UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EM BIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL
Análise molecular da resistência a antibióticos, factores de
virulência e grupos filogenéticos em Escherichia coli e
Enterococcus spp. de animais
Alexandre Fradeira Gonçalves
VILA REAL, 2009
Imagem capa: Escherichia coli
Copyright © 2009 Eraxion Dreamstime.com
Imagem contra-capa: Enterococcus faecium
Copyright © 2009 National Institutes of Health (US)
Orientador: __________________________________________
Professora Doutora Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis Poeta
(Departamento de Ciências Veterinárias, UTAD)
Co-Orientador: _______________________________________
Professor Doutor Gilberto Paulo Peixoto Igrejas
(Departamento de Genética e Biotecnologia, UTAD)
IV
Agradecimentos
Ao
terminar
esta
dissertação,
desejo
manifestar
o
meu
verdadeiro
reconhecimento pelo auxílio e pelas contribuições de diversas pessoas a quem estou
agradecido.
Ao Magnífico Reitor da UTAD, Prof. Doutor Armando Mascarenhas Ferreira,
Reitor da UTAD, pela disponibilidade e facilidades concedidas durante a realização
deste trabalho.
À Prof.ª Doutora Patrícia Poeta pela oportunidade, paciência, dedicação, e apoio
que sempre demonstrou.
Ao Prof. Doutor Gilberto Igrejas por todo o apoio prestado durante a execução
deste trabalho.
À Prof.ª Doutora Carmen Torres Manrique, da Universidade de La Rioja,
Logroño, Espanha, pelo apoio, orientação e hospitalidade durante a minha estadia.
Ao Prof. Doutor Divanildo Monteiro e a todas as pessoas que me ajudaram na
recolha das amostras estudadas neste trabalho.
Aos meus colegas de trabalho e amigos, em especial à Hajer, Céline, Carlos e
Catarina, pelo auxílio e amizade.
Ao Sérgio, Maria, Laura e Yoly pelo apoio e instrução prestada durante a estadia
em Espanha.
Às Técnicas do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciências
Veterinárias pela ajuda prestada.
Aos meus Pais, ao Martinho e à Ilda, por todo o apoio e força que me deram ao
longo de toda a minha carreira académica.
À Ana pelo carinho e paciência ao longo dos últimos anos.
Ao David, Matos e Luís Rocha pela amizade única.
A todas as pessoas que me apoiaram no decorrer dos trabalhos, o meu muito
obrigado.
VI
Análise molecular da resistência a antibióticos, factores de virulência e grupos
filogenéticos em Escherichia coli e Enterococcus spp. de animais.
Resumo
O reconhecimento da resistência antimicrobiana como um fenómeno emergente
em saúde pública, tem constituído um problema a nível mundial A comunidade
científica constatou a necessidade de realizar a avaliação da susceptibilidade aos
antibióticos em “bactérias indicadoras” de diversas origens, como uma medida para
combater o aumento da resistência antimicrobiana. As bactérias comensais Escherichia
coli e Enterococcus spp. são colonizadoras do tracto gastrintestinal da maioria dos
animais e humanos permitindo realizar estudos de emergência, ocorrência e
disseminação da resistência aos antibióticos.
Este trabalho teve por objectivo estudar a taxa de resistência a antibióticos em
isolados fecais de E. coli e Enterococcus spp. de diferentes origens animais, detectar
factores de virulência e analisar os grupos filogenéticos dos isolados de E. coli.
Um total de 209 amostras fecais (54 de avestruz, 13 de burro, 30 de suíno
comercial, 35 de suíno bísaro e 77 de javali) foram semeadas em Slanetz-Bartley
(suplementado e não suplementado com vancomicina) e em Levine (suplementado e
não suplementado com cefotaxima). Testou-se a susceptibilidade aos antibióticos pelo
método da difusão em disco de acordo com as normas do CLSI, usando-se 16
antibióticos em E. coli: ampicilina, amoxicilina+ácido clavulânico, cefoxitina,
cefotaxima, ceftazidima, aztreonam, imipenemo, gentamicina, amicacina, tobramicina,
estreptomicina,
ácido
nalidíxico,
ciprofloxacina,
trimetropim-sulfametoxazol,
tetraciclina e cloranfenicol. Em Enterococcus spp. utilizaram-se 11 antibióticos:
ampicilina, ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, quinupristina-dalfopristina,
tetraciclina, teicoplanina, vancomicina, e aminoglicosídeos de elevada carga
(estreptomicina, gentamicina e canamicina).
Obtiveram-se sete isolados de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina
(VRE) de amostras fecais de avestruz e 17 isolados de E. coli produtores de ȕlactamases de amplo espectro (BLAE) de amostras fecais de burro e de suínos
(comercial e bísaro). Seis dos sete isolados VRE (quatro isolados da espécie E. durans
onde foi detectado o gene vanA e em três isolados onde foi detectado o gene vanC1 que
VII
codifica uma resistência intrínseca à vancomicina em E. gallinarum) mostraram
resistência à tetraciclina e em todos eles foi detectado o gene tet(M). O gene erm(B) foi
detectado nos cinco isolados que mostraram resistência à eritromicina. A pesquisa de
factores de virulência permitiu identificar o gene hyl, codificador da hialuronidase, nos
três isolados VRE da espécie E. gallinarum.
Dos 17 isolados BLAE, 16 manifestaram a presença do gene blaCTX-M1 e oito a
presença do gene blaTEM (sete em combinação com o gene blaCTX-M1 e um em
combinação com o gene blaCTX-M14). O gene tet(A) ou tet(B) foi encontrado em 13 de 15
isolados resistentes à tetraciclina. O gene aadA foi encontrado em nove de 10 isolados
resistentes à estreptomicina. Em um isolado resistente ao cloranfenicol e um resistente
ao sulfametoxazol-trimetropim não foram detectados os genes que codificam a
respectiva resistência (cmlA e sul1, sul2 ou sul3, respectivamente). Os genes gyrA e
parC foram amplificados e posteriormente sequenciados nos isolados resistentes às
quinolonas. Num isolado resistente ao ácido nalidíxico e à ciprofloxacina foram
identificadas duas alterações aminoacídicas no gene gyrA (Ser83Leu + Asp87Asn) e
uma no gene parC (Ser80Ile). A pesquisa de factores de virulência evidenciou a
presença do gene fimA na totalidade dos isolados BLAE e o gene aer em seis destes.
Dos 17 isolados BLAE estudados, 14 pertenceram ao grupo filogenético A e três ao
grupo filogenético B1. O estudo da relação clonal dos isolados de E. coli produtores de
BLAE permitiu identificar nove padrões de restrição diferentes, sendo alguns dos
padrões idênticos em isolados provenientes de diferentes animais.
Os isolados de E. coli obtidos de meios não suplementados com cefotaxima
apresentaram uma elevada percentagem de resistência à tetraciclina (60,7%), à
ampicilina (24,8%) e à estreptomicina (21,3%). Os isolados de Enterococcus spp.
obtidos de meios não suplementados com vancomicina apresentaram fenótipos de
resistência à tetraciclina (68,1%), eritromicina (21%), canamicina (5%), estreptomicina
(4,2%), quinupristina-dalfopristina (3,4%), gentamicina (1,7%) e ampicilina (0,8%).
Neste estudo, dependendo das diferentes amostras fecais analisadas, foram
detectados diferentes níveis de colonização de enterococos com o gene vanA e também
diferentes percentagens de isolados de E. coli produtoras de ȕ-lactamases de amplo
espectro. Uma pequena variedade de genes codificadores de factores de virulência foi
encontrada nos isolados BLAE. O estudo da resistência antimicrobiana em E. coli e
Enterococcus spp., isolados a partir de meios não suplementados com antibiótico,
VIII
permitiu detectar variações na resistência entre os isolados obtidos de diferentes
espécies animais.
Os dados obtidos neste estudo são importantes para estabelecer políticas de uso
prudente de antibióticos tanto em animais como em humanos bem como, advertir a
população humana para os riscos do uso inadequado destes agentes.
Palavras-chave: Escherichia coli; Enterococcus spp.; BLAE; VRE; Antibióticos.
IX
Molecular study of antibiotic resistance, virulence factors and phylogenetic groups
in Escherichia coli and Enterococcus spp. strains of animals
Summary
The bacteria antimicrobial resistance is nowadays a public health emerging
dilemma. The scientific community recognize the necessity of accomplish the
evaluation of this situation with "indicative bacteria" of several origins as a measure to
combat the increase of the problem. Escherichia coli and Enterococcus spp. are
commensal bacteria from the gastrointestinal tract of the majority of animals and
humans that allow to monitories studies in the occurrence and spread of antibiotic
resistance.
The objective of this work was to study the antibiotic resistance in fecal E. coli
and Enterococcus spp. of different animal origins, to detect virulence factors and to
analyze the phylogenetic groups of the strains.
A total of 209 fecal samples (54 of ostrich, 13 of donkey, 30 of commercial
swine, 35 of bísaro swine and 77 of wild boar) were seeded in Slanetz-Bartley
(supplemented and not supplemented with vancomycin) and Levine (supplemented and
not supplemented with cefotaxime). Antimicrobial susceptibility was performed by disk
diffusion agar method as recommended by the CLSI recommendations. A total of 16
antimicrobial agents were tested against E. coli: ampicillin, amoxicillin-clavulanic acid,
cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime, imipenem, aztreonam, gentamicin, tobramycin,
amikacin, streptomycin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid,
ciprofloxacin and chloramphenicol. Antimicrobial susceptibility was tested additionally
for 11 antibiotics in enterococcal isolates (ampicillin, vancomycin, teicoplanin,
chloramphenicol, tetracycline, erythromycin, quinupristin-dalfopristin, ciprofloxacin
and high-level resistance for streptomycin, gentamicin, and kanamycin). Seven VRE
(vancomycin-resistant-Enterococus) strains isolated from faecal samples of ostrich and
17 extended-spectrum producing beta-lactamases (ESBLs)-Escherichia coli strains
isolated from faecal samples of donkey and swine (commercial and bísaro) were
obtained in this study.
Six of the seven VRE isolates (4 E. durans with vanA gene and 3 E. gallinarum
with vanC1 gene) were tetracycline resistant and all of them harbored the tet(M) gene.
Additionally the five isolates those were erythromycin resistant posses the erm(B) gene.
X
The hyl virulent factor gene was detected in the three E. gallinarum isolates. In relation
to the 17 ESBLs isolates, 16 of them manifest the presence of the blaCTX-M1 gene and
eight the presence of the blaTEM gene (seven in combination with the blaCTX-M1 gene and
one in combination with the blaCTX-M14 gene). The tet(A) or tet(B) genes were found in
13 of 15 tetracycline isolates and the aadA gene was found in nine of 10 streptomycin
resistant isolates. However, although one strain was chloramphenicol resistant and one
trimethoprim-sulfamethoxazole resistant neither showed the corresponded genes (cmlA
and sul1, sul2 or sul3, respectively). The gyrA and parC genes were amplified and
sequenced in the quinolone-resistant isolates. Two amino acid changes in GyrA
(Ser83Leu + Asp87Asn) and one in ParC (Ser80Ile) were identified in the nalidixic acid
and ciprofloxacin-resistant isolate. Research of virulence factors evidenced the presence
of the fimA gene in the totality of the ESBLs isolates and the aer gene in six of them.
Fourteen ESBL-containing E. coli isolates belonged to the A phylogenetic group and
three to the B1 phylogenetic group. The clonal relationship of the ESBL-containing E.
coli isolates allowed identifying nine different patterns of restriction, being some of
them identically and detected in isolates obtained from different animals.
The Enterococcus spp. isolates obtained from Slanetz-Bartley not supplemented
with vancomycin showed resistance to tetracycline (68,1%), erythromycin (21%),
kanamycin (5%), streptomycin (4,2%), quinupristin-dalfopristin (3,4%), gentamicin
(1,7%) and ampicillin (0,8%). On the other hand, the E. coli isolates obtained from
Levine not supplemented with cefotaxime showed a high percentage of resistance to
tetracycline (60,7%), ampicillin (24,8%) and streptomycin (21,3%).
In this study it was detected different levels of colonization by vanA
enterococcal strains as well different rates of ESBL-containing E. coli isolates
depending of the different faecal samples analyzed. A narrow variety of genes encoding
virulence factors were detected in ESBL-containing E. coli isolates. On the other hand,
differences in the frequency of antimicrobial resistance have been observed when faecal
enterococci and E. coli isolates of different origins, obtained without antibiotic
supplementation, have been compared. Data obtained in the present work are important
to establish policies of careful use of antibiotics in animals and in humans as well as, to
notice the human population for the inadequate use and risks of these agents.
Keywords:
Escherichia
coli;
Enterococcus
XI
spp.;
ESBL;
VRE;
Antibiotics.
Índice Geral
1.
Introdução .................................................................................................................. 1
1.1.
O género Enterococcus ...................................................................................... 2
1.2.
Interesse do estudo da resistência aos antibióticos em Enterococcus spp. ........ 3
1.3.
Escherichia coli ................................................................................................. 5
1.4.
Interesse do estudo das resistências aos antibióticos em E. coli ........................ 6
1.5.
Mecanismos de acção dos antibióticos .............................................................. 6
1.5.1. Inibição da síntese da parede celular ............................................................. 7
1.5.2. Inibição da síntese de proteínas ..................................................................... 8
1.5.3. Inibição da síntese do ácido fólico ................................................................ 9
1.5.4. Interferência na síntese dos ácidos nucleicos ................................................ 9
1.5.5. Alteração da permeabilidade da membrana celular ..................................... 10
1.6.
Mecanismos de resistência aos antibióticos ..................................................... 10
1.6.1. Alteração da permeabilidade da membrana ................................................. 11
1.6.2. Expulsão activa do antibiótico ..................................................................... 12
1.6.3. Modificação ou protecção do alvo............................................................... 13
1.6.4. Modificação ou inibição enzimática do antibiótico ..................................... 16
1.7.
Elementos genéticos de aquisição e transferência de genes de resistência ...... 18
1.7.1. Plasmídeos ................................................................................................... 18
1.7.2. Sequências de inserção e transposões .......................................................... 19
1.7.3. Integrões ...................................................................................................... 19
1.8.
Mutações em gyrA e parC ............................................................................... 21
1.9.
Produção de factores de virulência .................................................................. 22
1.10. Classificação filogenética de Escherichia coli ................................................ 22
2.
Objectivos ................................................................................................................ 25
3.
Material e Métodos .................................................................................................. 29
3.1.
Meios de cultura e provas de identificação ...................................................... 29
3.1.1. Meios de cultura .......................................................................................... 29
3.1.2. Provas de identificação ................................................................................ 30
3.2.
Amostras fecais ................................................................................................ 31
XII
3.3.
Processamento das amostras ............................................................................ 32
3.3.1. Isolamento de Enterococcus spp. ................................................................ 33
3.3.2. Isolamento de Escherichia coli.................................................................... 33
3.4.
Estudo da sensibilidade a antibióticos ............................................................. 34
3.4.1. Antibióticos estudados ................................................................................. 34
3.4.2. Determinação da sensibilidade aos antibióticos pelo método da difusão em
agar
..................................................................................................................... 36
3.4.3. Determinação fenotípica da produção de ȕ-lactamases de amplo espectro. 36
3.5.
Reacção em cadeia pela polimerase (PCR) ..................................................... 37
3.5.1. Extracção de DNA ....................................................................................... 38
3.5.2. Preparação dos tubos de PCR ...................................................................... 38
3.5.3. Primers e condições de PCR utilizadas ....................................................... 39
4.
3.6.
Electroforese em gel de agarose ...................................................................... 46
3.7.
Electroforese em campo pulsado (PGFE) ........................................................ 47
3.8.
Sequenciação.................................................................................................... 48
Resultados ............................................................................................................... 49
4.1.
Enterococcus spp. ............................................................................................ 49
4.1.1. Isolamento
de
Enterococcus
spp.
em
placas
de
Slanetz-Bartley
suplementadas com vancomicina ............................................................................ 49
4.1.2. Isolamento de Enterococcus spp. em placas de Slanetz-Bartley não
suplementadas com vancomicina ............................................................................ 50
4.1.3. Estudo da sensibilidade aos antibióticos nos isolados de enterococos ........ 51
4.1.3.1. Isolados obtidos nas placas de Slanetz-Bartley suplementadas com
vancomicina............................................................................................................. 51
4.1.3.2.
Isolados obtidos nas placas de Slanetz-Bartley não suplementadas com
vancomicina............................................................................................................. 52
4.1.3.3. Caracterização genotípica dos mecanismos de resistência ................... 54
4.1.4. Produção de factores de virulência .............................................................. 55
4.2.
Escherichia coli ............................................................................................... 56
4.2.1. Isolamento de E. coli em placas de Levine suplementadas com cefotaxima56
4.2.2. Isolamento de E. coli em placas de Levine não suplementadas com
cefotaxima ............................................................................................................... 56
4.2.3. Estudo da sensibilidade aos antibióticos nos isolados de E. coli................. 57
XIII
4.2.3.1. Isolados obtidos nas placas de Levine suplementadas com cefotaxima 57
4.2.3.2. Isolados obtidos nas placas de Levine não suplementadas com
cefotaxima .............................................................................................................. 58
4.2.3.3. Caracterização genotípica dos mecanismos de resistência ................... 61
4.2.4. Caracterização dos integrões ....................................................................... 64
4.2.5. Produção de factores de virulência .............................................................. 65
4.2.6. Classificação filogenética de Escherichia coli ............................................ 66
4.2.7. Relação clonal dos isolados de E. coli produtores de ȕ-lactamases de amplo
espectro por electroforese em campo pulsado ......................................................... 66
5.
Discussão ................................................................................................................. 69
6.
Conclusões............................................................................................................... 79
7.
Bibliografia .............................................................................................................. 83
XIV
Índice das Figuras
Figura 1: Mecanismos de acção dos principais grupos de antibióticos ............................ 7
Figura 2: Mecanismos de resistência aos antibióticos .................................................... 10
Figura 3: Estrutura de um integrão e integração de um gene no mesmo ....................... 20
Figura 4: Estirpe com fenótipo positivo para produção de ȕ-lactamases de amplo
espectro ........................................................................................................................... 37
Figura 5: Distribuição das amostras fecais em função das espécies animais de origem. 49
Figura 6: Percentagem de resistência aos antibióticos para os isolados de cada origem 53
Figura 7: Imagem do gel de electroforese resultante da amplificação por PCR do gene
hyl ................................................................................................................................... 55
Figura 8: Distribuição das amostras fecais, semeadas em Levine suplementado, em
função das espécies de origem........................................................................................ 56
Figura 9: Distribuição das amostras fecais, semeadas em Levine não suplementado, em
função das espécies de origem........................................................................................ 57
Figura 10: Resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli de diferentes origens ... 60
Figura 11: Comparação da sequência nucleotídica do gene gyrA do isolado de burro
com a sequência do gene gyrA selvagem ....................................................................... 63
Figura 12: Padrões de PFGE do DNA cromossómico digerido com XbaI, das 17 E. coli
produtoras de ȕ-lactamases de amplo espectro .............................................................. 67
XV
Índice das Tabelas
Tabela 1: Antibióticos e mecanismos de resistência ...................................................... 11
Tabela 2: Antibióticos usados em Enterococcus spp. e respectivo valor dos halos de
inibição ........................................................................................................................... 35
Tabela 3: Antibióticos usados em E. coli e respectivo valor dos halos de inibição ....... 35
Tabela 4: Componentes e concentrações usadas para a reacção de PCR. ...................... 38
Tabela 5: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para identificação das espécies de
Enterococcus spp. ........................................................................................................... 39
Tabela 6: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de
resistência a antibióticos em Enterococcus spp.............................................................. 40
Tabela 7: Sequências nucleotídicas dos primers de PCR para genes relacionados com a
codificação de factores de virulência em Enterococcus spp. ......................................... 41
Tabela 8: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de
resistência a antibióticos em E. coli................................................................................ 41
Tabela 9: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos integrões de
classe 1 e 2 em E. coli..................................................................................................... 44
Tabela 10: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos factores de
virulência em E. coli. ...................................................................................................... 45
Tabela 11: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos grupos
filogenéticos em E. coli. ................................................................................................. 46
Tabela 12: Número e percentagem de espécies de enterococos obtidos nas placas de
Slanetz-Bartley não suplementadas com vancomicina. .................................................. 50
Tabela 13: Fenótipo de resistência apresentado pelos isolados VRE............................. 51
Tabela 14: Resistência fenotipica aos antibióticos nos isolados de enterococos obtidos
em placas não suplementadas com vancomicina. ........................................................... 52
Tabela 15: Resistência aos antibióticos nos isolados de diferentes origens. .................. 53
Tabela 16: Fenótipos e genótipos de resistências aos antibióticos nos isolados VRE. .. 54
Tabela 17: Fenótipo de resistência aos antibióticos em E. coli obtidas de placas não
suplementadas com cefotaxima. ..................................................................................... 58
Tabela 18: Resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli. .................................... 59
Tabela 19: Resistência aos antibióticos nos isolados das diferentes origens. ................ 61
Tabela 20: Fenótipos e mecanismos de resistência aos antibióticos detectados nos
isolados de E. coli produtoras de ȕ-lactamases de amplo espectro. ............................... 62
XVI
Tabela 21: Estudo das regiões variáveis dos integrões de classe 1 em isolados de E. coli
resistentes ao sulfametoxazol-trimetropim. .................................................................... 64
Tabela 22: Estudo das regiões variáveis dos integrões de classe 2 em isolados de E. coli
resistentes ao sulfametoxazol-trimetropim. .................................................................... 65
XVII
Lista de Abreviaturas
aac— Aminoglicósido acetiltransferase
aad— Gene da adenilase
AK— Amicacina
AMC— Amoxicilina + Ácido clavulânico
AMP— Ampicilina
ATM— Aztreonam
ATP— Adenosina trifosfato (“Adenosine Triphosphate”)
BHI— Infusão de cérebro e coração (“Brain-Heart-Infusion”)
bla— Gene codificador de ȕ-lactamases de amplo espectro
BLAE— ȕ-lactamases de amplo espectro
CAZ— Ceftazidima
CHL— Cloranfenicol
chuA— Gene codificador de um receptor da membrana externa
CIP— Ciprofloxacina.
CLSI— Instituto de Padrões Clínicos e de Laboratório (“Clinical and Laboratory
Standards Institute”)
CMI— Concentração mínima inibitória
cmlA— Gene do cloranfenicol
CTX— Cefotaxima
ddl— Ligase D-alanila-D-alanina
DHF— Dihidrofolato
DHFR— Dihidrofolato redutase
DHFR— Enzima dihidrofolato reductase
DHPS— Dihidropteroato sintetase
DHPS— Enzima dihidropteroato sintetase
DNA— Ácido desoxiribonucleico (“Deoxyribonucleic Acid”)
dNTP— Deoxinucleotídeo trifosfato
EBI— Instituto Europeu de Bioinformática (“European Bioinformatics Institute”)
EDTA— Ácido etilenodiamino tetra-acético
erm— Eritromicina ribossoma metilase
ERY— Eritromicina
XVIII
esp— Gene da proteína de superfície extracelular (“Extracellular Surface Protein”)
fimA— Gene codificador da proteína fimbrilina
FOX— Cefotaxima
GEN— Gentamicina
gyrA— Gene codificador da DNA-girase
hyl— Gene da hialuronidase
IMP— Imipenemo
Intl— Gene codificador da integrase
KAN— Canamicina
McFarland— Escala que representa concentrações de bactéria por ml
MH— Mueller-Hinton
min— Minuto
ml— Mililitro
MLEE— Electroforese de enzimas multilocus (“Multilocus Enzyme Electrophoresis”)
MLST— “Multilocus Sequence Typing”
mm— Milímetro.
N.D.— Não detectado
NAL— Ácido nalidíxico
orf— Grelha de leitura aberta (“Open Reading Frame”)
PABA— Ácido para-aminobenzóico
parC—Gene codificador da topoisomerase IV
pb— Pares de bases
PBP— Proteínas de ligação à penicilina (“Penicillin Binding Protein”)
pbp5— Gene da proteína de ligação à penicilina (“Penicillin-Binding-Protein gene”)
PBP5— Proteína de ligação à penicilina (“Penicillin-Binding-Protein”)
PCR— Reacção em cadeia pela polimerase (“Polymerase Chain Reaction”)
PFGE— Electroforese em campo pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis”)
Q-D— Quinupristina-Dalfopristina
RNA— Ácido ribonucleico (“Ribonucleic Acid”)
s— Segundo
SB— Slanetz-Bartley
STR— Estreptomicina
sul— Gene do sulfametoxazol
SXT— Sulfametoxazol-Trimetropim
XIX
TEI— Teicoplanina
tet— Gene da tetraciclina
TET— Tetraciclina
THF— Ácido tetrahidrofólico
TOB— Tobramicina
TSI— Meio Agar - ferro e triplo açúcar (“Triple Sugar Iron”)
tspE4.C2— Fragmento de DNA
UFC— Unidades formadoras de colónias
van— Gene da vancomicina
VAN— Vancomicina
vat— Virginiamicina acetiltransferase
VRE— Enterococcus resistentes à vancomicina (“Vancomycin Resistant Enterococci”)
yjaA— Gene sem função associada conhecida
XX
1. Introdução
A necessidade de realizar a vigilância e avaliação da susceptibilidade aos
antibióticos em bactérias de origem humana, animal e do meio-ambiente surgiu, em
diversas reuniões científicas, como uma medida de combate ao aumento da resistência
antimicrobiana (WHO, 1997; WHO, 1998; NRCIM, 1998). Por este motivo é necessário
uma constante monitorização da resistência bacteriana, principalmente em estirpes
“indicadoras de resistência”, dada a sua presença numa grande diversidade de nichos
ecológicos permitindo comparar as resistências entre os diversos ecossistemas e avaliar
a pressão selectiva exercida devido ao uso dos antibióticos (Sáenz, 2004). O
conhecimento da origem dos genes codificadores de resistência na população
microbiana global é essencial para a definição de modelos abrangentes de avaliação do
ponto de situação e de medidas sustentáveis para o seu controlo (Sáenz, 2004).
As bactérias comensais, como Enterococcus spp. e Escherichia coli, são
colonizadoras do tracto gastrintestinal da maioria dos animais e dos humanos (Gold,
2001; Todar, 2002). Estas bactérias estão submetidas ao efeito do uso dos antibióticos
podendo, desta forma, seleccionar-se estirpes com mecanismos de resistência,
constituindo reservatórios de genes capazes de os adquirir e de os transferir a outras
bactérias comensais habitantes do intestino ou mesmo a bactérias patogénicas. A
transferência/fluxo destes genes entre diferentes espécies e géneros bacterianos é
designada por “transferência horizontal” e é facilitada devido à pressão exercida pelos
antibióticos (Woo et al., 2003). Enterococcus spp. e Escherichia coli são fundamentais
para a monitorização da resistência antimicrobiana existente no domínio animal e para
os estudos da emergência, ocorrência e disseminação da resistência, gerada pelo uso
destes agentes (OIE, 2000; Hayes et al., 2004).
1
Introdução
1.1. O género Enterococcus
Os enterococos são microrganismos que se identificam por métodos bioquímicos
como Gram-positivos, catalase negativos e anaeróbios facultativos. Estruturalmente
encontram-se
em
cocos,
diplococos
ou
ocasionalmente
em
cadeias
curtas
(estreptococos). São bactérias comensais muito abundantes na flora intestinal do
Homem e dos animais, podendo ser isolados em concentrações de 105 a 108 Unidades
Formadoras de Colónias (UFC)/grama de fezes, e que, eventualmente, colonizam a
cavidade oral e o tracto genital (Bonten et al., 2001; Shepard e Gilmore, 2002).
Thiercellin, em 1899, utilizou pela primeira vez a palavra “enterococo” para descrever
um diplococo Gram-positivo, de origem intestinal humana. Posteriormente, Sherman
definiu que o termo “Enterococcus” devia ser usado especificamente para streptococci
que crescem entre temperaturas de 10ºC a 45ºC, a pH 9,6, suportam concentrações de
NaCl a 6,5% e sobrevivem a 60ºC durante 30 minutos (Klein, 2003).
Através da produção de pigmento, da mobilidade, da reacção positiva ao antisoro do grupo D e das diferenças na fermentação do manitol, do sorbitol, da arabinose e
da rafinose, podemos diferenciar os Enterococcus spp. típicos (Enterococcus durans, E.
faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae e E. casseliflavus) de outros coccos Grampositivos (Franz et al., 1997; Klein, 2003). No entanto, a essência mutável destas
características torna a diferenciação complexa (Facklam e Collins, 1989).
Existem, actualmente, vários sistemas automatizados que permitem a
identificação das espécies de enterococos, como por exemplo as galerias API 20STREP,
API 32STREP, o sistema Microscan, PASCO, entre outros. Contudo, devido a
semelhanças entre algumas espécies torna-se díficil a sua distinção (Sader et al., 1995).
Torna-se, assim, evidente que os métodos de biologia molecular, baseados na técnica da
reação em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”, PCR) com o uso de
“primers” específicos para a diferenciação das espécies, são imprescincíveis e, ao
contrário dos sistemas anteriormente referidos, são mais fiáveis (Pérez-Hernández et al.,
2002).
2
Introdução
1.2. Interesse do estudo da resistência aos antibióticos em
Enterococcus spp.
Os enterococos fazem parte da microflora intestinal e são relativamente
abundantes em fezes humanas, isolando-se este género em mais de 90% de indivíduos
saudáveis (Noble, 1978). Estes microrganismos são dotados de uma grande capacidade
de resistência ao stress ambiental, sendo capazes de sobreviver sob uma amplitude
extremamente alargada de valores de temperatura, pH e salinidade, assim como de
resistir à acção dos detergentes (Costa, 2006). Encontram-se em diferentes ecossistemas
como por exemplo no solo, água e produtos alimentares. A ecorresistência desta espécie
potencializa a sua persistência num determinado biótopo bem como a colonização de
biótopos inacessíveis para outros microrganismos aumentando o número de
reservatórios potenciais. Estudos realizados por diversos autores provam a presença de
enterococos em instrumentos médicos, apesar da existência de vários protocolos
praticados na tentativa de eliminar essa contaminação (Morris et al., 1995; Noskin et
al., 1995; Costa, 2006).
Os enterococos apesar de terem sido, até ao final da década de 70, considerados
como microrganismos inofensivos, nas duas últimas décadas surgiram como
organismos patogénicos. Estas bactérias são, actualmente, consideradas como um dos
principais desafios clínicos para a medicina, quer pelo número elevado de mecanismos
que lhes conferem resistência à maioria dos antibióticos usados na terapêutica, quer pelo
acumulado número de resistências intrínsecas que possuem (Bonten et al., 2001; Costa,
2006). Este conjunto de factores favorece a capacidade de sobrevivência dos
enterococos, mesmo em locais onde a utilização de antibióticos é elevada, como por
exemplo em unidades de cuidados de saúde (Costa, 2006). Esta peculiaridade dos
enterococos, apesar da sua relativa baixa virulência, torna-os numa das principais
origens de infecção nosocomial, representando a 3.ª causa de infecção hospitalar nos
Estados Unidos da América (EUA) (Schaberg et al., 1991).
E. faecalis e E. faecium representam cerca de 80% a 90% e de 5% a 15%,
respectivamente, das causas de infecções clínicas em humanos. No entanto, outras
espécies como por exemplo E. gallinarum ou E. durans, raramente são identificadas em
isolados clínicos (Patterson et al., 1995). Alguns exemplos de infecções causadas por E.
faecalis e E. faecium em humanos são as do trato urinário, abcessos abdominais,
3
Introdução
infecções pós-cirúrgicas, infecções neonatais, entre outras (Charvers et al., 2003; Costa,
2006).
Diversos autores defendem uma relacção entre o aumento da incidência das
infecções causadas pelos enterococos e o aumento do uso de antibióticos como as
quilononas e cefalosporinas, devido ao facto destas bactérias apresentarem uma
resistência intrínseca ou susceptibilidade baixa a estes antibióticos usados diariamente
no tratamento das infecções. O desafio que se coloca quando se implementam medidas
relacionadas com saúde publica é a capacidade dos enterococos poderem adquirir
resistências através de mutações ou da transferencia de genes presentes em plasmídeos
ou transposões (Poeta, 2006). A pressão exercida devido ao uso de antibióticos pode,
desta forma, provocar a selecção de estirpes de enterococos resistentes e ser o factor
predominante para o aumento que se verificou no número de infecções hospitalares
(Rice, 2001; Martínez, 2008).
A vancomicina é o antibiótico várias vezes aplicado em infecções provocadas
por bactérias Gram-positivas multirresistentes ou em pacientes alérgicos a antibióticos
ȕ-lactâmicos (Costa, 2006). Porém, nas últimas décadas registou-se um enorme
aumento no número de enterococos resistentes à vancomicina (VRE), devido ao grande
número de prescrições hospitalares do antibiótico e também pela transferência de genes
de resistência entre os enterococos pertencentes à microbiota humana. Por outro lado, as
espécies pecuárias foram, durante anos, alimentadas com aditivos como a avoparcina
(entre outros), um promotor de crescimento estruturalmente análogo à vancomicina e à
teicoplanina (McDonald et al., 1997; Costa, 2006).
Segundo Hayes, em 2003, nenhuma infecção clínica em humanos foi associada a
enterococos de origem alimentar. No entanto, Hayes confirmou a capacidade destes
transferirem genes de resistência para estirpes adaptadas ao hospedeiro humano. Ao
efectuar a sequenciação nucleotídica do gene vanX, Jensen (1998) verificou que todas
as VRE isoladas nos habitantes de um país muçulmano pertenciam ao subtipo
característico das VRE isoladas a partir de frangos (variante G) e que nenhum pertencia
ao subtipo dominante nas estirpes de origem suína (variante T). Nos países não
muçulmanos verificava-se uma distribuição uniforme dos dois subtipos na população
humana.
4
Introdução
1.3. Escherichia coli
Escherichia coli é uma enterobactéria, anaeróbica facultativa e predominante do
sistema gastrintestinal do Homem e diversos animais. Foi identificada pela primeira
vez, em 1885, pelo pediatra Alemão Theodor Escherich (Ramos, 2002; Todar, 2002).
Foi nesta espécie que se identificou, pela primeira vez, o processo da conjugação
bacteriana, em 1946 por Joshua Lederberg e Eduard Tantum. A maioria das estirpes de
E. coli são comensais e sintetizam a vitamina K e B12. A bactéria identifica-se,
estruturalmente, pela forma de bacilos coliformes móveis com flagelos periféricos e por
métodos bioquímicos sendo oxidase negativa, catalase positiva e fermenta a glucose e a
lactose. E. coli coloniza o intestino humano imediatamente após o nascimento e
encontra-se em concentrações de 106 a 109 UFC/grama de fezes (Thielman e Guerrant,
1999).
A espécie E. coli apresenta diversas resistências a factores ambientais,
contaminando a água e alimentos, tornando-se um indicador modelo de contaminação
fecal (Madigan et al., 2000). A bactéria desempenha um papel protector do intestino
contra infecções, simultaneamente com outras bactérias comensais, devido a competir
com outras bactérias patogénicas intestinais como por exemplo Shigella e Salmonella.
Embora predominantemente comensal, E. coli é responsável por uma grande quantidade
de toxinfecções alimentares, infecções extra-intestinais tais como infecções abdominais
e do tracto urinário, meningite e, no caso de atingir a corrente sanguínea através do
tracto urinário, dos intestinos ou de uma ferida infectada, pode provocar septicemia
(Orskov e Orskov, 1985; Guerra et al., 2003; Costa, 2006). As estirpes patogénicas de
E. coli apresentam comummente uma série de factores de virulência que, usualmente,
não são encontrados em bactérias comensais (Sáenz, 2004). Foram declaradas cinco
classes de E. coli, que provocam doenças entéricas, dependendo do tipo de factores de
virulência que estas possuem: as enterotoxigénicas, as enteroinvasivas, as
enterohemorrágicas, as enteropatogénicas e as enteroagregativas (Todar, 2002; Sáenz,
2004).
5
Introdução
1.4. Interesse do estudo das resistências aos antibióticos em E. coli
Escherichia coli pode ser encontrada em nichos ecológicos diferentes, como a
microflora entérica de humanos e animais, amostras ambientais como a água e os
alimentos e, também, em ambientes clínicos. Nestes nichos ecológicos E. coli encontra
diversas situações de stress devido ao uso de antibióticos, o que lhe proporciona a
aquisição e disseminação de genes que lhes conferem a resistência a esses agentes
(Sáenz, 2004).
E. coli é uma excelente “bactéria indicadora” para realizar estudos sobre o
impacto do uso de antibióticos em humanos e animais. Este microrganismo permite
monitorizar o nível da resistência aos antibióticos e, desta forma, procurar resoluções
contra o seu aumento (Sáenz, 2004). O estudo da resistência antimicrobiana em E. coli
permite obter ao longo do tempo uma informação antecipada sobre a sua emergência em
bactérias potencialmente patogénicas (Schroeder et al., 2004; Costa, 2006).
Esta bactéria é um invasor oportunista e representa actualmente o principal
agente patogénico em clínica avícola, sendo a principal razão para o uso de antibióticos
com fins medicinais nestes animais (Gross, 1991). Num estudo realizado por Yang e
colaboradores em 2004, detectaram-se serótipos patogénicos em aves com uma
capacidade elevada de dispersão entre animais criados na mesma exploração. Estes
serótipos são, desta forma, os que mais vezes são expostos aos antibióticos sofrendo
uma maior pressão selectiva.
É, adicionalmente, importante referir que E. coli possui uma capacidade exímia
para adquirir e transmitir genes de resistência, tal como no caso dos enterococos,
mesmo a bactérias filogeneticamente afastadas (Martel et al., 2003; Costa, 2006).
1.5. Mecanismos de acção dos antibióticos
Os antibióticos podem ser classificados como bactericidas caso provoquem a
morte da bactéria ou como bacteriostáticos caso inibam o seu crescimento. Para além
desta classificação, os antibióticos actuam através de diferentes mecanismos tornandose possível distingui-los pelo seu modo de acção (Poeta, 2006).
Os cinco modos de acção utilizados pelos antibióticos, conforme representados
na Figura 1, são: 1- a inibição da síntese da parede celular, 2- a inibição da síntese de
6
Introdução
proteínas, 3- a inibição da síntese do ácido fólico, 4- a interferência na síntese do ácido
nucleico e 5- alteração da permeabilidade da membrana celular.
Síntese da parede celular:
Síntese de DNA:
Ǻ-lactâmicos
Quilononas
Glicopéptidos
Síntese de RNA:
Rifampicina
Síntese de proteínas:
Ribossomas
Síntese do ácido fólico:
Sulfonamidas
Tetracilina
Cloranfenicol
Aminoglicósidos
Macrólidos
Lincosamidas
Estreptogramina
Figura 1: Mecanismos de acção dos principais grupos de antibióticos (adaptado de Sáenz, 2004).
1.5.1.
Inibição da síntese da parede celular
As bactérias são revestidas por uma parede celular rígida composta,
maioritariamente, por peptidoglicano. Sendo este tipo de revestimento único para as
bactérias torna-se alvo de toxicidade selectiva. Os antibióticos ȕ-lactâmicos onde se
incluem as penicilinas, os monobactamos, carbapnemos, cefalosporinas, ácido
clavulânico, sulbactam e o tazobactam são o grupo mais usado na terapêutica em
medicina humana e veterinária. Este grupo de antibióticos inibe enzimas importantes
que intervêm na formação do peptidoglicano (as transpeptidases, carboxipeptidases e
transglicosidades), diminuindo a força da parede celular até provocar a lise celular e,
consequentemente, a morte da bactéria (Livermore, 1995; Poeta, 2006).
A vancomicina e a teicoplanina, antibióticos glicopéptidos, foram descobertas
em 1960. Estes antibióticos inibem as ligações cruzadas da cadeia do peptidoglicano. A
vancomicina liga-se aos terminais das moléculas D-Alanina-D-Alanina evitando a
formação e a incorporação do pentapéptido na cadeia de peptidoglicano que se está a
7
Introdução
formar (Cetinkaya et al., 2000). Estes antibióticos são moléculas grandes que não
conseguem deslocar-se através dos poros da membrana exterior das bactérias Gramnegativas, logo, são apenas eficientes contra bactérias Gram-positivas (Poeta, 2006).
1.5.2.
Inibição da síntese de proteínas
É nos ribossomas das bactérias onde a leitura do RNAm permite a síntese das
proteínas. Os ribossomas das bactérias são estruturalmente diferentes dos ribossomas
dos eucariotas. As bactérias possuem duas subunidades 30S e 50S, enquanto os
ribosomas dos eucariotas consistem de duas subunidades 40S e 60S.
Os antibióticos com o mecanismo de acção a interferir na síntese de proteínas
ligam-se às duas subunidades ribossomais, interferindo com um dos quatro estados da
síntese proteica (iniciação, alongação, translocação e terminação) (Sefton, 2002).
A tetracilina é um antibiótico de amplo espectro, bacteriostático, que se une e
modifica o local de ligação na subunidade 30S do aminoacil-RNAt não havendo
produção de proteínas (Walsh, 2003; Poeta, 2006). Este antibiótico penetra na bactéria
por difusão passiva, tem uma baixa toxicidade e foi utilizado durante vários anos como
promotor de crescimento em explorações pecuárias (Roberts, 1996).
O cloranfenicol une-se à subunidade ribossomal 50S o que bloqueia as funções
da peptidil transferase, interferindo com a incorporação dos novos aminoácidos na
cadeia peptídica em crescimento. Este antibiótico tem uma acção bacteriostática, causa
efeitos de toxicidade no fígado e nas células estaminais da medula óssea, tornando o seu
uso limitado (Sefton, 2002).
Os aminoglicosídeos unem-se à subunidade 30S do ribossoma não permitindo a
ligação correcta com a subunidade 50S e a consequente activação ribossómica. Este
grupo onde se insere a estreptomicina, a canamicina, a gentamicina, entre outros, têm
uma acção bactericida e apresentam, tal como o cloranfenicol, alguns efeitos tóxicos
(Sefton, 2002).
O grupo dos macrólidos, onde se insere a eritromicina, e o grupo das
lincosamidas possuem uma actividade bacteriostática e actuam na subunidade
ribossomal 50S, inibindo a fase de alongação na síntese das proteínas (Rice, 2001).
A estreptogramina quinupristina-dalfopristina (Q-D) apresenta um mecanismo
de inibição semelhante ao referido para os macrólidos. No entanto, são já muitas as
8
Introdução
estirpes de E. faecium que possuem um fenótipo que confere à Q-D apenas uma
actividade bacteriostática, sendo necessárias concentrações elevadas para que este
antibiótico seja eficaz (Rice, 2001).
1.5.3.
Inibição da síntese do ácido fólico
O ácido fólico desempenha um papel essencial em duas etapas da síntese das
purinas e numa fase importante da síntese das pirimidinas. As bactérias necessitam de
ácido fólico mas não possuem um sistema de obtenção deste ácido do ambiente que as
rodeia tendo, necessariamente, de o sintetizar (Sáenz, 2004).
As sulfonamidas, onde se insere o sulfametoxazol e o trimetropim são
antibióticos classificados como bacteriostáticos de amplo espectro, utilizados para fazer
frente a um grande número de microrganismos. Estes antibióticos actuam imitando o
substrato de duas enzimas (o ácido para-aminobenzóico, PABA, e o dihidrofolato,
DHF) que produzem a forma activa do ácido fólico, o ácido tetrahidrofólico (THF). A
combinação mais usada é denominada de cotrimoxazol e é composta por trimetropim e
sulfametoxazol na proporção 1/5, causando um bloqueio duplo para a formação do
ácido fólico resultando num efeito bactericida (Huovinen, 2001; Master et al., 2003).
1.5.4.
Interferência na síntese dos ácidos nucleicos
O grupo das quinolonas, onde se insere a ciprofloxacina e o ácido nalidíxico,
penetram no citoplasma das bactérias através dos canais de porinas ou da camada
fosfolipídica. No interior da célula, estes antibióticos actuam sobre a replicação dos
ácidos nucleicos através de mecanismos complexos que intervêm no enrolamento do
DNA. O alvo destes antibióticos é a DNA girase e a Topoisomerase IV, ambas
topoisomerases do tipo II (Walsh, 2003).
A rifampicina, o antibiótico mais importante das rifampicinas, é muito activa
frente a bactérias Gram-positivas. Este antibiótico liga-se à RNA polimerase dependente
de DNA, inibindo a iniciação da síntese do RNA. Este antibiótico não inibe a síntese
quando esta já se encontra iniciada (Sefton, 2002).
9
Introdução
1.5.5.
Alteração da permeabilidade da membrana celular
As polimixinas actuam, apenas, em bactérias Gram-negativas. O antibiótico ligase aos fosfolípidos, desorganizando a estrutura, causando a alteração da permeabilidade
e saída de constituintes intracelulares através da membrana (Sefton, 2002).
1.6.
Mecanismos de resistência aos antibióticos
As bactérias desenvolveram vários mecanismos que conferem resistência aos
antibióticos (Guardabbasi, 2006). Os mecanismos são muito variados (Walsh, 2003) e
alguns dos mais comuns, como ilustra a Figura 2, são os seguintes: (i) alteração da
permeabilidade da membrana, (ii) expulsão activa do antibiótico, (iii) modificação ou
protecção do alvo e (iv) modificação ou inibição enzimática do antibiótico.
antibiótico
Alteração de
Modificação do alvo
permeabilidade da
membrana
Protecção do alvo
Ribossoma
Proteína
Inactivação do
antibiótico
Expulsão activa do
antibiótico
Figura 2: Mecanismos de resistência aos antibióticos (adaptado de Yao e Moellering, 2005).
10
Introdução
Embora sejam muitos e variados os mecanismos de resistência aos antibióticos,
na Tabela 1 apresenta-se um resumo dos antibióticos mais importantes e dos respectivos
mecanismos de resistência.
Tabela 1: Antibióticos e mecanismos de resistência (adaptado de Gilbert, 2002).
Antibióticos
Mecanismos de resistência
ȕ-lactâmicos
- ȕ-lactamases
Penicilinas (ampicilina, amoxicilina)
-mutações na PBP
Cefalosporinas (cefotaxima, ceftazidima)
-diminuição da permeabilidade da membrana
Monobactam (aztreonam)
-expulsão activa do antibiótico
Carbapnemos (imipenemo)
Glicopéptidos (vancomicina, teicoplanina)
-alteração do alvo do antibiótico (genes van)
Tetraciclina
-expulsão activa do antibiótico
-protecção do alvo (ribossomas)
-inibição enzimática
Cloranfenicol
-inibição enzimática
Aminoglicosídeos (estreptomicina, gentamicina,
-modificação enzimática
canamicina)
Macrólidos (eritromicina) e Lincosamidas
-modificação do alvo (metilação dos ribossomas)
-expulsão activa do antibiótico
-inibição enzimática
Sulfametoxazol e Trimetoprim
-modificação do alvo (mutação em DHFR e DHPS)
Quinolonas
- modificação do alvo (mutações na DNA girase e
na topoisomerase IV)
Rifampicina
-modificação
do
alvo
(mutação
na
RNA
polimerase)
Quinupristina-dalfopristina
1.6.1.
-modificação enzimática
Alteração da permeabilidade da membrana
A redução da permeabilidade, que ocorre por perda ou alteração de canais de
porinas, é um mecanismo de resistência importante nas bactérias Gram-negativas. Este
mecanismo pode levar à multirresistência e resulta, normalmente, de mutações
espontâneas seleccionadas pela pressão exercida pelo uso de antibióticos. Contudo,
estas alterações apenas conferem um grau moderado de resistência (Sefton, 2002).
Nos ȕ-lactâmicos a diminuição da permeabilidade actua em conjunto com uma
enzima ȕ-lactamase localizada no espaço perisplásmico. A alteração das porinas facilita
11
Introdução
a hidrólise do antibiótico pela enzima. De uma forma semelhante, a diminuição da
permeabilidade às quinolonas diminui a sensibilidade da bactéria a estes antibióticos
(Moreillon, 2000).
Existem três tipos de porinas principais (OmpA, OmpC e OmpF) e tem-se
relacionado a diminuição da expressão das porinas do tipo OmpF com o aumento da
resistência não só às quinolonas mas também aos ȕ-lactâmicos, tetraciclina e
cloranfenicol (Sáenz, 2004). As porinas podem ser específicas para uma família de
antibióticos. No entanto, no caso do imipenemo e do meropenemo, pertencentes à
mesma classe de ȕ-lactâmicos, não utilizam os mesmos canais de porinas. Assim, uma
estirpe resistente a um agente poderá não ser resistente ao outro (Moreillon, 2000).
As bactérias Gram-positivas, embora não possuam invólucro externo,
conseguem também alterar a permeabilidade da membrana citoplasmática aos
aminoglicosídeos. Podem apresentar resistência intrínseca a concentrações baixas de
aminoglicosídeos e/ou moderadas no caso da estreptomicina (concentrações mínimas
inibitórias entre 62 a 550 μg/ml), sendo que este valor pode ser diminuído com a
utilização da penicilina que facilita a entrada da estreptomicina na célula (Gin e Zhanel,
1996).
1.6.2.
Expulsão activa do antibiótico
O mecanismo de expulsão activa do antibiótico, dependente de energia, é
utilizado pela bactéria para reduzir as concentrações de antibióticos na célula. Estas
bombas de expulsão têm como objectivo expulsar substâncias tóxicas, como os metais
pesados, podendo expulsar os antibióticos conferindo à bactéria resistência (Moreillon,
2000). Algumas bombas são específicas para determinados antibióticos, como por
exemplo a tetraciclina, enquanto outras bombas conseguem expulsar diferentes tipos de
antibióticos. No entanto, as primeiras conferem um nível de resistência mais elevado
que as segundas ao respectivos antibióticos (Sefton, 2002).
No caso da tetraciclina sabe-se que as bactérias resistentes absorvem o agente de
forma tão rápida como as sensíveis, mas diferem na capacidade de o expulsar. Sendo
esta diferença na capacidade de expulsar o antibiótico que define o carácter resistente
das bactérias (Sefton, 2002). Este processo é de igual forma importante em várias
bactérias para a resistência à ciprofloxacina. É também conhecido que o processo é
12
Introdução
mediado por genes localizados em plasmídeos, logo passíveis de serem transferidos,
como é o caso dos genes tet(K) e tet(L) encontrados em Enterococcus spp.,
codificadores de resistência à tetraciclina (Sefton, 2002).
Em estirpes de E. coli resistentes aos ȕ-lactâmicos a expressão das bombas de
expulsão de antibióticos desta família confere fenótipos de multirresistência (Sáenz,
2004). A expulsão activa do antibiótico é, em E. coli, um dos principais mecanismos de
resistência adquirida aos macrólidos (Sáenz, 2004; Poeta, 2006).
1.6.3.
Modificação ou protecção do alvo
Este mecanismo de modificação ou protecção do alvo do antibiótico pode
resultar de dois processos. O primeiro origina uma alteração, devido a uma mutação, do
local específico onde o antibiótico se liga, provocando uma diminuição de afinidade. O
segundo origina a produção de uma proteína que se liga ao local específico onde o
antibiótico actuaria (Sáenz, 2004).
A resistência aos aminoglicosídeos por modificação do alvo traduz-se por
mutações de genes codificadores de proteínas ribossomais que causam essa
modificação. Assim, por exemplo, em enterococos uma mutação no gene rpsL que
codifica uma proteína da subunidade ribossomal 30S, confere resistência à
estreptomicina (Moreillon, 2000; Sefton, 2002). Cada aminoglicosídeo possui um alvo
distinto na subunidade ribossomal 30S, sendo raro observar qualquer tipo de resistência
cruzada entre os distintos antibióticos (Sáenz, 2004).
A resistência à rifampicina, no caso dos enterococos, através deste mecanismo é
devida a uma mutação do gene rpoB que codifica a subunidade ȕ da RNA polimerase
(Moreillon, 2000).
A resistência às sulfonamidas e trimetoprim está dependente deste mecanismo
de modificação do alvo, estando descritas mutações dos genes codificadores das
enzimas dihidropteroato sintetase (DHPS) e dihidrofolato redutase (DHFR) (Sefton,
2002; Sáenz, 2004). No entanto, a aquisição de genes alternativos, transferíveis, é o
mecanismo de resistência mais frequente a estes antibióticos. Foram já caracterizados
mais de 20 genes dfr diferentes que codificam a resistência ao trimetoprim (produzem
variantes da enzima DHFR) e 3 genes sul que codificam a resistência ao sulfametoxazol
em bactérias Gram-negativas (produzem variantes da enzima DHPS), sendo estes genes
13
Introdução
transferíveis mediante a inclusão em integrões, transposões e/ou plasmídeos (Sáenz,
2004).
Estudos realizados em bactérias não produtoras de ȕ-lactamases, de forma ao
mecanismo da inibição enzimática do antibiótico não interferir com o mecanismo de
modificação do alvo, mostraram que as bactérias são capazes de modificar as enzimas
localizadas na membrana plasmática responsáveis pela união do peptidoglicano
(Moreillon, 2000). As enzimas envolvidas nesta união são denominadas de proteínas de
ligação à penicilina (PBP’s), devido à penicilina e derivados serem um análogo dos
precursores do peptidoglicano que se unem às enzimas, bloqueando o seu
prolongamento (Poeta, 2006).
Os enterococos possuem cerca de cinco tipos de PBP’s diferentes. A PBP5
possui uma afinidade natural baixa para os ȕ-lactâmicos sendo que, o determinante
codificador, o gene pbp5 é considerado intrínseco nos enterococos (Rice et al., 2006).
Esta PBP5 faz parte da membrana citoplasmática e é capaz de substituir as funções das
PBP’s de outro tipo, sempre que estas são inibidas pelo uso dos ȕ-lactâmicos (Fontana
et al., 1985). No entanto, a maioria dos isolados clínicos resistentes à penicilina
possuem essa resistência devido, maioritariamente, às mutações que ocorrem na PBP5,
diminuindo a sua afinidade (Williamson et al., 1983). Este tipo de mecanismo descrito
em relação aos ȕ-lactâmicos é mais relevante em bactérias Gram-positivas, do que em
Gram-negativas (Sáenz, 2004).
A modificação do alvo é o mecanismo mais importante na resistência cruzada
aos macrólidos, lincosamidas e estreptograminas (MLS). A resistência resulta da
metilação de uma região conservada do RNAr 23S da subunidade 50S do ribossoma
bacteriano, diminuindo, desta forma, a afinidade, por exemplo, da eritromicina ao alvo.
O gene codificador destas resistências é o erm(B) e, com menor frequência, os genes
erm(A) e erm(C) (Torres, 2002).
De forma semelhante aos macrólidos, os produtos codificados pelos genes
tet(M) e tet(O) ligam-se aos ribossomas impedindo a ligação dos antibióticos ao alvo,
provocando a resistência à tetraciclina (Moreillon, 2000).
A vancomicina é um antibiótico que altera o desenvolvimento da parede celular
das bactérias sendo que a resistência é devida a modificações na referida parede celular
(Bonten et al., 2001). Os enterococos, em geral, sintetizam precursores da parede
celular terminados em D-alanina-D-alanina (D-Ala-D-Ala), que, quando expostos à
vancomicina, se ligam com uma grande afinidade ao antibiótico. Assim, a vancomicina,
14
Introdução
nos enterococos produtores de precursores D-Ala-D-Ala, inibe a síntese do
peptidoglicano (Shepard e Gilmore, 2002). A presença de um indutor, como a
vancomicina, faz com que as estirpes resistentes gerem precursores com diferentes
terminais, como por exemplo o D-Alanina-D-Lactato (D-Ala-D-Lac), que possuem
menor afinidade para a vancomicina sendo a síntese do peptidoglicano assegurada
(Bonten et al., 2001).
O fenótipo VanA, que confere resistência a níveis elevados de vancomicina
(CMI de 64 a •1000μg/ml) e teicoplanina (CMI de 16 a 512 μg/ml), está associado com
a aquisição do gene vanA (Moreillon, 2000; Gold, 2001). Este gene contém um
transposão Tn1546 que codifica 9 polipéptidos diferentes. Estes polipéptidos são o
ORF1, ORF2, VanA, VanR, VanS, VanH, VanY, VanX, VanZ e tanto podem estar
localizados em plasmídeos como no DNA cromossómico. A expressão coordenada de
VanA, VanH e VanX é a chave para resistência das bactérias (Poeta, 2006).
A proteína VanA é uma ligase que catalisa a formação das ligações entre Dalanina e D-lactato, formando os precursores com menor afinidade à vancomicina. A
VanH é uma desidrogenase necessária também para a síntese do D-Ala-D-Lac, pois é
responsável pela produção de D-Lactato. A VanX hidrolisa as ligações D-Ala-D-Ala,
diminuindo, desta forma, a síntese competitiva e a disponibilidade destes precursores. A
transcrição dos genes que codificam estas três proteínas é coordenada e regulada por
VanS e VanR, sendo estas duas últimas proteínas que controlam e regulam os genes de
resistência aos glicopéptidos (Moreillon, 2000; Shepard e Gilmore, 2002; Poeta, 2006).
As proteínas VanY e VanZ, embora não essenciais, promovem um aumento de
resistência à vancomicina e à teicoplanina, respectivamente (Gold, 2001; Shepard e
Gilmore, 2002; Poeta, 2006).
O fenótipo VanB que confere resistência à vancomicina, mas não confere à
teicoplanina, está associado ao gene vanB que por sua vez também pode estar presente
em plasmídeos e no DNA cromossómico. O gene vanB foi encontrado em dois
transposões, Tn1547 e Tn5382, estando o segundo associado também ao transporte de
pbp5. Assim, conforme referido em alguns estudos, o cluster vanB está por vezes
associado a resistência à vancomicina e à ampicilina (Carias et al., 1998; Gold, 2001). O
cluster vanB é funcionalmente similar ao vanA porém difere na sua regulação (Gold,
2001). As estirpes com o fenótipo VanB não são induzidas pela teicoplanina e
apresentam sensibilidade a este antibiótico, enquanto o fenótipo VanA é resistente e
induzido pela vancomicina e pela teicoplanina (Shepard e Gilmore, 2002; Poeta, 2006).
15
Introdução
O fenótipo VanC representa as espécies E. gallinarum (gene vanC1), E. casselifalvus
(gene vanC2) e E. flavescens (gene vanC3) resistentes intrinsicamente à vancomicina
(com CMI ”32μg/ml). De forma diferente das ligases VanA e VanB, as ligases VanC
favorecem a produção de precursores com terminais D-Alanina-D-Serina (D-Ala-DSer), mas a produção dos precursores D-Ala-D-Ala não é diminuída sendo esse o
motivo da CMI mais baixa neste fenótipo. A diferença encontrada na resistência à
vancomicina no fenótipo VanC é explicada pela proporção diferente entre D-Ala-D-Ser
e D-Ala-D-Ala encontrada nas bactérias (Murray, 1998; Cetinkaya et al., 2000).
O fenótipo VanD é caracterizado de forma semelhante aos fenótipos VanA e
VanB. Está associado à resistência à vancomicina (CMI 64 μg/ml) e à teicoplanina
(CMI 4 μg/ml) e está localizado no DNA cromossómico (Poeta, 2006).
1.6.4.
Modificação ou inibição enzimática do antibiótico
Existem bactérias que produzem enzimas as quais podem modificar e inactivar o
antibiótico de forma a destruir a sua actividade antimicrobiana.
As enzimas mais conhecidas, as ȕ-lactamases, hidrolisam as penicilinas e
cefalosporinas sendo estrutural e funcionalmente próximas das PBP’s. Estas enzimas
protegem as bactérias inactivando as penicilinas, através da ruptura do anel ȕ-lactâmico
impedindo, desta forma, a ligação do antibiótico às PBP’s. Existem ȕ-lactamases
específicas, as penicilases e as cefalosporinases. No entanto, quando os genes que
codificam a produção destas enzimas sofrem mutações, as ȕ-lactamases podem tornarse mais eficazes contra penicilinas e cefalosporinas, as ȕ-lactamases de amplo espectro
(BLAE) (Moreillon, 2000).
No caso do cloranfenicol a resistência é devida à produção de enzimas
inactivadoras, cloranfenicol acetiltransferases (codificadas pelo gene catA), que
acetilam a molécula do antibiótico impedindo a união deste com os ribossomas
bacterianos (Sáenz, 2004).
Em E. faecium a virginiamicina acetiltransferase, codificada pelos genes vat(D)
e vat(E), confere resistência à Q/D (Poeta, 2006).
A resistência aos aminoglicosídeos de baixo nível, intrínseca para os
enterococos, através da capacidade de diminuir a entrada dos antibióticos pela
membrana, é também suportada pela presença de genes codificadores de enzimas
16
Introdução
capazes de inactivar estes antibióticos. Este mecanismo de resistência através da acção
de enzimas inactivadoras de aminoglicosídeos, é o de maior importância clínica. As
enzimas nucleotidiltransferases, acetiltransferases e fosfotransferases, impedem a acção
do antibiótico ao torná-lo num metabolito inactivo, resultando em estirpes com valores
muito elevados de CMI, (isto é, estirpes muito resistentes). Uma enzima afecta
diferentes aminoglicosídeos, o que torna o espectro de acção destas enzimas alargado a
muitos membros desta classe de antibióticos (Torres, 2002; Sáenz, 2004).
No caso dos enterococos existem vários genes codificadores de resistência. A
produção de enzimas modificadas ANT(6’) ou ANT(3’), são responsáveis pela
resistência a concentrações elevadas de estreptomicina, enquanto que para a resistência
elevada à gentamicina é necessária a produção da enzima 6’-aminoglicósido
acetiltransferase – 2’’-aminoglicosídeo fosfotransferase [AAC(6’)-Ie-APH(2’’)-Ia]. A
resistência à canamicina e amicacina é interferida pela produção do aminoglicosídeo
fosfotransferase [APH(3’)], promovendo a fosforilação dependente de ATP (Shepard e
Gilmore, 2002; Torres, 2002). Ainda nos enterococos a resistência a aminoglicosídeos
pode ser específica de uma espécie, como por exemplo, a produção de 6’-Naminoglicósido acetiltransferase [AAC(6’)-Ii] codificado pelo gene intrínseco aac(6’),
que confere resistência à tobramicina e à canamicina o qual foi, apenas, detectado em E.
faecium (Shepard e Gilmore, 2002; Torres, 2002).
No caso de E. coli podemos observar outras enzimas modificantes de
aminoglicosídeos que conferem fenótipos de resistência a esta classe de antibióticos,
tais como, a AAC(3)-I, AAC(3)-II, AAC(3)-IV, AAC(6’)-I, APH(3’)-I/II, APH(3’’)-I,
APH(6)-I, ANT(2’’)-I e ANT(3’’)-I (Sáenz, 2004).
Existem ainda outros fenótipos de resistência aos aminoglicósidos, que
partilham deste mecanismo de acção, porém são menos frequentes (Torres, 2002).
17
Introdução
1.7.
Elementos genéticos de aquisição e transferência de genes de
resistência
Existem elementos genéticos que podem conter vários genes de resistência a
diferentes classes de antibióticos conferindo, às bactérias que os possuem, um fenótipo
de multirresistência. A localização dos genes de resistência nestes elementos genéticos
móveis (os plasmídeos, transposões e os genes cassete dos integrões) torna possível a
transferência da resistência (Sáenz, 2004).
1.7.1.
Plasmídeos
Este elemento genético é uma molécula de DNA de cadeia dupla, superenrolada, que possui a capacidade de se auto-replicar. Pode existir apenas uma ou duas
cópias por célula mas, no entanto, quando o plasmídeo é pequeno podem existir mais de
10 cópias. Os plasmídeos são dos elementos genéticos móveis mais importantes porque
facilitam a sobrevivência e propagação da espécie. Possuem no seu interior para além de
genes de resistência, genes da replicação, metabolismo, fertilidade, resistência a
bacteriocinas e/ou bacteriófagos (Sáenz, 2004).
É importante referir que a bactéria não necessita destes elementos genéticos para
sobreviver, sendo que na ausência da pressão dos antibióticos estes podem desaparecer
(Madigan et al., 2000).
Uma das maiores dificuldades da terapêutica no combate às infecções causadas
por bactérias surge devido à transferência dos plasmídeos que possuem genes de
resistência. Estes plasmídeos podem não estar presentes em números expressivos mas,
no caso de haver uma pressão selectiva produz-se uma selecção das estirpes que os
possuem aumentando, desta forma, o seu número. Um único plasmídeo pode conter
vários genes codificadores de resistência e conferir um fenótipo multirresistente à
estirpe onde se insere (Sáenz, 2004).
Os plasmídeos podem, ainda, estar semi-inseridos em outros elementos
genéticos móveis, como integrões e transposões. A obtenção de novas resistências é,
maioritariamente, devida a transferências destes elementos genéticos (Sáenz, 2004).
18
Introdução
1.7.2.
Sequências de inserção e transposões
Estes elementos genéticos fazem parte do cromossoma ou de plasmídeos e são
capazes de se moverem dentro do genoma através de transposição (recombinação
específica). Estes elementos não possuem a capacidade de replicação autónoma e são
parte integrante do genoma de muitas bactérias (Sáenz, 2004).
As sequências de inserção (IS) medem entre 700 pares de base (pb) e 1500 pb e
possuem extremos repetidos inversamente que são reconhecidos pela transposase, a
enzima responsável pela transposição que é codificada por um gene que se localiza na
parte central da IS (Sáenz, 2004).
Os transposões têm um maior tamanho variando entre 2 a 50 kpb, possuem
extremos repetidos inversamente e no centro contêm no mínimo dois genes; um codifica
a transposase e outro, eventualmente, um marcador ou, mais relevante, um gene
codificador de resistência a um antibiótico. A presença de vários transposões num
mesmo plasmídeo é frequente, sendo possível que numa só transferência entre células
bacterianas possa haver a troca de vários genes de resistência (Madigan et al., 2000;
Sáenz, 2004).
1.7.3.
Integrões
Os integrões foram descritos no início dos anos 80 e possuem a informação
genética para codificar uma proteína capaz de integrar ou libertar elementos móveis tais
como os genes de resistência aos antibióticos. Esta proteína, denominada integrase,
integra genes (os genes cassete) nos integrões. Este mecanismo ocorre mediante
recombinação específica e verifica-se que os integrões possuem, também, um promotor
que permite, posteriormente, a expressão dos genes recentemente integrados (Sáenz,
2004).
Os integrões são constituídos por três elementos. O gene intI que codifica a
integrase responsável pela integração dos genes, o sítio onde ocorre a recombinação
específica (attI) e o promotor (P1) que faculta a expressão dos genes integrados. É
possível, por vezes, verificar a existência de dois promotores, sendo que o segundo
apenas incrementa o grau de expressão dos genes integrados (Sáenz, 2004). Podemos
observar um esquema representativo desta estrutura na Figura 3.
19
Introdução
Figura 3: Estrutura de um integrão e integração de um gene no mesmo (adaptado de Sáenz, 2004).
Os genes cassete podem aparecer sob a forma de moléculas circulares de DNA,
mas nos integrões é mais frequente encontrá-los como sequências lineares. Os genes
cassete possuem, geralmente, apenas um gene sendo na sua maioria de resistência a
antibióticos encontando-se na sua extremidade 3’ uma sequência de recombinação
específica (attC). A integrase reconhece esta sequência attC e, através do local receptor
attI, permite tanto a integração dos genes como a sua extracção (Figura 3) (Sáenz,
2004). A ligação attI-attC é mais específica que a ligação attC-attC e assim, quando há
inserção de um novo gene cassete este vai ficar mais perto do(s) promotor(es) do que o
gene cassete mais antigo. O novo gene, como fica colocado mais perto do(s)
promotor(es), vai ter uma maior expressão (Collis e Hall, 1995).
Através da sequência da integrase foi possível diferenciar 9 classes diferentes de
integrões, sendo que apenas as classes 1, 2, 3 e 9 possuem genes cassetes codificadores
de resistência aos antibióticos. No entanto, os integrões de classe 9 apenas possuem o
gene cassete dfrA1, que codifica resistência ao trimetropim (Sáenz, 2004).
Os integrões de classe 1 encontram-se com maior frequência em isolados
clínicos. Esta classe caracteriza-se por possuir duas regiões conservadas, a 5’ onde se
20
Introdução
encontra o gene da integrase (intI) e a 3’ onde se encontram os genes qacEǻ1 e sulI,
associados
às
resistências
a
anti-sépticos
e
à
resistência
a
sulfonamidas,
respectivamente. Possuem ainda um fragmento de leitura, orf513 (Sáenz, 2004).
Identificaram-se até hoje mais de 60 genes de resistência, onde se incluem os
que conferem resistência ao trimetropim (dfr), ao cloranfenicol (cmlA), à estreptomicina
(aadA), entre muitos outros (Sáenz, 2004).
O grande número de genes de resistência e o facto de muitos desses genes se
localizarem em elementos genéticos móveis, com a capacidade, no caso dos integrões,
de adquirirem e excluírem os genes, torna a bactéria num organismo versátil e eficaz,
sendo capaz de se adaptar rapidamente sempre que exista uma pressão selectiva por
parte dos antibióticos.
1.8.
Mutações em gyrA e parC
As quinolonas actuam no sistema de replicação do DNA, inibindo as enzimas
DNA girase e topoisomerases IV. As funções destas enzimas passam por desenrolar o
DNA imediatamente antes da duplicação deste e, subsequente à duplicação, levar as
cadeias novas ao estado inicial de enrolamento. Em Enterococcus spp. as mutações nos
genes gyrA, gyrC e gyrD são relatadas como responsáveis pela resistência às quinolonas
através deste mecanismo, mas na sua maioria a resistência a estes antibióticos está mais
relacionada com mecanismos de resistência derivados da diminuição intracelular da
concentração de antibióticos (Moreillon, 2000; Sefton, 2002).
Em E. coli e outras bactérias Gram-negativas, a resistência às quinolonas tem
como principal alvo a DNA-girase, pelo que as primeiras resistências têm lugar por
mutações produzidas nesta enzima, concretamente no gene gyrA. No entanto, mutações
no gene parC, codificante da topoisomerase IV, proporcionam resistência adicional
(Sáenz, 2004).
Entre as diferentes mutações detectadas no gene gyrA de E. coli, as substituições
no tripleto Ser-83 são as mais frequentemente descritas e caracterizam-se por produzir
níveis de resistência ao ácido nalidíxico. No entanto, a obtenção de níveis de maior
resistência a fluoroquinolonas requer a presença de mutações adicionais, como uma
substituição em Asp-87, a segunda posição mais comummente descrita em gyrA (Sáenz,
2004).
21
Introdução
As mutações descritas no gene parC de E. coli afectam principalmente os
tripletos 80 e 84. Estas mutações, associadas às substituições encontradas no gene gyrA,
conferem altos níveis de resistência a fluoroquinolonas (Vila et al., 1996).
1.9.
Produção de factores de virulência
Os factores de virulência conferem uma vantagem selectiva relativamente às
estirpes que os possuem em comparação com as estirpes comensais que não os
manifestam. Por exemplo, uma estirpe nosocomial que possua uma proteína de
superfície pode colonizar com melhor eficácia o intestino. No caso de doença, se o
indivíduo possuir este tipo de estirpe, o risco de uma infecção acontecer é provável e
elevado. Um exemplo de um factor de virulência com estas características é uma
proteína de superfície, codificada pelo gene esp, que aumenta a capacidade de ligação
da estirpe a superfícies epiteliais (Mundy et al., 2000).
No caso dos enterococos existem diversos factores de virulência que estão mais
relacionados com E. faecalis, como é o caso da citolosina, do factor de agregação, do
superóxido extra-celular e de proteínas de superfície, que podem permitir à bactéria a
ligação a superfícies epiteliais, escapar à resposta imunitária dos indivíduos, colonizar
locais extra-intestinais e, também, aumentar a eficácia na obtenção de nutrientes.
Embora existam outros factores de virulência, estes são os mais investigados. Apesar de
relacionados com E. faecalis, estes factores não são exclusivos e foram já identificados
em outras espécies de enterococos (Mundy et al., 2000; Shepard e Gilmore, 2002; Poeta
et al., 2008a).
No caso de E. coli existem outros factores de virulência tais como as cápsulas
K1 e K5, Į-hemolisina, entre outros que, tal como no caso dos enterococos, para além
de tornarem estas estirpes mais competitivas, aumentam a capacidade destas causarem
doenças (Robbins, 1974; Cavalieri et al., 1984).
1.10. Classificação filogenética de Escherichia coli
E. coli pode ser classificada em 4 grupos filogenéticos diferentes. Os grupos A,
B1, B2 e D. Estes grupos foram descritos através da electroforese de enzimas multilocus
(MLEE) e de “Multilocus Sequence Typing” (MLST) (Clermont et al., 2000).
Actualmente, não é necessário o uso das técnicas referidas e torna-se possível
classificar a estirpe em estudo através de PCR, de uma forma mais simples e rápida.
22
Introdução
Através da combinação de três PCR distintas, o gene chuA (codificador de um receptor
da membrana externa), o gene yjaA (sem função associada conhecida) e um fragmento
de DNA tspE4.C2 pode-se, de forma rápida e em larga escala, classificar as estirpes de
E. coli (Clermont et al., 2000).
O grupo B2 alberga a maioria das estirpes extra-intestinais de E. coli e a maioria
dos factores de virulência extra-intestinais estão concentrados neste grupo. Alguns dos
clones mais virulentos de E. coli, como por exemplo o O18:K1:H7 e o O4:K12:H5,
entre muitos outros, encontram-se neste grupo filogenético (Johnson, 2001a).
O segundo grupo mais comum em infecções extra-intestinais é o grupo D
possuindo um menor número de factores de virulência quando comparado com o grupo
filogenético B2. Alguns dos clones que pertencem a este grupo são o O7:K1:H-, o
O15:K52:H1, entre outros (Johnson, 2001a).
As estirpes pertencentes aos grupos filogenéticos A e B1, são estirpes
tipicamente comensais e, apenas excepcionalmente, são descritas como causa de
infecções extra-intestinais, sendo que nesses raros casos é devido à transferência
horizontal de genes codificadores de virulência (Johnson, 2001a; Johnson, 2001b).
A resistência aos antibióticos não conhece fronteiras e não é um fenómeno novo.
A descoberta dos antibióticos e a sua utilização em terapia anti-infecciosa constituiu um
progresso inquestionável da medicina do século XX no entanto, a falta de medidas
preventivas desde os primeiros casos de resistência antimicrobiana, anteriores à década
de 50, transformou este fenómeno numa realidade difícil ameaçando a população
humana e animal em todo o globo. A descoberta de novas famílias de antibióticos e a
síntese de novos agentes durante várias décadas levou à negligência generalizada
usando
imprudentemente
estes
agentes
conduzindo
a
novas
resistências
antimicrobianas. Actualmente estas resistências atingiram um nível crítico onde o surgir
de novos antibióticos torna-se cada vez mais escasso e os incentivos para o
desenvolvimento de novas drogas também são menores. A resistência antimicrobiana
conduziu ao aumento dos custos dos cuidados de saúde e ameaça aumentar cada vez
mais, os tratamentos de doenças infecciosas tornando-se menos eficazes e conduzindo
ao sofrimento prolongado do indivíduo.
A União Europeia (UE) tomou medidas e tenta adequar novas políticas
destinadas a controlar o fenómeno da resistência. Diversos sistemas de vigilância
nacionais e internacionais estão a decorrer e outros estão a ser desenvolvidos. O
Programa EARSS, financiado pelo ”European Centre for Diseases Prevention and
23
Introdução
Control” da Comissão Europeia, é uma rede internacional de sistemas de vigilância
nacionais, com o objectivo de reunir dados de resistência aos antibióticos relativos a
estirpes bacterianas isoladas de infecções invasivas, sendo esses dados recolhidos por
diferentes países participantes.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) confirmou a emergência e a
propagação da resistência aos antimicrobianos como um problema grave a nível
mundial, afectando tanto os países desenvolvidos como os países em desenvolvimento.
A OMS realizou várias reuniões onde têm sido redigidos diversos documentos onde se
apresentam variadas orientações a seguir para combater o aumento da resistência
antimicrobiana. Estas orientações passam pela (i) vigilância da resistência; (ii) educação
dos prescritores, dos profissionais de saúde e do grande público; (iii) regulamentação
em especial na promoção dos antibióticos pela indústria farmacêutica; (iv) investigação,
sobretudo pelo estudo dos mecanismos de resistência, da sua disseminação e obtenção
de novos agentes actuando sobre novos alvos; (v) prevenção da resistência pelo combate
e prevenção da infecção.
Os níveis de resistência aos antibióticos em Portugal são pouco conhecidos, em
particular no que diz respeito à dinâmica entre a população humana e a animal. É neste
contexto que este trabalho se pretende inserir contribuindo para a avaliação da
resistência antimicrobiana, estudo dos mecanismos que esta resistência apresenta e os
factores que permitem a sua disseminação.
24
2. Objectivos
O conhecimento da origem e transmissão dos genes codificadores de resistência,
na população microbiana global, é essencial para a definição de modelos abrangentes
para a avaliação do ponto de situação e de medidas sustentáveis para o controlo da
resistência antimicrobiana.
As bactérias comensais como Enterococcus spp. e Escherichia coli
colonizadoras do tracto gastrintestinal da maioria dos animais e dos humanos, são
submetidas ao efeito do uso dos antibióticos seleccionando-se estirpes com mecanismos
de resistência.
Os animais, como reservatórios de estirpes resistentes a antibióticos, tornam-se
num problema de saúde pública que necessitam de uma vigilância constante. Esta
vigilância é aconselhada por diversas organizações, como por exemplo a European
Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS). Neste sentido este trabalho
tem por objectivo contribuir para a epidemiovigilância, estudar a taxa de resistência a
antibióticos em isolados fecais de Enterococcus spp. e E. coli de diferentes origens
animais, detectar factores de virulência que os isolados possam conter e analisar os
grupos filogenéticos dos isolados de E. coli. Pretende-se, ainda, verificar se existe uma
relação clonal entre as estirpes produtoras de ȕ-lactamases de amplo espectro de
diferentes origens.
Os objectivos específicos deste trabalho são:
1-
Estudar a colonização por estirpes de Enterococcus spp. resistentes à
vancomicina (VRE), em amostras fecais de diferentes origens animais (suíno
bísaro, suíno comercial e avestruz) a partir de placas com meio de cultura
suplementado com vancomicina:
a.
Fazer a identificação ao nível da espécie das estirpes através de
PCR.
b.
Caracterizar fenotipicamente a resistência a 11 antibióticos
(ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, ciprofloxacina, quinupristina-
25
Objectivos
c.
dalfopristina,
eritromicina,
estreptomicina,
gentamicina
e
canamicina) e geneticamente os mecanismos de resistência.
d.
Caracterizar fenotipicamente e genotipicamente a resistência à
vancomicina e à teicoplanina (glicopéptidos).
2-
Estudar a colonização por estirpes de Enterococcus spp., em amostras
fecais de diferentes origens animais (suíno bísaro, suíno comercial e avestruz) a
partir de placas com meio de cultura não suplementado:
a.
Fazer a identificação ao nível da espécie das estirpes através de
PCR.
b.
Determinar os fenótipos de resistência a 11 antibióticos
(ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, ciprofloxacina, quinupristinadalfopristina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, canamicina,
vancomicina e teicoplanina) e estudar os seus mecanismos de resistência.
3-
Detectar através de PCR factores de virulência em estirpes de
Enterococcus spp. resistentes à vancomicina.
a.
4-
Identificar os genes codificadores de virulência (esp e hyl).
Estudar a colonização por estirpes de E. coli produtoras de ȕ-lactamases
de amplo espectro (BLAE), em amostras fecais de diferentes origens animais
(suíno bísaro, suíno comercial, burro), a partir de placas com meio de cultura
suplementado com cefotaxima:
a.
Caracterizar fenotipicamente a resistência a 16 antibióticos
(cefoxitina,
ceftazidima,
gentamicina,
amicacina,
ciprofloxacina,
ácido
aztreonam,
tobramicina,
nalidíxico,
sulfametoxazol-trimetropim)
e
ampicilina,
imipenemo,
cloranfenicol,
tetraciclina,
eritromicina,
caracterizar
estreptomicina
geneticamente
e
os
mecanismos de resistência.
b.
Caracterizar fenotipicamente e genotipicamente a resistência aos
ß-lactâmicos através da produção das ȕ-lactamases de amplo espectro
(BLAE).
26
Objectivos
5-
Estudar a colonização por estirpes de E. coli em amostras fecais de
diferentes origens animais (suíno bísaro, suíno comercial, burro e javali), a partir
de placas com meio de cultura não suplementado:
a.
Determinar os fenótipos de resistência a 16 antibióticos
(cefoxitina,
ceftazidima,
gentamicina,
amicacina,
ciprofloxacina,
ácido
aztreonam,
tobramicina,
nalidíxico,
ampicilina,
imipenemo,
cloranfenicol,
tetraciclina,
eritromicina,
estreptomicina
e
sulfametoxazol-trimetropim) e caracterizar o mecanismo de resistência.
6-
Detectar através de PCR, factores de virulência nas estirpes de E. coli
produtoras de BLAE e nas que apresentam multirresistência aos antibióticos.
a.
Identificar os genes codificadores de virulência (fimA, aer, papG,
papC e cnf1).
7-
Classificar nos respectivos grupos filogenéticos, através de PCR, as
estirpes de E. coli produtoras de BLAE e as que apresentam multirresistência
aos antibióticos.
8-
Estudar a relação clonal das estirpes de E. coli produtoras de BLAE
através da electroforese de campos pulsados (PFGE).
27
3. Material e Métodos
3.1. Meios de cultura e provas de identificação
3.1.1.
Meios de cultura
Os meios de cultura que foram utilizados no decurso deste trabalho estão a
seguir descritos:
Slanetz-Bartley agar (SB)- Meio selectivo utilizado no isolamento de enterococos.
Composição:
¾
Triptose – 20 g/l
¾
Extracto de levedura – 5 g/l
¾
Glicose – 2 g/l
¾
Fosfato dissódico hidratado – 4 g/l
¾
Azida de sódio – 0,4 g/l
¾
Cloreto de trifeniltetrazólio – 0,1 g/l
¾
Agar – 10 g/l
Eosin Methylene Blue Agar (Levine) – Meio selectivo utilizado para o isolamento de
enterobactérias.
Composição:
¾
Peptona – 10 g/l
¾
Lactose – 10 g/l
¾
Fosfato dipotássico hidrogenado – 2 g/l
¾
Eosina Y – 0,4 g/l
¾
Azul-de-metileno – 0,065 g/l
¾
Agar - 15 g/l
Bain-Heart-Infusion (BHI) – Meio não selectivo utilizado para o crescimento das
bactérias.
Composição:
¾
Cérebro de vitelo – 200 g/l
29
Material e Métodos
¾
Coração de vaca – 250 g/l
¾
Bacto protease peptona – 10 g/l
¾
Bacto dextrose – 2 g/l
¾
Cloreto de sódio – 5 g/l
¾
Fosfato dissódico – 2,5 g/l
¾
Agar – 15 g/l (adicionar caso se pretenda o meio sólido)
Mueller-Hinton agar (MH) – meio utilizado para a determinação da sensibilidade aos
antibióticos.
Composição:
¾
Infusão desidratada de carne de vitelo – 300 g/l
¾
Bacto casamino ácidos – 17,5 g/l
¾
Amido – 1,5 g/l
¾
Agar – 15 g/l
Meio de leite desnatado, desidratado (Skim-milk) – Meio utilizado a 10% para guardar
as estirpes no congelador.
3.1.2.
Provas de identificação
Canamicina-Esculina-Azida agar – Meio muito nutritivo usado para o crescimento e
identificação de enterococos, que degradam a esculina tornando o meio negro.
¾
Peptona de caseína – 20 g/l
¾
Extracto de levedura – 5 g/l
¾
Cloreto de sódio – 5 g/l
¾
Citrato de sódio – 0,1 g/l
¾
Azida de sódio – 0,15 g/l
¾
Sulfato de canamicina – 0,02 g/l
¾
Esculina – 1 g/l
¾
Citrato de amónio de ferro – 0,5 g/l
¾
Agar – 15 g/l
30
Material e Métodos
Meio Triple Sugar Iron (Agar - ferro e triplo açúcar, TSI) – prova de identificação de E.
coli, baseada na capacidade dos microrganismos fermentarem a frutose, a glucose e/ou a
lactose e produzirem gás ou sulfureto de ferro.
Catalase – prova de identificação de Enterococcus spp.. Consiste em adicionar algumas
gotas de água oxigenada a 7% sobre uma porção de bactéria retirada de uma cultura
pura. A presença da enzima catalase é demonstrada pela formação de efervescência.
Indol – prova de identificação de E. coli, composto por um caldo de peptona rico em
triptofano. Na presença da triptofanase, o aminoácido é degradado em NH4+ e indol.
Após 24 horas a 37ºC, adiciona-se umas gotas de reagente Kovac e a reacção positiva
forma um anel vermelho à superfície do meio.
Metil-Red e Voges-Proskauer (MRVP) – provas de identificação de E. coli. O meio é
composto por glicose-fosfato e após inoculação das colónias durante 24 horas a 37ºC a
adição dos respectivos reagentes permite identificar, através da mudança de cor, se a
reacção é positiva ou negativa.
Citrato – prova de identificação de E. coli. Este meio tem como única fonte de energia o
citrato. Após a incubação das bactérias, durante 24 horas a 37ºC, a reacção positiva
implica a mudança de cor do meio de verde para azul.
Ureia - prova de identificação de E. coli. Para se identificar como positivo ou negativo o
teste, verificamos se existe uma mudança de cor no meio devido à hidrólise da ureia.
3.2. Amostras fecais
Avestruz
Recolheram-se 54 amostras fecais de avestruzes (Struthio camelus L.) para
consumo. As amostras fecais correspondem a animais com idade superior a 1 ano, tendo
sido recolhidas em Novembro de 2007 numa exploração do Alentejo. A nenhum dos
animais foi administrado antibióticos nos 4 meses anteriores à recolha das amostras
tendo-se usado apenas uma amostra por animal.
31
Material e Métodos
Suíno comercial
Recolheram-se 30 amostras fecais de suínos (Sus scrofa domestica L.) para
consumo. As amostras fecais correspondem a animais com idades compreendidas entre
as 5 semanas e a idade adulta. As amostras foram recolhidas em Dezembro de 2007
numa exploração do Norte de Portugal e a nenhum dos animais foi administrado
antibióticos nos 4 meses anteriores à recolha das amostras tendo-se usado apenas uma
amostra por animal.
Suíno bísaro
Recolheram-se 35 amostras fecais de suínos de raça bísara (uma raça de suíno
autóctone) para consumo. As amostras fecais correspondem a animais com idades
compreendidas entre as 5 semanas e a idade adulta. As amostras foram recolhidas em
Dezembro de 2007 numa exploração do norte de Portugal e a nenhum dos animais foi
administrado antibióticos nos 4 meses anteriores à recolha das amostras tendo-se usado
apenas uma amostra por animal.
Javalis
Recolheram-se 77 amostras fecais de javali (Sus scrofa scrofa L.) em montarias
e batidas realizadas durante 2006-2007 no Nordeste de Portugal. Apenas foi usada uma
amostra fecal por animal.
Burros
Recolheram-se no Nordeste de Portugal, 13 amostras fecais de burro de Miranda
(uma raça autóctone de Equus asinus L.). As amostras fecais correspondem a animais
adultos e foram recolhidas em Novembro e Dezembro de 2007. A nenhum dos animais
foi administrado antibióticos nos 4 meses anteriores à recolha das amostras tendo-se
usado apenas uma amostra por animal.
3.3. Processamento das amostras
De cada animal (avestruz, burro, suíno comercial, suíno bísaro e javali)
recolheram-se 10g de fezes que, até chegarem ao laboratório, foram mantidas a 4ºC.
Cerca de 2 a 3g de cada amostra foi, posteriormente, diluída em solução salina antes de
ser semeada em placas de agar selectivo para Enterococcus spp. e para E. coli. O
restante de cada amostra guardou-se a temperaturas de congelação. O isolamento das
colónias de Enterococcus spp. e de E. coli, a partir das amostras fecais, foi realizado em
32
Material e Métodos
simultâneo de forma a não congelar/descongelar repetidamente e desnecessariamente as
mesmas amostras.
3.3.1.
Isolamento de Enterococcus spp.
As amostras fecais foram semeadas, através de zaragatoas esterilizadas, em
placas de meio selectivo Slanetz-Bartley (SB) suplementadas com vancomicina (4
μg/ml) e placas não suplementadas com antibiótico. Incubaram-se as placas na estufa
entre 24 horas e 48 horas, a 37ºC. Após sucessivas repicagens de cada uma das placas
de Slanetz-Bartley, escolheu-se, aleatoriamente, uma colónia, presumivelmente de
enterococos, a qual foi repicada para o meio de BHI agar para potenciar o crescimento
exponencial das bactérias.
Após 24 horas, as bactérias foram identificadas por métodos microbiológicos,
bioquímicos e moleculares de forma a distinguir com exactidão as colónias que
correspondiam a enterococos daquelas que se assimilavam fenotipicamente com este
género. Para tal cada isolado foi submetido à coloração pelo método de Gram, prova da
catalase e repicado para meio de canamicina-esculina-azida agar durante 24 horas, a
37ºC. As bactérias com morfologia de cocos em cadeias curtas, Gram-positivas, catalase
negativas e que apresentaram cor negra no meio de canamicina-esculina-azida agar
(devido à hidrólise da esculina) foram identificadas como sendo Enterococcus spp. Por
fim, os enterococos foram guardados em meio de leite desnatado e de seguida
congelado.
Posteriormente foi confirmado através de métodos moleculares a espécie de
Enterococcus spp. a que cada colónia pertencia.
3.3.2.
Isolamento de Escherichia coli
As amostras fecais foram semeadas, através de zaragatoas esterilizadas, em
placas de meio selectivo Levine suplementadas com cefotaxima (2 μg/ml) e placas não
suplementadas com antibiótico. Incubaram-se as placas na estufa entre 24 horas e 48
horas, a 37ºC. Após sucessivas repicagens de cada uma das placas de Levine, escolheuse, aleatoriamente, uma colónia, presumivelmente de E. coli, a qual foi repicada para o
meio de BHI agar para potenciar o crescimento exponencial da bactéria.
Após 24 horas, as bactérias foram identificadas por métodos microbiológicos,
bioquímicos e moleculares de forma a distinguir com exactidão as colónias que
33
Material e Métodos
correspondiam a E. coli daquelas que se assemelhavam fenotipicamente com esta
espécie. Para tal cada isolado foi submetido à coloração pelo método de Gram e aos
testes do indol, vermelho de metilo, “Voges-Proskauer”, TSI, ureia e citrato. As
bactérias com morfologia de bacilos, Gram-negativas, com resultados positivos na
prova do indol e vermelho de metilo, negativos para “Voges-Proskauer”, teste do citrato
e para o teste da ureia e que fermentam a glicose e a frutose com produção de gás, no
teste do TSI, foram identificadas como sendo E. coli. Por fim, os isolados de E. coli
foram guardados em meio de leite desnatado e de seguida congelado.
3.4. Estudo da sensibilidade a antibióticos
3.4.1.
Antibióticos estudados
Foi determinada a sensibilidade aos seguintes antibióticos:
Enterococcus spp.: ampicilina (10ȝg/ml), ciprofloxacina (5ȝg/ml), cloranfenicol
(30ȝg/ml), eritromicina (15ȝg/ml), quinupristina-dalfopristina (Q-D) (15ȝg/ml),
tetraciclina
(30ȝg/ml),
teicoplanina
(30ȝg/ml),
vancomicina
(30ȝg/ml),
e
aminoglicosídeos de elevada carga, estreptomicina (300ȝg/ml), gentamicina (120ȝg/ml)
e canamicina (120ȝg/ml).
E. coli: ampicilina (10ȝg/ml), amoxicilina+ácido clavulânico (20+10ȝg/ml), cefoxitina
(30ȝg/ml), cefotaxima (30ȝg/ml), ceftazidima (30ȝg/ml), aztreonam (30ȝg/ml),
imipenemo (10ȝg/ml), gentamicina (10ȝg/ml), amicacina (30ȝg/ml), tobramicina
(10ȝg/ml), estreptomicina (10ȝg/ml), ácido nalidíxico (30ȝg/ml), ciprofloxacina
(5ȝg/ml), trimetropim-sulfametoxazol (1,25+23,75ȝg/ml), tetraciclina (30ȝg/ml) e
cloranfenicol (30ȝg/ml).
No caso dos antibióticos utilizados em enterococos, os aminoglicosídeos de
elevada carga foram preparados no laboratório a partir de discos estéreis. Todos os
outros antibióticos foram utilizados conforme recomendado pelo CLSI (CLSI, 2007).
Os halos de inibição de cada antibiótico estão dispostos na Tabela 2 e 3, para
Enterococcus spp. e E. coli, respectivamente.
34
Material e Métodos
Tabela 2: Antibióticos usados em Enterococcus spp. e respectivo valor dos halos de inibição (CLSI, 2007).
Antibiótico
Halos de inibição (mm)
Resistente
Intermédio
Sensível
Cloranfenicol
”12
13-17
•18
Tetraciclina
”14
15-18
•19
Teicoplanina
”10
11-13
•14
Q-D
”15
16-18
•19
Vancomicina
”14
15-16
•17
Ciprofloxacina
”15
16-20
•21
Ampicilina
”16
-
•17
Eritromicina
”13
14-22
•23
”6
7-9
•10
Estreptomicina
Gentamicina
Canamicina
Tabela 3: Antibióticos usados em E. coli e respectivo valor dos halos de inibição (CLSI, 2007).
Antibiótico
Halos de inibição (mm)
Resistente
Intermédio
Sensível
Cloranfenicol
”12
13-17
•18
Tetraciclina
”14
15-18
•19
Ácido nalidíxico
”13
14-18
•19
Ciprofloxacina
”15
16-20
•21
Ampicilina
”13
14-16
•17
Tobramicina
”12
13-14
•15
Amicacina
”14
15-16
•17
Gentamicina
”12
13-14
•15
Estreptomicina
”11
12-14
•15
Amoxicilina+ác. clavulânico
”13
14-17
•18
Ceftazidima
”14
15-17
•18
Cefotaxima
”14
15-22
•23
Cefoxitina
”14
15-17
•18
Aztreonam
”15
16-21
•22
Imipenemo
”13
14-15
•16
Trimetropim-sulfametoxazol
”10
11-15
•16
35
Material e Métodos
3.4.2.
Determinação da sensibilidade aos antibióticos pelo método
da difusão em agar
Este método foi realizado pela técnica de Kirby-Bauer e interpretado seguindo as
normas do CLSI (CLSI, 2007).
Preparação do inóculo: semeou-se uma colónia, proveniente de uma placa com
a estirpe pura, em BHI-agar e incubou-se a 37ºC, durante 24 horas. Desta placa,
recolheram-se 3 a 4 colónias para um tubo de ensaio com soro fisiológico esterilizado
(NaCl a 0,9%) até se obter uma turvação de 0,5 da escala de McFarland.
Inoculação da placa: com o auxílio de uma zaragatoa esterilizada, semeou-se a
superfície de uma placa de MH na sua totalidade, de uma forma homogénea. Com uma
pinça, colocaram-se até 6 discos de antibiótico por placa. Incubaram-se as placas de MH
durante 24 horas a 37ºC ao fim do qual se mediram os halos de inibição.
3.4.3.
Determinação fenotípica da produção de ȕ-lactamases de
amplo espectro
Nos isolados de Escherichia coli, para determinar fenotipicamente se a estirpe é
produtora de ȕ-lactamases de amplo espectro (BLAE), colocou-se numa das placas de
Muller-Hilton (MH) os antibióticos ceftazidima, cefotaxima, aztreonam e a
amoxicilina+ácido clavulânico sendo este último colocado no meio dos restantes três
discos. Os discos são colocados a cerca de 2 cm entre eles e a placa incubada durante 24
horas a 37ºC. O fenótipo positivo para produção de BLAE verifica-se quando, junto da
área de interface entre os discos de ceftazidima, cefotaxima e aztreonam com o de
amoxicilina+ácido clavulânico, se observa uma ampliação do halo de inibição
denominada de zona fantasma (“ghost zone”). Esta ampliação do halo deve-se à
inibição das BLAE por parte do ácido clavulânico permitindo a actuação da
amoxicilina, um antibiótico ȕ-lactâmico. Podemos observar na Figura 4 o fenótipo
descrito.
36
Material e Métodos
CAZ
AH
AMC
AH
CTX
ATM
Figura 4: Estirpe com fenótipo positivo para produção de ȕ-lactamases de amplo espectro (imagem do autor). AHAmpliação do halo; AMC- amoxicilina+ácido clavulânico; CAZ- ceftazidima; CTX- cefotaxima; ATM- aztreonam.
3.5.
Reacção em cadeia pela polimerase (PCR)
Para realizar a técnica de PCR foi utilizada a metodologia e material descrito nos
passos seguintes:
3.5.1.
Extracção de DNA
Na extracção de DNA foram realizados dois protocolos diferentes para
Enterococcus spp. e E. coli.
Enterococcus spp.
A extracção foi realizada segundo o protocolo InstaGeneTM Purification Matrix
(Bio-Rad). Suspenderam-se em 1ml de água destilada esterilizada, colocada num
eppendorf, algumas colónias de uma cultura pura, centrifugando de seguida um minuto
a 12.000 rpm. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 200μl de resina de extracção ao
pellet. Ressuspendeu-se o pellet e colocou-se o eppendorf num banho-maria a 56ºC
durante 20 minutos. Após passar no vortex colocou-se num banho a 100ºC durante 8
minutos. Agitou-se novamente no vortex e colocou-se na centrifugadora a 13.000 rpm
durante 3 minutos.
37
Material e Métodos
Após a extracção realizou-se uma medida no espectrofotómetro, medindo a
absorção dos ácidos nucleicos a 260 nm, obtendo a concentração e pureza do DNA, por
comparação com esta medida a 280 nm. Como parâmetros óptimos para a extracção
definimos a absorvância entre 1,90 e 2,00 e a concentração entre 300 e 600 nanogramas
(ng). Guardou-se, finalmente, o DNA extraído a 4ºC.
E. coli
Para E. coli realizou-se um protocolo de extracção mais simples e rápido.
Suspendeu-se uma cultura pura, num eppendorf, com 0,5ml de água destilada
esterilizada. Colocou-se num banho a 100ºC durante 8 minutos, após o qual se agitou
vigorosamente no vortex. Centrifugou-se a 12.000 rpm durante 2 minutos.
Mediu-se num espectofotómetro a concentração e pureza do DNA, definindo
como valores óptimos a absorvância entre 1,80 e 1,90 e a concentração entre 200 e
800ng. Guardou-se o DNA extraído a 4ºC.
3.5.2. Preparação dos tubos de PCR
Cada tubo de reacção da técnica de PCR tem um volume final de 50μl dos
componentes descritos na Tabela 4:
Tabela 4: Componentes e concentrações usadas para a reacção de PCR.
Concentração final da
Componentes
Concentração
Volume por tubo
Primer directo
25μM
1μl
0,5μM
Primer reverso
25μM
1μl
0,5μM
5U/μl
0.3μl
1,5U
BIOTAQ
TM
DNA polimerase
reacção
Tampão de reacção
10X
5μl
1X
MgCl2
50mM
1,5μl
1,5mM
dNTP’s
10mM
1μl
0,2mM
DNA
-
10μl
-
Água miliQ esterilizada
-
Até perfazer 50μl
-
De referir que os primers utilizados foram sintetizados por Sigma-Aldrich, e que
os termocicladores utilizados eram dos modelos Perkin Elmer GeneAmp PCR 2400 e
Biometra T3000. Por fim, foram incluídos em todas as reacções de PCR um controlo
positivo e dois controlos negativos, um deles sem DNA e outro sem primers. Os
38
Material e Métodos
controlos positivos utilizados fazem parte da colecção da Universidade de La Rioja
(Espanha).
3.5.3. Primers e condições de PCR utilizadas
As sequências dos primers, condições de amplificação da reacção de PCR e o
tamanho do fragmento de DNA amplificado em cada caso estão descritos nas tabelas a
seguir organizadas, primeiro para Enterococcus spp. e de seguida para E. coli (Tabelas 5
a 11).
Enterococcus spp.
Tabela 5: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para identificação das espécies de Enterococcus spp.
Primers (sequência 5’ a 3’)
Condições de amplificação
Referência (Banda obtida)
ddl E. faecalis
ATCAAGTACAGTTAGTCT
ACGATTCAAAGCTAACTG
94 ºC
94 ºC
54 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
10’ 1 ciclo
Dutka-Malen et al., 1995
(941 pb)
ddl E. faecium
TAGAGACATTGAATATGCC
TCGAATGTGCTACAATC
94 ºC
94 ºC
54 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
10’ 1 ciclo
Dutka-Malen et al., 1995
(550 pb)
94 ºC
94 ºC
58 ºC
72 ºC
72 ºC
3’ 1 ciclo
30’’
2’ 40 ciclos
2’
6’ 1 ciclo
Dutka-Malen et al., 1995
(822 pb)
94 ºC
94 ºC
58 ºC
72 ºC
72 ºC
3’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
10’ 1 ciclo
Dutka-Malen et al., 1995
(439 pb)
E. hirae (murG)
GGCATATTTATCCAGCACTAG
CTCTGGATCAAGTCCATAAGTGG
94 ºC
94 ºC
60 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
1’
15’’ 30 ciclos
1’ 30’’
7’ 1 ciclo
Arias et al., 2006
(521 pb)
E. durans (mur2)
CGTCAGTACCCTTCTTTTGCAGAGTC
GCATTATTACCAGTGTTAGTGGTTG
94 ºC
94 ºC
60 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
1’
15’’ 30 ciclos
1’ 30’’
7’ 1 ciclo
Arias et al., 2006
(521 pb)
E. gallinarum (vanC1)
GGTATCAAGGAAACCTC
CTTCCGCCATCATAGCT
E. casseliflavus (vanC2-vanC3)
CTCCTACGATTCTCTTG
CGAGCAAGACCTTTAAG
39
Material e Métodos
Tabela 6: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de resistência a antibióticos em
Enterococcus spp.
Primers (sequência 5’ a 3’)
Condições de amplificação
Referência (Banda obtida)
erm(A)
TCTAAAAAGCATGTAAAAGAA
CTTCGATAGTTTATTAATATTAGT
93 ºC
93 ºC
52 ºC
72 ºC
72 ºC
3’ 1 ciclo
1’
1’ 35 ciclos
1’
5’ 1 ciclo
Sutcliffe et al., 1996
(645 pb)
erm(B)
GAAAAGRTACTCAACCAAATA
AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC
93 ºC
93 ºC
52 ºC
72 ºC
72 ºC
3’ 1 ciclo
1’
1’ 35 ciclos
1’
5’ 1 ciclo
Sutcliffe et al., 1996
(639 pb)
erm(C)
TCAAAACATAATATAGATAAA
GCTAATATTGTTTAAATCGTCAAT
93 ºC
93 ºC
52 ºC
72 ºC
72 ºC
3’ 1 ciclo
1’
1’ 35 ciclos
1’
5’ 1 ciclo
Sutcliffe et al., 1996
(642 pb)
tet(M)
GTTAAATAGTGTTCTTGGAG
CTAAGATATGGCTCTAACAA
94 ºC
94 ºC
55 ºC
72 ºC
72 ºC
1’ 1 ciclo
1’
2’ 30 ciclos
2’
10’ 1 ciclo
Aarestrup et al., 2000
(576 pb)
tet(L)
CATTTGGTCTTATTGGATCG
CAATATCACCAGAGCAGGCT
94 ºC
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
1’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
10’ 1 ciclo
Aarestrup et al., 2000
(456 pb)
tet(K)
TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC
GCAAACTCATTCCAGAAGCA
94 ºC
94 ºC
55 ºC
72 ºC
72 ºC
1’ 1 ciclo
1’
2’ 30 ciclos
2’
10’ 1 ciclo
Aarestrup et al., 2000
(697 pb)
vanA
GGGAAAACGACAATTGC
GTACAATGCGGCCGTTA
96 ºC
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
30’’
30’’ 35 ciclos
1’
10’ 1 ciclo
Miele et al, 1995
(732 pb)
vanB
ATGGGAAGCCGATAGTC
GATTTCGTTCCTCGACC
95 ºC
94 ºC
58 ºC
72 ºC
72 ºC
10’ 1 ciclo
30’’
30’’ 30 ciclos
30’’
10’ 1 ciclo
Dutka-Malen et al., 1995
(635 pb)
40
Material e Métodos
Tabela 7: Sequências nucleotídicas dos primers de PCR para genes relacionados com a codificação de factores de
virulência em Enterococcus spp.
Primers (sequência 5’ a 3’)
esp
TTGCTAATGCTAGTCCACGACC
GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA
hyl
GAGTAGAGGAATATCTTAGC
AGGCTCCAATTCTGT
Condições de amplificação
Referência (Banda obtida)
95 ºC
94 ºC
63 ºC
72 ºC
72 ºC
2’ 1 ciclo
45’’
45’’ 30 ciclos
1’
4’ 1 ciclo
Eaton e Gasson, 2001
(955 pb)
94 ºC
94 ºC
80 ºC
72 ºC
72 ºC
4’ 1 ciclo
30’’
30’’ 30 ciclos
30’’
4’ 1 ciclo
Klan et al., 2005
(661 pb)
E. coli
Tabela 8: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de resistência a antibióticos em E.
coli.
Primers (sequência 5’ a 3’)
Condições de amplificação
gyrA
TACACCGGTCAACATTGAGG
TTAATGATTGCCGCCGTCGG
92ºC
92ºC
64ºC
72ºC
72ºC
3’
1 ciclo
25’’
1’
32 ciclos
2’ 50’’
3’
1 ciclo
parC
AAACCTGTTCAGCGCCGCATT
GTGGTGCCGTTAAGCAAA
94ºC
94ºC
55ºC
72ºC
72ºC
3’
1’
1’
1’
3’
aadA
GCAGCGCAATGACATTCTTG
ATCCTTCGGCGCGATTTTG
94ºC
94ºC
60ºC
72ºC
72ºC
5’
1’
1’
1’
8’
cmlA
TGTCATTTACGGCATACTCG
ATCAGGCATCCCATTCCCAT
94ºC
94ºC
55ºC
72ºC
72ºC
5’
1’
1’
1’
7’
Referência (Banda obtida)
Oram and Fisher, 1991
(648 pb)
1 ciclo
30 ciclos
Vila et al., 1996
(395 pb)
1 ciclo
1 ciclo
35 ciclos
Madsen et al., 2000
(282 pb)
1 ciclo
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
41
Sáenz, 2004
(455 pb)
Material e Métodos
Tabela 8 (continuação): Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de resistência a
antibióticos em E. coli.
Primers (sequência 5’ a 3’)
blaTEM
ACGCTCAGTGGAACGAAAAC
TTCTTGAAGACGAAAGGGC
Condições de amplificação
94ºC
94ºC
60ºC
72ºC
72ºC
3’
1 ciclo
1‘
1’ 30 ciclos
1’
10’
1 ciclo
Referência (Banda obtida)
Belaaouaj et al., 1994
(1150 pb)
blaSHV
CACTCAAGGATGTATTGTG
TTAGCGTTGCCAGTGCTCG
96ºC 5’
1 ciclo
96ºC 15‘’
52ºC 15‘’ 24 ciclos
72ºC 2‘
72ºC 5’
1 ciclo
blaOXA1
ACACAATACATATCAACTTCGC
AGTGTGTTTAGAATGGTGATC
96ºC
96ºC
61ºC
72ºC
72ºC
5’
1 ciclo
1’
1’ 35 ciclos
2‘
10’
1 ciclo
Steward et al., 2001
(813 pb)
blaCTX-M9
GTGACAAAGAGAGTGCAACGG
ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC
94ºC 3’
1 ciclo
94ºC 45’’
60ºC 45’’ 35 ciclos
72ºC 45’’
72ºC 10’
1 ciclo
Simarro et al., 2000
(856 pb)
blaCTX-M-3G
GTTACAATGTGTGAGAAGCAG
CCGTTTCCGCTATTACAAAC
94ºC 7’
1 ciclo
94ºC 50’’
60ºC 40’’ 35 ciclos
72ºC 1’
72ºC 5’
1 ciclo
Pagani et al., 2003
(800 pb)
blaCMY
GATTCCTTGGACTCTTCAG
TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC
95ºC 3’
1 ciclo
94ºC 30’’
53ºC 30’’ 30 ciclos
72ºC 30’’
72ºC 3’
1 ciclo
Staplenton et al., 1999
(1800 pb)
CGATGTGCAGTACCAGTAA
TTAGTGACCAGAATCAGCGG
94ºC
94ºC
52ºC
72ºC
72ºC
5’
1 ciclo
30’’
30’’ 35 ciclos
1’
5’
1 ciclo
Batchelor et al., 2005
(585 pb)
ampC
AATGGGTTTTCTACGGTCTG
GGGCAGCAAATGTGGAGCAA
94ºC 3’
1 ciclo
94ºC 1’
57ºC 30’’ 10 ciclos
72ºC 6’
72ºC 10’
1 ciclo
Staplenton et al., 1999
(1800 pb)
blaCTX-MU
42
Pitout et al., 1998
(885 pb)
Material e Métodos
Tabela 8 (continuação): Sequência nucleotídica dos primers de PCR para genes codificadores de resistência a
antibióticos em E. coli.
Condições de
amplificação
Primers (sequência 5’ a 3’)
Referência (Banda
obtida)
sul1
TGGTGACGGTGTTCGGCATTC
GCGAGGGTTTCCGAGAAGGTG
94ºC 5’
1 ciclo
94ºC 30 ‘’
63ºC 30 ‘’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 8’
1 ciclo
Mazel et al., 2000
(789 pb)
sul2
CGGCATCGTCAACATAACC
GTGTGCGGATGAAGTCAG
94ºC 5’
1 ciclo
94ºC 30’’
50ºC 30’’ 30 ciclos
72ºC 1’ 30’’
72ºC 8’
1 ciclo
Maynard et al., 2003
(722 pb)
sul3
CATTCTAGAAAACAGTCGTAGTTCG
CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA
94ºC
94ºC
51ºC
72ºC
72ºC
5’
1’
1’
1’
5’
Perreten and Boerlin,
2003
(990 pb)
93ºC
93ºC
52ºC
72ºC
72ºC
3’
1’
1’
1’
5’
93ºC
93ºC
52ºC
72ºC
72ºC
3’
1’
1’
1’
5’
erm(A)
TCTAAAAAGCATGTAAAAGAA
CTTCGATAGTTTATTAATATTAGT
erm(B)
GAAAAGRTACTCAACCAAATA
AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
1 ciclo
35 ciclos
Sutcliffe et al., 1996a;
1996b
(645 pb)
1 ciclo
1 ciclo
35 ciclos
Sutcliffe et al., 1996a;
1996b
(639 pb)
1 ciclo
tetA
GTAATTCTGAGCACTGTCGC
CTGCCTGGACAACATTGCTT
95ºC 5’
1 ciclo
95ºC 30’’
62ºC 30’’ 23 ciclos
72ºC 45’’
72ºC 7’
1 ciclo
Guardabassi et al., 2000
(937 pb)
tetB
CTCAGTATTCCAAGCCTTTG
CTAAGCACTTGTCTCCTGTT
95ºC 5’
1 ciclo
95ºC 30’’
57ºC 30’’ 25 ciclos
72ºC 20’’
72ºC 7’
1 ciclo
Guardabassi et al., 2000
(416 pb)
tetC
TCTAACAATGCGCTCATCGT
GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC
95ºC 5’
1 ciclo
95ºC 30’’
62ºC 30’’ 30 ciclos
72ºC 30’’
72ºC 7’
1 ciclo
Guardabassi et al., 2000
(570 pb)
43
Material e Métodos
Tabela 9: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos integrões de classe 1 e 2 em E. coli.
Condições de
amplificação
Primers (sequência 5’ a 3’)
Intl1
GGGTCAAGGATCTGGATTTCG
ACATGGGTGTAAATCATCGTC
94ºC 5’
1 ciclo
94ºC 30’’
62ºC 30’’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 8’
1 ciclo
Região variável do integrão de classe 1 (rvintl1)
GGCATCCAAGCAGCAAG
AAGCAGACTTGACCTGA
94ºC
94ºC
55ºC
65ºC
72ºC
qacEǻ1
GGCTGGCTTTTTCTTGTTATCG
TGAGCCCCATACCTACAAAGC
94ºC 5’
1 ciclo
94ºC 30’’
62ºC 30’’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 8’
1 ciclo
IntI2
CACGGATATGCGACAAAAAGGT
GTAGCAAACGAGTGACGAAATG
94ºC 5’
1 ciclo
94ºC 30 ‘’
62ºC 30 ‘’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 8’
1 ciclo
94ºC
Região variável do integrão de classe 2 (rvintI2)
94ºC
CGGGATCCCGGACGGCATGCACGATTTGTA 60ºC
GATGCCATCGCAAGTACGAG
72ºC
72ºC
44
5’
1’
1’
8’
8’
5’
1’
1’
6’
8’
Referência (Banda
obtida)
Mazel et al., 2000
(483 pb)
1 ciclo
Levesque and Roy, 1993
35 ciclos
(variável)
1 ciclo
Mazel et al., 2000
(287 pb)
Mazel et al., 2000
(788 pb)
1 ciclo
White et al., 2001
35 ciclos
(variável)
1 ciclo
Material e Métodos
Tabela 10: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos factores de virulência em E. coli.
Condições de
amplificação
Primers (sequência 5’ a 3’)
papC
GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG
ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA
cnf1
AAGATGGAGTTTCCTATGCAGGAG
CATTCAGAGTCCTGCCCTCATTATT
94ºC 3’ 1 ciclo
94ºC 1’
63ºC 1’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 3’
1 ciclo
94ºC
94ºC
63ºC
72ºC
3’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
72ºC 3’
aer
TACCGGATTGTCATATGCAGACCGT
AATATCTTCCTCCAGTCCGGAGAAG
hly
AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT
ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA
3’ 1 ciclo
1’
1’ 30 ciclos
1’
72ºC 3’
fimA
GTTGTTCTGTCGGCTCTGTC
ATGGTGTTGGTTCCGTTATTC
94ºC
94ºC
55ºC
72ºC
papGIII
CATTTATCGTCCTCAACTTAG
AAGAAGGGATTTTGTAGCGTC
Yamamoto et al., 1995
(602 pb)
Yamamoto et al., 1995
(1177 pb)
Ruiz et al., 2002
(447 pb)
1 ciclo
94ºC 3’ 1 ciclo
94ºC 1’
55ºC 1’ 35 ciclos
72ºC 1’
72ºC 3’
1 ciclo
45
Yamamoto et al., 1995
(498 pb)
1 ciclo
3’ 1 ciclo
1’
1’ 35 ciclos
1’
72ºC 3’
Yamamoto et al., 1995
(328 pb)
1 ciclo
94ºC 3’ 1 ciclo
94ºC 1’
63ºC 1’ 30 ciclos
72ºC 1’
72ºC 3’
1 ciclo
94ºC
94ºC
63ºC
72ºC
Referência (Banda
obtida)
Ruiz et al., 2002
(482 pb)
Material e Métodos
Tabela 11: Sequência nucleotídica dos primers de PCR para o estudo dos grupos filogenéticos em E. coli.
Primers (sequência 5’ a 3’)
Condições de amplificação
94ºC 5’
Referência (Banda obtida)
1 ciclo
chuaA
94ºC 30’’
GACGAACCAACGGTCAGGAT
55ºC 30’’
TGCCGCCAGTACCAAAGACA
72ºC 30’’
30 ciclos
72ºC 7’
1 ciclo
94ºC
5’
1 ciclo
yjaA
94ºC
30’’
TGAAGTGTCAGGAGACGCTG
55ºC
30’’
ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC
72ºC
30’’
30 ciclos
72ºC
7’
1 ciclo
94ºC
5’
1 ciclo
tspE4.C2
94ºC
30’’
GAGTAATGTCGGGGCATTCA
55ºC
30’’
CGCGCCAACAAAGTATTACG
72ºC
30’’
72ºC
7’
30 ciclos
Clermont et al., 2000
(279 pb)
Clermont et al., 2000
(211 pb)
Clermont et al., 2000
(152 pb)
1 ciclo
3.6. Electroforese em gel de agarose
Após realizar a técnica de PCR, os amplicões obtidos foram visualizados através
da electroforese horizontal em gel de agarose.
Para preparar os géis utilizou-se uma concentração de agarose D-1, entre 1% a
2%, em relação ao tamanho dos fragmentos esperados. O tampão utilizado foi o TBE
1X (composto por: TBE 5X: 54g/l Tris (hidroximetil) aminometano; 27,5 g/l ácido
bórico; 20 ml EDTA 0,5M [pH 8]) e brometo de etídio com concentração final de
0,5μg/ml.
Aqueceu-se a mistura até à dissolução da agarose e, de seguida, colocou-se num
suporte com um pente para formar os poços. Após o gel solidificar, depositaram-se os
poços com 10μl do produto PCR junto com cerca de 2μl de tampão de carga (10%
sacarose, 0,0025% azul de bromofenol em TE [10mM Tris (hidroximetil) aminometano,
1mM EDTA pH8]). No primeiro poço de cada gel depositou-se um marcador
molecular, por vezes um amplicão positivo já estudado para o gene em questão ou um
marcador de tamanho escalado.
46
Material e Métodos
A electroforese foi realizada a 96 Volts (V) durante 45 minutos. Para visualizar e
fotografar o gel foi utilizado um aparelho que consiste de um transiluminador de luz
ultravioleta e um capturador de imagem, modelo Image Store 5000, UVP.
3.7. Electroforese em campo pulsado (PFGE)
Todos os isolados produtores de BLAE foram estudados por PFGE para
determinar a possível relação clonal. De seguida, descrevem-se os passos realizados.
Preparação dos insertos: a partir de uma cultura pura em BHI-agar, colocou-se
uma colónia em suspensão em 1ml de tampão SE (75mM NaCl; 25 mM EDTA, pH 8)
até se atingir a absorvância de 1,35 a 610nm. Preparou-se a agarose (Chromosomal
Grade Agarose BioRad) a 1,5% em tampão TE e manteve-se em agitação a 54ºC. De
seguida, misturou-se 0,5ml da suspensão bacteriana com 0,5ml de agarose e repartiu-se
pelos moldes moldes. Deixou-se solidificar 5 a 10 minutos no frigorífico.
Proteólise bacteriana: adicionou-se 3 ml de tampão de proteólise (50mM Tris;
50mM EDTA; 1% sarcosil; 0,1 mg/ml proteinase K, pH 8) a cada inserto e incubou-se
num Banho-Maria a 54ºC, com agitação durante 2 horas.
Lavagens dos insertos: depois de eliminar o tampão de proteólise, fizeram-se
em banho-Maria, com agitação, a 55ºC as lavagens:
a)
10ml de água destilada esterilizada a cada 10 minutos, três vezes.
b)
10ml de TE a cada 10 minutos, duas vezes.
Os insertos foram guardados a 4ºC e podem ser utilizados até o máximo de um
ano após este passo.
Digestão enzimática: de cada isolado preparou-se um inserto no qual foi
utilizada a enzima de restrição XbaI. O volume final do tampão de digestão foi de 100Pl
por tubo ao qual se juntou 40U da enzima XbaI (NewEngland, Biolabs), BSA a 0,01%,
o volume necessário do Tampão 10X de enzima e água destilada esterilizada.
Deixaram-se a incubar os tubos durante 6h, em Banho-Maria, a 37ºC.
Preparação do gel de agarose: preparou-se o gel de agarose (Pulsed Field
Certified Agarose, BioRad) a 1% em TBE 0,5X. VErteu-se a agarose fundida no molde
para fazer o gel, onde se colocou o pente correspondente e deixou-se solidificar à
temperatura ambiente. Encheram-se os poços com os insertos, colocando no primeiro e
último o marcador de tamanho, e fecharam-se com agarose a 50ºC.
47
Material e Métodos
Electroforese: colocou-se numa tina de electroforese de campo pulsado CHEFDR II (BioRad), 2 litros de TBE 0,5X suplementado com tioureia 75μM. Utilizou-se
como gradiente de voltagem de voltagem 6V/cm e manteve-se um pulso de 1 a 30
segundos durante 23 horas a 14ºC.
Coloração do gel e visualização: colocou-se o gel em uma solução aquosa de
200ml de brometo de etídio (10Pl/200ml) durante 10 minutos, lavando, posteriormente,
com água miliQ. Foi visualizado e fotografado no transiluminador ultravioleta e
captador de imagens.
Análise dos padrões de PFGE: os padrões compararam-se e foram
classificados em indistinguíveis, aproximadamente relacionados, possivelmente
relacionados e não relacionados (Tenover et al., 1995).
3.8. Sequenciação
Depois de visualizar o produto de PCR, os amplicões de diferentes genes de
resistência aos antibióticos foram sequenciados. A sequenciação foi realizada através do
uso dos mesmos primers que utilizados para a reacção de PCR. O sistema utilizado foi o
ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) através do serviço de uma
empresa especializada (Genome Express - França).
A análise das sequências obtidas foram realizadas através de diversas
ferramentas alojadas nos links http://molbiol-tools.ca/ e http://www.ebi.ac.uk/ e base de
dados (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) disponíveis na internet, que permitem
obter o alinhamento de sequências, comparar e procurar por possíveis mutações que
possam ter ocorrido.
48
4. Resultados
4.1. Enterococcus spp.
4.1.1.
Isolamento de Enterococcus spp. em placas de Slanetz-Bartley
suplementadas com vancomicina
A partir de um total de 119 amostras fecais (54 de avestruz, 30 de suíno
comercial e 35 de suíno bísaro), semeadas em placas de meio selectivo Slanetz-Bartley
(SB) suplementadas com vancomicina (4 μg/ml), obtiveram-se sete isolados das
amostras de avestruz. Estes constituem 13% dos isolados de avestruz e são
denominados enterococos resistentes à vancomicina (VRE).
Na Figura 5 podemos observar a distribuição das amostras fecais utilizadas no estudo
em função da origem animal.
Avestruz
Porco comercial
29,41%
Porco bísaro
45,38%
25,21%
Figura 5: Distribuição das amostras fecais em função das espécies animais de origem.
Através de métodos moleculares e bioquímicos foram identificados quatro
isolados como E. durans e três como E. gallinarum.
49
Resultados
4.1.2.
Isolamento de Enterococcus spp. em placas de Slanetz-Bartley
não suplementadas com vancomicina
A partir das amostras atrás referidas obtiveram-se 119 isolados (54 de avestruz,
30 de suíno comercial e 35 de suíno bísaro).
A Tabela 12 refere as espécies de enterococos isolados de acordo com cada
origem animal.
Tabela 12: Número e percentagem de espécies de enterococos obtidos nas placas de Slanetz-Bartley não
suplementadas com vancomicina.
Origem animal
Espécies
Avestruz N=54
de
Enterococcus spp.
Suíno
Total N=119
n.º
%
Comercial N=30
n.º
%
Bísaro N=35
n.º
%
n.º
%
E. faecium
14
25,9%
2
6,7%
16
45,7%
32
26,9%
E. faecalis
0
0%
0
0%
0
0%
0
0
E. hirae
31
57,4%
14
46,7%
9
25,7%
54
45,4%
E. durans
0
0%
0
0%
1
2,9%
1
0,8%
E. gallinarum
0
0%
0
0%
1
2,9%
1
0,8%
E. casseliflavus
2
3,7%
0
0%
0
0%
2
1,7%
Enterococcus spp. 7
13%
14
46,7%
8
22,9%
29
24,4%
N- número total de isolados; n- número de isolados de determinada espécie de enterococos; %- percentagem de
isolados.
Dos 54 isolados de avestruz obtidos, 57,4% foram identificados como E. hirae,
25,9% como E. faecium, 3,7% como E. casseliflavus e em 13% não foi possível
identificar a espécie (Tabela 12).
Dos 30 isolados de suíno comercial obtidos, 46,7% foram identificados como E.
hirae, 6,7% como E. faecium e em 46,7% não foi possível identificar a espécie.
Dos 35 isolados de suíno bísaro obtidos, 45,7% foram identificados como E.
faecium, 25,7% como E. hirae, 2,9% como E. durans, 2,9% como E. gallinarum e em
22,9% não foi possível identificar a espécie (Tabela 12).
50
Resultados
Assim, do total de isolados, 45,4% foram identificados como E. hirae, 26,9%
como E. faecium, 1,7% como E. casseliflavus 0,8% como E. durans, 0,8% como E.
gallinarum. De todos os isolados, 24,4% não foram identificados ao nível da espécie.
4.1.3.
Estudo da sensibilidade aos antibióticos nos isolados de
enterococos
4.1.3.1.
Isolados
obtidos
nas
placas
de
Slanetz-Bartley
suplementadas com vancomicina
Os sete isolados VRE obtidos manifestaram fenótipo de resistência à
vancomicina, seis apresentaram resistência à tetraciclina, cinco à eritromicina, quatro à
teicoplanina e dois à ciprofloxacina (Tabela 13).
Tabela 13: Fenótipo de resistência apresentado pelos isolados VRE.
Amostra
Origem
Espécie de
enterococos
Fenótipo de resistência
36 VRE
Avestruz
E. durans
TET, TEI, VAN, ERY
39 VRE
Avestruz
E. durans
TET, TEI, VAN, CIP, ERY
42 VRE
Avestruz
E. durans
TET, TEI, VAN, ERY
47 VRE
Avestruz
E. gallinarum
TET, VAN
49 VRE
Avestruz
E. gallinarum
TET, VAN
52 VRE
Avestruz
E. gallinarum
VAN, ERY
53 VRE
Avestruz
E. durans
TET, TEI, VAN, CIP, ERY
TET- tetraciclina; TEI- teicoplanina; VAN- vancomicina; ERY- eritromicina; CIP- ciprofloxacina.
Três dos isolados apresentaram resistência a dois antibióticos, dois a quatro
antibióticos e outros dois isolados apresentaram fenótipo de resistência a cinco
antibióticos. Os isolados identificados como Enterococcus durans mostraram um
fenótipo multirresistente enquanto os isolados de E. gallinarum foram apenas resistentes
a dois antibióticos (Tabela 13).
51
Resultados
4.1.3.2.
Isolados obtidos nas placas de Slanetz-Bartley não
suplementadas com vancomicina
Dos 54 isolados de avestruz, 35,2% apresentaram fenótipo de resistência à
tetraciclina, 3,7% à eritromicina e apenas, 1,9% à ampicilina, quinupristinadalfopristina, estreptomicina e canamicina (Tabela 14). Todos os isolados de suíno
comercial apresentaram fenótipo de resistência à tetraciclina, 23,3% à eritromicina, 10%
à quinupristina-dalfopristina e 3,3% à gentamicina. Dos 35 isolados de suíno bísaro,
91,4% manifestaram fenótipo de resistência à tetraciclina, 45,7% à eritromicina, 14,3%
à canamicina, 11,4% à estreptomicina e 2,9% à gentamicina. Do total dos isolados,
apenas um isolado de avestruz foi resistente à ampicilina. Nenhum isolado manifestou
resistência à ciprofloxacina, cloranfenicol, teicoplanina e vancomicina. A maioria dos
isolados (68,1%) foi resistente à tetraciclina (Figura 6).
Tabela 14: Resistência fenotipica aos antibióticos nos isolados de enterococos obtidos em placas não suplementadas
com vancomicina.
Isolados de
Isolados de suíno
Total
avestruz
Antibióticos
Comercial N=30
N=54
N=119
Bísaro N=35
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
AMP
1
1,9
0
0
0
0
1
0,8
CIP
0
0
0
0
0
0
0
0
CHL
0
0
0
0
0
0
0
0
ERY
2
3,7
7
23,3
16
45,7
25
21
Q-D
1
1,9
3
10
0
0
4
3,4
TET
19
35,2
30
100
32
91,4
81
68,1
TEI
0
0
0
0
0
0
0
0
VAN
0
0
0
0
0
0
0
0
STR
1
1,9
0
0
4
11,4
5
4,2
GEN
0
0
1
3,3
1
2,9
2
1,7
KAN
1
1,9
0
0
5
14,3
6
5
N- número total de isolados; n- número de isolados resistentes ao antibiótico; %- percentagem de isolados resistentes.
AMP- ampicilina; CIP- ciprofloxacina; CHL- cloranfenicol; ERY- eritromicina; Q-D- quinupristina-dalfopristina;
TET- tetraciclina; TEI- teicoplanina; VAN- vancomicina; STR- estreptomicina; GEN- gentamicina; KANcanamicina.
52
Resultados
100%
80%
60%
Avestruz
Porco comercial
40%
Porco bisaro
20%
0%
AMP CIP CHL ERY Q-D TET TEI VAN STR GEN KAN
Figura 6: Percentagem de resistência aos antibióticos para os isolados de cada origem. AMP- ampicilina; CIPciprofloxacina; CHL- cloranfenicol; ERY- eritromicina; Q-D- quinupristina-dalfopristina; TET- tetraciclina; TEIteicoplanina; VAN- vancomicina; STR- estreptomicina; GEN- gentamicina; KAN- canamicina.
Dos 54 isolados de avestruz, 61,1% foram susceptíveis a todos os antibióticos,
31,5% foram resistentes a um antibiótico e 7,4% tiveram um fenótipo de resistência a
dois antibióticos (Tabela 15). Nenhum dos isolados de suíno comercial foi susceptível a
todos os antibióticos, 73,3% foram resistentes a um antibiótico e 20% foram resistentes
a dois antibióticos. A percentagem de isolados de suíno comercial com fenótipo de
resistência a três ou a quatro antibióticos foi 3,3%. Dos 35 isolados de suíno bísaro,
5,7% são susceptíveis a todos os antibióticos, 42,9% tiveram um fenótipo de resistência
a um antibiótico, 37,1% foram resistentes a dois antibióticos, 8,6% a 3 antibióticos e
5,7% a quatro antibióticos.
Tabela 15: Resistência aos antibióticos nos isolados de diferentes origens.
Isolados de suíno
Isolados de
avestruz
Resistências
Total
Comercial
Bísaro
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
0 antibióticos
33
61,1
0
0
2
5,7
35
29,4
1 antibioticos
17
31,5
22
73,3
15
42,9
54
45,4
2 antibióticos
4
7,4
6
20
13
37,1
23
19,3
3 antibióticos
0
0
1
3,3
3
8,6
4
3,4
4 antibióticos
0
0
1
3,3
2
5,7
3
2,5
n- número de isolados resistentes; %- percentagem de isolados resistentes.
53
Resultados
Os isolados de avestruz não apresentam fenótipos de resistência a mais de dois
antibióticos e os isolados de suíno comercial e suíno bísaro não apresentam a mais de
quatro antibióticos. No total dos isolados, 29,4% foram susceptíveis a todos os
antibióticos, 45,4% foram resistentes a um antibiótico, 19,3% foram resistentes a dois
antibióticos, 3,4% foram resistentes a três antibióticos e 2,5% foram resistentes a quatro
antibióticos (Tabela 15).
4.1.3.3.
Caracterização
genotípica
dos
mecanismos
de
resistência
Estudou-se, nos isolados VRE, os mecanismos de resistência a diferentes
antibióticos. Para determinar os diferentes genótipos de resistência aos glicopétpidos
estudou-se, pela técnica de PCR, a presença dos genes vanA, vanB, vanC1, vanC2 e
vanD. Dos sete isolados VRE, quatro isolados possuíram o gene vanA (7,4% das
amostras fecais de avestruz) e três isolados o gene vanC1 (5,6% das amostras fecais de
avestruz) (Tabela 16).
Posteriormente, caracterizou-se a resistência destes isolados VRE à tetraciclina,
através da presença dos genes tet(M), tet(L) e tet(K), e à eritromicina, através da
presença dos genes erm(A), erm(B) e erm(C). Os seis isolados resistentes à tetraciclina
possuíam o gene tet(M) e os cinco isolados resistentes à eritromicina possuíam o gene
erm(B) (Tabela 16).
Tabela 16: Fenótipos e genótipos de resistências aos antibióticos nos isolados VRE.
Espécie de
Mecanismo de
enterococos
resistência van
Avestruz
E. durans
vanA
TET, TEI, VAN, ERY
erm(B), tet(M)
39 VRE
Avestruz
E. durans
vanA
TET, TEI, VAN, CIP, ERY
erm(B), tet(M)
42 VRE
Avestruz
E. durans
vanA
TET, TEI, VAN, ERY
erm(B), tet(M)
47 VRE
Avestruz
E. gallinarum
vanC1
TET, VAN
erm(B), tet(M)
49 VRE
Avestruz
E. gallinarum
vanC1
TET, VAN
tet(M)
52 VRE
Avestruz
E. gallinarum
vanC1
VAN, ERY
erm(B)
53 VRE
Avestruz
E. durans
vanA
TET, TEI, VAN, CIP, ERY
erm(B), tet(M)
Amostra
Origem
36 VRE
Fenótipo de resistência
TET- tetraciclina; TEI- teicoplanina; VAN- vancomicina; ERY- eritromicina; CIP- ciprofloxacina.
54
Genótipo de
resistência
Resultados
Como podemos observar na Tabela 16, os isolados VRE com resistência à
tetraciclina possuíam o gene tet(M), que modifica a conformação ribossomal e provoca
a consequente resistência. Os isolados VRE resistentes à eritromicina possuíam o gene
erm(B) que codifica uma enzima metilase que actua no local de ligação do ribossoma ao
antibiótico.
4.1.4.
Produção de factores de virulência
Analisou-se nos isolados VRE, através da técnica de PCR, a presença dos genes
codificadores de factores de virulência esp e hyl. O gene esp não foi detectado nos sete
isolados e o gene hyl, codificador da hialuronidase, manifestou-se nos três isolados
VRE da espécie E. gallinarum. Na Figura 7 pode observar-se a imagem do gel de
electroforese com os três isolados VanC1 positivos ao gene hyl.
1
2
3
4
5
6
Figura 7: Imagem do gel de electroforese resultante da amplificação por PCR do gene hyl. Poço 1- isolado 47VRE;
Poço 2-isolado 49VRE; Poço 3- isolado 52VRE; Poços 4 e 5- controlo negativo Poço 6- marcador de tamanho.
55
Resultados
4.2. Escherichia coli
4.2.1.
Isolamento de E. coli em placas de Levine suplementadas com
cefotaxima
A partir de um total de 78 amostras fecais (13 de burro, 30 de suíno comercial e
35 de suíno bísaro), semeadas em placas de meio selectivo Levine suplementadas com
cefotaxima (2 μg/ml) e isolada uma colónia por placa, obtiveram-se 17 isolados (um de
burro, sete de suíno comercial e nove de suíno bísaro). Estes isolados constituem 7,7%
das amostras fecais de burro, 23,3% das amostras de suíno comercial e 25,7% das
amostras de suíno comercial.
Na Figura 8 podemos observar a distribuição das amostras fecais, utilizadas no
estudo em função da origem animal.
Burro
Porco comercial
38,46%
44,87%
Porco bísaro
16,67%
Figura 8: Distribuição das amostras fecais, semeadas em Levine suplementado, em função das espécies de origem.
4.2.2.
Isolamento de E. coli em placas de Levine não suplementadas
com cefotaxima
A partir de um total de 155 amostras fecais (13 de burro, 30 de suíno comercial,
35 de suíno bísaro e 77 de javali), semeadas em placas de meio selectivo Levine,
56
Resultados
obtiveram-se 145 isolados (12 de burro, 29 de suíno comercial, 35 de suíno bísaro e 69
de javali).
Na Figura 9 podemos observar a distribuição das amostras semeadas nas placas
de Levine não suplementadas em função da origem.
22,58%
49,68%
Burro
Porco comercial
Porco bísaro
Javali
19,35%
8,39%
Figura 9: Distribuição das amostras fecais, semeadas em Levine não suplementado, em função das
espécies de origem.
4.2.3.
Estudo da sensibilidade aos antibióticos nos isolados de E. coli
4.2.3.1.
Isolados obtidos nas placas de Levine suplementadas
com cefotaxima
Todos os 17 isolados de E. coli apresentaram fenótipo de resistência à
ampicilina, 15 à tetraciclina, 14 à cefotaxima, 11 à estretpomicina, dois ao aztreonam,
dois ao ácido nalidíxico, um à ciprofloxacina, um ao cloranfenicol e um à
amoxicilina+ácido clavulânico (Tabela 17).
Todos os isolados das placas de Levine suplementadas com cefotaxima são
produtores de ȕ-lactamases de amplo espectro porque apresentaram uma ampliação dos
halos de inibição (ghost zone) entre o disco da amoxicilina + ácido clavulânico e os
restantes ȕ-lactâmicos colocados em redor. A produção destas enzimas foi
57
Resultados
posteriormente confirmada caracterizando o tipo de ȕ-lactamases de amplo espectro que
os isolados produzem (blaCTX-M, blaTEM, blaOXA, blaSHV e blaCMY).
Tabela 17: Fenótipo de resistência aos antibióticos em E. coli obtidas de placas não suplementadas com cefotaxima.
Amostra
Origem
Fenótipo de resistência
B12 BLAE
Burro
AMP;CIP; TET; NAL
PC8 BLAE
Suíno comercial
CTX;AMP;TET
PC9 BLAE
Suíno comercial
CTX;ATM;AMP;TET;STR
PC11 BLAE
Suíno comercial
AMP
PC12 BLAE
Suíno comercial
CTX;AMP;TET
PC17 BLAE
Suíno comercial
CTX;AMP;TET; STR
PC21 BLAE
Suíno comercial
AMC;CTX;AMP;TET; CHL
PC23 BLAE
Suíno comercial
AMP;TET
PB4 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB9 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR; SXT
PB10 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB12 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB14 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB18 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR; NAL
PB19 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB25 BLAE
Suíno bísaro
CTX;AMP;TET; STR
PB26 BLAE
Suíno bísaro
CTX;ATM;AMP;STR
BLAE- ȕ-lactamases de amplo espectro; AMP- ampicilina; CIP- ciprofloxacina; TET- tetraciclina; NAL- ácido
nalidíxico; CTX- cefotaxima; ATM- aztreonam; STR- estreptomicina; AMC- amoxicilina+ácido clavulânico; CHLcloranfenicol; SXT- sulfametoxazol-trimetropim.
Um isolado apresentou resistência a apenas um antibiótico, um foi resistente a
dois antibióticos, dois foram resistentes a três antibióticos, nove foram resistentes a
quatro antibióticos e quatro foram resistentes a cinco antibióticos (Tabela 17).
4.2.3.2.
Isolados
obtidos
nas
placas
de
Levine
não
suplementadas com cefotaxima
Dos 12 isolados de burro, 8,3% apresentaram fenótipo de resistência à
ampicilina e estreptomicina (Tabela 18).
58
Resultados
Dos 29 isolados de suíno comercial, 82,8% apresentaram resistência à
tetraciclina, 17,2% à estreptomicina, 13,8% à ampiciclina e sulfametoxazol-trimetropim
e 3,5% à gentamicina (Tabela 18). Dos 35 isolados de suíno bísaro, 97,1%
manifestaram resistência à tetraciclina, 54,3% à estreptomicina, 37,1% à ampicilina,
14,3% a sulfametoxazol-trimetropim e 5,7% foi o valor obtido para as resistências à
cefoxitina, ácido nalidíxico, ciprofloxacina e cloranfenicol. A percentagem de
resistentes à amoxicilina+ácido clavulânico e ao aztreonam foi de 2,9%. Do total dos
isolados nenhum mostrou resistência à cefotaxima, ceftazidima, imipenemo, amicacina
e tobramicina.
Tabela 18: Resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli.
Isolados de
Antibióticos
Isolados de suíno Isolados de suíno
Isolados de
Burro
comercial
bísaro
Javali
N=12
N=29
N=35
N=69
Total
N=145
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
AMP
1
8,3
4
13,8
13
37,1
18
26,1
36
24,83«
AMC
0
0
0
0
1
2,9
1
1,5
2
1,4
FOX
0
0
0
0
2
5,7
1
1,5
3
2,1
CTX
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CAZ
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
ATM
0
0
0
0
1
2,9
0
0
1
0,7
IMP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
GEN
0
0
1
3,5
0
0
1
1,5
2
1,4
AK
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
TOB
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
STR
1
8,3
5
17,2
19
54,3
6
8,7
31
21,4
NAL
0
0
0
0
2
5,7
11
15,9
13
9
CIP
0
0
0
0
2
5,7
0
0
2
1,4
SXT
0
0
4
13,8
5
14,3
9
13
18
12,4
TET
0
0
24
82,8
34
97,1
30
43,5
88
60,7
CHL
0
0
0
0
2
5,7
0
0
2
1,4
AMP- ampicilina; AMC- amoxicilina+ácido clavulânico; FOX- cefotaxima; CTX- cefotaxima; CAZ- ceftazidima;
ATM- aztreonam; IMP- imipenemo; GEN- gentamicina; AK- amicacina; TOB- tobramicina; STR- estreptomicina;
NAL- ácido nalidíxico; CIP- ciprofloxacina; SXT- sulfametoxazol-trimetropim; TET- tetraciclina; CHLcloranfenicol.
A maioria dos isolados apresentou elevada percentagem de resistência à
tetraciclina (60,7%) e ainda resistências elevadas a outros dois antibióticos: ampicilina
(24,8%) e estreptomicina (21,3%) (Figura 10).
59
Resultados
Como podemos observar na Figura 10 os isolados de suíno bísaro apresentaram
resistência a um maior número de diferentes antibióticos e oito destes possuíam maior
percentagem de resistência que os isolados das restantes origens. Apenas os isolados de
suíno comercial e javali apresentaram resistência à gentamicina.
Burro
Porco comercial
Porco bísaro
Javali
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Figura 10: Resistência aos antibióticos nos isolados de E. coli de diferentes origens. AMP- ampicilina; AMCamoxicilina+ácido clavulânico; FOX- cefotaxima; CTX- cefotaxima; CAZ- ceftazidima; ATM- aztreonam; IMPimipenemo; GEN- gentamicina; AK- amicacina; TOB- tobramicina; STR- estreptomicina; NAL- ácido nalidíxico;
CIP- ciprofloxacina; SXT- sulfametoxazol-trimetropim; TET- tetraciclina; CHL- cloranfenicol.
Dos 12 isolados de burro, 83,3% (10/12) foram susceptíveis a todos os
antibióticos e 16,7% (2/12) resistentes a um antibiótico. Não se detectaram isolados de
burro com resistência a mais que um antibiótico (Tabela 19). Dos 29 isolados de suíno
comercial, 17,2% (5/29) foram susceptíveis a todos os antibióticos, 55,2% (16/29)
resistentes a um antibiótico, 13,8% (4/29) foram resistentes a dois antibióticos, 6,9%
(2/29) foram resistentes a três antibióticos e 6,9% (2/29) foram resistentes a quatro
antibióticos. Não se detectaram isolados de suíno comercial com resistência a mais de 4
antibióticos. Dos 35 isolados de suíno bísaro, apenas um isolado (2,9%) foi susceptível
a todos os antibióticos, 25,7% (9/35) foram resistentes a um antibiótico, 22,9% (8/35)
foram resistentes a dois antibióticos, 28,6% (10/35) foram resistentes a três antibióticos
e 14,3% possuíram resistência a quatro antibióticos. Adicionalmente, 2,3% (1/35) foram
resistentes a seis e sete antibióticos. Não se detectaram isolados de suíno bísaro com
resistência a cinco ou mais de sete antibióticos. Dos 69 isolados de javali, 50,7%
60
Resultados
(35/69) foram susceptíveis a todos os antibióticos, 13% (9/69) foram resistentes a um
antibiótico, 15,9% (11/69) foram resistentes a dois antibióticos, 13% (9/69) foram
resistentes a três antibióticos, 5,8% (5/69) foram resistentes a quatro antibióticos e 1,5%
(1/69) foram resistentes a cinco antibióticos. Não se detectaram isolados de javali
resistentes a mais de cinco antibióticos. No total dos isolados, 35,2% (51/145) foram
susceptíveis a todos os antibióticos, 24,8% (36/145) foram resistentes a um antibiótico e
14,5% (21/145) foram resistentes a três antibióticos. A percentagem de isolados
multirresistentes foi no total 24,2% (35/145) embora, nos isolados de suíno bísaro, este
valor seja de 48,6% (17/35).
Tabela 19: Resistência aos antibióticos nos isolados das diferentes origens.
Isolados de suíno
Isolados de
Burro
Antibióticos
Comercial
Isolados de
Total
Javali
Bísaro
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
n.º
%
0 antibióticos
10
83,3
5
17,3
1
2,9
35
50,7
51
35,2
1 antibioticos
2
16,7
16
55,2
9
25,7
9
13
36
24,8
2 antibióticos
0
0
4
13,8
8
22,9
11
15,9
23
15,9
3 antibióticos
0
0
2
6,9
10
28,6
9
13
21
14,5
4 antibióticos
0
0
2
6,9
5
14,3
4
5,8
11
7,6
5 antibióticos
0
0
0
0
0
0
1
1,5
1
0,7
6 antibióticos
0
0
0
0
1
2,9
0
0
1
0,7
7 antibióticos
0
0
0
0
1
2,9
0
0
1
0,7
n- número de isolados resistentes; %- percentagem de isolados resistentes.
4.2.3.3.
Caracterização
genotípica
dos
mecanismos
de
resistência
Na análise dos isolados de E. coli BLAE procedeu-se com a caracterização dos
mecanismos de resistência a diferentes antibióticos (tetraciclina, cloranfenicol,
estreptomicina, sulfametoxazol-trimetropim e quinolonas) e confirmação do tipo de ȕlactamases de amplo espectro que os isolados produzem pesquisando e sequenciando os
genes blaCTX-M, blaTEM, blaOXA, blaSHV e blaCMY. Através da técnica de PCR realizou-se
o estudo dos genes codificadores dos diferentes mecanismos de resistência aos
61
Resultados
antibióticos ou, como no caso da resistência às quinolonas, pesquisaram-se mutações
que podem levar à respectiva resistência.
Para determinar os diferentes mecanismos de resistência à tetraciclina, pela
técnica de PCR, foi estudada a presença dos genes tetA, tetB e tetC. Para o
sulfametoxazol pesquisaram-se os genes sul1, sul2 e sul3. Para o cloranfenicol analisouse o gene cmlA. No caso das quinolonas pesquisaram-se os genes gyrA e parC e
sequenciaram-se os amplicões obtidos para determinar, por comparação com sequências
tipo (com os números de acesso no GenBank X06373 e M58408, respectivamente), se
existiam mutações que podiam causar a resistência.
Na Tabela 20 pode-se observar os isolados de E. coli BLAE obtidos com os
respectivos fenótipos e mecanismos de resistência a diferentes antibióticos.
Tabela 20: Fenótipos e mecanismos de resistência aos antibióticos detectados nos isolados de E. coli produtoras de
ȕ-lactamases de amplo espectro.
Mecanismo de resistência
Amostra
B12 BLAE
Origem
Burro
Mutações
Fenótipo de resistência
(não ȕ-lactâmicos)
TET
PC9 BLAE Suíno comercial
TET; STR
PC11 BLAE Suíno comercial
-
PC12 BLAE Suíno comercial
TET
detectados
blaCTX-M14;blaTEM1b;tetB
CIP; TET; NAL
PC8 BLAE Suíno comercial
Genes de resistência
blaCTX-M1;tetA
aminoacídicas
gyrA
parC
S83L;D87N S80I
-
-
blaCTX-M1;blaTEM1b;tetA;aadA
-
-
blaCTX-M1
-
-
blaCTX-M1;tetA
-
-
PC17 BLAE Suíno comercial
TET; STR
blaCTX-M1;blaTEM1b; tetA
-
-
PC21 BLAE Suíno comercial
TET; CHL
blaCTX-M1;tetA
-
-
PC23 BLAE Suíno comercial
TET
blaCTX-M1;tetA
-
-
blaCTX-M1;blaTEM1b;tetA;aadA
-
-
PB4 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
PB9 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR; SXT
blaCTX-M1;tetA;aadA
-
-
PB10 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
blaCTX-M1;blaTEM1b; tetA
-
-
PB12 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
blaCTX-M1;aadA
-
-
PB14 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
blaCTX-M1;blaTEM1b;tetA;aadA
-
-
PB18 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR; NAL
blaCTX-M1;blaTEM1b;tetA;aadA
n.d.
-
PB19 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
blaCTX-M1;blaTEM1b;aadA
-
-
PB25 BLAE
Suíno bísaro
TET; STR
blaCTX-M1;blaTEM1b;tetA;aadA
-
-
PB26 BLAE
Suíno bísaro
STR
blaCTX-M1;aadA
-
-
n.d.- não detectada; BLAE- ȕ-lactamases de amplo espectro; CIP- ciprofloxacina; TET- tetraciclina; NAL- ácido
nalidíxico; STR- estreptomicina; CHL- cloranfenicol; SXT- sulfametoxazol-trimetropim; S- serina; L- leucina; Dácido aspártico; N- asparagina; I- isoleucina.
62
Resultados
Dos 17 isolados produtores de ȕ-lactamases de amplo espectro, 94,1% (16/17)
possuíam o gene blaCTX-M-1, dos quais oito se detectaram em conjunto com o gene
blaTEM-1b. Um dos isolados, 5,9% (1/17) possuía o gene blaCTX-M-14 em conjunto com o
gene blaTEM-1b. O gene blaTEM-1b esteve presente em 52,9% (9/17) dos isolados (Tabela
20). Dos 15 isolados com fenótipo de resistência à tetraciclina, 80% (12/15)
manifestaram o gene tetA, 6,7% (1/15) contiveram o gene tetB e 13,3% (2/15) não
continham nenhum dos genes pesquisados. Dos 10 isolados com fenótipo de resistência
à estreptomicina, 90% (9/10) possuíam o gene aadA. O isolado com fenótipo de
resistência ao cloranfenicol não possuía o gene cmlA e o isolado com fenótipo de
resistência ao sulfametoxazol-trimetropim não possuía os genes sul1, sul2 ou sul3.
Dos dois isolados resistentes às quinolonas, o isolado de burro possuía o gene
gyrA com duas mutações que provocam a alterações aminoacídicas (substituição no
tripleto 83 da produção de serina por leucina e no tripleto 87 da produção de ácido
aspártico por asparagina) e o gene parC com uma mutação que causa alteração
aminoacídica (substituição no tripleto 80 da produção de serina por isoleucina). No
isolado de suíno bísaro com fenótipo de resistência ao ácido nalidíxico não foram
detectadas mutações (Tabela 20 e Figura 11).
Figura 11: Comparação da sequência nucleotídica do gene gyrA do isolado de burro com a sequência do gene gyrA
selvagem publicado por Swandberg and Wang, 1987. As mutações, nos tripletos que implicam substituições
aminoacídicas, estão assinaladas a vermelho.
63
Resultados
4.2.4.
Caracterização dos integrões
Analisou-se a presença de integrões de classe 1 e 2 nos 19 isolados de E. coli
com fenótipo de resistência ao sulfametoxazol-trimetropim. Amplificou-se por PCR um
fragmento do gene codificador da integrase do tipo 1 e do tipo 2 (intl1 e intl2,
respectivamente) e observou-se a presença de integrões de classe 1 em 15 (79%) dos
isolados e de integrões de classe 2 em três (15,8%) isolados. Os dois genes
codificadores das integrases foram detectados em simultâneo em dois isolados (um de
suíno bísaro e um de javali).
Os integrões de classe 1, geralmente, possuem uma região conservada 3’ onde se
incluem os genes qacEǻ1 e sul1. Dos 15 isolados que possuem o integrão de classe 1,
12 amplificaram o gene qacEǻ1+sul1.
Nos 16 isolados que amplificaram o gene intl1 e/ou o gene intl2, a região
variável do integrão de classe 1 e 2, respectivamente, foi analisada através de PCR e
posterior sequenciação. Os resultados obtidos estão apresentados nas Tabelas 21 e 22.
Tabela 21: Estudo das regiões variáveis dos integrões de classe 1 em isolados de E. coli resistentes ao
sulfametoxazol-trimetropim.
“Genes cassete” da região
Detecção do gene
variável do integrão de classe 1
qacEǻ1+sul1
Amostras
Suíno comercial:
- PC1; PC6;
dfrA1+aadA1
Suíno bísaro:
+
- PB23; PB28; PB29;
Javali:
- J27; J39; J43; J47; J70; J71
dfrA17+aadA5
Suíno comercial:
+
- PC6
Suíno comercial:
dfrA1
- PC18
-
Javali:
- J36
dfrA12+orfF+aadA2
Suíno bísaro:
-
- PB16
PC- Suíno Comercial; PB- Suíno Bísaro; J- Javali
64
Resultados
Tabela 22: Estudo das regiões variáveis dos integrões de classe 2 em isolados de E. coli resistentes ao
sulfametoxazol-trimetropim.
“Genes cassete” da região
variável do integrão de
Amostras
classe 2
Suíno bísaro:
- PB23
dfrA1+sat1+aadA1
- PB9 BLAE
Javali:
- J71
PB- Suíno Bísaro; J- Javali
Sequenciaram-se quatro tipos diferentes de regiões variáveis do integrão de
classe 1 e apenas um tipo de região variável do integrão de classe 2. Os isolados PB23
de suíno bísaro e J71 de javali possuíam dois integrões, um de classe 1 (dfrA1+aadA1)
e outro de classe 2 (dfrA1+sat1+aadA1) (Tabela 21 e 22).
Dos 15 isolados que possuem integrões de classe 1, 11 manifestaram a região
variável dfrA1+aadA1, dois revelaram a região variável dfrA1, um manifestou a região
variável dfrA17+aadA5 e um revelou a região variável dfrA12+orfF+aadA2 (Tabela
21).
Os três isolados que possuíam integrões de classe 2 revelaram a região variável
dfrA1+sat1+aadA1 (Tabela 22).
Os genes encontrados nas regiões variáveis são responsáveis por resistências aos
antibióticos. Os genes dfrA1, dfrA12 e dfrA17 conferem resistência ao trimetropim. Os
genes aadA1, aadA2 e aadA5 codificam resistência à estreptomicina. O gene sat1
codifica uma acetiltransferase capaz de inactivar a estreptomicina.
4.2.5.
Produção de factores de virulência
Analisou-se, nos isolados BLAE, através da técnica de PCR, a presença dos
genes codificadores de factores de virulência fimA, aer, papGIII, papC, cnf1 e hly.
Dos 17 isolados (um de burro, sete de suíno comercial e nove de suíno bísaro), o
isolado de burro manifestou os genes fimA e aer, os sete isolados de suíno comercial
expressaram o gene fimA e um revelou, igualmente, o gene aer. Os nove isolados de
suíno bísaro revelaram o gene fimA e seis destes possuíam, também, o gene aer. A
65
Resultados
totalidade revelou o gene fimA e o gene aer manifestou-se em 47,1% (6/17) dos
isolados sendo que, os restantes factores de virulência não foram detectados.
4.2.6.
Classificação filogenética de Escherichia coli
Nos 17 isolados de E. coli BLAE realizou-se o estudo da caracterização do
grupo filogenético mediante a técnica de PCR. Dos 17 isolados estudados, 14
pertenceram ao grupo A e três ao grupo B1 (um de burro, um de suíno comercial e um
de suíno bísaro). Todos os isolados estudados pertenceram a grupos filogenéticos
denominados comensais (A ou B1).
4.2.7.
Relação clonal dos isolados de E. coli produtores de
ȕ-lactamases de amplo espectro por electroforese em campo pulsado
A análise por electroforese em campo pulsado (PFGE) dos isolados de E. coli
BLAE está ilustrada na Figura 12. Encontraram-se através da electroforese em campos
pulsados nove padrões de restrição diferentes. O isolado de burro B12 BLAE (linha 2)
mostrou um padrão de restrição que foi designado de A. O padrão do isolado PC8
BLAE encontra-se possivelmente relacionado com o padrão anterior e foi designado por
A1. Os isolados PC12 BLAE, PB10 BLAE, PB14 BLAE, PB18 BLAE e PB25 BLAE
apresentaram o mesmo padrão de restrição denominado de B. Os isolados PB4 BLAE e
PB19 BLAE apresentaram o mesmo padrão de restrição. Este padrão é
aproximadamente relacionado com o padrão B e foi denominado B1 (Figura 12). Os
isolados PC21 BLAE e PB9 BLAE apresentaram padrões de restrição aproximadamente
relacionados denominados C e C1. Nos restantes 6 isolados foram descritos padrões de
restrição individuais denominados D, E, F, G, H e I.
A análise por PFGE dos isolados de E. coli BLAE permitiu identificar vários
padrões de restrição. No entanto, foram descritos isolados de diferentes origens que
possuíam padrões relacionados e/ou semelhantes, como no caso dos padrões A, B e C.
Estes resultados evidenciam um movimento de bactérias entre animais o que por sua
vez leva à transferência de genes de resistência.
66
Resultados
Figura 12: Padrões de PFGE do DNA cromossómico digerido com XbaI, das 17 E. coli BLAE. Poços 1 e 19
– Marcador de tamanho; Poço 2 – Isolado de burro B12 BLAE; Poços 3 a 9 – Isolados de suíno comercial
(PC8 BLAE, PC9 BLAE, PC11 BLAE, PC12 BLAE, PC17 BLAE, PC21 BLAE, PC23 BLAE,
respectivamente); Poços 10 a 18 – Isolados de suíno bísaro (PB4 BLAE, PB9 BLAE, PB10 BLAE, PB12
BLAE, PB14 BLAE, PB18 BLAE, PB19 BLAE, PB25 BLAE, PB26 BLAE, respectivamente).
67
5. Discussão
A relação entre o uso disseminado de agentes antimicrobianos em medicina
humana e veterinária e o desenvolvimento de bactérias resistentes tem sido objecto de
numerosos estudos sobre bactérias patogénicas e comensais que colonizam o tracto
gastrintestinal de seres humanos e animais (Threlfall et al., 1998; Bronzwaer et al.,
2002; McEwen e Fedorka-Cray, 2002). A microflora bacteriana intestinal, submetida ao
stress do consumo de antibióticos, pode ser um reservatório de genes de resistência e
desempenhar um papel importante como dador e receptor destes genes (Davies, 1994;
Salyers et al., 2004; Sunde et al. 1998). Portanto, como Escherichia coli e Enterococcus
spp. são parte integrante da microflora intestinal de humanos e animais (Sunde et al.,
1998) e dada a sua conhecida capacidade de transferir genes de resistência, estas
bactérias podem ser consideradas como "indicadoras" da propagação da resistência.
Neste estudo caracterizaram-se fenotípica e genotipicamente a resistência a
diversos antibióticos em isolados de Enterococcus spp. e de E. coli, recolhidos de
amostras fecais de burros de Miranda, suíno comercial, suíno bísaro, avestruz e javali
bem como, pesquisaram-se factores de virulência e a relação clonal entre as estirpes de
E. coli produtoras de ȕ-lactamases de amplo espectro.
5.1.
Identificação, resistência a antibióticos e factores de virulência nos
isolados de Enterococcus spp. de diferentes origens
Os isolados obtidos neste trabalho pertenceram às espécies E. faecium, E.
durans, E. hirae, E. gallinarum e E. casseliflavus. Não se detectou a espécie E. faecalis.
As espécies encontradas com maior frequência, a partir de placas de Slanetz-Bartley não
suplementadas com vancomicina, foram E. hirae (45,4%) e E. faecium (26,9%). No
entanto, 24,4% dos isolados foram identificados como pertencentes ao género não se
conseguindo identificar as espécies. O suíno bísaro foi a única origem onde os isolados
de E. faecium (45,7%) foram superiores aos de E. hirae (25,7%).
Nos isolados, de placas de meio selectivo suplementado, obtiveram-se sete
isolados dos quais quatro foram identificados como E. durans e 3 como E. gallinarum.
69
Discussão
De acordo com outros autores as espécies detectadas com maior frequência em
amostras de diversos animais de companhia e de humanos são E. faecium, E. faecalis e
E. hirae (Murray, 1990; Devriese et al., 1992; Schouten et al., 1999). Um estudo
realizado por Rodrigues e colaboradores, em 2002 revelou, em amostras fecais de cão e
gato, as espécies E. faecium (58%), E. avium (41%) e E. faecalis (1%). Num estudo
realizado por Klein, em 2003, as espécies mais detectadas em amostras fecais de suínos
e frangos foram E. faecium e E. faecalis sendo E. hirae detectado ocasionalmente. Um
estudo realizado por Poeta e colaboradores, em 2005, com amostras fecais de animais
selvagens revelou a presença com maior frequência de E. faecalis (52,1%) e E. faecium
(32,1%) (Poeta et al., 2005b). Num estudo realizado pelos mesmos autores, em 2006, as
espécies mais detectadas em amostras fecais de humanos foram E. faecium (72,6%) e E.
faecalis (27,4%); em amostras de frangos foram detectadas com maior prevalência as
espécies E. faecalis (60,6%) e E. faecium (35,5%) e, em amostras fecais de animais de
companhia, a maior frequência foi de E. faecium (47,2%), E. faecalis (31,7%) e E. hirae
(21,1%). No entanto, os valores encontrados no nosso estudo apontam para uma
prevalência de E. hirae e E. faecium.
A resistência completa ou relativa aos ȕ-lactâmicos é uma característica do
género Enterococcus (Gin et al., 1996). Deste modo, uma mutação no gene pbp5, pode
aumentar de forma significativa a resistência aos antibióticos ȕ-lactâmicos e poderá
explicar o aparecimento do isolado de avestruz resistente à ampicilina (Poeta et al,
2007b).
Um estudo conduzido em isolados clínicos de humanos descreve que a
ciprofloxacina tem apenas actividade moderada sobre enterococos (Fernandez-Guerrero
et al, 1987). Um estudo realizado em amostras fecais de frangos e de animais de
companhia detectou 12,5% e 8%, respectivamente, dos isolados resistentes à
ciprofloxacina (Poeta et al., 2006). No nosso estudo, obtiveram-se apenas dois isolados
VRE resistentes à ciprofloxacina, ambos identificados como E. durans. Nos isolados
obtidos das placas de Slanetz-Bartley, não suplementado com vancomicina, não foi
detectada resistência à ciprofloxacina.
Neste estudo cerca de 68% e 21% dos isolados foram resistentes à tetraciclina e
eritromicina, respectivamente. O elevado uso da eritromicina em medicina humana e
veterinária pode aumentar o nível da resistência a este antibiótico (Hayes et al., 2003;
Poeta et al., 2007a). A relação apontada entre os genes codificadores da resistência à
70
Discussão
tetraciclina e à eritromicina pode levar a que a pressão selectiva do uso de um
antibiótico favoreça a resistência ao outro (De Leener et al., 2004).
A virginiamicina é um macrólido com estrutura semelhante às estreptograminas
surgindo resistência cruzada entre estes antibióticos (Hayes et al., 2003; Poeta et al.,
2007a). Num estudo realizado por Poeta e colaboradores, em 2006, com amostras fecais
de frangos e de animais de companhia a percentagem de isolados resistentes à
quinupristina-dalfopristina foi de 33% e 15%, respectivamente. Os isolados de avestruz
e suíno comercial com resistência ao antibiótico Q-D detectados neste estudo (1,9%, e
10%, respectivamente) podem ter surgido devido ao uso de virginiamicina como
promotor de crescimento (Poeta, 2006).
Num estudo realizado por Poeta e colaboradores, em 2006, com amostras fecais
de frango, os valores de resistência obtidos aos aminoglicosídeos de elevada carga
foram de 1% para a gentamicina, de 2% para a estreptomicina e de 26% para a
canamicina. No presente trabalho obteve-se resistência à gentamicina em 1,7% dos
isolados, à estreptomicina em 4,2% dos isolados e à canamicina em 5% dos isolados.
Neste estudo foram obtidos sete isolados VRE. Destes isolados, quatro foram
identificados como E. durans e possuíam o mecanismo de resistência vanA (7,4% das
amostras fecais de avestruz), três isolados foram identificados como E. gallinarum
possuindo o mecanismo de resistência intrínseca vanC1 (5,6% das amostras fecais de
avestruz). Num estudo realizado por Poeta e colaboradores, em 2005, com amostras
fecais de aves para consumo obtiveram-se 9,6% de isolados com o mecanismo vanA e
1,3% com o mecanismo vanC1. O facto do nosso estudo apresentar valores inferiores,
no caso do mecanismo vanA, pode ser devido à criação das avestruzes de forma não
intensiva e assim haver um uso mais ponderado de antibióticos o que diminui a selecção
de estirpes resistentes. Estudos efectuados por diversos autores, como por exemplo
Aarestrup e Sorum, demonstram uma diminuição de estirpes com o mecanismo vanA.
Uma investigação desenvolvida na Dinamarca revelou que a proibição da avoparcina
em 1997 foi acompanhada por uma diminuição de estirpes vanA em frangos de 72,7%
em 1995 para 5,8% em 2000 (Aarestrup et al., 2001). Noutra investigação efectuada na
Noruega refere-se que a prevalência de estirpes VRE em amostras fecais de frangos
sofreu uma acentuada diminuição oito anos após a proibição do glicopéptido (Sorum et
al., 2006).
Dos sete isolados VRE, aqueles que apresentaram resistência à tetraciclina
possuíam o gene tet(M) o que vai de acordo com outros estudos realizados em amostras
71
Discussão
fecais de animais para consumo (Aarestrup et al., 2000; Poeta, 2006). Os isolados VRE
que apresentaram resistência à eritromicina, todos eles apresentam o gene erm(B)
consistindo, de igual modo, com os resultados obtidos nos estudos atrás referidos.
Além da resistência a antibióticos investigou-se a presença de dois genes (esp e
hyl) que codificam factores de virulência. Um dos factores mais importantes que pode
contribuir, indirectamente, para a patogenicidade de estirpes de Enterococcus spp. é a
resistência aos antibióticos. No entanto, esta resistência não pode explicar a sua
virulência. Para se tornarem patogénicas as bactérias necessitam expressar factores de
virulência associados com a adesão, invasão, evasão à resposta imunitária e causarem
alterações patológicas (Johnson, 1994).
No nosso trabalho observou-se a presença do gene hyl, codificador da
hialuronidase, em três isolados VRE da espécie E. gallinarum provenientes da avestruz.
Em estudos anteriores realizados em isolados clínicos foi observado uma associação do
gene hyl com estirpes resistentes à ampicilina/vancomicina (Klare et al., 2005). É
importante observar que o gene codificador do factor de virulência foi detectado nos
isolados com o mecanismo intrínseco vanC1 e não estava presente nos isolados com o
mecanismo vanA.
5.2.
Resistência a antibióticos, factores de virulência, grupos filogenéticos
e relação clonal dos isolados de E. coli de diferentes origens
A frequência de resistência à ampicilina entre os isolados de E. coli de burros
(8,3%) foi inferior à encontrada nos isolados de suíno comercial, suíno bísaro e javali
(13,8%, 37,1% e 26,1%, respectivamente). Em diversos estudos realizados com
amostras fecais de frangos e suínos em Espanha, observaram-se percentagens elevadas
de resistência à ampicilina (66% a 72%) (Blanco et al., 1997; Al-Ghamdi et al., 1999;
Teshager et al., 2000). Num trabalho realizado por Sáenz e colaboradores, em 2001,
com amostras fecais de suínos e outros animais, obtiveram-se 29% dos isolados de
suíno resistentes à ampicilina.
Os isolados obtidos neste estudo foram susceptíveis ao imipenemo, amicacina e
tobramicina o que consiste com resultados obtidos num estudo realizado com amostras
fecais de suínos em Espanha (Sáenz et al., 2001).
Neste estudo obteve-se uma percentagem de resistência à gentamicina de 3,5%
nos suínos comerciais e 1,5% nos javalis. Os isolados de burro e de suíno bísaro não
72
Discussão
apresentaram resistência à gentamicina. Estudos realizados em amostras fecais de
suínos mostraram uma percentagem de resistência à gentamicina baixa (7%) (Teshager
et al., 2000; Sáenz et al., 2001).
A frequência de resistência à estreptomicina obtida neste estudo foi de 8,3% nos
burros, 17,2% no suíno comercial, 54,3% em suíno bísaro e 8,7% em javali. Num
estudo realizado em amostras fecais de animais selvagens obtiveram-se valores de
resistência à estreptomicina de 22,3% (Costa et al., 2008). Um estudo realizado por
Poeta e colaboradores, em 2008b, com amostras fecais de gaivotas da Ilha Berlenga
(Portugal) apresentou 63,63% de isolados, produtores de ȕ-lactamases de amplo
espectro, resistentes à estreptomicina. Os isolados de javali obtidos neste estudo
apresentaram valores inferiores, tal como os isolados de burro. Os suínos comerciais e
de raça bísara são animais residentes em explorações, para posterior abate e consumo,
sendo que a maior percentagem de resistência poderá estar associada ao contacto destes
animais com antibióticos.
A percentagem de resistência ao ácido nalidíxico, nos isolados obtidos das
placas sem antibiótico, foi de 5,7% nos isolados de suíno bísaro e 15,9% nos isolados de
javali. A resistência à outra quinolona testada, a ciprofloxacina, foi de 4,6% nos
isolados de suíno bísaro. Um estudo realizado por Teshager e colaboradores, em 2000,
com amostras fecais de suíno apresentou 8% de isolados resistentes à ciprofloxacina.
Num estudo realizado por Sáenz e colaboradores, em 2001 com isolados de suíno, o
valor de resistência à ciprofloxacina foi de 3% e a percentagem de resistência ao ácido
nalidíxico foi de 14%. A percentagem de resistência a estes antibióticos poderá estar
associada ao uso de quinolonas.
Apenas foram obtidos isolados resistentes ao sulfametoxazol-trimetropim de
suíno comercial (13,8%), suíno bísaro (14,3%) e javali (13%). Os valores obtidos são
inferiores aos valores encontrados num estudo realizado em Espanha com amostras
fecais de suínos (Sáenz et al., 2001).
A resistência à tetraciclina, nos isolados obtidos nas placas de Levine não
suplementadas, foi a que atingiu valores mais elevados (82,8% dos isolados de suíno
comercial, 97,1% de suíno bísaro e 43,5% de javali). Os valores encontrados, no nosso
estudo, estão de acordo com outros estudos realizados em amostras fecais de suínos
(Teshager et al., 2000; Sáenz et al., 2001).
Apenas se encontraram isolados resistentes ao cloranfenicol em isolados de
suíno bísaro (5,7%). Os valores encontrados por outros autores em estudos realizados
73
Discussão
com amostras fecais de suíno, em Espanha, são superiores às encontradas no presente
trabalho (Teshager et al., 2000; Sáenz et al., 2001).
A percentagem de multirresistência encontrada no nosso estudo foi de 13,1% em
suíno comercial, 48,6% em suíno bísaro e 20,3% em javali. Um estudo realizado em
Espanha com amostras fecais de suínos encontrou multirresistência em 35% dos
isolados (Sáenz et al., 2001).
Nas placas de Levine suplementadas com antibiótico obtiveram-se a partir de 78
amostras fecais (13 de burro, 30 de suíno comercial e 35 de suíno bísaro), 17 isolados
(um de burro, sete de suíno comercial e nove de suíno bísaro). Estes isolados
apresentaram fenótipo positivo de produção ȕ-lactamases de amplo espectro (BLAE),
correspondendo a 7,7% das amostras fecais de burro, 23,3% das amostras fecais de
suíno comercial e 25,7% das amostras fecais de suíno bísaro. Um estudo realizado com
amostras fecais de animais selvagens detectou 16% de isolados de E. coli produtores de
ȕ-lactamases de amplo espectro (Costa et al., 2006). Um trabalho realizado com
amostras fecais de gaivotas da Ilha Berlenga (Portugal) apresentou 19,3% de isolados de
E. coli BLAE (Poeta et al., 2008b). Num estudo realizado em isolados clínicos de
humanos detectaram 1,4% de E. coli BLAE (Brinãs et al., 2005b). Um trabalho
realizado com amostras fecais de suínos, em meio de Levine suplementado com
cefotaxima a 1μg/ml obteve 36% de isolados BLAE e em meio suplementado com 8
μg/ml obteve 13% (Moreno et al., 2007). Num estudo realizado em Portugal com
amostras fecais de cães e gatos obteve-se 5,33% de isolados BLAE (Costa et al., 2004).
O gene blaTEM foi detectado em 9 dos 17 isolados BLAE (um de burro, dois de
suíno comercial e seis de suíno bísaro), e após sequenciar o amplicão obtido por PCR
foi identificado como blaTEM-1b. Esta ȕ-lactamase foi encontrada por diversos autores
em animais (Brinãs et al., 2005a; Costa et al., 2006). O isolado de burro além do gene
blaTEM-1b possuía também o gene blaCTX-M-14. Os restantes 16 isolados possuíam o gene
blaCTX-M-1. Os genes blaCTX-M-14 e blaCTX-M-1 detectados no nosso estudo foram
analisados por outros autores estando a sua presença identificada em isolados fecais de
animais selvagens, de frangos e outros animais (Brinãs et al., 2003; Brinãs et al., 2005a;
Costa et al., 2006; Poeta et al., 2008b).
Dos 17 isolados BLAE obtidos, 15 apresentaram um fenótipo de resistência à
tetraciclina. Destes 15 isolados, o gene tetA foi detectado em 12 e o gene tetB em um
isolado. O mecanismo de resistência à tetraciclina através de bombas de efluxo é o mais
abundante em bactérias Gram-negativas, encontrando-se os genes tetA e tetB, como
74
Discussão
codificadores de resistência a este agente, mais frequentemente em isolados de E. coli
(Costa et al., 2008).
Dos 10 isolados com fenótipo de resistência à estreptomicina, nove apresentaram
o gene aadA. Este resultado encontra-se de acordo com estudos efectuados por outros
autores em amostras fecais de animais selvagens (Costa et al., 2006; Costa et al., 2008;
Poeta et al., 2008b).
O isolado de burro, resistente ao ácido nalidíxico e à ciprofloxacina, possuía o
gene gyrA com mutações no tripleto 83 e 87 que provocam alterações aminoacídicas
(serina por leucina e ácido aspártico por asparagina, respectivamente) e o gene parC
com uma mutação no tripleto 80 que causa alteração aminoacídica (serina por
isoleucina). As mutações encontradas nestes genes foram descritas por outros autores,
sendo as mais frequentes (Sáenz, 2004). As mutações no gene gyrA, no caso do tripleto
83 conduzem à incapacidade de formar as pontes de hidrogénio. A substituição no
tripleto 87 implica a perda de um aminoácido carregado negativamente. O conjunto
destas duas mutações é importante na interacção da quinolona com o complexo
DNAgirase-DNA. A substituição no tripleto 87 do gene parC provoca a perda da
capacidade para formar pontes de hidrogénio. Estas mutações descritas confirmam que
as proteínas GyrA e ParC apresentam uma estrutura e comportamento similar frente à
acção das quinolonas (Sáenz, 2004).
A presença de integrões com genes cassete que conferem resistência a
antibióticos aumenta a frequência de estirpes bacterianas multirresistentes. No nosso
estudo encontrámos 15 isolados que continham um integrão de classe 1, três isolados
apresentaram um integrão de classe 2 e dois isolados possuíam integrões das duas
classes. As diferentes organizações de genes cassete detectadas foram já descritas por
outros autores em estudos com amostras fecais de frangos e de alimentos (Sáenz, 2004).
Os integrões de classe 1 possuem geralmente na região conservada 3’ os genes qacEǻ1
e sul1, sendo a ausência destes genes descrita com frequência diminuta (Sáenz, 2004;
Grape et al., 2005; Sunde, 2005). No nosso estudo, em três dos isolados que possuíam o
integrão de classe 1 não foram detectados os genes qacEǻ1 e sul1. Em 2 desses isolados
a região variável do integrão de classe 1 possuía o gene cassete dfrA1 e uma continha os
genes dfrA12+orfF+aadA2. Esta região variável sem a parte conservada 3’ foi descrita
por outro autor num estudo realizado com isolados obtidos de produtos alimentares
(Sunde, 2005).
75
Discussão
Os isolados que possuíam o integrão de classe 1 apresentaram, maioritariamente,
(11 dos 15) a região variável dfrA1+aadA1, dois isolados manifestaram a região
variável dfrA1, um isolado apresentou a região variável dfrA17+aadA5 e outro isolado
manifestou a região variável dfrA12+orfF+aadA2. A região variável dfrA1+aadA1 foi
a mais frequente no nosso estudo o que consiste com estudos realizados por outros
autores em isolados de amostras fecais de frangos e produtos alimentares (Sáenz, 2004;
Sunde, 2005). As outras regiões variáveis do integrão de classe 1 detectadas foram,
igualmente, descritas noutros trabalhos (Sáenz, 2004; Sunde, 2005).
Os isolados onde foram detectados integrões de classe 2 apresentaram a região
variável composta pelos “genes cassete” dfrA1+sat1+aadA1. Esta região variável
encontra-se descrita por diversos autores e é a estrutura principal descrita para esta
classe de integrões (Sáenz, 2004; Sunde, 2005). Podemos verificar, pelos resultados
obtidos, que a resistência à estreptomicina e ao sulfametoxazol-trimetropim encontra-se
nos genes incluídos nos integrões o que lhes confere uma maior capacidade de
disseminação.
Escherichia coli é uma das maiores causas de infecção bacteriana. Na maioria
dos casos as estirpes potencialmente patogénicas estão presentes na flora entérica e o
potencial patogénico é dependente da presença de factores de virulência (Tiba et al.,
2008). Os isolados de E. coli BLAE estudados, no nosso estudo, apresentaram o gene
codificador de virulência fimA e em quase 50% destes foi detectado o gene aer. Estes
resultados são similares ao estudo realizado por Ruiz e colaboradores, em 2002 em
amostras clínicas, onde o gene fimA e o gene aer foram os mais detectados. No entanto,
estes autores, ao contrário do revelado pelo nosso estudo, também descreveram os
outros genes codificadores de factores de virulência, onde o gene cnf1 foi detectado em
cerca de 60% das estirpes, o gene sat em cerca de 25%, o gene papC em cerca de 55% e
o gene papGIII em cerca de 15%. Outro tipo de factor de virulência fimbriae (fimH) foi
detectado em isolados clínicos, exibindo um valor percentual superior ao de outros
factores de virulência (Tiba et al., 2008). A percentagem de factores de virulência em
isolados clínicos é maior que nas estirpes comensais isoladas no nosso estudo.
Os grupos filogenéticos de E. coli denominados como A, B1, B2 e D baseiam-se
em sequências de DNA utilizadas como determinantes. As estirpes que foram
identificadas nos grupos A e B1 são associadas a bactérias comensais não causadoras de
infecções extra-intestinais. As estirpes enquadradas nos grupos B2 e D estão associadas
a bactérias implicadas em infecções extra-intestinais, mais patogénicas (Clermont et al.,
76
Discussão
2000). No nosso estudo, dos 17 isolados de E. coli BLAE, 14 foram identificadas como
pertencente ao grupo A e três ao grupo B1. A prevalência de estirpes isoladas em
amostras fecais de animais saudáveis, pertencentes aos grupos A e B1 (tipicamente
comensais) foi mostrada por diversos autores (Baldy-Chudzik e Stosik, 2007). Em
isolados clínicos a percentagem de estirpes pertencentes aos grupos B2 e D é maior
(Johnson, 2001).
A multirresistência aos antibióticos em estirpes de E. coli intestinais, de animais
e de alimentos de origem animal, acarreta a preocupação destas estirpes serem um
reservatório de genes de resistência com a possibilidade da transferência destes a outras
bactérias do ecossistema intestinal dos animais ou a transferência bidireccional entre
animais e humanos. Demonstrar a transferência de bactérias resistentes entre animais ou
entre animais e humanos é algo delicado. Para determinar a transferência de bactérias
estuda-se a sua relação clonal, entre os isolados de diferentes origens (Sáenz, 2004).
Donabedian e colaboradores, em 2003, demonstraram a difusão de estirpes bacterianas
resistentes à gentamicina de animais para humanos através dos alimentos, mediante o
estudo da relação clonal das estirpes e dos determinantes genéticos de resistência ao
referido antibiótico. No nosso estudo estudaram-se os 17 isolados de E. coli produtores
de ȕ-lactamases de amplo espectro (BLAE) e através da electroforese em campos
pulsados obtiveram-se nove padrões diferentes. O padrão “B” possui isolados de
diferentes origens, designadamente suíno comercial e suíno bísaro. Os isolados do
padrão “C-C1”, foram descritos como aproximadamente relacionados e provêm de
origens diferentes, suíno comercial e suíno bísaro. Os isolados do padrão “A-A1” foram
descritos como possivelmente relacionados e provêm de origens diferentes, burro e
suíno comercial, contendo o gene blaCTX-M14 e o gene blaCTX-M1, respectivamente.
Baseados nos padrões de PFGE detectados podemos observar que as bactérias
portadoras dos genes codificadores de ȕ-lactamases de largo espectro podem ter sido
transferidas, no caso do suíno bísaro, entre animais diferentes e até entre espécies
animais diferentes, como no isolado de suíno comercial com o padrão “B”. A possível
relação entre o isolado de burro e de suíno comercial com o padrão “A” apoia,
igualmente, a provável transferência de bactérias e genes codificadores de resistência a
antibióticos entre os animais.
77
6. Conclusões
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram a presença de estirpes
comensais de Enterococcus spp. e E. coli de animais, com perfis de resistência distintos
a vários agentes antimicrobianos e com genes codificadores de virulência.
Desta forma, é imperativo monitorizar as espécies de enterococos e E. coli
multirresistentes a antibióticos, tal como é muito importante avaliar o papel de animais
para consumo humano e animais selvagens como reservatórios destas bactérias com
genes codificadores de resistência. Este tipo de investigações deve, ainda, incluir
animais autóctones para se conseguir uma percepção deste problema a nível endémico
caracterizando o papel destes animais como reservatórios de estirpes multirresistentes.
Deste modo, como principais conclusões, podemos referir:
1. Em Enterococcus spp.
1.1.
A detecção de percentagens moderadas de colonização por VRE, com
genótipo vanA (7,4%) e genótipo vanC1 (5,6%), de amostras fecais de avestruz,
em Portugal. As percentagens de colonização, por VRE, observadas em
amostras fecais de suíno comercial e bísaro foram nulas. A detecção dos
isolados VRE nas amostras de avestruz, 11 anos depois da proibição da
avoparcina, implica a necessidade de considerar outros factores de selecção de
bactérias VRE.
1.2.
Os isolados VRE de avestruz apresentaram, quase sempre, resistência
associada a outros antibióticos, especialmente, tetraciclina e eritromicina. Estes
antibióticos são utilizados frequentemente em medicina humana e veterinária.
1.3.
Os diferentes níveis de resistência observados, nos isolados obtidos
aleatoriamente das amostras fecais dos animais, permitiram discernir diferenças
que podem ser um reflexo da diferente pressão selectiva exercida pelos
antibióticos nos distintos grupos de animais.
1.4.
O gene hyl, codificador de um factor de virulência, foi detectado nos
isolados VRE com o genótipo vanC1. Não se detectou a presença do gene
codificador de virulência esp nos isolados VRE.
1.5.
A existência de estirpes comensais de Enterococcus spp., de animais
destinados ao consumo humano, com fenótipo de multirresistência é um
79
Conclusões
problema de saúde pública devido à possível transferência, dos genes que
conferem a respectiva resistência, a humanos. No entanto, os mecanismos de
resistência e os genes que a codificam, assim como os que estão associados a
factores de virulência, necessitam de investigação aprofundada de forma a
estudar, em pormenor, a epidemiologia da resistência e da patogenicidade.
1.6.
É importante investigar a especificidade de cada espécie do género
Enterococcus spp. em relação ao hospedeiro. Para isto, é fundamental aumentar
o número de animais analisados, pertencentes à mesma espécie. Só com o
aumento no número de indivíduos estudados é que se poderá realizar uma
análise mais precisa sobre a referida especificidade das espécies de enterococos.
2. Em Escherichia coli
2.1.
A detecção de E. coli produtora de ȕ-lactamases de amplo espectro nos
isolados de burro (7,7%), de suíno comercial (23,3%) e de suíno bísaro
(25,7%).
2.2.
A detecção de ȕ-lactamases de amplo espectro do tipo CTX-M e TEM
nos isolados de burro (1 isolado com CTX-M-1 e TEM-1b), de suíno comercial
(sete isolados com CTX-M-1 dos quais dois possuíam também TEM-1b) e
suíno bísaro (nove isolados com CTX-M-1 dos quais seis possuíam TEM-1b).
2.3.
Em 70,6% dos isolados BLAE detectaram-se susceptibilidade reduzida a
dois ou três antibióticos observando-se, em todos, resistência à tetraciclina. A ȕlactamase do tipo CTX-M-14 detectada no isolado de burro estava associada
com a resistência às quinolonas onde foram detectadas mutações nos genes
gyrA (no tripleto 83 acarretando a troca aminoacídica de serina por leucina e no
tripleto 87 trocando ácido aspártico por asparagina) e parC (no tripleto 80
procedendo à troca aminoacídica de serina por isoleucina).
2.4.
Os 17 isolados BLAE apresentaram, quase sempre, resistência a outros
antibióticos, especialmente, tetraciclina, estreptomicina e sulfametoxazoltrimetropim.
2.5.
Os diferentes níveis de resistência observados, nos isolados obtidos
aleatoriamente das amostras fecais dos animais, permitiram discernir diferenças
(como uma maior percentagem de resistência à tetraciclina, ampicilina,
estreptomicina e sulfametoxazol-trimetropim) que podem ser um reflexo da
80
Conclusões
diferente pressão selectiva exercida pelos antibióticos nos distintos grupos de
animais.
2.6.
A maioria dos isolados de E. coli resistentes ao sulfametoxazol-
trimetropim apresentam “genes cassete” incluídos em integrões de classe 1 e/ou
classe 2, detectando-se uma diversidade na organização genética destes. A
inclusão de genes de resistência em integrões favorece a co-selecção através do
uso de diferentes antibióticos, o que pode explicar o surgir do fenómeno das
multirresistências.
2.7.
Foi identificada a presença de genes codificadores de factores de
virulência nos isolados BLAE. O gene fimA foi confirmado em todos os
isolados e o gene aer manifestou-se em seis dos 17 isolados BLAE.
2.8.
Todos os isolados pertenceram aos grupos filogenéticos A e B1,
tipicamente comensais.
2.9.
A análise por PFGE reflectiu alguma diversidade clonal sendo
identificados nove padrões diferentes entre os isolados BLAE. No entanto, foi
observada a presença de padrões relacionados e/ou semelhantes entre isolados
de indivíduos da mesma espécie animal e entre isolados de indivíduos de
diferente origem animal.
O estudo da evolução da resistência a antibióticos em “bactérias indicadoras”,
como Enterococcus spp. e E. coli, de diferentes ecossistemas permitiu detectar
variações na resistência a determinados antibióticos ou a emergência de novos
mecanismos que a codificam. Assim, é necessário continuar a realizar este tipo de
monitorização em diferentes animais, realçando a importância de incluir animais
selvagens visto estes últimos estarem em menor contacto com o Homem e no caso de
manifestação de resistência aos antibióticos por parte das bactérias da flora intestinal
poderemos verificar o nível de disseminação deste fenómeno.
A União Europeia (UE), por si só, desenvolveu em apenas quatro anos (19992002) projectos de combate à resistência antimicrobiana no valor de 50 milhões de
euros. Estes projectos actuaram em diferentes áreas estratégicas e tiveram diferentes
aproximações ao problema em questão. As acções prioritárias identificadas foram
divididas em quatro áreas-chave onde se complementa a recomendação específica
relativa à utilização prudente de agentes antimicrobianos. As acções foram as seguintes:
81
Conclusões
a vigilância e a cooperação internacional, a prevenção, a investigação e o
desenvolvimento de produtos.
A Comissão da União Europeia realça a importância de desenvolver redes
coordenadas de vigilância a nível Europeu encorajando a participação de países não
pertencentes à UE de forma a melhorar a recolha de dados sobre o consumo de
antibióticos e assim promover a cooperação internacional neste problema. Neste sentido
a Comissão propôs a aplicação das seguintes estratégias: (i) investir em campanhas
educacionais dirigidas a profissionais e ao público em geral e assim, através da
consciencialização, evitar a utilização excessiva e indevida de agentes antimicrobianos;
(ii) certificar que os antibióticos estão apenas disponíveis na medicina humana e
veterinária após prescrição de profissionais; (iii) promover programas de prevenção de
infecções; (iv) eliminação da utilização dos antibióticos como promotores de
crescimento; (v) desenvolver testes, de diagnóstico e susceptibilidade rápidos e fiáveis;
e (vi) encorajar o desenvolvimento de novos antibióticos, vacinas e tratamentos
alternativos.
Actualmente, os custos estimados para o desenvolvimento de um novo
antibiótico são de 500 milhões de euros, mas os investimentos nesta indústria têm sido
bastante inferiores o que constitui um obstáculo ao acesso de novos agentes eficazes.
Como resultado ao longo dos últimos anos foram escassas as descobertas de novas
classes de antibióticos. Assim torna-se imperativo recorrer a todas as outras medidas
apresentadas de forma a combater a resistência antimicrobiana. É neste sentido que este
trabalho foi realizado sendo todos os dados obtidos neste tipo de estudo importantes
para estabelecer políticas de uso prudente de antibióticos tanto em animais como em
humanos.
82
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