MARIA ESTHER RICCI DA SILVA
ANÁLISE PROTEÔMICA DO COMPLEXO SALIVAR
DA SANGUESSUGA HAEMENTERIA depressa
Tese Apresentada ao Programa de PósGraduação Interunidades em Biotecnologia
– USP – Instituto Butantan – IPT da
Universidade de São Paulo, para obtenção
do Título de Doutor em Biotecnologia.
Orientadora: Dra Ana Marisa Chudzinski-Tavassi
São Paulo
Outubro/2004
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
Ricci-Silva, Maria Esther.
Análise proteômica do complexo salivar da sanguessuga
Haementeria depressa / Maria Esther Ricci-Silva. -- São Paulo, 2004.
Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação Interunidades em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT.
Área de concentração: Biotecnologia.
Linha de pesquisa:coagulacão e fibrinólise a) purificação,
caracterização, mecanismos de ação e biologia molecular de agentes
anticoagulantes e fibrinolíticos naturais.
Orientador: Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa.
Versão do título para o inglês: Proteomic analysis of the salivary
gland complex from leech Haementeria depressa.
Descritores: 1. Haementeria depressa 2. Eletroforese bidimensional
3. Espectrometria de massa 4.Proteoma 5. Complexo salivar 6.
proteínas antihemostáticas
ICB/SBIB091/2004
Àos
meus pais Delson Edmundo Ferraz da Silva e Maria José Ricci da Silva;
meu irmão Delson Edmundo Ferraz da Silva Júnior;
minha cunhada Andréa Christie Oliveira Peters;
meu namorado Adrien Oleszkiewicz.
pelo incentivo que sempre encontrei.
AGRADECIMENTOS
Este período de desenvolvimento de doutoramento (1999-2004) propicioume uma oportunidade de conhecer pessoas que contribuíram para meu
aperfeiçoamento científico e pessoal. Além do conhecimento adquirido, agradeço
pelo incentivo, confiança e apoio.
Desta forma, agradeço em especial:
À Dra. Ana Marisa Chudzinski-Tavassi do Laboratório de Bioquímica e
Biofísica – Instituto Butantan, minha orientadora, que nunca deixou de me apoiar
em todas as etapas difíceis e permitiu a concretização deste trabalho.
Ao Dr. Tetsuo Yamane do Laboratório de Toxinologia Molecular – Instituto
Butantan, meu co-orientador, que me acolheu com amizade em seu laboratório.
Agradeço também àqueles que participaram efetivamente de meu trabalho:
Ao Dr. Katsuhiro Konno do Centro de Toxinologia Aplicada - Instituto
Butantan, pela ajuda na obtenção de seqüências por espectrometria de massa,
bem como em suas interpretações;
Ao Dr. Gandhi Rádis Baptista do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular - Universidade Federal do Ceará, pela confiança e incentivo durante o
desenvolvimento deste trabalho;
Ao Dr. Wagner Fontes do Laboratório de Bioquímica e Química de
Proteínas - Universidade de Brasília, pela orientação na fase de digestão dos
spots à partir de géis bidimensionais, para posterior sequenciamento;
Ao Dr. Reto Stöcklin, Sophie Michalet, Philippe Favreau, Guillaume Gueton
do Laboratório Atheris – Suíça, pelos ensinamentos dos princípios de
espectrometria de massa e pelo carinho com que me acolheram durante 6 meses;
À Fernanda Faria do Laboratório de Bioquímica e Biofísica – Instituto
Butantan, pelo suporte com a construção do banco de ESTs e pela colaboração
durante o desenvolvimento deste trabalho;
À Simone Michaela Simons do Laboratório de Bioquímica e Biofísica –
Instituto Butantan, pelo auxílio na coleta e manutenção de sanguessugas;
Ao Márcio Fritzen do Laboratório de Bioquímica e Biofísica – Instituto
Butantan, e Cícero Zanini da Universidade Federal de Santa Catarina, pelo auxílio
na coleta de sanguessugas;
Ao Álvaro Rossan de Brandão Prieto da Silva do Laboratório de Toxinologia
Molecular – Instituto Butantan, pelo apoio e pelo auxílio na confecção das figuras
desta dissertação;
Ao Dr. Igor Correia Almeida do Laboratório de Glicobiologia de Parasitas –
ICB/USP; Ernesto Satoshi Nakayasu e Lourivaldo dos Santos Pereira do
Laboratório de Bioquímica e Imunologia de artrópodes – ICB/USP, Dr. Claudemir
Lúcio do Lago do Laboratório de Automação e Instrumentação analítica do
IQ/USP, pela atenção com que me receberam para discussões e sugestões
científicas;
Ao Michael Murgu, Luciana Curiati, Marisa Dinnocenzo – Amersham
Biosciences, pelo suporte técnico;
Ao Dr. Ivo Lebrun – Diretor do Laboratório de Bioquímica e Biofísica –
Instituto Butantan, pelas sugestões por ocasião da qualificação deste trabalho;
Ao Dr. Antônio Carlos Martins de Camargo, Diretor do Centro de
Toxinologia Aplicada do Instituto Butantan, pelo suporte instrumental para a
concretização deste trabalho;
Aos amigos/colegas: Durvanei Maria Augusto, Myriam Paola Alvarez Flores,
Janaína de Souza Ventura, Isabel de Fátima Correa Batista, Cleyson Valença
Reis, Jeane Claine Albuquerque Modesto, Linda Christian Carrijo, Agostinho Luiz
Maia Pereira, do Laboratório de Bioquímica e Biofísica – Instituto Butantan;
Ricardo Yassaka e Maria Cristina Viana Braga do Laboratório de Toxinologia
Molecular – Instituto Butantan; Fernando Pretel do Laboratório de Imunogenética –
Instituto Butantan, pelo apoio;
Ao pessoal do Setor de Informática – Instituto Butantan, em especial Sérgio
Marcello Humantschuk, pelo apoio técnico;
Ao pessoal da Secretaria da Biotecnologia – ICB/USP, em especial Nancy
Gonçalves de Melo e Eliane de Araújo Campos Gouveia;
À Adriana de Almeida Barreiros da biblioteca do IQ/USP, à Maria José de
Jesus Carvalho e Eva Aparecida da Silva Oliveira da biblioteca do ICB/USP, pelo
auxílio na consulta e revisão de referências bibliográficas;
Ao Noronha e Sílvia (Miracatu-SP); Luciano Barbosa e Delfino Beck
Barbosa (Camaquã- RS), pela acolhida para coleta de sanguessugas;
Ao Isaias França, pelo apoio no preparo e lavagem de materiais do
laboratório;
À todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho;
À FAPESP, pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
1 Introdução
1
1.1 Hemostasia
1
1.2 Hematófagos em geral
3
1.3 Sanguessugas
4
1.3.1 Gênero Haementeria
8
1.3.2 Haementeria depressa
10
1.4 A era pós-genômica e o desenvolvimento do proteoma
14
1.5 Eletroforese bidimensional
17
1.6 Espectrometria de massa
17
1.6.1 Técnicas de ionização
18
1.6.1.1 Ionização por dessorção da matriz assistida por laser (Matrix assisted
18
laser desorption ionization – MALDI)
1.6.1.2 Ionização por electrospray (ESI)
20
1.6.2 Analisadores de massa
22
1.6.2.1 Analisador TOF (tempo de vôo – time of flight)
22
1.6.2.2 Analisador quadrupolo
23
1.6.3 Detector
24
1.6.4 Espectrômetros de massa
24
1.7 Identificação de proteínas
24
1.7.1 Identificação de proteínas analisadas por espectrometria de massa
25
1.7.1.1 Peptide mass fingerprinting (PMF) por MALDI-TOF
25
1.7.1.2 Análise via tandem MS – sequenciamento de novo por ESI-Q-TOF
26
MS
1.8 Visão atual da aplicação destas metodologias em estudos de
27
hematófagos
2 Objetivo
30
3 Materiais e Métodos
31
3.1 Sanguessugas Haementeria depressa
31
3.2 Eletroforese bidimensional
31
3.2.1 Preparo da amostra
31
3.2.2 Detecção de proteínas em géis bidimensionais
32
3.3 Seleção e digestão enzimática de spots
32
3.4 Espectrometria de massa
33
3.5 Identificação de proteínas
34
3.6 Detecção específica por zimografia
35
3.6.1 Atividade fibrinolítica e localização de hementerina
35
3.6.2 Zimografia bidimensional
36
3.6.3 Atividade sobre gelatina
37
3.6.4 Lefaxin
37
4 Resultados
38
4.1 Perfil bidimensional do extrato bruto do complexo salivar
38
4.2 Perfil espectrométrico do extrato bruto do complexo salivar
43
4.3 Análise proteômica do complexo salivar de H. depressa
43
4.3.1 Spots bidimensionais
43
4.3.1.1 Spots 1 e 2
43
4.3.1.1.1 Identificação dos spots 1 e 2: antiagregante plaquetário
52
4.3.1.2 Spots 3, 4 e 5
54
4.3.1.2.1 Identificação dos spots 3, 4 e 5: miohemeritrina
58
4.3.1.3 Spots 6, 7, 8, 9 e 10
63
4.3.1.3.1 Identificação dos spots 6, 7, 8, 9 e 10: anidrase carbônica
77
4.4.4 Outros spots analisados do mapa bidimensional e ainda não
77
identificados
4.5 Análises do lefaxin e hementerina purificados
95
4.6 Atividade biológica determinada por zimografia
98
4.6.1 Substrato: gelatina
98
4.6.2 Substrato: fibrina
101
5 Discussão
102
5.1 Abordagem proteômica do complexo salivar
102
5.2 Perfil espectrométrico do extrato bruto do complexo salivar
103
5.3 Spots bidimensionais identificados
104
5.3.1 Antiagregante plaquetário
104
5.3.2 Miohemeritrina
107
5.3.3 Anidrase carbônica
109
5.4 Lefaxin
110
5.5 Hementerina
112
5.6 Proteína com atividade biológica sobre gelatina
112
5.7 Proteínas antihemostáticas de sanguessugas do gênero Haementeria
113
5.8 Contribuições da análise proteômica para este trabalho
116
6 Conclusões
117
Referências
120
Glossário (espectrometria de massa)
132
Anexo
136
Ferramentas bioinformáticas
137
RESUMO
Diversos anticoagulantes, fibrinolíticos e antiagregantes plaquetários já foram
descritos nos mais diversos gêneros de hematófagos. As sanguessugas
Haementeria depressa vêm sendo estudadas desde a década de 60 no Instituto
Butantan. Neste trabalho foram analisados os mapas bidimensionais do complexo
salivar e de um tecido muscular. O complexo salivar é composto pelas glândulas
salivares e a probóscide. As análises bidimensionais mostraram que as proteínas
de ambos tecidos apresentaram pI entre 3.5 a 9.5 e MM na faixa entre 10 a 105
kDa. O mapa eletroforético bidimensional do complexo salivar apresentou 352
spots totais, sendo 103 comuns com o tecido muscular e 249 exclusivos do
complexo salivar (corado por nitrato de prata). Apenas 219 spots totais foram
visualizados quando o gel foi corado por Coomassie Blue. As proteínas isoladas
dos géis foram identificadas após sequenciamento por tandem MS (proteoma)
através de análise complementar baseadas em sequências deduzidas do cDNA
(transcriptoma). As proteínas identificadas neste trabalho foram: antiagregante
plaquetário; miohemeritrina e anidrase carbônica. O antiagregante plaquetário
impede a formação de trombos plaquetários; a miohemeritrina, além de seu papel
como transportadora de oxigênio, por apresentar similaridade com lefaxin e com
prolixin S pode ser anticoagulante; a anidrase carbônica auxilia na manutenção do
pH do sistema digestivo. Estas foram as proteínas mais expressas nas glândulas
salivares de sanguessugas não alimentadas durante 2-3 meses e portanto, devem
exercer
um
papel
durante
a
alimentação
e
apresentar
propriedades
antihemostáticas. Ainda, por zimografia, foi identificada uma protease que lisa
gelatina (45 kDa). Interessantemente, o lefaxin (inibidor de FXa) não foi
identificado pela análise proteômica e a hementerina (fibrinogenolítico e inibidor de
agregação plaquetária), foi localizada no gel bidimensional somente após ensaio
zimográfico, o que mostra a necessidade do uso de técnicas adicionais para a
completa elucidação da constituição desta amostra.
ABSTRACT
Many anticoagulants, fibrinolytics and antiplatelet proteins were described in
hematophagous animals. The leeches Haementeria depressa have been studied in
Instituto Butantan since 1960. The electrophoretical bidimensional maps of the
salivary complex and muscular tissue were carried out in this work. The salivary
complex is composed by the salivary glands and proboscis. The two-dimensional
analysis showed the proteins from both extracts have a pI from 3.5 to 9.5 and
molecular weight
from 10 to 105 kDa. The bidimensional map of the salivary
complex showed 352 total spots, 103 in common with the muscular tissue and 249
are exlusives from the salivary complex (silver stained). Only 219 total spots were
visualized in a Coomassie Blue stained gel. The proteins isolated from the gels
were identified after tandem analysis (proteome) by a complemetary analysis
based on deduced sequencing from cDNA (transcriptome). The proteins identified
in this work were: an antiplatelet protein, a myohemerythrin and a carbonic
anhydrase.
The
antiplatelet
protein
avoids
the
platelet
agreggation;
myohemerythrin, besides its role as an oxygen-carrier, by its similarity with lefaxin
and with prolixin S can act as anticoagulant; carbonic anhydrase, which helps in
the pH maintenance of the digestive system. Once these are the most expressed
proteins in the salivary glands from leeches which were not fed for about 2-3
months, so these proteins should play a role during feeding and have some
antihemostatic properties. Furthermore, by zymography, a gelatinolytic protease
was identified (about 45 kDa). Interestingly, lefaxin (inhibitor of Fxa) was not
identified by the proteomic analysis and hementerin (fibrinolytic and inhibitor of
platelet aggregation), was localized on 2D protein map only by zimographyc
assays. This fact shows that use of additional techniques will be necessary for the
complete knowledge about the composition of this sample.
ABREVIATURAS
2D - bidimensional
CHAPS - 3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethyl-Ammonio]-1-Propanesulfonate
DTT - ditiotreitol
ESI – electrospray ionization
HCCA – ácido α-ciano-4- hidroxicinâmico
IEF - isoeletrofocalização
MALDI – matrix-assisted laser desorption ionization
MM – massa molecular
MS – espectrometria de massa
pI – ponto isoelétrico
PMF – peptide mass fingerprinting
Q-TOF – quadrupole- time of flight
SA- ácido sinapínico
SDS – dodecil sulfato de sódio
TFA – ácido trifluoracético
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Hemostasia
O sistema hemostático mantém o sangue em estado fluido sob
condições fisiológicas, sendo considerado como a reação de equilíbrio do
organismo frente às injúrias. A hemostasia é então mantida por fatores que
apresentam atividades pró-coagulantes, anticoagulantes, por inibidores e por
moléculas que atuam a nível vascular, controlando os processos de
coagulação, fibrinólise, agregação plaquetária e o fluxo sanguíneo nos vasos.
Resumidamente, a cascata de coagulação pode ser desencadeada após
uma lesão por dois processos: via fator tissular associado ao FVIIa ou via
calicreína-cininogênio associados ao FXIIa, ambas vias são processadas e
resultam no ponto comum de formação de FXa, o qual é responsável pela
geração de trombina. A trombina converte o fibrinogênio em monômeros de
fibrina que sofrem ação do FXIII através de uma reação de trans-glutaminação,
formando polímeros de fibrina estáveis. Por outro lado, o plasminogênio, sob
ação de ativadores de plasminogênio (uPA ou tPA), é transformado em
plasmina, a qual degrada a fibrina em vários fragmentos. As plaquetas também
secretam fatores de coagulação (Figura 1).
O sistema da coagulação é regulado por anticoagulantes naturais,
representados por inibidores como TFPI (Tissue factor pathway inhibitor) que
bloqueia TF/FVIIa (Broze; Girard; Novotny, 1990), antitrombinas, por exemplo
antitrombina III, que bloqueia os fatores FIXa, FXa e trombina (Rosenberg,
1987), sistema da proteína C que degrada FVa e VIIIa (Dibella; Maurer e
Scheraga, 1995; Esmon, 1989) e inibidores menos específicos como a α1antitripsina (Carrel; Boswell, 1986) e a α2 macroglobulina (Sottroup-Jensen,
1989). Esses inibidores de proteases asseguram o equilíbrio hemostático
permitindo a manutenção das reações procoagulantes em níveis fisiológicos. O
endotélio vascular tem uma função anticoagulante devido à síntese de
2
glicosaminoglicanos, de cofatores do inibidor da via do fator tissular, de
antitrombinas e de trombomodulina (COLMAN et al., 1994).
XI
XII
Fator
Tissular
Fator
Fator
Tissular
Tissular
XIIa
FvW
VII
IX
Plaquetas
XIa
TFPI
HK•PreKal
HKa • kali
IXa
VIIa
V
PS
PC
Xa
uPA
scuPA
αAP
Plasminogênio
ATIII
F1+2
Trombina
II
TAT
Plasmina
Fibrina
Fibrinogênio
tPA
FXIIIa
PAI-1
FXIII
Trombina
D-D
Figura 1 - Representação esquemática da cascata de coagulação.
Obs: Inibidores da coagulação - TFPI, ATIII, αAP, PAI-1 e PC.
3
1.2 Hematófagos em geral
Hematófagos são considerados como organismos modelos de estudos
relacionados à hemostasia. Após ingestão de sangue, proteases e outras
enzimas digestivas são estimuladas. Para estes animais, a manutenção da
fluidez do sangue faz-se por meio de proteínas que interferem no mecanismo
de hemostasia do hospedeiro, apresentando constituintes que inibem a
coagulação sanguínea, inibidores da agregação plaquetária, compostos
fibrinolíticos, vasodilatadores ou inibidores de vasoconstrição. Também a
presença de imunomoduladores na saliva destes animais, contribui com a
supressão da resposta alérgica para adesão do predador ao seu hospedeiro
(RIBEIRO, FRANCISCHETTI, 2003).
Diversos anticoagulantes foram encontrados nas glândulas salivares de
hematófagos. As Anophelinas, são inibidores de trombina
presentes no
mosquito Anopheles stephensi (Valenzuela et al., 2003). No morcego
Desmodus rotundus foi descrito um inibidor de FXa, denominado draculina
(Apitz-Castro et al., 1995) e também um fibrinolítico, denominado Bat- PA
(Gardell et al., 1989). O carrapato Ornithodoros moubata apresenta um potente
inibidor do complexo protrombinase, TAP (tick anticoagulant peptide) (Waxman
et al., 1990). De outro carrapato, Ixodes scapularis, foi isolado um potente
inibidor de FXa, o ixolaris (Francischetti et al., 2002). A prolixina S, foi isolada
do inseto Rhodnius prolixus, a qual foi inicialmente descrita como inibidor de
FVIII (Ribeiro et al., 1995) e posteriomente, demonstrou-se tratar de uma
proteína que inibe a ativação do FIXa, em presença de cálcio e fosfolipídeos,
independente de FVIII (Sun et al., 1996). Também já foram descritas diversas
apirases, que possuem atividade sobre agregação plaquetária e foram
encontradas em insetos e carrapatos.
4
1.3 Sanguessugas
Sanguessugas são anelídeos (filo: Annelidae, sub-classe: Hirudinae) e
somam mais de 650 espécies conhecidas, podendo ser aquáticas (água doce e
salgada) e terrestres. Cerca de 75% das sanguessugas são hematófagas e
capazes de ingerir cerca de duas à dez vezes o volume de seu corpo em
sangue em uma única refeição. Antes mesmo que os princípios medicinais das
sanguessugas fossem estudados em profundidade, notava-se que o sangue
ingerido por estes animais permanecia líquido por semanas em seu tubo
digestivo (BAGDY et al., 1976).
O uso de sanguessugas Hirudo medicinalis para sangrias surgiu nas
civilizações antigas (Egito), atingindo o auge de sua popularidade no século
XIX, no continente europeu (Eldor; Orevi; Rigbi, 1996), sendo interrompido pela
falta de assepsia. A utilização destas sanguessugas no pós-operatório de
cirurgias plásticas de implantes tem sido relatada recentemente no Reino Unido
e na Irlanda, ainda que sejam poucos os registros; porém, adota-se uma
profilaxia antibiótica (WHITAKER et al., 2004).
As
sanguessugas
Hirudo
medicinalis
(ordem:
Gnathobdellidae)
apresentam o aparelho bucal composto por 3 mandíbulas adaptadas à
perfuração da pele do hospedeiro (Sawyer, 1986). A Hirudo medicinalis é
parasita de anfíbios e injeta fatores antihemostáticos ao redor da área perfurada
onde se alimenta, capaz de manter a incoagulabilidade por cerca de 10 horas
(SAWYER et al., 1991).
Um dos grandes interesses nos estudos de diversos gêneros e espécies
de sanguessugas está relacionado a compostos biologicamente ativos que
possam interferir no mecanismo hemostático humano, em busca de novas
drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares, que representam um
dos maiores índices de morbidez mundial.
5
Diversos
constituintes
encontrados
nas
glândulas
salivares
de
sanguessugas já foram descritos como anticoagulantes, fibrinolíticos e
antiagregante-plaquetários.
A hirudina, um potente inibidor de trombina (Ki 21fM), foi encontrada em
Hirudo medicinalis (Haycraft, 1884). A hirudina é um peptídeo natural de cadeia
simples, que contém 65 resíduos de aminoácidos com três pontes dissulfeto
intra-cadeias, e um resíduo de tirosina sulfatado (Markwardt et al., 1989). A
hirudina é uma substância que apresenta formas variantes. A hirudina é um
estrito inibidor de trombina do tipo “tight binding”, não sendo necessários
cofatores para sua atividade (TALBOT, 1989).
À partir de 1986, o cDNA da hirudina foi clonado, e o recombinante (rH)
obtido em larga escala em Escherichia coli (Fortkamp et al., 1986), em
Saccharomyces cerevisiae (Courtney et al., 1989), e em Acremonium
chrysogenum (Radzio; Kück, 1997). A avaliação pré-clínica e a triagem clínica
da rH e de formas análogas, têm sido aperfeiçoadas ao longo dos últimos anos
(Verstraete; Zoldhelyi, 1995), e sua forma de ação tem sido comparada às
heparinas de baixo peso molecular, as quais representam os anticoagulantes
orais mais empregados.
Além da hirudina, outros inibidores de trombina têm sido isolados de
sanguessugas. Dentre eles, um peptídeo similar à granulina (Hirudo nipponia)
(Hong; Kang, 1999), a bufrudina (Hirudinaria manillensis) (Electricwala et al.,
1991), a theromina (Theromyzon tessulatum) (Salzet et al., 2000) e a hemadina
(Haemadipsa sylvestri) (Strube et al., 1993). A hemadina e a theromina foram
descritas recentemente e não apresentam homologia em suas seqüências com
os demais inibidores até agora descritos em todo o reino animal. Destes, o mais
potente inibidor é o theromina (Ki 12 fM),o qual foi isolado do intestino da
sanguessuga.
Além dos inibidores de trombina, têm sido estudados inibidores dos
fatores de coagulação, como os inibidores de FXa.
6
A antistasina foi o primeiro inibidor de FXa isolado de sanguessuga
(Haementeria officinalis). É do tipo reversível, apresentando uma constante de
dissociação entre 0.31 à 0.62 nM (Dunwiddie et al., 1989; Nutt et al., 1988). A
antistasina possui 119 resíduos de aminoácidos, sendo que o domínio I
(resíduos 1–55) é 56% similar ao domínio II (resíduos 56–110). Dos nove
resíduos da porção C-terminal (111–119; domínio III), quatro são positivamente
carregados (Nutt et al., 1988) e o sítio reativo está localizado no domínio I
(Blankenship et al., 1990; Theunissen et al., 1994; Han et al., 1989). O cDNA da
antistasina foi clonado (Theunissen et al., 1994) e a proteína recombinante foi
expressa em sistema de vetor baculovírus em células de insetos (Han et al.,
1989); porém, o desenvolvimento para uso clínico foi interrompido pela alta
imunogenicidade da proteína.
O peptídeo sintético mais potente de antistasina é composto por 22
resíduos e apresenta Ki de 35 nM para FXa (Ohta et al., 1995). Um peptídeo
menor (DRCRVHCP) apresentou atividade anticoagulante e foi capaz de
aumentar em 50% o tempo de coagulação, quando utilizado em concentrações
micromolares (OHTA et al., 1995).
Uma proteína homóloga à antistasina, foi encontrada em Haementeria
ghilianii, a ghilanteína (BLANKENSHIP et al., 1990).
Outro inibidor de FXa é a therostasina que é o mais potente inibidor de
FXa natural conhecido (Ki de 34 pM), e que foi isolado de T. tessulatum (Chopin
et al., 2000). Este inibidor apresenta 16 resíduos cisteínas.
Uma nova família de inibidores do tipo-antistasina foi descrita por
apresentarem especificidade distintas sobre as serinoproteases, devido as
seqüências ao redor do sítio reativo serem diferentes; mas apresentarem
distanciamentos entre os resíduos de cisteína semelhantes. Algumas moléculas
desta família, como a therina e a tessulina, também mostraram atividade antiinflamatória (Chopin et al., 1998a, 1998b). Therina, tessulina ou therostasina
quando administradas isoladamente foram capazes de diminuir o nível de
ativação de granulócito e monócito, e quando administradas em conjunto
7
agiram sinergisticamente. Isto indica que elas também exercem uma ação de
inibição enzimática na inflamação, fazendo com que estes inibidores tenham
um alto interesse como agentes terapêuticos no tratamento de enfisema, câncer
e inflamação (SALZET, 2002).
Também foram identificados inibidores tipo-antistasina na espécie Hirudo
medicinalis: a hirustasina e a bdellastasina. A hirustasina foi o primeiro inibidor
de calicreína tissular descrito em sanguessugas, é também um inibidor do tipo
“tight-binding” de tripsina, quimotripsina e catepsina G de neutrófilo (Sollner et
al., 1994). A bdellastasina é um inibidor de plasmina e tripsina (Moser et al.,
1998). A piguamerina, isolada de Hirudo nipponia, é um inibidor de tripsina,
calicreína tissular e plasmática (Kim; Kang, 1998). Apesar da similaridade com
a antistasina, tanto a hirustasina como a piguamerina não inibem a coagulação
in vitro, nem a atividade amidolítica do FXa isolado (KIM; KANG, 1998; MOSER
et al., 1998; SOLLNER et al., 1994).
Além dos inibidores de trombina e de FXa, foram isolados inibidores de
agregação plaquetária em glândulas salivares de sanguessugas. O calin,
isolado de Hirudo medicinalis, e o LAPP (leech antiplatelet protein), obtido de
Haementeria officinalis, bloqueiam a adesão e agregação plaquetária induzidas
por colágeno, sendo que o LAPP é o mais potente (IC50 = 3 μg/ml) do que o
calin (IC50 = 10 μg/ml) (Huizinga et al., 2001; Depraetere; Kerekes; Deckmyn,
1999; Van Zanten et al., 1995). Foi demonstrado que o calin apresentou efeito
antitrombótico em plasma rico em plaqueta de hamsters (Deckmyn et al., 1995).
Estudos terapêuticos já vem sendo realizados com o LAPP recombinante (Van
Zanten et al., 1995), porém esta proteína não foi capaz de prevenir a formação
de trombos em macacos (KREZEL et al., 2000).
A decorsina e a ornatina, isoladas de Macrobdella decora e Placobdella
ornata, respectivamente, são potentes antagonistas do complexo glicoprotéico
GPIIb/IIIa e apresentam uma seqüência RGD. A seqüência RGD é uma
seqüência de reconhecimento comum à proteínas de adesão, tais como
fibrinogênio, fator von Willebrand, fibronectina e vitronectina, que ligam-se ao
8
receptor GPIIb/IIIa. A inibição da ligação de GPIIb-IIIa ao fibrinogênio pela
decorsina, apresentou IC50 de ~1.5 nM e para ornatina, o IC50 variou de 2.9 à
5.3 nM (Seymour et al., 1990) (Mazur et al., 1991). Os inibidores mais comuns
de agregação plaquetária induzida por colágeno são as apirases, encontradas
em Hirudo medicinalis (RIGBI; OREVI; ELDOR, 1996).
O peptídeo tridegin encontrado em Haementeria ghilianii é um inibidor
potente (Ki de 9.2 nM) de FXIIIa e impede a formação de fibrina estável (Finney
et al., 1997). Enzimas fibrinogenolíticas, tais como destabilases e hementina,
foram encontradas nas sanguessugas Hirudo medicinalis e Haementeria
ghilianii, respectivamente (Baskova et al., 2001) (Swadesh; Huang; Budynski,
1990). A hementina também apresenta ação antiagregante plaquetária por
clivar o fibrinogênio, responsável pelas ligações cruzadas entre as plaquetas.
Peptídeos antibacterianos denominados theromacin e theromizin foram
recentemente descritos, sendo encontrados no celoma de sanguessugas T.
tessulatum (TASIEMSKI et al., 2004).
Ainda que a hirudina, a antistasina e a decorsina apresentem seqüências
de aminoácidos e funções distintas, elas apresentam uma estrutura
tridimensional semelhante, denominada LAP (leech antihemostatic protein), que
é uma região rica em cisteínas (Cys-X6~12-Cys-X-Cys-X3~6-Cys-X3~6-Cys-X8-14)
(KREZEL et al.,1994).
1.3.1 Gênero Haementeria
As sanguessugas do gênero Haementeria (ordem: Rhyncobdellida)
possuem uma probóscide no seu aparelho bucal, a qual introduzem no póro do
hospedeiro, geralmente mamíferos, e encontram vasos sangüíneos mais
periféricos, por onde se alimentam (SAWYER, 1986).
A sanguessuga Haementeria depressa é encontrada na região Sul do
Brasil, e tem como principais hospedeiros bovinos e eqüínos. Foram
caracterizadas previamente a hementerina, um fibrinogenolítico e o lefaxin, um
9
inibidor de FXa (anticoagulante) à partir dos complexos salivares desta
sanguessuga. Maiores detalhes sobre a Haementeria depressa serão
fornecidos adiante pois ela foi o objetivo de estudo do presente trabalho.
A sanguessuga Haementeria ghilianii, popularmente conhecida como
sanguessuga gigante, é encontrada no Norte do Brasil e Guiana Francesa,
podendo atingir até 50 cm de comprimento. Além de mamíferos, estas
sanguessugas parasitam répteis. Foram isolados da glândula salivar de H.
ghilianii: a ghilianteína, um inibidor de FXa; a hementina, um fibrinogenolítico, e
a tridegin, um inibidor de FXIIIa.
A sanguessuga Haementeria officinalis é encontrada na América Central
e América do Sul e à partir de suas glândulas salivares, foram descritas a
antistasina, um inibidor de FXa e o LAPP, um antiagregante plaquetário.
Outras espécies de Haementeria, como: H. gracilis, H. lutzi, H. molesta,
H. tuberculifera foram catalogadas, porém proteínas com propriedades
antihemostáticas ainda não foram caracterizadas à partir de suas glândulas
salivares.
10
1.3.2 Haementeria depressa
A Figura 2 mostra a sanguessuga Haementeria depressa. O complexo
salivar é composto por um par de glândulas anteriores, um par de glândulas
posteriores e a probóscide.
A)
Figura 2 – A) Sanguessuga Haementeria depressa; B) complexo salivar: GA- glândula
anterior, GP- glândula posterior; PB - probóscide.
A sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudada desde a
década de 60 no Instituto Butantan (São Paulo – Brasil). Os pioneiros destes
estudos foram Dr Gastão Rosenfeld e Dra Eva M. A. Kelen, descrevendo pela
primeira vez em sanguessugas um fibrinolítico que foi denominado hementerina
(Kelen;
Rosenfeld,
colaboradores
1975).
prosseguiram
A
Dra
os
Ana
Marisa
estudos
com
Chudzinski-Tavassi
esta
e
sanguessuga,
caracterizaram a hementerina e a descreveram como um fibrinogenolítico capaz
de degradar o fibrinogênio preferencialmente nas cadeias α e γ (agindo portanto
como um antipolimerizante dos monômeros de fibrina, o que promove a
formação de fibrina instável) (Chudzinski-Tavassi et al., 1998). A hementerina,
além de fibrinogenolítico, é capaz de inibir a agregação plaquetária induzida por
diferentes
agonistas
(trombina,
ADP,
colágeno,
adrenalina
e
ácido
11
araquidônico), pela via nitridérgica, induzindo o aumento do nível de cálcio-via
GMPc e pelo aumento da atividade da óxido nítrico sintase e aumento dos
níveis de cGMP, o que conseqüentemente, promovem a inibição da agregação
plaquetária (Chudzinski-Tavassi et al, 2003). Acredita-se que no momento em
que o animal injeta a saliva no hospedeiro, a hementerina pode promover um
aumento dos níveis de óxido nítrico, induzindo a vasodilatação e a inibição da
agregação plaquetária, exercendo assim o seu papel na alimentação do animal
(CHUDZINSKI-TAVASSI et al., 2003).
O lefaxin, a outra proteína isolado do complexo salivar de H. depressa,
foi purificado à partir do extrato bruto do complexo salivar, através de uma
etapa de gel filtração em resina Sephadex G-150, seguida de duas
cromatografias de troca iônica em Mono Q (sistema FPLC) (Faria et al., 1999).
A inibição do FXa pelo lefaxin foi demonstrada pela inibição da atividade
amidolítica da enzima, medida pela hidrólise do substrato cromogênico S2765
(Ki
ap
= 3,6 nM), por sua habilidade em inibir a geração de trombina no
complexo protrombinase (EC50 = 10 nM), além de inibir este fator diretamente
no plasma (EC50 = 40 nM) (FARIA et al., 1999).
O lefaxin é uma proteína de cadeia simples, com massa molecular 30
kDa (SDS-PAGE). As seqüências da região N-terminal e de peptídeos internos
foram determinadas por degradação de Edman e até o presente, não
mostraram similaridade com outros inibidores de FXa isolados de salivas de
sanguessugas (Faria et al., 1999). Por outro lado, a seqüência N-terminal
apresentou similaridade com a miohemeritrina (68 %) proveniente do anelídeo
Nereis diversicollor (Takagi; Cox, 1991), e prolixina S (44 %), do inseto
Rhodinus prolixus (RIBEIRO et al., 1995).
Em paralelo à análise proteômica, foi desenvolvida uma análise
transcriptômica do complexo salivar de Haementeria depressa (Faria, 2004),
onde foram identificados os seguintes peptídeos e proteínas (Tabela 1):
12
Tabela 1: Identificação dos clusters que codificam proteínas putativas envolvidas na alimentação
dos complexos salivares de sanguessugas H. depressa.
Na
A
Database b
/ No de acesso
Anidrases Carbônicas
HDEP0020c 2 carbonic anhydrase 15 [Mus musculus]
A
ref|NP_085035.1||
32
2e-004
HDEP0030c
2
carbonic anhydrase VII [Mus musculus]
A
ref|NP_444300.1||
30
4e-016
HDEP0035c
4
carbonic anhydrase [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_172285.1||
28
7e-007
HDEP0065c
2
carbonic anhydrase [Helicobacter hepaticus]
A
ref|NP_860452.1||
36
9e-011
HDEP0073c
3
carbonic anhydrase [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_172285.1||
30
1e-006
HDEP0088c
2
carbonic anhydrase [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_172285.1||
32
9e-006
HDEP0112s
1
carbonic anhydrase 2 [Rattus norvegicus]
A
ref|NP_062164.1||
32
2e-005
HDEP0123s
1
carbonic anhydrase VII [Homo sapiens]
A
ref|NP_005173.1||
37
4e-008
HDEP0214s
1
carbonic anhydrase VI precursor [Mus musculus]
A
sp|P18761|
30
1e-006
HDEP0302s
1
carbonic anhydrase VII [Mus musculus]
A
ref|NP_444300.1||
30
4e-006
HDEP0372s
1
carbonic anhydrase [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_172285.1||
32
7e-006
HDEP0393s
1
carbonic anhydrase VI precursor [Mus musculus]
A
sp|P18761|
30
8e-006
HDEP0406s
1
carbonic anhydrase [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_172285.1||
31
2e-005
HDEP0442s
1
carbonic anhydrase VI precursor [Mus musculus]
A
sp|P18761|
32
1e-005
HDEP0451s
1
carbonic anhydrase II [Homo sapiens]
A
pdb|1UGA|
32
2e-008
HDEP0470s
1
carbonic anhydrase [Caenorhabditis elegans]
A
ref|NP_510674.1||
31
1e-008
HDEP0494s
1
carbonic anhydrase [Caenorhabditis elegans]
A
gb|AAB52498.1|
34
6e-010
HDEP0500s
1
carbonic anhydrase [Caenorhabditis elegans]
A
ref|NP_510674.1||
34
1e-009
HDEP0501s
1
carbonic anhydrase [Anopheles gambiae]
A
ref|XP_308327.1||
32
1e-007
Miohemeritrina
HDEP0005c 2
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
50
1e-029
HDEP0031c 3
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
55
2e-034
HDEP0086c 3
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
52
2e-026
HDEP0098c 2
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
N
sp|Q9GYZ9|
59
3e-033
HDEP0146s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
56
4e-024
HDEP0161s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
57
4e-028
HDEP0219s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
N
sp|Q9GYZ9|
57
2e-030
HDEP0269s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
58
8e-032
HDEP0312s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
53
1e-034
HDEP0369s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
53
6e-026
HDEP0435s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
59
6e-036
Cluster
No
Identificação provável por similaridade /
[Organismo]
Identidade
%
e-value
13
HDEP0438s 1
myohemerythrin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9GYZ9|
59
1e-035
Inibidores da família antistasina
HDEP0007c 2
therostasin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9NBW4|
67
1e-030
HDEP0296s 1
therostasin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9NBW4|
55
9e-024
HDEP0412s 1
therostasin [Theromyzon tessulatum]
A
sp|Q9NBW4|
53
2e-020
Inibidores de agregação plaquetária
HDEP0059c 2
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
A
pir||A42435
44
1e-023
HDEP0224s 1
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
N
sp|Q9NBW4|
53
2e-021
HDEP0318s 1
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
A
pir||A42435
91
4e-074
HDEP0344s 1
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
A
pir||A42435
44
8e-021
HDEP0192s 1
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
A
sp|Q01747|
36
3e-006
HDEP0361s 1
leech antiplatelet protein precursor [H. officinallis]
N
sp|Q9NBW4|
53
2e-019
HDEP0415s 1
leech antiplatelet protein precursor [H.officinallis]
A
sp|Q01747|
45
7e-009
HDEP0545s 1
leech antiplatelet protein precursor [H.officinallis]
A
pir||A42435
64
3e-048
Inibidores de Fator XIIIa
HDEP0060c 3
tridegin [Haementeria ghilianii]
A
2e-024
HDEP0457s 1
tridegin [Haementeria ghilianii]
A
1e-034
HDEP0496s 1
tridegin [Haementeria ghilianii]
A
2e-034
HDEP0497s 1
tridegin [Haementeria ghilianii]
A
1e-028
HDEP0498s 1
tridegin [Haementeria ghilianii]
A
1e-033
Outros inibidores de proteases
HDEP0284s 1
alpha-2-macroglobulin protein [Ciona intestinalis]
A
emb|CAD24311.1|
37
2e-024
HDEP0322s 1
alpha-2 macroglobulin protein [Mus musculus]
A
ref|NP_694738.1||
36
4e-018
HDEP0336s 1
cysteine-rich protease inhibitor [Mus musculus]
A
dbj|BAB03453.1|
42
1e-024
HDEP0338s 1
protease inhibitor [Arabidopsis thaliana]
A
ref|NP_030435.1||
56
8e-012
HDEP0469s 1
alpha-1-inhibitor III [Mesocricetus auratus]
A
pir||A41081
40
9e-019
HDEP0027c 2
C-type lectin [Mus musculus]
A
ref|NP_064332.1||
28
4e-004
HDEP0145s 1
serum lectin isoform 4 precursor [Salmo salar]
A
gb|AAO43608.1|
31
3e-005
HDEP0335s 1
C-type lectin-like protein 2 [Bungarus fasciatus]
A
gb|AAK43585.1|
29
2e-010
Antimicrobianos
HDEP0121s 1
theromacin [Theromyzon tessulatum]
A
gb|AAR12065.1
64
3e-017
HDEP0285s 1
theromacin [Theromyzon tessulatum]
A
gb|AAR12065.1|
53
7e-026
HDEP0385s 1
theromacin [Theromyzon tessulatum]
A
gb|AAR12065.1|
53
2e-026
HDEP0458s 1
theromacin [Theromyzon tessulatum]
A
gb|AAR12065.1|
59
7e-026
Lectinas tipo C
14
Proteases
HDEP0179s 1
caseinolytic protease X homolog [Homo sapiens]
A
ref|NP_006651.2||
59
1e-036
HDEP0400s 1
metalloendopeptidase M16 [Anopheles gambiae]
A
ref|XP_316158.1||
42
3e-011
Outros
HDEP0117s 1
calreticulin precursor [Boophilus microplus]
A
gb|AAN03709.1|
82
3e-063
HDEP0281s 1
calreticulin [Aplysia californica]
A
pir||JH0795
74
2e-054
A
ref|NP_823881.1||
45
4e-021
Proteínas com função não conhecida
HDEP0022c 7
hypothetical protein [Streptomyces avermitilis ]
HDEP0002c 3
no hit
HDEP0511s 1
no hit
N: Similaridade de nucleotídeos obtida por BlastN. A: Similaridade de aminoácidos obtida por
BlastX.
b Databases: Gb - GenBank (nr); Emb - European Molecular Biology Laboratory; Dbj - DNA
Database of Japan; Pir - Protein Information Resource; Sp – SwissProt; Ref – Reference Sequence
project, PDB - Protein Data Bank.
a
1.4 A era pós-genômica e o desenvolvimento do proteoma
O sucesso dos projetos genômicos na década de 90 deu-se em virtude
da automação dos métodos de análise dos ácidos núcleicos (PCR,
seqüenciamento automático, microarray), permitindo a análise genômica em
larga escala de diversos organismos (Wilkins et al., 1997). Por outro lado, a
análise sistemática de proteínas, não pôde, naquele momento, seguir aos
projetos de genoma com mesma intensidade e proporção. A razão é que os
ácidos nucléicos são moléculas quimicamente homogêneas, informativas e
consideradas moléculas estáticas. Por meio da análise genômica foi visto que
tanto em procariotos, como em eucariotos, diversos produtos polipeptídicos
podem ser formados a partir de um único gene. Isso deve-se, por exemplo, ao
embaralhamento de exons, às modificações transcripcionais dos RNAs
mensageiros e às modificações co- e pós-traducionais das proteínas (por
exemplo,
acilação,
alquilação,
carboxilação,
fosforilação,
sulfonação,
carboxilação, sialilação, processamento proteolítico).
Evidenciou-se que a complexidade protéica é bem maior que a genética,
o que resultou no desencadeamento de estratégias tecnológicas de análise
global de proteínas expressas, em relação ao estudo da função e da interação
15
dos produtos. Como conseqüência, foram reunidas e desenvolvidas estratégias
tecnológicas de análise global de proteínas, nas quais são analisados não só o
padrão de expressão, mas também as modificações moleculares de proteínas
de uma célula, de um tecido ou de um organismo.
O termo “PROTEOMA” refere-se a todas as PROTEínas expressas de
um dado genOMA ou tecido (Wilkins et al., 1997). Dessa forma, o proteoma ou
estudo proteômico é posterior a genômica. A análise global de proteinas, em
escala proteômica, tem então se constituído de múltiplas técnicas, que
abrangem não somente o isolamento e a identificação de proteínas em larga
escala (por exemplo: cromatografia líquida, eletroforese bidimensional e
espectrometria de massa), mas também aquelas metodologias que abrangem
seu aspecto funcional no contexto celular (por exemplo: microscopia eletrônica
e confocal, análise de interações entre proteínas, cristalização de proteínas,
entre outras) (Phizicky et al., 2003). A composição de um complexo protéico é
determinada através de complementariedade entre métodos e instrumentos,
resultando na identificação e caracterização das proteínas individuais
(AEBERSOLD; MANN, 2003).
A eletroforese bidimensional foi a primeira técnica empregada para
analisar quantitativamente um grande número de produtos gênicos (Aebersold;
Mann, 2003). Os padrões característicos de uma amostra podem ser
detectados por esta técnica.
A espectrometria de massa é uma técnica analítica sensível, precisa e de
alta resolução, capaz de fornecer valores precisos de massa molecular de
amostras isoladas ou de misturas complexas. Porém, esta técnica não é
quantitativa, e para esta finalidade, metodologias alternativas, como a marcação
radioativa incorporada à proteína (vias metabólica, enzimática ou reação
química) são utilizadas (AEBERSOLD; MANN, 2003; WASINGER; CORTHALS,
2002).
A
combinação
das
técnicas
de
eletroforese
bidimensional
e
espectrometria de massa tem sido atualmente muito usual em análise
16
proteômica com alta resolução e encontra amplas aplicações, tais como: a
análise de expressão protéica, de modificações pós-traducionais e de ligações
não-covalentes (LIN; TABB; III, 2003; WASINGER; CORTHALS, 2002; PENG;
GYGI, 2001; GYGI et al., 2000; LARSEN; ROEPSTORFF, 2000; JUNGBLUT;
THIEDE, 1997).
A análise proteômica estabelece comparações em situações biológicas
e metabólicas distintas, mostrando alterações na quantidade e qualidade das
proteínas expressas. Um exemplo desta aplicação é em diagnósticos de
doenças, onde células sadias são comparadas com células doentes (câncer,
diabetes e doenças do coração). Inclusive, pode-se efetuar o monitoramento
através de uma avaliação do aumento ou da diminuição da abundância das
proteínas nos dois tecidos, sendo facilmente visualizada na eletroforese
bidimensional (AEBERSOLD; LEAVITT, 1990).
A localização celular das proteínas pode ser determinada empregandose técnicas de análise proteômica (eletroforese bidimensional e espectrometria
de massa). Assim, proteínas específicas de determinadas organelas podem ser
identificadas (WASINGER; CORTHALS, 2002).
A investigação de modificações pós-traducionais pode mostrar como
estas influenciam na estrutura e função das proteínas, modulando a atividade
protéica (Jonsson, 2001; Mann; Hendrickson e Pandey, 2001; Pandey; Mann,
2000). A eletroforese bidimensional é capaz de isolar as proteínas modificadas,
e a espectrometria de massa, identifica estas modificações na seqüência
primária da proteína.
A proteômica funcional identifica as proteínas de um complexo, do qual
as proteínas que o compõem foram previamente purificadas. A análise de
interações entre proteínas ou entre proteína e DNA, são realizadas por
espectrometria de massa (PHIZICKY et al., 2003; JONSSON, 2001; MANN;
HENDRICKSON e PANDEY, 2001; PANDEY; MANN, 2000).
17
1.5 Eletroforese bidimensional
A eletroforese bidimensional é uma técnica bioquímica que consiste na
separação de proteínas por dois atributos físicos: o ponto isoelétrico (pI) e a
massa molecular (MM). A primeira etapa é a isoeletrofocalização (IEF), onde a
separação ocorre de acordo com o ponto isoelétrico (pI); e a segunda etapa é a
eletroforese feita em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE), onde as
proteínas são separadas de acordo com a massa molecular.
A técnica consiste em aplicar a amostra em tiras de gradiente de pH
imobilizado, e efetua-se a IEF sob alta voltagem. Em seguida, as tiras são
equilibradas com solução contendo SDS, o qual fornece cargas negativas às
proteínas incorporadas nas tiras, que favorece a migração durante a
eletroforese, e também nesta etapa as proteínas sofrem redução e alquilação.
Após a etapa de equilíbrio, procede-se a corrida de eletroforese (RABILLOUD,
2000).
A detecção de proteínas nos géis bidimensionais incluem usualmente
colorações por nitrato de prata, por Coomassie Blue ou através de reações
antígeno-anticorpo (Westernblotting) (Shalhoub et al., 2001). Outras estratégias
como marcações radioativas, colorações baseadas em fluorescência ou
quimioluminescência vêm sendo adotadas em análises proteômicas, sendo
técnicas mais sensíveis (PATTON, 2002).
1.6 Espectrometria de Massa
Espectrometria de massa é a análise ou separação de partículas
carregadas em fase gasosa, tais como átomos e moléculas ionizados, baseada
em suas relações de massa/carga, em condições de baixa pressão. Além da
determinação da massa molecular, a espectrometria de massa permite a
obtenção de seqüência primária; a determinação de modificações pós-
18
traducionais e de associações de proteínas (MANN; HENDRICKSON;
PANDEY, 2001; NYMAN, 2001; BEAVIS; CHAIT, 1996; MANN; WILM, 1995).
Os espectrômetros compreendem três partes principais: fonte de
ionização, analisador e detector. Os íons são produzidos na fonte de ionização
e subseqüentemente separados em um analisador, seguindo para o detector.
1.6.1 Técnicas de ionização
Os analitos precisam ser ionizados e transferidos para a fase gasosa
antes de serem analisados. A ionização por MALDI e ESI são técnicas
consideradas suaves, por não causarem fragmentação excessiva, e usualmente
empregadas em análises de peptídeos e proteínas. Ambas as técnicas
permitem analisar, além de proteínas e peptídeos, lipídeos, carboidratos,
oligossacarídeos
e
oligonucleotídeos
(CHAPMAN,
2000;
BANKS;
WHITEHOUSE, 1996; MANN; WILM, 1995).
1.6.1.1 Ionização por dessorção da matriz assistida por laser (Matrix
assisted laser desorption ionization - MALDI)
O MALDI utiliza energia proveniente de laser para ionizar as
biomoléculas. O princípio deste processo baseia-se na irradiação de um curto
pulso de laser sobre a mistura de analito em excesso de matriz sólida (variando
entre 1:1000 - 1:10000) aplicada sobre uma placa metálica. A matriz absorve
energia pela incidência do laser, promovendo a dessorção do analito. Os íons
do analito são formados em fase gasosa pela transferência de prótons de
moléculas de matriz protonadas para moléculas neutras do analito (Mann;
Hendrickson; Pandey, 2001; Beavis; Chait, 1996; Karas et al., 1987) (Figura 3).
A ionização por MALDI é uma técnica descontínua, visto que os íons são
produzidos somente por períodos curtos, quando o laser é acionado.
19
analisador TOF
grid de extração
ions do analito e matriz desorbidos
feixe de laser
Analito
Matriz
Cation
placa de aplicação
da amostra
Figura 3 - Representação esquemática do processo de ionização por MALDI
(www-methods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/theory).
As matrizes mais utilizadas são: ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico
(HCCA), ácido dihidrobenzóico (DHB) para peptídeos (abaixo de 5 kDa) e ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico (ácido sinapínico) (SA) para proteínas (acima de
5 kDa) (MANN; HENDRICKSON; PANDEY, 2001; BEAVIS; CHAIT, 1996).
A ionização por MALDI permite a análise de proteínas íntegras (até 100
kDa) ou fragmentos peptídicos digeridos enzimaticamente, o qual gera um perfil
espectrométrico que auxilia na identificação protéica através do peptide mass
fingerprinting (PMF).
O espectro obtido por MALDI é caracterizado principalmente pela
produção de íons moleculares (M + H)+, monocarregados; contudo, íons com
poucas cargas (2 a 5) podem aparecer, sendo dependentes da amostra, da
20
matriz e da intensidade do laser. Também podem encontrar-se dímeros (2M +
H)+ e trímeros (3M + H)+ (Mann; Hendrickson; Pandey, 2001; Beavis; Chait,
1996; Karas et al., 1987). Tal propriedade gera espectros de fácil interpretação,
porém requerem maiores habilidades para análise dos dados obtidos.
A predominância de íons com carga simples favorece a análise de
amostras complexas, encontrando, deste modo, ampla aplicação para análises
de compostos biológicos (Chapman, 2000). Uma das vantagens experimentais
é a pequena quantidade de material (cerca de 1 a 10 pmol de proteína)
necessária para efetuar uma análise.
A determinação de massa molecular por SDS-PAGE depende do SDS
ligado à proteína e da migração no campo elétrico, conferindo ao MALDI uma
determinação com maior precisão por mensurar a massa química da molécula,
não sendo afetada pelas propriedades físicas ou hidrodinâmicas das proteínas
(SCOBLE et al., 1993).
O MALDI é mais tolerante à presença de sais, tampões, glicerol, agentes
quelantes e alguns detergentes (Beavis; Chait, 1996) quando comparado à
ionização por ESI; entretanto, sais e outros contaminantes causam alargamento
do pico e formação de aductos, resultando em imprecisão no valor da massa e
sendo limitante na sensibilidade da técnica.
1.6.1.2 Ionização por electrospray (ESI)
O analito em forma líquida é injetado, geralmente, com uma seringa e
uma alta voltagem é aplicada (3-4 kV). Sob influência do campo elétrico, cargas
semelhantes do analito (por exemplo: íons positivos) são acumuladas na
extremidade de um tubo capilar, ejetadas e dispersas no interior do
espectrômetro. Ocorre a formação de gotículas carregadas e posterior
formação de íons (Jonsson, 2001; Mann; Hendrickson; Pandey, 2001; Gaskell,
1997; Banks; Whitehouse, 1996) (Figura 4). Esta etapa ainda não está
completamente elucidada. Existem duas teorias à respeito da formação de íons
21
na fase gasosa a partir das gotículas carregadas: a) Modelo da carga residual:
supõe-se que haja evaporação das gotículas, tornando-se cada vez menores,
até a geração de uma única molécula, a qual prosseguirá para análise (Dole et
al., 1968); b) Modelo de dessorção do íon: supõe-se que também haja
evaporação do solvente, e ainda a influência do campo elétrico promovendo a
dessorção do íon (Iribarne e Thomson, 1976). Esta última teoria é a mais aceita.
Cátodo
Ânodo
Fonte de Alimentação
Figura 4 - Representação esquemática do processo de ionização por electrospray (JONSSON,
2001).
A característica do espectro obtido por electrospray é a produção de íons
múltiplas cargas, o que limita o valor de m/z abaixo de 2500, restringindo a
análise de proteínas de 10 a 100 kDa (Jonsson, 2001; Mann; Hendrickson;
Pandey, 2001; Gaskell, 1997; Banks; Whitehouse, 1996). Comumente,
observam-se no espectro, estados múltiplo-carregados para um único
composto, formando um envelope típico.
22
A ionização por electrospray requer amostras purificadas e não tolera
limites superiores à 0.01% de detergentes iônicos e 1 mM de sais (Mann; Wilm,
1995). A remoção de detergente e a dessalinização devem ser feitas por
métodos cromatográficos.
É possível realizar por ESI uma análise estrutural, tal como o
sequenciamento, onde duas etapas de separação são necessárias (modo
tandem MS). Para este tipo de análise, os íons duplamente carregados,
normalmente, são os escolhidos, visto que a complexidade da interpretação dos
espectros aumenta com o maior número de cargas da molécula.
A formação de íons no ESI, partindo de uma amostra em solução, é
contínuo e torna compatível o acoplamento de um cromatógrafo líquido ao
espectrômetro (LC-MS), deste modo, analisa-se o composto purificado de modo
direto.
1.6.2 Analisadores de massas
Após a ionização, os íons seguem para o analisador. A função do
analisador de massa é a separação dos íons de acordo com sua proporção
massa/carga (m/z). Os analisadores mais usuais em análises protéicas, e
portanto, empregados neste trabalho são o TOF e o Quadrupolo.
1.6.2.1 Analisador TOF (tempo de vôo -Time of flight)
O analisador TOF mede o tempo de vôo dos íons acelerados, através de
um tubo livre de um campo elétrico, até atingir o detector. Os íons serão
separados de acordo com a proporção massa/carga, onde os íons menores
atingem o detector antes do que os íons maiores (Jonsson, 2001; Beavis; Chait,
1996) (Figura 5).
23
Detetor
Analisador (região livre de campo elétrico)
Figura 5 – Princípio da separação de massa através do analisador TOF (DASS, 2001).
1.6.2.2 Analisador Quadrupolo
O analisador Quadrupolo consiste de quatro cilindros metálicos,
operando sob uma combinação de voltagens de corrente direta e radiofreqüência, que estabilizam a trajetória dos íons (Figura 6).
íon a ser detectado
para o detector
íon não detectado
fenda de entrada para o quadrupolo
barras metálicas: quadrupolo
Íons do analito apresentando valores de m/z distintos
Figura 6 - Representação da trajetória dos íons no analisador quadrupolo (wwwmethods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/theory).
24
1.6.3 Detector
Os detectores são responsáveis pela amplificação do sinal e formação do
espectro. Os detectores mais usuais são o Multiplicador de elétrons e o Faraday
cup (WATSON, 1997).
1.6.4 Espectrômetros de massa
Existem diversas possíveis combinações de fontes de ionização e
analisadores
para
atender
necessidades
particulares.
Os
instrumentos
utilizados neste estudo foram o MALDI-TOF MS e ESI-Q-TOF MS, disponíveis
no Instituto Butantan (CAT/CEPID). O MALDI-TOF MS combina sistemas
descontínuos de formação de íons e separação, apresentando alta resolução,
sensibilidade e precisão (Jonsson, 2001). O Q-TOF MS combina o analisador
quadrupolo, permitindo a seleção do íon no modo tandem MS, com o analisador
TOF, analisando valores de m/z com alta resolução (JONSSON, 2001).
1.7 Identificação de proteínas
A
identificação
completamente
de
elucidado,
proteínas
como
de
por
organismos,
exemplo:
cujo
genoma
Haemophilus
foi
influenza,
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, torna-se simples, visto que todas
seqüências estão representadas em um banco de dados disponível (Rabilloud,
2000). Inclusive, foi criado um banco de dados de padrões de géis
bidimensionais
de
organismos
com
genoma
definido:
GELBANK
(http://gelbank.anl.gov).
O desenvolvimento das tecnologias genômica e proteômica contribuem
para a ampliação exponencial de dados para a bioinformática, onde por
exemplo, existem hoje 152040 registros no SwissProt e mais de 38.989.342.500
sequências disponíveis no GenBank (junho/2004). Usualmente, as buscas
25
funcionam em um sistema de similaridade utilizando programas como o BLAST,
o qual permite uma correlação entre nucleotídeos e proteínas.
Contudo, a identificação de amostras desconhecidas é mais restrita,
baseando-se em bancos específicos obtidos por sequenciamento aleatório de
clones mais representativos da biblioteca de cDNA, denominados ESTs
(Expressed Sequence Tag) (DASS, 2001; MANN; HENDRICKSON; PANDEY,
2001).
1.7.1 Identificação de proteínas analisadas por espectrometria de massa
A identificação de proteínas é feita pela combinação dos dados obtidos
por espectrometria de massa em bancos de dados disponíveis, sejam bancos
de proteínas, DNA ou ESTs. A identificação de proteínas a partir de géis
bidimensionais pode ser feita através do peptide mass fingerprinting (PMF) por
MALDI-TOF MS e/ou por sequenciamento de novo por ESI-Q-TOF MS (DASS,
2001; MANN; HENDRICKSON; PANDEY, 2001).
1.7.1.1 Peptide mass fingerprintig (PMF) por MALDI-TOF
Para o mapeamento peptídico, as proteínas são diferenciadas com base
em seu padrão de fragmentação. A proteína a ser analisada é submetida à
digestão enzimática, geralmente por tripsina, a qual cliva especificamente na
porção C-terminal dos resíduos lisina ou arginina (DASS, 2001; MANN;
HENDRICKSON; PANDEY, 2001).
26
1.7.1.2 Análise via tandem MS - Sequenciamento de novo por ESI Q-TOF
MS
Quando o mapa peptídico (análise por PMF) é originado de uma proteína
com seqüência desconhecida, as determinações individuais das seqüências
dos peptídeos são essenciais (DASS, 2001).
A espectrometria por tandem visa a obtenção de informações adicionais
sobre a estrutura da amostra. Inicialmente, a amostra digerida enzimaticamente
é injetada no espectrômetro, gerando um perfil peptídico. Em seguida,
seleciona-se o íon a ser fragmentado, o qual sofre colisões induzidas pela
injeção de um gás inerte (hélio, geralmente). O espectro resultante apresenta
uma série de picos que diferem pelas massas dos resíduos de aminoácidos e
posterior interpretação de seqüências primárias do peptídeo. Por definição, o
íon inicialmente selecionado é denominado íon precursor e os íons
fragmentados, são íons produtos.
Fragmentos peptídicos digeridos por tripsina contêm resíduos de
aminoácidos básicos, os quais serão facilmente protonados, favorecendo o
subseqüente sequenciamento por ESI.
Os tipos mais comuns de íons formados nas análises tandem são do tipo
–b e –y, o que denota fragmentação na ligação amídica, com retenção de carga
no grupamento –N ou –C terminal, respectivamente. Peptídeos trípticos
apresentam dominância relativa de íons do tipo –y, pois os resíduos lisina e
arginina estão na porção –C terminal (MANN et al., 2001; STULTS, 2000).
27
x3
y3 z3
R1 O
NH2
C
C
H
a
1
x2
y2 z 2 x 1
R2 O
R3 O
N
C
H
H
b1 c1
C
a
2
N
C
H
H
b2 c 2
y1 z1
R4
C
a
3
N
C
H
H
COOH
b3 c 3
Figura 7 - Classificação dos fragmentos de íons peptídicos nas regiões N- e C- terminal, de
acordo com Roepstorff (WATSON, 1997).
1.8 Visão atual da aplicação destas metodologias em estudos de
hematófagos
A tendência crescente da análise proteômica pode ser avaliada pelas
amplas aplicações encontradas para diversos organismos, contribuindo com a
determinação estrutural e funcional dos compostos analisados. Esta hipótese é
confirmada pelo número de registros (mais de 3400) existentes sobre Proteoma
no Pubmed (Junho/2004).
Em especial, o uso das mais diversas tecnologias disponíveis propiciam
novas descobertas de moléculas antihemostáticas, elucidando a constituição da
saliva de animais hematófagos.
Alguns
estudos
envolvendo
transcriptoma
e
proteoma
foram
desenvolvidos, nestes últimos 2 anos. Pode-se considerar que esta interrelação favoreça a identificação das moléculas da mistura complexa em um
tempo relativamente rápido.
A interrelação entre transcriptoma e proteoma da glândula salivar para o
carrapato Ixodes scapularis já foi realizada (Valenzuela et al., 2002). Foram
28
obtidas seqüências completas de cDNA e a análise protéica foi feita a partir de
eletroforese SDS-PAGE e sequenciamento por degradação de Edman. Foram
encontradas diversos inibidores de proteases, metaloproteases, proteína com
domínio para ligação de histamina e proteínas com função desconhecida.
O sialoma do mosquito Anopheles stephans também foi feito por
Valenzuela et al. (2003). Foram encontradas enzimas associadas ao sistema
anti-hemostático: peroxidases, com função vasodilatadora; apirases, com ação
antiagregante plaquetária. Também foram encontradas proteínas que interferem
na coagulação sanguínea: um inibidor de trombina e um inibidor de
quimiotripsina; entre outras. Em Anopheles gambiae notou-se que as proteínas
envolvidas no metabolismo basal são mantidas pela ingestão de açúcar e a
expressão de proteínas relacionadas à oôgenese são intensificadas após
refeição com sangue (RIBEIRO, 2003).
O sialoma do inseto Rhodnius prolixus foi desenvolvido a partir da
obtenção da biblioteca de cDNA da glândula salivar, a qual foi sequenciada ao
acaso, e pelo fracionamento das proteínas mais abundantes através de HPLC
(Ribeiro
et
al.,
2004).
Foram
descritas
substâncias
anticoagulantes,
antiagregantes e vasodilatadores, destacando-se a abundância de proteínas da
família lipocalina.
As principais proteínas solúveis de glândula salivar de moscas tsé-tsé
(Glossina
morsitans
morsitans)
foram
identificadas
a
partir
de
géis
bidimensionais e espectrometria de massa, e correspondem a: fator de
crescimento, com motivo adenosina-deaminase, que está relacionado à
modulação da vasodilatação e agregação plaquetária; antígeno 5, um alérgeno;
e duas proteínas novas com funções desconhecidas (HADDOW et al., 2002).
Uma
análise
comparativa
de
saliva
dos
carrapatos
Amblyoma
americanum e Amblyoma maculatum foi feita por eletroforese bidimensional, os
quais apresentaram perfis protéicos semelhantes, mas uma maior concentração
de peptídeos foi encontrada em A. maculatum (MADDEN; SAUER; DILLWITH,
2003).
29
A análise transcriptômica da sanguessuga Theromyzon tessulatum foi
feita pela combinação de RT-PCR e microarrays de DNA (Lefebvre et al., 2004),
focando no inibidor de cisteina-proteases cistatina B, o qual está relacionado à
resposta imune inata.
Gânglios cefálicos e caudais do sistema nervoso central de Hirudo
medicinalis foram analisados por eletroforese bidimensional e fosfoproteínas
induzidas por forbol éster foram detectadas (Garcia-Gil et al., 1991). Especulase que as fosfoproteínas da sanguessuga estejam envolvidas na modulação
dos canais iônicos, biossíntese e liberação de neurotransmissor, regulação de
receptor de neurotransmissor.
Os avanços conquistados pela análise proteômica de organismos muito
estudados, como por exemplo no caso da levedura S. cerevisiae, indicam que
estudos mais minuciosos devem ser feitos em análises estruturais, que são
baseadas nas interações não-covalentes (DZIEMBOWSKI e SÉRAPHIN, 2004).
Deste modo, o presente trabalho, aborda, pela primeira vez, o proteoma
do complexo salivar de sanguessugas analisado por eletroforese bidimensional,
espectrometria de massa e transcriptoma.
30
2 OBJETIVO
O principal objetivo do presente trabalho foi o de fazer um mapeamento
das proteínas que compõem o complexo salivar da sanguessuga Haementeria
depressa e identificar as proteínas com possível atividade anti-hemostáticas
desta amostra através das técnicas de eletroforese bidimensional, análises
zimográficas e espectrometria de massa.
Etapas desenvolvidas:
a) Obtenção do mapa protéico bidimensional do complexo salivar e de
um tecido muscular;
b) Obtenção dos géis bidimensionais do complexo salivar para remoção
de spots a serem analisados;
c) Detecção de proteases com atividade sobre fibrina e gelatina, através
de zimografia;
d) Obtenção de seqüências da hementerina e lefaxin purificados e
localização destas proteínas no mapa bidimensional;
e) Análise por Peptide Mass Fingerprinting (PMF) dos fragmentos
trípticos dos spots ou de proteína isolada (em solução ou gel) por MALDI-TOF
MS;
f) Análise de sequência dos fragmentos trípticos de spots mais
abundantes por ESI-Q-TOF MS;
g) Identificação de peptídeos/proteínas utilizando banco de dados de
proteínas, incluindo o banco de ESTs do complexo salivar de H. depressa.
31
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Sanguessugas Haementeria depressa
Sanguessugas foram coletadas em pântanos da região Sul do Brasil,
foram mantidas em aquário no biotério no laboratório de Bioquímica e Biofísica
do Instituto Butantan (São Paulo). As sanguessugas não alimentadas por 2 a 3
meses foram anestesiadas com éter e os complexos salivares foram
dissecados através de uma incisão longitudinal na região dorsal. A ventosa
posterior também foi dissecada para uma análise comparativa. Os complexos
salivares e as ventosas removidos foram imediatamente congelados e
conservados à - 80ºC.
Considerando a dificuldade para obtenção da saliva secretada, foram
utilizados os complexos salivares inteiros para as análises. Como a ventosa
posterior é constituída majoritariamente por proteínas musculares, foi
selecionada como o tecido comparativo para exclusão de proteínas teciduais.
3.2 Eletroforese Bidimensional
3.2.1 Preparo da amostra
Considerando que o complexo salivar é composto também por um tecido
muscular (probóscide), foram preparados géis bidimensionais do complexo
salivar e de um tecido muscular (ventosa) para fins comparativos, que
permitissem distinguir as proteínas exclusivas da saliva. Um pool de 300
complexos salivares e/ou 20 ventosas foram utilizados para a análise em géis
bidimensionais. Os tecidos foram triturados em gral sob nitrogênio líquido e
solubilizados em solução contendo uréia 8M, CHAPS 2%, tampão com anfólitos
carreadores 0.5% e azul de bromofenol. Foram aplicadas 0.1-1.0 mg de
proteína, com remoção de pellets celulares por centrifugação (10 000 x g por 20
32
minutos). Foi adicionado DTT 60 mM à solução de rehidratação contendo a
amostra protéica, perfazendo um volume total de 350 μl, e aplicadas em uma
tira de 18 cm pH 3-10. A rehidratação foi realizada no aparelho IPGphor®
(Amersham Biosciences, Suécia) por 12 horas, sob voltagem de 30 V.
Na eletroforese bidimensional, a primeira dimensão consiste na
isoeletrofocalização, que empregou o aparelho IPGphor®, até atingir 33000 Vh.
Em seguida, as tiras foram equilibradas em solução contendo Tris-Cl
1.5M pH 8.8, uréia 6M, glicerol 30%, SDS 2%, DTT 65 mM e bromofenol blue
durante 15 minutos sob leve agitação. Um segundo equilíbrio foi feito com esta
solução, onde o DTT foi substituído por iodoacetamida 135 mM.
Para a execução da segunda dimensão, as tiras foram colocadas em
contato com o gel de corrida, acrilamida 14% homogêneo. Marcadores de peso
molecular, Rainbow® Full range (10-250 kDa) foram aplicados em papel de
filtro 3MM. Em seguida, as tiras e os marcadores foram selados com agarose
0.5%. A eletroforese foi efetuada em Hoefer® DALT (Amersham Bioscience,
Suécia) aplicando-se uma corrente de 60 mA por gel.
3.2.2 Detecção de proteínas em géis bidimensionais
As estratégias para detecção de proteínas utilizadas foram a coloração
por prata (Shevchenko et al., 1996) ou por Coomassie Blue (LEGENDRE et al.,
1993).
Após as digitalizações dos géis, as análises das imagens foram feitas
com o auxílio do programa Image Master® (Amersham Biosciences, Suécia).
3.3 Seleção e digestão enzimática de spots
Os spots dos géis bidimensionais foram selecionadas de acordo com
massas moleculares e pontos isoelétricos de proteínas de sanguessugas
33
citadas na literatura e por abundância dos spots, visto que o fator limitante para
obtenção de seqüências por espectrometria de massa tem sido a quantidade de
proteína, mesmo que aparelhos muito sofisticados e sensíveis estejam
disponíveis.
Os spots foram introduzidos em tubos eppendorff e lavados com
bicarbonato de amônio 100 mM por 10 minutos e adicionados de 100 μl de
acetonitrila. Foram assim mantidos por 10 minutos. O excesso da solução foi
removido e submetido à secagem em Speed Vac por 30 minutos. Acrescentouse ao tubo 20 μl do tampão de digestão, composto por bicarbonato de amônio
50 mM, cloreto de cálcio 5 mM e 12.5 ng/μl de tripsina. Foi feita uma incubação
em gelo por 45 minutos e o sobrenadante foi removido. Adicionou-se ao
macerado 20 μl de cloreto de cálcio 5 mM contido em bicarbonato de amônio 50
mM e procedeu-se nova incubação à 37 °C por 16 horas. Para efetuar a
extração, 100 μl de bicarbonato de amônio 20 mM foram adicionados e a
amostra sonicada por 20 minutos. O sobrenadante foi armazenado à -20°C.
Três lavagens sucessivas com 100 μl de acetonitrila 50%, ácido acético 5%
foram efetuadas, coletando-se o sobrenadante. As amostras foram secas em
Speed Vac, posteriormente (HEUNSSEN, DOWDLE, 1980).
Após digestão com tripsina e extração das proteínas dos spots do gel
bidimensional, as amostras foram ressuspensas em TFA 0.1%, dessalinizadas
em microponteiras Ziptip® C18 e secas em Speed Vac. Em seguida, as
amostras foram adicionadas à matriz HCCA, solubilizadas em acetonitrila 50%
e TFA 0.1% para análises no MALDI-TOF. Para análise pelo electrospray, elas
foram solubilizadas em acetonitrila 50% e TFA 0.1%.
3.4 Espectrometria de massa
A análise dos fragmentos peptídicos foi executada no espectômetro
ETTAN MALDI-TOF (Amersham Biosciences, Suécia), equipado com pulso de
34
laser à 337 nm no modo linear. A matriz HCCA foi preparada em concentração
de 10 mg/ml em 1:1 acetonitrila, 0.1% TFA. 0.5 μl da solução peptídica foi
misturada à 0.5 μl da solução de matriz e aplicadas na placa de análise. A
voltagem de aceleração foi de 20 kV. A calibração externa foi feita com [Ile7]angiotensina III (m/z 897.51) e hormônio adrenocorticotrófico humano,
fragmento 18-39 (m/z 2465.19).
O espectrômetro ETTAN MALDI-TOF (Amersham Biosciences, Suécia)
apresenta resolução de 12000 e 1000 (FWHM) nos modos reflectron e linear,
respectivamente; sensibilidade de 10 e 5 fmol nos modos reflectron e linear,
respectivamente; precisão > 25 ppm (calibração interna), > 100 ppm (calibração
externa); capacidade de analisar massas na faixa de 500 à 500.000 Da.
A análise de sequenciamento foi efetuada no espectrômetro Q-TOF
Ultima API com fonte de ionização por electrospray (Micromass, Reino Unido).
A energia de colisão empregada variou de 18 à 45 e os íons precursores foram
selecionados em uma janela de 1 m/z. As seqüências peptídicas foram
determinadas com o auxílio do software MassLynx®. A calibração externa foi
feita com NaI.
3.5 Identificação de proteínas
A identificação de proteínas baseou-se na localização bidimensional dos
spots; na análise por Peptide mass fingerprinting (PMF), que correlaciona
massas peptídicas geradas pela digestão de uma proteína pura com as massas
peptídicas teoricamente esperadas. Utilizou-se o programa MASCOT que
efetua a busca em banco de dados disponíveis. Utilizou-se também o banco de
ESTs do complexo salivar de H. depressa, através da simulação tríptica dos
clusters completamente seqüenciados. Para a identificação das seqüências dos
peptídeos/proteínas obtidos foram consultados então os bancos de ESTs e
bancos de proteínas, como BLASTp e BLAST-MS.
35
Os bancos de ESTs cobrem porções parciais do cDNA (Expressed
Sequence Tags), através dos quais podem-se correlacionar informações
provenientes da espectrometria de massa e seqüências do cDNA.
Como não existe banco de dados disponível exclusivo de sanguessugas,
em paralelo a este trabalho, foi construído uma biblioteca de cDNA a partir do
complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa e 900 clones
aleatórios desta biblioteca tiveram sua sequência analisada (Faria, 2004). ESTs
desta biblioteca foram seqüenciadas e traduzidas com o auxílio do programa
Bioedit®. Resultaram 555 contigs, os quais foram utilizados para as análises
comparativas. As seqüências obtidas das ESTs contribuíram para a
identificação
das
proteínas
analisadas
por
Espectrometria
de
Massa.
Recentemente, as seqüências dos nucleotídeos do complexo salivar da
Haementeria depressa foram depositadas no banco de ESTs do GenBank.
Os clusters que apresentaram seqüências completas foram submetidos à
uma digestão teórica e deste modo, foi construído um banco parcial para
análises por PMF.
Diversos programas e utilitários de acesso livre on-line foram utilizados
para análise dos resultados obtidos, estando apresentados no anexo.
3.6 Detecção específica por zimografia
A técnica de zimografia auxilia na identificação de proteases e, no
presente trabalho, foram avaliadas as atividades fibrinolítica e gelatinolítica de
possíveis proteases presentes no extrato do complexo salivar de H. depressa.
3.6.1 Atividade fibrinolítica e localização de hementerina
Como primeira etapa de identificação de atividade fibrinolítica foi
realizada zimografia a partir de SDS-PAGE (Laemmli, 1970). O gel SDS-PAGE
36
10% homogêneo foi preparado, e nele foram aplicados 80 μg de extrato do
complexo salivar. A corrida eletroforética foi realizada à 6 mA à 4°C. Em
seguida, o gel foi lavado com Triton X100 2.5% por 30 minutos, e depois com
tampão Tris-HCl 50 mM pH 7.5 por 10 minutos, por 3 vezes. Após as lavagens,
o gel foi depositado sobre uma placa de fibrina-agarose, mantido por 18 horas a
37 °C em câmara úmida. Após observação da área de lise na placa de fibrinaagarose, o gel foi removido e corado por Coomassie Blue. Em paralelo, fez-se
um gel SDS-PAGE nas mesmas condições para estabelecer comparações de
localização da proteína ativa por sobreposição. A proteína revelada no gel de
acrilamida correspondente à posição que apresentou lise na placa de fibrinaagarose foi então reservada para análise espectrométrica.
A placa de fibrina-agarose (placa de atividade) sobre a qual depositou-se
o gel de acrilamida foi preparada da seguinte maneira: solução de fibrinogênio
humano (Calbiochem) correspondente à 2 mg/ml em proteína coagulável em 15
ml Tris 50 mM pH 7.5 contendo CaCl2 5mM e adicionando trombina 20U/ml.
Preparou-se em tubo separado uma solução de agarose 2% no mesmo tampão.
A solução de fibrinogênio e de agarose foram misturados em volumes iguais em
tubo Falcon à 40 °C e depositados sobre uma placa de Petri sob leve agitação
que permaneceu por cerca de 1 hora à temperatura ambiente em superfície
nivelada (ASTRUP, 1956).
3.6.2 Zimografia bidimensional
Para a execução da zimografia bidimensional, foram aplicados 350 μg de
extrato bruto em tira de 11 cm de gel imobilizado na faixa de pH de 3.0 à 10.0
sob voltagem constante de 3000V, até atingir 16000Vh. A tira foi equilibrada e a
eletroforese foi executada. A segunda dimensão foi feita em um gel de
acrilamida 14% homogêneo. O gel foi lavado e transferido para placa de fibrinaagarose, conforme procedimentos descritos acima.
37
A localização da hementerina no gel bidimensional foi obtida pela
sobreposição da área de lise observada na placa de fibrina-agarose com o gel
comparativo. Este spot correspondente à hementerina foi submetido à análise
de sequenciamento.
3.6.3 Atividade sobre gelatina
Para avaliar a atividade gelatinolítica da amostra, preparou-se gel de
poliacrilamida SDS-PAGE 10% contendo 0.1 mg/ml de gelatina. 120 μg de
extrato do complexo salivar foram aplicados. A corrida eletroforética foi
realizada sob voltagem baixa à 4 °C. Em seguida, o gel foi lavado com Triton
X100 2.5% por 30 minutos, e depois com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7.5 por 10
minutos, por três vezes. Após as lavagens, o gel foi corado por Coomassie Blue
por 2 horas e descorado. A proteína correspondente à atividade gelatinolítica foi
reservada para análise espectrométrica.
3.6.4 Lefaxin
Foram aplicadas 40 μg de proteína purificada em um gel de acrilamida
SDS-PAGE, e a banda correspondente ao lefaxin (30 kDa) foi recortada,
submetida à digestão tríptica (conforme procedimentos descritos no item 3.3) e
reservada para análise de sequenciamento por espectrometria de massa.
38
4 RESULTADOS
4.1 Perfil bidimensional do extrato bruto do complexo salivar
O mapeamento bidimensional do complexo salivar da sanguessuga H.
depressa foi obtido aplicando-se 100 μg de proteína, no qual foram detectados
um total de 352 spots, quando corado por nitrato de prata (Figura 8) e 183
spots totais foram detectados no mapa protéico do tecido muscular, também
corado por nitrato de prata (Figura 9). Foram detectadas proteínas do complexo
salivar e do tecido muscular com pI entre 3.5 a 9.5 e massa molecular entre 10
e 105 kDa. A reprodutibilidade destes géis foi observada através de
experimentos sucessivos que apresentaram o mesmo padrão de spots. Uma
análise comparativa entre os géis do complexo salivar e tecido muscular foi feita
para relacionar as proteínas constituintes de ambos tecidos e sobretudo, as
exclusivas da glândula salivar. Esta análise foi feita utilizando o programa
Image Master® (Amersham Biosciences, Suécia), o qual relaciona os spots
detectados nos géis, baseando-se no posicionamento, volume e distância entre
os spots. Observou-se que dos 352 spots totais do complexo salivar, 249 foram
exclusivos da saliva e 103 spots comuns com o tecido salivar (Figura 10).
Visando a identificação dos spots do complexo salivar, foram aplicadas
800 μg de proteína e os géis foram corados por Coomassie; sendo detectados
219 spots totais (Figura 11).
39
pH
3,0
10,0
250 kDa
MM
10 kDa
Figura 8 - Gel bidimensional do complexo salivar de Haementeria depressa.
Foram aplicadas 100 ug de proteína em uma tira de 18 cm linear com
gradiente imobilizado de pH entre 3.0 à 10.0. Primeira dimensão: IEF feita no
equipamento IPGphor até atingir 33kVh. Segunda dimensão: corrida
eletroforética em gel SDS-PAGE 14%, utilizando o sistema Hoefer DALT.
Proteínas foram detectadas pela coloração por nitrato de prata (352 spots
totais).
40
pH
3,0
10,0
250kDa
MM
10kDa
Figura 9 - Gel bidimensional do tecido muscular de Haementeria depressa.
Foram aplicadas 100 ug de proteína em uma tira de 18 cm linear com
gradiente imobilizado de pH entre 3.0 à 10.0. Primeira dimensão: IEF feita no
equipamento IPGphor até atingir 33kVh. Segunda dimensão: corrida
eletroforética em gel SDS-PAGE 14%, utilizando o sistema Hoefer DALT.
Proteínas foram detectadas pela coloração por nitrato de prata (183 spots
totais).
41
pH
3,0
10,0
250kDa
MM
10kDa
Figura 10 - Sobreposição dos spots detectados no complexo salivar
(vermelho) e no tecido muscular (azul) de Hamenteria depressa - análise
efetuada com o auxilio do software Image Master.
42
3,0
pH
10,0
250 kDa
MM
10 kDa
Figura 11 - Gel bidimensional do complexo salivar de Haementeria
depressa.
Foram aplicadas 800 ug de proteína em uma tira de 18 cm linear com
gradiente imobilizado de pH entre 3.0 à 10.0. Primeira dimensão: IEF feita
no equipamento IPGphor até atingir 33kVh. Segunda dimensão: corrida
eletroforética em gel SDS-PAGE 14%, utilizando o sistema Hoefer DALT.
Proteínas foram detectadas pela coloração por Coomassie Blue (219 spots
totais).
43
4.2 Perfil espectrométrico do extrato bruto do complexo salivar
A análise preliminar desta amostra detectou 7 íons moleculares
principais: 1856.3; 2028.4; 3369.3; 3863.8; 5103.4; 5734.6 e 7028.6 Da, com a
matriz HCCA solubilizada em acetonitrila 50% e TFA 0.1% (Figura 12).
Utilizando-se a matriz SA solubilizada em acetonitrila 50% e TFA 0.1%,
detectaram-se 7 íons principais: 7025.4; 8476.7; 10805.6; 14046.2; 16952.5;
28261.1; 42448.2 (Figura 13).
4.3 Análise proteômica do complexo salivar de H. depressa
Os
constituintes
do
complexo
salivar
obtidos
por
eletroforese
bidimensional (25 spots), proteínas com atividade biológica reveladas por
zimografia (hementerina e “gelatinase”) e ainda, proteínas purificadas
(hementerina e lefaxin) foram analisados por espectrometria de massa.
4.3.1 Spots bidimensionais
A Figura 14 mostra os spots bidimensionais selecionados para análise.
O gel bidimensional do complexo salivar apresentou um total de 219
spots totais, quando corado por Coomassie Blue, dos quais foram analisados os
25 mais abundantes do complexo salivar; dentre os quais, 10 spots tiveram
suas seqüências definidas.
4.3.1.1 Spots 1 e 2
Os spots foram localizados no mapa protéico do complexo salivar: spot 1
= pI 3.5 e MM 17 kDa; spot 2 = pI 3.5 e MM 16 kDa.
Figura 12 - Perfil espectrométrico do complexo salivar de H. depressa analisado por MALDI-TOF
MS em matriz HCCA (faixa de m/z: 500-10000).
Figura 13 - Perfil espectrométrico do complexo salivar de H. depressa analisado por MALDI-TOF MS em
matriz SA (faixa de m/z: 5000-100000).
pH
3,0
10,0
250 kDa
25
24
23
21
MM
10
19 9
18
20
22
17
678
1
15
2
16
14
3
13
10 kDa
12
11
Spot
45
Proteína
pI
MM (kDa)
1
Antiagregante plaquetário
3.5
17
2
Antiagregante plaquetário
3.5
16
3
Miohemeritrina
6.7
14
4
Miohemeritrina
7.1
14
5
Miohemeritrina
7.3
14
6
Anidrase carbônica
5.6
30
7
Anidrase carbônica
5.8
30
8
Anidrase carbônica
6.0
30
9
Anidrase carbônica
5.5
32
10
Anidrase carbônica
5.7
32
11
4.5
10
12
7.0
12
13
4.7
13
14
3.9
15
15
5.2
20
16
6.3
20
17
8.3
26
18
4.5
31
19
5.2
30
20
8.3
34
21
3.7
35
22
3.8
35
23
5.2
36
24
5.2
37
25
6.2
74
Figura 14 - Análise dos spots do gel bidimensional do complexo salivar de
H. depressa. Área circular pontilhada: hementerina.
47
Em seguida, foram feitas as análises via PMF, e os seguintes íons
moleculares dos fragmentos tripsinizados foram analisados por MALDI-TOF
MS:
Spot 1: (M + H)+ = 643.4; 913.6; 1243.6; 1371.7; 1653.7; 2531.2;
Spot 2: (M + H)+ = 789.4; 851.5; 1207.9; 1375.8.
Os espectros das análises por PMF dos spot 1 e 2 estão apresentados
nas Figuras 15 e 16, respectivamente.
Tratando-se de uma amostra desconhecida, o sequenciamento de novo
foi essencial para a identificação das proteínas. Os íons analisados no ESI-QTOF MS e as respectivas seqüências obtidas estão apresentadas na Tabela 2:
Tabela 2 - Análises espectrométricas dos spots 1 e 2 por ESI-Q-TOF.
Spot 1
Spot 2
(M + H)+
(M + 2H)2+
(monoisotópico)
(monoisotópico)
913.6
457.2
LPDNLLTK
1243.6
622.2
TEFTSVDECR
1653.7
827.3
ILQINTETNECYR
789.4
Seqüências
KKENDR
851.5
426.2
FDESILK
1375.8
688.4
CQVIQVNDSNKK
Obs: os íons duplamente carregados foram selecionados para fragmentação, exceto o íon
monocarregado 789.4 do spot 2 .
Os espectros obtidos para o sequenciamento estão apresentados nas
figuras 17 e 18.
Figura 15 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 1 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde a uma proteína similar a antiagregante
plaquetário de H. officinalis.
Figura 16 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 2 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde a uma proteína similar a antiagregante
plaquetário de H. officinalis.
A) LPDNLLTK
LP
D
K
N
T
L
L
LT
L
N
K
D
P
800.42
y7
100
%
327.12
129.11
0
248.15
147.12 230.08 y2
y1
440.20
b4
525.28
459.27 a5
400.79
703.37
y6
588.35
y5
801.56
707.31
803.10
653.37
299.14
bMax
yMax
L
893.37
911.42 994.41
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
B) TEFTSVDECR
TE
F
R
T
C
100
S
D
E
V
D
S
V
E
T
231.11
b2
%
140.11
0
335.17 378.15
y2
b3
170.05
100
678.28
y5
755.46
507.29
259.15
200
1014.55
579.19
y4
461.13
300
400
500
bMax
yMax
T
866.33
y7
765.29
y6
203.09
a2
CR
E
F
1013.40
y8
600
867.50
995.36
766.40
768.92
869.41
800
900
700
1015.91
1000
1157.61
1100
1245.61
M/z
1300
1200
C) ILQINTETNECYR
IL
Q
R
I
C
Y
N
T
E
E
N
T
T
N
E
E
T
C
I
N
Y
Q
R
L
100
355.22
b3
1186.41
y9
827.50
%
175.11 227.18
b2
349.28
y1
bMax
I
yMax
1653.68(M+H) +
709.57
498.21 627.29
453.44
820.34
y3
y4 705.25
842.32971.34
y7
y6
1072.39
y8
1169.43
1654.85
1658.19
1299.47
y10
1427.52
1636.66
y11
1187.59
1429.84
1409.78
1658.44
1667.63
1714.97
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Figura 17 - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
1, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
LPDNLLTK; B) TEFTSVDECR; C) ILQINTETNECYR.
A) KKENDR
K
K
E
R
N
D
N
D
R
E
bMax
yMax
789.39(M+H) +
KK
100
790.53
%
116.11 158.11
175.14
y1
150
200
404.23
370.20387.21 y3
290.18
y2
175.89
0
100
229.13
a2
250
300
350
791.26
481.24
400
450
499.22
500
615.24
b5
562.10
550
600
772.46
691.42
650
700
794.39 830.43
M/z
800
850
750
B) FDESILK
F
K
D
L
E
S
I
I
S
L
D
E
K
F
bMax
yMax
704.46
y6
100
589.41
y5
%
214.13 263.13
120.11
b2
a1
147.14
F
y1 158.08
427.16
460.37
y4
314.11 332.13 426.34
571.42
469.20
705.60
b6
590.52627.37
851.48(M+H) +
708.49745.73
833.42
855.48 921.35
0
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
936.66
M/z
900
C) CQVIQVNDSNKK
CQ
V
K
K
I
N
Q
S
V
D
NDS
N
V
N
Q
KK
VQC
I
bMax
yMax
331.19
b3
100
232.10
b2
%
204.10
129.13 a2
242.17
419.12476.33
y4
369.34
705.43
591.36
y6
661.28
y5
804.49
y7
787.50
915.60
994.79
1045.74
y9
1000
1100
1184.791255.57
1374.421410.11
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1200
1300
1400
Figura 18 - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot 2,
analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
KKENDR; B) FDESILK; C) CQVIQVNDSNKK.
52
4.3.1.1.1 Identificação dos spots 1 e 2: antiagregante plaquetário
A localização bidimensional do spot 1 (pI 3.5 e MM 16 kDa) foi similar ao
LAPP (leech antiplatelet protein) (pI 4.0 e MM 16 kDa) (Q01747), um
antiagregante plaquetário encontrado na sanguessuga H. officinalis (Connoly;
Jacobs; Condra, 1992). A análise por PMF, utilizando o programa MASCOT,
confirmou que os íons moleculares 913.61 e 1243.68 correlacionam-se ao
LAPP.
Por outro lado, a análise por PMF do spot 1, usando o banco de ESTs
(digestão tríptica teórica dos clusters completos), apresentou uma correlação
dos íons: 643.41; 913.61; 1243.68; 1371.75 e 2531.27 com os clusters 318 e
545, identificados pela similaridade ao LAPP. Esta proteína também foi
identificada após a obtenção de seqüências com a utilização do BLASTp –
seqüências curtas. Deste modo, o spot 1 foi identificado como antiagregante
plaquetário.
Apesar do spot 2 estar intimamente próximo ao spot 1 no gel, os dados
de massas peptídicas e de seqüências não apresentaram correlação
significativa com os bancos de proteínas disponíveis; deste modo, a análise foi
feita utilizando o banco de ESTs de H. depressa.
Para o spot 2, a análise por PMF, mostrou que os íons moleculares
851.55; 1207.92 e 1375.93 corresponderam ao antiagregante plaquetário,
identificados nos clusters 59 e 344. Apenas o íon 789.48 (QQENDR) não
apresentou correlação por PMF. Assim, o spot 2 apresentou similaridade aos
clusters identificados como antiagregante plaquetário.
A Figura 19 mostra o posicionamento das seqüências provenientes da
fragmentação tríptica destes spots em relação aos clusters similares ao LAPP e
ao LAPP, propriamente dito, através de alinhamento.
53
LAPP_HAEOF
HDEP344
HDEP59
HDEP318
HDEP545
SPOT1ANTIPLAT
SPOT2ANTIPLAT
10
20
30
40
50
60
|
|
|
|
|
|
MNSFLFSLACSLLVAIPAISAQDEDAGGAGDETSEG-EDTTGSDETPSTGGGGDGGNEET
-------LLCSLLLVAPVIRAQDE---EEGGESEET-TGEGDEPTPPSDDGGEP----PG
MNSFLFYLLCSLLLVAPVIRAQDE---EEGGESEET-TGEGDEPTPPSDDGGEPPASPPG
MNSFLFSFVCSLLVAIPAVRAQDEG--DAGDEANEGGEDNTGSDETTSTGGGGGGGNEET
MNSFLFSFVCSLLVAIPAVRAQDE---DAGDEASEGGEDNTGSDETTSTGGGGGGGNEET
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Prim.cons.
MNSFLFSL2CSLLVAIPAIRAQDE2AG2AGDE22EGGED2TGSDETPSTGGGG2GGNEET
LAPP_HAEOF
HDEP344
HDEP59
HDEP318
HDEP545
SPOT1ANTIPLAT
SPOT2ANTIPLAT
Prim.cons.
70
80
90
100
110
120
|
|
|
|
|
|
ITAGNEDCWSKRPGWKLPDNLLTKTEFTSVDECRKMCEESAVEPSCYILQINTETNECYR
GNEESSDCWSERKDLKFDESILKDSGTTSVEECKKKC---LENDRCAVIQVNDSNKKCYI
GNEESSDCWSERKDLKFDESILKDSGTTSVEECKKKC---LENDRCAVIQVNDSNKKCYI
ITAGNGDCWSKRPGWKLPDNLLTKTEFTSVDECRKMCEKSAVEPACYILQINTETNECYR
ITAGNGDCWSKRPGWKLPDNLLTKTEFTSVDECRKMCEKSAVEPACYILQINTETNECYR
----------------LPDNLLTKTEFTSVDECR-------------ILQINTETNECYR
----------------FDESILK----------KK------ENDRCAVIQVNDSNKK--: :.:*.
:
::*:* ..::
ITAGN2DCWSKRPGWKLPDNLLTKTEFTSVDECRKMCEKSA222RC2ILQINTETNECYR
LAPP_HAEOF
HDEP344
HDEP59
HDEP318
HDEP545
SPOT1ANTIPLAT
SPOT2ANTIPLAT
130
140
150
|
|
|
NNEGDVTWSSLQYDQPNVVQWHLHACSK---YP-ADADWGSVQQGSTGYTQYHIHACQ----YP-ADADWGSVQQGSTGYTQYHIHACQ----NNEGDVTWSSLQYDQPNVVQWHLHACSNRKNW
NNEGDVTWSSLQYDQPNVVQWHLHACSK------------------------------------------------------------------
Prim.cons.
NNEGDVTWSSLQYDQPNVVQWHLHACSKRKNW
Figura 19 - Alinhamento de proteínas identificadas como antiagregante plaquetário,
incluindo a seqüência de Haementeria officinalis, as seqüências de proteínas traduzidas
de ESTs dos clusters 59, 344, 318 e 545 (acesso Genbank: HDEP0059c, HDEP0318s,
HDEP0344c, HDEP0545s) e as seqüências de fragmentos peptídicos obtidos por
espectrometria de massa dos spots 1 e 2 de Haementeria depressa. O alinhamento foi
feito utilizando o utilitário CLUSTALW.
54
4.3.1.2 Spots 3, 4 e 5
Spots apresentando pI entre 6.7 a 8.5 e massa molecular de cerca de 14
kDa foram detectados como muito abundantes no complexo salivar e no tecido
muscular de H. depressa. Os spots 3 (pI 6.7 e MM 14 kDa), 4 (pI 7.1 e MM 14
kDa) e 5 (pI 7.3 e MM 14 kDa) foram visualizados nos géis bidimensionais como
um grupo seriado de spots com pIs distintos e massas moleculares próximas.
Uma migração dispersa, em forma de cauda, observada nos spots 4 e 5,
poderia sugerir modificação pós-traducional.
A análise por PMF detectou os seguintes íons moleculares por MALDITOF MS:
Spot 3: (M+ H)+ = 871.4; 978.5; 1010.6; 1044.6; 1243.7; 1276.7; 1281.9;
1311.7; 1339.6; 1455.7; 1486.6; 1855.0; 2321.1; 2446.1; 2562.2; 2943.3;
Spot 4: (M+ H)+ = 599.2; 713.2; 768.3; 850.4; 882.4; 996.4; 1024.5; 1165.6;
1263.6; 1311.5; 1343.4; 1455.5; 1534.4; 1854.9; 2307.0; 2562.1.
Spot 5: (M+ H)+ = 599.2; 713.2; 768.4; 850.4; 882.4; 996.4; 1024.4; 1165.6;
1311.5; 1327.5; 1421.7; 1455.5; 1503.7; 1534.5; 1707.7; 1854.9; 2307.0;
2383.9; 2562.2.
As Figuras 20 , 21 e 22 mostram os espectros obtidos por MALDI-TOF
MS.
Os íons moleculares comuns para os spots 3, 4 e 5 foram: 1311; 1455;
1854 e 2562.
A análise por PMF revelou ainda íons moleculares comuns entre os spots
4 e 5: (M+ H)+ = 599.2; 713.2; 768.4; 850.4; 882.4; 996.4; 1024.4; 1165.6;
1311.5; 1455.5; 1534.5; 2307.0 e 2582.2; e alguns íons exclusivos do spot 5:
1421.7; 1503.7; 1707.7 e ainda revelou que o íon 1263.6 é exclusivo do spot 4,
portanto, os íons exclusivos podem indicar correlações com modificações póstraducionais.
Figura 20 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 3 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.Este spot corresponde a uma proteína similar a miohemeritrina
de T. tessulatum.
Figura 21 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 4 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde a uma proteína similar a miohemeritrina
de T. tessulatum.
Figura 22 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 5 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde a uma proteína similar a
miohemeritrina de T. tessulatum.
58
O sequenciamento de novo, foi realizado para os íons correspondentes
ao spot 3, cujas seqüências estão apresentadas na Tabela 3:
Tabela 3 – Análise espectrométrica do spot 3 por ESI-Q-TOF.
(M + H)+
Spot 3
(M + 2H)2+
Sequências
(monoisotóp)
(monoisotóp)
871.3
436.2
FEEGMMK
978.5
490.2
FDVPEPFK
1010.5
505.7
DWLVNHVK
1243.6
622.3
GLFEAFFDLGK
1276.7
638.8
SPSDAHALTHLK
1311.6
656.3
HFRFEEGMMK
2321.1
1161.5
LHTDFEHDLESVHTPVSTEK
Os espectros das sequências obtidas estão apresentados nas Figuras
23A e 23B.
Fragmentos peptídicos referentes aos spots 4 e 5 serão ainda
sequenciados.
4.3.1.2.1 Identificação dos spots 3, 4 e 5: miohemeritrina
A identificação dos spots 3, 4 e 5 foi possível após PMF em banco de
EST e/ou por sequenciamento de novo.
Pela análise por PMF dos spots 3, 4 e 5, usando o programa MASCOT,
foram encontradas diversas proteínas, de diversos organismos, incluindo
globinas e hemocianinas, o que indicaria uma relação de identificação funcional.
A) FEEGMMK
F
K
E
M
E
M
G
G
MM
K
E
E
bMax
yMax
F
595.30
y5
100
249.14
277.13
a2
b2
%
120.11
a1
147.13
F
y1
186.12
724.36
y6
436.28 466.26
y4
577.32
406.22
498.66
b3
278.17
y2
318.13
871.37(M+H) +
596.40
706.34
598.81
876.09
726.27
811.25 853.46
935.53 958.55
M/z
900
950
0
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
B) FDVPEPFK
F
K
D
V
PEPF
F
P
391.28
y3
100
E
P
V
K
F
D
bMax
yMax
978.64(M+H) +
617.37
y5
%
129.13
0
217.16 263.14
b2
147.13
y1
618.44
471.27
324.20
100
200
716.46
y6
392.23
294.20
y2
300
400
502.30
581.35
500
600
981.77
717.39
737.26
618.94
715.34
851.42 864.41 977.41
700
800
H
V
W
900
983.31 1064.71
M/z
1000
C) DWLVNHVK
DW
K
L
V
274.14
a2
100
V
H
302.13
b2
N
N
V
L
K
bMax
yMax
D
709.49
y6
596.40
y5
%
351.20
256.13
187.11
132.10143.07
383.27
y3
507.36
563.37
464.29
603.34
692.45
710.63
1010.56(M+H) + 1070.04
711.92 829.32 878.57 899.68
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
M/z
1100
1000
D) GLFEAFFDLGK
GL
K
F
G
E
D
L
A
F
F
F
100
F
A
797.45
726.42 y7
y6
D
E
LG
F
926.56
y8
K
LG
1073.56
y9
277.13
%
143.14
a2
249.13
318.20
432.27
b3 348.19 y4
553.36
1074.72
579.34
y5
622.45
727.55
633.40
204.15;y2
bMax
yMax
927.45
b8 1072.88
798.59
1157.89
1243.57(M+H) +
1288.37
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
M/z
1300
Figura 23A - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
3, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
FEEGMMK; B) FDVPEPFK; C) DWLVNHVK; D) GLFEAFFDLGK.
E) SPSDAHALTHLK
SP
S
L
214.12
K
100
%
D
H
158.04
147.13
y1
A
H
T
L
A
T
H
546.78
547.29
H
D
A
L
K
S
P
890.55
y8
793.39
765.47
bMax
yMax
S
1189.74
y11
1092.76
y10
682.49
y6
397.31 427.16
y3
315.13
A
L
1193.83
930.46
1096.07
1074.68
1278.67
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
F) HFRFEEGMMK
H
K
F
M
R
F
M
G
E
E
E
E
100
%
147.13
y1
130.11
173.15
285.16
b2
580.35
452.32
424.28
717.46
b5
766.40
G
FR
903.47
b7
875.58
a7
M
MK
F
904.63 1006.53
a8
619.31
bMax
yMax
H
1034.51
b8
1174.65
1274.87
1313.01
y9
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
G) LHTDFEHDLESVHTPVSTEK
LH
K
T
E
T
D
S
F
V
E
P
T
H
H
D
V
L
S
E
E
S
L
V
D
H
HTPV
E
S
F
T
DT
E
H
100
251.17
b2
2071.00
y18
660.39
y6
%
761.47
y7
501.43
234.13 253.11
898.52
y8
1036.64
630.27
1547.68
1237.76
2053.02
b10 1306.65 1535.90 1548.97 1796.341854.96
y16 1970.31
K
bMax
L
yMax
2321.31(M+H) +
2303.14
2321.79
2190.32
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2329.05
2333.94
M/z
2400
Figura 23B - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
3, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: E)
SPSDAHALTHLK; F) HFRFEEGMMK; G) LHTDFEHDLESVHTPVSTEK.
61
A análise por PMF utilizando o banco de ESTs, mostrou uma correlação
dos seguintes íons moleculares dos fragmentos trípticos dos spots 3, 4 e 5 com
os íons moleculares da digestão teórica do cluster 312:
Spot 3: (M+ H)+ = 871.4; 1010.6; 1243.7; 1276.7; 1311.7; 1455.7; 1486.6;
1855.0; 2321.1 e 2943.3;
Spots 4 e 5: (M+ H)+ = 768.4; 1311.5; 1455.5; 1854.9 e 2307.0.
Esta proteína também foi identificada após a obtenção de seqüências
com a utilização do BLASTp – seqüências curtas.
O cluster 312 possui o domínio hemeritrina (PS00550), o qual requer H,
E e Q para a ligação do ferro, sendo definido pela seguinte seqüência: H-FX(2)-[EQ]-[ENQ]-X(2)-[LMF]-X(4)-[FY]-X(5-6)H-X(3)-[HR]. Neste caso, os íons
moleculares 1311 e 1455 correspondem aos fragmentos deste domínio. Uma
vez que estes íons são comuns aos spots 3, 4 e 5 foi possível considerá-los
como pertencentes à família das hemeritrinas. O íon 1311.70 do spot 3 foi
seqüenciado e a seqüência do íon 1455.74 pôde ser deduzida pelo PMF no
banco de ESTs.
A Figura 24 apresenta o alinhamento das seqüências obtidas por
espectrometria de massa em relação às seqüências completas do cluster 312
de H. depressa e da miohemeritrina de T. tessulatum.
62
HEMM_THETS
HDEP312
SPOT3hemeritrina
Prim.cons.
HEMM_THETS
HDEP312
SPOT3hemeritrina
Prim.cons.
HEMM_THETS
HDEP312
SPOT3hemeritrina
Prim.cons.
10
20
30
40
50
60
|
|
|
|
|
|
--------------MVFEIPEPYQWDETFEVFYEKLDEEHKGLFKGIKDLSDSPACSETL
MKAFIVLAACFAATLAFDVPEPFKWDHSFEVFYEKLDEQHKGLFEAFFDLGKSPSDAHAL
----------------FDVPEPF-----------------KGLFEAFFDLGKSPSDAHAL
*::***:
****:.: **..**: :.:*
MKAFIVLAACFAAT22FDVPEPF2WD22FEVFYEKLDE2HKGLFEAFFDLGKSPSDAHAL
70
80
90
100
110
120
|
|
|
|
|
|
EKLVKLIEDHFTDEEEMMKSKSYEDLDSHKKIHSDFVETLKGVKAPVSEENIKMAKEWLV
THLKDVVHKHFRFEEGMMKNAHYAEYDAHHKLHTDFEHDLESVHTPVSTEKVHWAKDWLV
THLK-----HFRFEEGMMK------------LHTDFEHDLESVHTPVSTEK-----DWLV
:*
** ** ***
:*:** . *:.*::*** *:
:***
THLK22222HFRFEEGMMK222Y222D2H2KLHTDFEHDLESVHTPVSTEK222AKDWLV
130
|
NHIKGTDFKYKGKL
NHVKGVDFKYKGKL
NHVK---------**:*
NHVKG2DFKYKGKL
Figura 24 - Alinhamento de proteínas identificadas como miohemeritrinas, incluindo a
seqüência de T. tessulatum, seqüência de proteína traduzida do cluster 312 (acesso
Genbank: HDEP0312s) e as seqüências de fragmentos peptídicos obtidos do spot 3 de H
depressa. O alinhamento foi feito utilizando o utilitário CLUSTALW.
63
4.3.1.3 Spots 6, 7, 8, 9 e 10
Muitos spots abundantes foram localizados na região de 30 kDa e na
faixa de pI entre 5.5 à 6.2 no gel bidimensional do complexo salivar de H.
depressa, e 5 destes spots foram recortados e analisados. No tecido muscular
não foram observados spots correspondentes à esta região.
Foram feitas análises por PMF em MALDI-TOF MS, encontrando-se os
seguintes íons moleculares:
Spot 6: (M+ H)+ = 568.2; 722.5; 851.5; 878.5; 1031.5; 1069.7; 1093.6;
1131.6; 1174.6; 1355.8; 1474.7; 1535.9; 1590.92; 1718.9; 2075.14;
Spot 7: (M+ H)+ = 568.1; 677.3; 752.3; 840.5; 878.5; 1007.5; 1173.7;
1320.7; 1337.7; 1381.8; 1436.8; 1463.8; 1594.9; 1608.9; 1670.0; 1737.0;
1987.2; 2125.2; 2259.3;
Spot 8: (M+ H)+ = 568.1; 1055.7; 1233.6; 1283.7; 1443.8; 1748.0; 1774.0;
Spot 9: (M+ H)+ = 1243.7; 1371.8;
Spot 10: (M+ H)+ = 568.1; 1037.5; 1073.6; 1199.6; 1215.5; 1275.7;
1401.7; 1457.8; 1521.9; 1608.8; 1685.7; 1721.8; 1864.0; 1903.9; 2124.1;
2199.1; 2503.3; 2932.2; 3372.0; 3442.6.
Observou-se que o íon molecular 568.1 é comum aos spots 6, 7, 8 e 10 e
o íon 1173.7, comum aos spots 6 e 7. Os íons 1608.9 e 2125.2 foram
encontrados nos spots 7 e 10, e os demais íons não se correlacionaram entre
si.
Os espectros das análises por PMF estão apresentados nas Figuras 2529.
Após a análise via PMF destes spots, os íons foram selecionados,
detectados, seqüenciados e estão apresentados na Tabela 4:
64
Tabela 4 – Análises espectrométricas dos spots 6, 7, 8, 9, e 10 por ESI-Q-TOF.
Spot 6
(M + H)+
(M + 2H)2+
(monoisotóp)
(monoisotóp)
486.34
Spot 7
ELPK
812.53
406.79
LVNELPK
772.93
1544.85
QCEGNQSLPNLDVK
530.39
Spot 8
NVLGK
1159.77
580.37
VGNKNEELEK
1196.81
598.91
KMVNEPTHLK
1337.78
669.39
QYDLELTNEGR
1737.11
869.06
MVLSLSQEQLDAFKK
476.32
Spot 9
Spot 10
Sequências
QSNK
1275.75
638.38
LADTDNEELQK
706.51
353.76
FVSLLK
1233.75
617.39
ESLSLSQTQLK
1375.77
688.41
LNEGTENTELQK
973.58
487.32
WNVLSVAGK
1018.56
509.76
EVSPDNVMK
1037.50
519.26
SYYQYEGK
1073.63
537.31
QDELNEVVK
Os espectros dos sequenciamentos estão apresentados nas Figuras 3034.
Figura 25 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 6 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde a uma proteína similar a anidrase
carbônica.
Figura 26 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 7 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde à uma proteína similar a anidrase
carbônica.
Figura 27 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 8 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde à uma proteína similar a anidrase
carbônica.
Figura 28 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 9 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde à uma proteína similar a anidrase
Figura 29 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 10 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS. Este spot corresponde à uma proteína similar a anidrase
carbônica.
A) EPLK
EP
L
K
K
L
P
bMax
yMax
486.35(M+H) +
E
100
487.28
%
129.12
81.33 87.78
0
50
75
260.22
y2
279.86
227.13
199.13
b2
a2
147.13
y1
312.25
a3
488.81
340.22
b3
374.23
440.27
387.21
504.95
540.38
587.47 615.42
M/z
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
600
B) LVNELPK
LV
NE
K
P
L
L
E
PK
N
100
185.20
a2
%
0
V
bMax
yMax
L
600.42
y5
244.19
y2
699.47
y6
213.20
b2
129.13
147.15
y1
100
150
245.25
200
250
343.18
300
812.52(M+H) +
813.65
601.34
357.25
y3
406.83 427.28 487.46
350
400
450
700.60
583.37
500
550
602.56 685.49
600
650
700
715.66
789.55
750
800
817.20
850
861.15
M/z
900
C) QCEGNQSLPNLDVK
QC
K
V
100
E
D
361.23
b3
y3
232.12
184.11
b2
%
147.14
y1
G
N
L
Q
S
N
P
588.41
y5
367.15
343.19
463.14 491.49
300
400
L
773.41
LP
S
N
Q
L
N
885.61
y8
721.29
799.49
643.28
887.71
V
K
bMax
Q
yMax
1544.98(M+H) +
C
1184.67
b11
y11
798.58
y7
772.89
D
E
G
1013.63
y9
1548.91
1313.86
y12
1175.65
1544.13
1549.71
1459.82
1285.75
0
M/z
100
200
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
Figura 30 - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
6, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
ELPK; B) LVNELPK; C) QCEGNQSLPNLDVK.
A) NVLGK
NV
L
K
G
G
L
K
V
bMax
yMax
530.41(M+H) +
N
100
%
129.12
73.97
147.13
y1
75
100
125
317.26
y3
214.14
b2
309.66
240.16
150
175
200
225
250
531.30
327.25
b3
262.17
226.17
110.70
0
50
186.15
a2
275
377.20
367.22
300
325
350
393.23
437.27
375
400
425
472.33 505.32 513.39
450
475
500
532.18
525
553.75 579.38 586.92
M/z
550
575
B) VGNKNEELEK
VG
K
N
E
K
L
N
E
E
E
E
N
L
K
E
N
K
G
1060.67
y9
100
761.45
y6
%
0
129.13
a2
147.14
226.12 258.20
y1
373.21
387.30
451.34
530.74
551.45
647.42
y5
V
bMax
yMax
1159.64(M+H) +
673.37
775.34
793.58
700
800
889.58
y7
1043.73
971.68
1163.26
1061.50
1117.34
1167.54
1263.80
M/z
100
200
300
400
500
600
900
1000
1100
1200
C) KMVNEPTHLK
K
K
M
L
V
NE
HT
P
E
P
T
H
N
100
260.21
b2
y2
%
147.13
y1
0
100
L
M
K
K
bMax
yMax
938.49
440.24
325.18 427.22
83.87
V
937.64
b8
y8
519.54
838.53
724.47
865.64
y7
599.36 666.46 y6 821.45
939.82
1196.89(M+H) +
1050.75
1097.73
b9
1198.14
M/z
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Figura 31A - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot 7,
analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
NVLGK; B) VGNKNEELEK; C) KMVNEPTHLK.
D) QYDLELTNEGR
QY
D
RG
E
L
E
N
T
L
T
L
NEGR
E
L
D
Y
bMax
yMax
Q
1319.89
100
689.45
y6
576.33
y5
%
158.10
247.12
264.19
a2
358.23 390.15
475.27
y4
1046.65
y9
818.50
y7
660.32
691.61
931.56
y8
819.37
1005.41
1320.68
1337.69(M+H) +
1047.50 1151.92
1209.77
y10
1340.18
1383.50
M/z
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Q
L
1000
1100
1200
1300
1400
E) MVLSLSQEQLDAF
MV
K
L
F
S
A
L
D
S
L
Q
Q
E
E
Q
100
S
1065.66
y9
D
L
A
F
S
K
L
1265.83
y11
%
326.19
147.15
y1
213.10
100
200
395.24
850.54
805.45
978.63
508.32 593.42
y7
y8
y5 613.35 804.91
959.45
1178.69
y10
1068.36
bMax
yMax
VM
1609.10(M+H) +
1378.80
y12
1268.00
1380.08
1613.33
1607.79
1700.36
0
M/z
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Figura 31B - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot 7,
analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: D)
QYDLELTNEGR; E) MVLSLSQEQLDAFKK.
A) QSNK
Q
S
N
K
K
N
bMax
SQ
yMax
476.36(M+H) +
100
477.27
%
55.14
0
100.28
129.12
b1
115.30
175.13
201.15
229.17
259.17
478.74
330.21
b3
371.09 391.23 403.25
301.00 312.21
430.18
459.31
495.34
M/z
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
B) LADTDNEELQK
LA
K
D
T
Q
D
E
L
NE
E
E
D
N
L
Q
D
1091.57
y9
T
100
%
185.17
b2
0
157.17
a2
217.12
100
200
300.21
401.23
b3
369.24 b4
638.43
517.37
y4
629.44
704.36
875.48
y7
760.44
y6
775.46
876.64
976.56
y8
K
A
L
bMax
yMax
1162.69
y10
1275.64(M+H) +
1257.63
1282.30 1368.53
1073.56
984.70
M/z
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Figura 32 - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
8, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
QSNK; B) LADTDNEELQK.
A) FVSLLK
FV
S
K
L
L
L
L
S
K
V
bMax
yMax
F
460.37
y4
100
219.19
a2
461.33
%
120.11
a1
F
260.24
y2
147.13
y1
201.14
560.49
b5
707.62
524.34 561.34 629.63 706.53(M+H) +
708.44
437.27
354.24
282.24 314.26
493.42
401.37
0
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
747.77 805.30
M/z
800
750
B) ESLSLQTQLK
ES
L
K
S
L
L
Q
S
T
QT
Q
S
L
100
704.46
y6
%
0
147.13
130.14 y1
100
312.19
217.10
b2
489.37
y4
512.33
399.23
200
300
400
500
617.46
b6
y5
817.59
y7
619.05
600
800
K
906.11
900
bMax
yMax
SE
1017.74
y9
905.77
886.63
706.65
700
QL
L
S
904.59
y8
1233.66(M+H) +
1018.59
1000
1238.15
1216.71
1100
1265.34
M/z
1300
1200
C) LNEGTEENTELQK
LN
K
E
Q
G
L
T
E
ENTE
T
L
N
E
T
100
228.17
b2
%
147.15
y1 211.12
275.19
y2
688.34
357.21
b3
455.23
517.33
y4
618.44
y5
732.45
y6
G
1019.63
y9
Q
E
1148.63
y10
K
N
L
bMax
yMax
1375.92(M+H) +
1376.71
861.54
y7
962.57
y8
843.48
1130.64
1022.81
862.42
1262.71
y11
1273.69
1244.80
1379.41
1200
1400
1382.20
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1300
Figura 33A - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot 9,
analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
FVSLLK; B) ESLSLSQTQLK; C) LNEGTENTELQK.
D) GVPVQDAVDR
GV
R
P
V
D
Q
A
V
D
A
Q
D
V
D
V
R
P
bMax
G
yMax
1055.59(M+H) +
V
100
460.31
y4
%
175.13
y1
349.32
120.07 169.16
237.16 330.17
596.39
b6
530.33
1056.80
528.41
443.32
599.57
802.47
y7
696.51
899.54
881.56 y8
1038.76
b9
919.43
1060.06
1061.89
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
E) LSYDFELTENGR
LS
R
G
Y
N
D
E
F
E
T
L
L
T
E
EN
F
D
G
Y
R
S
100
576.32
y5
%
136.10
Y
201.14
b2
279.11
346.20
y3 463.41
689.43
y6
475.29
y4
513.25
818.50
y7
965.58
y8
1080.59
y9
1243.76
y10
1330.74
y11
724.60
624.35
819.37
973.45
bMax
L
yMax
1443.74(M+H) +
1081.77
1444.98
1447.66
1426.91
1450.67
1400
1500
1511.69
M/z
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Figura 33B - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot 9,
analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: D)
GVPVQDAVDR E) LSYDFELTENGR.
A) EVSPDNVMK
E
K
V
S
M
V
PDNV
D
N
M
P
703.44
y6
100
V
395.80
704.35
509.85
511.98 595.43
686.37
300
400
500
600
1000.53
792.30
724.51
854.47
1019.68
982.54
1000
1024.73 1092.52
M/z
1100
S
bMax
yMax
795.40
0
200
1018.52(M+H) +
791.57
201.16 229.16
a2
b2 298.16 352.17
147.13
114.99
y1
bMax
yMax
E
790.43
y7
%
100
K
S
700
800
900
B) SYYQYEGK
SY
Y
KG
Q
E
Y
Y
E
Q
100
%
136.10
Y
204.15
y2
G
Y
Y
K
787.48
y6
223.15
a2
1037.54(M+H) +
788.38
251.13
b2
292.17
414.20 445.21
b3
519.36
606.37
624.35
y5
789.62
1039.40
875.44
792.39
721.51
991.46
1044.45 1113.80
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
C) QDELNEVVK
Q
K
D
V
E
LN
V
E
EV
N
V
L
E
K
D
Q
100
bMax
yMax
1073.64(M+H) +
1075.45
537.40
%
129.13
b1
203.13
216.13 244.14
a2
b2
701.56
a6
y6
539.49 588.44
373.22
451.30 487.21
337.82
b3
y5
830.55
y7
745.30
1079.05
947.44
1058.52
831.43 943.53
971.44
1082.22
1144.52
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
D) WGEMYWCR
W
R
G
E
MY
C
W
W
M
Y
100
159.13
a1
W
129.12
R
113.48
335.20
373.22
y2
b3
317.19
227.12
487.22
815.40
y5
585.91 669.29
549.32
453.16
R
W
G
1001.44
y7
684.34
y4
521.26
y3
%
C
E
635.24
745.31
690.40
1189.60
1002.60
817.31
bMax
yMax
1170.50
1192.66
945.40
1044.55
836.31
1205.26
0
M/z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
Figura 34 - Interpretações das seqüência obtidas pelos espectros de
massas pelo modo tandem de íons produzidos pela fragmentação do spot
10, analisado por ESI-Q-TOF MS, cuja interpretação de seqüência é: A)
EVSPDNVMK; B) SYYQYEGK; C) QDELNEVVK; D) WGEMYWCR.
77
4.3.1.3.1 Identificação dos spots 6, 7, 8, 9 e 10: anidrase carbônica
À primeira vista, os fragmentos peptídicos obtidos dos spots 6, 7, 8, 9 e
10 selecionados do complexo salivar apresentaram uma pequena correlação de
massas e/ou seqüências entre si.
A análise por PMF da digestão teórica dos clusters do banco de ESTs,
também não resultou na correlação dos spots individuais com seus respectivos
clusters.
A identificação foi possível somente após a obtenção de seqüências de
aminoácidos. As seqüências dos fragmentos peptídicos foram correlacionadas
isoladamente com os 19 clusters existentes no banco de ESTs, que apresentam
similaridade ao domínio de anidrase carbônica descrito para eucariotos
(PS00162), tratando-se portanto, de isoformas.
Poucas são as anidrases carbônicas relatadas em invertebrados.
Contudo, uma similaridade significativa por BLAST-MS permitiu a correlação
das seqüências VGNKNEELEK (íon 1159.77) e MVLSLSQEQLDAFKK
(1737.11) do spot 7 com anidrase carbônica da bactéria Bacillus halodurans;
porém os fragmentos seqüenciados não foram correspondentes ao domínio de
anidrases.
4.4.4 Outros spots analisados do mapa bidimensional e ainda não
identificados
Outros 15 spots foram selecionados de diversas regiões do gel (Figura
14), os espectros das análises obtidos por PMF estão apresentadas nas
Figuras 35-49, e os seguintes íons moleculares foram detectados:
spot 11: 568.23; 809.48; 906.56; 929.57; 962.57; 985.85; 1190.74; 1335.74;
1409.74; 2134.12; 2150.14;
78
spot 12: 568.20 ; 887.55 ; 952.65 ; 1202.79 ; 1379.86. 1466.78 ; 1567.90 ;
1606.91 ; 1639.90 ; 1724.02 ; 1801.89 ; 2172.13 ;
spot 13: 1014.76; 1038.71; 1098.77; 1150.73; 1230.82; 1649.95; 1720.23;
1750.04; 1784.08;
spot 14: 568.17 ; 706.45 ; 795.36 ; 860.99 ; 972.66 ; 1151.71 ; 1201.73 ;
1280.73 ; 1376.72 ; 1438.75 ; 1720.95 ; 2027.97 ; 2044.37 ;
spot 15: 568.07; 911.49; 948.35; 1008.47; 1287.64; 1571.86; 1666.82; 1673.81;
spot 16 : 911.60; 1223.82; 1281.85; 1411.86; 1698.95; 1859.16; 2116.16;
spot 17: 568.11; 665.98; 841.21; 893.12; 977.54; 1037.61; 1074.69; 1194.72;
spot 18: 568.22 ; 846.66 ; 917.58 ; 1121.71 ; 1155.72 ; 1207.77 ; 1260.68 ;
1372.79 ; 1403.86 ; 1452.88 ; 1557.90 ; 1868.04 ; 3440.49 ; 3865.79 ; 4122.87 ;
spot 19: 722.47; 851.45; 1069.63; 1174.60; 1275.65; 1302.84; 1356.70;
1474.71; 1511.89; 1590.77; 1718.78; 1921.00; 2074.95;
spot 20: 887.57; 965.68; 1202.77; 1379.84; 1418.89; 1466.79; 1581.91;
1606.92; 1639.86; 1738.02; 2158.16;
spot 21: 599.24; 713.24; 768.39; 850.38; 882.43; 996.47; 1165.62; 1196.50;
1213.51; 1245.50; 1285.61; 1534.49; 1572.53;
spot 22: 599.26; 671.86; 713.28; 768.40; 850.43; 882.43; 996.46; 1051.58;
1147.50; 1165.62; 1420.45; 1534.49; 1572.47; 1716.75; 1851.87;
spot 23: 599.26 ; 713.31 ; 768.40 ; 882.37; 945.47; 976.37; 996.50; 1051.63;
1132.48; 1198.66; 1354.59; 1499.62; 1516.66; 1534.51; 1572.47; 1790.87;
1833.81; 1854.03;
spot 24: 599.27 ; 713.31 ; 768.43 ; 850.45 ; 882.48 ; 996.54 ; 1051.63 ;
1245.64 ; 1292.62 ; 1367.75 ; 1406.68 ; 1435.73 ; 1534.52 ; 1588.07 ; 1617.80 ;
1633.77 ; 1810.95 ; 1934.08 ; 1974.02 ; 2265.32 ; 2298.10 ;
spot 25: 599.27; 713.31; 768.44 ; 850.43 ; 882.48 ; 996.52 ; 1033.52 ; 1057.53 ;
1165.71 ; 1278.65 ; 1312.56 ; 1403.71 ; 1437.77 ; 1534.52 ; 1572.50 ; 1630.87 ;
1694.82; 2201.08.
Figura 35 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 11 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 36 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 12 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 37 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 13 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 38- Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 14 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 39 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 15 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 40 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 16 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 41 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 17 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 42 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 18 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 43 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 19 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 44 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 20 do complexo salivar de
H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 45 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 21 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 46 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 22 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 47 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 23 do complexo
salivar de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 48- Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 24 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 49 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do spot 25 do complexo salivar
de H.depressa analisado por MALDI-TOFMS.
94
Ainda que seja difícil identificar proteínas de amostras desconhecidas
sem a obtenção de seqüências, a análise por PMF permitiu apresentar algumas
sugestões de similaridade com proteínas depositadas em bancos de dados:
Spot 11: hirulin, inibidor de trombina, encontrado na sanguessuga
Hirudinaria manillensis; hemoglobinase, encontrada em Fasciola hepática;
precursor de equinatoxin V, proteína com atividade hemolítica encontrada na
anêmona marinha Actinia eqüina.
Spot 13: hemocianina, proteína transportadora de oxigênio, semelhante à
hemeritrinas; ornatina, antiagregante plaquetário encontrado na sanguessuga
Placobdella ornata; globina;
Spot 14: hemiptericin, antibacteriano encontrado em Pyrrhocoris apterus;
piguamerin, inibidor de tripsina e calicreína, encontrado na sanguessuga Hirudo
nipponia;
Spot 15: guamerin, inibidor de elastase encontrado em Hirudo nipponia;
óxido nítrico sintase, encontrado em Rhodnius prolixus; metalotioneína, uma
metaloprotease;
Spot 16: bdellastasin, inibidor de tripsina e plasmina encontrado na
sanguessuga Hirudo medicinalis; hemoglobina;
Spot 17: conopressin, vasopressina encontrada na lesma Lymnasa
stagnalis; theromin, inibidor de trombina de sanguessuga Theromyzon
tessulatum; ixodidin, inibidor de quimiotripsina e elastase, encontrado no
carrapato Boophilus microplus; precursor de proteína adesiva de matriz;
Spot 18: lectina;
Spot 19: coagulógeno, presente na hemolinfa de Carcinoscorpius
rotundicauda; hirustasin, inibidor de trombina, tripsina, quimiotripsina e
catepsina G encontrado em Hirudo medicinalis;
Spot 20: maragatoxin; defensin; profilin; precursor de coagulógeno;
Spots 21 e 22: coagulógeno de Carcinoscorpius rotundicauda;
Spot 23: metalotioneína; calpaína; inibidor de serinoprotease.
95
Assim, estes spots correspondem a proteínas com potencial função
antihemostática.
Em relação aos spots 21 e 22, os quais apresentaram proximidade
bidimensional e perfis espectrométricos semelhantes, através de PMF,
sugerimos que estas proteínas sejam isoformas, uma vez que apresentaram
alguns íons moleculares comuns: (M + H)+ = 713.2; 768.4; 850.4; 882.4; 996.4;
1165.6; 1534.4 e 1572.4. Foram exclusivos ao spot 21 os seguintes íons
moleculares: (M + H)+ = 1196.5; 1213.5; 1285.6; e os exclusivos do spot 22
foram: (M + H)+ = 1051.5; 1147.5; 1420.4; 1716.7 e 1851.8. O programa
MASCOT identificou estas proteínas com valores de massas similares ao
coagulógeno do siri Carcinoscorpius rotundicauda, presente na hemolinfa.
Outros spots analisados parecem não estar diretamente envolvidos com
funções antihemostáticas, e podem apresentar similaridade com as seguintes
proteínas:
Spot 12: esterase; apolipoforina;
Spot 24: actina;
Spot 25: globina; tropomiosina; actina.
4.5 Análises do lefaxin e hementerina purificados
O lefaxin e a hementerina purificados foram aplicados em um gel
bidimensional e observou-se que o lefaxin apresentou cerca de 14 kDa, mas o
pI não pôde ser determinado, pois durante a isoeletrofocalização ocorreu
retração do gel nas extremidades (efeito de eletroendosmose). No caso da
hementerina, um único spot de cerca de 80 kDa e pI próximo à 8.0, foi revelado.
Devido à baixa concentração protéica, os spots foram desconsiderados para
análise de seqüência. Por outro lado, o lefaxin pré-purificado aplicado em gel
SDS-PAGE, foi extraído e a hementerina purificada, em solução, foram
digeridos com tripsina e analisados via PMF (Figuras 50 e 51).
Figura 50 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica do lefaxin purificado submetido a
eletroforeseSDS-PAGE e analisado por MALDI-TOFMS.
Figura 51 - Espectro do Peptide mass fingerprint após digestão tríptica de
hementerina purificada (em solução) analisada por MALDI-TOFMS.
98
Os seguintes íons moleculares foram detectados:
Lefaxin: (M+ H)+ = 599.2; 713.3; 768.4; 850.4; 882.4; 979.4; 1019.4; 1066.5;
1125.5; 1179.6; 1283.7; 1455.6; 1534.5; 1586.8;
Hementerina: (M+ H)+ = 1037.4; 1467.4.
Pela análise por PMF do lefaxin no MASCOT, uma lista de diversas
proteínas apresentaram alguma correlação, porém, não foram significativas.
Os
íons
referentes
ao
lefaxin,
com
maior
intensidade,
serão
seqüenciados em uma próxima etapa. A hementerina em solução foi analisada
por ESI-Q-TOF MS após digestão tríptica, apresentando as seqüências:
TGYGQPLTSN (íon 1037.4) e FGQSNLLS (íon 1467.4), as quais não
mostraram similaridade significativa com proteínas depositadas em banco de
dados.
4.6 Atividade biológica determinada por zimografia
4.6.1 Substrato: gelatina
Uma proteína com cerca de 45 kDa do extrato bruto do complexo salivar
de H. depressa foi detectada por ocasionar uma leve área de lise sobre a
gelatina, incorporada ao gel SDS-PAGE (Figura 52). Esta área protéica foi
recortada do gel e submetida à digestão tríptica. A amostra foi analisada por
MALDI-TOF MS (Figura 53) e os seguintes íons foram obtidos:
(M+ H)+ = 678.3; 898.5; 988.5; 1105.6; 1193.7; 1241.7; 1267.7; 1427.7;
1459.7; 1562.8; 1648.8; 1655.8; 1832.9; 1922.9; 1976.1; 2056.2; 2216.2;
2472.2; 2707.3; 2855.3.
A
B
45 kDa
Figura 52 - Atividade gelatinolítica do extrato bruto de
Haementeria depressa
A) controle: colagenase; B) 120 ug de proteína de extrato
bruto do complexo salivar.
Figura 53 - Espectro do Peptide mass fingerprint de digestão tríptica em gel da proteína do complexo salivar
de H.depressa com atividade sobre gelatina analisado por MALDI-TOFMS.
101
A análise dos fragmentos peptídicos desta banda por PMF, utilizando o
MASCOT, derivou uma lista de diversas proteínas com similaridade, podendose sugerir as seguintes candidatas: precursor de catepsina L (40 kDa), que
degrada proteínas lisossomais; um precursor de fibropelina II (40 kDa), uma
metaloprotease com domínio EGF; metalotioneína 10-IV (sistema digestivo) (8
kDa), que sequestra íons metálicos tóxicos.
A análise de sequenciamento de novo para esta proteína deverá ser
efetuada em uma próxima etapa.
4.6.2 Substrato: fibrina
Um gel bidimensional do complexo salivar foi aplicado sobre placa de
fibrina-agarose. Um único spot de cerca de 80 kDa e pI 8.0-9.0 revelou área de
lise, identificando a hementerina. Estes dados foram confirmados pelos
resultados obtidos na análise bidimensional da proteína pura.
102
5 DISCUSSÃO
5.1 Abordagem proteômica do complexo salivar
À partir do gel bidimensional preparativo do complexo salivar de H.
depressa, contendo 219 spots corados por Coomassie Blue, foram analisados
os 25 spots mais representativos, dos quais 10 foram identificados por
seqüência de aminoácidos.
O gel bidimensional do complexo salivar apresentou 352 spots totais
quando corado por nitrato de prata e 219 spots quando corado por Coomassie
Blue, refletindo a diferença de sensibilidade de detecção. A detecção por
Coomassie requer cerca de 100 ng por spot; e por prata, o limite está entre 1 à
10 ng de proteína por spot. A determinação de massa de um peptídeo ou
proteína por espectrometria de massa requer alguns picomoles, porém uma
análise de sequenciamento de novo requer nanomoles da amostra. Portanto,
teoricamente, todos spots detectados por Coomassie Blue, deveriam gerar
informações de massa suficientes para caracterização das proteínas (Jungblut;
Thiede, 1997). No entanto, muitos spots não foram detectados por
espectrometria de massa.
Após o mapeamento bidimensional dos componentes do complexo
salivar, nosso objetivo era o de identificar o maior número possível de proteínas
por espectrometria de massa. Contudo, apenas as proteínas mais abundantes à
partir de géis corados por Coomassie Blue puderam ser identificadas. Assim, a
análise proteômica de uma amostra complexa, envolvendo as técnicas de
eletroforese bidimensional e espectrometria de massa, apresentou uma
limitação quantitativa para a obtenção de seqüências. Apesar do uso de spots
semelhantes obtidos de 3 géis preparados simultaneamente, muitas vezes não
foi possível obter proteína suficiente para análise de sequências.
Deve-se considerar ainda que a implantação das técnicas de eletroforese
bidimensional e de espectrometria de massa no Instituto Butantan (Lab. de
103
Toxinologia Molecular e Lab. de Espectrometria de Massa - CAT/CEPID,
respectivamente) e, conseqüentemente, o estabelecimento de condições
apropriadas para este tipo de abordagem, foram desenvolvidas durante este
trabalho. Deste modo, este trabalho foi o pioneiro na identificação de proteínas
a partir destas técnicas proteômicas em nosso laboratório.
Alguns trabalhos relataram que a análise proteômica baseada na
eletroforese bidimensional apresenta limitações para identificação de proteínas
de média e pouca abundância (Kim et al., 2003; Gygi et al., 2000).
O
acoplamento de um sistema de HPLC e o uso de uma fonte de ionização com
nanospray podem minimizar as perdas protéicas e assim, ampliar a
identificação dos compostos.
A vantagem da abordagem proteômica para organismos com genoma
definido reside na rapidez de identificação dos compostos, os quais são
usualmente analisados por PMF.
5.2 Perfil espectrométrico do extrato bruto do complexo salivar
Sendo a espectrometria de massa considerada uma técnica sensível,
seria esperado encontrar-se um maior número de peptídeos/proteínas
detectados no extrato bruto do complexo salivar, tendo em vista que o perfil
bidimensional desta amostra já havia sido estabelecido (352 spots totais,
corado por prata e 219 spots totais, corado por Coomassie Blue). No entanto,
os 13 íons detectados neste extrato bruto (Figuras 12 e 13) corresponderiam
supostamente aos compostos mais abundantes. Quando o extrato bruto do
complexo salivar é submetido à eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), cerca
de 20 bandas são reveladas (entre 20 à 100 kDa), representando as proteínas
mais expressas. Muito provavelmente, a supressão de sinal observada por
espectrometria de massa, também poderia estar relacionada à presença de sais
na amostra, uma vez que o processo de ionização é influenciado pela amostra
104
em si e pelo seu preparo; ou também, pela dificuldade de ionização de
proteínas grandes, as quais são significativas no extrato bruto em questão.
Assim, foi estabelecido um perfil preliminar geral do extrato bruto do
complexo salivar de H. depressa; sendo que outras análises espectrométricas
foram feitas a partir de proteínas isoladas deste complexo.
5.3 Spots bidimensionais identificados
A identificação de proteínas de amostras com genoma desconhecido,
como foi o caso desta amostra, somente tornou-se viável com o auxílio de um
banco de ESTs. Assim, o banco de ESTs do complexo salivar de H. depressa
construído, em paralelo, complementou a interpretação de seqüências obtidas
por
espectrometria
de
massa
e
resolveu
uma
das
limitações
do
sequenciamento por ESI-Q-TOF MS, o qual não distingue entre resíduos que
apresentam os mesmos valores de massa (resíduos isobáricos) ou valores
próximos e também para os dipeptídeos da porção N-terminal do fragmento
peptídico.
Deste modo, através do uso destas duas técnicas, proteoma e
transcriptoma, foram identificadas proteínas que devem estar envolvidas na
aquisição de sangue, e portanto, podem interferir nos processos de coagulação,
fibrinólise e agregação plaquetária do sangue ingerido pela sanguessuga.
5.3.1 Antiagregante plaquetário
A localização bidimensional, a análise por PMF e as seqüências obtidas
no espectrômetro ESI-Q-TOF permitiram a identificação dos spots 1 e 2
correlacionando-o com o LAPP.
105
O sequenciamento de novo dos fragmentos trípticos do spot 1
correlacionaram-se aos clusters 318 e 545, onde as seqüências traduzidas de
ESTs complementaram alguns pontos duvidosos obtidos por espectrometria de
massa: a) no íon 1243.64 foi possível definir a posição de resíduos do
dipeptídeo TE; b) no íon 1653.73 foi possível distinguir entre leucina (L) e
isoleucina (I).
As seqüências obtidas por espectrometria de massa do spot 2
correlacionaram-se com os clusters 59 e 344, os quais contribuíram para
distinguir os resíduos: a) glutamina (Q) de lisina (K) nos íons 789.48 e 1375.93;
b) leucina (L) de isoleucina (I) nos íons 851.55 e 1375.93.
As proteínas dos spots 1 e 2 apresentaram um caráter ácido (pI 3.5), e
portanto poucos resíduos básicos, os quais normalmente favorecem a
protonação dos fragmentos trípticos. A eficiência do sequenciamento por
espectrometria de massa pode ser avaliada pela área de cobertura das
seqüências obtidas em relação à sequência completa (proveniente da dedução
do cDNA).
Para o spot 1, de 150 resíduos totais do cluster 318, 45 resíduos foram
identificados por espectrometria de massa, correspondendo a 30% da
seqüência completa. Sendo que 45 resíduos foram obtidos por PMF no MALDITOF-MS e 31 destes resíduos foram seqüenciados por ESI-Q-TOF MS. Para o
cluster 545, de 145 resíduos totais, 45 resíduos também foram identificados por
espectrometria de massa. Neste caso, a análise por PMF abrangeu todos os
resíduos seqüenciados. Para o spot 2, de 139 resíduos totais do cluster 59, 35
resíduos foram identificados por espectrometria de massa, correspondendo à
25% da seqüência traduzida completa, sendo que 29 resíduos foram
identificados por PMF e 25 resíduos foram seqüenciados. Para o cluster 344,
contendo 128 resíduos totais, 35 resíduos foram identificados.
106
Concluiu-se então que a área de cobertura das seqüências obtidas por
espectrometria de massa obteve apenas esta abrangência pelo fato dos
fragmentos peptídicos dos spots 1 e 2 apresentarem poucos resíduos
susceptíveis à protonação. Uma análise espectrométrica complementar poderia
ser realizada utilizando-se outras enzimas proteolíticas ou por análise no modo
negativo, no qual ocorre deprotonação e analisam-se as cargas negativas.
Porém uma vez que a sequência completa foi determinada por seqüências
traduzidas de ESTs, esta análise não se fez necessária neste trabalho.
Assim, os resultados apresentados para H. depressa mostraram que
tanto os spots 1 e 2, como os clusters 59, 318, 344 e 545 são proteínas
isoformas correspondentes ao antiagregante plaquetário LAPP (Figura 19). As
seqüências completas traduzidas de ESTs mostraram 8 clusters identificados
como antiagregante plaquetário, que apresentaram 32% de identidade e 16%
de similaridade entre si, e uma variação de pI entre 3.8 à 4.4 e de MM de 10.0 à
15.7 kDa. No entanto, apenas uma única forma de antiagregante plaquetário foi
descrita em H. officinalis (Connoly et al., 1992). Em especial, os clusters 318 e
545, apresentaram 86 e 82%, respectivamente, de similaridade com o LAPP. O
mais importante é que estes dois clusters compartilham as mesmas seqüências
e posições necessárias na configuração da estrutura secundária, já
determinada para o LAPP através de ensaios cristalográficos (Huizinga et al.,
2001). A porção C-terminal do LAPP assemelhou-se à porção N-terminal do
fator de crescimento de hepatócito, o que o classifica como um domínio PAN, o
qual apresenta 6 folhas pregueadas, 1 alfa-hélice e 2 pontes dissulfeto na
região central da molécula (Huizinga et al., 2001). O domínio PAN pertence à
família de fatores de crescimento que assemelha-se com a seqüência, com a
organização do domínio e com o mecanismo de ação do plasminogênio. A
proteína identificada como similar ao LAPP está sendo clonada pelo nosso
grupo e após sua expressão, a atividade biológica e o mecanismo de ação da
proteína poderão ser avaliados.
107
5.3.2 Miohemeritrina
Somente após a análise por PMF utilizando o banco de ESTs e após a
obtenção de seqüências parciais foi possível identificar os spots 3, 4 e 5 como
miohemeritrinas.
A seqüência da miohemeritrina de H. depressa (cluster 312) apresentou
71% de similaridade com a miohemeritrina de T. tessulatum, a qual já foi
descrita como uma proteína abundante de 14 kDa e com pI estimado de 4.95
(Q0GYZ9) (Coutte et al., 2001). As miohemeritrinas de H. depressa foram
localizadas no gel bidimensional com massa molecular total correspondente à
miohemeritrina de T. tessulatum. Porém, como apresentam pIs distintos,
mostram que as seqüências primárias também são distintas. Deste modo, não
foi possível avaliar a correlação de valores de massa por PMF através do
MASCOT para esta proteína.
A interpretação de alguns resíduos das seqüências obtidas por ESI-QTOF MS foram confirmadas, baseando-se nas seqüências traduzidas de ESTs,
esclarecendo-se que: a) íon 977.56 – houve substituição dos resíduos YV por
FD; b) íon 1010.63 – identificou-se o posicionamento do dipeptídeo DW; c) íon
1243.74 – ocorreu a substituição de VA por GL; d) íon 2321.15 – identificou-se
o posicionamento do dipeptídeo LH; ocorreram as substituição de YL por FE e
de W por SV.
A análise do spot 3 por PMF no banco de EST mostrou que de 134
resíduos totais do cluster 312, 102 resíduos foram identificados por
espectrometria de massa, correspondendo à 76% da seqüência traduzida
completa (Figura 20), considerando-se ainda que este cluster apresentou a
região do peptídeo sinal, o qual não é expresso na proteína madura. Concluiuse então que o spot 3 e o cluster 312 correspondem à mesma proteína.
Ressalta-se que a digestão tríptica destas proteínas com pI de caráter neutro,
apresentou uma protonação favorável e conseqüentemente, o sequenciamento
108
por espectrometria de massa foi eficiente. Destaca-se também a obtenção da
seqüência de um fragmento contendo 20 resíduos de aminoácidos (íon 2321.1).
Uma análise detalhada pôde ser feita considerando-se apenas o spot 3, que foi
o único spot seqüenciado até este momento, no presente trabalho, para esta
família de proteínas.
Uma análise comparativa mostrou que o spot 3 diferenciou-se dos spots
4 e 5, sendo evidenciado pelos pIs distintos e pelo perfil espectrométrico
através de PMF (Figuras 21, 22 e 23). A diferenciação das seqüências
primárias entre estes spots deve basear-se nos íons moleculares exclusivos de
cada spot. A migração dispersa (forma de cauda) visualizada nos spots 4 e 5
sugere alguma similaridade entre eles que os distingue do spot 3.
O spot 3 não apresentou o íon 1534.4, o qual estava presente nas
análises dos spots 4 e 5, o que poderia sugerir uma modificação póstraducional. A adição de fosfato ao íon 1455.5 implicaria em um incremento de
massa de 80 Da, obtendo-se o íon 1535.4. Provavelmente a variação de 1 Da
poderia ser por ajustes de calibração do instrumento. O programa NetPhos,
disponível no site do Swiss Prot, propiciou a predição de fosforilação, podendose sugerir que a adição de fosfato seja em um dos resíduos tirosina (Y) do íon
1455.5. Porém, maiores esclarecimentos de caracterização serão possíveis
apenas após o sequenciamento de novo.
No cluster de miohemeritrinas foram encontrados 12 clusters completos,
com 17.6% de identidade e 13.9% de similaridade, pIs variando entre 5.0 à 7.9
e massa molecular de 10.9 à 13.9 kDa, confirmando que os spots visualizados
nesta faixa ampla de pI (6.7 à 8.5) no gel bidimensional, onde estão incluídos os
spots 3, 4 e 5, tratam-se de isoformas.
Assim, os spots 3, 4 e 5 foram identificados como miohemeritrinas.
Hemeritrinas são multímeros não-heme, envolvidas na transferência e
armazenamento de oxigênio intracelular presente no sistema vascular e no
fluido do celoma em invertebrados, como anelídeos. Miohemeritrinas são
109
análogas de hemeritrinas encontradas no tecido muscular, geralmente na forma
de monômeros. O mesmo perfil bidimensional de spots analisados do complexo
salivar foi observado no gel do extrato muscular de H. depressa; embora os
spots do tecido muscular não tenham sido analisados, pode-se sugerir uma
relação entre estas proteínas presentes em ambos extratos.
Organismos que expressam múltiplas formas de hemeritrinas podem
apresentar adaptações funcionais, pois estas proteínas transportadoras de
oxigênio evoluíram quanto à estrutura e função (TERWILLIGER, 1998).
Além da miohemeritrina, a ovohemeritrina, uma outra proteína da família
das hemeritrinas, não glicosilada, foi descrita na sanguessuga Theromyzon
tessulatum (BAERT et al., 1992).
Foram descritas hemeritrinas em vermes Nereis diversicolor, as quais
apresentaram propriedades antibacterianas, por seqüestrarem íons ferro
(DELOFFRE et al., 2003).
5.3.3 Anidrase carbônica
As seqüências obtidas por espectrometria de massa dos spots 6, 7, 8, 9
e 10 analisados correlacionaram-se com diferentes clusters, dados pela grande
diversidade desta proteína, sendo que todos estes clusters foram classificados
como anidrase carbônica. Deve-se considerar ainda que a identificação das
seqüências traduzidas de ESTs apresentaram similaridade com anidrase
carbônica de diversos organismos (Tabela 1).
Existem diferentes tipos de anidrases carbônicas: citosólicas (I, II e III);
ligadas às membranas (IV e II); mitocondrial (V); secreção salivar (VI).
Anidrases carbônicas do tipo II são amplamente distribuídas nos tecidos
epiteliais do sistema digestivo (Parkkila et al., 1994) e as anidrases do tipo VI
são secretadas na saliva, sendo seu constituinte principal (KIVELÄ et al., 1999).
110
Anidrases carbônicas participam da manutenção do pH homeostático de
diversos tecidos e fluidos biológicos, catalisando a seguinte reação reversível:
CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+
Considerando que a sanguessuga alimenta-se de sangue e necessite de
enzimas que metabolizem o sangue e o mantenham fluido, pode-se sugerir que
a manutenção do pH exerça um papel importante para o desempenho destas
enzimas no mecanismo digestivo.
Destaca-se que pela primeira vez está sendo descrita a presença de
anidrases carbônicas no complexo salivar de sanguessugas através das
técnicas de proteoma e de transcriptoma.
Os spots analisados foram exclusivos do complexo salivar, indicando que
sejam anidrases carbônicas do tipo VI, ou seja, secretados pela saliva; contudo,
o tecido muscular esquelético de mamíferos apresentam estas proteínas (tipo
III) (Cote, Ambrosio e Perreault, 1999). No estômago do hematófago Aedes
aegypti foi descrita uma anidrase carbônica (tipo II), sendo possível a presença
de isoformas (Corena et al., 2002). No entanto, não foram descritas anidrases
carbônicas no sialoma de glândulas salivares de Aedes aegypti (VALENZUELA
et al., 2002).
5.4 Lefaxin
Os íons moleculares 1099 e 1586 foram comuns ao lefaxin purificado
analisado via
PMF e à miohemeritrina de T. tessulatum, analisada pela
digestão teórica da seqüência completa, sugerindo uma correlação entre estas
proteínas. Como previamente descrito, a região N-terminal do lefaxin apresenta
uma similaridade de 68% com a miohemeritrina de Nereis diversicolor (Faria et
al., 1999). A migração bidimensional do lefaxin purificado, apresentando massa
molecular de cerca de 14 kDa, poderia ser outro indicativo de que o lefaxin seja
classificado como uma proteína da família hemeritrina. O lefaxin foi descrito por
Faria et al. (1999) como uma proteína de cerca de 30 kDa (SDS-PAGE), sendo
111
possível que esta proteína seja um dímero, o que poderia mostrar uma relação
com as hemeritrinas, as quais são geralmente multímeros.
Por outro lado, os íons moleculares 1311 e 1455, supostamente
relacionados
ao
domínio
hemeritrina,
estavam
ausentes
no
perfil
espectrométrico do lefaxin. Mas pelo fato de não haver conservação de alguns
resíduos na região do domínio, ainda não se pode desconsiderar que o lefaxin
seja uma hemeritrina.
O lefaxin, inibidor de FXa, também já descrito por apresentar, em sua
porção N-terminal, similaridade de 44% com o prolixin S, um inibidor de FIXa,
de Rhodnius prolixus (Faria et al., 1999). Deste modo, supondo que o lefaxin
pertença à família hemeritrina, seu papel anticoagulante representaria uma
adaptação funcional desta classe de proteínas.
O lefaxin purificado apresentou alguns íons comuns aos spots 4 e 5
(miohemeritrinas): (M+ H)+ = 599, 713, 768, 850, 882 e 1534. Os spots 4 e 5
apresentaram modificações pós-traducionais, conforme discutido no item 5.3.2,
porém o íon 1455, correspondente ao provável fragmento peptídico fosforilado,
não foi detectado no lefaxin purificado.
O perfil espectrométrico do lefaxin purificado parece sugerir a presença
de açúcares (2 moléculas de HexNAc) no íon 1125.52, com o incremento de
406 Da, observando o íon 1534.55 (Figura 50), com um erro de cerca de 2Da.
De fato, o lefaxin foi descrito como uma glicoproteína, sendo caracterizado
através da reação de Schiff (FARIA et al., 1999).
As hemeritrinas descritas até hoje não são glicosiladas e a provável
seqüência do lefaxin possui sítio de glicosilação. As hemeritrinas são
susceptíveis à fosforilação, portanto, pode-se sugerir que a funcionalidade
destas proteínas deva estar relacionada com as modificações pós-traducionais.
Deste modo, as análises sobre o lefaxin foram inconclusivas e maiores
informações estruturais serão possíveis apenas após os sequenciamentos dos
fragmentos diferenciais desta proteína. O lefaxin também não foi identificado
112
pela análise transcriptômica e continua sendo motivo de estudos em nosso
grupo.
5.5 Hementerina
Apenas a análise por PMF com o MASCOT não foi suficiente para a
identificação da hementerina. A dificuldade de obtenção de seqüências da
hementerina por espectrometria de massa deve-se provavelmente ao tamanho
desta proteína. Após digestão tríptica, tentou-se a extração do spot do gel
bidimensional com uma mistura de solventes orgânicos (ácido fórmico,
acetonitrila, isopropanol e água) para aumentar a sensibilidade de detecção no
espectrômetro (Ehring et al., 1997). Também foram feitas tentativas de análise
à partir do extrato bruto e a partir de proteína purificada, tanto em solução como
aplicada em gel bidimensional. Porém, seqüências de apenas dois fragmentos
foram obtidas à partir da proteína em solução, ocorrendo ainda uma
contaminação com fragmentos da autólise de tripsina, vistos no espectro
apresentado na Figura 51.
Observou-se que a hementerina também não foi identificada no banco de
ESTs, portanto, a análise desta proteína requer o uso de outras técnicas,
provavelmente, por bioquímica clássica.
5.6 Proteína com atividade biológica sobre gelatina
Uma proteína com atividade gelatinolítica foi encontrada pela primeira
vez em sanguessugas pelo grupo de Rigbi (1987). Esta proteína de Hirudo
medicinalis foi identificada como colagenase originária de mamíferos,
apresentando cerca de 50 kDa. Embora a gelatina seja um substrato para
colagenases, a atividade proteolítica observada foi lenta, detectando-se uma
banda suave em torno de 45 kDa no complexo salivar de H. depressa. A
caracterização de colagenases deve ser através de métodos bioquímicos. Por
113
exemplo, hialuronidases são determinadas pela formação de ferrocianeto férrico
(Rigbi et al., 1987). Metaloproteases que hidrolisam gelatina já foram descritas
no carrapato Ixodes scapularis (FRANCISCHETTI et al., 2003).
A presença de enzimas proteolíticas na saliva podem estar relacionadas
com o aumento da permeabilidade tecidual, favorecendo a ingestão de sangue
do hospedeiro. Em escorpiões Tityus bahiensis e Tityus serrulatus, foram
encontradas serinoproteases que degradam gelatina, mostrando que estas
enzimas também atuam sobre a permeabilidade vascular, facilitando a difusão
das proteínas do veneno (ALMEIDA et al., 2002).
5.7 Proteínas antihemostáticas de sanguessugas do gênero Haementeria
O estudo da evolução da hematofagia desenvolve-se a partir da
identificação e caracterização de compostos bioativos. Os inibidores de
coagulação sanguínea e os antiagregantes-plaquetários apresentam origens
evolutivas comuns, conforme descrito para os carrapatos do gênero
Ornithodoros (Mans; Louw; Neitz, 2002). E mais, as proteínas da glândula
salivar do mosquito Anopheles stephans podem ser evolutivamente mais
desenvolvidas quando comparadas às enzimas constitutivas, a fim de
adaptarem-se a diferentes hospedeiros (VALENZUELA et al., 2003).
Substâncias
com
propriedades
anticoagulantes
e
antiagregantes-
plaquetárias foram descritas em sanguessugas. Analisando as proteínas
encontradas nas espécies H. depressa, H. ghilianii e H. officinalis, foram
encontradas proteínas com seqüências similares e funções comuns, sugerindo
um ancestral comum.
As proteínas antihemostáticas isoladas e caracterizadas encontradas nas
espécies H. ghilianii e H. officinalis estão apresentadas na Tabela 5 , bem como
seus valores de pI e massa molecular:
114
Tabela 5 - Proteínas antihemostáticas das sanguessugas H. ghilianii e H. officinalis.
Proteína/peptídeo
Função
Acesso
on-line
pI*
Massa
molecular*
(kDa)
Ghilanteína
Inibidor FXa
P16242
8.49
13.3
Hementina**
fibrinolítico
A61007
n. d.
82.0
Tridegin
Inibidor FXIII
5.79
7.6
Haementeria ghilianii
Haementeria officinalis
Antistasina
Inibidor FXa
P15358
8.74
15.2
LAPP
Antiagr. plaq.
Q01747
4.06
15.9
* pI (ponto isoelétrico) e massa molecular correspondem a valores estimados, consultados no
banco de dados SWISS-PROT.
** Hementina: seqüência depositada em banco de patente, pI não determinado (n. d.).
Os anticoagulantes lefaxin (H. depressa), ghilanteína (H. ghilianii) e
antistasina (H. officinalis) são inibidores do FXa. A ghilanteína e a antistasina
são proteínas ricas em cisteína, apresentando arginina34-valina35 como resíduos
reativos para inibição do fator X (Blankenship et al., 1990; Dunwiddie et al.,
1989). Ainda que a ghilanteína seja mais potente do que a antistasina
(Blankenship et al., 1990; Condra et al., 1989), o antisoro capaz de neutralizar a
antistasina reage com a ghilanteína (Condra et al., 1989). Não foi possível
estabelecer
uma
relação
do
lefaxin
com
estas
proteínas,
pois
a
seqüência/estrututa do lefaxin ainda não está completamente definida, mas foi
encontrado um inibidor da família antistasina no banco de ESTs (Faria, 2004).
Por outro lado, inibidores de trombina também não foram encontrados neste
gênero de sanguessugas.
Conforme discutido anteriormente, foram encontradas isoformas do
antiagregante plaquetário no complexo salivar da sanguessuga H. depressa,
havendo similaridade ao LAPP, descrito em H. officinalis. A configuração
115
estrutural dos clusters 318 e 545 são semelhantes a do LAPP (Huizinga et al.,
2001), o que sugere que o mecanismo de ação possam ser equivalentes. O
LAPP inibe a ligação do fator de von Willebrand ao colágeno (Conolly; Jacobs;
Condra, 1992; Depraetere; Kerekes; Deckmyn, 1999), sendo um inibidor da
agregação plaquetária.
Na sanguessuga H. ghilianii, a hementina parece ter um papel como
antiagregante plaquetário por clivar o fibrinogênio, responsável pela ligação
cruzada entre as plaquetas (Sawyer et al., 1991; Swadesh; Huang; Budzynski,
1990). A hementina é um fibrinogenolítico por promover a clivagem
das
cadeias α, β e γ do fibrinogênio, nesta ordem (Budzynski, 1991). A única
fibrinogenase
descrita
até
o
presente
momento
que
hidrolisa,
preferencialmente, as cadeias α e γ do fibrinogênio é a hementerina de H.
depressa (Chudzinski-Tavassi et al., 1998). Este fato é curioso porque a
formação de fibrina “cross-linked” dá-se pela ação do FXIII, exatamente nas
cadeias α e γ dos monômeros de fibrina; se estas cadeias estiverem
degradadas a fibrina pode ser facilmente solubilizada. Ainda foi encontrado em
H. ghilianii um inibidor de FXIIIa, denominado tridegin; o qual também foi
encontrado no banco de ESTs de H. depressa, e não identificado pelo
proteoma. Na espécie H. officinalis ainda não foram descritos fibrinogenolíticos.
Sendo que o LAP (leech antihemostatic protein) é considerado um fator
antihemostático para sanguessugas, e sendo a antistasina o representante do
gênero Haementeria, seria esperado encontrar-se proteínas com regiões ricas
em cisteína na H. depressa (Tabela 1: clusters 7, 296 e 412 – inibidores da
família antistasina).
Deste modo, os constituintes da glândula salivar das sanguessugas
Haementeria asseguram a fluidez do sangue por meio da combinação de
componentes,
como
inibidor
de
FXa,
antiagregante-plaquetário
e
fibrinogenolítico. A ocorrência de proteínas diferentes pode significar adaptação
das próprias proteínas deste gênero de sanguessugas aos diferentes
hospedeiros.
116
5.8 Contribuições da análise proteômica para este trabalho
O estudo proteômico do complexo salivar da sanguessuga Haementeria
depressa, através da eletroforese bidimensional, possibilitou o isolamento dos
spots
e
também
permitiu
estabelecer
a
diferenciação
protéica
entre
constituintes da saliva e do tecido muscular; determinar a abundância das
proteínas nestes tecidos; predizer possíveis presenças de modificações póstraducionais. Ainda, a seleção de spots referentes à saliva possibilitaram a
detecção de potenciais proteínas com função antihemostática através da
análise por PMF. Foram obtidas informações de estrutura primária dos
fragmentos peptídicos provenientes dos spots através da espectrometria de
massa.
Frente
ao
grande
número
de
constituintes
detectados
no
gel
bidimensional, os resultados alcançados foram relativos às proteínas mais
abundantes presentes na amostra e estes foram analisadas tanto pelo
proteoma como pelo transcriptoma. Deve-se considerar ainda que cerca de
11% das proteínas deduzidas do banco de ESTs não encontraram correlação
com proteínas que tenham função conhecida, e portanto, são hipotéticas.
Embora as técnicas que envolvam análises proteômica e transcriptômica
sejam potentes, ambas não foram capazes de identificar todas as proteínas que
compõem o complexo salivar de Haementeria depressa, até o momento;
mostrando que o uso de metodologias bioquímicas convencionais podem
fornecer resultados adicionais para a elucidação dos constituintes da saliva.
117
6 CONCLUSÕES
" Este trabalho foi pioneiro na análise proteômica, envolvendo
eletroforese bidimensional e espectrometria de massa, no Instituto Butantan
(São Paulo).
"
Através
de
uma
abordagem
proteômica,
identificaram-se
os
constituintes do complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa. O
mapeamento bidimensional do complexo salivar e do tecido muscular desta
sanguessuga mostraram um total de 352 e 183 spots totais, respectivamente,
quando corados por nitrato de prata, sendo 249 exclusivos da saliva. As
proteínas de ambos tecidos apresentaram pI entre 3.5 a 9.5 e massa molecular
entre 10 e 105 kDa.
" O gel bidimensional preparativo do complexo salivar, corado por
Coomassie Blue, apresentou 219 spots, mostrando 25 spots como os mais
abundantes e estes puderam ser detectados e analisados por espectrometria
de massa.
" As análises foram feitas à partir de complexos salivares removidos de
sanguessugas alimentadas de 2 a 3 meses anteriormente à dissecação,
supondo que nestas condições as glândulas salivares estariam aptas a secretar
proteínas que facilitem o metabolismo do sangue. As proteínas mais
abundantes nestas condições foram identificadas, o que poderia determinar
seus papéis na alimentação, e portanto, no processo de coagulação do sangue
usado no processo alimentar. Identificou-se um possível antiagregante
plaquetário, que evitaria a formação de trombos plaquetários. Outra proteína
identificada foi a miohemeritrina, que além de seu papel no transporte de
oxigênio, poderia ter um papel anticoagulante, por apresentar similaridade com
o lefaxin e com a prolixin S. Também identificou-se a anidrase carbônica, capaz
118
de neutralizar as condições ácidas promovidas pela ingestão do alimento
(sangue) no sistema digestivo.
" Ainda foram identificadas, através de zimografia, uma protease
gelatinolítica (cerca de 45 kDa), uma provável colagenase; e a hementerina (80
kDa) presente no extrato bruto, responsável pela única área de lise em fibrinaagarose.
" A hementerina e o lefaxin purificados foram analisados por
espectrometria de massa. As seqüências TGYGQPLTSN e FGQSNLLS obtidas
à partir da digestão tríptica da hementerina purificada não encontraram
similaridade significativa com proteínas disponíveis em banco de dados,
podendo-se sugerir que correspondam a fragmentos desta proteína. Já o lefaxin
purificado
apresentou
um
perfil
espectrométrico
de
íons
comuns
à
miohemeritrina de T. tessulatum, ao cluster 312 (similar à miohemeritrina de T.
tessulatum). Porém ambas proteínas não foram completamente identificadas
através do proteoma, e também não foram encontradas no banco de ESTs,
mostrando que o uso de outras técnicas serão necessárias para suas
caracterizações.
" A análise por PMF identificou proteínas, exclusivas da saliva, com
potencial atividade antihemostática.
" A análise por PMF feita no MALDI-TOF MS mostrou-se rápida, porém
as interpretações dos resultados foram mais difíceis, por tratar-se de organismo
que não apresenta genoma completamente elucidado.
" A grande limitação da identificação das proteínas, neste trabalho, foi a
obtenção de seqüências por ESI-Q-TOF MS, a partir de pequena quantidade de
119
proteína, ainda que os géis tenham sido corados por Coomassie e os spots
idênticos acumulados para esta análise.
" As seqüências obtidas por sequenciamento de novo através de ESI-QTOF MS foram identificadas e/ou confirmadas pelas seqüências de proteínas
deduzidas de ESTs do complexo salivar da sanguessuga, uma vez que o
espectrômetro não distingue valores de massa próximos (resíduos isobáricos)
ou iguais. As seqüências genômicas de um organismo são as bases para as
análises protéicas. Deste modo, as proteínas foram identificadas pela
complementariedade de resultados obtidos através de análises proteômicas e
transcriptômicas, e contribuíram para a elucidação parcial da composição deste
extrato salivar. Ambas as técnicas são poderosas mas apresentam suas
limitações, mostrando a necessidade de técnicas adicionais, pelo menos, para a
identificação do lefaxin e de hementerina, presentes neste complexo salivar.
"
As
proteínas
identificadas
por
eletroforese
bidimensional
e
espectrometria de massa correspondem a formas expressas dos transcritos
traduzidos do genoma obtidos por transcriptoma. Uma vantagem do estudo de
proteínas é a possibilidade de avaliar modificações pós-traducionais, o que não
é possível em seqüências de DNA.
" A perspectiva de análise de proteínas pouco abundantes é grande, pois
os espectrômetros disponíveis são sensíveis e novos aprimoramentos no
preparo da amostra serão capazes de detectar estes sinais.
" Os resultados obtidos neste trabalho deverão marcar o primeiro estudo
proteômico e transcriptômico para glândulas salivares de sanguessugas na
literatura, e abrem perspectivas para a continuidade de análises de outros spots
que compõem o complexo salivar de H. depressa, cujas proteínas podem
apresentar papéis importantes em diferentes sistemas homeostáticos.
120
REFERÊNCIAS*
AEBERSOLD, R.; MANN, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, v.
422, p. 198-207, 2003.
AEBERSOLD, R.; LEAVITT, J. Sequence analysis of proteins separated by
polyacrylamide gel electrophoresis: towards an integrated protein database.
Electrophoresis, v. 11, p. 517-527, 1990.
ALMEIDA, F. M.; PIMENTA, A. M. C.; FIGUEIREDO, S. G.; SANTORO, M. M.;
MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; DINIZ, C. R.; LIMA, M. E. Enzymes with
gelatinolytic activity can be found in Tityus bahiensis and Tityus serrulatun
venoms. Toxicon, v. 40, p. 1041-1045, 2002.
APITZ-CASTRO, R.; BÉGUIN, S.; TABLANTE, A.; BARTOLI, F.; HOLT, J. C.;
HEMKER, H. C. Purification and partial characterization of draculin, the
anticoagulant factor present in the saliva of vampire bats (Desmodus rotundus).
Thromb. Haemost., v. 73, n. 1, p. 94-100, 1995.
ASTRUP, T.; PERMIN, P. M. Fibrinolysis in animal organism. Nature, v. 159, p.
778, 1947.
BAERT, J. L.; BRITEL, M.; SAUTIERE, P.; MALECHA, J. Ovohemerythrin, a
major 14 kDa yolk protein distinct from vitellogenin in leech. Eur. J. Biochem.,
v. 209, n. 2, p. 563-569, 1992.
BAGDY, D.; BARABAS, E.; GRAF, L.; PETERSEN, T.E.; MAGNUSSON, S.
Hirudin Methods Enzymol., v. 45, p. 669-678, 1976.
BANKS, J. F.; WHITEHOUSE, C. M. Electrospray ionization Mass spectrometry.
Methods Enzymol., v. 270, p. 486-519, 1996.
BASKOVA, I. P.; ZAVALOVA, L. L.; BASANOVA, A. V.; SASS, A. V. Separation
of monomerizing and lysozyme activities of destabilase from medicinal leech
salivary gland secretion. Biochemistry, v. 66, p. 12, p. 1368-1373, 2001.
______________
*De acordo com:
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023:
informação e documentação: referências: elaboração. Rio de Janeiro, 2002.
NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE. List of journals indexed in Index
Medicus,. 2001.
Available from:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi
www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html
121
BEAVIS R.C.; CHAIT B.T. Matrix-assisted laser desorption ionization massspectrometry of proteins. Methods Enzymol., v. 270, p 519-551 1996.
BLANKENSHIP, D. T.; BRANKAMP, R. G.; MANLEY, G. D.; CARDIN, A. D.
Aminoacid sequence of ghilanten: anticoagulant-antimetastatic principle of the
South American leech Haementeria ghilianii. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v. 166, n. 3, p. 1384-1389, 1990.
BROZE, G. L.; GIRARD, T. J.; NOVOTNY, W. F. Regulation by a multivalent
Kunitz-type inhibitor. Biochem., v. 29, p. 7539-7546, 1990.
BUDZYNSKI, A. Z.; OLEXA, S. A.; SAWYER, R. T. Composition of salivary
gland extracts from the leech Haementeria ghilianii. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,
v. 168, 259-265, 1981.
CARRELL, R. W.; BOSWELL, D. R. Serpins: the superfamily of plasma serine
proteinase inhibitors In: Barret and Salvesen (Eds.) Elsevier Science, p. 403420, 1986.
CHAPMAN, J. R. Mass spectrometry of proteins and peptides. CHAPMAN Ed.
Manchester: Humana Press, 2000. 554 p.
CHOPIN, V.; MATHIAS, I.; STEFANO, G. B. ; SALZET, M. Aminoacid sequence
determination and biological activity of therin, a naturally occuring specific
trypsin inhibitor from the leech Theromyzon tessulatum. Eur. J. Biochem., v.
254, p. 565-570, 1998A.
CHOPIN, V.; STEFANO, G. B.; SALZET, M. Amino-acid-sequence
determination and biological activity of tessulin, a naturally occurring trypsinchymotrypsin inhibitor isolated from the leech Theromyzon tessulatum. Eur. J.
Biochem., v. 258, p.662-668, 1998B.
CHOPIN, V.; SALZET, M.; BAERT, J. L.; VANDERBULCKE, F.; SAUTIERE
P.E.; KERCKAERT, J. P.; MALECHA, J. Therostasin, a novel clotting factor Xa
inhibitor from the rhynchobdellid leech, Theromyzon tessulatum. J Biol. Chem.,
v. 275, p. 32701-32707, 2000.
CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M.; KELEN, E. M. A.; PAULA ROSA, A. P.; LOYAU,
S.; SAMPAIO, C. A. M.; BON, C.; ANGLÉS-CANO, E. Fibrino(geno)lytic
properties of a purified hementerin, metalloproteinase from the leech
Haementeria depressa. Thromb. Haemost., v. 80, p.155-160, 1998.
CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M.; BERMEJO, E.; ROSENSTEIN, R. E.; FARIA, F.;
SARMIENTO, M. I. K.; ALBERTO, F.; SAMPAIO, M. U.; LAZZARI, M. A.
122
nitridergic platelet pathway activation by hementerin, a metalloprotease from
Haementeria depressa leech. Biol. Chem., v. 384, p. 1333-1339, 2003.
COLMAN, R. W.; MARDER, V. J.; SALZMAN, E. W.; HIRSH, J. Overview of
Haemostasis In: Haemostasis and Thrombosis: Basics Principles and Clinical
Practice. 3 ed. Philadelphia, J. B. Lippincott Company., p. 3-17, 1994.
CONDRA, C.; NUTT, E.; PETROSKI, C. J.; SIMPSON, E.; FRIEDMAN, P. A.;
JACOBS, J. W. Isolation and structural characterization of a potent inhibitor of
coagulation factor Xa from the leech Haementeria ghilianii. Thromb. Haemost.,
v. 61, p. 437-441, 1989.
CONNOLLY, T. M.; JACOBS, J. W.; CONDRA, C. An inhibitor of collagenstimulated platelet activation from the salivary glands of the Haementeria
officinalis leech – identification, isolation and characterization. J. Biol. Chem., v.
267, p. 6893-6898, 1992.
CORENA, M. P.; SERON, T. J.; LEHMAN, H. K.; OCHRIETOR, J. D.; KOHN, A.
TU C.; LINSER, P. J. Carbonic anhydrase in the midgut of larval Aedes aegypti:
cloning, localization and inhibition. J. Exp. Biol., v. 205, p.591-602, 2002.
COTE, C. H.; AMBROSIO, F.; PERREAULT, G. Metabolic and contractile
influence of carbonic anhydrase III in skeletal muscle is age dependent. Am. J.
Physiol., v. 276, p. R599, 1999.
COURTNEY, M.; LOISON, G.; LEMOINE, Y.; RIEHL-BELLON, N.; DEGRYSE,
E.; BROWN, S.W.; CAZENAVE, J. P.; DEFREYN, G.; DELEBASSEE, D.;
BERNAT, A. Production and evaluation of recombinant hirudin. Semin.
Thromb. Hemost. 1989.
COUTTE, L.; SLOMIANNY, M. C.; MALECHA, J.; BAERT, J. L. Cloning and
expression analysis of a cDNA that encodes a Leech Hemerythin. Biochim.
Biophys. Acta, v. 1518, p. 282-286; 2001.
DASS, C. Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry. In: D. M
DESIDERIO; N. M. M. NIBBERING (Ed.). Nova York: Wiley-Interscience, 2000.
415 p.
DECKMYN, H.; STASSEN, J. M.; VREYS, I.; VAN HOUTTE, E.; SAWYER, R.
T.; VERMYLEN, J. Calin from Hirudo medicinalis, an inhibitor of platelet
adhesion to collagen, prevents platelet-rich thrombosis in hamsters. Blood, v.
85, p. 712-719, 1995.
123
DELOFFRE, L.; SALZET, B.; VIEAU, D.; ANDRIES, J. C.; SALZET, M.
Antibacterial properties of hemerythrin of the sand warm Nereis diversicolor.
Neuroendocrinol. Lett., v. 24, p. 39-45, 2003.
DEPRAETERE, H.; KEREKES, A.; DECKMYN, H. The collagen-binding leech
products rLAPP and calin prevent both von Willebrand factor and α2β1 (GPIaIIa)-I-domain binding to collagen in a different manner. Thromb. Haemost., v.
82, p. 1160-1163, 1999.
DIBELLA, E. E. ; MAURER, M. C. ; SCHERAGA, H. A. Expression and folding
of recombinant bovine prethrombin-2 and its activation to thrombin. J. Biol.
Chem., v. 270 , p. 163 - 169, 1995.
DOLE, M.; MACH, L. L.; HINES, R. L.; MOBLEY, R. C.; FERGUSON, L. D.;
ALICE, M. B. Molecular beans of macroions. J. Chem. Phys., v. 49, p. 22402247, 1968.
DUNWIDDIE, C.; THORNBERRY, N. A.; BULL, H. G.; SARDANA, M.;
FRIEDMAN, P. A.; JACOBS, J. W.; SIMPSON, E. Antistasin, a leech-derived
inhibitor of factor Xa – kinetic analysis of enzyme inhibition and identification of
the reactive site. J. Biol. Chem., v. 264, p.16694-16699, 1989.
DZIEMBOWSKI, A.; SÉRAPHIN, B. Recents developments in the analysis of
protein complexes. FEBS Letters, v. 566, p. 1-6, 2004.
EHRING, H.; STROMBERG, S.; TJERNBERG, A.; NOREN, B. Matrix-assisted
laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins extracted directly from
sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gels. Rapid Commun. Mass
Spectrom., v. 11, p. 1867-1873, 1997.
ELDOR, A.; OREVI, M.; RIGBI, M. The role of the leech in medical therapeutics.
Blood Rev., v. 10, p.201-209, 1996.
ELECTRICWALA, A.; SAWYER, R. T.; JONES, C. P.; ATKINSON, T. Isolation
of thrombin inhibitor from the leech Hirudinaria manillensis. Blood Coagul.
Fibrinolysis, v. 2, n. 1, p. 83-89, 1991.
ESMON, C. T. The roles of protein C and thrombomodulin in the regulation of
blood coagulation. J. Biol. Chem., v. 264, p. 4743-4746, 1989.
FARIA, F. Análise transcriptômica dos complexos salivares de
sanguessugas Haementeria depressa através de Expressed Sequence Tags
(ESTs) e estudos cinéticos sobre o lefaxin. Tese de Doutorado – Escola
Paulista de Medicina, São Paulo, 2004.
124
FARIA, F.; KELEN, E. M. A.; SAMPAIO, C. A. M.; BON, C.; DUVAL, N.;
CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M. A new factor Xa inhibitor (lefaxin) from the
Haementeria depressa leech. Thromb. Haemost., v. 82, n. 5, p. 1469-1473,
1999.
FINNEY, S.; SEALE, L.; SAWYER, R. T.; WALLIS, R. B. Tridegin, a new
peptidic inhibitor of factor XIIIa, from the blood sucking leech Hamenteria
ghilianii. Biochem. J., v. 324, p. 797-805, 1997.
FORTKAMP,
E.;
RIEGER,
M.;
HEISTERBERG-MOUTESSES,
G.;
SCHWEITZER, S.; SOMMER, R. Cloning and expression in Escherichia coli of
a synthetic DNA for hirudin, the blood coagulation inhibitor in the leech. DNA,
New York, v. 5, n. 6, p. 511-517, 1986.
FRANCISCHETTI, I. M. B.; MATHER, T. N.; RIBEIRO, J. M. C. Cloning of a
salivary gland metalloprotease and characterization of gelatinase and
fibrin(ogen)lytic activities in the saliva of the Lyme disease tick vector Ixodes
scapularis. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 305, p. 869-875; 2003.
FRANCISCHETTI, I. M. B.; VALENZUELA, J. G.; ANDERSEN, J. F.; MATHER,
T. N.; RIBEIRO, J. M. Ixolaris, a novel recombinant tissue factor pathway
inhibitor (TFPI) from the salivary gland of the tick, Ixodes scapularis –
Identification of factor X and factor Xa as scaffolds for the inhibitor of factor
VII/tissue factor complex. Blood, v. 99, p. 3602-3612, 2002.
GARCIA-GIL, M.; BOTTAI, D.; CANNIZZARO, M.; BRUNELLI, M. Effect of
phorbol ester on protein phosphorylation in the central nervous system of the
leech Hirudo medicinalis: a two-dimensional electrophoretical analysis. Comp.
Biochem. Physiol. B, v. 99, n. 4, p. 859-864, 1991.
GARDELL, S. J.; DUONG, L. T.; DIEHL, R. E.; YORK, J. D.; HARE, T. R.;
REGISTER, R. B.; JACOBS, J. W.; DIXON, R. A. F.; FRIEDMAN, P. A.
Isolation, characterization and cDNA cloning of a vampire bat salivary
plasminogen activator. J. Biol. Chem., v. 264, p. 17947-17952, 1989.
GASKELL, S. J. Electrospray: principles and practice. J. Mass Spectrom., v.
32, p. 677-688, 1997.
GYGI, S. P.; CORTHALS, G. L.; ZHANG, Y.; ROCHON, Y.; AEBERSOLD, R.
Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis
technology. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 97, n. 17, p. 9390-9395, 2000.
HADDOW, J. D.; POULIS, B.; HAINES, L. R.; GOODING, R. H.; AKSOY, S.;
PEARSON, T. W. Identification of major soluble salivary gland proteins in
125
teneral Glossina morsitans morsitans. Insect Biochem. Mol. Biol., v. 32, p.
1045-1053, 2002.
HAN, J. H.; LAW, S. W.; KELLER, P. M.; KNISKERN, P. J.; SILBERKLANG, M.;
TUNG, J. S.; GASIC, T. B.; GASIC, G. J.; FRIEDMAN, P. A.; ELLIS, R. W.
Cloning and expression of cDNA encoding antistasin, a leech-derived protein
having anticoagulant and anti-metastatic properties. Gene, v. 75, p. 47-57,
1989.
HAYCRAFT, J. B. Ueber die einwirkung eines secretes dés officinellen blutegels
auf die gerinnbarkeit des blutes. Naunnyn-Schmiedeberg’ s. Arch. Exp. Pathol.
Pharmakol., v.18, p. 209-217, 1884.
HEUSSEN, C.; DOWDLE, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen
activator in polyacrylamide gels containing dodecyl sulphate and copolymerized
substrates Anal. Biochem., v. 102, p. 196-202, 1980.
HUIZINGA, E. G.; SCHOUTEN, A.; CONNOLLY, T. M.; KROON, J.; SIXMA, J.
J.; GROS, P. The structure of leech antiplatelet protein, an inhibitor of
haemostasis. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., v. 57, p. 1071-1078,
2001.
HONG, S. J. ; KANG, K. W. Purification of granulin-like polypeptide from the
blood-sucking leech, Hirudo nipponia. Protein Expr. Purif., v. 16, p. 340-346,
1999.
IRIBARNE, J. V.; THOMSON, B. A. On the evaporation of small ions from
charged droplets. J. Chem. Phys., v. 64, p. 2287-2294, 1976.
JONSSON, A. P. Mass spectrometry for protein and peptide characterization –
review. Cell. Mol. Life Sci., v. 58, p. 868-884; 2001.
JUNGBLUT, P.; THIEDE, B. Protein identification from 2DE gels by MALDI-TOF
mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev., v. 16, p. 145-162, 1997.
KARAS, M.; BACHMANN, D.; BAHR, U.; HILLENKAMP, F. Matrix-assisted
ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds. Int. J. Mass Spectrom.
Ion Process, v. 78, p. 53-68,1987.
KELEN, E. M. A.; ROSENFELD, G. Fibrinogenolytic substance (Hementerin) of
brazilian blood-sucking leeches (Hamenteria lutzi Pinto 1920). Haemostasis , v.
4, p. 51-64, 1975.
126
KIM, D. R.; KANG, K. W. Aminoacid sequence of piguamerin, an antistasin-type
protease inhibitor from the blood sucking leech Hirudo nipponia. Eur. J.
Biochem., v. 254, p. 692-697, 1998.
KIM, S. I.; KIM, J. Y.; KIM, E. A.; KWON, K. H.; KIM, K. W.; CHO, K.; LEE, J. H.;
NAM, M. H.; YANG, D. C.; YOO, J. S.; PARK, Y. M. Proteome analysis of hairy
root from Panax ginseng CA Meyer using peptide fingerprinting, internal
sequencing and expressed sequence tag data. Proteomics, v. 3, p. 2379-2393,
2003.
KIVELÄ, J.; PARKKILA, S.; PARKILLA, A. K.; LEINONEN, J.; RAJANIEMI, H.
Salivary carbonic anhydrase isoenzyme VI. J. Physiol., v. 520, n. 2; p. 315-320,
1999.
KREZEL, A. M.; WAGNER, G.; SEYMOUR-ULMER, J.; LAZARUS, R. A.
Structure of the RGD protein decorsin: conserved motif and distinct function in
leech proteins that affect blood clotting. Science, v. 264, p. 1944-1947, 1994.
LARSEN, M. R.; ROEPSTORFF, P. Mass spectrometric identification of proteins
and characterization of their post-translational modifications in proteome
analysis. J. Anal. Chem., v. 366, p. 677-690, 2000.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
LEFEBVRE, C.; COCQUERELLE, C.; VANDENBULCKE, F.; HOT, D.; HUOT,
L.; LEMOINE, Y.; SALZET, M. Transcriptomic analysis in the leech Theromyzon
tessulatum: involvement of cystatin B in innate immunity. Biochem. J., v. 380, p.
617-625, 2004.
LIN, D.; TABB, D. L.; III, J. R. Y. Large scale protein identification using mass
spectrometry. Biochem. Biophys. Acta, v. 1646, p. 1-10, 2003.
MADDEN, R. D.; SAUER, J. R.; DILLWITH, J. W. A proteomics approach to
characterizing tick salivary secretions. Exp. Applied Acarol., v. 28, p. 77-87,
2002.
MANN, M.; HENDRICKSON, R. C.; PANDEY, A. Analysis of proteins and
proteomes by mass spectrometry. Annu. Rev. Biochem., v. 70, p. 437-473,
2001.
MANN, M.; WILM, M. Electrospray mass spectrometry
characterization. Trends Biochem. Sci., v. 20, p. 219-224, 1995.
for
protein
127
MANS, B. J.; LOUW, A. I. ; NEITZ, A. W. H. Evolution of hematophagy in ticks:
origins for blood coagulation and platelet aggregation inhibitors from soft ticks of
the genus Ornithodoros. Mol. Biol. Evol., v. 19, p. 1695-1705, 2002.
MARKWARDT, F., KAISER, B.; NOWAK, G. Studies on antithrombotic effects of
recombinant hirudin. Thromb. Res., v. 54, n 5, p. 377-388, 1989.
MAZUR, P.; HENZEL, W. J.; SEYMOUR, J. L.; LAZARUS, R. A. Ornatins:
potent glycoprotein IIb-IIIa antagonists and platelet aggregation inhibitors from
the leech Placobdella ornate. Eur. J. Biochem., v. 202, p. 1073-1082, 1991.
MOSER, M.; AUERSWALD, E.; MENTELE, R.; ECKERSKORN, C.; FRITZ, H.;
FINK, E. Bdellastasin, a serineprotease inhibitor of the antistasin family from the
medicinal leech (Hirudo medicinalis) – Primary structure, expression in yeast,
and characterization of native and recombinant inhibitor. Eur. J. Biochem., v.
253, p. 212-220, 1998.
NYMAN, T. A. The role of mass spectrometry in proteome studies. Biomol.
Eng., v. 18, p. 221-227, 2001.
NUTT, E.; GASIC, T.; RODKEY, J.; GASIC, G. J.; JACOBS, J. W.; FRIEDMAN,
P. A.; SIMPSON, E. The amino acid sequence of antistasin. A potent inhibitor of
factor Xa reveals a repeated internal structure. J. Biol. Chem., v.263, p. 1016210167, 1988.
PANDEY, A.; MANN, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature, v.
405, p. 837-846, 2000.
PARKKILA, S.; PARKKILA, A. K.; JUVONEN, T.; RAJANIEMI, H. Distribution of
the carbonic anhydrases I, II and VI in the human alimentary tract. Gut, v. 35 n.
5, p. 646-650, 1994.
PATTON, W. F. Detection technologies in proteome analysis – review. J.
Chromatogr. B, v. 771, p. 3-31, 2002.
PENG, J.; GYGI, S. P. Proteomics: the move to the mixtures. J. Mass
Spectrom., v. 36, p.1083-1091, 2001.
PHIZICKY, E.; BASTIAENS, P. I. H.; ZHU, H.; SNYDER, M.; FIELDS, S.
Proteins analysis on a proteomic scale. Nature, v. 422, p. 208-215, 2003.
RABILLOUD, T. Proteome research: two-dimensional gel electrophoresis
and identification methods. Berlin: Springer Verlag, 2000. 248. p.
128
RADZIO, R.; KUCK, U. Efficient synthesis of the blood-coagulation inhibitor
hirudin in the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Appl. Microbiol.
Biotechnol., v. 48, n. 1, p. 58-65, 1997.
RIBEIRO., J. M. C.; ANDERSEN, J.; SILVA-NETO, M. A.; PHAM, V. M.;
GARFIELD, M. K.; VALENZUELA, J. G. Exploring the sialome of the bloodsucking bug Rhodnius prolixus Insect Biochem. Mol. Biol., v. 34 n.1, p. 61-79,
2004.
RIBEIRO, J. M. C.; FRANCISCHETTI, I. M. B. Role arthropod saliva in blood
feeding: Sialome and post-sialome perspectives Annu. Rev. Entomol. v. 48, p.
73-88, 2003.
RIBEIRO, J. M. C. A catalogue of Anopheles gambiae transcripts significantly
more or less expressed following a blood meal. Insect Biochem. Mol. Biol., v.
33, p. 865-882, 2003.
RIBEIRO, J. M. C.; SCHNEIDER, M. GUIMARÃES, J. A. Purification and
characterization of prolixin S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the
blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem. J., v. 308, p. 243-249, 1995.
RIGBI, M.; OREVI, M. M. S.; ELDOR, A. Platelet aggregation and coagulation
inhibitors in leech saliva and their roles in leech therapy. Semin. Thromb.
Hemost., v. 22, p. 273-278, 1996.
RIGBI, M.; LEVY, H.; IRAQI, F.; TEITELBAUM, M.; OREVI, M.;
ALAJOUTSIJARVI, A.; HOROVITZ, A.; GALUN, R. The saliva of the medicinal
leech Hirudo medicinalis – biochemical characterization of the high molecular
weight fraction. Comp. Biochem. Physiol., v. 87, p. 567-573; 1987. PT B.
ROSENBERG, R. D. The heparin-antithrombin system: a natural anticoagulant
mechanism. In: COLMAN, HIRSH, MARDER, SALZMAN (Eds.) Haemostasis
and Thrombosis. Basic principles and clinical practice. Philadelphia: J. B.
Lippincott Company, pp. 1373-1392, 1987.
SALZET, M. Leech thrombin inhibitors. Curr. Pharm. Des., v. 8, n. 7, p. 493503, 2002.
SALZET, M. Anticoagulants and inhibitors of platelet aggregation derived from
leeches FEBS Lett., v. 492, n. 3, p. 187-192, 2001.
129
SALZET, M.; CHOPIN, V.; BAERT, J. L.; MATHIAS, I.; MALECHA, J. Theromin,
a novel leech thrombin inhibitor. J. Biol. Chem., v. 275,n. 40, p. 30774-30780,
2000.
SAWDESH, J. K.; HUANG, L. Y.; BUDYNSKI, A. Z. Purification and
characterization of hementin, a fibrinogenolytic protease from the leech
Haementeria ghilianii. J. Chromatrogr., v. 502, p. 359-369, 1990.
SAWYER, R. T.; CASELLAS, M.; MUNRO, R.; JONES, P. Secretion of
hementin and other antihaemostatic factors in the salivary gland complex of the
giant amazon leech Haementeria ghilianii. Comp. Haematol. Int., v. 1, p. 35-41,
1991.
SAWYER, R.T. Leech Biology and Behaviour. Oxford: Clarendos Press,
1986.
SCOBLE, H. A.; VATH, J. E.; YU, W.; MARTIN, S. A. Mass spectrometric
strategies for structural characterization of proteins. In: MATSUDAIRA, P. (Ed.).
A Pratical guide to protein and peptide purification for microsequencing. 2
ed. Londres: Academic Press, p.125-184,1993.
SEYMOUR, J. L.; HENZEL, W. J.; NEVINS, B.; STULTS, J. T.; LAZARUS, R. A.
Decorsin: a Potent glycoprotein IIb-IIIa Antagonist and Platelet Aggregation
Inhibitor from the Leech Macrobdella decora. J. Biol. Chem., v. 265, p. 1014310147; 1990.
SHALHOUB, P.; KERN, S.; GIRARD, S.; BERETTA, L. Dis. Markers, v. 17, p.
217-223, 2001.
SHEVCHENKO, A.; SUNYAEV, S.; LOBODA, A.; SHEVCHENKO, A.; BORK,
P.; ERNS, W.; STANDING, K. G. Charting the proteomes of organisms with
unsequenced genomes by MALDI-quadrupole time-of-flight mass spectrometry
and BLAST homology searching. Anal. Biochem., v. 73, p. 1917-1926, 2001.
SHEVCHENKO, A.; WILM, M.; VORM, O.; MANN, M. Mass Spectrometry
sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., v.
68, p. 850-858, 1996.
SOLLNER, C.; MENTELE, R.; ECKERSKORN, C.; FRITZ, H.; SOMMERHOFF,
C.P. Isolation and characterization of hirustasin, an antistasin-type serineproteinase inhibitor from the medicinal leech Hirudo medicinalis Eur. J.
Biochem., v. 219, p. 937-943, 1994.
130
SOTTROUP-JENSEN, L. Alpha-macroglobulins: structure, shape, and
mechanism of proteinase complex formation. J. Biol. Chem., v. 264, p. 1153911542, 1989.
STRUBE, K. H.; KROGER, B.; BIALOJAN, S.; OTTE, M.; DODT J. Isolation,
sequence analysis and cloning of haemadin- an anticoagulant peptide from the
indian leech. J. Biol. Chem., v. 266, p. 8590-8595, 1993.
STULTS, J. T. Peptide sequencing by mass spectrometry. Biomed. Appl. Mass
Spectrom., v 34, p. 146-201
SUN, J.; YAMAGUCHI, M.; YUDA, M.; MIURA, K.; TAKEYA, H.; HIRAI, M.;
MATSUOKA H.; DO, K.; WATANABE, T.; SUZUKI, K.; CHINZEI, Y. Purification,
characterization and cDNA cloning of a novel anticoagulant of the intrinsic
pathway, (prolixin S) from salivary glands of the blood sucking bug, Rhodnius
prolixus Thromb. Haemost., v.75, p. 573-577, 1996.
TAKAGI, T.; COX, J. A. Primary structure of myohemerythrin from the annelid
Nereis diversicolor. FEBS, v. 285, n. 1, p. 25-27, 1991.
TALBOT, M. D.; AMBLER, J.; BUTLER, K. D.; FINDLAY, V. S.; MITCHELL, K.
A.; PETERS, R. F.; TWEED, M. F.; WALLIS, R. B. Recombinant
desulphatohirudin (CGP 39393) anticoagulant and antithrombotic properties in
vivo.Thromb. Haemost. , v. 61, n. 1, p. 77-80, 1989.
TASIEMSKI, A.; VANDENBULCKE, F.; MITTA, G.; LEMOINE, J.; LEFEBVRE,
C.; SAUTIERE, P. E.; SALZET, M. Molecular characterization of two novel
antibacterial peptide inducible upon bacterial challlenge in an annelid: the leech
Theromyzon tessulatum. J. Biol. Chem., 2004. In press.
TERWILLIGER, N. B. Functional adaptations of oxygen-transport proteins. J.
Exp. Biol., v. 201, p. 1085-1098, 1998.
THEUNISSEN, H.J.; DIJKEMA, R.; SWINKELS, J. C.; DE POORTER, T. L.;
VINK, P. M.; VAN DINTHER, T.G. Mutational analysis of antistasin, an inhibitor
of blood coagulation factor Xa derived from the Mexican leech Haementeria
officinalis.Thromb. Res. v. 75, n.1, p. 41-50, 1994.
URATA, J.; SHOJO, H.; KANEKO, Y. Inhibition mechanisms of hematophagous
invertebrate compounds acting on the host blood coagulation and platelet
aggregation pathways. Biochimie, v. 85, n. 5, p. 493-500, 2003.
131
VALENZUELA, J. G.; FRANCISCHETTI, I. M. B.; PHAM, V. M.; GARFIELD, M.
K.; RIBEIRO, J. M. C. Exploring the salivary gland transcriptome and proteome
of the Anopheles stephensi mosquito. Insect Biochem. Mol. Biol., v. 33; p.
717-732, 2003.
VALENZUELA, J. G.; FRANCISCHETTI, I., M. B.; PHAM, V., M.; GARFIELD, M.
K.; MATHER, T. N.; RIBEIRO, J.M. Exploring the sialome of the tick Ixodes
scapularis. J. Exp. Biol., v. 205, p. 2843-2864, 2002.
VALENZUELA, J. G.; PHAM, V. M.; GARFIELD, M. K.; FRANCISCHETTI, I. M.
B.; RIBEIRO, J. M. C. Towards a description of the sialome of the adult female
mosquito Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol., v. 32, p. 1101-1122,
2002.
VAN ZANTEN, G. H.; CONNOLLY, T. M.; SCHIPHORST, M. E.; GRAAF, S.;
SLOOTWEG, P. J.; SIXMA, J. J. Recombinant leech antiplatelet protein blocks
platelet deposition on collagen surfaces under flow conditions. Arterioscl.
Thromb. Vasc. Biol., v. 15, p. 1424-1431, 1995.
VERSTRAETE, M.; ZOLDHELYI, P. Novel antithrombotic drugs in development.
Drugs, v. 49, n. 6, p. 856-84, 1995.
WASINGER, V. C.; CORTHALS, G. L. Proteomics tools for biomedicine. J.
Chromatogr., v. 771, p. 33-48, 2002. Part B.
WATSON, J. T. Introduction to mass spectrometry. 3 ed. New York:
Lippincott-Raven, 1997. 496 p.
WAXMAN, L.; SMITH, D. E.; ARCURI, K. E.; VLASUK, G. P. Tick anticoagulant
peptide (TAP) is a novel inhibitor of blood coagulation factor Xa. Science, v.
248, p. 593-596, 1990.
WHITAKER, I. S. ; IZADI, D.; OLIVER, D. W.; MONTEATH, G.; BUTLER, P. E.
Hirudo medicinalis and the plastic surgeon. Br. J. Plastic Surgery, v. 57., n. 4,
p. 348-353, 2004.
WILKINS, M. R.; WILLIAMS, K. L.; APPEL, R. D.; HOCHSTRASSE, D. F. (Ed.).
Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics – Principles and
Practice. Berlin: Springer Verlag, 1997. 243 p.
132
GLOSSÁRIO 1 (espectrometria de massa)
Analisador de m/z: é a porção do espectrômetro onde os íons, formados na
fonte, são diferenciados com base em sua proporção massa-carga. Após o
analisador, os íons passam para o detector.
Analisador quadrupolo: filtro de m/z onde a combinação de voltagens de
corrente direta e radiofreqüência são aplicadas sobre quatro cilindros metálicos,
de tal maneira que permita a transmissão apenas de íons com massa/carga
selecionadas.
Analisador TOF:
analisador de m/z que fornece a medida de m/z pela
determinação do tempo de vôo de íons apresentando a mesma energia cinética
por uma distância fixa. Os íons são formados no mesmo local e ao mesmo
tempo, e recebem a mesma energia através da voltagem de aceleração quando
eles passam para o tubo de separação. Os íons com valores menores de m/z
apresentam maior velocidade e os íons com valores maiores de m/z
apresentam menor velocidade. A determinação do tempo de chegada dos íons
até atingirem o detector é o meio de diferenciar suas massas.
Dissociação induzida por colisão: em uma colisão entre íons e espécies
neutras, a energia translacional do íon é convertida em energia interna. Esta
energia interna causa a dissociação do íon em íons de fragmentos menores e
também pode provocar mudanças na carga dos íons. Dissociações induzidas
por colisões são comuns em experimentos MS/MS.
Energia de ionização: energia mínima necessária para remover um elétron de
um átomo ou molécula para produzir um íon positivo.
1
Busch K. L. www.spectroscopyonline.com
133
Espectrômetro tempo de vôo com reflectron: reflectron é um instrumento
incorporado ao tubo de vôo que opera como um espelho eletrostático. Íons com
energias cinéticas distintas provenientes da fonte de ionização, atravessam a
primeira porção do tubo de vôo e então atingem o reflectron. O resultado é que
todos os íons refletidos são focados no detector, fornecendo maior resolução de
m/z.
Ionização por dessorção: termo geral usado para diversos métodos [por
exemplo: MALDI, FAB (Fast atom bombardment), dessorção por plasma] onde
os íons são gerados diretamente da amostra através de uma rápida absorção
de energia gerando íons em estado gasoso.
Ionização por electrospray: uma solução contendo as moléculas a serem
analisadas é injetada através de um tubo capilar metálico sob um alto potencial.
A solução é dispersa e mantida em uma câmara sob pressão atmosférica. Uma
diferença de potencial forma gotículas carregadas, que progressivamente
diminuem de tamanho com a evaporação do solvente. A carga é mantida na
superfície das gotículas.
Íon molecular: é formado pela remoção (íons positivos) ou adição (íons
negativos) de um ou mais elétrons de uma molécula M para formar M+ ou M-. A
massa do íon molecular corresponde à massa monoisotópica da molécula, com
a massa do elétron adicionada ou subtraída.
Ion monoisotópico: massa de um íon dada pela fórmula empírica usando a
massa exata do isótopo mais abundante de cada elemento.
Ion precursor: íon que dissocia-se em fragmentos pequenos, usualmente
através de dissociação induzida por colisão em um experimento MS/MS.
134
Limite de detecção: quantidade de amostra necessária para um sinal ser
distinguido do ruído.
MALDI (Ionização por dessorção de laser assistida por matriz): No MALDI,
as moléculas da amostra são misturadas com matriz sólida em excesso, a qual
é capaz de absorver energia do laser. A mistura é co-cristalizada em um filme
fino sobre um suporte metálico. A irradiação repetitiva neste filme com pulsos
de laser, libera os íons da superfície, os quais são acelerados
para o
analisador TOF.
Massa/carga (m/z): relação da massa de um íon sobre o número de cargas
carregadas por este íon; onde m é a massa iônica relativa e z é o múltiplo do
total de cargas do íon.
Massa exata: a massa exata de um íon de composição isotópica específica é
calculada pela somatória das massas exatas dos átomos constituintes.
Molécula protonada: uma molécula protonada é um íon formado pela adição
de um próton à molécula neutra M, sendo (M + H)+. A transferência de um
próton de uma molécula para outra em fase gasosa é uma reação ácido/básica
onde as afinidades relativas por prótons da espécie reativa determina a
energética da reação.
Precisão: para medida experimental de uma massa exata, o percentual da
precisão é determinado por (massa real – massa observada)/massa real x
100%, opcionalmente pode ser expresso em partes por milhão (ppm).
Resolução: é definida em diferentes maneiras relativas dadas comumente pela
fórmula m/Δm, onde m é a massa do íon onde a resolução é especificada. Para
dois picos simétricos e adjacentes com alturas iguais no espectro, os
135
parâmetros instrumentais (físicos ou elétricos) são ajustados para que os picos
de massas m e (m-Δm) sejam separados por um vale, em 50% da altura dos
picos. Assim, a resolução é baseada em Δm. A resolução é normalmente
expressa em comprimento completo do pico em sua altura média (fwhm).
Sensibilidade: é a resposta do sistema medida pela quantia de amostra
disponível no sistema. As unidades são dadas em termos de Coulombs por
micrograma. Também pode ser especificada pela troca de pressão parcial d
amostra na fonte de ionização.
Tandem MS: o instrumento MS/MS consiste de 2 analisadores operados
independentemente unidos por uma região de reação onde o íon é induzido à
reação. A indução ocorre geralmente por colisão, onde um íon de maior m/z
dissocia-se em íons produtos menores.
Voltagem de aceleração: voltagem aplicada à fonte para mover os íons
formados nesta fonte em direção ao analisador. Em espectrômetros com
quadrupolo, a voltagem de aceleração pode ser de algumas dezenas de volts,
enquanto em espectrômetros com TOF, chegam a ser aplicados centenas de
volts.
136
ANEXO
Ferramentas bioinformáticas
137
FERRAMENTAS BIONFORMÁTICAS
Diversas ferramentas de análises e predições foram consultadas para
auxiliar a interpretação dos resultados. Estando sumarizadas adiante:
" Identificação e caracterização de proteínas:
site: www.expasy.ch
Swiss Prot é um banco de dados de proteínas integrado a outros bancos de
dados biomoleculares. Contém informações para identificações estruturais e
funcionais através de diversos utilitários.
Como exemplo, o utilitário TagIdent identifica proteínas pelo ponto isoelétrico e
massa molecular.
Prosite é um banco de dados sobre famílias de proteínas e domínios, sendo a
identificação feita através de seqüências padrões.
" Análise por PMF
www.matrixscience.com
O programa MASCOT identifica proteínas à partir de valores de massa de
proteínas digeridas por enzimas específicas.
" Análises espectrométricas
www.prospector.ucsf.edu
ProteinProspector apresenta dados de seqüências aliados a experimentos de
espectrometria de massa. Como utilitários: MS-Product, que é capaz de prever
os íons formados sob a fragmentação induzida a partir de determinada
seqüência; MS-Digest, que simula a digestão tríptica de uma seqüência
protéica.
138
" Tradução de seqüências
As seqüências de oligonucleotídeos geradas da biblioteca de cDNA foram
traduzidas para seqüências de proteínas com o auxílio do programa Bioedit®.
" Análises de similaridades de sequências
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
www.dove.embl-heidelberg.de/Blast2/msblast.html
As seqüências obtidas também foram comparadas com dados destes bancos.
" Alinhamento de seqüências
As seqüências obtidas foram alinhadas com o auxílio do programa Clustal W.
" Predições de modificações pós-traducionais
www.expasy.ch
O utilitário GlycoMod permite a predição de glicosilações; o utilitário NetPhos,
por outro lado, permite a predição de fosforilações.
" Informações atualizadas / jornais / links sobre espectrometria de massa
www.i-mass.com