologicamente com
associações de cloridrato de cetamina e xilazina (protocolo A); cloridrato de tiletamina e
zolazepam (protocolo B); de cloridrato de tiletamina e zolazepam tramadol (protocolo
C); ou indução da anestesia com cloridarato de cetamina e diazepam, e manutenção com
isoflurano (protocolo D). Quando necessário, após a indução anestésica e antes da
intubação, os animais eram submetidos à máscara com isoflurano dissolvido em
oxigênio medicinal. Para a intubação foi utilizada lidocaína spray a 10% para
dessensibilização da laringe, cânulas de 4 ou 4,5 mm de diâmetro interno, e circuito
semi-aberto de Baraka, conectados a um vaporizador universal. Após a perda do reflexo
de endireitamento postural, uma veia foi canulada para administração de soro
fisiológico 0,9% (NaCl), permitindo a reposição do anestésico por via intravenosa na
velocidade de 22 gotas/min até o erguimento espontâneo da cabeça e tentativa por parte
do animal de levantar-se.
Tabela 1: Descrição do número de animais, fármacos, doses e via de administração dos
protocolos anestésicos utilizados.
Protocolo
N°
Fármacos
animais
A
B
13
13
Via de
Dose
administração
cloridrato de cetamina1
IM
15 mg/kg
cloridrato de xilazina2
IM
1 mg/kg
cloridrato de tiletamina e
IM
15 mg/kg
IM
15 mg/kg
cloridrato de tramadol4
IM
2 mg/kg
cloridrato de cetamina1
IM
15 mg/kg
diazepam5
IM
1mg/Kg
isoflurano6
inalatória
-
zolazepam3
C
13
cloridrato de tiletamina e
3
zolazepam
D
14
IM= intramuscular
1
Dopalen®,Vetbrands®, Brasil
2
Anasedan®, Vetbrands®, Brasil
3
Zoletil®, Virbac, Brasil e Telazol®, Fort Dodge Saúde Animal Ltda ®, Brasil
4
Sylador®, Sanofi Synthelabo Ltda®, Brasil
5
Compaz®, Cristália®, Brasil
6
Isoforine®, Cristália®, Brasil
As freqüência cardíaca (bpm) e respiratória (mrm), a temperatura retal (°C), a
sensibilidade dolorosa e o reflexo palpebral foram aferidos antes da anestesia, após 10
minutos da aplicação de todos os fármacos, durante as séries de choques elétricos, em
cada intevalo de série de choques e aos 5, 10, 30 e 60 minutos após o término da última
série de choques. Em todos os procedimentos anestésicos os animais foram
acompanhados quanto aos parâmetros fisiológicos citados até a tentativa espontânea de
erguer a
cabeça e manter-se na posição de estação. A sensibilidade dolorosa foi
avaliada através da avaliação de parâmetros como reflexo de retração ao pinçamento
interdigital dos membros anteriores ou posteriores; vocalização perceptível na caixa
torácica ao momento da auscultação ou vocalização audível sem auxílio de aparelhos.A
entrada em plano anestésico era considerada quando o animal não mais apresentava
sensibilidade dolorosa. A qualquer momento da EEJ no qual o plano anestésico não
fosse mantido a suplementação da anestesia era realizada por via intravenosa (IV) com
metade da dose inicial calculada, até obtenção do plano anestésico ideal. Para o
protocolo C somente a combinação tiletamina e zolazepam foi complementada.
Os protocolos anestésicos utlizados em cada animal foram distribuídos de forma
aleatória, não havendo uma seqüência pré-definida.
Etapa 2:
Nesta etapa foram utilizados 4 gatos adultos, dos quais 1 já havia participado da
etapa 1. Foi procedido 1 protocolo anestésico anteriormente descrito por animal
(protocolo A, n = 1; B, n = 1; C, n = 1; D, n =1). Realizou-se monitoração contínua da
saturação funcional de oxigênio (SpO2) utilizando oxímetro de pulso digital, através de
sensor localizado na língua do animal nos momentos após a anestesia antes dos choques
elétricos, durante, nos intervalos e após os choques elétricos. O equipamento facilitou o
monitoramento da freqüência cardíaca e permitiu a visualização da representação
gráfica de ondas pletismográficas com derivação DII (Oxifast 9504®, Takaoka®),
permitindo um melhor acompanhamento de possíveis alterações cardíacas e
respiratórias ao longo da EEJ.
3. Coleta do sêmen
Para a obtenção do sêmen foi utilizado um eletroejaculador portátil (Eletrojet®Electrovet®-Brasil), acoplado a uma sonda trans-retal (13 x 1 cm) com os eletrodos
voltados para o assoalho da ampola retal, previamente lubrificado com gel inócuo à base
de um polímero carboxivinílico. Após a entrada em plano anestésico, o reto foi limpo de
bolos fecais e a sonda introduzida cerca de 5 a 7 cm no reto dos animais, e então foram
aplicados 80 estímulos elétricos divididos em 3 séries. Na primeira série, 10 estímulos
sucessivos de 20, 30 e 40 mA. Na segunda, 10 estímulos de 30, 40 e 50 mA e na
terceira, estímulos de 50 e 60 mA. Cada estímulo elétrico durou entre 2 e 3 segundos, e
entre cada série, foi realizado um intervalo de 5 minutos.
3. Análise Estatística
Os parâmetros fisiológicos das freqüência cardíaca, respiratória e temperatura
retal antes, após anestesia até 60 min pós-EEJ foram expressos na forma de média ±
erro padrão. O reflexo palpebral e a sensiblidade dolorosa foram descritos
subjetivamente. Os parâmetros freqüência cardíaca, respiratória e temperatura retal após
anestesia até 60 min pós-EEJ foram comparados entre os protocolos por ANOVA,
seguido de teste de Fisher PLSD. Para todos os parâmetros, considerou-se p<0,05 (Stat
View for Windows®, SAS Institute Inc., Versão 5.0, 1998).
Resultados e Discussão
Considerando-se
que
o
gato
doméstico
é
modelo
experimental
para
desenvolvimento de protocolos de conservação de sêmen a serem utilizados em
programas de conservação de espécies felídeas ameaçadas de extinção, optou-se por 4
protocolos anestésicos que permitissem administração inicial por via IM. Os parâmetros
fisiológicos de freqüência cardíaca, respiratória e temperatura não puderam ser aferidos
em todos os animais. Por características próprias da espécie, alguns animais
apresentavam-se inquietos e agressivos após o deslocamento do gatil ao laboratório, não
permintindo a manipulação para aferição de temperatura e auscultação cardiorespiratória; ou ainda no sentido inverso, ronronando e não permitindo a aferição
cardíaca. Em alguns casos, nos quais as aferições foram possíveis, o estresse também
alterou sensivelmente a freqüência respiratória, já que a frequência respiratória normal
do gato não submetido à anestesia é de 20 a 30 mrm (KELLY, 1986). Assim, as
comparações estatísticas dos parâmetros fisiológicos só foram realizadas a partir de 10
min após de anestesia. Os resultados obtidos após a anestesia e durante a EEJ para
freqüência cardíaca e respiratória e temperatura retal encontram-se descritos na Tabelas
2, 3 e 4 respectivamente.
Após 60 min do final da EEJ, em todos os protocolos testados, os valores de
temperatura encontravam-se em limites aceitáveis para gatos que foram submetidos a
procedimentos anestésicos, não denotando significado clínico relevante, haja vista que a
diminuição de temperatura é esperada com o uso das associações de cetamina e xilazina
e tiletamina e zolpazepam (SANTOS et al., 2004). Segundo ERDMANN (2005) os
valores de temperatura obtidos no presente trabalho durante a EEJ encontram-se dentro
do limite de segurança para felídeos.
O reflexo palpebral esteve presente ao longo de toda anestesia nos protocolos B e
C, todavia, no protocolo A, observou-se diminuição deste reflexo em 1 animal e
ausência antes da EEJ em outro animal, que foi recuperado após o início da EEJ. No
protocolo D o reflexo palpebral alternou ausência e presença ao longo da EEJ em 13 dos
14 animais testados. Considerando-se que a manutenção do reflexo palpebral é desejada
nas anestesias dissociativas e se constitui em um bom indicativo do não
aprofundamento indesejado da anestesia, as observações no protocolo D com presença
de reflexo indicam que o plano anestésico não estava sendo alcançado satisfatoriamente
ao longo de toda a EEJ (ANDRADE et al., 2002).
Tabela 2: Freqüência cardíaca (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tempos de
avaliação
Antes da Anestesia
10 min após
1ª série
1° Intervalo
2ª série
2° Intervalo
3ª série
5 min após EEJ
10 min após EEJ
30 min após EEJ
60 min após EEJ
A
(bpm)
Protocolos anestésicos
C
B
(bpm)
(bpm)
D
(bpm)
(n=13)
(n=13)
(n=13)
(n=14)
193,00 ± 11,52
142,00 ± 5,59a
153,45 ± 6,11a
138,18 ± 5,77a
161,45 ± 4,95ad
137,45 ± 7,52a
173,82 ± 9,21a
137,45 ± 6,48a
138,00 ± 7,30a
134,73 ± 5,29a
124,73 ± 9,10a
171,00 ± 13,64
167,00 ± 8,73ac
187,11± 9,77b
192,00 ± 15,49b
179,11 ± 10,30ac
185,33 ± 12,45bc
182,22 ± 6,54a
180,00 ± 11,33b
195,08 ± 7,40b
192,44 ± 10,10bc
217,78 ± 15,80b
165,60 ± 16,47
174,00 ± 10,42cb
200,00 ± 6,70b
191,56 ± 11,02b
194,22 ± 6,70bc
200,00 ± 16,30b
172,00 ± 15,52a
187,11 ± 13,85b
180,62 ± 11,93b
194,78 ± 9,56b
199,11 ± 9,47b
169,00 ± 14,27
155,00 ± 14,84ac
127,83 ± 20,60a
138,33 ± 22,68a
133,17 ± 22,90d
149,83 ± 24,53ac
148,17 ± 25,69a
126,83 ± 20,62a
151,36 ± 11,89a
126,83 ± 18,53ac
146,67 ± 6,98a
A: protocolo de anestesia dissociativa de cetamina + xilazina;
B: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam;
C: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam + tramadol;
D: protocolo de anestesia inalatória (indução com cetamina + diazepam e manutenção com isoflurano);
a,b,c,d- letras diferentes representam diferenças entre colunas; (P<0,05)
Tabela 3: Freqüência respiratória (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tempos de
avaliação
Antes da Anestesia
10 min após
1ª série
1° Intervalo
2ª série
2° Intervalo
3ª série
5 min após EEJ
10 min após EEJ
30 min após EEJ
60 min após EEJ
A
(mrm)
Protocolos anestésicos
C
B
(mrm)
(mrm)
D
(mrm)
(n=13)
(n=13)
(n=13)
(n=14)
71,20 ± 5,57
18,14 ± 4,11a
24,29 ± 2,63a
15,43 ± 1,84ad
24,00 ± 2,31a
16,57 ± 1,62ac
21,86 ± 1,46a
18,43 ± 1,38ac
21,14 ± 1,44ab
25,71 ± 2,74a
30,29 ± 4,85a
50,40 ± 6,00
22,00 ± 1,71a
22,67 ± 1,98a
23,33 ± 1,23bc
23,33 ± 1,61a
24,67 ± 1,91b
24,67 ± 1,91a
26,00 ± 2,25bd
26,67 ± 2,23a
28,00 ± 2,73a
40,00 ± 5,56a
67,33 ± 9,43
15,33 ± 1,41a
22,44 ± 1,99a
18,78 ± 1,10cd
22,89 ± 1,21a
20,44 ± 1,94cb
22,78 ± 0,94a
22,11 ± 1,67cd
24,00 ± 2,00ab
23,33 ± 3,02a
29,89 ± 4,90a
52,75 ± 5,22
20,56, ± 9,69a
8,44 ± 2,62b
12,44 ± 2,71a
9,56 ± 3,58b
10,78 ± 2,90a
12,11 ± 4,04b
17,89 ± 2,37c
19,67 ± 2,19b
20,22 ± 1,94a
32,78 ± 9,82a
A: protocolo de anestesia dissociativa de cetamina + xilazina;
B: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam;
C: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam + tramadol;
D: protocolo de anestesia inalatória (indução com cetamina + diazepam e manutenção com isoflurano);
a,b,c,d- letras diferentes representam diferenças entre colunas; (P<0,05)
Tabela 4: Temperatura retal (média ± erro padrão) de gatos submetidos à
eletroejaculação após anestesia com 4 diferentes protocolos.
Tempos de
avaliação
Antes da Anestesia
10 min após
1ª série
1° Intervalo
2ª série
2° Intervalo
3ª série
5 min após EEJ
10 min após EEJ
30 min após EEJ
60 min após EEJ
A
(°C)
Protocolos anestésicos
B
C
(°C)
(°C)
D
(°C)
(n=13)
(n=13)
(n=13)
(n=14)
38,58 ± 0,40
39,20 ± 0,15a
38,93 ± 0,08a
38,75 ± 0,19a
38,58 ± 0,21a
38,37 ± 0,16a
37,96 ± 0,17a
37,61 ± 0,17a
38,58 ± 0,40a
39,20 ± 0,15a
38,93 ± 0,08a
37,30 ± 0,37
38,30 ± 0,15a
37,50 ± 0,16bc
37,30 ± 0,17a
37,30 ± 0,17ac
37,29 ± 0,24b
37,08 ± 0,20bc
36,84 ± 0,24bc
37,30 ± 0,37b
38,30 ± 0,15a
37,50 ± 0,16bc
38,30 ± 0,00
38,40 ± 0,15a
38,10 ± 0,17ac
37,80 ± 0,18a
37,80 ± 0,17ac
37,82 ± 0,13c
37,43 ± 0,15ac
36,90 ± 0,27c
38,30 ± 0,00c
38,40 ± 0,15a
38,10 ± 0,17ac
37,50 ± 0,45
38,43 ± 0,47a
38,20 ± 0,31c
37,97 ± 0,50a
37,50 ± 0,30bc
37,50 ± 0,15bc
37,01 ± 0,22bc
37,10 ± 0,32ac
37,50 ± 0,45bc
38,43 ± 0,47a
38,20 ± 0,31c
A: protocolo de anestesia dissociativa de cetamina + xilazina;
B: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam;
C: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam + tramadol;
D: protocolo de anestesia inalatória (indução com cetamina + diazepam e manutenção com isoflurano);
a,b,c,d- letras diferentes representam diferenças entre colunas;
A,B- letras diferentes representam diferenças linhas (tempos avaliados x parâmetros antes da anestesia).
P<0,05
Como o protocolo de anestesia inalatória (D) fez uso da intubação do animal para
fornecimento de oxigênio medicinal e permitiu a regulação do volume de anestésico a
ser fornecido ao paciente, a ocorrência e conseqüente manutenção do animal em
bradipinéia, como ocorrido no protocolo D durante os choques, ou sem reflexo
palpebral é menos preocupante do ponto de vista anestésico que no protocolo A e C,
desde que mantidos batimentos cardíacos regulares, como apresentado. O uso da
combinação cetamina e xilazina é uma prática comum na anestesia de pequenos
animais, embora o grau de analgesia possa ser questionável de acordo com o
procedimento (FANTONI et al., 1999). Sabidamente a xilazina apresenta efeitos
cardiopulmonares que incluem bradicardia; redução do débito cardíaco e aumento
inicial da pressão arterial seguido de hipotensão duradoura, devido aos seus efeitos
sedativos de α-2 agonista, os quais nem sempre são contrabalançados pela ação
simpatomimética da cetamina usada em associação anestésica com a xilazina
(ANDRADE et al., 2002). Assim como afirmado por ERDMANN (2005) com o uso da
combinação xilazina com tiletamina e zolazepam para EEJ, um menor controle da dor
com os protocolos A, B e C podem justificar as elevações de freqüência cardíaca e
respiratória em vários momentos de observação. Os valores obtidos para freqüência
cardíaca estão dentro dos limites normais para gatos domésticos submetidos à anestesia
(CISTOLA et al., 2004).
A adição do tramadol à combinação tiletamina e zolazepam (protocolo C) foi
usada em substituição à morfina utilizada na combinação anestésica anteriormente
descrita por Tebet et al. (2006) para EEJ de gatos domésticos. Estes autores não
descreveram os efeitos desta associação ao longo da EEJ e detiveram-se aos aspectos de
coleta seminal e criopreservação. Tebet (2004) citou que o protocolo tiletamina,
zolazepam e morfina foi considerado mais adequado à EEJ de gatos domésticos do que
a mesma associação sem o uso de opióide pois, além dos resultados satisfatórios de
colheita de sêmen, promoveu tranqüilidade dos animais sem ocorrências de vocalização
ou quaisquer sinais de desconforto. A decisão de substituir a morfina pelo tramadol no
protocolo testado no presente trabalho foi devida aos efeitos analgésicos similares dos
dois fármacos, evitando os efeitos indesejados de bradicardia da morfina. Além disto, o
tramadol possui apresentação comercial de mais fácil acesso, podendo ser empregado
futuramente com maior facilidade do que a combinação tiletamina, zolazepam e
morfina. O tramadol, ainda pouco empregado clinicamente em gatos domésticos, já
demonstrou ser bastante seguro para a espécie em dose até duas vezes maior que a
utilizada no presente trabalho (BRAGA, 2007).
Interferências na auscultação cardíaca no momento da EEJ e arritmias transitórias
logo após uma série de EEJ levaram à realização da Etapa 2 (Tabela 5), onde percebeuse que a SpO2 diminuiu considerável e abruptamente no momento dos choques elétricos
no animal submetido à anestesia dissociativa com o protocolo A. A SpO2, que estava em
torno de 90 a 93%, caiu a 47 a 58%, considerado um valor preocupante durante uma
anestesia, todavia após o fim da EEJ os valores retornaram aos valores iniciais. É
possível que a queda na oxigenação seja dificultada pelas contrações abdominais e/ou
torácicas que os animais apresentam no momento do choque elétrico em conjunto com a
distensão dos membros posteriores. Isto pode se constituir um risco quando o animal já
possui limitações respiratórias não detectáveis antes da anestesia. No animal submetido
ao protocolo B os valores de SpO2 de 78 a 97% após anestesia, mas antes do choque
elétrico, decaíram a 59 a 86% durante a série de choques. No protocolo C os valores
mantiveram-se praticamente constantes, entre 89 a 98%, antes e ao longo dos choques
elétricos. No animal submetido ao protocolo D com anestesia inalatória também não foi
observada queda preocupante na SpO2 (82 a 98%); desta forma, pode-se concluir que o
comprometimento temporário dos movimentos respiratórios provavelmente não afetou a
SpO2, já que o animal continuou passivamente recebendo oxigênio medicinal (100%)
via traqueotubo. Quanto ao traçado da onda pletismográfica, foram observados traçados
compatíveis com os protocolos utilizados, com presença de taquicardia sinusal nos
protocolos dissociativos (NUNES, 2002). Contudo, no momento da EEJ independente
do protocolo utilizado, foram observados em alguns momentos traçados estranhos, que
causaram impossibilidade de leitura. À auscultação logo após o final da série de EEJ no
qual o traçado anormal era observado havia taquicardia sem evidências de arritmia,
sugerindo interferência na leitura da condutividade elétrica do coração pelos estímulos
elétricos gerados pelo equipamento utilizado para EEJ. As aferições em aparelhos deste
tipo sofrem interferências com movimentos (MORATO et al., 2002). As arritmias
transitórias observadas na Etapa 1 não foram evidenciadas em nenhum dos 4 animais
utilizados na Etapa 2.
De todos os protocolos testados no presente estudo somente a anestesia inalatória
(protocolo D) foi capaz de eliminar a dor de forma efetiva, haja vista que a vocalização
audível sem auxílio de aparelhos, um dos sinais mais evidentes de desconforto e dor, foi
observada em 3, 2 e 2 animais dos respectivos protocolos A, B e C. Para eliminar a
sensibilidade dolorosa, seja pelo reflexo de retração ao pinçamento interdigital, ou pela
vocalização, foram necessárias novas aplicações dos fármacos dissociativos antes de
iniciar a EEJ ou no seu transcurso. No protocolo A, 10 animais receberam uma única
dose da combinação anestésica. No protocolo B, somente 1 animal não necessitou de
complementação. No protocolo C, somente 2 não necessitaram de reforços. A
necessidade de complementações anestésicas pode ser o desencadeante dos tempos de
recuperação encontrados para os protocolos testados. No protocolo A, a tentativa
espontânea de erguer a cabeça e manter-se na posição de estação foi observada entre 60
e 229 min após o final da EEJ, enquanto nos protocolos B e C, de 30 a 90 min, e no D,
de 30 a 60 min. A recuperação anestésica foi acompanhada de intensa excitação em 1
animal nos protocolos A e B. Uma grande vantagem do uso do protocolo anestésico D,
frente ao A, B e C é a alta potência do isoflurano e o maior controle do plano anestésico.
A indução e recuperação são rápidas, além do fato do efeito tempo não ser um limitante,
já que devido à sua baixa solubilidade do isoflurano somente 0,2% do fármaco é
biotransformado, gerando ausência de efeitos cumulativos e conseqüente baixa
toxicidade renal e hepática (CASSU e LUNA, 2003).
Tabela 5: Saturação de oxigênio (SpO2) de gatos submetidos à eletroejaculação após
anestesia com 4 diferentes protocolos antes, durante e nos intervalos da EEJ.
Tempos de
avaliação
A
Antes da EEJ
91,67 ± 0,88
Protocolos anestésicos
B
C
90,18 ± 1,63
D
97,00 ± 0,00
96,00 ± 2,00
49,00 ± 1,53
72,39 ± 1,63
95,00 ± 1,29
Durante a EEJ
Intervalos e
91,67 ± 0,88
93,60 ±0,82
97,50 ± 0,50
após a EEJ
A: protocolo de anestesia dissociativa de cetamina + xilazina (n= 1);
95,00 ± 1,29
94,26 ± 0,69
B: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam (n= 1);
C: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina + zolazepam + tramadol (n= 1);
D: protocolo de anestesia inalatória (indução com cetamina + diazepam e manutenção com
isoflurano- n= 1);
Os protocolos dissociativos de cetamina/xilazina e tiletamina/zolazepam foram
descritos como seguros e eficazes para EEJ de diversas espécies de felídeos (MORAIS
et al., 2002; MORATO et al., 2002). Nestas duas combinações anestésicas a xilazina
pode ser revertida por antagonistas como a ioimbina (ANDRADE et al., 2000; EMÍLIO
et al., 2004) e o zolazepam pelo flumazenil, acelerando o tempo de retorno anestésico e
inibindo os efeitos indesejados desses fármacos. O uso de reversor não foi avaliado no
presente trabalho, já que não houve necessidade de seu uso e desejava-se avaliar o
tempo de recuperação espontânea. Embora os protocolos dissociativos sejam mais
práticos e menos onerosos em relação aos custos de equipamentos e fármacos é preciso
avaliar a dose a ser utilizada e os riscos implicados a ela de acordo com o paciente a ser
eletroejaculado.
O intervalo de 15 dias entre coleta e anestesia não causou efeitos indesejados para
a maioria dos animais no presente trabalho, com exceção à convulsão observada em um
animal após o final da EEJ no protocolo A (cetamina e xilazina). Este animal apresentou
outras crises convulsivas somente mais de 6 meses após o final dos 4 procedimentos de
EEJ, responsivas à fenobarbital, em momentos de transporte ou estresse. O zolazepam e
o diazepam usados nos protocolos B, C e D são importantes agentes anti-convulsivantes
(ANDRADE et al., 2002). Assim, em um paciente epilético, pode-se creditar à ausência
de um anti-convulsivante, associado ao uso de um fármaco sabidamente excitatório
(cetamina) à possível causa da convulsão apresentada. Platz e Seager (1978) relataram
que a EEJ com anestesia utilizando-se a cetamina pode ser executada rotineiramente
uma vez por semana sem efeitos causados pela anestesia ou pela inserção da sonda no
reto do animal.
Conclusão
O protocolo de anestesia inalatória com indução anestésica com cetamina,
diazepam e manutenção com isoflurano foi o que melhor promoveu analgesia,
segurança ao procedimento anestésico e à equipe e rápida recuperação, para EEJ em
gatos domésticos.
Agradecimentos
Ao CNPQ, à CAPES e à FUNCAP pelo custeio do experimento e pelas bolsas de
pesquisas concedidas. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza pela concessão
das vacinas anti-rábicas aplicadas nos animais.
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5.2. Capítulo 2:
Artigo aceito para publicação na Revista Ciência Animal
Comparação de quatro protocolos anestésicos para a coleta de sêmen por
eletroejaculação em gatos domésticos
(Comparison of four anesthetic protocols for semen collection by electroejaculation in
domestic cats)
Ticiana Franco Pereira da Silva1*, Carlos Gabriel Almeida Dias1, Janaína de Fátima
Saraiva Cardoso1, Daniel Couto Uchoa1, Ana Cristina Paulino Braga2, Camila Louise
Ackermann1, Francisco Tiago Silva Pinheiro1, Daniel Falcão Menezes Brilhante1,
Raimundo Diones Carneiro1, Leonardo Tavernezi1, Henna Roberta Quinto1, Lúcia
Daniel Machado da Silva1
1
Laboratório de Reprodução de Carnívoros-FAVET, PPGCV, UECE , Av. Paranjana,
1700, Cep 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil, Fone: (85) 31019860; Fax: (85)31019840
2
Médica Veterinária Autônoma
e-mail: * [email protected]
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar quatro protocolos de anestesia para a coleta
de sêmen em gatos domésticos por eletroejaculação (EEJ). Quatorze gatos foram
anestesiados com cetamina/ xilazina (protocolo A), tiletamina/ zolazepam (protocolo
B), tiletamina/ zolazepam e tramadol Protocolo C), e isoflurano (protocolo D) e foram
submetidos a 3 séries de choques elétricos (20 – 60 mA). Os parâmetros de qualidade
seminal, volume, a presença de espermatozóides e a contaminação por urina foram
avaliados para todos os protocolos após eletroejaculação. O sucesso na obtenção de
ejaculado foi de 84,62% (11/13); 92,31% (12/13); 92,31% (12/13) e 100% (14/14),
respectivamente para os protocolos A, B, C e D. Diferenças significativas entre os
grupos foram encontradas para motilidade, vigor e volume seminal. O protocolo de
anestésico com isoflurano é eficientemente indicado para coleta de sêmen por
eletroejaculação em gatos domésticos.
Palavras-chave: Eletroejaculação, anestesia, gato.
Abstract
The aim of this study was to compare four anesthetics protocols for semen
collection by electroejaculation in domestic cats. Fourteen tom cats were anesthetized
with ketamine/ xylazine (protocol A), tiletamine/ zolazepam (protocol B), tiletamine/
zolazepam and tramadol (protocol C), and isofluorane (protocol D) and submitted to a 3
series of electric stimuli (20 – 60 mA). The parameters of semen quality, volume,
spermatozoa presence and urine contamination were analyzed for all protocols after
electroejaculation. The success in ejaculated obtaining was 84.62% (11/13); 92.31%
(12/13); 92.31% (12/13) and 100% (14/14), respectively to A, B, C e D protocols.
Significant diferences in motility, vigour and seminal volume were observed among
groups. The inalatory anesthetic protocol with isofluorane is efficiently indicated for
semen collection in domestic cats by electroejaculation.
Key Words: Electroejaculation, anesthesia, cat.
Introdução
A eletroejaculação (EEJ) é considerada o método de eleição para obtenção de
sêmen felino. Este método possibilita análises andrológicas em animais de alto valor
genético ou animais silvestres que não permitem avaliação sem anestesia devido à sua
agressividade ou por não serem treinados para ejaculação em vagina artificial
(MORATO e BARNABE, 1998) e baseia-se na indução do reflexo ejaculador através
de estímulos elétricos, com a introdução de uma sonda trans-retal conectada a um
estimulador elétrico, no assoalho da ampola retal do animal (SILVA et al., 2004a). A
EEJ é considerada, pela maioria dos autores, um procedimento simples, rápido e prático
(MORAIS et al., 2002). É uma técnica útil para avaliação andrológica do animal em
ambiente clínico, já que o treinamento para a coleta do sêmen por vagina artificial pode
levar de duas a três semanas, obtendo-se sucesso em apenas 60 a 70% dos casos
(PLATZ e SEAGER, 1978).
Para felinos, os protocolos de estimulação elétrica não apresentam grandes
diferenças (WILDT et al., 1983; HOWARD et al., 1984), entretanto os protocolos
anestésicos utilizados variam de acordo com os autores, que na grande maioria optam
por um único protocolo de anestesia para coleta. Entre estes protocolos para EEJ em
gatos domésticos e felídeos silvestres são citados: cloridrato de cetamina (PLATZ e
SEAGER, 1978) e as associações de cloridrato de cetamina e xilazina (MORAIS et al.,
2002); tiletamina e zolazepam (MORAIS et al., 2002; MORATO et al., 2002; TEBET et
al., 2006); tiletamina, zolazepam e morfina; tiletamina, zolazepam, butorfanol e
acepromazina (TEBET et al., 2006); cetamina e medetomidina (AXNÉR et al., 1998;
ZAMBELLI et al., 2007); propofol (CHATDARONG et al., 2006), propofol e
buprenofina (CHATDARONG et al., 2006); indução anestésica com propofol e
anestesia epidural com lidocaína (LEITE et al., 2006), ou anestesia inalatória com a
indução anestésica à base cetamina, diazepam, tiopental sódico e manutenção anestésica
com isoflurano (SILVA et al., 2004b). Alguns autores atribuem parte do sucesso na
coleta, ou seja, boa qualidade seminal, volume suficiente para análise e/ou conservação
e ausência de contaminação do ejaculado por urina ao protocolo de anestesia empregado
(ZAMBELLI et al., 2007; TEBET, 2004). O uso de diferentes associações torna difícil a
comparação da eficiência entre os protocolos mais utilizados. Assim, o objetivo deste
trabalho foi comparar quatro protocolos de anestesia para coleta de sêmen em gatos
domésticos por eletroejaculação.
Material e Métodos
1. Animais
Foram utlizados 14 gatos machos púberes sem raça definida (SRD), com peso
entre 3 e 5 Kg, provenientes do gatil experimental da Universidade Estadual do Ceará
(3º 44’ de latitude Sul e 38° 34’ de longitude Oeste), estando os animais submetidos a
12 horas diárias de luz natural. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e
alimentados com ração comercial de manutenção para gatos (Kitekat®- Éffem®, Brasil),
recebendo água à vontade.
2. Anestesia
Os animais foram submetidos a uma coleta por EEJ por protocolo anestésico
testado, respeitando-se um intervalo mínimo de 15 dias entre cada coleta do mesmo
animal. Os animais foram previamente submetidos a um jejum alimentar de 24h e
hídrico de 12h, e após serem pesados, foram contidos farmacologicamente com
associações de cloridrato de cetamina (15 mg/Kg - Dopalen®,Vetbrands®, Brasil) e
cloridrato de xilazina (1 mg/Kg - Anasedan®, Vetbrands®, Brasil), por via IM (n=13 –
protocolo A); cloridrato de tiletamina e zolazepam (15 mg/Kg - Zoletil ®, Virbac, Brasil
e Telazol®, Fort Dodge Saúde Animal Ltda ®, Brasil) por via IM (n=13 – protocolo B);
cloridrato de tiletamina e zolazepam (15 mg/Kg), e tramadol (2 mg/Kg - Sylador®,
Sanofi Synthelabo Ltda®, Brasil) por via IM (n=13 – protocolo C); e indução anestésica
com cloridarato de ketamina (15 mg/Kg) e diazepam (1mg/Kg - Compaz®, Cristália®,
Brasil) por via IM, e manutenção em isoflurano (Isoforine®, Cristália®, Brasil - n=14 –
protocolo D). Após a indução anestésica, quando necessário, antes da intubação os
animais eram submetidos à máscara com isoflurano dissolvido em oxigênio medicinal.
Para a intubação foi utilizada lidocaína spray a 10% para dessensibilização da laringe,
cânulas de 4 ou 4,5 mm de diâmetro interno e circuito semi-aberto de Baraka,
conectados a um vaporizador universal. Após a perca da reação de endireitamento
postural, uma veia foi canulada para administração de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9%,
permitindo a reposição do anestésico por via intravenosa.
Em todos os procedimentos anestésicos, os animais foram acompanhados quanto
aos parâmetros fisiológicos até a tentativa espontânea de erguer a cabeça e manter-se
em estação. A qualquer momento da EEJ no qual o plano anestésico não fosse mantido,
a suplementação da anestesia era realizada por via IV com metade da dose inicial
calculada, até obtenção do plano anestésico ideal. Para o protocolo C, somente a
combinação tiletamina e zolazepam foi complementada.
3. Coleta de sêmen
Para coleta do sêmen, foi utilizado um eletroejaculador portátil (Eletrojet® Electrovet®-Brasil), acoplado a uma sonda trans-retal (13 x 1 cm) com os eletrodos
voltados para o assoalho da ampola retal, previamente lubrificado com gel inócuo à base
de um polímero carboxivinílico. Após a entrada em plano anestésico, o reto foi limpo de
bolos fecais e a sonda introduzida cerca de 5 a 7 cm no reto dos animais, e então foram
aplicados 80 estímulos elétricos divididos em 3 séries. Na primeira série, 10 estímulos
sucessivos de 20, 30 e 40 mA. Na segunda, 10 estímulos de 30, 40 e 50 mA e na
terceira, estímulos de 50 e 60 mA. Cada estímulo elétrico durou entre 2 e 3 segundos, e
entre cada série, foi realizado um intervalo de 5 minutos. O ejaculado de cada série de
estímulos foi coletado em tubos plásticos de 1,5 mL
4. Análise do sêmen
Afim de evitar possíveis alterações por conta do tempo transcorrido até o final do
procedimento de EEJ, imediatamente após cada série, os ejaculados, foram observados
em relação às características macroscópicas de volume e coloração, e microscópicas de
presença ou não de células espermáticas, porcentagem de espermatozóides móveis
(motilidade) e o vigor espermático (0 a 5), em microscopia de luz (100 e 400x).
Amostras com suspeita de contaminação por urina foram mensuradas quanto ao pH
através de fitas (D52348, Macherey-Nagel®, Alemanha). A porcentagem de alterações
morfológicas espermáticas foi avaliada em microscópia óptica de contraste de fase
(1000x) por coloração de uma alíquota do sêmen em Rosa de Bengala. Os
espermatozóides foram classificados como normais ou anormais quando apresentavam
algum defeito de acrossoma, cabeça, peça intermediária ou cauda. Os ejaculados
contendo células espermáticas do mesmo animal (1ª e 2ª série) em cada protocolo foram
mantidos em banho-maria a 37°C e misturados à 3ª série somente para a mensuração da
concentração espermática, através de uma câmara de Neubauer em microscópio óptico
(400x).
5. Análise Estatística
Os parâmetros de volume, motilidade, vigor, concentração e alterações
morfológicas foram expressos para o procedimento de EEJ somando-se os resultados
das 3 séries na forma de média e desvio padrão. A motilidade, após conversão em arcoseno, e o volume foram comparados entre os protocolos e/ou séries pelo teste t-Student
e o vigor pelo teste de Mann Whitney. Para todos os parâmetros, considerou-se p<0,05
(Stat View for Windows®, SAS Institute Inc., Versão 5.0, 1998).
Resultados
Todos os 14 animais ejacularam com conteúdo espermático em pelo menos uma
série da coleta, mostrando possuírem produção seminal. A obtenção de ejaculado no
procedimento de EEJ foi de 84,62% (11/13); 92,31% (12/13); 92,31% (12/13) e 100%
(14/14), respectivamente para os protocolos A, B, C e D. Nos protocolos A e B, mais de
¼ das séries de EEJ resultou em falha de ejaculação. No C, mais de 80% das séries
resultou em ejaculação; ao passo que no protocolo D, o inverso foi observado. A
ejaculação contendo células espermáticas foi observada independentemente da série
(voltagem) executada.
O volume médio do ejaculado quando analisado quanto à presença ou não de
células espermáticas, não diferiu entre os protocolos (Tab. 1).
Para o cálculo de motilidade e vigor médios, os ejaculados contendo baixa
concentração espermática (uma a quatro células em todos os campos observados) não
foram considerados. A tabela 2 traz os resultados de motilidade e vigor obtidos para os
protocolos.
A coloração das séries do ejaculados variou de transparente a esbranquiçado (n=
122 séries do ejaculado), com exceção das amostras contaminadas por urina que
apresentavam coloração amarelada (n= 4 séries do ejaculado). Estes ejaculados com
urina foram obtidos nos protocolos A e D. Nestes casos, o pH do ejaculado obtido foi 7
e 8, enquanto que nas outras séries de EEJ no mesmo protocolo para o mesmo animal o
pH foi igual a 9. A contaminação com urina ocorreu em um animal nas duas primeiras
séries de EEJ do protocolo de anestesia inalatória, nas quais foi obtido plasma seminal
(400 e 140 μL); e em outro animal na 2ª (10 μL) e 1ª série (110 μL) dos protocolos A e
D, respectivamente, nas quais foi obtido ejaculado contendo células espermáticas.
A concentração espermática média para os protocolos A e C, foi respectivamente
de 460 e 258 x 106 sptz/ mL. A avaliação de concentração não foi efetuada nos
protocolos B e D. Em relação à morfologia espermática foram obtidos: 55,47% ± 27,05;
85,03% ± 21,17; 35,63% ± 5,13; e 46,82% ± 17,74 de anormalidades, respectivamente
para os grupos A, B, C e D, predominando o defeito de cauda enrolada.
Discussão
Para felídeos, os relatos de obtenção de ejaculado na coleta por EEJ são de 100%
na onça pintada, utilizando tiletamina e zolpazepam (MORATO et al., 1998), 100% no
gato-do-mato-pequeno, utilizando tiletamina zolazepam e xilazina (ERDMANN et al.,
2005) e 80% no gato doméstico, utilizando indução anestésica com propofol e anestesia
epidural com lidocaína (LEITE et al., 2006). Assim como no presente trabalho, a
presença de espermatozóides no ejaculado nem sempre é observada. A obtenção de
somente plasma seminal foi relatada para onças pintadas em 20,4% dos procedimentos
de EEJ. ERDMANN et al. (2005) relataram que em gato-do-mato-pequeno, todas as
coletas resultaram em ejaculado contendo espermatozóides, sendo portanto a EEJ um
procedimento satisfatório para confirmar a produção seminal dos animais. A ausência
de ejaculação em um procedimento isolado não deve, no entanto, caracterizar a
incapacidade de produção espermática pelo animal. Segundo PLATZ e SEAGER
(1978), duas EEJ são necessárias para uma boa avaliação andrológica de um animal. Já
LEITE et al. (2006) relataram que 20% dos animais não ejacularam em nenhuma das
séries, entretanto, somente uma EEJ foi procedida por animal. As variações na obtenção
de ejaculados com ou sem espermatozóides podem estar vinculadas a vários fatores,
entre eles os diferentes procedimentos anestésicos realizados entre autores. No presente
trabalho, a obtenção de ejaculados parece não ter sido influenciado pela anestesia. A
EEJ não é só utilizada para avaliação andrológica, mas principalmente para obtenção de
sêmen para estudos de conservação e inseminação artificial (PLATZ e SEAGER, 1978;
TEBET et al., 2006). Assim, a obtenção de um ejaculado contendo espermatozóides
torna-se essencial. Por este ponto de vista, utilizando-se o protocolo B (tiletamina e
zolazepam), obteve-se menos freqüentemente ejaculado contendo espermatozóides
móveis (5,13%) e mais freqüentemente somente plasma seminal (64,10%). Já utilizando
o protocolo D, obteve-se um sucesso maior em relação à obtenção do ejaculado
(11,90% de ausência de ejaculação) e este contendo espermatozóides móveis (40,48%).
A ocorrência de contaminação por urina em 14,28 % das EEJ pelo protocolo D e
em 7,69% pelo protocolo A, ambas confirmadas pela coloração e pH mais baixo que do
ejaculado contaminado, é considerada normal. O sêmen coletado por EEJ apresenta pH
mais elevado do que o coletado por vagina artificial, provavelmente devido à maior
estimulação da próstata, cujo conteúdo é mais alcalino (DOOLEY e PINEDA, 1986).
Assim, a queda do pH no ejaculado contendo urina não é tão acentuada, como foi
observado no presente trabalho (pH= 7 e 8 com urina e pH=9 sem urina).
A
contaminação por urina no ejaculado após EEJ em gato doméstico é mais
freqüentemente relatada com uso de voltagens superiores a 8V (PINEDA e DOOLEY,
1984) ou com o uso de combinações anestésicas contendo acepromazina (MARTIN,
1978). Procedimentos de EEJ em gato-do-mato-pequeno mostraram que em planos
anestésicos muito profundos ou muito superficiais a incidência de contaminação por
urina é maior (TEBET, 2004). De acordo com HOWARD (1993), o uso de anestésicos
inalatórios pode relaxar a musculatura ao redor da bexiga, facilitando a ejaculação com
urina. Entretanto, a contaminação do ejaculado por urina na EEJ de jaguatiricas
utilizando tiletamina, zolazepam não diferiu das anestesiadas com a mesma combinação
suplementadas com isoflurano (QUEIROZ et al., 2004). Experimento anterior de EEJ
com o uso de anestesia inalatória com isoflurano e indução anestésica com cetamina,
diazepam, tiopental sódico de parte dos mesmos animais utilizados no presente trabalho,
não observou a contaminação por urina descrita com o protocolo D (SILVA et al.,
2004b).
A contaminação do ejaculado por urina não é um fenômeno fisiológico, entretanto
a ejaculação retrógrada é freqüentemente observada durante ejaculação natural ou EEJ
no gato doméstico (DOOLEY et al., 1991; TEBET, 2004; ZAMBELLI et al., 2007). No
presente trabalho, nas séries sem obtenção de ejaculado ou com ejaculação de pequeno
volume, somente de plasma seminal e com concentração baixa de células espermáticas é
possível que a ejaculação retrógrada tenha ocorrido. Entretanto, não foi realizada
cistocentese dos animais, para a verificação de células espermáticas na urina de forma a
confirmar a ejaculação retrógrada. A visualização de pequena quantidade de
espermatozóides na urina colhida por cistocentese é normal em gatos mesmo sem o uso
de qualquer contenção farmacológica ou estímulo ejaculatório (ZAMBELLI et al.,
2007). Uma repetição do experimento com cistocentese seria interessante para
evidenciar se as EEJ realizadas com o protocolo A, contendo xilazina, induziriam ou
não nos animais uma maior freqüência de ejaculação retrógrada, já que este fenômeno
ocorre com o uso da xilazina em cães (DOOLEY et al., 1990), mas não em suínos
(MARTIN et al., 2003).
O sucesso de uma coleta de sêmen em felídeos por EEJ envolve a combinação de
múltiplos fatores (QUEIROZ et al., 2004). Além das variações promovidas pelas
combinações anestésicas utilizadas para as diferentes espécies e protocolo de voltagens
utilizado, deve-se considerar a variação individual, o posicionamento e tamanho da
sonda, e a presença de fezes no reto. No presente trabalho, o reflexo de extensão das
patas foi observado em todos os estímulos, para todos os animais em todos os
protocolos, aventando-se que mesmo nas séries em que não houve ejaculação, o
estímulo elétrico foi fornecido satisfatoriamente. Na EEJ, é esperado o reflexo de
extensão das patas traseiras. Se o reflexo nas primeiras sub-séries não é observado, ou a
reação for exacerbada, a posição da sonda pode não estar sendo adequada ou há
interferência no estímulo elétrico pela presença de fezes no reto (PLATZ e SEAGER,
1978; SILVA et al., 2004a). Assim como relatado por PLATZ e SEAGER (1978), a
inserção da sonda no reto do animal e aplicação de choques elétricos nesta região em
intervalos de até 1 semana, não promoveu no presente trabalho efeitos indesejados. O
volume médio obtido após a EEJ, para todos os protocolos pode ser considerado baixo.
Grandes volumes só foram observados quando houve contaminação por urina (100 –
400 μL). Redução no volume do ejaculado por EEJ é observado com uso da atropina na
pré-anestesia (MARTIN, 1978), e o aumento do volume pode ser observado com a
repetição das coletas (PINEDA et al., 1984), ou a repetição pode causar redução no
volume (AXNÉR et al., 1997). Alguns autores não incluem o volume do ejaculado na
estatística, já que o método de coleta pode afetá-lo (AXNÉR et al., 1997). O volume do
ejaculado é um dado bastante variável entre autores, protocolos de coleta e anestesia,
indo de 77 a 738 μL no uso da cetamina isolada (PLATZ e SEAGER, 1978), 140 μL
para associações à base de tiletamina e zolazepam (TEBET et al., 2006), e 42,5 μL para
isoflurano (SILVA et al., 2004b).
A EEJ mostrou-se satisfatória para determinação da ocorrência de produção
seminal pelos animais utilizados, visto que nem todos haviam sido previamente
coletados por vagina artificial ou qualquer outro método. A qualidade média dos
ejaculados pode ser considerada normal para a espécie já que resultados de motilidade
para o gato doméstico após EEJ são bastante variáveis (47% a 91%- PLATZ e
SEAGER, 1978; LEITE et al., 2006;) Valores de 80 a 100% de motilidade foram
observados em pelo menos 8 animais em 1 ou mais de 1 protocolo. Todos os animais
em pelo menos 1 ejaculado de cada série individual apresentou resultado de motilidade
≤ 50% distribuído entre os protocolos, parecendo não haver efeito de 1 ou mais animais
naturalmente com melhor ou pior qualidade seminal, mas sim do procedimento de EEJ,
o qual proporcionou uma grande variação na motilidade observada. Já o vigor
espermático médio, está abaixo dos valores descritos para os diferentes protocolos,
sendo observado em geral valores de 3 a 5 (AXNÉR et al., 1997; TEBET et al., 2006;
ZAMBELLI et al., 2007).
A utilização de tubos de coleta à temperatura ambiente (aproximadamente 28°C) e
não pré-aquecidos (37°C) pode ter contribuído para uma discreta diminuição da
qualidade seminal em algumas amostras. Porém, o tempo da coleta de cada série até a
analise não parece ser suficiente para determinar significativa queda de qualidade em
todos os procedimentos (PLATZ e SEAGER, 1978; SILVA et al., 2004a). Bons
resultados de qualidade após EEJ foram obtidos por TEBET et al. (2006), utilizando
tubos coletores mantidos à temperatura ambiente (não descrita) e processamento do
sêmen após a EEJ.
O percentual de alterações morfológicas observadas está dentro do limite médio
de <2 a 59,1% encontrado após EEJ em gatos domésticos (PLATZ e SEAGER, 1978;
AXNÉR et al., 1997). Relatos comprovam que a EEJ altera a osmolaridade do sêmen
(DOOLEY e PINEDA, 1986), o que pode ter influenciado na predominância de defeitos
de cauda enrolada. A diminuição da qualidade e aumento de alterações morfológicas
parecem estar mais vinculadas ao aumento da secreção das glândulas acessórias
(AXNÉR et al., 1998), já que o uso da EEJ causa aumento do volume do plasma
seminal quando comparado à vagina artificial (PLATZ e SEAGER, 1978) e sabe-se que
a presença do plasma seminal afeta negativamente a habilidade de fertilização no gato
doméstico (LUVONI et al., 2003). Quanto maior a voltagem, mais líquido de glândulas
acessórias (DOOLEY e PINEDA, 1986).
Salienta-se que os animais do presente trabalho foram submetidos em ordem
aleatória aos protocolos anestésicos para realização da EEJ. Assim, diminui-se a
possibilidade do efeito da ordem da coleta, avaliando-se somente o uso da associação
anestésica. O aumento da secreção de glândulas acessória é acompanhado do
decréscimo da concentração espermática (PLATZ e SEAGER, 1978), entretanto os
valores de concentração espermática obtidos foram superiores aos relatados na literatura
(9 a 198,88 x 106 sptz/mL- PLATZ e SEAGER, 1978; ZAMBELLI et al., 2007) para
coleta de sêmen por EEJ em gatos domésticos, assemelhando-se aos resultados
anteriormente obtidos em parte do mesmo grupo experimental para anestesia com
isoflurano (867 x 106 sptz/mL- SILVA et al., 2004b). Estas diferenças podem se dever a
fotoperiodicidade do gato doméstico, já que os diferentes experimentos podem ter sido
realizados em localizações geográficas e estações do ano distintas, influenciando na
concentração espermática obtida (STORNELLI, 2007).
Modificações no número de séries e intensidade de estímulos partindo-se de um
protocolo base (TEBET, 2004), a realização de uma segunda EEJ em um mesmo plano
anestésico após alguns minutos (AXNÉR et al., 1997) e o uso de sondagem uretral
durante o procedimento da EEJ (HERRON et al., 1986; TEBET, 2004) são alternativas
já descritas a fim de melhorar volume e a qualidade do ejaculado ou facilitar a
manipulação de pequenos volumes em gatos domésticos. A obtenção no tubo coletor de
pequenos volumes foi bastante comum no presente trabalho, e uma alternativa ao uso do
cateter foi a pipetagem, em alguns casos, do líquido aderido entre a mucosa peniana e o
prepúcio, diminuindo as perdas.
Quando a obtenção de um volume suficiente de ejaculado contendo
espermatozóides móveis de boa qualidade é considerada não somente para avaliação
andrológica, mas para o processamento do sêmen por métodos de refrigeração e/ou
criopreservação, o uso do protocolo anestésico B para EEJ resulta nos piores resultados.
O protocolo D apresenta o inconveniente de necessitar do uso de um equipamento e de
um profissional treinado para realização da anestesia, utilizando também maior
quantidade de combinações farmacológicas, tornando o protocolo mais oneroso e menos
prático. Apesar destes incovenientes, para uso clínico, apresenta boa relação custobenefício, diminuindo riscos anestésicos no procedimento de EEJ quando realizado em
animais de alto valor zootécnico, financeiro e/ou afetivo. O protocolo A, permite a
coleta na maior parte das séries de EEJ, entretanto a qualidade da analgesia e segurança
desta combinação anestésica é inferior à do protocolo D (SILVA et al., dados não
publicados). O protocolo C mostra-se como uma alternativa no uso de uma anestesia
dissociativa e apresenta no geral resultados semelhantes aos protocolos A e D.
Conclusão
O protocolo de anestesia inalatória com a indução anestésica com cetamina,
diazepam e manutenção com isoflurano é eficientemente indicado para coleta de sêmen
por eletroejaculação em gatos domésticos.
Agradecimentos
Ao CNPQ, à CAPES e à FUNCAP pelo custeio do experimento e pelas bolsas de
pesquisas concedidas. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza pela concessão
das vacinas anti-rábicas aplicadas nos animais.
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Tabela 1: Volume médio (± DP) do ejaculado (com ou sem espermatozóides), máximos
e míninos obtidos na eletroejaculação em gatos domésticos utilizando quatro diferentes
protocolos anestésicos.
Protocolos anestésicos
Ejaculado
A
B
C
D
(μL)
Com espermatozóides
Sem espermatozóides
8,64 ± 7,10
14,50 ± 19,55
10,24 ± 6,05
51,07 ± 106,63
(5 - 25)
(4 - 90)
(4 - 20)
(5 - 400)
13,24 ± 10,89
11,25 ± 4,79
18,62 ± 28,72
18,70 ± 26,85
(5 - 40)
(5 - 15)
(2 - 105)
(4 - 110)
A: protocolo de anestesia dissociativa de cetamina e xilazina (n=28 ejaculados);
B: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina e zolazepam (n=29 ejaculados);
C: protocolo de anestesia dissociativa tiletamina, zolazepam e tramadol (n=32
ejaculados);
D: protocolo de anestesia inalatória (indução com cetamina, diazepam e manutenção
com isoflurano - n= 37 ejaculados).
(P>0,05)
Tabela 2: Média ± DP do volume, da motilidade e vigor espermáticos obtidos na
eletroejaculação em gatos domésticos utilizando quatro diferentes protocolos
anestésicos.
Parâmetros
Protocolos anestésicos
Volume
Motilidade
Vigor
(μL)
(%)
(0 - 5)
A
11,43 ± 9,71a
42,73 ± 25,92a
2,66 ± 1,21ab
B
14,41 ±17,94a
46,67 ± 50,33ab
1,67 ± 1,44a
C
10,50 ± 8,88a
54,64 ± 40,78ab
2,93 ± 1,82ab
D
30,95 ± 69,28a
55,73 ± 29,32b
3,08 ± 1,22b
A: anestesia dissociativa de cetamina e xilazina (n=15 ejaculados);
B: anestesia dissociativa tiletamina e zolazepam (n=3 ejaculados);
C: anestesia dissociativa tiletamina, zolazepam e tramadol (n=14 ejaculados);
D: anestesia inalatória (indução com cetamina, diazepam e manutenção com isoflurano n=22 ejaculados).
a,b
Letras diferentes representam diferença entre linhas (P<0,05).
5.3. Capítulo 3:
Artigo enviado para publicação na Revista Brasileira de Zoociências
Biometria da genitália externa e parâmetros seminais de gatos domésticos
mantidos em fotoperíodo equatorial natural
Ticiana Franco Pereira da Silva*,Camila Louise Ackermann, Francisco Tiago Silva
Pinheiro, Leonardo Tavernezi, Lúcia Daniel Machado da Silva
Laboratório de Reprodução de Carnívoros - FAVET, PPGCV, UECE
Av. Paranjana, 1700, Cep 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil
Fone: (85) 3101-9860; Fax: (85)3101-9840
e-mail: *[email protected]
Resumo: Para gatos domésticos, poucas informações estão disponíveis sobre o volume
testicular e se este parâmetro pode ou não predizer o potencial reprodutivo de um
animal. O objetivo do trabalho foi avaliar os parâmetros seminais e biometria da
genitália externa em gatos domésticos submetidos ao fotoperíodo equatorial natural e
verificar a ocorrência de correlações entre eles. Quinze gatos machos púberes foram
treinados à ejaculação em vagina artificial. O sêmen dos 7 machos que se adaptaram ao
método de coleta foi avaliado quanto aos parâmetros de volume, coloração, motilidade e
vigor espermático, concentração espermática, número total de espermatozóides e
porcentagem de alterações morfológicas. Após anestesia, foi realizada aferição da
consistência, volume testicular, e comprimento peniano, verificação do aspecto e da
presença ou ausência de espículas penianas. O teste de correlação de Spearman foi
aplicado, porém o volume testicular não apresentou correlações com os parâmetros de
concentração espermática, n° total de espermatozóides, volume seminal, peso corporal,
comprimento peniano e grau de espículas penianas. Conclui-se que em condições de
fotoperíodo equatorial natural, os valores de volume testicular não é indicado nesta
espécie, até o momento, para predizer outros parâmetros reprodutivos.
Palavras-chave: concentração espermática, volume testicular, vagina artificial e felino.
Abstract: In domestic cats, few information about testicular volume are avaiable and if
this parameter can predict or not the reproductive potencial of an animal. The aim of
this study was to analyze the sperm parameters and the genital biometrie of domestic
cats under natural equatorial photoperiod and verify the existence of correlation among
then. Fifteen tom cats were trained to ejaculate in artificial vagina. The semen of the
seven one that had the best adaptation was analyzed for the parameters of volume, color,
motility, vigour, sperm concentration and the percentual of abnormal spermatozoa. The
analyses of testicular consistence, testicular volume, penis length and presence of penis
spines were done under anesthesy. The Spearman rank correlation coefficient was
applied, but the parameters of sperm concentration, total number of spermatozoa,
seminal volume, body weight, penis length and penis spines degree were not correlated
with testicular volume. In conclusion, under natural equatorial photoperiod, until the
moment, the testicular volume is not indicated as predictive test for another
reproductive paramethers.
Key words: sperm concentration, testicular volume, artificial vagina and feline.
INTRODUÇÃO
Sabe-se que o volume testicular é uma forma utilizada para predizer a
capacidade reprodutiva em ruminantes (BALEY et al., 1998). Cerca de 70-80% da
massa testicular constitui-se de túbulos seminíferos, podendo o volume testicular refletir
a espermatogênese (GOULETSOU et al., 2007). O volume testicular é usualmente
calculado durante exame andrológico de carnívoros silvestres, desde felídeos
(MORATO et al., 1999; MORAIS et al., 2002; ERDMANN et al., 2005), a quatis
(QUEIROZ, 2007) e também primatas (PAZ et al., 2006). Em cães, poucos e
divergentes estudos foram realizados abordando a relação entre as características
seminais e parâmetros biométricos da genitália externa (OLAR et al., 1983;
ENGLAND, 1991). Nesta espécie, na raça Pastor Alemão, a circunferência escrotal não
foi correlacionada com a concentração espermática (CORTEZ et al., 2002). Para gatos
domésticos, poucas informações estão disponíveis sobre o volume testicular
(JOHNSTON et al., 2001; TEBET, 2004), em especial aquelas que indiquem que o
parâmetros biométricos da genitália externa possam ou não predizer o potencial
reprodutivo de um animal.
A estacionalidade reprodutiva observada em outras espécies animais ainda é
controversa nos machos de gatos domésticos. Segundo Stornelli (2007), esta está
diretamente relacionada com o número de horas de luz diárias (fotoperíodo) a qual os
animais estejam submetidos em localizações geográficas onde exista marcada variação
da duração do dia durante o ano. Entretanto, trabalhos realizados através de coletas
epididimárias ao longo do ano em diferentes localizações afirmam não haver variação
na qualidade ou quantidade de espermatozóides recuperados de gatos domésticos (38°
de latitude norte - SPINDLER & WILDT, 1999) até a ocorrência de moderada
sazonalidade (52° de latitude norte - BLOTTNER & JEWGNOW, 2007). Em condições
equatoriais, não foram encontradas informações sobre a qualidade espermática ou
sazonalidade de gatos domésticos, sendo as informações limitadas ao comportamento
sexual das fêmeas da mesma espécie durante os períodos chuvoso (SILVA et al., 2006)
e seco (MACIEL, 2006). Informações sobre a qualidade seminal de gatos domésticos
mantidos sobre fotoperíodo de 12h de luz/dia são necessárias para a melhor
compreensão da fisiologia reprodutiva dos animais de zonas equatoriais e aplicação de
biotécnicas.
Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar a existência de correlação
entre os parâmetros seminais e biometria da genitália externa em gatos domésticos
submetidos ao fotoperíodo equatorial natural.
MATERIAL E MÉTODOS
ANIMAIS
Foram utlizados 15 gatos machos púberes sem raça definida (SRD),
provenientes do gatil experimental da Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza/ Ceará
(3º 44’ de latitude sul e 38° 34’ de longitude oeste, clima equatorial semi-úmido e
aproximadamente 12h diárias de luz natural ao longo do ano). Os animais foram
mantidos em gaiolas individuais e alimentados com ração comercial de manutenção
para gatos (Kitekat®- Éffem®, Brasil), recebendo água à vontade. Todos os animais já
haviam sido previamente submetidos à coleta de sêmen por eletroejaculação (EEJ), e
ejacularam com conteúdo espermático em pelo menos uma coleta, mostrando possuírem
produção espermática. Os animais antes de cada coleta por EEJ foram pesados em
balança mecânica.
COLETA DE SÊMEN
As coletas foram realizadas entre maio de 2006 a junho de 2007. Todos os
animais foram antes submetidos a um período de treinamento de no mínimo 2 meses (2
a 3 tentativas de coleta por semana) para ejaculação em vagina artificial. A vagina
artificial foi manufaturada utilizando-se o dispositivo de borracha de um conta-gotas
acoplado a um tubo plástico de 1,5 mL desprovido de tampa. Para a coleta do sêmen por
este método, o animal era solto no seu ambiente de coleta para demarcação territorial e
reconhecimento da área, e então, apresentado a uma gata em estro natural, sendo-lhe
permitido cortejar a fêmea. O estro foi determinado como o momento da aceitação de
cópula, quando a fêmea permitia a fixação pela nuca e lateralização da cauda em resposta à
tentativa de intromissão peniana, entretanto a cópula para todos os casos foi impedida pelo
observador.
Por ocasião da monta, inicialmente o observador com a mão enluvada
realizou massagem peniana com os espaços interdigitais indicador e médio ou médio e
anelar para que o macho viesse a ejacular sobre a luva, permitindo uma melhor
adaptação ao manuseio de pênis durante a coleta. Após um período para a aceitação da
coleta sobre a luva, a vagina artificial era posicionada entre os dedos de forma a permitir
a penetração do pênis do gato, vindo este a ejacular no interior do tubo, sendo o sêmen
imediatamente destinado à avaliação. Os tubos de coleta foram trocados quando
necessário, até que fosse obtido ejaculado contendo células espermáticas. Durante o
treinamento, alterações comportamentais (ausência de libido, desistência da coleta, não
aceitação da vagina artificial ou agressividade frente às gatas ou manipulador) foram
observadas.
MORFOBIOMETRIA
A morfobiometria foi realizada após anestesia para coleta de sêmen por
EEJ. Para este procedimento foram previamente submetidos a um jejum alimentar de
24h e hídrico de 12h, e foram contidos farmacologicamente com uma das associações:
cloridrato de cetamina (15 mg/Kg - Dopalen®,Vetbrands®, Brasil) e cloridrato de
xilazina (1 mg/Kg - Anasedan®, Vetbrands®, Brasil), por via IM; cloridrato de
tiletamina e zolazepam (15 mg/Kg - Zoletil ®, Virbac, Brasil e Telazol®, Fort Dodge
Saúde Animal Ltda ®, Brasil) por via IM; cloridrato de tiletamina e zolazepam (15
mg/Kg), e tramadol (2 mg/Kg - Sylador®, Sanofi Synthelabo Ltda®, Brasil) por via IM;
e indução anestésica com cloridarato de cetamina (15 mg/Kg) e diazepam (1mg/Kg Compaz®, Cristália®, Brasil) por via IM, e manutenção em isoflurano (Isoforine®,
Cristália®, Brasil).
Imediatamente após a coleta por EEJ, foi procedida a limpeza e secagem da
genitália externa (testículos, prepúcio e pênis) com um papel toalha não áspero quando
necessário. A aferição do volume testicular (VT- cm3) foi realizada com paquímetro
(comprimento, largura e espessura em cm), O volume testicular foi calculado pela
fórmula: VT= C x L2 x 0,524, sendo C= comprimento, L= largura e 0,524 a constante
para cálculo de áreas esferóides. O VT dos animais foi expresso por testículo, e também
o volume testicular total (VTT), sendo este a soma dos volumes testiculares de cada
animal (MORAIS et al., 2002). Foi também raelizada palpação para determinação de
sua consistência em duros, firmes ou normais e flácidos (MOREIRA & MORATO,
2007).
O pênis foi exposto para verificação do aspecto (presença de aderências ou
lesões), formato (cônico), comprimento (cm) e da presença ou ausência de espículas
penianas classificadas, segundo MORAIS et al. (2002) em graus, variando de 0
(ausência) a 3 (tamanho de aproximadamente 0,75mm).
ANÁLISE DO SÊMEN
Imediatamente após a coleta do sêmen, foram observadas as características
macroscópicas de volume (através de micropipetas de 2 a 50μL) e coloração; e
microscópicas: porcentagem de espermatozóides móveis (motilidade) e o vigor
espermático (0 a 5), através de microscopia de luz (100x e 400x). Uma alíquota foi
destinada à mensuração da concentração espermática (106 sptz/mL), através de uma
câmara de Neubauer em microscópio óptico de luz (400x). O número total de
espermatozóides foi calculado a partir da concentração espermática e volume do
ejaculado. A porcentagem de alterações morfológicas espermáticas foi avaliada em
microscópia de contraste de fase (1000x) por coloração em Rosa de Bengala
(CARDOSO, 2005), sendo os espermatozóides classificados como normais ou anormais
quando apresentavam algum defeito de acrossoma, cabeça, peça intermediária ou cauda.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os parâmetros de motilidade, vigor, volume, concentração espermática,
número total de espermatozóides, alterações morfológicas, volume testicular,
comprimento peniano e grau de espículas penianas foram expressos na forma de média
e desvio padrão. O aspecto peniano e a consistência testicular e a coloração do sêmen
foram descritos subjetivamente. O teste de correlação de Spearman (Stat View for
Windows®, SAS Institute Inc., Versão 5.0, 1998) foi aplicado para VTT e o peso
corporal, a concentração espermática, o volume do ejaculado, o n° total de
espermatozóides) e aos parâmetros biométricos de comprimento peniano e grau de
espículas penianas. Os dados morfométricos relativos aos animais que não ejacularam
em vagina artificial foram descartados da correlação entre parâmetros seminais e
biométricos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A coleta de sêmen por vagina artificial não é considerada um método
prático de avaliação andrológica de animais em ambiente clínico, sendo útil para gatos
domésticos de colônias (PLATZ & SEAGER, 1978; AXNÈR & LINDE-FORSBERG,
2002), e nestas condições já foi utilizado por vários autores (SOJKA et al., 1970;
PLATZ et al., 1978; TANAKA et al., 2000; TSUTSUI et al., 2000ab, 2001; SÁNCHEZ
& TSUTSUI, 2002; VILLAVERDE, 2007).
Apesar de todos os machos terem demonstrado em pelo menos uma coleta
por EEJ possuírem produção espermática, o treinamento para a coleta por vagina
artificial permitiu a seleção dos animais quanto ao parâmetro comportamental. Dos 15
machos avaliados, 2 animais não apresentaram interesse por nenhuma das manequins
utilizadas, sendo que 1 apresentou-se em todas as tentativas sem libido, e o outro com
episódios de ausência de libido e agressividade à fêmea. Outros 2 animais, apresentaram
grande interesse pela fêmeas testadas, cercando-as e cheirando-as, entretanto, sendo
agressivos em todas as tentativas com a fêmea ou com o manipulador, não sendo
possível realizar a coleta sem riscos à gata e ao manipulador durante o procedimento.
Todos os demais gatos ejacularam pelo menos 1 vez em vagina artificial, corroborando
a presença de produção espermática previamente avaliada por EEJ. Entretanto, a rotina
de coletas consecutivas só foi obtida em 7 machos. Assim, apesar do sucesso no
treinamento para coleta por vagina (73,33% dos machos treinados), o que está em
acordo com os percentuais descritos na literatura por PLATZ & SEAGER (1978),
somente 46,66% adaptaram-se à rotina laboratorial de coletas. Um período de adaptação
maior que 3 semanas, período geralmente descrito, foi necessário à coleta por vagina
artificial. AXNÈR & LINDE-FORSBERG (2002) afirmam que o gato mesmo que
treinado, se colocado em ambiente que não é o seu usual, provavelmente não ejaculará.
Assim, este método é útil para gatos domésticos de colônias. Entretanto, em alguns
gatos com temperamento mais agressivo esta é uma prática que oferece inúmeros riscos
às pessoas que irão manipular o animal. Acrescenta-se com este experimento, que
mesmo gatos já treinados no seu ambiente podem não ejacular.
A coleta por vagina artificial envolveu uma série de fatores, desde a
experiência do manipulador e o conhecimento do comportamento individual dos
animais utilizados, do ambiente (como demarcação territorial prévia, ausência de
barulhos externos que atrapalhassem a concentração do animal na manequim e piso
adequadamente seco), do tamanho da abertura da borracha da vagina artificial (com
maior ou menor compressão do pênis), e principalmente da fêmea a ser utilizada como
manequim. As gatas foram utilizadas em estro médio, com comportamento sexual
bastante evidente e tolerante à presença do macho sobre o seu dorso com as mordidas na
nuca durante vários minutos. Fêmeas em estro inicial ou tardio, fêmeas jovens
inexperientes ou naturalmente agressivas em estro muitas vezes atrapalharam a
eficiência da coleta, sendo necessária a troca de 2 ou 3 manequins durante o
procedimento. Uma alternativa seria o treinamento dos animais a ejacular em vagina
com auxílio de uma manequim inanimada, utilizando-se animais de pelúcia, como já
relatado por VILLAVERDE (2007).
Outro entrave observado durante as coletas foi a formação de anéis de pêlo
em torno do pênis que acabaram por vezes causando uma constrição peniana e
atrapalhando a coleta. Segundo FELDMANN & NELSON (1996), este acúmulo de
pêlos pode ocorrer nas tentativas frustradas de penetração pelo macho, com o friccionar
do pênis sobre a região lombo-sacra da fêmea. Os machos por vezes pararam o cortejo
na tentativa de retirar com lambeduras o anel, porém, nem sempre conseguiam e após
várias tentativas de penetração na vagina, cansavam-se e desistiam do procedimento.
Assim, nos casos necessários, a coleta foi interrompida para retirada do anel de pêlos
por fricção com os dedos ou com pinça, levando, em algumas coletas, a pequenos
sangramentos penianos que inviabilizaram a coleta de sêmen deste animal por 24 a 48h.
Quando os animais apresentaram anéis de pêlo com constrição peniana, em geral,
recusaram-se a coletas consecutivas no mesmo dia. Ferimentos e dor no momento da
coleta podem diminuir a confiança do macho no manipulador e inviabilizar a utilização
deste macho felino para futuros procedimentos de coleta por vagina artificial.
Todos os animais apresentaram espículas penianas, estando compatível com
o normal para a espécie (ELLENPORT, 1986; JOHNSTON et al., 2001). A observação
da presença das espículas penianas é realizada em felídeos, embora a classificação do
grau não seja rotineiramente descrita pelos autores. São descritas espículas penianas:
presentes e proeminetes em gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus), jaguatirica Leopardus pardalis (MORAIS et al., 2002), gato-do-mato-grande (Leopardus geoffroy),
gato-palheiro (Leopardus colocolo) e gato-mourisco (Puma yagouaroundi) (MOREIRA
& MORATO, 2007); presentes, arredondadas, chatas e espaçadas na glande em onça
pintada - Panthera onca (SILVA et al., 2003; MOREIRA & MORATO, 2007); e
ausentes no gato-maracajá - Leopardus weiidi (MORAIS et al., 2002). SILVA et al.
(2003) relataram em um macho de onça pintada espículos de grau 3. A presença dos
espículos é andrógeno-dependente e parece estar correlacionada ao estímulo vaginal que
culmina na ovulação (MORAIS, 1999; JOHNSTON et al., 2001). O formato, aspecto
peniano e a consistência testicular foram considerados normais para todos os animais.
Os valores obtidos para os parâmetros biométricos avaliados, peso corporal estão
expressos na Tabela 1.
Os valores obtidos para comprimento, largura e espessura estão acima dos
descritos por JOHNSTON et al. (2001), que descrevem testículos em média de 1,5 x 1 x
1 cm cada. O valor de volume testicular total obtido no presente trabalho também
supera os descritos por a por TEBET (2004) de 3,52 ± 0,7 cm3, embora o peso corporal
médio dos animais do pesente trabalho seja 1kg inferior aos descritos por este autor (4,5
kg). Para outros felídeos brasileiros do mesmo porte, como o gato-do-mato-pequeno, os
valores obtidos na literatura variam de 2,3 (ERDMANN et al., 2005) a 4,2 cm3
(MORAIS et al., 2002).
Foi obtido um total de 41 ejaculados dos 7 machos que melhor se adaptaram
à vagina artificial. Os parâmetros seminais avaliados estão descritos na Tabela 2. A
concentração espermática em gatos domésticos pode oscilar com o método de coleta
(STORNELLI, 2007). SOJKA et al. (1970) obtiveram concentração média (1730 x 106
sptz/mL) dos ejaculados de gatos domésticos coletados por vagina artificial próximas às
obtidas no presente trabalho. Em 8 amostras (19,51%) que apresentavam concentração
acima de 580 x 106 sptz/mL, motilidade espermática de 100% e o vigor 5, observou-se
motilidade massal ou turbilhonamento. A motilidade e o vigor espermáticos são
parâmetros muito variáveis em relação ao tempo de abstinência sexual (AXNÈR &
LINDE-FORSBERG, 2002). O percentual de alterações morfológicas está dentro do
limite aceitável para gatos domésticos, já que gatos com até 40% de alterações
morfológicas, são ainda considerados normospérmicos. Entretanto, gatos com alterações
morfológicas acima deste patamar podem ainda possuir boa fertilidade após monta
natural (PUKAZHENTHI et al., 2001; AXNÈR & LINDE-FORSBERG, 2002). Os
valores médios obtidos demonstram a boa qualidade seminal dos gatos utilizados. Os
parâmetros de coloração e volume também foram considerados normais para a espécie
(AXNÈR & LINDE-FORSBERG, 2002). Em fotoperíodo equatorial, as fêmeas de gato
doméstico apresentam comportamento sexual ao longo de todo ano (SILVA, 2003;
MACIEL, 2006), já que a diferença entre dia mais curto e mais longo do ano é de
apenas 5 minutos, não sendo suficiente para promover alteração no eixo pineal-hipófisegonadal. Assim, acredita-se que a qualidade espermática do gato doméstico nestas
condições também não apresente variações na coleta em relação ao período do ano,
entretanto, isto não pode ser comprovado, já que as coletas não foram realizadas de
forma distribuída ao longo das estações e períodos do ano.
O parâmetro de volume testicular apresentou baixas correlações não
significativas entre os parâmetros de concentração espermática, n° total de
espermatozóides, volume seminal, peso corporal, comprimento peniano e grau de
espículas penianas. Os valores obtidos e seus graus de significância estão descritos na
tabela 3. Não foram encontradas descrições científicas que aplicassem teste de
correlação entre parâmetros seminais e biométricos em gatos domésticos. A ausência de
correlações significativas entre parâmetros seminais e biométricos também foi
observada para onças pintadas de cativeiro, realizando-se coletas a cada 2 meses em 4
machos (7 avaliações por macho- MORATO et al., 1999). Na jaguatirica, correlações
positivas e significativas entre o volume testicular, peso corporal (r= 0,58) e o número
total de espermatozóides no ejaculado (r= 0,59) foram obtidas por MORAIS (1999). O
mesmo autor obteve correlação positivas e significativas entre o volume testicular, peso
corporal (r= 0,65) em gato-maracajá. Para ambas as espécies, foram utilizados 3 animais
coletados mensalmente por 14 meses. O tamanho da amostra utlizada no presente
trabalho associada a uma baixa variabilidade pode ter contribuído para os resultados
alcançados.
Sabe-se ainda que a ejaculação retrógrada é freqüentemente observada
durante ejaculação natural ou EEJ no gato doméstico, com percentuais de 15 a mais de
90% (DOOLEY et al., 1991). Assim, é possível que a coleta por vagina artificial possa
não ter refletido corretamente o volume do ejaculado, a concentração espermática e o n°
total de epermatozóides, com parte do ejaculado indo em direção à bexiga urinária. O
volume do ejaculado também é regulado pelo volume de secreção das glândulas
acessórias, que nos felídeos são a próstata e bulbouretrais (AXNÈR & LINDEFORSBERG, 2002). Observa-se na prática que, em geral, a ejaculação de amostras mais
concentradas aconteceu com menos tempo de contato entre o macho e a fêmea, ou seja,
em um ritual (cortejo, monta, ejaculação) mais rápido. Quando o cortejo foi mais lento,
com ejaculação ocorendo após a segunda ou terceira monta e fixação na nuca, em geral,
vários tubos de coleta foram utilizados até que fosse obtido ejaculado contendo células
espermáticas, podendo esta observação refletir uma maior estimulação e ejaculação de
secreção de glândulas acessórias. Sugere-se que novas avaliações do volume testicular
de gatos domésticos sejam realizadas em diferentes fotoperíodos e estações do ano, já
que em condições de fotoperíodo equatorial natural, os resultados obtidos demonstram
que este parêmetro não é, até o momento, indicado para avaliar os reprodutores.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPQ, à CAPES e à FUNCAP pelo custeio do experimento e pelas
bolsas de pesquisas concedidas. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza pela
concessão das vacinas anti-rábicas aplicadas nos animais. À FUNCEME pela concessão
dos dados climáticos.
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Tabela 1: Média ± desvio padrão do peso corporal e da biometria dos testículos,
comprimento e grau de espículas do pênis de gatos domésticos mantidos em fotoperíodo
equatorial natural (n=15).
Parâmetros
Valores
Comprimento do testículo direito
2,19 ± 0,29 cm
Comprimento do testículo esquerdo
2,08 ± 0,30 cm
Largura do testículo direito
1,54 ± 0,21 cm
Largura do testículo esquerdo
1,59 ± 1,9 cm
Espessura do testículo direito
1,22 ± 0,12 cm
Espessura do testículo esquerdo
1,21 ± 0,16 cm
Volume testicular direito
2,83 ± 0,96 cm3
Volume testicular esquerdo
2,89 ± 0,89 cm3
Volume testicular total
5,66 ± 1,61 cm3
Peso Corporal
3,74 ± 0,45 Kg
Comprimento do pênis
0,92 ± 0,11 cm
Graus de espículas penianas
2,5 ± 0,50
Tabela 2: Média ± desvio padrão dos parâmetros seminais obtidos de ejaculados de
gatos domésticos mantidos em fotoperíodo equatorial natural coletados por vagina
artificial (n= 7).
Parâmetros
Coloração
Volume
Concentração espermática
Valores
Branco-opalescente a leitoso
42, 53 ± 25,08 μL
(14,00 – 135,00)
1.306,25 ± 1.401,63
(130,00 – 7260,00)
x 106 sptz/mL
N° total de sptz
Motilidade
Vigor
Alterações Morfológicas Totais
54,01± 62,60 x 106 sptz
(2,88– 304,92)
93,95 ± 8,53 %
(70,00 – 100,00)
4,69 ± 0,61
(2,00 – 5,00)
24,29 ± 11,74 %
(3 – 48)
Tabela 3: Tamanho da amostra (N), valores de correlação (r) e de probabilidade (P)
obtidos na aplicação da correlação de Sperman entre parâmetros seminais e biométricos
de gatos domésticos mantidos em fotoperíodo equatorial natural coletados por vagina
artificial.
Correlações
N
r
P
VTT x CE
7
0,12
0,47
VTT x N° total de sptz
7
0,05
0,77
VTT x Volume seminal
7
- 0,07
0,66
VTT x Peso corporal
15
0,34
0,20
VTT x Comprimento do pênis
15
0,34
0,20
VTT x Grau de espículas peniana
15
0,20
0,45
VTT= volume testicular total
CE= concentração espermática
5.4. Capítulo 4:
Inseminação artificial intravaginal com sêmen fresco de gatos domésticos diluído
em água de coco em pó (ACP-117®): resultados preliminares
[Intravaginal artificial insemination with domestic cats semen diluted in powdered
coconut water (ACP-117®)]
Ticiana Franco Pereira da Silva1*, Camila Louise Ackermann2, Francisco Tiago Silva
Pinheiro2, Leonardo Tavernezi2, Daniel Falcão Menezes Brilhante1, Henna Roberta
Quinto1, Lúcia Daniel Machado da Silva3
1
2
Doutoranda - PPGCV, FAVET/ UECE
Graduando (a) em Medicina Veterinária, UECE
3
Prof. Adjunto, FAVET/ UECE
Laboratório de Reprodução de Carnívoros – PPGCV, FAVET/ UECE
Av. Paranjana, 1700, CEP 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil
Fone: (85) 3101-9860; Fax: (85)3101-9840
e-mail: *[email protected]
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do ACP-117® como diluidor do
sêmen de gatos domésticos para inseminação artificial intravaginal. Foram utilizados 11
ejaculados de 5 machos adultos coletados por vagina artificial. Os parâmetros de
qualidade seminal e volume foram avaliados para o sêmen fresco e diluído em ACP117®. Quatro fêmeas em estro natural receberam 250 UI de hCG por via intra-muscular
e foram inseminadas no 2° e 4° dia do estro pela via intravaginal com o sêmen diluído
em ACP-117®. A motilidade e o vigor espermáticos não foram alterados pela diluição,
entretanto observou-se um aumento das alterações morfológicas após a diluição.
Nenhuma gestação se desenvolveu. Conclui-se que o uso da diluição do sêmen fresco
de gatos domésticos com ACP-117® não altera a motilidade e o vigor espermático,
entretanto o protocolo descrito para IA intravaginal utilizado não foi adequado,
necessitando de ajustes no protocolo e um maior número de inseminações.
Palavras-chave: sêmen, água de coco em pó, inseminação artificial, gato.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the use of powdered coconut water
(ACP-117®) as seminal extender for intravaginal artificial insemination in domestic
cats. Eleven ejaculates of five toms were collected by artificial vagina. The parameters
of volume and semen quality were analyzed for fresh and diluted semen in ACP-117®.
Four queens in natural estrus received 250 UI of hCG, IM and were submitted to
intravaginal artificial insemination in the second and forth day of estrus with semen
diluted in ACP-117®. The motility and vigour did were not affected by the dilution, but
it was observed an increase of spermatic morphological defects after semen dilution.
None gestation was carried out. In conclusion, the use of dilution of domestic cat semen
in ACP-117® did not affect motility and vigour, but the protocol for intravaginal
artificial insemination used was not suitable and adjustments in the protocol and more
inseminations are necessary.
Key Words: semen, powdered coconut water, artificial insemination, cat.
Introdução
A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da
família Palmae) é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais,
açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitormônios) e muito pouco fosfolipídeo
(LAGUNA, 1996). A água de coco contém ainda outros compostos que mostram
atividades semelhantes àquelas das citocininas (NUNES e SALGUEIRO, 1999). Nunes
e Combarnous (1995) isolaram o ácido 3-indol-acético na água de coco, verificando que
a mesma apresentava uma ação benéfica sobre a motilidade do sêmen de caprinos e
ovinos incubado a 37 °C. Apesar da água de coco ser um diluente eficiente na
conservação do sêmen de diversas espécies, era necessário preparar a solução para cada
utilização. Para permitir a conservação do produto por um longo período, foi
desenvolvida a água de coco em pó (ACP®). O líquido endospérmico do coco é
transformado em pó fino e uniforme, amorfo, destituído de água livre, com alta
solubilidade (NUNES et al., 2005). O ACP® recebe uma denominação de acordo com a
espécie, e para felinos é o ACP-117®. Desde então, o uso do ACP® vem sendo utilizado
na diluição para inseminação artificial (IA) em caprinos (SALGUEIRO et al., 2002) e
cães (UCHOA et al., 2004). Entretanto, não há relatos de seu uso para IA em gatos
domésticos ou felídeos silvestres.
Na década de 70 surgiram os primeiros relatos de coleta e conservação de
sêmen de gatos domésticos (PLATZ et al, 1978) e de IA (SOJKA et al., 1970; PLATZ
et al, 1978). Desde então, a tecnologia de sêmen vem ganhando espaço cada vez mais
crescente nos estudos de reprodução. A IA é utilizada principalmente nos casos de
problemas em acasalamentos naturais por não aceitação do macho pela fêmea, ou o
inverso, limitações físicas ou, em animais selvagens, a agressividade natural da espécie
(LUVONI et al., 2003). Esta técnica evita o contato entre os animais, diminuindo o
risco de transmissão de doenças sexualmente transmissíveis ou infecto-contagiosas
(VILLAVERDE e LOPES, 2007).
Poucos são os relatos de IA intravaginal com sêmen fresco de gatos
domésticos, com taxas de concepção de 50, 78 e 33%, utilizando-se sêmen diluído em
solução salina (SOJKA et al., 1970), tris (CHATDARONG et al., 2007) e tris frutose
citrato e gema de ovo (TANAKA et al., 2000b), respectivamente. Mais estudos são
necessários para o aperfeiçoamento do protocolo de IA em gatos, para que a IA possa
ser aplicada em um futuro breve para fins comerciais. Assim, o objetivo do presente
trabalho foi avaliar o efeito do ACP-117® sobre a qualidade seminal de gatos
domésticos e seu uso como extensor de sêmen para IA intravaginal.
Material e Métodos
1. Animais
Foram utilizados 5 gatos machos púberes e 4 fêmeas sem raça definida
(SRD), pesando entre 2,5 e 4 kg, provenientes do gatil experimental da Universidade
Estadual do Ceará, Fortaleza/ Ceará (3º 44’ de latitude sul e 38° 34’ de longitude oeste,
clima equatorial semi-úmido e aproximadamente 12h diárias de luz natural ao longo do
ano). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e alimentados com ração
comercial de manutenção para gatos (Kitekat®- Éffem®, Brasil), recebendo água à
vontade. Todos os animais já haviam sido previamente submetidos à coleta de sêmen
por vagina artificial, possuindo características seminais normais para a espécie segundo
JOHNSTON et al. (2001).
2. Coleta de sêmen
Os animais foram então submetidos à coleta de sêmen em vagina artificial,
sendo esta manufaturada utilizando-se o dispositivo de borracha de um conta-gotas
acoplado a um tubo plástico de 1,5 mL desprovido de tampa. Para o procedimento, o
animal era solto no recinto de coleta para demarcação territorial e reconhecimento da
área, e então, apresentado a uma gata em estro natural, sendo-lhe permitido cortejar a
fêmea. O estro foi determinado como o momento da aceitação de cópula, quando a fêmea
permitia a fixação pela nuca e lateralização da cauda em resposta à tentativa de intromissão
peniana, entretanto a cópula para todos os casos foi impedida pelo observador.
Por ocasião da monta, inicialmente o observador com a mão enluvada
realizou massagem peniana para a entrada em ereção e posicionou a vagina artificial
entre os dedos de forma a permitir a penetração do pênis do gato, vindo este a ejacular
no interior do tubo, sendo o sêmen imediatamente destinado à avaliação. Os tubos de
coleta foram trocados quando necessário, até que fosse obtido ejaculado contendo
células espermáticas.
3. Análise e diluição do sêmen
Imediatamente após a coleta do sêmen, os ejaculados foram observados em
microscopia de luz (100 e 400x) em relação à presença ou não de células espermáticas.
Aqueles contendo células espermáticas, foram avaliados quanto às características
macroscópicas de volume e coloração, e microscópicas de porcentagem de
espermatozóides móveis (motilidade) e o vigor espermático (0 a 5). A porcentagem de
alterações morfológicas espermáticas foi avaliada em microscópia de contraste de fase
(1000x) por coloração de uma alíquota do sêmen em Rosa de Bengala. Os
espermatozóides foram classificados como normais ou anormais quando apresentavam
algum defeito cabeça, peça intermediária ou cauda. A concentração espermática (106
sptz/mL) foi avaliada através de uma câmara de Neubauer em microscópio óptico
(400x). Durante as análises de motilidade, vigor e concentração espermática o sêmen foi
mantido em banho-maria a 37°C.
O ACP-117® foi fabricado após uma etapa prévia de mensuração do pH e
ajuste do diluidor ao sêmen felino realizada com 10 ejaculados de 9 gatos domésticos
através de fitas (D52348, Macherey-Nagel®, Alemanha). Assim, o ACP -117® foi
ajustado ao pH de 8,2. A reconstituição do ACP-117® foi preparada segundo as
recomendações do fabricante, adicionando-se 2,63g do pó a 50 mL de água destilada,
seguido de homogeinização. Alíquotas do ACP-117® reconstituído foram congelas a 10°C e no momento de sua utilização foram descongeladas e mantidas em banho-maria
a 37°C.
Após a retirada das alíquotas para análises do sêmen fresco, o sêmen foi
diluído em ACP-117® até que um volume de 100 μL da diluição sêmen-diluidor fosse
atingido. Imediatamente após a diluição, o sêmen diluído foi avaliado quanto aos
parâmetros de porcentagem de espermatozóides móveis e o vigor espermático e
porcentagem
de
alterações
morfológicas
espermáticas.
O
número
total
de
espermatozóides utilizado na IA foi calculado apartir da concentração espermática do
ejaculado.
4. Inseminação artificial (IA)
As fêmeas com fertilidade comprovada por parição em ciclos anteriores
foram avaliadas diariamente quanto à exibição dos sinais de comportamento estral. A
citologia vaginal foi utilizada para confirmar o momento adequado da IA (≥ 70% de
células queratinizadas). A citologia foi realizada através da introdução de uma escova
interdental umedecida com solução salina fisiológica (0,9% de NaCl), rolagem em
lâmina de vidro, coloração em panótico rápido e leitura em microscopia óptica de luz
(100 e 400X).
Durante a coleta de sêmen, as fêmeas, no 2° e 4° dias do estro foram
tranqüilizadas por via intramuscular com acepromazina (1 mg/kg) e xilazina (0,5
mg/kg) e no 2° dia do estro a ovulação foi induzida por uma administração de 250UI de
hCG, por via IM. O sêmen foi depositado através de uma seringa de 1mL após
introdução de uma sonda urinária tom cat na porção caudal da vagina em sentido crânioascendente, mantendo-se o trem posterior da fêmea elevado. A elevação do trem
posterior foi mantida por 15 minutos após a injeção do sêmen.
Para diagnóstico gestacional e avaliação uterina, foram realizadas avaliações
por ultra-sonografia abdominal aos 15, 22, 29 e 36 dias após a primeira IA.
5. Análise Estatística
Os parâmetros de volume, porcentagem de espermatozóides móveis, vigor,
concentração espermática, número total de espermatozóides e porcentagem de
alterações morfológicas foram expressos na forma de média e desvio padrão. A
porcentagem de espermatozóides móveis, após conversão em arco-seno, foi comparada
entre o sêmen fresco e diluído pelo teste t-Student e o vigor pelo teste de Mann
Whitney. A porcentagem de alterações morfológicas entre o sêmen fresco e diluído foi
comparada por ANOVA seguida de do teste de Fisher PLSD. Para todos os parâmetros,
considerou-se p<0,05 (Stat View for Windows®, SAS Institute Inc., Versão 5.0, 1998).
Os resultados da IA foram analisados de forma descritiva.
Resultados e Discussão
Foram obtidos 11 ejaculados dos 5 machos. Os parâmetros seminais obtidos
estão descritos na Tabela 1. O volume, a concentração espermática, motilidade, vigor e
alterações morfológicas estão dentro da normalidade para a espécie através da coleta por
vagina artificial tanto para o sêmen fresco, como diluído em ACP-117® (SOJKA et al.,
1970; PLATZ et al., 1978; TANAKA et al., 2000ab). Em 6/11 amostras (54,54%) que
apresentavam motilidade espermática de 100% e vigor 5, observou-se motilidade
massal ou turbilhonamento.
O preparo do ACP® seguido de congelação a -10°C e descongelação já foi
utilizado para cães com o ACP-106® (CARDOSO, 2005). Entretanto neste caso, o
diluidor foi acresido de 20% de gema de ovo e adicionado ao sêmen canino à
temperatura ambiente, destinando-se à criopreservação. A estocagem a -10°C não
afetou a criopreservação, e segundo o descrito, tornou o uso do diluidor mais prático,
evitando seu preparo a cada coleta. Com o uso do ACP-106® como extensor seminal, ou
seja, com utilidade semelhante ao utilizado no presente trabalho, relata-se em cães não
haver alteração ou haver uma discreta melhora na motilidade e no vigor com a diluição
de 0,5 a 2 mL de fração seminal com ACP-106® preparado no momento da coleta, até
atingir 6 mL de volume inseminante (UCHOA, 2004, comunicação pessoal). No
presente trabalho, embora a motilidade e vigor médios não tenham sido afetados após a
diluição com ACP-117®, o percentual de alteraçõers morfológicas demonstrou uma
predominância de alterações de cauda (> 72% das anormalidades), em grande parte de
enrolamento de cauda. Pode-se supor que uma pequena alteração na composição fisicoquímica do diluidor após a congelação-descongelação possa ter induzido a alterações
morfológicas, sem no entanto ter afetado a motilidade e o vigor espermático. A
avaliação subjetiva destes últimos parâmetros, em especial de amostras muito
concentradas pode induzir a erros de avaliação e superestimação dos valores. Outra
possibilidade, é que o pH e a osmolaridade do diluidor utlizado, não sejam as ideiais
para o uso com sêmen de gatos domésticos, entretanto a avaliação de osmolaridade de
cada amostra antes da diluição não foi realizada devido ao peuqeno vloume seminal da
espécie.
Tabela 1: Valores (média ± desvio padrão) obtidos para o sêmen fresco de gatos
domésticos e diluído em ACP-117® (n= 11 ejaculados).
Valores
Parâmetros
Sêmen Fresco
Sêmen Diluído
Coloração
Branco-opalescente a leitoso
-
Volume
36,73 ± 21,04 µL
100 uL
Concentração espermática
1329,09 ± 966,62 x 106 sptz/mL
-
Motilidade
97,73% ± 4,10a
84,55% ± 31,58a
Vigor
4,86 ± 0,32 a
4,18 ± 1,66 a
Normais
81,82% ± 7,49a
62,32% ± 13,79b
Anormais
18,18% ± 7,49a
37,68% ± 13,79b
Alterações Morfológicas
a,b
Letras diferentes representam diferença entre colunas (P<0,05).
O número médio de espermatozóides utilizado em cada IA foi de 48,06 ±
6
14,48 x 10 sptz, com mínimo de 7,20 e máximo de 144,48 x 106 sptz. O número de
espermatozóides recomendado é bastante variável entre autores, tendo sido obtido
gestação com sêmen a fresco via intravaginal com 1,25 x 106 sptz (SOJKA et al.,1970)
a 80 x 106 sptz (TANAKA et al., 2000b). Embora o número de espermatozóides para IA
utilizado tenha sido alcançado, nenhuma das gatas inseminadas apresentou diagnóstico
gestacional positivo. Uma fêmea apresentou mucometra na primeira avaliação ultrasonográfica e foi tratada com prostaglandina F2α (1 μg/kg, 2x ao dia por 3 dias) e
enrofloxacina (5mg/kg, 1x ao dia por 5 dias), sendo realizadas avaliações ultrasonográficas até não fosse mais visualizado imagem de conteúdo uterino. Uma fêmea
que apresentou estro após a confirmação do diagnóstico negativo, e a fêmea tratada após
apresentar novo estro, foram novamente submetidas ao protocolo de IA, perfazendo
assim 6 protocolos de IA realizados. A ausência de gestação pode ter sido ocasionada
por uma falha metodológica na inseminação, como a escolha da indução de ovulação no
momento da IA no 2°dia de estro, ou do efeito da diluição do sêmen com o ACP-117®.
Certo refluxo foi observado com a injeção do sêmen na vagina através da sonda tom cat,
fazendo com que o procedimento tivesse que ser executado lentamente de forma a evitar
ao máximo a perda seminal. Logo após a introdução de aproximadamente 0,5 cm da
sonda urinária tom cat não era mais possível a sua introdução, porque a vagina da gata é
curta e provavelmente atingiu-se o fórnix da vagina (AXNÉR et al., 1998). Assim,
retirava-se um pouco a sonda em sentido caudal a fim de possibilitar o fluxo seminal. O
volume de 100 μL da diluição sêmen-diluidor foi utilizado segundo as recomendações
da literatura para IA intravaginal com sêmen fresco (SOJKA et al.,1970; TANAKA et
al., 2000b). Embora o recomendado por alguns autores seja não ultrapassar o limite de
100 μL (VILLAVERDE e LOPES, 2007), outros afirmam que pode ser utilizado até
250μL da diluição por este método (CHATDARONG et al., 2007).
A IA foi executada preferencialmente com o sêmen do mesmo macho nos 2
dias de estro. Somente em uma gata não foi possível executar os dois procedimentos de
IA pela ausência de fornecimento de ejaculado por quaisquer dos machos utilizados. A
escolha do uso de fêmeas em estro natural com a aplicação de 205 UI de hCG no
segundo dia de estro foi baseada em resultados descritos por TANAKA et al. (2000b),
também utilizando IA intravaginal com sêmen fresco, entretanto realizando-se a
primeira IA de 15 a 30h após hCG. No presente trabalho, optou-se por aplicar no
momento da IA, segundo CHATDARONG et al. (2007), utilizando gatas também em
estro natural. Entretanto, pela ausência de dosagem de progesterona, torna-se impossível
determinar se no presente experimento a dose de hCG e o momento da indução de
ovulação foram realmente adequados. Por via intravaginal com sêmen a fresco, SOJKA
et al. (1970) obteve 50% de taxa de concepção, de TANAKA et al. (2000b) 78% e
33,3% de CHATDARONG et al. (2007). O insucesso da técnica também pode ser
devido ao baixo número de repetições, frente as 20 e 45 repetições relatadas na
literatura, respectivamente por CHATDARONG et al. (2007) e TANAKA et al.
(2000b). Não se descarta também a possibilidade da falha de fertilidade estar vinculado
aos machos, já que nem todos haviam sido submetidos a teste de fertilidade prévio.
Mais estudos e repetições com melhores adequações do protocolo devem ser realizados
a fim de descartar o efeito da diluição do sêmen de gatos domésticos com ACP-117®.
Conclusão
O uso da diluição do sêmen fresco de gatos domésticos com ACP-117® não
altera a motilidade e o vigor espermático, entretanto o protocolo descrito para IA
intravaginal utilizado não foi adequado, necessitando de ajustes no protocolo e um
maior número de inseminações.
Agradecimentos
Ao CNPQ, à CAPES e à FUNCAP pelo custeio do experimento e pelas
bolsas de pesquisas concedidas. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza pela
concessão das vacinas anti-rábicas aplicadas nos animais. À FUNCEME pela concessão
dos dados climáticos.
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VILLAVERDE, A. I. S. B.; LOPES, M. D. É possível realizar inseminação artificial em
gatas na minha clínica? Clínica Veterinária, n.70, 2007.
5.5. Capítulo 5:
Criopreservação de sêmen de gatos domésticos em meio à base de água de coco em
pó ACP-117®
(Criopreservation of domestic cats semen in media based on coconut powered water
ACP-117®)
Ticiana Franco Pereira da Silva1*, Camila Louise Ackermann2, Francisco Tiago Silva
Pinheiro2, Leonardo Tavernezi2, Cláudia da Cunha Barbosa1, Lúcia Daniel Machado da
Silva3
1
2
Doutoranda - PPGCV, FAVET/ UECE
Graduando (a) em Medicina Veterinária, UECE
3
Prof. Adjunto, FAVET/ UECE
Laboratório de Reprodução de Carnívoros – PPGCV, FAVET/ UECE
Av. Paranjana, 1700, Cep 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil
Fone: (85) 3101-9860; Fax: (85)3101-9840
2
Médica Veterinária Autônoma
e-mail: *[email protected]
Resumo
O objetivo do trabalho foi avaliar o uso do ACP-117® na criopreservação de
sêmen de gatos domésticos. Seis gatos foram coletados por vagina artificial, e o sêmen
foi avaliado quanto ao volume, coloração, motilidade e vigor espermático, concentração
espermática, funcionalidade de membrana plasmática, e porcentagem de alterações
morfológicas e espermatozóides vivos e mortos. O sêmen foi diluído em ACP-117® e
20% de gema de ovo (50 x 106 sptz/mL) e submetido ao resfriamento (15°C/ 40 min e
4°C/ 30 min). O ACP 117® -gema de ovo acrescido de glicerol (concentração final de
6%) foi adicionado ao sêmen. Os ejaculados foram congelados em vapor de nitrogênio
líquido e armazenados a -196 °C. O sêmen foi descongelado (37 °C/ 1 min) e os
parâmetros espermáticos foram avaliados. Parte dos ejaculados também foram
submetidos ao teste de termorresistência e análise computadorizada de sêmen (CASA).
Após a diluição, motilidade e vigor mantiveram-se semelhante ao sêmen a fresco,
havendo uma redução significativa após o resfriamento (P>0,05). Após a
descongelação, os valores de motilidade e vigor foram 25,07% ± 21,40% e 3,44 ±
1,28%. A motilidade progressiva no CASA foi de 4,79 ± 5,17%. No teste de
termorresistência. a motilidade e o vigor espermático se mantiveram por 20 min. As
alterações morfológicas, totais e secundárias, espermatozóides mortos e perca da
funcionalidade de membrana foram superiores pós-descongelação (P>0,05). Conclui-se
que o protocolo utilizado para criopreservação de sêmen de gatos domésticos em ACP117® permite baixa viabilidade in vitro dos espermatozóides pós-descongelação.
Palavras-chave: sêmen, água de coco, gato, criopreservação.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the use of ACP-117® for the preservation of
domestic cat sperm. Six cats were colleted by artificial vagina, and the sperm was
analyzed for the parameters of volume, color, motility, vigour, sperm concentration,
acrosomal status, percentual of abnormal spermatozoa, functionality of membrane and
the percentual of alive or dead spermatozoa. The semen was initially extended in ACP117® and 20% of egg yolk (50 x 106 sptz/mL) and submitted to cooling (15°C/ 40 min
and 4°C/30 min). The ACP 117® -egg yolk- glycerol (final concentration of 6%) was
added to the sperm. The ejaculates were submitted to frozen in nitrogen vapor and
stored in liquid nitrogen (-196 °C). The samples were thawed (37 °C/ 1 min) and the
spermatic parameters were analyzed. Part of the ejaculates was also submitted to
thermoresistance tests and computer aided semen analysis (CASA). After dilution, the
motility and vigour were similar to fresh semen, beginning significant reduction after
cooling (P>0.05). After thawing, motility and vigor values were 25.07% ± 21.40% and
3.44 ± 1.28%. The progressive motility in CASA was 4.79 ± 5.17%. In the
thermoresistance tests, motility and vigour were maintained for 20 min. The total and
secondary percentage of sperm abnormalities, dead sperm and the lost of functionality
of membrane post-thaw were greater. In conclusion, the protocol used for domestic cat
semen criopreservation in ACP-117® allow low in vitro post-thaw viability.
Key Words: semen, coconut water, cat, criopreservation.
Introdução
O aumento da criação de gatos alavanca um mercado de produtos e serviços
especializados, além de criar uma demanda por biotecnologias, em especial as
reprodutivas, já que muitos criam não só por hobby, mas também como uma atividade
comercial. Isto gera a necessidade dos criadores em potencializar a capacidade
reprodutiva de seus animais (SILVA JÚNIOR, 2002).
Entre estes serviços, encontram-se a avaliação andrológica e inseminação artificial
(IA- STORNELLI & STORNELLI, 2001). Para o uso comercial da IA em gatos, um
dos entraves são os protocolos de conservação do sêmen felino. A conservação de
sêmen, seja pelo resfriamento ou pela congelação, permite o transporte de material
genético de animais de alto valor comercial por longas distâncias, facilitando
significativamente a criação comercial e possibilitando, também, a troca de sêmen entre
populações selvagens geograficamente isoladas, restaurando o vigor genético (LUVONI
et al., 2003).
Uma alternativa bastante discutida para a preservação de espécies e da
variabilidade genética é o banco de genoma, o qual armazenaria a longo prazo, material
genético criopreservado, incluindo gametas e embriões de espécies ameaçadas de
extinção (MORAIS et al., 2002). Além de serem animais de companhia, os gatos têm
importante papel como modelo experimental, permitindo o aperfeiçoamento do
conhecimento dos processos biológicos e reprodutivos a serem aplicados aos felídeos
selvagens (LUVONI et al, 2003). Assim, protocolos de criopreservação de sêmen
podem ser inicialmente testados em gatos domésticos e depois avaliados nas diferentes
espécies selvagens.
O sêmen felino vem sendo conservado segundo o padrão adotado para outras
espécies carnívoras, com grande variação de protocolos entre os autores. Os resultados
pós-descongelação são bastante variáveis entre autores, desde < 30% (TSUTSUI et al.,
2000) a > 70% (PLATZ et al., 1978) de espermatozóides móveis. Os diluidores de
sêmen ainda mais empregados são o Tes e o Tris, isolados, adicionado de frutose ou
glicose (HAY & GOODROWE, 1993), ou em conjunto, constituindo o TesT (AXNER,
1998; SÁNCHEZ & TSUTSUI, 2002). Nos protocolos de conservação, estes diluidores
são em geral adicionados de 20% de gema de ovo (HAY & GOODROWE, 1993) e nos
casos de congelação de 3% (HAY & GOODROWE, 1993) a 4% de glicerol
(ZAMBELLI et al, 2002).
Os resultados obtidos com os estudos com a água de coco in natura na
conservação de células espermáticas em capotes (MILITÃO et al., 1994), caprinos
(SALGUEIRO et al., 2002), ovinos (NUNES, 1995), suínos (TONIOLLI e
MESQUITA, 1990) e cães (CARDOSO, 2001); e a necessidade do preparo da solução
para cada utilização, levaram à elaboração de um meio de conservação à base de água
de coco em pó (ACP®), facilitando sua conservação. O ACP® recebe uma denominação
de acordo com o pH e a osmolaridade do sêmen de cada espécie, e para felinos é
denominado de ACP-117®. Em cães (ACP-106®), para testes in vitro, foi empregado no
resfriamento (MADEIRA et al., 2004; CARDOSO, 2006) e na congelação (CARDOSO,
2005), e in vivo como extensor para IA com sêmen a fresco (UCHOA et al., 2004).
Entretanto, ainda não havia sido empregado em gatos domésticos ou qualquer outra
espécie felídea.
Assim diante da necessidade de desenvolvimento de diluidores e protocolos de
conservação de sêmen capazes de garantir bons resultados pós-descongelação,
objetivou-se avaliar, segundo o protocolo descrito para cães, o uso do ACP-117® na
criopreservação de sêmen de gatos domésticos.
Material e Métodos
1.Animais
Foram utlizados 6 gatos machos púberes e sem raça definida (SRD), pesando
entre 3 e 4 kg, provenientes do gatil experimental da Universidade Estadual do Ceará,
Fortaleza/ Ceará (3º 44’ de latitude sul e 38° 34’ de longitude oeste, clima equatorial
semi-úmido e aproximadamente 12h diárias de luz natural ao longo do ano). Os animais
foram mantidos em gaiolas individuais e alimentados com ração comercial de
manutenção para gatos (Kitekat®- Éffem®, Brasil), recebendo água à vontade. Todos os
machos já haviam sido previamente submetidos à coleta de sêmen por vagina artificial,
possuindo características seminais normais para a espécie segundo JONHSTON et al.
(2001).
2. Coleta de sêmen
Os animais foram submetidos à coleta de sêmen em vagina artificial, sendo esta
manufaturada utilizando-se o dispositivo de borracha de um conta-gotas acoplado a um
tubo plástico de 1,5 mL desprovido de tampa. Para o procedimento, o animal era solto
no recinto de coleta para demarcação territorial e reconhecimento da área, e então,
apresentado a uma gata em estro natural, sendo-lhe permitido cortejar a fêmea. O estro
foi determinado como o momento da aceitação de cópula, quando a fêmea permitia a
fixação pela nuca e lateralização da cauda em resposta à tentativa de intromissão peniana,
entretanto a cópula para todos os casos foi impedida pelo observador.
Por ocasião da monta, inicialmente o observador com a mão enluvada realizou
massagem peniana para a entrada em ereção e posicionou a vagina artificial entre os
dedos de forma a permitir a penetração do pênis do gato, vindo este a ejacular no
interior do tubo, sendo o sêmen imediatamente destinado à avaliação. Os tubos de coleta
foram trocados quando necessário, até que fosse obtido ejaculado contendo células
espermáticas. Foram processados de 3 a 4 ejaculados por animal.
3. Análise do sêmen
Imediatamente após a coleta do sêmen, os ejaculados foram observados em
microscopia de luz (100 e 400x) em relação à presença ou não de células espermáticas.
Aqueles contendo células espermáticas, foram avaliados quanto às características
macroscópicas de coloração e volume, e microscópicas de porcentagem de
espermatozóides móveis (motilidade) e o vigor espermático (0 a 5). A concentração
espermática (106 sptz/mL) foi avaliada através de uma câmara de Neubauer em
microscópio óptico (400x), através da diluição de 2μL do sêmen em 400μL de solução
salina formolizada a 0,1%. Durante as análises de motilidade, vigor e concentração
espermática o sêmen foi mantido em banho-maria a 37°C. Somente ejaculados com um
mínimo de 70% de motilidade e 3,0 de vigor foram destinados ao processamento.
A porcentagem de alterações morfológicas espermáticas e a integridade
acrossomal foram avaliadas em microscópia de contraste de fase (1000x) por coloração
de uma alíquota do sêmen em de um corante constituído por 1,5% de Rosa Bengala
acrescido de formol citrato a 1% (1:15). A mistura permaneceu em repouso por cerca de
60 segundos e então uma gota desta mistura foi colocada sobre uma lâmina de vidro e
recoberta por lamínula para observação. Para a integridade acrossomal considerou-se
sua presença, ausência, destacamento, edemaciação e vesiculação. Os espermatozóides
foram classificados como normais ou anormais quando apresentavam algum defeito de
cabeça, peça intermediária ou cauda, sendo classificados os defeitos em primários e
secundários (CARDOSO, 2005).
Para avaliar a funcionalidade da membrana, foi realizado o teste hiposmótico, no
qual uma alíquota de sêmen foi diluída água destilada (1: 9), permanecendo esta mistura
em banho-maria a 37 °C por 30 minutos (TEBET, 2004). Na avaliação realizada em
microscopia ótica de luz (400x) considerou-se o percentual de espermatozóides com
cauda enrolada como apresentando funcionalidade preservada.
A avaliação do percentual de espermatozóides vivos ou mortos foi realizada em
microscopia ótica de luz (400x) com o esfregaço de uma alíqüota de sêmen corada com
corante à base de azul de bromofenol (1:1), na qual somente os espermatozódes que se
apresentassem completamente descorados à leitura imediata eram classificados como
vivos (contagem de 100 células- BARBOSA, 2007).
Para o percentual de alterações morfológicas, vivos e mortos e funcionalidade de
membraba, foram contados 200, 100 e 100 células, respectivamente.
4. Criopreservação
Seguiu-se o protocolo de criopreservação em ACP-106®, descrito por CARDOSO
(2005) para cães. A reconstituição do ACP-117® de pH 8,2 e 310 mOsm/L (ACP-117®,
ACP Biotecnologia®, Fortaleza-Ceará, Brasil) foi preparada segundo as recomendações
do fabricante, adicionando-se 2,63g do pó a 50 mL de água destilada, seguido de
homogeinização. Alíquotas do ACP-117® reconstituído foram congelas a -10°C e no
momento de sua utilização foram descongeladas em banho-maria a 37°C.
Antes da adição do sêmen à temperatura ambiente (± 28°C), o ACP-117® foi
modificado, substituindo-se 20% de seu volume por 20% de gema de ovo, constituindo
o ACP-117®-gema. Este foi fracionado em duas porções, sendo a 1a porção adicionada
ao sêmen imediatamente após a coleta e análise inicial à temperatura ambiente (±
28°C), e a 2a porção do diluidor acrescida de 12% de glicerol. Após a diluição inicial do
sêmen com a 1ª porção ACP-117®-gema, permitindo uma concentração de 50 x 106
sptz/mL, os tubos de vidro foram acondicionados em banho-maria com água à
temperatura ambiente em caixa plástica térmica com gelo biológico a 15 °C por 40 min.
Ao final deste período, o sêmen levado ainda em banho-maria à geladeira a 4 °C por 30
min. A 2a porção do diluidor foi então adicionada ao sêmen, fornecendo uma
concentração final de glicerol de 6%. Cinco minutos após a glicerolização, o sêmen foi
envasado em palhetas de 250 μL e expostas aos vapores de nitrogênio de -70°C em
caixa de isopor por 5 min, distando as palhetas 5 cm do nível de nitrogênio líqüido. Ao
final deste período, foram acondicionados em botijão de nitrogênio a –196 °C.
Motilidade e vigor foram avaliados após diluição, resfriamento a 15°C e 4°C; e
glicerolização.
5. Descongelação e análise do sêmen
5.1. Análise subjetiva do sêmen
Após um intervalo mínimo de uma semana, foi realizada a descongelação por
imersão das palhetas em banho-maria a 37°C por um minuto, depositando-se o sêmen
em tubos aquecidos a 37°C. Imediatamente, o sêmen descongelado foi avaliado quanto
à motilidade e vigor espermáticos em microscopia de luz (100x).
5.2. Análise computadorizada do sêmen
Dez amostras (1 a 2 ejaculados de cada animal) foram destinadas à análise
computadorizada da motilidade espermática, com auxílio de um microscópio de
contraste de fase acoplado a uma vídeo-câmara adaptada ao sistema Sperm Class
Analyser® (SCA, Microptic S.L., versão 3.2.0). Dois μl de cada amostra foram
colocados em uma Câmara de Makler® (Sel-Medical Instruments), previamente
aquecida a 37ºC, sendo avaliados os parâmetros de motilidade total (MT, %),
motilidade progressiva (MP, %), velocidade média da trajetória do espermatozóide
(VAP, μm/s) e percentual de sub-populações de espermatozóides com velocidade média
(VAP 55 a 95 μm/s) e rápida (VAP > 95 μm/s).
5.3. Teste de Termorresistência
Dez amostras (1 a 2 ejaculados de cada animal) do sêmen descongelado foram
avaliadas quanto à longevidade espermática pelo teste de termorresistência em
microscopia de luz (100x) quanto à motilidade e vigor espermáticos imediatamente após
a descongelação e a cada 10 min durante 60 min (T0 a T60). No tempo T0, foi
procedido o teste hiposmótico e a avaliação do percentual de espermatozóides vivos e
mortos, como descrito para o sêmen fresco. Nos tempos T0, e T60 de incubação
também foram avaliadas a morfologia espermática e integridade do acrossoma, com
lâminas coradas com rosa de bengala.
6. Análise Estatística
Os resultados de coloração foram descritos subjetivamente e os demais
parâmetros de análise subjetiva e computadorizada foram expressos na forma de média
e desvio padrão. Os dados percentuais sofreram transformação angular. ANOVA
seguida do teste de Fisher PLSD foi utilizada para comparar a motilidade e o vigor,
alterações morfológicas, porcentagem de espermatozóides vivos, e membrana funcional
entre os diferentes etapas. Para todos os parâmetros, considerou-se p<0,05 (Stat View
for Windows®, SAS Institute Inc., Versão 5.0, 1998).
Resultados e Discussão
Foram utilizados 23 ejaculados para o processamento inicial de diluição,
resfriamento, glicerolização e envase. Os resultados de motilidade e vigor espermáticos
obtidos para o sêmen a fresco estão descritos na Tab 1. Grande variação no volume e na
concentração foi encontrada entre as amostras, mas todos os dados encontram-se dentro
da normalidade para a espécie, segundo SOJKA et al. (1970) e AXNER e LINDEFORSBERG (2002).
Os mesmos parâmetros avaliados nas diferentes etapas avaliadas pré-congelação,
expressos nos Gráficos 1 e 2, também revelam bons resultados com o uso do ACP117®. Entretanto, mesmo a ação protetora das lipoproteínas de membrana incluídas na
fração de baixa densidade da gema de ovo, protegendo a célula por interação com a
membrana plasmática, pode não ter sido suficiente para proteger de forma efetiva os
danos causados pelo abaixamento da temperatura. Sabe-se que gema de ovo previne o
enrolamento da cauda do espermatozóide, favorecendo sua motilidade (HOLT, 2000).
Assim, a baixa dissolução da gema, observada pela grande quantidade de grumos à
microscopia óptica e no CASA, pode também ter afetado a motilidade e o vigor
espermático associado à redução da temperatura.
O método de congelação empregado no presente trabalho não permitiu o controle
efetivo da velocidade do resfriamento. BAUDI (2005) também utilizando resfriamento
em geladeira relata para sêmen de gatos domésticos e para mais duas espécies de
felídeos silvestres, a jaguatirica (Leopardus pardalis) e o gato-do-mato-pequeno e (L
tigrinus) que independente da taxa de resfriamento utilizada (lenta ou rápida) há
redução significativa na motilidade e no vigor pós-descongelação, assim como o
observado no presente trabalho.
Após a etapa de glicerolização, observou-se uma queda significativa da motilidade
e do vigor em relação à diluição inicial, bem como no resultado pós-descongelação. A
injúria pós-descongelação sofrida pelo espermatozóide e outras células viáveis
ocasionada pela retirada brusca do glicerol é geralmente atribuída ao choque osmótico
(FRIM e MAZUR, 1983, SCHNEIDER e MAZUR, 1984). Para sêmen felino,
preconiza-se a adição de 3% (HAY & GOODROWE, 1993) a 4% de glicerol
(ZAMBELLI et al, 2002), e concentrações de 8% de glicerol são consideradas tóxicas
aos espermatozóides felinos (ZAMBELLI et al., 2002). Bons resultados nos testes
iniciais com TRIS acrescido de 20% de gema e 6% de glicerol e o mesmo protocolo de
criopreservação empregado neste trabalho realizado em nosso laboratório (SILVA et al.,
comunicação pessoal), levou-nos a realizar as avaliações da congelação do sêmen felino
com o ACP-117® com esta concentração de glicerol. Entretanto, sugerem-se novas
avaliações com taxas de glicerolização mais próximas às descritas na literatura, a fim de
se obter melhores valores de motilidade e vigor espermáticos. Para cães, o ACP-106®,
seguindo o mesmo protocolo utilizado, permite valores superiores entre 46 e 66% de
motilidade (CARDOSO et al., 2005; MADEIRA, 2007; BARBOSA, 2007). A
temperatura de adição do glicerol, também é um fator variante entre os procedimentos
de criopreservação, observando-se na literatura que para gatos domésticos a adição pode
ocorrer tanto a 20 (ZAMBELLI et al., 2002) como a 4°C (CHATDARONG et al.,
2007). Além disto, o tempo de equilíbrio utilizado no presente trabalho (de apenas 5
minutos) pode não ter sido suficiente para que o crioprotetor exercesse a sua ação
benéfica de desidratação antes congelação. Em cães, com o ACP-106®, não foram
observadas diferenças na motilidade espermática com a adição de glicerol a 4 ou 27°C
(BARBOSA, 2007), sugerindo que diferentes temperaturas de adição do glicerol sejam
avaliadas com o ACP-117®.
Após o resfriamento incial, ZAMBELLI et al. (2002), utilizando TRIS, 20% gema
e 4% de glicerol afirmam que a taxa de 3,85 °C/ min permitiu os melhores resultados,
com 61,55% de motilidade pós-descongelação. Após o envase, com o método de
congelação utilizado no presente trabalho, realizou-se uma queda de 4 a -70°C na
temperatura em aproximadamente 5 min, sendo superior à taxa de congelação descrita
por ZAMBELLI et al. (2002), podendo ter contribuído para os baixos resultados
observados no presente trabalho. A média de motilidade pós-descongelação obtida no
presente trabalho encontra-se próxima do valor obtido para sêmen epididimário (24%TSUTSUI et al., 2003), e obtido por vagina artificial (26%- TSUTSUI et al., 2000), mas
abaixo do valor médio obtido (52,8%) por VILLAVERDE, (2007), todos utilizando
TRIS como diluidor base. Os resultados de motilidade pós-descongelação no presente
trabalho foram muito variáveis entre as amostras (0 a 60%). O vigor espermático está
compatível com o obtido por TEBET et al. (2006), porém para sêmen eletroejaculado e
epididimário. Resultados de 26% (15-40%) de motilidade pós-descongelação obtidos
por TSUTSUI et al. (2000) garantiram gestação de 4 de 9 gatas inseminadas via
intrauterina. Desta forma, avaliações in vivo com IA intrauterina são sugeridas para que
o uso do sêmen criopreservado com o ACP-117®, segundo o protocolo utilizado, seja
recomendado. Resultados bastante superiores de motilidade pós-descongelação com
sêmen obtido por vagina artificial (70,6%- PLATZ et al., 1978) e por eletroejaculação
(70%- CHATDARONG et al., 2007), demonstram que o protocolo testado no presente
trabalho necessita ser ajustado a fim de garantir melhores resultados pós-descongelação,
para que o ACP-117® venha a se constituir uma alternativa aos diluidores
convencionais.
Outro fator a ser controlado para garantir melhores resultados pós-descongelação
é a taxa de descongelação, realizada por muitos autores a 37 °C/ 30 segundos
(ZAMBELLI et al., 2002; TSUTSUI et al., 2003; BAUDI, 2005), taxa esta próxima a
utilizada no presente trabalho. Taxas de descongelação a 46°C/ 12 segundos
(VILLAVERDE, 2007) e 15 segundos (TEBET, 2004) ou 70°C/6 segundos
(CHATDARONG et al., 2007) são relatadas em protocolos de criopreservação,
garantindo resultados de motilidade de vigor superiores aos aqui obtidos. Sugere-se que
novas taxas de descongelação devam ser avaliadas utilizando o sêmen felino com o
ACP-117®, assim como realizado para cães com o ACP-106®, que garantiu melhores
resultados a 55°C/ 5 segundos (MADEIRA, 2007).
Sabe-se que quando não diluído, o sêmen felino pode ser incubado a 37 °C
mantendo boa motilidade por 60 minutos (AXNÈR, 1998). Entretanto, após a
descongelação no presente trabalho, a motilidade já em baixos níveis se manteve por
apenas 10 minutos (Tabela 2). Uma significativa redução no percentual de
espermatozóides normais pós-descongelação (Tab. 3) do sêmen de gatos domésticos era
esperada segundo a literatura (BAUDI, 2005), entretanto, a integridade acrossomal foi
mantida, sendo a as alterações pós-descongelação caracterizadas por alterações
morfológicas secundárias, predominando o enrolamento da cauda. A avaliação pósdescongelação foi realizada no presente trabalho sem a remoção do diluidor contendo o
crioprotetor e a gema de ovo. Alguns trabalhos realizam a centrifugação pósdescongelação e o concentrado de espermatozóides é resuspendido em meio base
(BAUDI, 2005), ou a amostra após a descongelação permanece incubada a 38°C por 5
min em meio base (CHATDARONG et al., 2007) e somente após estes procedimentos
as amostras são avaliadas quanto a motilidade pós-descongelação. Entretanto, as
avaliações de sêmen realizadas para cães em ACP-106®não utilizam a centrifugação. A
realização da centrifugação pode contribuir para um melhor avaliação da motilidade
pelo CASA (Tab. 4). No presente trabalho observou-se grande quantidade de grumos de
gema, tornando esta avaliação pouco prática e requerendo a limpeza manual das
imagens, já que grumos são confundidos com espermatozóides imóveis. A motilidade
subjetiva das mesmas amostras submetidas ao CASA foi de 22,03 ± 6,79 %. Assim, na
motilidade subjetiva, acredita-se que certos grumos de gema em movimento também
podem ter sidos interpretados como espermatozóides, levando a uma grande diferença
entre as análises. A análise computadorizada de sêmen é ainda pouco empregada para
gatos domésticos, tendo sido os relatos encontrados na literatura oriundos de diferentes
sistemas de análise: Cell Track/s System para sêmen epididimário (STACHECKI et al.,
1993) e Hamilton Thorn Reasearch para sêmen obtido por vagina (VILLAVERDE,
2007). Assim, não foram encontradas descrições prévias do uso do SCA para gatos
domésticos.
Tabela 1: Avaliação (média ± desvio padrão) do sêmen fresco dos gatos domésticos
utilizados (n= 23 ejaculados).
Parâmetros
Valores
Coloração
Branco-opalescente a leitoso
Volume
42,10 ± 22,21 µL (14 – 110)
Concentração espermática
1.455,00 ± 1.720,69 x 106 sptz/mL (130- 7.260)
Motilidade Espermática
92,10% ± 9,67 (70 - 100)
Vigor
4,67 ± 0,49 (3,5 – 5)
ab
bc
bc
c
Descongelado
Glicerolizado
4°C
15°C
Diluição inicial
d
Fresco
Motilidade (%)
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Etapas
Gráfico 1: Motilidade média do sêmen a de gatos domésticos e nas etapas de
criopreservação (diuição inicial, a 15°C, a 4°C, após a glicerolização, e descongelação)
utilizados (n= 23 ejaculados) com água de coco em pó (ACP-117®).
a,b,c,d
Letras diferentes representam diferença significativa (P<0,05).
a
5
4,5
ab
b
bc
bc
Vigor
4
3,5
c
3
2,5
2
1,5
1
Descongelado
Glicerolizado
4°C
15°C
Diluição inicial
Fresco
0,5
0
Etapas
Gráfico 2: Vigor médio do sêmen a de gatos domésticos e nas etapas de
criopreservação (diuição inicial, a 15°C, a 4°C, após a glicerolização, e descongelação)
utilizados (n= 23 ejaculados) com água de coco em pó (ACP-117®).
a,b,c
Letras diferentes representam diferença significativa (P<0,05).
Tabela 2: Análise subjetiva de motilidade e vigor (média ± erro padrão) durante os
tempos de avaliação do teste de termorresistência do sêmen dos gatos domésticos após
criopreservação em água de coco em pó (ACP-117®; n= 21 ejaculados).
Tempos
a,b,c,d,e
Parâmetros
Motilidade
Vigor
T0
25,07% ± 21,40a
3,44 ± 1,28a
T10
21,13% ± 20,95ab
3,23 ± 1,56a
T20
16,80% ± 17,47ad
2,64 ± 1,71ac
T30
8,68% ± 11,90bde
1,70 ± 1,70bc
T40
2,56% ± 3,95ce
1,41 ± 1,74bd
T50
1,16% ± 2,66ce
1,27 ± 1,59bd
T60
0,16% ± 0,34c
0,65 ± 1,22d
Letras diferentes na mesma coluna representam diferença significativa (P<0,05).
Tabela 3: Avaliação do sêmen de gatos domésticos a fresco e após criopreservação em
água de coco em pó (ACP-117®) em relação aos parâmetros de percentual de
espermatozóides vivos, com funcionalidade de membrana, e alterações morfológicas
(integridade acrossomal, percentual de normais e anormais e alterações primárias e
secundárias; n= 10 ejaculados).
Tempos
Parâmetros
(%)
Fresco
T0
T60
Sptz vivos
46,55 ± 32,32a
16,81 ± 18,03b
9,10 ± 9,37b
Funcionalidade de
membrana
Alterações morfológicas
66,68 ± 25,70a
44,33 ± 11,63b
NR
Integridade acrossomal
98,67 ± 1,23a
98,56 ± 1,52a
98,11 ± 1,50a
normais
81,50 ± 10,80a
66,56 ± 10,62b
65,69 ± 14,07c
anormais
18,5 ± 10,80a
33,44 ± 10,62b
29,31 ± 11,78c
alterações primárias
6,77 ± 12,50a
1,28 ± 1,05b
1,13 ± 1,69a
alterações secundárias
11,73 ± 5,70a
47,16 ± 33,94bc
41,13 ± 38,49ac
NR- não realizado
a, b, c
Letras diferentes na linha representam diferença significativa (P<0,05).
Tabela 4: Análise computadorizada (CASA) do sêmen de gatos domésticos após
criopreservação em água de coco em pó (ACP-117®) em relação aos parâmetros de
motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %), velocidade média da
trajetória do espermatozóide (VAP, μm/s) e sub-populações de espermatozóides rápidos
e lentos (%; n= 10 ejaculados).
Parâmetros
Valores
MT
9,12 ± 10,54
(%)
(0 – 29,50)
MP
4,79 ± 5,17
(%)
(0 – 15,60)
VAP dos sptz rápidos
65,32 ± 45,63
(μm/s)
(0 – 109,60)
VAP dos sptz médios
49,02 ± 49,02
(μm/s)
(0 – 81,50)
Sub-população A
2,41 ± 3,15
(%)
(0 – 10,10)
Sub-população B
2,89 ± 3,44
(%)
(0 – 9,10)
A- sub-populações de espermatozóides com velocidade média (VAP 55 a 95 μm/s);
B- sub-populações de espermatozóides com velocidade rápida (VAP > 95 μm/s).
CASA realizada pelo sistema Sperm Class Analyser® (SCA), Microptic S.L., versão
3.2.0
Conclusão
O protocolo utilizado para criopreservação de sêmen de gatos domésticos em
ACP-117® permite baixa viabilidade in vitro dos espermatozóides pós-descongelação.
A formulação do ACP-117® e o protocolo testado no presente trabalho necessitam ser
ajustados a fim de garantir melhores resultados pós-descongelação, para que o ACP117® venha a se constituir uma alternativa aos diluidores convencionais para
criopreservação de sêmen de gatos domésticos.
Agradecimentos
Ao CNPQ, à CAPES e à FUNCAP pelo custeio do experimento e pelas
bolsas de pesquisas concedidas. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza pela
concessão das vacinas anti-rábicas aplicadas nos animais. À FUNCEME pela concessão
dos dados climáticos. Ao Prof. Dr. José Ferreira Nunes e Dra. Cristiane de Mello
Salgueiro pela disponibilização do uso do CASA, e do ACP-117®.
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6. Conclusões
•
O protocolo de anestesia inalatória com indução anestésica com cetamina,
diazepam e manutenção com isoflurano foi o que melhor promoveu analgesia,
segurança ao procedimento anestésico e à equipe, bem como um tempo rápido
de recuperação para EEJ em gatos domésticos.
•
O protocolo de anestesia inalatória com a indução anestésica com cetamina,
diazepam e manutenção com isoflurano é eficientemente indicado para coleta de
sêmen por eletroejaculação em gatos domésticos.
•
Em condições de fotoperíodo equatorial natural, o volume testicular de gatos
domésticos não é, até o momento, indicado para indicado para avaliar os
reprodutores.
•
O uso da diluição do sêmen fresco de gatos domésticos com ACP-117® não
altera a motilidade e o vigor espermático, entretanto o protocolo descrito para IA
intravaginal utilizado não foi adequado, necessitando de ajustes no protocolo e
um maior número de inseminações.
•
O protocolo utilizado para criopreservação de sêmen de gatos domésticos em
ACP-117® permite baixa viabilidade in vitro dos espermatozóides pósdescongelação. A formulação do ACP-117® e o protocolo testado no presente
trabalho necessitam ser ajustados a fim de garantir melhores resultados pósdescongelação, para que o ACP-117® venha a se constituir uma alternativa aos
diluidores convencionais para criopreservação de sêmen de gatos domésticos.
7. Perspectivas
•
Avaliação de novos protocolos anestésicos para EEJ em gatos domésticos
que possam garantir qualidade seminal adequada a fim de ser utilizado em
protocolos de conservação;
•
Aperfeiçoamento do protocolo de IA com sêmen a fresco diluído em ACP117® em gatos domésticos possibilitará incremento na taxa de gestação;
•
O desenvolvimento de um protocolo de criopreservação de sêmen específico
para a espécie felina, utilizando ACP-117® em gatos domésticos, garantirá
bons resultados in vitro e in vivo;
•
O desenvolvimento deste protocolo viabilizará o uso do ACP-117® para
criopreservação de sêmen de espécies felídeas ameaçadas de extinção.
8. Referências Bibliográficas
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9. Apêndices
APÊNDICE 1: Anel de pêlo na base do pênis de um gato doméstico.
A
B
APÊNDICE 2: Vagina artificial para coleta de sêmen de gatos
domésticos. A- Montagem da vagina com tubo plástico de 1,5 mL
sem tampa e borracha de conta-gotas. B- Amostra de seminal.
APÊNDICE 3: Coleta de sêmen de um gato
doméstico com uso da vagina artificial.
APÊNDICE 4: Biometria do pênis de um gato doméstico
com paquímetro.
A
B
APÊNDICE 5: Eletroejaculação. A- Aparelho para eletroejaculação utilizado nos
experimentos (Eletrojet®, Electrovet®, Brasil). B- Exposição peniana para colocar o tubo
de coleta de sêmen antes da aplicação dos choques elétricos em um gato doméstico
anestesiado.
APÊNDICE 6: Monitoração da saturação de oxigênio durante a
eletroejaculação, utilizando oxímetro de pulso digital através de sensor
localizado na língua do animal (Oxifast 9504®, Takaoka®).
APÊNDICE 7: Esfregaço de sêmen felino a fresco corado com
azul de bromo fenol. Seta amarela- espermatozóides totalmente
corados ou parcialmente corados (mortos). Seta verdeespermatozóides descorados (vivos). Aumento de 400x.
APÊNDICE 8: Análise computadorizada (Sperm Class
Analiser®) após descongelação do sêmen de gato doméstico
criopreservado em ACP-117® acrescido de 20% de gema de
ovo e 6% de glicerol. Pontos amarelos- espermatozóides
imóveis. Traçados vermelho, verde e azul: trajetória de
espermatozóides rápidos, médios e lentos, respectivamente.
Pontos brancos- grumos de gema de ovo. Aumento de 100x.
10. Anexos
ANEXO 1: Composição e modo de preparo do corante Rosa de Bengala.
Componentes
Quantidades
Água destilada
20 mL
Citrato de sódio
0,58 g
Formaldeído
0,8 mL
Rosa de Bengala
0,3 g
Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e
acrescenta-se o Rosa de Bengala.
ANEXO 2: Composição e modo de preparo do corante Azul de Bromofenol.
Componentes
Quantidades
Água destilada
10 mL
Citrato de sódio
0,4 g
Azul de Bromofenol
0,1 g
Após a mistura dos componentes, o pH e osmolaridade devem ser aferidos.
ANEXO 3: Composição da água de coco anão maduro.
1. Aminoácidos (μg/ml)
Alanina
177,1
Aminobutírico
168,8
Arginina
16,8
Asparagina
10,4
Aspártico
5,4
Fenilalanina
10,2
Glicina
13,9
Glutâmico
78,8
Glutamina
13,4
Histidina, Metionina e Hidroxipolina
Traços
Homoserina
5,2
Leucina
31,7
Lisina
22,5
Prolina
21,6
Serina
65,8
Tirosina
3,1
Treonina
26,3
Valina
15,1
2. Açúcares(μg/ml)
Frutose
8,9
Glicose
2,46
Sacarose
2,51
3. Vitaminas (μg/ml)
Ácido fólico
0,003
Ácido nicotínico
0,64
Ácido pantotéico
0,52
Biotina
0,02
Tiamina e Piridoxina
0,01
4. Minerais (μg/ml)
Cálcio
Traços
Cloro
183,0
Cobre
0,04
Enxofre
24,0
Ferro
0,10
Fósforo
37,0
Magnésio
30,0
Potássio
312,0
Sódio
105,0
FONTE: NUNES e COMBARNOUS, 1995.