UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
Marcos Paulo Pinheiro Ferreira
EFEITO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE A
VIABILIDADE DE CÉLULAS MUSCULARES
São Paulo, SP
2008
1
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
Marcos Paulo Pinheiro Ferreira
EFEITO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE A
VIABILIDADE DE CÉLULAS MUSCULARES
Dissertação de Mestrado
apresentada à Universidade Nove
de Julho, para obtenção do título
de Mestre em Ciências da
Reabilitação.
Orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes
Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
São Paulo, SP
2008
2
Ferreira, Marcos Paulo Pinheiro
Efeito da laserterapia de baixa potência sobre a viabilidade de células
musculares. / Marcos Paulo Pinheiro Ferreira. São Paulo : 2008.
25 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Nove de Julho, 2008.
Orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes
Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
1. Laserterapia. 2. Mioblastos. 3.C2C12. 4.Células musculares.
I. Fernandes, Kristianne Porta Santos. II. Ferrari, Raquel Agnelli
Mesquita
CDU 611.018
3
Gostaria de agradecer...
A minha orientadora Kristianne Porta Santos Fernandes que nos últimos
anos foi mais que uma orientadora ou colega e sim uma amiga que
esteve ao meu lado para me ajudar em todos os meus problemas,
sempre me lembrarei com muito carinho da Kris, e mais do que tudo
muito obrigado pela paciência.
A Raquel Agnelli Mesquita Ferrari, por estar sempre pronta para me
ajudar em qualquer momento e no que fosse necessário.
Aos meus colegas e amigos Erick, Hanne, Nadhia e Camila por terem
passado tanto tempo no lab comigo, sem essa ajuda nunca poderia estar
finalizando este trabalho.
A todos técnicos do laboratório que sempre me ajudaram muito em todos
os meus problemas dentro do lab..
A minha amiga Vanessa Pavesi por estar ao meu lado me dando forças nos
momentos em que mais precisava.
A Profa. Manoela Domingues que tem toda a minha admiração, agradeço pelas
risadas, sem sua ajuda e suas palavras de incentivo com certeza não teria
chegado até aqui.
A empresa MM Optics pelo empréstimo do aparelho Twin-laser
Ao Prof. Dr. José Ernesto Belizário do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo pela doação da linhagem celular C2C12.
Muito obrigado!
4
EFEITO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE A
VIABILIDADE DE CÉLULAS MUSCULARES
Os efeitos benéficos da fototerapia usando lasers de baixa energia
dependem dos parâmetros de irradiação e do tipo de laser usado. Entretanto,
não poucos dados na literatura sobre a proliferação de mioblastos C2C12 após
a fototerapia com lasers GaAIAs e InGaAIP. O objetivo deste estudo in vitro foi
avaliar o efeito de fototerapia na viabilidade de mioblastos C2C12 cultivados
sob diferentes condições nutricionais (modelo de lesão muscular) usando os
lasers GaAIAs e InGaAIP de baixa energia com diferentes comprimentos de
onda e intensidades. As células C2C12 cultivadas em meios de cultura
convencional (10% soro fetal bovino, SFB) e em deficiência de nutrientes (5%
SFB) foram irradiados com lasers GaAlAs (660 nm) e InGaAlP (780 nm) de
baixa energia com densidade de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2, e 3.8, 10 e
17.5 J/cm2, respectivamente. A proliferação celular foi avaliada indiretamente
24h depois da irradiação por meio da mensuração da atividade mitocondrial e
pelo método do cristal violeta. Não houve diferença significativa na viabilidade
celular entre os mioblastos tratados com laser e as controle para todos os
parâmetros testados, após de 24hs incubação. Entretanto, as culturas que
cresceram em meio convencional suplementado com 10% de SFB exibiram
taxas de crescimento mais altas que as que (irradiadas ou não) cresceram no
meio com deficiência nutricional. A laserterapia, usando os parâmetros
anteriormente descritos, não melhorou a viabilidade das células C2C12
cultivadas sob condições habituais ou sob deficiência de nutrientes (modelo de
injúria muscular).
palavras-chave: laserterapia, C2C12, mioblastos
5
EFFECT OF LOW-ENERGY LASER IRRADIATION ON THE
VIABILITY MYOBLASTS
The beneficial effects of phototherapy using low energy lasers depend on
irradiation parameters and type of laser used. However, there are few data in
the literature on C2C12 myoblasts proliferation following phototherapy with
GaAlAs and InGaAlP lasers. The aim of this in vitro study was to evaluate the
effect of phototherapy on the viability of cultured C2C12 myoblasts under
different nutritional conditions (muscle injury model) using low energy GaAlAs
and InGaAlP lasers with different wavelengths and powers. C2C12 cell line
cultured in regular (10% fetal bovine serum, FBS) and nutrient-deficient (5%
FBS) media were irradiated with low-energy GaAlAs (660 nm) and InGaAlP
(780 nm) lasers with energy densities of 3.8, 6.3 and 10 J/cm2, and 3.8, 10 and
17.5 J/cm2, respectively. Cell proliferation was assessed indirectly 24 h after
irradiation by measuring the mitochondrial activity and by the crystal violet
assay. There were no significant differences in cell viability between lasertreated myoblasts and control cultures for all tested parameters after 24 h of cell
culture. However, cell cultures grown in regular nutrient medium supplemented
with 10% FBS exhibited higher growth rates than cultures, irradiated or not,
grown in nutrient-deficient medium. Laser phototherapy did not improve C2C12
viability under regular or nutrient-deficient (muscle injury model) conditions
using the above parameters.
Key-words: laser therapy, C2C12, myoblasts
6
SUMÁRIO
Contextualização.....………………………………………….....…………………...01
Estudo................................................................................................................03
Considerações Finais........................................................................................19
Referências bibliográficas..................................................................................22
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DMEM = Dulbecco's modified Eagles's medium
GaAIAs = arseneto de gálio alumínio
He-Ne = hélio neônio
InGaAIP = índio gálio alumínio fósforo
LPB = lasers de baixa potência
MTT = 3-{4,5-dimetiltiazol-2il}-2,5-difenil brometo de tetrazólio
SFB = soro fetal bovino
8
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Tabela 1: Parâmetros do laser
FIG. 1A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células
C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de
diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2.
Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os grupos de
controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 1B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de
células C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser
de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2.
Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os grupos de
controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 2A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células
C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas
com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10
e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os
grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 2B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de
células C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e
irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia
de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade
celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 3A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células
C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de
diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2.
Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os grupos de
controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 3B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de
células C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser
de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2.
Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os grupos de
9
controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 4A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células
C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas
com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3
e 10 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os
grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 4B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de
células C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e
irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia
de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular
entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
10
Photomedicine and Laser Surgery
11
Contextualização
Existe considerável interesse na regeneração do músculo esquelético
em função de situações como a reparação rápida de lesões em atletas, os
transplantes, as distrofias e as atrofias musculares. Nestas situações de injúria
muscular, o processo de formação do novo tecido requer que células
mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas, proliferem, se
diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos.
Subsequentemente, os miotubos irão sofrer diferenciação e maturação para
formar fibras musculares funcionais reparando assim as miofibrilas danificadas
(Bischoff et al. 1994, Sakuma et al. 2003, Grounds et al. 2002, Dominov et al.
1998, Kumar et al. 2005, Dogra et al., 2007).
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de
acelerar o processo de reparo do tecido muscular esquelético é a terapia com
lasers de baixa potência (LBP). Em contrapartida ainda são escassas, e por
vezes contraditórias, as evidências científicas e clínicas que determinem os
parâmetros dosimétricos e metodológicos necessários à aquisição de seus
objetivos terapêuticos (Ferrari et al. 2005, Amaral 2004, Weiss & Oron 1992,
Bibikova & Oron 1993, Oliveira et al.1999, Lopes-Martins et al. 2006).
LBP são aqueles que possuem baixa energia e ausência de potencial
foto-térmico. Os mais usados estão na porção óptica do espectro vermelho e
do infra-vermelho (400 a 780 nm e 780 a 1mm). Seus fótons de energia são
inferiores a 2,0 elétron-volt (eV), portanto, inferiores à energia da ligação das
moléculas biológicas e do DNA, não podendo quebrar ligações químicas e não
sendo capazes de induzir mutação e carcinogênese (Fujihara 2002, Moore et
al. 2005).
Os LBP podem ser agrupados em dois grupos: o laser de hélio neônio
(HeNe) que possui luz vermelha, sendo utilizado como raio terapêutico, ou
como raio piloto em lasers cirúrgicos invisíveis, e o laser diodo (infravermelho)
que pode apresentar os modos de operação pulsátil ou contínuo e possui maior
penetração nos tecidos biológicos (Brugnera et. al., 1991).
Conhecer a correta combinação de parâmetros (tipo de laser,
comprimento de onda, potência e intensidade) no emprego dos LPB é crucial
1
12
para alcançar efetivamente os efeitos desejados no uso clínico. Vários estudos
demonstram que mesmo parâmetros similares, podem causar efeitos
diferentes, dependendo do tipo tecidual e celular e da função a ser avaliada.
(Marques et al. 2004, Azevedo et a.l 2006, Moore et al. 2005, Amaral 2004,
Fujihara 2002, Fujihara et al. 2006, Almeida-Lopes et al. 2001, Pereira et
al.2002, Kreisler et al. 2003).
Em se tratando de tecido muscular esquelético, a maioria dos estudos
sobre a utilização de LBP refere-se aos efeitos bioestimulantes da radiação de
HeNe de comprimento 632,8nm em modelos animais e em culturas primárias
de células musculares (Bibikova & Oron 1993, Bibikova & Oron 1995, Weiss &
Oron 1992, Amaral et al. 2001, Ben-Dov et al. 1999, Shefer et al. 2001, Shefer
et al. 2002, Shefer et al. 2003, Shefer et al. 2008). Já o comprimento de onda
de 904 nm de um laser de GaAs mostrou-se ineficaz no processo de reparação
de lesões musculares in vivo (Oliveira et al. 1999).
Mais recentemente, um estudo analisou os efeitos do laser de Arseneto
de Gálio Alumínio (GaAlAs) nos parâmetros de 830 nm (0,3J/cm2), 685 nm
(0,6J/cm2) e 670 nm (1,2J/cm2) sobre culturas primárias de células precursoras
miogênicas e concluiu que a taxa de proliferação celular induzida por estas
irradiações foi de 84,3%, 70,6% e 56,8% respectivamente (Amaral 2004).
O efeito dos lasers de GaAlAs na linhagem de células musculares
C2C12 e do laser de InGaAlP em células precursoras miogênicas ou na
linhagem de células musculares C2C12 ainda não foi descrito.
O estudo dos efeitos da irradiação laser in vitro, utilizando cultura de
células, permite padronizar as amostras e estabelecer rígido controle de pH,
temperatura, pressão osmótica, e tensão de gás carbônico e de oxigênio, deste
modo, pode-se compreender melhor como utilizar este recurso terapêutico nas
diferentes condições clínicas (Freshney 2005, Eduardo et al. 2007).
A proposta do presente estudo foi a avaliar o efeito do laser de GaAlAs
(660 nm) e do laser de InGaAlP (780 nm) sobre a viabilidade de células
musculares (linhagem C2C12) num modelo in vitro de mimetização de injúria
muscular já previamente estabelecido (Shefer et al. 2003).
2
13
Estudo
Introdução
As lesões musculares ocorrem freqüentemente durante as atividades
esportivas e mesmo nos locais de trabalho, por uma variedade de mecanismos,
que incluem aqueles que surgem de trauma direto e/ou indireto1-3. Depois da
lesão muscular, as células satélites que servem como predecessores dos
mioblastos tornam-se ativas e passam por múltiplos ciclos de divisão antes de
fundirem-se com novas miofibras, promovendo a regeneração muscular4-6.
As modalidades de tratamento para as lesões musculares incluem
reparação
cirúrgica,
repouso,
crioterapia,
termoterapia,
eletroterapia,
compressão, elevação, imobilização e uso de antiinflamatórios não esteróides.
O tratamento ideal ainda não foi determinado, pois os métodos tradicionais
normalmente não promovem recuperação rápida e a recorrência de lesão é
comum, indicando que tais tratamentos falham em prover total recuperação
funcional e são provavelmente ineficazes na prevenção da formação de tecido
cicatricial permanente 3,7,8.
Vários autores têm demonstrado o potencial da laserterapia de baixa
potência (LBP) para facilitar a recuperação muscular
9-12
, entretanto, pouco é
conhecido sobre os efeitos da fototerapia na proliferação de mioblastos.
Por outro lado, tem sido demonstrado que LBP promove a proliferação de
células mesênquimais tais como fibroblastos13-16 e osteoblastos
necessidade
de
novos
estudos
para
estabelecer
quais
17,18
. Há
parâmetros,
particularmente doses e períodos de tratamento, são ideais para induzir a
ativação e a proliferação de cada tipo celular
19-21
e também para determinar o
efeito da fototerapia no crescimento celular sob diferentes condições
nutricionais 13,14,20.
É sabido que os efeitos benéficos de fototerapia usando lasers de baixa
energia depende dos parâmetros de irradiação e tipo de laser usado
13,22
.
Entretanto, não há nenhum dado na literatura sobre proliferação de mioblastos
C2C12 após fototerapia com lasers GaAlAs e InGaAlP. Nós conduzimos o atual
estudo para melhor entender o efeito da irradiação dos lasers GaAlAs e
InGaAlP na viabilidade de mioblastos C2C12 usando diferentes parâmetros de
irradiação.
14
3
Materiais e Métodos
Cultura Celular
A linhagem celular C2C12 é um subclone da linhagem celular de mioblastos
C2 derivada de células satélites de ratos adultos
23,24
. As células C2C12
cresceram em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab,
Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB,
Cultilab) e 1% de solução antibiótica-antimicótica (Cultilab), sempre a 37°C em
um ambiente úmido e a 5% CO2. As células foram mantidas em estado de
subconfluência e repicadas a cada 2 ou 3 dias.
Experimentos
Antes dos experimentos, todas as culturas foram examinadas e a sua
viabilidade foi confirmada pelo método de exclusão do azul de trypan. Para
induzir o estresse celular, metade das culturas foi cultivada em DMEM
suplementado com apenas 5% de SFB por 24hs antes de cada experimento.
Esta situação in vitro produz estresse similar às condições de estresse in vivo,
reduzindo as taxas de crescimento celular13,14,16,18,20 e, portanto permitindo a
observação dos possíveis efeitos da fototerapia no crescimento das culturas
13,20
.
Irradiação laser
As células foram irradiadas com os lasers de GaAlAs (660nm) e de
InGaAlP (780nm), (MMOptics Ltd., São Carlos, SP, Brasil). Os parâmetros
estão listados na tabela 1 e o tempo de exposição foi fixado em 10 segundos. A
potência de saída dos lasers foi checada usando um medidor de potência
LaserCheck (Coherent, Santa Clara, CA, USA). Para padronizar os resultados,
a distância entre o cabeçote do laser e as culturas celulares foi mantida
constante. A irradiação foi aplicada no fundo dos tubos de ensaio que
continham as células em cultura, como anteriormente descrito18. Desta
maneira, o feixe laser não passou pelo meio de cultura, mas foi aplicado
diretamente no agregado celular presente no fundo dos tubos. As culturas
controle foram submetidos às mesmas condições experimentais que as células
15
4
irradiadas, exceto para a irradiação. A irradiação foi realizada no escuro para
evitar a influência de outras fontes de luz.
Comprimento
de onda
Potência
de saída
Área
cabeçote
Potência
Densidade
2
de energia
(mW/cm )
2
2
(mW)
(cm )
(J/cm )
780
15
0.4
37.5
3.8
780
40
0.4
100
10
780
70
0.4
175
17.5
660
15
0.4
37.5
3.8
660
25
0.4
62.5
6.3
660
40
0.4
100
10
Tabela 1. Parâmetros do laser
Os grupos experimentais incluíram o grupo controle (não irradiado), os
grupos tratados com laser de 780 nm operando a 3.8, 10 e 17.5 J/cm2, e os
grupos tratados com o laser de 660 nm operando a 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Todos
os grupos foram cultivados em dois meios de cultura diferentes: um contendo
5% SFB e o outro contendo 10% de SFB.
Efeitos da Irradiação Laser na Viabilidade Celular
Depois da irradiação, os “pellets” celulares do grupo controle (não
irradiado) e os tratados (irradiados) foram suspensos em meio DMEM
(contendo 10% ou 5% de SFB) e as células foram distribuídas (104
células/poço) em placas de 96 poços. Para a análise de viabilidade celular, as
culturas foram incubadas em um ambiente úmido com 5% de CO2 por 24
horas. As análises de atividade mitocondrial e o ensaio de cristal violeta foram,
então, realizados para avaliar a viabilidade celular.
Análise da Atividade Mitocondrial
A função mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada usando o
ensaio
MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium
bromide)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Depois da irradiação laser e incubação
por 24 horas, o MMT foi adicionado às culturas celulares numa concentração
de 0.5 mg/mL e as células foram incubadas num ambiente úmido,contendo 5%
5
16
CO2 , a 37° por 3 h. Depois deste período, 100 µL de isopropanol foi adicionado
em cada poço para dissolver os cristais formazan. A absorbância foi medida a
620 nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020, Anthos Labtec
Instruments, Wals, Austria). Figuras 1 a 4 mostram os valores de absorbância
mensurados.
Ensaio de Cristal Violeta
O ensaio cristal violeta é útil para obter informação quantitativa sobre a
densidade relativa de células aderidas em placas de cultura. Brevemente, ao final do
período de incubação, e depois da remoção do meio de cultura, as placas de
96 poços foram
lavadas com 100 µl de PBS por poço, coradas por meio da adição de 10 µl de
solução cristal violeta a 0.5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) em
30% de ácido acético, por 15 minutos em temperatura ambiente e finalmente
lavadas com água destilada
25
. O cristal violeta foi solubilizado em 200 µl de
etanol por 30 minutos e a absorbância foi medida a 620 nm usando o leitor de
microplacas. Os dados da absorção estão descritos nas figuras 1 a 4.
Análise Estatística
Os dados de absorbância (correspondente à viabilidade celular) foram
obtidos em quadruplicata e estão representados como médias ± valores de
desvio padrão (DV). As comparações entre os grupos foram realizadas usando
análise de variância (ANOVA) e o teste Dunnett foi usado para determinar
diferenças significativas entre os grupos irradiados e o grupo controle. Valores
de p< 0.05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados foram
analisados usando o software estatístico GraphPad Prism 4.0 (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA). Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicada em 3 experimentos independentes, embora apenas um único
experimento representativo dos três realizados está demonstrado em cada
figura.
Resultados
6
17
Efeito de irradiação de laser InGaAIP na viabilidade celular (780 nm a 3.8, 10 e
17.5 J/cm2)
Não houve diferenças significantes na viabilidade celular (avaliada pelos
métodos MTT e cristal violeta) entre mioblastos tratados com laser e culturas
controle depois de 24 horas de incubação. Contudo, a viabilidade das células
cultivadas em meio suplementado com 5% de SFB (condição de injúria) foi
significantemente mais baixa que a das células cultivadas em meio de cultura
padrão contendo 10% de SFB.
A Figura 1 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade de células
C2C12 irradiadas com o laser de 780nm (com densidades de energia de 3.8,
10 e 17.5 J/cm2) com a viabilidade das culturas controle não irradiadas, ambas
cultivadas em meio de cultura convencional (10% de SFB).
FIG. 1A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células C2C12 em
meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com
2
densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças significantes na
viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
18
7
FIG. 1B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células C2C12
em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm)
2
com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças significantes na
viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
A Figura 2 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade de células
C2C12 irradiadas com o mesmo laser de 780 nm (com densidades de 3.8, 10 e
17.5 J/cm2) com a das culturas controle não irradiadas, ambas cultivadas em
deficiência nutricional (5% SFB).
19
8
FIG. 2A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células C2C12 em
meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo
2
InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças
significantes na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os
ensaios.
FIG. 2B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células C2C12
em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo
2
InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças
significantes na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os
ensaios.
Efeito de irradiação do laser de GaAIAs na viabilidade celular (660 nm a 3.8,
6.3 e 10 J/cm2)
Da mesma forma, nos grupos tratados com o laser de 660nm, não houve
diferenças significantes na viabilidade celular (avaliado pelo método MTT e
pelo ensaio de cristal violeta) entre mioblastos tratados com laser e células
controle, depois de 24 horas de incubação. Contudo, a viabilidade das células
cultivadas em meio de cultura suplementado com 5% SFB (condição de lesão)
foi significantemente mais baixa que a das células cultivadas em meio de
cultura padrão contendo 10% de SFB.
A Figura 3 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade das células
C2C12 irradiadas com o laser de 660 nm (em 3.8, 10 e 17.5 J/cm2 de
20
9
densidade de energia) com a das células controle não irradiadas, ambas
cultivadas em meio de cultura convencional (10% de SFB).
FIG. 3A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células C2C12 em
meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com
2
densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças significantes na
viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
FIG. 3B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células
C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660
1021
2
nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm . Não houve diferenças significantes
na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.
A Figura 4 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade de células
C2C12 irradiadas com o mesmo laser de 660 nm (em 3.8, 6.3 e 10 J/cm2) com
a das células não irradiadas, ambas mantidas em meio de cultura com
deficiência de nutrientes (5% SFB).
FIG. 4A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células C2C12 em
meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo
2
GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm . Não houve diferenças
significantes na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os
ensaios.
1122
FIG. 4B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células C2C12
em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo
2
GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm . Não houve diferenças
significantes na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os
ensaios.
Discussão
Este estudo demonstrou que a irradiação laser em diferentes
comprimentos de onda e parâmetros de energia foi incapaz de estimular a
proliferação celular e de prover taxas de crescimento mais altas que as
observadas nas culturas de controle (em situações de deficiência nutricional e
em meio de cultura convencional). Estes resultados foram confirmados por dois
tipos diferentes de ensaios de viabilidade celular: o ensaio de cristal violeta,
que indica a densidade relativa das células aderidas a placas e o ensaio MTTT,
que avalia a atividade mitocondrial.
Um estudo prévio também indicou que as taxas de crescimento de
células Vero irradiadas uma ou duas vezes com lasers diodos de 660 nm
(GaAlAs) e de 780 nm (InGaAlP) (40 e 70 mW a 3 e 5 J/cm2) foram similares as
do grupo controle não irradiadas, mantidas em meio de cultura com deficiência
de nutrientes
20
.
Por outro lado, o mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que as
taxas de crescimento de fibroblastos gengivais humanos irradiados duas vezes
1223
com um laser diodo de 660 nm GaAlAs (2 J/cm2) foram significantemente mais
altas que as do grupo de controle, e que culturas de osteoblastos, derivados da
calvária de ratos, irradiadas com laser diodo de InGaAlP (780 nm) usando
diferentes parâmetros de irradiação (10 mW, 3 J/cm2) apresentou um número
mais alto de células que as não irradiadas 16,18.
É possível que a energia emitida pelos lasers no estudo atual não foi
suficiente para estimular a proliferação da célula C2C12 devido a diferenças
específicas entre os tipos de celulares.
Estudos anteriores sobre o efeito do LBP em músculos demonstraram
que a irradiação do laser de He-Ne pode estimular a regeneração e induzir o
acúmulo de miofibras jovens em locais lesionados do músculo esquelético,
sugerindo que as células satélites são as principais candidatas responsivas à
irradiação 26,27 .
Estes resultados são sustentados por estudos sobre o efeito do laser
He-Ne em culturas primárias de células satélites de rato, que relatam a indução
de expressão de proteína regulatória no ciclo da celular, aumento da
proliferação de células satélites, sobrevivência e inibição de diferenciação
celular e de apoptose 12,28,29.
Nós escolhemos usar a linhagem C2C12 porque estas células são um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de células satélites de ratos
adultos
23
. Esta linhagem celular exibe a maioria das características do
mioblasto normal e é comumente usada como modelo para estudar a
proliferação e a diferenciação de células musculares. Além disso, o uso de
linhagens celulares como modelo para a análise de proliferação celular elimina
a possibilidade da influência da irradiação de laser na produção de fatores de
crescimento por células não miogênicas contidas nas culturas primárias, tais
como fibroblastos e macrófagos 30,31.
O modelo de lesão muscular usado no atual estudo foi baseado no fato
que, imediatamente após a lesão muscular (por exemplo, excisão parcial), a
área traumatizada sofre lesão isquêmica e falta de nutrientes e oxigênio, assim
o cultivo celular em meio de cultura com baixas concentrações de soro ou
ainda na ausência deste mimetiza o início da fase pós-traumática
12
. Portanto,
as condições de estresse in vitro podem ser obtidas em diferentes linhagens
celulares variando-se a concentração de SFB no meio de cultura. Alguns tipos
1324
de células são capazes de crescer com a metade da concentração de SFB do
meio de cultura habitual exigido para sua taxa de crescimento característica
13,15,16,18
, já outros tipos de células necessitam de uma redução marcante na
concentração de nutrientes para reduzir as suas taxas de crescimento
14,20
. Em
culturas de mioblastos C2C12, a proliferação e a diferenciação também são
controladas pelos mitógenos do soro, como demonstrado pelos efeitos de
condicionamento do meio ou pela adição ou remoção de mitógenos24.
Usando o meio de cultura complementado com 5% de SFB, nós
observamos que a viabilidade das células C2C12 foi mantida, mas as taxas de
crescimento foram significantemente mais baixas que as das células em meio
de cultura convencional, suplementado com 10% de SFB. Portanto, esta
concentração de soro foi apropriada para o experimento proposto, isto é, o
estudo dos efeitos da irradiação laser de baixa potência na proliferação de
células submetidas a uma condição que mimetiza a lesão muscular.
Na verdade, as condições de deficiência de nutrientes não devem
bloquear completamente o crescimento celular, mas apenas reduzir a sua taxa
de crescimento para que o possível observar o efeito da irradiação laser nas
taxas de crescimento celular sob estas condições
20
. Contudo, os parâmetros
do laser usado no atual estudo foram incapazes de normalizar o crescimento
dos mioblastos neste modelo de lesão muscular.
De acordo com outros estudos
13-16,18,20,22
, é possível concluir que a
resposta celular a bioestimulação com laser de baixa potência depende da
combinação dos seguintes fatores: comprimento de onda, densidade de
energia, densidade de potência, tempo de irradiação e o tipo de célula exposta
à irradiação. Portanto, os estudos usando as células em cultura são
importantes para determinar a melhor combinação de parâmetros, tais como o
comprimento de onda e doses de irradiação, para diferentes tipos de células
14,16,18
.
Tais estudos ajudarão os clínicos a escolher os parâmetros de laser mais
apropriados para serem usados de acordo com o tratamento necessário 16,20.
Muitas questões foram levantadas por esta pesquisa, portanto, outros
estudos são necessários para entender os mecanismos de bioestimulação a
laser em células de músculo esquelético. Além disso, tais estudos também
1425
podem determinar os parâmetros de laser corretos para otimizar a
bioestimulação de mioblastos.
Conclusão
A laserterapia, usando os parâmetros anteriormente descritos, não
melhorou a viabilidade das células C2C12 cultivadas sob condições habituais
ou sob deficiência de nutrientes (modelo de injúria muscular).
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1829
Considerações Finais
Para administrar a fototerapia com a dosimetria ideal é necessário
conhecer o comprimento de onda apropriado para o tecido a ser irradiado, a
energia (J), a fluência (J/cm2), a forma de irradiação (pontual ou varredura), a
potência (mW) e finalmente a quantidade e freqüência de irradiações que serão
necessárias (Meneguzzo 2007).
Cada tipo celular ou linhagem tem um pico ótimo de irradiação que é
dose-dependente, podendo-se estabelecer inclusive uma curva de fluência
versus resposta biológica, de modo que valores acima deste pico ocasionam
uma fotoinibição, conforme o conceito da lei de Arndt-Schultz (Baxter 1997,
Low & Reed 2001, Tiphlova & Karu 1987, Meneguzzo 2007).
Optou-se aqui pela utilização da linhagem celular C2C12 pelo fato
destas células derivarem de músculo esquelético de camundongos, exibirem a
maioria das características dos mioblastos normais e diferenciarem-se em
cultura, propiciando um bom modelo para estudar a regeneração muscular.
Além disso, o uso linhagens celulares em modelos de análise de proliferação
celular elimina a possibilidade da influência da irradiação laser sobre a
produção de fatores de crescimento por células não miogênicas contidas em
culturas primárias, como fibroblastos e macrófagos (Lee et al. 2005, Amaral
2004, Amack & Mahadevan 2001, Kumar et al. 2005).
Para evitar especulações sobre crescimento e perda de viabilidade, que
é cíclico, estabeleceu-se como ideal avaliar a viabilidade celular após 24 horas
da aplicação da laserterapia (Freshney 2005, Meneguzzo 2007).
Como não existiam registros na literatura sobre a utilização dos lasers
de GaAlAs e de InGaAlP na linhagem de células musculares C2C12, escolheuse seis parâmetros em aplicação única e pontual na tentativa de buscar a
dosimetria ideal.
Não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular
entre as culturas irradiadas e as culturas controle nos parâmetros avaliados, ou
seja, diodo GaAlAs com doses de 3.8 J/cm2 (15 mW), 6.3 J/cm2 (25 mW) e 10
J/cm2 (40 mW) e diodo InGaAlP com doses de 3.8 J/cm2 (15 mW), 10 J/cm2
(40 mW) e 17.5 J/cm2 (70 mW) .
1930
Os relatos científicos sobre a aplicação destes lasers (nestes mesmos
comprimentos de onda) em culturas celulares demonstram resultados
variáveis.
Um estudo também indicou que as taxas de crescimento celular da
linhagem Vero cultivada em meio com déficit nutricional e irradiada uma ou
duas vezes com os diodos de GaAlAs e de InGaAlP (40 e 70 mW, em 3 e 5
J/cm2) foi similar a das culturas controle não irradiadas (Eduardo et al. 2007).
Já outros estudos do mesmo grupo de pesquisadores, demonstraram
que a taxa de crescimento celular de culturas de fibroblastos gengivais
humanos irradiados duas vezes com o diodo de GaAlAs (10 e 29 mW, 2 J/cm2)
foi significativamente maior que a do grupo controle e que culturas de
osteoblastos irradiadas com o diodo InGaAlP (10 mW, 3 J/cm2) apresentaram
um número de células maior que as não irradiadas (Azevedo et al. 2006,
Fujihara et al. 2006).
Por outro lado, outro estudo demonstrou efeitos opostos da irradiação de
780 nm (50 mW, em 1, 5, e 10 J/cm2) utilizada em culturas de osteoblastos
(MC3T3) e em células derivadas de osteosarcoma (MG63). Houve efeito
inibitório de 14% e de 24% no crescimento celular de osteoblastos irradiados
com doses de 5 e 10 J/cm2 respectivamente, e houve um efeito estimulatório
de 27% e de 14% nas mesmas doses quando aplicadas às células tumorais
(Renno et al. 2007).
Diante da variabilidade encontrada na literatura quanto aos efeitos da
aplicação destes lasers, conclui-se que ainda existe um vasto campo de
pesquisa a ser explorado a fim de que seja possível estabelecer parâmetros
ideais de aplicação para cada tipo celular e finalmente, para a obtenção dos
efeitos terapêuticos desejados.
Nosso modelo evidenciou ainda o papel do LBP em um modelo, já
descrito, de mimetização de lesão muscular (privação parcial de soro na cultura
celular). Este modelo baseia-se no princípio de que imediatamente após a
lesão muscular, a área traumatizada sofre uma injúria isquêmica com falta de
oferta de nutrientes e de oxigênio, assim, o cultivo celular em meio sem soro ou
com baixas concentrações deste nutriente, simula a fase pós-traumática
(Shefer et al. 2003).
2031
Além disso, vários autores já demonstraram que quando há carência
nutricional, a taxa de crescimento celular é diminuída permitindo a observação
de possíveis diferenças na proliferação celular entre culturas tratadas e culturas
do grupo controle (Azevedo et al. 2006, Marques et al. 2004, Amaral 2004,
Fujihara et al. 2006).
Deste modo, este estudo traz mais uma contribuição ao conhecimento
da atuação do laser de baixa potência sobre as células musculares, de modo a
auxiliar na determinação científica de parâmetros para o uso clínico.
2132
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