NAFTOL AS-D CLOROACETATO
ESTERASE E
α-NAFTIL ACETATO ESTERASE
(Procedimento N.º 90)
_______________________________
UTILIZAÇÃO PREVISTA
_______________________________
Os reagentes da Sigma-Aldrich destinam-se à
demonstração citológica de naftol AS-D cloroacetato esterase
e α-naftil acetato esterase em esfregaços do sangue ou
medula óssea ou preparações de tecido duro. Os reagentes
de esterase destinam-se à “utilização em diagnóstico in vitro”.
As esterases celulares são ubíquas e representam uma
série de enzimas diferentes que actuam sobre substratos
seleccionados. Em condições de reacção definidas, poderá
ser possível determinar os tipos de células hematopoiéticas,
utilizando substratos de esterase específicos. Os métodos
descritos apresentam formas para distinguir granulócitos de
monócitos.1-8
Para realizar a análise, os esfregaços do sangue e
da medula óssea ou as preparações de tecido duro são
incubados com naftol AS-D cloroacetato ou α-naftil acetato na
presença de um sal de diazónio estável. A hidrólise enzimática
de ligações éster liberta compostos de naftol livres. Estes
compostos acoplam-se ao sal de diazónio, formando depósitos
fortemente coloridos nos locais de actividade enzimática.
_______________________________
REAGENTES
_______________________________
DIMETILFORMAMIDA, N.º de Catálogo 9010-25 mL
Éter monometílico do etileno glicol, N.º de Catálogo 9011-25 mL
NAFTOL AS-D CLOROACETATO, N.º de Catálogo 905-10CAP
Cápsula contém 20 mg.
α-NAFTIL ACETATO, N.º de Catálogo 906-10CAP
Cápsula contém 20 mg.
CONCENTRADO DE TAMPÃO TRIZMALTM 6,3,
N.º de Catálogo 903C-50 mL
TRIZMA® maleato, 200 mmol/L. Clorofórmio adicionado como
conservante.
CONCENTRADO DE TAMPÃO TRIZMALTM 7,6,
N.º de Catálogo 902C-50 mL
TRIZMA® maleato, 200 mmol/L. Clorofórmio adicionado como
conservante.
Solução de hematoxilina de MAYER,
N.º de Catálogo MHS1-100 mL
Hematoxilina, certificada, 0,1% (p/v) e estabilizadores.
SOLUÇÃO DE HEMATOXILINA ÁCIDA, N.º de Catálogo 2852-100 mL
Hematoxilina certificada, 1 g/L e estabilizadores, pH 3,3 a 25°C.
SAL RR DE AZUL PERMANENTE,
N.º de Catálogo FBS25-10CAP
Cápsulas previamente pesadas. O peso real por cápsula irá
variar consoante a pureza do lote do corante e foi optimizado
por ensaio.
SAL V DE CORINTO PERMANENTE,
N.º de Catálogo 9015-10CAP
CONCENTRADO DE CITRATO, N.º de Catálogo 3861-20 mL
Tampão citrato, 0,383 mol/L, pH 5,4 quando diluído de acordo
com o procedimento.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE:
A dimetilformamida, o éter monometílico do etileno glicol,
o concentrado de tampão TRIZMALTM 6,3, o concentrado
de tampão TRIZMALTM 7,6, a solução de hematoxilina de
Mayer e a solução de hematoxilina ácida são armazenados à
temperatura ambiente (18–26°C).
O naftol AS-D cloroacetato, o α-naftil acetato e o sal RR
de azul permanente são armazenados a uma temperatura
inferior a 0°C.
O sal V de Corinto permanente e o concentrado de citrato
são armazenados refrigerados (2–8°C).
O naftol AS-D cloroacetato, o α-naftil acetato, o sal RR de
azul permanente e o sal V de Corinto permanente permanecem
estáveis até ao final do prazo de validade indicado nos rótulos.
A solução diluída de citrato permanece estável durante
1 semana quando armazenada devidamente tapada à
temperatura ambiente (18–26°C).
O concentrado de tampão TRIZMALTM 6,3, concentrado
de tampão TRIZMALTM 7,6 e o concentrado de citrato são
adequados para utilização na ausência de crescimento
bacteriano.
Fluoreto de sódio, 2 g/dL. Armazenar à temperatura
ambiente (18–26°C). Utilizado se for realizado o “Procedimento
de α-naftil acetato esterase com inibição de fluoreto”.
DETERIORAÇÃO:
Eliminar a dimetilformamida e o éter monometílico do
etileno glicol se apresentarem coloração ou turvação.
A solução de tampão diluído TRIZMALTM 6,3 e solução
de tampão diluído TRIZMALTM 7,6 deverão ser utilizadas uma
única vez e, em seguida, eliminadas.
Eliminar a hematoxilina de Mayer e solução de
hematoxilina ácida quando o período necessário para uma
coloração adequada ultrapassar em mais de 5 minutos o
período recomendado no procedimento.
PREPARAÇÕES:
A SOLUÇÃO DE NAFTOL AS-D CLOROACETATO é
preparada dissolvendo o conteúdo de 1 cápsula de naftol AS-D
cloroacetato em 2 mL de dimetilformamida. Retirar 1 cápsula
do congelador, conforme necessário. Preparar imediatamente
antes de utilizar.
A SOLUÇÃO DE α-NAFTIL ACETATO é preparada
dissolvendo o conteúdo de 1 cápsula de α-naftil acetato em
2 mL de éter monometílico do etileno glicol. Retirar 1 cápsula
do congelador, conforme necessário. Preparar imediatamente
antes de utilizar.
A SOLUÇÃO DE TAMPÃO DILUÍDO TRIZMALTM 6,3
é preparada diluindo 1 parte de concentrado de tampão
TRIZMALTM 6,3 com 9 partes de água desionizada. O pH
deverá ser 6,3 a 25°C.
A SOLUÇÃO DE TAMPÃO DILUÍDO TRIZMALTM 7,6
é preparada diluindo 1 parte de concentrado de tampão
TRIZMALTM 7,6 com 9 partes de água desionizada. O pH
deverá ser 7,6 a 25°C.
A hematoxilina de Mayer e a solução hematoxilina ácida
deverão ser filtradas antes de utilizar
A SOLUÇÃO DE CITRATO DILUÍDA é preparada diluindo
1 parte de concentrado de citrato com 9 partes de água
desionizada. pH 5,4 quando diluída.
FIXADOR DE CITRATO, ACETONA E METANOL: A 18
mL de solução de citrato diluída, adicionar 27 mL de acetona
de graduação ACS e 5 mL de metanol. Armazenar o frasco
devidamente tapado à temperatura ambiente (18–26°C).
Eliminar após 8 horas.
PRECAUÇÕES:
Deverão ser aplicadas as precauções normais
relativamente ao manuseamento de reagentes laboratoriais.
Eliminar os resíduos de acordo com todos os regulamentos
locais, estaduais, regionais ou nacionais. Consultar a ficha
de dados de segurança dos materiais para obter informações
mais actualizadas sobre os riscos, perigos ou segurança.
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PROCEDIMENTO
_______________________________
COLHEITA DE AMOSTRAS:
Recomenda-se que a colheita de amostras seja realizada
de acordo com o documento M29-A3 da CLSI. Nenhum método
de teste conhecido poderá garantir totalmente que as amostras
sanguíneas ou de tecido não irão transmitir infecções. Por essa
razão, todos os derivados sanguíneos ou amostras de tecido
deverão ser considerados potencialmente infecciosos.
Poderão ser utilizados esfregaços do sangue e
medula óssea, preparações de tecido duro e preparações
citocentrífugas com α-naftil acetato esterase e naftol AS-D
cloroacetato esterase É possível utilizar EDTA ou heparina
como anticoagulante.9 Os tecidos congelados e embebidos em
parafina podem ser utilizados com a naftol AS-D cloroacetato
esterase. A α-naftil acetato esterase poderá ser utilizada com
sucesso em secções de tecido congeladas.10 Os esfregaços de
sangue ou da medula óssea podem ser armazenados fixados
à temperatura ambiente (18–26°C) durante várias semanas
ou sem estarem fixados durante vários dias, sem que se
verifique uma alteração significativa na actividade.5,9 Não enviar
amostras de sangue total para serem analisadas noutros
laboratórios. Enviar lâminas fixadas ou sem estarem fixadas.
Durante o transporte as amostras deverão ser conservadas
num ambiente refrigerado. Antes de se proceder à fixação,
deixar secar as lâminas durante, pelo menos, uma hora.
MATERIAIS ESPECIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO
FORNECIDOS:
Metanol, absoluto
Acetona, Reagente ACS
Solução de fluoreto de sódio, N.º de Catálogo 919-25 mL
Fluoreto de sódio, 2 g/dL
1-PT
NOTAS:
Os procedimentos descritos são realizados a 37°C. Se os
reagentes não se encontrarem a esta temperatura, poderão
obter-se reacções insuficientes ou negativas. Recomenda-se
a verificação das temperaturas com um termómetro preciso.
Os banhos-maria com controlo de temperatura são mais
eficazes do que as incubadoras de ar quente e deverão ser
utilizados para os métodos citoquímicos de enzimas. Uma vez
que a transferência de calor através do vidro é mais rápida do
que através do plástico, deverão utilizar-se jarras de Coplin de
vidro.
Altamentes sistemas enzimáticos são sensíveis a
vestígios mínimos de detergente. A lavagem dos materiais de
vidro com hipoclorito de sódio diluído seguida de uma lavagem
em quantidades copiosas de água desionizada irá impedir o
efeito do detergente sobre as enzimas celulares.
Os resultados baseiam-se num determinado grau de
interpretação subjectiva. Os laboratórios individuais deverão
estabelecer os seus próprios intervalos normais.
Os dados obtidos com este procedimento servem apenas
para auxiliar o diagnóstico e deverão ser analisados em
conjunto com outros testes de diagnóstico ou informações
clínicas.
PROCEDIMENTO:
PROCEDIMENTO DA NAFTOL AS-D
CLOROACETATO ESTERASE:
1.
Fixar as lâminas durante 1 minuto em fixador de citrato,
acetona e metanol à temperatura ambiente (18–26°C).
2.
Lavar abundantemente com água desionizada e secar
ao ar durante, pelo menos, 20 minutos.
3.
A 50 mL de solução de tampão diluído TRIZMALTM
6,3, PRÉ-AQUECIDA A 37°C, adicionar, mexendo
constantemente, o conteúdo de 1 cápsula de sal V de
Corinto permanente.
4.
Quando o sal se dissolver completamente no tampão,
adicionar 2 mL de solução de naftol AS-D cloroacetato. A
solução apresentará uma turvação considerável.
5.
Continuar a misturar durante 15 a 30 segundos e, em
seguida, adicionar a uma jarra de Coplin. NÃO FILTRAR.
6.
Colocar as amostras na solução de coloração (do Passo
5) e incubar a 37°C durante 5 minutos.
NOTA: PROTEGER DA LUZ.
7.
Retirar as lâminas da solução de coloração e lavar em
água desionizada durante 3 minutos. Eliminar a solução
de coloração.
8.
Caso se pretenda, proceder à contracoloração em
solução de hematoxilina ácida durante 5 a 10 minutos e
lavar com água da torneira.
9. Deixar secar ao ar e examinar as lâminas
microscopicamente. Caso seja necessária uma solução
de protecção, utilizar apenas um meio de montagem
aquoso.
PROCEDIMENTO DE α-NAFTIL ACETATO ESTERASE:
1.
Fixar as lâminas em fixador de citrato, acetona e metanol
durante 1 minuto à temperatura ambiente (18–26°C).
2.
Lavar abundantemente com água desionizada e secar
ao ar durante, pelo menos, 20 minutos.
3.
A 50 mL de solução de tampão diluído TRIZMALTM
7,6, PRÉ-AQUECIDA A 37°C, adicionar, mexendo
constantemente, o conteúdo de 1 cápsula de sal RR de
azul permanente.
4.
Quando o sal se dissolver completamente no tampão,
adicionar 2 mL de solução de α-naftil acetato. A solução
apresentará uma cor amarela e uma ligeira turvação.
5.
Continuar a mexer durante 15 a 20 segundos e, em
seguida, adicionar a uma jarra de Coplin. NÃO FILTRAR.
6.
Colocar as amostras na solução de coloração (do Passo
5) e incubar a 37°C durante 30 minutos.
NOTA: PROTEGER DA LUZ.
7.
Retirar as lâminas da solução de coloração e lavar em
água desionizada durante 3 minutos. Eliminar a solução
de coloração.
8.
Caso se pretenda, proceder à contracoloração durante
5 a 10 minutos em solução de hematoxilina de Mayer e
lavar com água da torneira.
9.
Deixar secar ao ar e examinar as lâminas microscopicamente. Caso seja necessária uma solução
de protecção, utilizar apenas um meio de montagem
aquoso.
PROCEDIMENTO DE ESTERASE DE DUPLA COLORAÇÃO:
1.
Realizar o teste de α-naftil acetato esterase, conforme
descrito em Procedimento. Não realizar uma
contracoloração.
2.
Lavar as lâminas durante 5 minutos em água
desionizada.
3.
Realizar o teste de naftol AS-D cloroacetato esterase,
conforme descrito nos passos 3 a 9 do procedimento.
PROCEDIMENTO DE α-NAFTIL ACETATO ESTERASE
COM INIBIÇÃO DE FLUORETO:
Embora a α-naftil acetato esterase seja detectada
principalmente em células de estirpes monocíticas quando o
teste é realizado conforme descrito deverá reconhecer-se que
os megacariócitos e precursores eritróides são positivos para
esta enzima.11 Os linfócitos e alguns granulócitos maduros
também apresentam ocasionalmente uma positividade.5
Para diferenciar estas células de uma forma convincente dos
monócitos, incorpora-se fluoreto de sódio com o sistema de
incubação. A enzima de monócitos é inactivada na presença
deste composto.12 É possível utilizar o procedimento seguinte
para realizar o teste de inibição de fluoreto.
1.
Fixar as lâminas em fixador de citrato, acetona e metanol
durante 1 minuto à temperatura ambiente (18–26°C).
2.
Lavar abundantemente com água desionizada e secar
ao ar durante, pelo menos, 20 minutos.
3.
Identificar 2 provetas com as letras A e B, e adicionar
o seguinte:
Proveta A
Proveta B
50 mL
50 mL
Adicionar, mexendo
constantemente, RR azul
permanente
1 cápsula
1 cápsula
Solução de α-naftil acetato
2 mL
2 mL
Tampão diluído pré-aquecido
a 37°C TRIZMALTM 7,6
—
2 mL
Solução de fluoreto de sódio
4.
Misturar bem e deitar nas jarras de Coplin identificadas
com a letra A e B.
5.
Continuar conforme descrito nos Passos 6–9 do
procedimento de α-naftil acetato esterase.
_______________________________
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
_______________________________
MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO:
Observar o esfregaço e seleccionar uma área fina com
poucos eritrócitos. Os locais de actividade de naftol AS-D
cloroacetato esterase irão apresentar uma granulação
vermelha viva e os de α-naftil acetato esterase uma
granulação negra. Classificar de 0 a 4+ com base na
quantidade e intensidade dos corantes individuais ao longo do
citoplasma dos respectivos tipos de células. As características
de classificação baseiam-se, de certa forma, na interpretação
subjectiva. Na Tabela 1 está apresentada uma sugestão para
o formato de classificação. As conclusões baseiam-se na
presença ou ausência relativas de coloração.
TABELA I
Características de classificação
Classificação
das células
0
1+
2+
3+
4+
Intensidade
de coloração
Nenhuma
Ligeira a moderada
Moderada a forte
Forte
Brilhante
Interpretação
–
±
+
+
+
RESULTADOS:
NAFTOL AS-D CLOROACETATO ESTERASE:
Esta enzima é normalmente considerada específica das
células de séries granulocíticas. As células deverão apresentar
uma granulação vermelha. A actividade é insuficiente ou
ausente nos monócitos ou linfócitos.
α-NAFTIL ACETATO ESTERASE:
Nas condições do ensaio (pH 7,6), esta enzima é detectada
principalmente em monócitos, macrófagos e histiócitos, e é
praticamente ausente nos granulócitos. Os monócitos deverão
apresentar uma granulação negra. Ocasionalmente, os
linfócitos poderão demonstrar actividade.
α-NAFTIL ACETATO ESTERASE
COM INIBIÇÃO DE FLUORETO:
Todas as células de estirpes monocíticas serão negativas
para a actividade enzimática, à excepção dos histiócitos
diferenciados ou macrófagos especializados em tecido que
também podem ser resistentes ao fluoreto de sódio.10
ESTERASE DE DUPLA COLORAÇÃO:
As amostras obtidas a partir do procedimento de dupla
coloração irão demonstrar os granulócitos com granulação
vermelha e os monócitos com granulação negra.
A reactividade celular esperada dos testes da actividade
da esterase está resumida na Tabela II.
TABELA II
Reacções citoquímicas dos elementos figurados do sangue
Tipo de células
Mieloblastos
Promielócitos
Neutrófilos.
Eosinófilos
Basófilos
Monócitos
Linfócitos
Linfoblastos
Megacariócitos
Eritroblastos
Células plasmáticas
Mastócitos
Células pilosas
Histiócitos
Naftol AS-D
α-Naftil
cloroacetato esterase acetato esterase
±
+
+
—
±
—
—
—
—
—
—
+
—
±
±
±
—
—
—
+
±
±
+
±
±
—
±
+
TRIZMA é uma marca comercial registada e TRIZMAL é uma
marca comercial da Sigma-Aldrich Co. LLC
A Sigma-Aldrich, Inc. garante que os seus produtos estão em
conformidade com as informações contidas nesta e em outras
publicações da Sigma-Aldrich. O comprador deverá determinar
a adequação do(s) produto(s) ao fim particular a que se
destinam. Poderão aplicar-se termos e condições adicionais.
Consultar o verso da factura ou carta de porte para mais
informações sobre os termos e condições de venda adicionais.
Procedimento N.º 90
Revisão Anterior: 2012-10
Revisto: 2013-02
O sistema de reagentes deverá ser monitorizado através
de lâminas de controlo positivo e negativo. As lâminas de
controlo positivo podem ser preparadas a partir de amostras
leucémicas ou linhagens celulares específicas conhecidas
como positivas.
Em alternativa, é possível utilizar sangue anticoagulado de
amostras normais (de preferência com uma contagem elevada
de monócitos se se estiver a utilizar o procedimento de α-naftil
acetato esterase); no entanto, este tipo de amostras fornecerá
uma coloração menos intensa e possuirá um número inferior
de células positivas.
As lâminas de doentes negativos conhecidos poderão
ser utilizadas como controlo negativo. Caso não estejam
disponíveis, a coloração de uma amostra numa mistura
de incubação com o substrato omitido irá proporcionar os
resultados pretendidos. No entanto, recomenda-se a utilização
da primeira.
Se os resultados observados forem diferentes dos
esperados, contactar a Assistência Técnica da Sigma-Aldrich
para mais informações.
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BIBLIOGRAFIA
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AR-MED, a division of Quintiles Ltd
Runnymede Malthouse
Off Hummer Road
Egham
Surrey
TW20 9BD
United Kingdom
SIGMA-ALDRICH, INC.
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