o UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS­GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA BRUNO MOTTA OLIVEIRA COMPORTAMENTO KILLER EM LEVEDURAS ASSOCIADAS À FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO MOSTO DA CANA­DE­AÇÚCAR DE PRODUTORES DE CACHAÇA DE ALAMBIQUE DA BAHIA. Feira de Santana, BA 2009
BRUNO MOTTA OLIVEIRA COMPORTAMENTO KILLER EM LEVEDURAS ASSOCIADAS À FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO MOSTO DA CANA­DE­AÇÚCAR DE PRODUTORES DE CACHAÇA DE ALAMBIQUE DA BAHIA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós­Graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro (UESC) Co­orientadores: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa (UFMG); Profa. Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes (CPqLMD/Fiocruz­AM) Feira de Santana, BA 2009
Aos meus pais, Leonel Marcos Oliveira e Margareth Rose Motta Oliveira, que não mediram esforços para sempre oferecer uma educação de qualidade a mim e meus irmãos. Em especial, ao meu filho Leonel Lucas, benção divina em minha vida.
AGRADECIMENTOS À Deus que sempre tem iluminado meus caminhos nos momentos mais difíceis, mostrando­me que o amor, a paz interior e a simplicidade são a base para uma vida plena e feliz. À Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro, pelos ensinamentos, orientação, confiança e por muitas vezes surpreender­me com palavras de conforto e atenção capazes de me incentivar nos momentos mais difíceis, mostrando­me ser muito mais que uma orientadora de pesquisa. Ao Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto, por ter confiado em mim quando mais precisei, pelos ensinamentos em pesquisa e por ser um exemplo de cientista capaz, empreendedor, dinâmico e ao mesmo tempo simples e sempre disposto a ajudar. Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), pela co­orientação, cepas de leveduras cedidas e valiosas contribuições para análise do trabalho. À Profa. Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes do Centro de Pesquisa Leônidas Maria Deane (CpqLMd) da Fiocruz­AM, pela co­orientação e gentil cessão das nove cepas de leveduras killer correspondentes às classes K1 a K9. Aos amigos e colegas do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da UEFS, pelo companheirismo e contribuições de ordem técnico­científica: Carla Pinheiro Ribeiro, Marcielle Santos Silva, José Valadares Neto, Paulo Ricardo, Getúlio, Rita, Íris, Ivana, Fabíola, Isabella, Jacqueline Miranda, e às técnicas Berlene e Luciana. À Helton, pelos serviços de extrema eficiência prestados na secretaria do Programa de Pós­Graduação em Biotecnologia UEFS/FIOCRUZ­BA. Aos professores e colegas do curso de Pós­Graduação em Biotecnologia, pela contribuição no meu desenvolvimento pessoal e profissional, especialmente ao Prof. Dr. Antônio Azeredo pelas excelentes aulas e aos amigos (as) Cléber Miranda Gonçalves, Alice Ferreira da Silva, Catiane Sacramento Souza, Bruno Silva Andrade e Carlos Eduardo Cordeiro. Aos meus pais Leonel e Margareth e meus irmãos Vinicius e Priscilla pelo constante apoio, incentivo, sábios conselhos de vida e por oferecer todas as condições necessárias para que eu finalizasse este estudo, principalmente, amor e “aconchego de família”.
Às minhas avós Zeza e Luzi pelo exemplo de força, honestidade, dignidade e amor a vida. À minha querida namorada, amiga, noiva e agora esposa e mãe, Aline Monteiro S.S. Oliveira, por toda a compreensão, confidências, apoio, paciência e palavras de incentivo que me deram e dão forças para seguir em frente sempre confiante. À FAPESB pela concessão da bolsa ITEC­3 (BOL0022/2008) vinculada ao projeto de pesquisa “BPF e Seleção de leveduras da fermentação da cachaça visando o melhoramento biotecnológico do seu processo produtivo na Bahia e seleção de linhagens boas produtoras de bioetanol” aprovado via edital sob número de outorga PET0024/2007. Aos membros da banca, Dra. Fernanda Badotti e Dra. Márcia Luciana Cazzeta, pelas sugestões e correções.
“Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos. Fazer ou não fazer algo só depende de nossa vontade e perserverança.” (Albert Einstein)
RESUMO A cachaça de alambique ou artesanal, produzida por fermentação espontânea, geralmente exibe variabilidade química e sensorial a cada produção por consequência, principalmente, do processo fermentativo ser conduzido por diversas espécies e linhagens de leveduras propagadas durante o preparo do fermento natural ou “pé­de­cuba”. A manifestação da atividade killer , caracterizada pela produção de toxinas letais a outras leveduras com ação mediada por parede celular, é uma das características desejáveis em um fermento iniciador selecionado para fermentações industriais. A utilização de leveduras killer pode evitar e inibir contaminantes, proporcionando vantagem competitiva e maior padronização e eficiência do processo fermentativo. Este trabalho teve como objetivo verificar o comportamento killer em leveduras isoladas de fermentações espontâneas para produção de cachaça de alambique no estado da Bahia e identificá­las. Dentre os 324 isolados de sete destilarias, que tiveram a atividade killer investigada em meio ágar YEPD­MB, 51 (16%) demonstraram atividade a 25 °C e pH 4,0. Entre estes, 16 demonstraram ação letal sobre 12 de 20 leveduras isoladas da fase inicial das fermentações, com ausência de atividade killer e bioquimicamente identificadas como Saccharomyces cerevisiae. Somente um isolado identificado como S. cerevisiae apresentou atividade killer sobre uma levedura pertencente ao grupo das identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae. Estes 17 isolados killer foram caracterizados através da análise da sequência do domínio D1/D2 do 26S rDNA como S. cerevisiae. O padrão de sensibilidade killer (KSP), obtido pela submissão de cada um dos 51 isolados de levedura killer frente à ação letal de nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9, associou os isolados com a destilaria de origem e discriminou­os em 13 distintos biótipos. Os 17 isolados de S. cerevisiae foram discriminados em sete distintos biótipos killer ou linhagens. Os resultados indicam que, quanto ao comportamento killer , estas linhagens são boas candidatas a culturas starter para produção de cachaça de alambique, principalmente em suas regiões de origem, pois podem evitar e inibir o crescimento de leveduras contaminantes em fermentações com temperatura controlada. Palavras­chave: Cachaça de alambique. Fermentação alcoólica. Levedura killer . Aplicação biotecnológica.
ABSTRACT The “cachaça” (The Brazilian sugarcane spirit), produced by spontaneous fermentation, is a beverage that generally exhibits chemical and sensory variability in each production as a consequence, mainly, of the fermentation process being conducted by various species and strains of yeasts propagated during the preparation of natural yeast or "pé­de­cuba". The expression of killer activity, which is characterized by production of lethal toxins to other yeasts with action mediated by cell wall, is a desirable characteristic in selected initiator yeast for industrial fermentations. The use of yeast killer can prevent and inhibit contaminants, and it can provide competitive advantage and greater standardization and efficiency of the fermentation process. This study aimed to verify the killer behavior in yeasts isolated from spontaneous fermentation for production of “cachaça” in the State of Bahia and identify them. Among the 324 isolates of seven distilleries, which were investigated in the killer activity using agar YEPD­MB, 51 (16%) showed activity at 25°C and pH 4.0. Among these, 16 showed lethal action on 12 of 20 yeasts isolated from the initial phase of fermentation, with no killer activity and identified biochemically as Saccharomyces cerevisiae. Only one isolate identified as S. cerevisiae showed killer activity again one yeast belonging to the group of the biochemically classified in non­S. cerevisiae. These 17 killer isolates were identified by analyzing the sequence of the D1/D2 domain of 26S rDNA as S. cerevisiae. The killer sensitivity pattern (KSP), obtained by the submission of each 51 isolates front lethal action of the nine killer reference yeast belonging to the classes K1 to K9, associated the isolates to the distillery of origin and distinguish them in 13 distinct biotypes. The 17 isolates of S. cerevisiae were separated into seven different killer biotypes or strains. The results indicate that, as the behavior killer, these strains are good candidates for starter cultures for production of “cachaça”, especially in their regions of origin, since they can prevent and inhibit the growing of contaminant yeasts in fermentations with controlled temperature. Keywor ds: “Cachaça”. Alcoholic fermentation. Killer yeast. Biotechnological application.
LISTA DE FIGURAS Figura 01 Expressão de toxina baseada no sistema de replicação dos “vírus” de RNA dupla fita em células de leveduras killer . Fonte: Magliani et al. (1997)............................................................................................................ . Figura 02 Mecanismos genéticos, de secreção e de ação das toxinas K1, K2 e K28 de S. cerevisiae. Fonte: Magliani et al. (1997).............................................. 32 35 Figura 03 Mecanismo de formação da toxina K1 de S. cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002)................................................................................................... 37 Figura 04 Mecanismo de ação da toxina K1 de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002)................................................................................... 38 Figura 05 Fluxograma da metodologia geral realizada neste trabalho.......................... 45 Figura 06 Mapa do estado da Bahia destacando suas Mesorregiões e os municípios onde estão localizadas as sete destilarias em que foram realizadas as coletas............................................................................................................ 46 Figura 07 Fotos de dornas em diferentes fases da fermentação do mosto da cana­de­ açúcar (Tin., Tint. e Tfinal) em que as coletas das amostras foram realizadas....................................................................................................... 50 Figura 08 Fotos de etapas da realização do teste para determinação da atividade killer .............................................................................................................. 51 Figura 09 Fluxograma para determinação da atividade killer...................................... 52 Figura 10 Estrutura de DNA ribossomal (rDNA). Fonte: adaptado de VILGALYS LAB, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm................. 57 Figura 11 Iniciadores (primers) para amplificação da subunidade maior do DNA ribossomal (LSU 25­28S)............................................................................. 58 Figura 12 Atividade killer positiva: presença de zona clara de inibição em volta do isolado inoculado em forma de ponto, delimitada por halo adjacente de células coradas em azul................................................................................. 65 Figura 13 Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados D1­1 a D1­ 11, inoculados em forma de ponto sobre Candida glabrata Y­55 ATCC90525 previamente semeada sobre o meio ágar YEPD­MB.............. 72 Figura 14 Dendograma gerado com o método UPGMA baseado no índice SM, utilizando os dados de sensibilidade dos 51 isolados de levedura killer às nove leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9..................... 83
Figura 15 Distribuição dos 13 distintos biótipos, representativos dos 51 isolados de levedura killer , ao longo das três fases do ciclo fermentativo de cada uma de suas cinco destilarias de origem............................................................... 87 Figura 16 Produtos da PCR referente às 38 leveduras selecionadas, submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1X, 5V/cm, 1,5 hrs, corado com brometo de etídio e fotografados pelo sistema de fotodocumentação Edas 290 (Kodak).......................................................... 88 Figura 17 Árvore filogenética dos 17 isolados de levedura killer identificados molecularmente como Saccharomyces cerevisiae, obtida por análise de neighbour­joining (modelo de Kimura dois parâmetros) do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA...................................................................... 94
LISTA DE TABELAS Tabela 01 Classificação das leveduras killer , baseada nos padrões de atividade e sensibilidade às toxinas................................................................................. 28 Tabela 02 Bases genéticas para a expressão de toxinas killer em leveduras................. 31 Tabela 03 Correlação das bases genéticas de toxinas, seus receptores e mecanismos de ação de sistemas killer das espécies de leveduras mais estudadas. Fonte: Marquina et al. (2002)........................................................................ 34 Tabela 04 Principais aplicações descritas das leveduras killer e suas respectivas toxinas. Fonte: Marquina et al. (2002) ......................................................... 42 Tabela 05 Leveduras integrantes do grupo “S” – identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação (T0) e que não apresentaram fenótipo killer ................................................. 53 Tabela 06 Leveduras integrantes do grupo “NS” – identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae. Dados de temperatura (°C) e °Brix do mosto em fermentação no momento em que foram coletadas................. 54 Tabela 07 Leveduras de referência correspondentes a nove distintas classes de leveduras killer .............................................................................................. 55 Tabela 08 Número de isolados de leveduras, submetidas à determinação do fenótipo killer , por destilaria (DEST) e seus municípios de origem............. 60 Tabela 09 Dados de coleta (°Brix, Temperatura, Horário e pH), referentes ao mosto da cana­de­açúcar em fermentação, em cada dorna pertencente às sete distintas destilarias (DEST 1 a DEST 7)....................................................... 61 Tabela 10 Percentual de isolados com fenótipo killer por destilaria e sua distribuição de acordo com as fases da fermentação alcoólica......................................... 67 Tabela 11 Características do mosto da cana­de­açúcar (°Brix, pH e temperatura), origem de isolamento (fase da fermentação, dorna, tempo e colônia) e identificação bioquímica de cada isolado de levedura killer associado às fermentações realizadas em cinco das sete distintas destilarias investigadas................................................................................................... 70 Tabela 12 Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados................... 74 Tabela 13 Ação dos 51 isolados killer , sobre leveduras identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação e que não apresentaram atividade killer (Grupo S)............. 77
Tabela 14 Ação dos 51 isolados killer , sobre leveduras identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae (Grupo NS)........... 80 Tabela 15 Padrão de sensibilidade killer (KSP) de cada um dos 51 isolados de levedura killer encontrados, frente às nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9................................................... 82 Tabela 16 Caracterização molecular das 38 leveduras escolhidas para identificação, baseada em análises da sequência do domínio D1/D2 do gene 26S do DNA ribossomal............................................................................................ 90 Tabela 17 Discriminação intra­específica, através dos distintos KSPs, dos 17 isolados de levedura killer identificados como S. cerevisiae por meio de análise das sequências da região D1/D2 da subunidade (26S) do rDNA..... 92
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 14 2 2.1 2.2 OBJ ETIVOS.................................................................................................. ... OBJETIVO GERAL....................................................................................... OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 16 16 16 3 3.1 3.1.1 3.2 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................. CACHAÇA DE ALAMBIQUE.................................................................... Importância econômica da cachaça............................................................. LEVEDURAS, FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA E QUALIDADE DA CACHAÇA DE ALAMBIQUE..................................................................... Utilização de leveduras selecionadas........................................................... O FENÔMENO KILLER................................................................................ Toxinas killer .................................................................................................. Bases genéticas e mecanismos de ação......................................................... O fenômeno killer em Saccharomyces cerevisiae......................................... Padr ão de sensibilidade killer : Utilização na biotipagem de levedur as.... Aplicações biotecnológicas do sistema killer ............................................... LEVEDURAS KILLER E A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA................ 17 17 19 21 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS............................................................................................... Determinação do pH, temper atura e °Brix do mosto da cana­de­açúcar em fer mentação............................................................................................ Preser vação das leveduras isoladas............................................................ Manutenção e r eativação das cultur as de levedur a.................................. AMOSTRAGEM PARA OS TESTES DE COMPORTAMENTO KILLER PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER.............................................. Teste para determinação das atividade killer ............................................ Influência da temper atura sobr e a atividade killer das leveduras........... AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS...... DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN ­ KSP) DAS LEVEDURAS KILLER.... CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LEVEDURAS...................... Obtenção de biomassa e extração de DNA genômico................................ Amplificação do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA........................... Pur ificação e sequênciamento dos produtos da PCR................................ Análises das sequências................................................................................ Análise filogenética........................................................................................ 45 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS............................................................................................... 60 3.2.1 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.4 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.5 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.6.4 4.6.4.1 5 5.1 24 26 28 30 35 39 41 42 46 48 48 49 49 50 50 52 53 54 56 56 57 59 59 59 60
64 5.5 PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER................................................ AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS....... DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN ­ KSP) DAS LEVEDURAS KILLER.... CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LEVEDURAS....................... 6 CONCLUSÃO............................................................................................... 95 REFERÊNCIAS............................................................................................ 97 APÊNDICES................................................................................................. APÊNDICE A ­ Teste para determinação do Padrão de Sensibilidade Killer APÊNDICE B ­ Sequências amplificadas do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA......................................................................................................... 109 109 ANEXOS........................................................................................................ ANEXO A ­ Meios de Cultura........................................................................ ANEXO B ­ Soluções, tampões e reagentes................................................... 120 120 121
5.2 5.3 5.4 74 80 86 110 1 INTRODUÇÃO A cachaça é uma bebida alcoólica produzida pela destilação do mosto da cana­de­ açúcar fermentado, muito apreciada por possuir aroma e sabor característico e considerada o destilado alcoólico mais popular produzido no Brasil (CARDOSO, 2006). As leveduras e as condições de fermentação são apontadas como os fatores que mais influenciam para a característica final dessas bebidas, pois é durante a fermentação alcoólica que a maioria dos compostos responsáveis pelo sabor é formada (LEHTONEN e JOUNELA­ERIKSSON, 1983). No Brasil, a produção da cachaça de alambique ou artesanal é muito frequente devido à tradição, identidade regional e também pela mesma apresentar características peculiares quanto ao sabor e aroma (AZEVEDO et al., 2003). A fabricação é caracterizada pelo preparo do fermento inicial ou “pé­de­cuba”, que consiste na propagação da microbiota natural ocorrente numa mistura geralmente composta de caldo de cana­de­açúcar, milho, arroz e/ou farinha de soja de forma que a fermentação alcoólica é realizada pela ação de comunidades mistas de leveduras (PATARO et al., 2002). O metabolismo fermentativo das leveduras difere entre as espécies e linhagens, e este fato influencia diretamente na composição final das bebidas (CLEMENTE­JIMENEZ et al., 2005; OLIVEIRA et al. 2005; QUEROL e FLEET, 2006; GOMES et al., 2008). Dessa forma, a fermentação espontânea característica da produção da bebida, pode causar grande variabilidade sensorial no produto final obtido dentro de uma mesma safra comprometendo a padronização e qualidade (GOMES et al., 2008). Assim, a utilização de leveduras selecionadas como fermento iniciador ou culturas starter tem sido indicada como a principal maneira de padronizar e consequentemente elevar a qualidade da bebida (PATARO et al., 2002; GOMES, 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). No entanto, a contaminação de culturas starter ou outras culturas selecionadas, com leveduras indesejáveis ao processo estão entre os principais responsáveis pela redução do rendimento fermentativo e da qualidade do produto final em processos fermentativos industriais de produção de bebidas alcoólicas (CHEN et al., 2000). Uma característica vantajosa em leveduras selecionadas para processos fermentativos industriais da produção de bebidas é possuir fenótipo killer (MARQUINA et al., 2002; SANGORRÍN et al., 2007): serem capazes de produzir toxinas protéicas ou glicoprotéicas letais às células sensíveis de mesma espécie ou gênero e mais raramente de gêneros diferentes, sendo imunes a mesma (MAGLIANI et al., 1997). Além de habitats naturais com
altas concentrações de açúcar e baixo pH, estas leveduras normalmente podem ser encontradas durante processos fermentativos para produção de bebidas sejam eles espontâneos ou induzidos por fermento comercial ou selecionado (MARQUINA et al., 2002; CECCATO­ANTONINI, 2004). A manifestação deste fenótipo pode proporcionar vantagem competitiva às leveduras fermentadoras, através da inibição do crescimento de linhagens sensíveis indesejáveis minimizando as chances de contaminação externa, além de assegurar a permanência da linhagem selecionada durante todo processo e consequentemente aumentar a eficiência da fermentação. Estas vantagens normalmente contribuem para a manutenção de padrões de qualidade bem definidos a cada produção (MAGLIANI et al., 1997; MARQUINA et al., 2002; CECCATO­ANTONINI et al., 2004). A presença natural de linhagens killer durante a fermentação para produção de vinho aliada as suas vantagens de utilização como culturas iniciadoras, tem contribuído para o estudo e seleção de linhagens que reúnam todas as características desejáveis para a produção da bebida (PÉREZ et al., 2001; SANGORRÍN et al., 2001; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007b). A ocorrência do fenótipo killer , principalmente em Saccharomyces cerevisiae provenientes da fermentação espontânea para produção de vinho e cachaça e a utilização de algumas linhagens de forma bem sucedida como culturas iniciadoras (SANGORRÍN et al., 2001;; LOPES et al., 2005; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007a; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009), incentiva a detecção e identificação de leveduras killer nativas da fermentação natural do mosto da cana­de­açúcar durante a produção da cachaça de alambique no estado da Bahia. Os resultados deste estudo auxiliarão na seleção criteriosa de linhagens de leveduras que possam apresentar os benefícios proporcionados pelo fenótipo killer, sendo assim, boas candidatas a serem utilizadas como fermento iniciador de processos fermentativos para produção de cachaça com padrões de qualidade bem estabelecidos.
2 OBJ ETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Determinar o comportamento killer em leveduras associadas à fermentação espontânea do mosto da cana­de­açúcar de produtores de cachaça de alambique do estado da Bahia. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Determinar a atividade killer dos isolados de levedura selecionados durante as distintas fases da fermentação sobre leveduras de referência e sensíveis quanto ao fenótipo killer .
· Avaliar a ação letal dos isolados que apresentarem atividade killer sobre os demais isolados dos processos de fermentação.
· Avaliar o padrão de sensibilidade dos isolados que apresentarem atividade killer frente a um painel composto por distintas leveduras killer de referência.
· Realizar a identificação molecular dos isolados que apresentarem atividade killer por meio de análise das sequências do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA.
3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 CACHAÇA DE ALAMBIQUE A origem da cachaça perpassa pelo período colonial da história do Brasil, pois seu surgimento ocorreu no século XVI, mais precisamente entre os anos de 1534 e 1549, juntamente com o desenvolvimento do ciclo da cana­de­açúcar. A descoberta é descrita através de um fato curioso onde, nos engenhos, as sobras da produção eram dadas aos escravos, que deixavam a borra de melaço acumular por alguns dias. A fermentação natural então acontecia, formando um líquido que os escravos bebiam e que deu origem à cachaça após a introdução do processo de destilação no Brasil colônia. Desta forma, a cachaça se tornou a primeira bebida destilada da América Latina e a aguardente de cana genuinamente brasileira (CARDOSO, 2006). Visando definir e caracterizar os termos cachaça e aguardente de cana, a legislação brasileira apresenta esta última como a bebida com graduação alcoólica variando entre 38 a 54% em volume, a 20°C, obtida de destilado alcoólico simples de cana­de­açúcar ou pela destilação do mosto fermentado da cana­de­açúcar, podendo ser adicionada de açúcares em até seis gramas por litro (BRASIL, 1997). E cachaça, como a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no Brasil (BRASIL, 2001), com graduação alcoólica de 38 a 48% em volume, a 20°C, obtida pela destilação do mosto fermentado de cana­de­açúcar com características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até seis gramas por litro, expressos em sacarose (BRASIL, 2002). Logo, as aguardentes de cana abrangem as cachaças, principalmente, por possuir um limite máximo de teor alcoólico mais elevado e, pelo fato de poder ser obtida também de destilado alcoólico simples de cana­de­açúcar. De acordo com o processo produtivo, equipamentos de produção e a certificação e registro do produto, a cachaça apresenta ainda três classificações informais: as industriais, a artesanal ou de alambique e as informais. Esta última se refere àquelas que não possuem qualquer tipo de registro ou identificação. A cachaça industrial é caracterizada, principalmente, pela produção em larga escala e adoção de métodos não convencionais como a realização de destilação contínua em colunas de destilação feitas em aço inoxidável, fermentação alcoólica utilizando leveduras prensadas e aditivos químicos e queima da cana­ de­açúcar antes da colheita e moagem. Sua produção corresponde por cerca de 70% de toda a
cachaça produzida no Brasil, estando os principais produtores concentrados nos estados de São Paulo, Ceará, Pernambuco e Rio de Janeiro (OLIVEIRA et al., 2005a). A cachaça artesanal ou de alambique é destilada em alambique feito em cobre. É caracterizada pela produção em pequenas destilarias com mão­de­obra familiar utilizando processos artesanais e/ou naturais como fermentação espontânea com fermento caipira ou “pé­de­cuba” o qual é constituído por leveduras nativas ou selvagens e destilação em alambiques de cobre com separação das frações do destilado em “cabeça”, “coração” e “cauda” (CARDOSO, 2006). O envelhecimento em barris de madeira também contribui para que a cachaça de alambique apresente maior aceitação pelo mercado consumidor, pois favorecem a obtenção de um produto com melhores características sensoriais quando comparado à industrial (FILHO et al., 1999). A utilização do cobre como material de confecção dos alambiques, embora em alguns casos, possa levar à contaminação do produto final por íons cúprico, favorece a melhoria da qualidade sensorial da cachaça (CARDOSO et al., 2003). LIMA­NETO et al. (1994) demonstraram que cachaças obtidas por processos de destilação que fazem uso de destiladores confeccionados com outros materiais que não o cobre, apresentam maior concentração de radicais sulfetos, os quais conferem um aroma indesejável à bebida. O processo de envelhecimento em tonéis de madeiras, prática muito comum na produção da cachaça de alambique, confere à bebida coloração característica, sabor e aroma diferenciado (AQUARONE et al., 1983), por consequência agrega valor ao produto final. Os principais compostos extraídos da madeira responsáveis pela modificação das características físicas e sensoriais da cachaça são óleos voláteis, substâncias tânicas, açúcares, glicerol, ácidos orgânicos não­voláteis e esteróides (CARDELLO e FARIA, 1998). Embora o carvalho seja a madeira mais utilizada e estudada para envelhecimento de bebidas destiladas em todo o mundo, no caso específico da cachaça, diversas outras madeiras como Amburana cearensis (amburana), Myroxylon balsamum (bálsamo), Cariniana estrellensis (jequitibá) e Arachis hypogea (amendoim) estão sendo empregadas e estudadas no Brasil com o objetivo de atender a demanda de consumidores cada vez mais diversificada e exigente (DIAS et al., 1998). No que se refere ao processo produtivo, o que talvez mais caracterize a cachaça de alambique, e que mais a diferencie da cachaça industrial seja a fermentação alcoólica realizada por “fermento caipira”, também muito conhecido entre os produtores como “pé­de­ cuba”. O preparo deste fermento inicial consiste na propagação da microbiota natural ocorrente numa mistura geralmente composta pelo caldo da cana­de­açúcar, milho, arroz e/ou
farinha de soja. Dessa forma, a fermentação é realizada, principalmente, pela ação de comunidades mistas de leveduras nativas da própria cana, moenda e do ambiente de fermentação (PATARO et al., 2002). Embora existam outras espécies atuantes, linhagens de Saccharomyces cerevisiae têm demonstrado ser predominante no fermento inicial e durante o ciclo fermentativo (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 2000). Como, não só o etanol, mas também em proporções menores, os compostos secundários que a depender das proporções podem influenciar positivamente ou negativamente a qualidade da cachaça, são derivados do metabolismo fermentativo das leveduras, grande ênfase têm sido dada a elas e às condições de fermentação quando se quer produzir uma cachaça de alambique baseada nos padrões de qualidade. Outra prática característica da produção da cachaça de alambique, é que durante o processo de destilação o destilado total é separado nas frações “cabeça” (fração inicial), “coração” (cachaça) e “cauda” (fração final). Este fracionamento é de fundamental importância de modo a evitar compostos indesejáveis e contaminantes orgânicos e inorgânicos na cachaça, normalmente presentes em altas concentrações nos destilados de “cabeça” e “cauda” (CARDOSO, 2006) 3.1.1 Impor tância econômica da cachaça No Brasil, cerca de 15 milhões de pessoas estão diretamente ou indiretamente empregadas na produção de açúcar, álcool, cachaça, melado e rapadura, evidenciando que as atividades derivadas da industrialização da cana­de­açúcar consistem num ramo de grande importância econômica para o país. Somente para a fabricação de cachaça, são produzidas no Brasil 10 milhões de toneladas de cana­de­açúcar por ano, o equivalente a uma área plantada de 125 mil hectares (SEBRAE, 2005). O Governo Federal visando iniciar um processo de valorização da cachaça, estimular o aumento de sua produção bem como melhorar sua qualidade com vistas a ampliar o volume de exportações para o mercado externo, adotou algumas medidas importantes para este setor do agronegócio. Em novembro de 1997 foi criado o Programa Brasileiro de Desenvolvimento da Cachaça (PBDAC), que tem procurado divulgar a bebida de forma intensiva e que incluiu o produto no Programa Especial de Exportações (PEE) e no Programa dos Novos Pólos de Exportação (PNPE) do Governo Federal. Através do Decreto 4.072 de janeiro de 2002 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a cachaça passou a ser regulamentada em sua definição como uma bebida genuinamente brasileira. O reconhecimento da
denominação cachaça como produto tipicamente brasileiro também constituiu num importante passo para sua consolidação no exterior (OLIVEIRA et al., 2005a; ABRABE, 2009). A cachaça é a segunda bebida alcoólica mais apreciada pelos brasileiros, ficando atrás somente da cerveja (SEBRAE e SEAMA, 2001). Estima­se um consumo de 70 milhões de doses diárias, o que representa, em média, aproximadamente seis litros (habitante ano ­1 ). O consumo brasileiro garante a esta bebida a terceira colocação entre os destilados do mundo inteiro, atrás somente da vodca e do soju asiático (ABRABE, 2009). Estima­se que a produção total de cachaça no Brasil varie entre 1,3 a 2 bilhões de litros anuais existindo mais de 5 mil marcas e 30 mil produtores. A produção ocorre em todas as regiões brasileiras e a cachaça é encontrada em mais de 960 pontos comerciais do território nacional se constituindo na bebida destilada mais consumida do país, gerando uma receita próxima de US$ 600 milhões (PBDAC, 2009). De acordo com o Programa Brasileiro de Desenvolvimento da Cachaça dentre os maiores produtores brasileiros estão os estados de São Paulo (44%), Pernambuco (12%), Ceará (12%), Rio de Janeiro (8%), Minas Gerais (8%) e Paraná (8%). Segundo dados do Ministério da Agricultura, de todo volume anual de cachaça produzida, cerca de 400 milhões de litros correspondem à cachaça de alambique e seus produtores são responsáveis pela geração de aproximadamente 1 milhão de empregos diretos e indiretos (OLIVEIRA et al., 2005a). O estado da Bahia produz anualmente cerca de 1,8 milhões de litros de cachaça de alambique se posicionando como o segundo maior produtor do Brasil, atrás apenas de Minas Gerais. Cerca de três mil pequenos estabelecimentos rurais estão envolvidos ativamente na produção de derivados de cana (melado, rapadura, açúcar mascavo, além de cachaça) empregando aproximadamente 60 mil pessoas de forma direta ou indireta. Embora a Bahia produza pouco menos de dois milhões de litros anuais, a capacidade máxima do estado é estimada em cerca de 3,5 milhões de litros de cachaça artesanal (SICM, 2009). Com relação às exportações, o Brasil desembarca 15 milhões de litros de cachaça/ano para mais de 60 países, com destaque para Alemanha, Paraguai, Itália e Portugal. Há sete anos as exportações no setor não chegavam a 970 mil litros/ano. Em 2002, possivelmente como resultados da adoção de medidas de valorização do produto pelo governo federal, o país passou a exportar mais de 14,8 milhões de litros para países como Alemanha, Japão e EUA (PBDAC, 2009). Apesar dos números, as exportações da cachaça não chegam a 1% da produção nacional e apenas cerca de 120 fabricantes exportam regularmente (SEBRAE, 2005). Apesar do alto volume de cachaça produzida pelo Brasil o que impede uma maior exportação é a negligência na observação dos padrões de identidade exigidos pelo Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e a falta de controle da qualidade da bebida (MIRANDA, 2005). 3.2 LEVEDURAS, FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA E QUALIDADE DA CACHAÇA DE ALAMBIQUE As leveduras são microrganismos eucarióticos unicelulares, que se reproduzem geralmente de forma assexuada por brotamento, e em poucos casos por fissão binária, classificados no Domínio Eukarya (WOESE et al., 1990), reino Fungi, porém, não formam um grupo taxonômico ou filogenético específico (KURTZMAN e PISKUR, 2006). Estes microrganismos possuem uma diversidade filogenética que os insere tanto na divisão Ascomycota como na Basidiomycota, e, estimativas recentes indicam que somente 1% de todas as espécies de leveduras esteja descrita (KURTZMAN e PISKUR, 2006), embora cerca de 1.500 espécies já tenham sido descritas (KURTZMAN e FELL, 2006). Estes fungos unicelulares apresentam­se amplamente difundidos na natureza, em diversos substratos como folhas, frutos, solo, ar, lagos, rios, mares ou habitando o interior de insetos e animais e muito estudado sob o ponto de vista tecnológico e industrial (PHAFF e STARMER, 1987). São utilizados há séculos na fabricação de bebidas alcoólicas, no crescimento de massas de panificação, e mais recentemente, na síntese de vitaminas, gorduras e proteínas sendo, portanto, bastante explorados pelo homem (MARQUES et al., 1998). O seu emprego na fermentação de açúcares é a mais antiga aplicação, sendo que, dentre as espécies de leveduras a mais utilizada é Saccharomyces cerevisiae, a qual é empregada na produção de diversos alimentos e bebidas como, por exemplo: pão, cerveja, vinho, cachaça e xilitol (SREENIVAS et al., 2004). Atualmente, sabe­se que as leveduras são os principais microrganismos responsáveis por processos fermentativos, sobretudo devido a sua atividade metabólica, pois em meio apropriado, são capazes de desenvolver a fermentação espontânea, na qual os gêneros, espécies e/ou linhagens substituem­se, devido a um processo de seleção natural. Neste ambiente competitivo, as espécies e/ou linhagens que mais se adaptam às condições ambientais predominam como os principais agentes responsáveis pelo processo fermentativo (ZAGORC et al., 2001). Para que a fermentação alcoólica se inicie é necessário que haja uma determinada concentração celular. Esta se multiplica gradativamente até atingir o denominado “número de Brown”, momento em que o açúcar é quase que totalmente convertido em álcool
em detrimento da via metabólica de transformação em biomassa (OLIVEIRA, 2001). Ao longo dos anos, o processo fermentativo tem sido na maioria das vezes, independente da aplicação, conduzido em batelada, em um sistema em que a formação do produto está diretamente relacionada ao crescimento do microrganismo agente. Esta relação entre crescimento e formação do produto levou a uma classificação de “fermentação com crescimento associado” embora existam outros sistemas independentes desta relação como, por exemplo, o de fluxo contínuo dentre outros (GOMES, 2006). A fermentação se constitui numa etapa fundamental para a produção de bebidas alcoólicas, principalmente as destiladas como a cachaça, pois é neste processo que as leveduras realizam as transformações químicas sobre os açúcares fermentescíveis produzindo os metabólitos primários, CO2 e álcool etílico. Este álcool, após o processo de destilação, é o principal componente em termos quantitativos nestas bebidas. O processo fermentativo inicia­ se logo que a levedura entra em contato com o mosto e é dividido em 3 fases: (i) fase preliminar ou pré­fermentação, caracterizada pela adaptação das leveduras e multiplicação celular; (ii) fase de fermentação principal ou tumultuosa, com desprendimento abundante de gás e produção de álcool e (iii) fase de fermentação complementar ou pós­fermentação, onde se observa redução acentuada da atividade fermentativa (CARDOSO, 2006). Durante o metabolismo fermentativo das leveduras também são formados subprodutos, chamados de componentes secundários, os quais também compõem o produto final e cujas concentrações, influenciam diretamente na qualidade química e sensorial da cachaça de alambique (GOMES et al., 2008). De maneira geral, os principais fatores que contribuem para a grande variação da qualidade de bebidas alcoólicas destiladas como a cachaça estão intimamente relacionados com todas as etapas do processo produtivo: matéria­prima, fermentação, método de condução do processo fermentativo, a destilação e o envelhecimento. Entretanto, a fermentação tem sido apontada como a mais importante, pois é a que mais influencia diretamente no aroma e sabor das bebidas alcoólicas (LEHTONEN e JOUNELA­ERIKSSON, 1983). É durante esta fase que os constituintes químicos, sejam eles primários ou secundários da bebida são produzidos como produtos do metabolismo fermentativo das leveduras e/ou de outros microrganismos que possam estar atuando, como por exemplo, bactérias contaminantes (CARDOSO, 2006). A cachaça é composta principalmente por água e álcool em proporções variáveis de acordo com a graduação alcoólica e de componentes secundários em quantidades bem menores, mas responsáveis por conferir à bebida suas características peculiares de aroma e sabor (CARDOSO, 2006). Os componentes secundários responsáveis pelo aroma ou
“bouquet” das bebidas pertencem às classes dos aldeídos, alcoóis superiores, ésteres, furfural, terpenos, lactonas, furanos, pirazinas, ácidos orgânicos dentre outros (LEHTONEN e JOUNELA­ERIKSSON, 1983). Como o metabolismo fermentativo das leveduras difere entre as distintas espécies e linhagens, as concentrações e proporções relativas dos compostos constituintes da cachaça sofre uma influência direta da microbiota responsável pela realização do processo fermentativo (CLEMENTE­JIMENEZ et al., 2005; OLIVEIRA et al. 2005; QUEROL e FLEET, 2006; GOMES, 2006). Portanto, a utilização do “fermento caipira” na produção da cachaça de alambique, o qual favorece a propagação de diferentes espécies e linhagens de leveduras na fermentação e que promove uma gama de interações entre as mesmas que ainda são pouco entendidas (FLEET, 2003), está fortemente relacionada com o nível de eficiência do processo e com a variação da qualidade do produto final. Segundo trabalho realizado por Morais et al. (1997), a fermentação espontânea ou artesanal mostrou ser caracterizada por uma microbiota mista de leveduras, com predominância de linhagens de Saccharomyces cerevisae e uma certa frequência de outras espécies pertencentes aos gêneros Candida , Kluyveromyces, Kloeckera e Pichia . Foi demonstrado também que durante o processo fermentativo, as espécies apresentavam­se em constante sucessão, devido à introdução de microrganismos que acompanham o caldo de cana, contaminantes e também às condições do processo. Muitos outros estudos visando caracterizar a microbiota envolvida na fermentação têm sido realizados em distintos produtores de cachaça de alambique do estado de Minas Gerais, (PATARO et al., 1998; GUERRA et al. 2001; SCHWAN et al. 2001; GOMES et al., 2008). Os resultados dos trabalhos também demonstram que, durante o ciclo fermentativo, ocorre uma sucessão de espécies de leveduras, culminando com a predominância de S. cerevisiae (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001). Oliveira (2001) avaliou as características fermentativas e formação dos principais compostos secundários produzidos por trinta linhagens de leveduras, isoladas de destilaria artesanal e industrial de cachaça e destilaria de álcool, compreendendo Saccharomyces cerevisae, Candida , Kloeckera , Pichia e Schizosaccharomyces. As linhagens de S. cerevisae e de Pichia apresentaram bom potencial fermentativo em relação ao baixo rendimento encontrado nos demais gêneros de leveduras. Também foram demonstradas diferenças nas quantidades e proporção dos compostos secundários responsáveis pelo aroma e sabor entre as cachaças obtidas pelas distintas linhagens estudadas. Tais variações foram evidenciadas principalmente quanto ao aroma, pois as linhagens de Saccharomyces obtiveram a maior
média neste aspecto sensorial, contrastando significativamente com a menor média da linhagem Saccharomyces pombe. Dentre as 30 linhagens estudadas, 11 pertencentes a uma mesma destilaria, apresentaram variabilidade nas características fermentativas, sugerindo falta de condições estáveis de processo e produção de uma cachaça menos padronizada ao longo da safra, com rendimentos oscilantes. Dessa forma, a fermentação alcoólica de forma espontânea, caracterizada pela ação de comunidades mistas de leveduras e utilizada na fabricação da cachaça de alambique, pode causar variabilidade sensorial no produto final de até mesmo um único produtor numa mesma safra, fato que, dificulta o estabelecimento de um padrão de produção (GOMES et al., 2008). Segundo Oliveira et al. (2004), para evitar tais variações na qualidade, a seleção criteriosa de linhagens iniciadoras de leveduras para a produção da cachaça como ocorre para a cerveja e o vinho se constitui como uma das soluções mais apropriadas, pois estudos mostram que a cada ciclo produtivo, diferentes linhagens, nem sempre adequadas, são isoladas de processos fermentativos (PATARO et al. 2000; SCHWAN et al., 2001; GOMES, 2006). Entretanto, alguns trabalhos buscando uma seleção adequada vêm analisando as características de várias linhagens de leveduras, levando em consideração, principalmente, parâmetros cinéticos e produção de metabólitos secundários (SILVA et al., 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). 3.2.1 Utilização de levedur as selecionadas O processo de seleção de leveduras para utilização em processos fermentativos vem sendo empregado com êxito em outros processos produtivos que não a cachaça, como por exemplo, para a produção de etanol combustível (CECCATO­ANTONINI et al., 2004) e de bebidas alcoólicas fermentadas (LOPES et al., 2007b). Com o progresso da tecnologia de bebidas, linhagens de leveduras foram sendo selecionadas segundo características desejáveis capazes de gerar melhorias tanto ao processo como ao produto. Segundo Hammond (1995) as características ideais e altamente desejáveis em leveduras para a produção de bebidas são: alta produtividade e eficiência de fermentação; tolerância ao etanol, tolerância à temperatura elevada; resistência às altas concentrações de açúcares; produção de concentração e balanço adequado de compostos secundários desejáveis para a qualidade da bebida; habilidade de flocular e a propriedade de produzir metabólitos anticontaminantes (toxinas killer ). A utilização de cepas de leveduras selecionadas é
determinante para a manutenção das boas características de um vinho, sendo de fundamental importância saber o potencial de produção de compostos secundários e metabólitos de cada uma delas, para que seja possível selecionar a que mais atenda a produção de uma bebida padronizada e de qualidade (LOPES et al., 2007b ). É natural que no processo fermentativo espontâneo da produção de cachaça de alambique, caracterizado por culturas mistas, ocorram microrganismos contaminantes indesejáveis como principalmente, bactérias e leveduras, as quais são geralmente responsáveis pela redução do rendimento alcoólico e depreciação na qualidade do produto por contribuir para acidez elevada e sabores estranhos (OLIVEIRA, 2001). No caso específico de contaminação bacteriana, ocorre a formação de ácidos (ácido láctico, acético e succínico) e outros compostos estranhos que comprometem as características organolépticas (HAMMOND, 1995). Não somente por causa de microrganismos contaminantes, mas como já citado anteriormente, pelas frequentes variações sensoriais na cachaça de alambique, é que a utilização de leveduras selecionadas, como cultura única ou starter na fermentação, tem sido apontada como a principal maneira de padronizar e elevar a qualidade da bebida (PATARO et al., 2002; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). Entretanto, Basso et al. (1996) comprovaram que leveduras de panificação ou até mesmo linhagens de leveduras estritamente selecionadas em laboratório como adequadas à processos fermentativos industriais, não conseguem predominar ao longo de uma safra por serem substituídas no decorrer do período por cepas de leveduras da biodiversidade ambiental e que passam a ser responsáveis pela fermentação alcoólica. Com isto, diversas pesquisas visando selecionar linhagens nativas do próprio ambiente de fermentação, mas detentoras de características desejáveis para a produção e para a cachaça de alambique têm sido realizadas nos últimos anos (PATARO et al., 1998; PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001; SCHWAN et al., 2001; PATARO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2004; SILVA et al., 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). Tais pesquisadores abordam que a incorporação de cepas selecionadas na fermentação espontânea contribuirá para o estabelecimento de um padrão de qualidade e identidade da cachaça, se constituindo numa medida muito importante para o sucesso da produção.
3.3 O FENÔMENO KILLER A ocorrência do fenômeno killer é uma das características apresentadas pelas leveduras que contribuíram para que elas se tornassem microrganismos modelos em diversos estudos de pesquisa básica (MAGLIANI et al., 1997; MARQUINA et al., 2002). A ocorrência deste fenômeno foi pela primeira vez descrita em 1963, por Bevan e Makower, a partir da observação de que alguns isolados da levedura Saccharomyces cerevisiae secretavam uma substância que era letal para outras linhagens de mesma espécie. A partir de então, uma série de estudos vem demonstrado que esta característica não é restrita a S. cerevisiae, mas que ela ocorre em mais de 90 gêneros de leveduras incluindo ascomicetos e basidiomicetos (POLONELLI e MORACE, 1986; MAGLIANI et al., 1997). A atividade killer de leveduras está fundamentada na produção de exotoxinas também conhecidas como micocinas, de natureza protéica ou glicoprotéica, com atividade mediada por receptores de parede celular específico nos microrganismos sensíveis. As leveduras killer são originalmente definidas como produtoras de exotoxinas capazes de matar células sensíveis pertencentes à mesma espécie ou gênero, sendo que, a levedura produtora é imune à sua toxina (BEVAN e MAKOWER, 1963). Quanto ao fenótipo killer , elas podem apresentar­se como: killer resistentes (K + R + ) ou killer sensíveis (K + R ­ ), quando produzem toxinas letais, podendo ser resistentes ou não às distintas classes de leveduras killer ; neutras (K ­ R + ), quando não produzem toxinas e são resistentes às diversas classes e sensíveis (K ­ R ­ ), sendo estas que não sintetizam toxinas e, claro, não apresentam resistência (MAGLIANI et al., 1997). Segundo Azevedo (1998), o cruzamento de linhagem killer com sensível tem como resultado toda descendência do tipo killer , do mesmo modo, linhagens neutras cruzadas com sensíveis, todos descendentes são neutros. Por sua vez, o cruzamento de killer com neutra resulta em distintas proporções entre ambas (4:0 até 0:4). Young e Yourgiu (1978) propuseram um sistema de classificação para as leveduras killer baseando­se na interação entre as linhagens, através de seus padrões de sensibilidade e atividade killer (Tabela 01). De acordo com este sistema, a classe de leveduras K1 é definida por matar as de classes K2, K3 e K4 e por serem sensíveis a todas as classes, exceto a ela mesma. Zhu e Bussey (1989) incrementaram a classificação incluindo a classe K11. Portanto, tal sistema de classificação, bastante utilizado até hoje em estudos de biotipagem, é constituído por 11 distintos grupos denominados de K1 a K11. Logo após a descoberta do fenômeno, estudos sobre os efeitos da presença destas leveduras no ambiente, indicam que o fenômeno killer em leveduras representa um modelo de
competição biológica entre os gêneros e espécies, semelhante ao das bacteriocinas entre as bactérias (HARDY, 1975). Para Cassone et al. (1997) tal fenômeno é um sofisticado mecanismo biológico para regulação da dinâmica das populações nos ecossistemas. Além disso, alguns trabalhos também demonstram um maior espectro de ação das toxinas killer , pois, além de leveduras filogeneticamente relacionadas, elas também podem ser letais a bactérias Gram­positivas e diversos fungos filamentosos de interesse clínico e ambiental (POLONELLI e MORACE, 1983; POLONELLI et al., 1986; WALKER et al., 1995). Em um estudo recente, este amplo espectro de ação foi constatado pela atividade das linhagens de Candida sp. e Dipodascus capitatus, isoladas respectivamente de solo de fazenda orgânica e da decomposição da fruta proveniente de Artocarpus heterophyllus (jaca), inibindo o crescimento do fungo causador da doença “vassoura­de­bruxa” no cacaueiro, o Moniliophthora perniciosa (syn. Crinipellis perniciosa ) (CABRAL et al., 2009). As leveduras killer têm sido isoladas dos mais variados habitats de distintas regiões do mundo e, dentre os mais de 90 gêneros de leveduras que o fenótipo vem sendo encontrado, destacam­se: Sacchamomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Williopsis, Zygosacchoromyces, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia, Rhodothorula, Schwanniomyces, Torulopsis, Ustilago e Zigowillopsis (CHEN et al., 2000; SCHMITT e BREINING, 2002). As frutas, provavelmente, consistem no habitat de maior ocorrência, uma vez que 1/3 das linhagens de leveduras isoladas de frutas no ambiente têm apresentado o fenótipo killer . Esta alta frequência pode ser explicada pelo fato das frutas oferecerem, de modo geral, condições ideais para o desenvolvimento das leveduras e estabilidade de suas toxinas tais como: baixo pH, temperatura e concentração adequada de açúcares (MAGLIANI et al., 1997). Outro aspecto relevante, é que estão expostas ao ambiente, contribuindo para que sejam constantemente visitadas por potenciais vetores, como abelhas, besouros, pássaros ou outros animais (KURTZMAN e FELL, 2006). As vantagens que as leveduras killer possuem sobre linhagens sensíveis no ambiente podem explicar sua abundância, uma vez que a atividade de suas toxinas é considerada como importante mecanismo de competição entre gêneros e espécies (PEREZ et al., 2001; ZAGORC et al., 2001; CARREIRO et al., 2002). Portanto, quanto aos aspectos ecológicos, sabe­se que a produção de toxinas killer confere às linhagens produtoras uma vantagem competitiva, em relação às células sensíveis, por nutrientes disponíveis no meio (MARQUINA et al., 2002). Pelo fato de as plantas, frutas e os alimentos representarem os habitats mais importantes para as leveduras killer , diversos estudos buscando uma maior
compreensão das funções ecológicas e da interação destas leveduras têm sido desenvolvidos, principalmente, a partir de isolados destes ambientes (GOLUBEV, 1998; GOLUBEV, 2006). Tabela 01. Classificação das leveduras killer , baseada nos padrões de atividade e sensibilidade às toxinas Classificação killer Classes sensíveis K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K2, K3 e K4 K1 e K4 K1 e K4 K1 K1, K3 e K4 K1, K2, K3 e K4 K1, K3, K4 e K6 K1, K2, K3, K4 e K6 K1, K2, K3, K4, K5 e K8 K1, K2, K3, K4, K5, K6, K7 e K8 K1 3.3.1 Toxinas killer As toxinas killer , ou micocinas, são geralmente proteínas ou glicoproteínas de baixo peso molecular e que são excretadas para o meio extracelular, consistindo assim em uma exotoxina (MAGLIANI et al., 1997). Por serem secretadas, elas atuam sobre outras leveduras sensíveis sem a necessidade do contato direto célula­célula, mas sim por mecanismos específicos através de receptores de parede e membrana celular. No entanto, apesar de algumas evidências de ação contra outros microrganismos como, por exemplo, fungos filamentosos e bactérias Gram­positivas (WALKER et al., 1995), ainda não se conhecem os mecanismos de interação com estes últimos. Quanto à classificação, estas toxinas podem ser agrupadas em três distintos grupos de acordo com seu tamanho ou peso molecular e a natureza bioquímica. A grande maioria pertence ao grupo das protéicas ou glicoprotéicas, que são aquelas que possuem massa molecular acima de 5 kDa e onde a K1 de S. cerevisiae é a mais caracterizada. O grupo das microcinas apresenta esta denominação pela semelhança de tamanho das toxinas com as
bacteriocinas das bactérias e é definido por abrigar glicoproteínas de massa molecular de cerca de 1 kDa, sendo que devido ao pequeno tamanho, costumam ser termoestáveis e resistentes a proteases (PUCHKOV et al., 2002). Por sua vez, aquelas toxinas killer que apresentam uma porção lipídica ligada ao radical glicosídeo, em substituição a uma porção protéica, são classificadas como glicolipídicas e por causa da natureza bioquímica, apresentam uma alta ação emulsificante com atividades antimicrobianas já demonstradas contra as leveduras Pseudozyma flocculosa (CHENG et al., 2003), P. fusiformata (GOLUBEV et al., 2001), Sympodiomycopsis paphiopedili (GOLUBEV et al., 2004) e Cryptococcus humicola (PUCHKOV et al., 2002). Portanto, além da constituição bioquímica, o grande diferencial das toxinas glicolipídicas em relação às glicoprotéicas, é que as primeiras apresentam um espectro de ação mais amplo, não possuindo um padrão de atividade restrito taxonomicamente (GOLUBEV, 2006). De maneira geral, a estabilidade e atividade das toxinas killer é altamente sensível a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico­ químicas do meio e concentração de células sensíveis. Normalmente, as micocinas expressam a atividade killer em valores de pH ácido que variam entre 4 e 5, e temperaturas entre 20 a 25°C (IZGU et al., 1997). Soares e Sato (2000) demonstraram uma faixa ainda mais estreita para a toxina de S. cerevisiae, encontrando valores de pH entre 4,2 a 4,7. Entretanto, atualmente aceita­se que em pH 4,5 a maioria das toxinas apresentam máxima atividade e estabilidade tornando­se instáveis e inativas em valores acima de 5,0 (FUENTEFRIA et al., 2006; BUZZINI et al., 2007). Quanto à temperatura, por conta da constituição protéica das toxinas killer, elas são inativadas em função do tempo à medida que há elevação. Isso também foi verificado nas bacteriocinas, toxinas das bactérias, provavelmente pelo fato de ambas serem semelhantes quanto à função e natureza molecular (MAGLIANI et al., 2004). Além do pH, temperatura e de outras condições que também podem influenciar a atividade das toxinas, valores ótimos de estabilidade para uma determinada condição podem sofrer variações de acordo com o gênero, espécie e até mesmo entre distintas linhagens de leveduras killer . Por exemplo, diferindo de Soares e Sato (2000) que encontraram valores ótimos de pH para estabilidade das toxinas de linhagens de S. cerevisiae entre 4,2 e 4,7, Brites (2003) encontrou que, em meio líquido e a uma temperatura de 22°C, valores entre 4,6 e 4,8 para estabilidade de toxinas secretadas pelas mesmas linhagens. Neste trabalho, as mesmas foram inativadas em temperaturas superiores a 25°C em meio líquido tamponado e também quando o meio foi filtrado ou vigorosamente aerado, demonstrando certa susceptibilidade a fatores físicos e ambientais. A atividade ótima para a toxina killer isolada de Pichia
membranifaciens situou­se exatamente a 20ºC e pH 4,0 (SANTOS e MARQUINA, 2004). A mesma eficiência foi relatada por Chen et al., (2000), para a micocina de Schwanniomyces occidentalis, com máxima atividade situada em pH 4,2­4,8 e temperaturas entre 20 e 30ºC. Por sua vez, uma toxina obtida de Williopsis saturnus DBVPG 4561 permaneceu ativa em valores de pH 4,5­8,0, porém com máxima atividade nas temperaturas de 20 a 30ºC (BUZZINI et al., 2004). Durante a realização dos testes para determinação da atividade killer de leveduras, quanto mais alta for a concentração celular da suspensão de leveduras que é espalhada sobre o meio de cultura, menor é o halo inibitório podendo ser até indetectável. Isto ocorre pois é formada uma camada ou “tapete” muito densa de células que interferem na avaliação do ensaio por subestimar a atividade da toxina. Logo, altas concentrações de células sensíveis no meio de cultura influenciam a expressão da atividade da toxina e a sensibilidade do teste (GOLUBEV, 2006). Resultados obtidos por Lorente et al. (1997), e corroborados pelo trabalho de Lucas e Aguiar (2000), indicam que a presença de cloreto de sódio no meio seja capaz de transformar linhagens de leveduras resistentes em sensíveis às toxinas killer , através de um aumento gradativo de sua susceptibilidade em função do tempo. 3.3.2 Bases genéticas e mecanismos de ação Os caracteres genéticos de codificação e expressão das toxinas killer apresentam variações de acordo com a biologia e fisiologia dos distintos gêneros e espécies de leveduras (Tabela 02). No entanto, de um modo geral, as micocinas são expressas através do envolvimento de duas bases genéticas: exclusivamente por genes cromossomais ou através da combinação destes com elementos genéticos extra­cromossomais. Estes últimos representam a base citoplasmática, que é constituída por RNA de fita dupla encapsulado (dsRNA) conhecido como VLPs (vírus­like particles) ou vírus de RNA e os plasmídeos de DNA de fita dupla linear. Esta codificação das toxinas, baseada em elementos extra­cromossomais, é o sistema mais encontrado em leveduras killer até então estudadas (WICKNER, 1996; GOLUBEV, 2006).
Tabela 02. Bases genéticas para a expressão de toxinas killer em leveduras Levedur a killer Bases genéticas Saccharomyces cerevisiae Hanseniaspora uvarum Zygosaccharomyces bailii Ustilago maydis Kluyveromyces lactis Pichia acaciae Pichia inositovora Pichia kluyveri Pichia farinosa Pichia ianomala Williopsis mrakii dsRNA dsRNA dsRNA dsRNA dsDNA linear plasmidial dsDNA linear plasmidial dsDNA linear plasmidial Cromossomal Cromossomal Cromossomal Cromossomal Embora a maioria das informações sobre mecanismos de expressão das toxinas killer se concentre sobre aquelas codificadas por elementos extra­cromossomais, a exemplo de K1, K2 e K28 de S. cerevisiae (DIGNARD et al., 1991; SCHMITT e BREINIG, 2002), KP6 de Ustilago maydis (PERRY et al., 1987; TAO et al., 1990; SCHMITT e BREINIG, 2002) e toxina killer de Kluyveromyces lactis (GUNGE et al., 1981; SCHMITT e BREINIG, 2002), pouco se conhece sobre a natureza molecular das toxinas codificadas por cromossomos. Sabe­ se, no entanto, que todas as toxinas killer glicolipídicas caracterizadas até o momento apresentam sistema de codificação genético baseado exclusivamente por genes cromossomais e nenhum elemento citoplasmático foi detectado em células produtoras destas toxinas (CHENG et al., 2003). Outras evidências do envolvimento destas duas bases genéticas de expressão têm sido descritas em alguns trabalhos, como por exemplo, codificação de toxinas por: DNA cromossomal identificado em Pichia kluyveri e Williopsis mrakii (GOTO et al.,1990); DNA – dupla fita linear (dsDNA) como descrito em Kluyveromyces lactis, Pichia inositovora e Pichia acaciae (GUNGE, et al., 1981) e RNA dupla fita veiculado por um vírus ­ like (dsRNA), descrito em S. cerevisiae, Ustilago maydis e Hansentaspora uvarum (WICKNER et al., 1996; SCHMITT e BREINIG, 2002). Contudo, Goto (1990) detectou que toxinas de algumas linhagens de S. cerevisiae também eram expressas por genes situados em seus cromossomos V e IX.
As leveduras killer ou neutras detentoras de sistemas de expressão de toxinas baseados em dsRNA, contêm dois tipos de VLPs de RNA de dupla fita em seu citoplasma: um grande ( L­A ­ dsRNA) e outro pequeno (M ­ dsRNA) encapsulados em partículas virais, sendo que, cada tipo de RNA exerce uma função específica. Como verificado na Figura 01, a presença das partículas com o pequeno RNA é responsável pela expressão efetiva da toxina em si e por conferir imunidade à célula, contra a ação da sua própria toxina. Para tanto, depende do alelo cromossomal +mak 1 e das partículas contendo o RNA grande de dupla fita (BRITES, 2003). O L­A ­ dsRNA codifica a RNA polimerase (C Pol) responsável pela replicação dos dois tipos de vírus e proteínas capsídicas (Gag C) para ambas as partículas virais. Dessa forma, existe uma interdependência na expressão de gene cromossomal e os L­A e M – dsRNAs, necessária para a produção das micocinas dependentes deste sistema (SILVA, 1996; SCHMITT e BREINING, 2002). Essas partículas virais podem, no entanto, sofrer um processo de “cura” e inativação quando as células de leveduras são submetidas a determinadas condições. Tratamentos por choque térmico, radiação ultravioleta, brometo de etídio, cicloheximida ou corantes mutagênicos, além de gerar a perda da atividade killer , também podem causar a perda da imunidade celular à sua própria toxina (SCHAFFRATH e BREUNIG, 2000). Figur a 01. Expressão de toxina baseada no sistema de replicação dos “vírus” de RNA dupla fita em células de leveduras killer . Fonte: Magliani et al. (1997).
Segundo Wickner (1996), a produção das toxinas killer ocorre de forma intensa durante a fase log ou exponencial de crescimento das leveduras e seus diferentes mecanismos de ação dependem primordialmente de suas bases genéticas de expressão. A figura 2 exibe as correlações entre as bases genéticas, caracterização de toxinas e os principais efeitos gerados por elas sobre as células sensíveis. Woods e Bevan (1968) propuseram que a letalidade das micocinas fosse semelhante àquelas causada pelas colicinas produzidas por algumas bactérias, matando o organismo sem causar a lise da célula. Bussey (1972) avaliou o grau de ligação de toxinas killer de S. cerevisiae à parede celular de leveduras sensíveis e a importância desta ligação na sua ação. Foi relatado que quando a toxina era lançada no meio, ela ligava­se tanto as paredes das células sensíveis, quanto às das células killer , porém estas últimas eram imunes à ação da toxina. Segundo os autores, este fato demonstrou que os sítios de ligação na parede celular são fundamentais para que ocorra ação letal numa célula sensível. Geralmente os efeitos letais das toxinas killer sobre as células sensíveis ocorrem após duas ações básicas: 1­ ligação a receptores específicos de parede celular e membrana plasmática e 2­ translocação para o citoplasma. Contudo, uma vez dentro da célula, os principais mecanismos específicos que as toxinas exercem sobre as células sensíveis são: aumento da permeabilidade da membrana plasmática, causando ruptura e perda de íons potássio, ATP e metabólitos intracelulares; inibição e síntese dos principais componentes da parede celular como glicana, manose e quitina; inibição da síntese de DNA e o bloqueio da fase G1 do ciclo celular (CASTORIA et al., 2001; SANTOS et al., 2002; GOLUBEV, 2006). Em alguns casos, os efeitos das toxinas são também capazes de afetar a célula sensível imediatamente após ligação à parede celular, por inibição do transporte de L­leucina e de prótons que normalmente seriam transportados com aminoácidos para o interior da célula. As toxinas modificam o gradiente eletroquímico de prótons através da membrana plasmática inibindo o bombeamento para o meio externo, principalmente, em células que metabolizam ativamente glicose, sendo que todos os efeitos dependem da concentração da toxina no meio (BRITES, 2003). Conforme evidenciado na Tabela 03, até mesmo toxinas produzidas por uma mesma espécie podem causar diferentes efeitos letais. Por exemplo, os efeitos das toxinas K1 e K28 secretadas por S. cerevisiae estão relacionados, respectivamente, com a indução de uma atividade anormal dos canais iônicos formando poros e com a inibição da síntese de DNA durante o ciclo celular, causando morte celular por perda de íons ou apoptose. Outros efeitos também foram comprovados, como por exemplo, a interferência na fase G1 do ciclo celular causada pela toxina produzida por Kluyveromyces lactis, e a inibição da síntese
de β ­ 1,3 – glicana causada pela micocina de Williopsis saturnus var. mrakii (GOLUBEV, 1998; GOLUBEV, 2006). Tabela 03. Correlação das bases genéticas de toxinas, seus receptores e mecanismos de ação de sistemas killer das espécies de leveduras mais estudadas. Fonte: Marquina et al. (2002) Base Genética Sistema killer dsRNA encapsulado em VLPs Saccharomyces cerevisiae Tamanho da t oxina killer (KDa) Receptor Mecanismo de ação K1 19 β­1,6­D­glicano K2 21,5 β­1,6­D­glicano K28 21,5 α­1,3­mannose Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons Inibição da síntese de DNA P1 19 ­ P4 11,1 ­ P6 17,7 ­ Hanseniaspora uvarum Zygosaccharomyces bailii Phaffia rhodozyma Kluyveromyces lactis ­ ­ Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons ­ ­ ­ ­ ­ 156,5 ­ Quitina ­ Bloqueio do ciclo celular, atividade de quitinase Pichia inositovora Pichia acaciae >100 ~190 ­ Quitina ­ Bloqueio do ciclo celular, atividade de quitinase KHR 20 ­ KHS 75 ­ Pichia kluyveri 19 ­ Pichia farinosa KK1 14,2 ­ Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons Aumento da permeabilidade da membrana à íons HM­1 10,7 K­500 1,8­5,0 Pichia anomala 83,3 β glicano de parede celular β glicano de parede celular β glicano de parede celular Ustilago maydes Plasmídeo linear de ds DNA Genes nucleares Saccharomyces cerevisiae Williopsis mrakii WC65 Inibição da síntese de β­1,3­ glicano Aumento da permeabilidade da membrana à íons ­
3.3.3 O Fenômeno Killer em Saccharomyces cerevisiae O sistema killer mais conhecido e estudado consiste no de S. cerevisiae, devido ao fato de que esta levedura representa a espécie modelo em experimentos genéticos visando a expressão de genes de interesse em organismos eucarióticos (GOLUBEV, 1998; GOLUBEV, 2006). De modo geral, o mecanismo exato de formação das toxinas killer em leveduras não está totalmente esclarecido. Contudo, para a espécie S. cerevisiae tal mecanismo está totalmente descrito e está baseado na ação de três toxinas denominadas K1, K2 e K28, de acordo com sua característica molecular e que são codificadas pelas respectivas partículas semelhante à vírus (VLPs) de RNA dupla fita (ds­RNA) denominados ScV­M1, ScV­M2 e ScV­M28 (MAGLIANI et al., 1997) (Figura 02). Figur a 02. Mecanismos genéticos, de secreção e de ação das toxinas K1, K2 e K28 de S. cerevisiae. Fonte: Magliani et al. (1997).
Para a produção de cada uma destas três toxinas, é necessário a presença de seu VLP correspondente e de um outro, também de RNA dupla fita, denominada ds­RNA L­A helper o qual possui replicação autônoma independente mas que sozinho não atribui nenhuma característica a célula hospedeira pois sua função é a manutenção da auto­imunidade. As três toxinas são produzidas por mecanismos similares, de forma que inicialmente é formada uma pré­toxina que apenas torna­se madura e biologicamente ativa após modificações pós­ traducionais (BREINIG et al., 2002). A Figura 03 ilustra o processo de formação da toxina K1, a mais conhecida quanto a síntese e mecanismos de ação sobre as células sensíveis. Ela corresponde a um heterodímero composto por 316 aminoácidos e com 19 kDa, distribuídos nas subunidades alfa de 9,5 kDa e beta de 9,0 kDa. Durante o estágio de pré­toxina, a primeira subunidade com 44 aminoácidos é denominada domínio δ e forma o peptídeo sinal. As demais subunidades formam os domínios: a, com 103 aminoácidos; γ (domínio central) e o domínio β que é o último, possuindo 83 aminoácidos, nas posições 234 a 316. Uma vez sintetizada a pré­toxina esta passa ao retículo endoplasmático, onde sofre a ação de uma peptidase que cliva o peptídeo sinal no aminoácido 26. No dictiossoma (aparelho de Golgi) celular, o fragmento remanescente (27 a 44) e os domínios δ e γ são removidos por endopeptidases codificadas pelos genes nucleares KEX1 e KEX2 em pelo menos três etapas. As subunidades a e β são então unidas por ligações covalentes dissulfeto, que provavelmente se formam entre os resíduos de cistina das subunidades (MARQUINA et al., 2002; SCHMITT e BREINIG, 2002).
Figur a 03. Mecanismo de formação da toxina K1 de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002). Os mecanismos de formação das toxinas K2 e K28 são semelhantes ao da K1. Especificamente para a formação de K2 é sintetizada uma pré­toxina inicial constituída de 362 aminoácidos, a qual após as modificações a nível de retículo endoplasmático e dictiossoma, leva à formação de subunidades a (com 180 aminoácidos) e β (com 140 aminoácidos), que constituirão a toxina madura (WICKNER, 1996). Entretanto, quanto aos mecanismos de ação sobre células sensíveis, estas três toxinas diferem principalmente quanto aos seus receptores de membrana específico, pois para todas elas a depender das condições ótimas de pH, geralmente 4,6, e de suas concentrações no sítio de ligação, inicialmente ligam­ se a seus receptores específicos para que seja possível exercerem seus efeitos letais. As toxinas K1 e K2 ligam­se a β­1,6­glicana para consequentemente interagirem com a membrana plasmática da célula sensível alterando seu potencial de membrana por provocar a
ativação de canais de íons, formando poros e causando a perda de íons, prótons e ATP (Figura 04). A toxina K28, por sua vez, liga­se inicialmente a receptores de manoproteína e age especificamente na fase G1/S do ciclo celular por interferir na reprodução assexuada por brotamento de modo a impedir a segregação do DNA para a célula filha com a consequente apoptose celular (SHIMITT e BREINIG, 2002; GOLUBEV, 2006; BUZZINI et al., 2007). Figur a 04. Mecanismo de ação da toxina K1 de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002). Uma série de trabalhos também caracterizam e descrevem duas toxinas monoméricas denominadas KHR termoestável com 20 kDa e KHS termosensível com 75 kDa que são codificadas por genes nucleares cromossomais, indicando que as bases genéticas de expressão de toxinas killer em S. cerevisiae apresentam mecanismos distintos que podem variar até mesmo dentro de uma mesma linhagem (WICKNER, 1996; BARTUNEK et al., 2001; BREINIG et al., 2002; FLEGELOVÁ et al., 2002; GOLUBEV, 2006). Linhagens de S.
cerevisiae denominadas “superkiller” por produzirem toxinas resistentes a altas temperaturas tem sido descritas e caracterizadas, demonstrando o potencial de produção de distintas toxinas por esta espécie. Palfree e Bussey (1979) relataram uma toxina de 11,5 kDa que apresentou­se estável após tratamento térmico a 30 ◦ C. Radler et al. (1990), caracterizaram uma outra toxina com 16 kDa que apresenta a manana como receptor específico de membrana isolada de outra linhagem e que apresentou ótima estabilidade após exposição a 40 ◦ C por 1 hora. 3.3.4 Padrão de Sensibilidade Killer: Utilização na biotipagem de levedur as Muitas técnicas fenotípicas e moleculares atualmente vêm sendo empregadas na discriminação intra­específica (biotipagem) de leveduras em subgrupos (biotipos) visando atender diversos objetivos, sejam eles de caráter ecológico, epidemiológico ou aplicado como, por exemplo, para identificação e/ou seleção de linhagens de interesse biotecnológico. Em processos de fermentação alcoólica, algumas linhagens contaminantes indesejáveis podem predominar causando prejuízos muito grandes na produção por reduzir drasticamente o rendimento industrial (CECCATO­ANTONINI et al., 2004). Neste caso, estes métodos discriminatórios intra­específicos auxiliam muito na identificação e monitorização destas linhagens, como também na seleção e identificação de ótimas linhagens fermentadoras, desejáveis para um processo fermentativo específico. Dentre os métodos moleculares mais empregados, destacam­se o RFLP e RAPD os quais se baseiam respectivamente em polimorfismos de tamanho do fragmento de restrição e da amplificação randômica do DNA e os amplificadores de sequências repetitivas (SSRs) ou de microssatélites (PEREZ et al., 2001; BUZZINI et al., 2007) No entanto, embora estes métodos sejam mais eficientes e sensíveis que os fenotípicos são também muito onerosos, exigem mão­de­obra qualificada e muitas vezes são inviáveis tecnicamente para a realização (GUIDI, 2000). Logo, por conta da facilidade de execução e também certa eficácia de resultado, a grande maioria dos pequenos laboratórios emprega metodologias fenotípicas de biotipagem que se baseiam principalmente na resistência celular a toxinas e substâncias antimicrobianas para a determinação de padrões de susceptibilidade que permitam a diferenciação intra­específica (SLOOS et al., 2000). A utilização do sistema killer , baseando­se no padrão de susceptibilidade de leveduras às toxinas, conhecido como Killer Sensitivity Pattern (KSP), tem sido já há algum tempo apontado por Polonelli et al. (1985) e mais recentemente por Buzzini et al. (2007) como uma
ferramenta muito vantajosa na discriminação intra­específica de leveduras por ser simples, de baixo custo, sensível e reprodutível. Estes autores foram os primeiros a demonstrar o poder discriminatório intra­específicos do KSP, através de um estudo epidemiológico com isolados de Candida albicans de pacientes hospitalizados que serviu para identificação precoce e acompanhamento de linhagens patogênicas. Posteriormente, diversos outros trabalhos com objetivos distintos obtiveram resultados satisfatórios aplicando o padrão de sensibilidade killer na caracterização de leveduras e definição de um perfil discriminatório e característico da linhagem (biotipo) em diversas outras espécies e gêneros como também em fungos patogênicos (BUZZINI e MARTINI, 2000; BUZZINI e MARTINI, 2001; BUZZINI et al., 2003; BUZZINI et al., 2004). No método proposto por Polonelli et al. (1983), um painel composto por nove leveduras pertencentes aos gêneros Picchia e Hansenula correspondentes às classes de leveduras killer K1 a K9, foi utilizado com sucesso na biotipagem de espécies de Candida sp. baseando­se no padrão de sensibilidade destas últimas frente a ação das distintas classes de leveduras killer . Através da obtenção do KSP foi possível conhecer a variabilidade de linhagens envolvidas no estabelecimento de uma infecção por leveduras deste gênero. Lopes et al. (2005) em um estudo de caracterização e diversidade de leveduras isoladas da fermentação natural da produção de vinho, associou a técnica molecular de RFLP­mtDNA com a determinação do KSP e discriminou 112 isolados da levedura Saccharomyces cerevisiae em 42 distintas linhagens, sendo que, utilizando isoladamente cada técnica só foi possível obter 19 biotipos killer e 35 linhagens pela técnica molecular. O trabalho concluiu que a utilização combinada de métodos fisiológicos e moleculares foi capaz de amplificar o poder discriminatório intra­específico, possibilitando uma melhor caracterização de leveduras atuantes na fermentação alcoólica e consequentemente auxiliar numa seleção mais refinada de linhagens melhores adaptadas às condições fermentativas de origem. Os principais obstáculos a serem superados para execução da técnica de obtenção do KSP são apontadas por Buzzini et al. (2007) e decorre principalmente da dificuldade de padronização, no que se refere especificamente à quantidade de toxina secretada pelas distintas linhagens killer e subjetividade na interpretação da inibição, podendo haver alguma inibição de crescimento não relacionada a atividade killer ou a não detecção de halos muito pequenos. Tais dificuldades, segundo o autor, podem ser suprimidas facilmente pela simples padronização do inóculo da levedura a ser utilizada no bioensaio ou utilizando­se a própria toxina purificada em concentrações padronizadas em substituição a levedura inoculada.
3.3.5 Aplicações Biotecnológicas do Sistema Killer As leveduras killer e suas toxinas apresentam inúmeras aplicações em potencial, sejam elas de caráter biotecnológico ou não (Tabela 04). Dentre os principais campos de aplicação biotecnológica, destacam­se a fermentação de bebidas, a taxonomia e a medicina pela maior freqüência de aplicação. Além desses, Marquina et al. (2002) indicam aplicações em estudos de mecanismos de processamento e secreção de proteínas, de interação das toxinas com as células sensíveis (SCHMITT, 1995), controle biológico na agricultura (WALKER et al., 1995) e tecnologia da preservação de alimentos (LOWES et al., 2000). Vale salientar que as leveduras killer vêm sendo utilizadas como sistemas modelo em pesquisa básica para estudar os mecanismos de regulação de processamento, secreção e ligação de polipeptídeos eucarióticos a seus receptores de membrana. Através da tecnologia de DNA recombinante, plasmídeos killer de S. cerevisiae e Kluyveromyces lactis podem ser úteis como vetores de clonagem para secreção efetiva de polipeptídeos exógenos expressados (DIGNARD et al., 1991). Na indústria de alimentos, especificamente em processos de fermentação alcoólica, estas leveduras estão sendo muito utilizadas como “starters”, ou seja, culturas iniciadoras do processo fermentativo, devido principalmente à vantagem conferida pela característica killer em combater contaminantes nativos do processo produtivo de bebidas e alimentos em geral como, por exemplo, cerveja (YOUNG, 1981), vinho (SANGORRÍN et al., 2001; LOPES et al., 2005; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007a; LOPES et al., 2007b), cachaça (LIMA et al., 2007), pão (BORTOL et al., 1986), sendo também aplicadas com eficiência no controle biológico de leveduras indesejáveis na preservação de alimentos (PALPACELLI et al., 1991). Na área biomédica, as leveduras killer estão sendo utilizadas particularmente na biotipagem de espécies patogênicas como Candida albicans, Cryptococcus spp. e Staphylococcus epidermidis (YOUNG e YORGIU, 1978; POLONELLI et al., 1985; FUENTEFRIA et al., 2008). As toxinas, por sua vez, são alvos de uma série de estudos que destacam seu notável potencial terapêutico e preventivo em micoses superficiais e sistêmicas em humanos e animais. Estão sendo utilizadas no desenvolvimento de promissores agentes antimicóticos, de anticorpos e antibióticos, sintéticos ou naturais, capazes de exercer as mesmas atividades das toxinas killer correspondentes e de vacinas idiopáticas (BUZZINI e MARTINI, 2001; MAGLIANI et al., 2001; POLONELLI et al., 2003; MAGLIANI et al., 2004; MAGLIANI et al., 2005; FIORI et al., 2006).
Tabela 04. Principais aplicações descritas das leveduras killer e suas respectivas toxinas. Fonte: Marquina et al. (2002) Campo de aplicação Biotecnológica Controle Biológico na Agricultura Fermentação de bebidas Pesquisa de biologia celular em células eucarióticas Tecnologia de alimentos Genética Medicina Taxonomia Aplicação Atividade antifúngica contra podridão da madeira e fungos fitopatogênicos. Controle de contaminantes indesejáveis e como linhagens iniciadoras de processos fermentativos. Estudos de biossíntese, processamento celular e secreção de proteínas. Preservação de alimentos de origem natural. “Fingerprinting” de leveduras do vinho. Tecnologia do DNA recombinante. Atividade zimocida conta patógenos. Padrão de sensibilidade killer como indicativo de parentesco filogenético. As leveduras e toxinas killer além de apresentarem uma grande potencialidade de aplicação, sendo ambas exploradas em diversos setores de aplicação biotecnológica, costumam predominar em habitats naturais (MAGLIANI et al., 1997; SCHMITT e BREINIG, 2002). Sendo assim, uma maior prospecção destes microrganismos em novos nichos e ambientes ainda não estudados, contribuirá para o maior conhecimento da diversidade e possibilitará o surgimento de novas aplicações para o sistema killer . 3.4 LEVEDURAS KILLER E A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA De maneira similar a existência da relativa abundância das leveduras killer no meio ambiente, em processos industriais de fermentação alcoólica, as espécies e linhagens predominantes geralmente apresentam uma alta frequência de atividade killer (CECCATO­ ANTONINI et al., 2004). Este fato é o reflexo de sua vantagem competitiva sobre leveduras comerciais que, em sua maioria, são sensíveis as linhagens killer (SOARES e SATO, 1999). Uma grande ênfase tem sido dada para que sejam utilizadas leveduras selecionadas em processos fermentativos em geral, não somente para a produção de cachaça de alambique,
devido às inúmeras vantagens concedidas de acordo com os diversos critérios empregados no processo de seleção destas leveduras (OLIVEIRA et al., 2005b; LOPES et al., 2007b). Entretanto, caso uma levedura sensível quanto ao fenótipo killer seja selecionada, a mesma pode ser suprimida durante o processo de fermentação por leveduras killer selvagens e indesejáveis causando baixa qualidade no produto final ou até mesmo retardo ou parada da fermentação alcoólica (PEREZ et al., 2001). Fato que pode ser agravado se a região e/ou o ambiente onde ocorre o processo fermentativo apresentar uma ampla distribuição de leveduras killer nativas, pois de acordo com Lopes et al. (2006), isto indica que a atividade killer exerce fundamental importância durante a fermentação, influenciando na competição natural entre as leveduras atuantes sendo portanto, determinante para o estabelecimento das linhagens predominantes do processo. Logo, neste contexto, a presença do fenótipo killer torna­se uma característica imprescindível em leveduras selecionadas com o objetivo de serem aplicadas como culturas iniciadoras (PEREZ et al., 2001). Portanto, a realização de estudos visando conhecer o grau de distribuição e ocorrência das leveduras killer numa determinada região ou ambiente fermentativo, antes de iniciar o processo de seleção de leveduras nativas melhor adaptadas a uma determinada região e processo fermentativo, consiste numa etapa muito importante para o sucesso da linhagem selecionada (SANGORRÍN et al., 2001; LOPES et al., 2007b) Uma série de estudos tem sido realizada em leveduras isoladas de processos fermentativos naturais para produção de vinho, visando caracterizar a ocorrência, distribuição e comportamento killer a fim de que sejam utilizadas como culturas iniciadoras (SANGORRÍN et al., 2001; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2005; LOPES et al., 2006; LOPES et al., 2007a; LOPES et al., 2007b). Eles demonstram e/ou indicam que as leveduras killer são capazes de impor uma enorme vantagem competitiva, o que inibe o desenvolvimento de linhagens sensíveis indesejáveis, minimizando os níveis de contaminação, assegurando a permanência da linhagem selecionada durante o processo e consequentemente aumentando a eficiência da fermentação, contribuindo para a garantia de padrões de qualidade bem definidos a cada produção. Um estudo realizado por Torrea–Goñi e Ancín­Azpilicueta (2002), mostrou também que, durante o ciclo fermentativo, as leveduras killer são mais eficientes no consumo de aminoácidos e compostos de nitrogênio presentes no mosto minimizando a acidez volátil no produto final. De acordo com Zagorc et al. (2001), quando uma levedura combina fenótipo killer com características enológicas ideais, produzem um vinho de excelente qualidade devido ao estabelecimento de uma fermentação sem competição e com maior rendimento.
Quanto à manifestação do fenótipo killer durante a fermentação, é relevante considerar que se apresenta variável de acordo com as fases do ciclo fermentativo, pois no transcorrer do mesmo, as medidas de pH e temperatura são normalmente alteradas influenciando diretamente na estabilidade da toxina secretada (ZAGORC et al., 2001). Além disto, em fermentações espontâneas para a produção de vinho, a magnitude do efeito killer depende de fatores como a presença de substâncias no mosto que são adsorventes de proteínas (YOUNG, 1987), as condições ambientais e a fase de crescimento das células sensíveis (WOODS e BEVAN, 1968), a presença de leveduras neutras protetoras (DA SILVA, 1996), a susceptibilidade das linhagens sensíveis às toxinas killer de diferentes linhagens de leveduras (VAN VUUREN e JACOBS, 1992), a quantidade do inóculo e disponibilidade de nitrogênio (NALLY et al., 2005) e principalmente, a proporção inicial entre leveduras killer e linhagens sensíveis (PÉREZ et al., 2001). A compatibilidade e o tipo da linhagem de levedura associada que pode ser utilizada em fermentações alcoólicas pelo processo de co­cultivo deve ser cuidadosamente avaliada para evitar interferência entre células sensíveis e killer (VAGNOLI et al., 1993). Resultados contraditórios sobre os níveis iniciais adequados de células killer e sensíveis presentes num inóculo iniciador para a determinação de condições fermentativas que propiciem uma atividade killer efetiva, têm sido divulgados e por isso estudos adicionais são requeridos. Alguns autores relatam terem obtido predominância e atividade de linhagens killer, quando as mesmas são inoculadas em baixos níveis, correspondendo a 0,01 a 10% da população total de leveduras S. cerevisiae (VAN VUUREN e WINGFIELD, 1986; VAN VUUREN e JACOBS, 1992). No entanto, outros apenas encontraram tal predomínio quando o inóculo de leveduras killer correspondeu a mais que 50% (PETERING et al., 1991). A constatação da ampla difusão do fenótipo killer em leveduras nativas de processos fermentativos naturais para produção de vinho (SANGORRÍN et al., 2001) e do bom desempenho fermentativo das mesmas como culturas iniciadoras (LOPES et al., 2007a), estimula a utilização da característica killer em leveduras como um dos principais critérios a serem analisados no processo de seleção de leveduras adequadas para produção de cachaça de alambique. Contudo, embora a ocorrência e o papel das leveduras killer estejam muito bem determinados em diversos ciclos fermentativos espontâneos da produção de vinho, pouco se conhece sobre a ocorrência, distribuição e o papel destas leveduras em fermentações espontâneas para produção de cachaça (MORAIS et al., 1997; LIMA et al., 2007).
4 MATERIAL E MÉTODOS Para facilitar o entendimento do delineamento experimental, o fluxograma abaixo (Figura 05) ilustra todas as etapas metodológicas que são descritas a seguir de acordo com sua ordem de realização. Isolamento de leveduras Determinação da atividade killler e influência da temper atura (25°C, 28°C e 32°C) Isolados killer X Levedur as do Gr upo S Isolados com Atividade Positiva Isolados killer X Leveduras do Grupo NS Deter minação do KSP (Killer Sensitivity Pattern ) Isolados com Atividade Positiva Caracterização Molecular: Sequenciamento do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA Identificação molecular e Análise filogenética
Figur a 05. Fluxograma da metodologia geral realizada neste trabalho. 4.1 COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS A coleta foi realizada em sete distintos produtores de cachaça de alambique, ou destilarias (DEST), pertencentes aos municípios de Ibirataia, Jaguaripe, Ilhéus, Condeúba, Caculé e Rio de Contas, todos localizados no estado da Bahia (Figura 06). As leveduras isoladas para os testes de determinação do comportamento killer foram coletadas em diferentes regiões do estado da Bahia com o intuito de se obter uma maior representatividade das distintas comunidades de leveduras fermentadoras do mosto da cana­de­açúcar. B D C A F Ibir ataia E J aguar ipe Ilhéus Rio de Contas Caculé G
C ondeúba Figur a 06. Mapa do estado da Bahia destacando suas Mesorregiões e os municípios onde estão localizadas as sete destilarias em que foram realizadas as coletas. (A) Extremo Oeste Baiano; (B) Vale São­Franciscano da Bahia; (C) Centro­Norte Baiano; (D) Nordeste Baiano; (E) Centro­Sul Baiano; (F) Metropolitana de Salvador; (G) Sul Baiano. Fonte: Adaptado de http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bahia_Mesoregions.svg. A partir de cada uma das 18 dornas de fermentação, uma alíquota de 50 mL do mosto em fermentação foi retirada com um tubo Falcon estéril desde o momento em que o mosto foi vertido na dorna sobre o fermento, marcando assim o início do processo fermentativo, de modo que a primeira amostra coletada foi chamada de tempo 0 (T0). E assim, a cada diminuição de dois graus °Brix (teor de sólidos solúveis) do mosto em fermentação, uma nova amostra correspondendo a um novo momento (T1, T2, T3...) era coletada até que este valor chegasse à 0°Brix (zero) indicando o fim do processo fermentativo. Após a homogeneização de cada amostra de 50 mL, foi retirado 1,0 mL para realização da diluição decimal seriada em tubos de ensaio contendo água peptonada 0,1% estéril até a diluição na ordem de 10 ­7 . Em seguida, a partir de cada tubo que correspondia a uma determinada concentração do mosto, 100µL foram retirados e espalhados com auxílio de alça de Drigalski, sob condições assépticas, sobre a superfície do meio ágar­SCY (Anexo A) contido em placas de Petri estéril (90 x 15 mm). Após este plaqueamento das triplicatas, as placas de Petri foram armazenadas a temperatura ambiente (25°C) e as leituras do crescimento de colônias de leveduras foram realizadas desde o segundo até o décimo dia de inoculação. Após isolamento das colônias de leveduras em placa, procedeu­se a purificação dos isolados, que foi feito a partir das colônias isoladas nas diferentes diluições realizadas. Em seguida, a partir de cada amostra coletada (T0, T1, T2...), os morfotipos de colônias predominantes e os distintos que surgiram, foram repicados por estria composta sobre a superfície do meio ágar­Sabouraud (Anexo A) contido numa outra placa de Petri. Para a garantia da obtenção de culturas de leveduras puras, cada colônia isolada crescida foi repicada por estria simples sobre a superfície do ágar­Sabouraud contido numa outra placa de Petri a qual foi incubada sob as mesmas condições. Para cada cepa de levedura obtida, foi estabelecida uma denominação em código que expressa sua origem de isolamento: DEST“x” D“y” T“z” ID da colônia; significando respectivamente a destilaria de origem (DEST); o número da dorna de fermentação (D); o tempo ou momento da coleta (T), correlacionado com o °Brix na dorna e o número da colônia isolada inicialmente na primeira placa (ID da colônia), sendo “x”, “y” e “z” as respectivas destilarias, dornas e tempo de coleta.
4.1.1 Deter minação do pH, temper atura e °Brix do mosto da cana­de­açúcar em fer mentação A cada amostra coletada, foram realizadas medidas de pH, temperatura, do tempo e do °Brix do mosto em fermentação. A detecção dos valores de pH foi realizada no momento da coleta de cada alíquota, mergulhando uma fita padrão para determinação de pH diretamente no mosto em fermentação presente na dorna. Com a utilização de termômetro convencional, os valores de temperatura também foram obtidos no momento da coleta das alíquotas, com a introdução direta do termômetro no mosto em fermentação contido na dorna. Através da utilização de um sacarímetro de Brix, o teor de sólidos solúveis totais expressos em teor de sacarose (°Brix) foi monitorado em intervalos médios de 20 a 30 minutos durante todo o processo fermentativo desde o momento da primeira alíquota coletada. Este acompanhamento do teor de sacarose permitiu que cada nova amostra coletada fosse distinta da anterior por 2 °Brix a menos, sendo desta forma, determinante para a indicação do momento exato das coletas. 4.1.2 Pr eser vação das levedur as isoladas Cada isolado de levedura foi crescido em 850µL de meio GYMP em caldo (Anexo A) contidos em criotubos de capacidade de 2,0mL de volume. Os tubos foram colocados inclinados, de modo a permitir aeração, em incubadora shaker por 24 horas a uma temperatura de 28°C e rotação de 200 rpm. Após este período, 150µL de glicerol estéril foram acrescentados sobre o caldo GYMP, seguindo­se de uma homogeneização suave. Os criotubos foram devidamente identificados (DEST”x” D”y” T”z” ID da colônia) e armazenados em ultrafreezer a ­85°C em caixas apropriadas para criopreservação devidamente organizadas e identificadas. Todo o processo foi realizado em triplicata.
4.1.3 Manutenção e r eativação das culturas de levedur a Todos os isolados de leveduras utilizados neste trabalho, incluindo as leveduras de referência, foram conservados, além de preservados em ­85°C, em meio ágar­YEPD (Anexo A) contido em placas de Petri e repicados sucessivamente a cada período máximo de 2 meses. As leveduras foram crescidas em estufa incubadora B.O.D. sob temperatura de 28°C por 48 horas e mantidas em geladeira sob temperatura média de 4°C. Para reativação dos isolados criopreservados a ­85°C foram feitos repiques em meio ágar­YM (Anexo A) contido em placas de Petri, os quais foram incubados em estufa B.O.D., sob temperatura de 28°C, por um período de 3 a 7 dias. Após crescimento, as leveduras foram novamente repicadas para o meio ágar­YEPD e mantidas em geladeira (4°C) até que fossem requeridas para os testes. 4.2 AMOSTRAGEM PARA OS TESTES DE COMPORTAMENTO KILLER A partir de cada fase de um processo fermentativo (inicial, intermediária e final), foram escolhidos seis isolados de levedura totalizando 18 de cada dorna. Deste modo, foi possível obter uma boa representatividade das leveduras associadas às fermentações dos sete distintos produtores de cachaça de alambique (DEST1 a DEST7). As fases da fermentação foram delimitadas de acordo com os tempos de coleta das alíquotas (T) em função do teor de sólidos solúveis totais (°Brix) do mosto em fermentação, de modo que a fase inicial foi representada pelos dois tempos iniciais (Tin), a intermediária pelos dois mais intermediários (Tint) e a fase final pelos dois últimos tempos (Tfinal) de coleta (Figura 07). O número de tempos de coleta numa determinada dorna de fermentação foi dependente do °Brix inicial do mosto da cana­de­açúcar, o qual foi monitorado durante todo ciclo fermentativo. De cada tempo foram selecionados, prioritariamente, três morfotipos predominantes e também distintos entre si.
DORNA DE FERMENTAÇÃO
Fase inicial Tin 06 isolados Fase intermediária Tint 06 isolados Fase final Tfinal 06 isolados Figur a 07. Fotos de dornas em diferentes fases da fermentação do mosto da cana­de­açúcar (Tin, Tint e Tfinal) em que as coletas das amostras foram realizadas. 4.3 PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER Os isolados de leveduras escolhidos para os testes foram submetidos a uma triagem inicial que selecionou aqueles que possuíam fenótipo killer , como também verificou a estabilidade das toxinas produzidas em diferentes temperaturas (25°C, 28°C e 32°C); posteriormente, os que apresentaram atividade, passaram por uma análise de comportamento que avaliou cada um deles quanto à ação letal sobre outras leveduras associadas aos processos fermentativos também isoladas no presente trabalho e, finalmente, o comportamento de sensibilidade destas frente às distintas classes de leveduras killer de referência. 4.3.1 Teste para deter minação da atividade killer As linhagens de referência como padrão de sensibilidade killer Saccharomyces cerevisiae NCYC1006 e Candida glabrata Y­55 ATCC90525, foram utilizadas para a determinação da atividade killer das leveduras escolhidas e Saccharomyces cerevisiae NCYC232, produtora da toxina K1, utilizada como levedura killer padrão servindo como controle positivo para os testes. Antes da realização dos testes, todas as leveduras foram repicadas e submetidas a crescimento em estufa B.O.D. a temperatura de 28°C, por 24 horas. Os testes foram realizados utilizando­se a técnica de semeadura em meio ágar­YEPD­ MB (extrato de levedura 10g.L ­1 , glicose 20g.L ­1 , peptona 20g.L ­1 , ágar 20g.L ­1 , azul de metileno 0,03g.L ­1 ; tamponado ao pH 4,0 com tampão citrato­fosfato 0,5 M) contido em placa de Petri conforme descrito por Sangorrín et al. (2001) ligeiramente modificado e citado a seguir. A atividade killer de cada um dos isolados escolhidos para o teste foi avaliada contra as duas linhagens padrão de sensibilidade, Saccharomyces cerevisiae NCYC1006 e Candida glabrata Y­55 ATCC90525, as quais foram ressuspensas em solução salina 0,85% até a concentração de aproximadamente 5 x 10 5 UFC/mL. Em seguida, 100µL desta suspensão celular correspondente a cada uma das linhagens sensíveis foram espalhados, com auxílio da alça de Drigalski, sobre a superfície do meio ágar­YEPD­MB contido em placas de Petri (90 x 15 mm). Após a secagem da suspensão, os isolados de levedura foram inoculados em forma de ponto, conforme a Figura 08, com auxílio da alça de platina, sobre cada uma das placas correspondentes a uma linhagem sensível de referência, de forma que, em cada placa de Petri, foi possível inocular 11 isolados teste mais a linhagem Saccharomyces cerevisiae NCYC 232 que serviu de controle positivo (produtora da toxina K1 que é letal às duas linhagens teste). A B C K1
Figur a 08. Fotos de etapas da realização do teste para determinação da atividade killer . (A) Espalhamento de 100µL da suspensão celular da levedura sensível de referência; (B) Após secagem, inoculação das leveduras em forma de ponto; (C) Verso da placa de Petri, destacando a localização de cada levedura inoculada e da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 232, produtora da toxina K1 (controle positivo). As placas foram incubadas em estufa B.O.D. a 25 ◦ C por 72 horas e observadas diariamente. A presença do fenótipo killer (K + ) foi constatada nos isolados em que houve formação de uma zona clara de inibição em volta da colônia, onde não houve crescimento da levedura sensível, delimitada por um halo adjacente de células coradas em azul que evidencia morte celular e é indicativo de atividade killer (YOUNG, 1987). O isolado de levedura foi considerado killer , quando esta característica foi observada contra, ao menos, uma das duas distintas linhagens padrão de sensibilidade. Todos os testes foram realizados em triplicata para cada um dos isolados de levedura testados. As etapas do teste para determinação da atividade killer são descritas na Figura 09. LINHAGENS PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER: Saccharomyces cerevisiae NCYC1006; Candida glabrata Y­55 ATCC90525 Meio ágar­YEPD–MB semeado com 100µL da suspensão celular das linhagens sensíveis Inoculação das levedur as isoladas das destilar ias e Saccharomyces cerevisiae NCYC232 (contr ole positivo) 3 DIAS/ 25 O C Halo de inibição delimitado por zona adjacente de células cor adas em a zul PRESENÇA: per fil Killer AUSÊNCIA: per fil Sensível ou Neut r o
Figur a 09. Fluxograma para determinação da atividade killer . 4.3.2 Influência da temperatura sobr e a atividade killer das levedur as Testes de determinação da atividade killer foram realizados com os isolados que se apresentaram positivos nos testes da triagem inicial, anteriormente descrito, modificando apenas a temperatura de incubação. Assim, para cada isolado killer encontrado, foram feitos mais dois testes em que as temperaturas de incubação foram respectivamente 28°C e 32°C. 4.4 AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS A atividade inibitória dos isolados de levedura killer previamente encontrados foi verificada sobre outras leveduras associadas aos processos fermentativos que foram distribuídas em dois distintos grupos denominados de S (Tabela 05) e NS (Tabela 06). Tais grupos foram formados, principalmente, a partir dos resultados de identificação bioquímica dos isolados de leveduras obtidos do trabalho de mestrado (dados ainda não publicados) da aluna do Programa de Pós Graduação em Biotecnologia UEFS/FIOCRUZ­BA, Alice Ferreira da Silva. Tabela 05. Leveduras integrantes do grupo “S” – identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação e que não apresentaram fenótipo killer . Dados de temperatura (°C) e °Brix do mosto em fermentação no momento em que foram coletadas Código DEST3 D1 T0 1 DEST3 D1 T0 2 DEST3 D1 T0 3 DEST3 D1 T1 1 DEST3 D1 T1 2 DEST4 D3 T0 3 DEST4 D3 T1 1 DEST4 D3 T1 2 DEST5 D2 T0 1 DEST5 D2 T0 3 DEST5 D2 T0 12 DEST7 D2 T1 1 DEST7 D2 T1 2 DEST 7 D2 T1 3 DEST2 D2 T0 6 DEST2 D2 T1 3 DEST2 D2 T1 10 DEST6 D1 T0 1 DEST6 D1 T1 3 DEST6 D2 T0 2 Temper atura do mosto de origem (°C) 24 24 24 26 26 25 27 27 23 23 23 30 30 30 27 28 28 24 29 24 °Brix do mosto de or igem 13 13 13 11 11 10 8 8 16 16 16 13 13 13 14 11 11 23 20 23
Tabela 06. Leveduras integrantes do grupo “NS” – identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae. Dados de temperatura (°C) e °Brix do mosto em fermentação no momento em que foram coletadas Código DEST1 D2 T1 2A DEST1 D2 T4 2 DEST1 D2 T5 1A DEST1 D2 T7 1A DEST1 D2 T7 1B DEST1 D2 T7 2A DEST1 D2 T7 3A DEST1 D2 T7 3B DEST5 D2 T1 17 DEST5 D2 T1 19 DEST5 D2 T3 16 DEST5 D2 T4 3 DEST5 D2 T1 13A DEST4 D3 T0 2 DEST4 D3 T0 1 DEST4 D3 T2 1 DEST4 D3 T0 14 DEST7 D2 T0 3 DEST7 D2 T0 15 DEST7 D2 T0 10B DEST7 D2 T0 24 Temperatur a do mosto de or igem (°C) ND 30,0 34,0 34,0 34,0 34,0 34,0 34,0 25,5 25,5 30,0 32,5 25,5 25,0 25,0 28,0 25,0 27,0 27,0 27,0 27,0 °Brix do mosto de or igem 11 5 3 0 0 0 0 0 14 14 10 8 14 10 10 6 10 15 15 15 15 A determinação da atividade micocinogênica dos isolados de levedura killer sobre cada uma das 20 leveduras integrantes do grupo S e 21 leveduras integrantes do grupo NS, foi realizada conforme já descrito no item “4.3.1 ­ Teste para determinação da atividade killer”. 4.5 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN ­ KSP) DAS LEVEDURAS KILLER Nove leveduras de referência, gentilmente cedidas pela Dra. Ormezinda Fernandes Cristo Celeste do Centro de Pesquisa Leônidas e Maria Deane (CPqLMD) / Fiocruz­ Amazônia, formaram um painel representativo de distintas classes de leveduras killer , K1 a K9 (Tabela 07). Estas leveduras foram utilizadas para determinar o KSP das leveduras killer previamente encontradas entre todas que foram escolhidas e submetidas à triagem inicial para
determinação do fenótipo killer . Para isso, cada uma destas linhagens teve sua sensibilidade avaliada frente às nove distintas leveduras que compuseram o painel. Tabela 07. Leveduras de referência correspondentes a nove distintas classes de leveduras killer Levedur a killer de referência Classe killer Hansenula sp. Pichia sp. Hansenula anomala Hansenula anomala Hansenula anomala Hansenula californica Hansenula canadensis Hansenula dimennae Hansenula mrakii K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 Os testes foram realizados de acordo com a metodologia descrita no item 4.3.1, de forma que as nove leveduras de referência foram inoculadas em forma de ponto sobre a superfície do meio ágar­YEPD­MB contido em placa de Petri. Antes da inoculação, as placas foram previamente semeadas com 100µL da suspensão celular correspondentes a cada uma das leveduras killer encontradas. Os resultados obtidos possibilitaram a criação de uma matriz de dados binários, na qual o número 1 (um) foi considerado como sensibilidade à toxina killer e o número 0 (zero) como ausência de sensibilidade. Dessa forma, através da utilização do programa PAUP* (SWOFFORD, 2001), foi possível gerar coeficientes de similaridade baseados no índice SM (Simple Matching ) e realizar agrupamentos pelo método UPGMA (Unweighted pair group with aritmetic average), que permitiram a criação de um dendrogama gráfico utilizado na interpretação dos resultados.
4.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR Todos os isolados de leveduras pertencentes ao grupo NS e aqueles com fenótipo killer, que tiveram atividade micocinogênica determinada também contra leveduras integrantes dos grupos S e NS, foram selecionados para identificação e caracterização molecular, através da análise de suas respectivas sequências de DNA representativas da região D1/D2 do gene 26S do DNA ribossomal (Figura 10). 4.6.1 Obtenção de biomassa e extração de DNA genômico Antes da obtenção do DNA total, os isolados foram repicados em placas de Petri, com meio ágar­YEPD, onde foram incubados a 28ºC por 48 horas. Após crescimento, cada isolado foi inoculado em 1,5mL de caldo YEPD contido em microtubos de 2,0 mL e incubados sob agitação orbital mecânica a 250 rpm por 12 horas a uma temperatura de 28°C. Em seguida, cada amostra foi centrifugada em seus respectivos microtubos a 13.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e a massa celular obtida submetida à maceração com nitrogênio líquido com auxílio de bastões de vidro. Logo em seguida, cada tubo foi acrescido de 1,0 mL de tampão de extração de DNA [2% CTAB; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA (pH 8,0); 100 mM Tris HCl (pH 8,0); 2% PVP­40] previamente aquecido a 65ºC por 30 minutos e 4,0 μL de β­mercaptoetanol de acordo com protocolo modificado de Doyle e Doyle (1987). Os tubos foram invertidos por algumas vezes e colocados em banho­maria a 65ºC por 30 min até a completa homogeneização. Após este tempo, adicionou­se aos tubos já em temperatura ambiente, 800μL de Clorofórmio: Álcool Isoamílico (24:1), seguindo­se com constante agitação por 60 minutos. Posteriormente, foi realizada centrifugação a 13.000 rpm por 10 min, seguindo da transferência da fase aquosa superior para novos tubos, tomando cuidado para não contaminá­la com a interfase. Aos novos tubos foi adicionado isopropanol gelado, ao mesmo volume da fase superior que foi transferida seguindo­se de inversões sucessivas por várias vezes antes de serem e deixados por 12 horas a uma temperatura de ­20ºC. Uma nova centrifugação a 13.000 rpm por 10 minutos foi realizada para obtenção do precipitado, o qual foi lavado três vezes com 1 mL de etanol 70% e centrifugado a 13.000 rpm por 5 min aos intervalos das lavagens evitando sua perda. Por fim, os tubos contendo o precipitado foram colocados para secar sob temperatura
ambiente. Depois de seco, acrescentou­se ao precipitado 50μL de tampão Tris­EDTA (TE) e as amostras foram armazenadas a ­20ºC. Figur a 10. Estrutura de DNA ribossomal (rDNA), composto por sequências codificadoras altamente conservadas dos RNAs ribossomais (rRNAs) 18S, 5,8S e 25­28S, intercaladas com regiões não codificadoras menos conservadas (ITS e IGS). Fonte: adaptado de VILGALYS LAB, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm Para avaliação da qualidade e quantidade do DNA extraído, 3,0 μL de cada amostra acrescido de 4,0 μL do corante azul de bromofenol, foram submetidos ao processo de eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) em tampão TAE 1X, corado com 2,0 μL “SYBR Safe” (Invitrogen), submersos na cuba com tampão TAE 1X. Como parâmetro da concentração de DNA obtida, utilizou­se o marcador “Lambda DNA/HindIII Markers” (Promega). O gel foi submetido a uma voltagem de 60 volts (V) e corrente de 50 miliamperes (mA) por 1 hora e 30 minutos. Ao final da eletroforese, o gel foi visualizado em transiluminador de luz UV. Em seguida, as amostras muito concentradas foram diluídas em TE para a concentração de 50 ng/µL e estocadas a 4°C até serem requeridas nas reações de amplificação. 4.6.2 Amplificação do domínio D1/D2 do gene 26S do r DNA A sequência de DNA correspondente a região D1/D2 do gene 26S do rDNA, foi amplificada através de reações em cadeia da enzima DNA polimerase, utilizando­se o iniciador (primer ) direto LR0R (5’­ACCCGCTGAACTTAAGC­3’) e o reverso LR5 (5’ TCCTGAGGGAAACTTCG­3’), os quais se alinham respectivamente, com as sequências homólogas nas posições 26­42 e 964­948 da subunidade maior do RNA ribossomal (rRNA)
da levedura Saccharomyces cerevisae disponível no GenBank, amplificando um trecho de aproximadamente 900 pares de bases (Figura 11). Domínio D1/D2 (900pb)
Figur a 11. Iniciadores (primers) para amplificação da subunidade maior do DNA ribossomal (LSU 25­28S). Em vermelho, destaque para a região correspondente ao domínio D1/D2 e os iniciadores LR0R e LR5 utilizados em sua amplificação. Fonte: adaptado de VILGALYS LAB, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm. As reações da PCR (Polymerase Chain Reaction) foram realizadas em microtubos de 0,2 mL e ajustadas para um volume final de 25 μL. A concentração final dos componentes foi: tampão da Taq DNA polimerase 1X, 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 1,0 pmol/μL de cada primer , 0,02 μL de Taq DNA polimerase, 1,0 ng/μL de DNA genômico e água mili­Q q.s.p. 25µL. As reações foram feitas em paralelo com um controle negativo a fim de verificar possíveis contaminações. Em seguida, cada microtubo contendo 25 µL dos componentes da reação foram colocados em aparelho termociclador (Mastercycler, Eppendorf), programado com as condições de reação de acordo com protocolo modificado de Gardes e Bruns (1993). As amostras foram submetidas a um ciclo de desnaturação inicial de 94ºC por 1 min e 25 segundos, seguido de 35 ciclos compostos pelas etapas de desnaturação a 95ºC por 35 segundos, anelamento a 55ºC por 55 segundos e extensão a 72ºC por 2 min. Ao final dos 35 ciclos, as amostras foram submetidas a mais um ciclo de extensão a 72º C por 10 minutos. Após a amplificação, cada amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose conforme descrito anteriormente no item 4.6.1., diferindo apenas pelo fato de que a qualidade e quantidade do DNA amplificado foram estimadas através de comparação com o marcador de peso molecular “Gene Ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas). 4.6.3 Purificação e sequenciamento dos produtos da PCR Os produtos da PCR foram devidamente enviados ao centro de serviços da Macrogen USA (order number 081222FN_039) onde foram purificados e sequenciados. O processo de purificação foi realizado através do PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen) utilizando­se de beads magnéticas, seguindo as orientações do fabricante. As reações de sequenciamento foram realizadas sob as condições do BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences), conforme manual do fabricante e processadas no seqüenciador automático ABI 3730x1 “Genetic Analyzer” (Applied Biosystems). 4.6.4 Análises das sequências Os cromatogramas obtidos do sequenciamento foram editados e analisados pelos programas EditSeq e SeqMan pertencentes ao pacote de programas “DNASTAR Lasergene 8”. As sequências resultantes foram submetidas ao BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e comparadas com sequências depositadas no GenBank. Desta forma, por meio de alinhamentos realizados entre sequências já descritas e depositadas no banco de dados do NCBI (Gen Bank) e as sequências correspondentes a cada isolado de levedura, foi possível realizar a identificação molecular de cada um destes isolados. 4.6.4.1 Análise filogenética Foi construída uma árvore filogenética com as sequências de DNA das leveduras killer que foram identificadas molecularmente como pertencente ao táxon Saccharomyces cerevisiae. O alinhamento das sequências de DNA foi obtido através do programa CLUSTAL X (THOMPSON et al., 1997). A árvore foi gerada com o pacote PAUP* (SWOFFORD, 2001), usando o método “neighbour­joining” (SAITOU e NEI, 1987). A distância entre as sequências foi calculada baseada no modelo Kimura de dois parâmetros (KIMURA, 1980) e a análise do bootstrap (FELSENSTEIN, 1985) foi baseada em 1000 replicações.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS No total, 324 isolados de levedura representativos de todas as dornas de fermentação dos sete distintos produtores de cachaça de alambique, foram isolados, purificados, preservados a ­85°C e selecionados para os testes de comportamento killer. A Tabela 08 mostra o número de isolados selecionados por destilaria, que variou entre 36 e 54 pois o número de dornas utilizadas para fermentação alcoólica foi de duas ou três unidades, dependendo da destilaria. Segundo Cardoso (2006) em um processo fermentativo reconhecido como ideal para as leveduras fermentadoras, a temperatura deve variar entre 25 e 32°C, o °Brix inicial do mosto a ser fermentado deve apresentar­se entre 14 e 16 e o mesmo é finalizado dentro de um período médio de 24 horas. No entanto, como todos os 324 isolados foram coletados de maneira representativa de todo o ciclo fermentativo de cada dorna de fermentação presente nas sete distintas destilarias, foi possível obter leveduras associadas as mais diversas condições fermentativas de temperatura e °Brix, bem como distintos tempos de duração do processo. Com exceção da destilaria número 2 (DEST 2), o pH foi a única medida que não oscilou, permanecendo sempre em 4,0, em todos os tempos de coleta e dornas coletadas pertencentes aos distintos produtores de cachaça de alambique (destilaria) (Tabela 09). Tabela 08. Número de isolados de leveduras submetidos à determinação do fenótipo killer por destilaria (DEST) e municípios de origem Destilar ia Município Númer o de dor nas coletadas Númer o de isolados DEST 1 DEST 2 DEST 3 DEST 4 DEST 5 DEST 6 DEST 7 Total Ibirataia Jaguaripe Ilhéus Condeúba Caculé Rio de Contas 02 03 02 03 03 02 36 54 36 54 54 36 Rio de Contas 03 18 54 324 DEST 1 a DEST 7 – Destilarias onde foram realizadas as coletas.
Tabela 09. Dados de coleta (°Brix, Temperatura, Horário e pH), referentes ao mosto da cana­de­açúcar em fermentação, em cada dorna pertencente às sete distintas destilarias (DEST 1 a DEST 7) Dor na T0 T1 °Brix 12 10,5 Temp. 21 ° C 24 ° C Horário 08:18 09:57 pH 4,0 4,0 Dor na T0 T1 °Brix 12,5 11 Temp. X ° C X ° C Horário 13:40 14:38 pH 4,0 4,0 T2 7,5 27 ° C 11:00 4,0 T2 9,5 X ° C 15:20 4,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 T1 13 10 25 ° C 27 ° C 10:15 20:15 3,0 3,0 T0 T1 14 11 27 ° C 28 ° C 12:15 22:15 3,0 3,0 T0 T1 12 7 28 ° C 31 ° C 11:50 21:50 3,0 3,0 T2 9 27 ° C 06:15 3,0 T2 9 28 ° C 08:15 3,0 T2 6 32 ° C 02:15 3,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 T1 13 11 24 ° C 26 ° C 11:00 12:30 4,0 4,0 T0 T1 15 12 26 ° C 27 ° C 13:15 14:20 4,0 4,0 T2 9 27 ° C 15:00 4,0 T2 10 28 ° C 15:41 4,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 T1 14 12 25 ° C 27 ° C 12:00 22:50 4,0 4,0 T0 T1 10 8 25 ° C 28 ° C 12:00 00:00 4,0 4,0 T0 T1 10 8 25 ° C 27 ° C 15:40 20:45 4,0 4,0 T2 10 28 ° C 09:30 4,0 T2 6 28 ° C 10:48 4,0 T2 6 28 ° C 00:50 4,0 Tabela 09. Continuação
DESTILARIA 1 T3 T4 5,5 4 28 ° C 30 ° C 11:26 12:19 4,0 4,0 T3 T4 7 5 X ° C 30 ° C 16:20 17:40 4,0 4,0 DESTILARIA 2 T3 T4 7 5 29 ° C 29 ° C 16:15 02:15 3,0 3,0 T3 T4 8 ° 6 30 C 30 ° C 18:15 04:15 3,0 3,0 T3 T4 5 ° 4 32 C 32 ° C 06:15 10:15 3,0 3,0 DESTILARIA 3 T3 T4 7 5 29 ° C 31 ° C 16:50 19:05 4,0 4,0 T3 T4 7 ° 5 29 C 31 ° C 17:13 18:40 4,0 4,0 DESTILARIA 4 T3 T4 8 ° 6 29 C 29 ° C 20:20 11:00 4,0 4,0 T3 T4 4 2 28 ° C 27 ° C 20:20 11:00 4,0 4,0 T3 T4 4 ° 2 29 C 29 ° C 04:20 07:00 4,0 4,0 T5 1,5 30 ° C 13:23 4,0 T5 3,5 34 ° C 18:50 4,0 T6 0 30 ° C 14:20 4,0 T6 2 35 ° C 19:36 4,0 T7 ­ ­ ­ ­ T7 0 34 ° C 21:40 4,0 T5 T6 4 2 30 ° C 30 ° C 12:15 03:30 3,0 3,0 T5 T6 5 ° 2 31 C 30 ° C 14:15 08:10 3,0 3,0 T5 T6 3 ° 2 32,5 C 33 ° C 14:15 18:15 3,0 3,0 T7 0 30 ° C 18:50 3,0 T7 0 31 ° C 22:30 3,0 T7 1,5 33 ° C 22:15 3,0 T5 3 33 ° C 21:34 4,0 T5 4 32 ° C 20:50 4,0 T6 1,6 33 ° C 23:40 4,0 T6 1 34 ° C 1:00 4,0 T7 0 34 ° C 02:15 4,0 T7 0 34 ° C 03:05 4,0 T5 4 28 ° C 04:20 4,0 T5 0 27 ° C 12:35 4,0 T5 0 28 ° C 14:00 4,0 T6 2 28 ° C 16:37 4,0 T6 ­ ­ ­ ­ T6 ­ ­ ­ ­ T7 1 27 ° C 07:55 4,0 T7 ­ ­ ­ ­ T7 ­ ­ ­ ­ T8 ­ ­ ­ ­ T8 ­ ­ ­ ­ T8 0 32 ° C 08:10 3,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 14 24 ° C 11:45 4,0 T0 16 23 ° C 08:38 4,0 T0 16 24 ° C 13:58 4,0 T1 T2 12 10 29 ° C 31 ° C 15:08 15:36 4,0 4,0 T1 T2 14 12 ° 25,5 C 28 ° C 10:21 11:25 4,0 4,0 T1 T2 13 11 31 ° C 33 ° C 15:30 16:20 4,0 4,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 T1 23 20 ° 24 C 29 ° C 09:45 16:40 4,0 4,0 T0 T1 23 20 26 ° C 29 ° C 14:50 22:00 4,0 4,0 T2 17 31 ° C 20:40 4,0 T2 17 31 ° C 02:20 4,0 Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH Dor na °Brix Temp. Horário pH T0 T1 14 12 22 ° C 25 ° C 08:30 14:00 4,0 4,0 T0 T1 15 13 27 ° C 30 ° C 11:20 15:44 4,0 4,0 T0 T1 14 12 ° 28 C 30 ° C 16:05 18:00 4,0 4,0 T2 10 26 ° C 16:00 4,0 T2 11 32 ° C 18:10 4,0 T2 10 32 ° C 19:28 4,0 DESTILARIA 5 T3 T4 8 6 33 ° C 34,5 ° C 16:58 17:50 4,0 4,0 T3 T4 10 8 ° 30 C 32,5 ° C 12:21 13:17 4,0 4,0 T3 T4 9 7 35 ° C 37 ° C 17:00 17:45 4,0 4,0 DESTILARIA 6 T3 T4 14 11 ° 32 C 33 ° C 00:30 06:10 4,0 4,0 T3 T4 14 11 31 ° C 30 ° C 09:40 17:30 4,0 4,0 DESTILARIA 7 T3 T4 8 6 28 ° C 29 ° C 19:00 21:10 4,0 4,0 T3 T4 9 7 33 ° C 34 ° C 20:27 23:00 4,0 4,0 T3 T4 8 6 ° 34 C 34 ° C 21:20 23:20 4,0 4,0 T5 4 36,5 ° C 19:12 4,0 T5 6 34 ° C 14:00 4,0 T5 5 38 ° C 18:34 4,0 T6 2 38,5 ° C 21:25 4,0 T6 4 36 ° C 14:59 4,0 T6 3 38,5 ° C 21:25 4,0 T7 T8 0 ­ 33 ° C ­ 06:17 ­ 4,0 ­ T7 T8 2 0 ° 37,5 C 38 ° C 15:50 16:57 4,0 4,0 T7 T8 0 ­ 39 ° C ­ 07:16 ­ 4,0 ­ T5 8 33 ° C 12:30 3,0 T5 8 30 ° C 00:50 4,0 T6 5 33 ° C 21:53 4,0 T6 5 28 ° C 10:34 4,0 T7 2 30 ° C 10:50 4,0 T7 2 28 ° C 00:40 3,0 T5 4 30 ° C 12:03 4,0 T5 5 34 ° C 02:35 4,0 T5 4 35 ° C 01:40 4,0 T6 2 31 ° C 03:26 4,0 T6 3 33 ° C 08:25 4,0 T6 2 36 ° C 04:40 4,0 T7 0 30 ° C 08:40 4,0 T7 0 32 ° C 18:40 4,0 T7 0 33 ° C 09:50 4,0 T8 0 28 ° C 06:40 3,0 T8 0 26 ° C 08:50 3,0 (Temp.) Temperatura; (T) Tempo de coleta; (­) Coleta não realizada; (X) Temperatura não mensurada.
O metabolismo fermentativo das leveduras é diretamente influenciado pelo teor de açúcar ou sacarose do meio em que se encontram, de maneira que altas concentrações de açúcar no mosto podem provocar fermentações lentas e incompletas. Dessa forma, para que as leveduras possam realizar uma fermentação mais eficiente e rentável quanto aos níveis de etanol produzido, é aconselhável corrigir o °Brix do caldo da cana­de­açúcar madura, que normalmente encontra­se entre 18 e 24, para valores entre 14 e 16 através de diluição com água potável (FILHO e OLIVEIRA, 1999). Durante a realização das coletas foi observado que esta correção algumas vezes, ou não era realizada, ou não era feita de maneira correta. Isto gerou grandes oscilações nos valores de °Brix inicial do mosto entre as amostras coletadas, que variou entre 10, nas dornas 2 e 3 da destilaria número 4, e 23 em ambas as dornas da destilaria número 6 (Tabela 09). Como consequência destes valores iniciais, o processo fermentativo durou em média, respectivamente, menos de 24 horas e quase 72 horas para ser completado, ou seja, para que os valores de °Brix chegassem à zero. Em relação à temperatura alcançada durante os distintos ciclos fermentativos, também houve variações entre as fermentações das distintas destilarias e dentro de um mesmo ciclo fermentativo. A menor temperatura inicial do mosto foi a de 21°C, ocorrente na dorna 1 da destilaria número 1 e a maior, foi de 28°C, na dorna 3 das destilarias número 2 e 7. A variação máxima de temperatura, entre o início (T0) e o fim (Tfinal) de um mesmo processo fermentativo, foi de 15°C, demonstrada nas fermentações realizadas nas dornas 2 e 3 da destilaria número 5 (Tabela 09). Segundo Angelis (1992), a faixa ideal de temperatura para o metabolismo fermentativo das leveduras se encontra entre 25 e 32 °C, pois a dispersão dos lipídeos celulares e seus efeitos na permeabilidade das membranas são propriedades influenciadas pela temperatura e que podem interferir no trânsito de metabólitos, como o etanol, através da membrana plasmática. As variações observadas nos distintos processos fermentativos (dornas e destilarias) estudados indicam particularidades na produção de cada unidade produtora de cachaça de alambique. Diferenças estas, principalmente quanto ao preparo do fermento iniciador de maneira artesanal, pois este contribui para a definição das espécies e linhagens de leveduras predominantes na fermentação e que de acordo com suas características fisiológicas, como por exemplo, resistência a altas temperaturas e concentrações de etanol, eficiência fermentativa e produção de toxinas killer, podem influenciar a eficiência do ciclo fermentativo (PATARO et al., 2000). As comunidades de leveduras nativas de cada região produtora estão em constante sucessão durante a fermentação alcoólica, sendo também sujeitas à contaminação por microrganismos indesejáveis como bactérias que podem retardar
o processo (MORAIS et al., 1997). Além disto, durante o preparo do fermento inicial, processo que pode durar de cinco a vinte dias, espécies de leveduras nativas e associadas ao caldo de cana fresco são constantemente introduzidas no microambiente da fermentação (PATARO et al., 2002). Somando­se a estas considerações, o clima e a temperatura média anual específica de cada uma das distintas regiões produtoras também podem influenciar nas fermentações alcoólicas contribuindo para a definição do perfil fisiológico das comunidades de leveduras associadas à cana­de­açúcar (FILHO e OLIVEIRA, 1999). 5.2 PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER Dentre os 324 isolados de levedura submetidos à triagem inicial para detecção da atividade killer , 51, aproximadamente 16%, demonstraram resultado positivo para atividade killer (Figura 12) sobre pelo menos uma das duas leveduras sensíveis de referência utilizadas no teste, Saccharomyces cerevisiae NCYC1006 ou Candida glabrata Y­55 ATCC90525 . A Tabela 10 mostra que todos eles foram originados das distintas fases da fermentação alcoólica de cinco das sete destilarias estudadas, pois nenhum isolado com atividade killer foi encontrado associado às fermentações realizadas nas destilarias número 2 e número 6. No entanto, comparando somente as três fases do processo fermentativo (inicial, intermediária e final) quanto ao número de isolados killer encontrados associados a elas, percebe­se que a maioria representada por 22 isolados contra 15 da fase inicial e 14 da intermediária, foi encontrada associada à fase final de fermentação. Além disso, dentre os 51 isolados de levedura killer encontrados, 31 (60,8%) foram originados da destilaria 01, representando 86% de seus 36 isolados testados no presente trabalho (Tabela 10). Este percentual de isolados killer encontrado no trabalho como um todo, apresenta­se relativamente alto quando comparado a outros resultados obtidos de investigações realizadas em comunidades de leveduras também associadas a processos fermentativos do mosto da cana­de­açúcar até agora descritos. Em uma pesquisa realizada com 230 isolados de levedura, Lima et al. (2007) encontraram apenas 7,0% de isolados com fenótipo killer associados a processos fermentativos para produção de cachaça no estado do Ceará. Resultados ainda menores foram obtidos por Vaz (2003) que encontrou 4 isolados dentre 207 representando menos de 2% do total analisado e por Morais et al. (1997) e Bonilla­Salinas et al. (1995) os
quais encontraram resultados similares em torno de 3,5% do total de isolados de leveduras analisadas e representativas de todo ciclo fermentativo. Ceccato­Antonini et al. (2004), investigando a presença do fenótipo killer em leveduras isoladas de usinas para produção de álcool combustível, também encontraram 7% de isolados com atividade killer do total de 342 isolados de leveduras testadas. Em investigações realizadas em fermentações espontâneas do mosto da uva para produção de vinho na região da Patagônia ­ Argentina, Sangorrín et al. (2001) encontrou 42% de isolados killer de um total de 135 isolados de leveduras testadas. Posteriormente, em estudo realizado com outros produtores da mesma região, Sangorrín et al. (2007) obtiveram 37% de isolados com atividade killer corroborando a frequência obtida anteriormente. Entretanto, Zagorc et al. (2001) encontraram 22 isolados de leveduras killer , representando somente 3,6% do total de 613 isolados de leveduras testadas e isoladas da produção de vinho tinto na região sudoeste da Eslovênia. 1 2 4
3 Figur a 12. Em 1 e 4, atividade killer positiva: presença de zona clara de inibição em volta do isolado inoculado em forma de ponto, delimitada por halo adjacente de células coradas em azul. Em 2 e 3, ausência de atividade killer. Esta variabilidade nos índices percentuais encontrados entre os trabalhos citados acima pode ser ocasionada, principalmente, por aspectos como flutuação da frequência de leveduras killer durante os diversos estágios da fermentação; características inerentes a zona geográfica, como por exemplo, o grau de competitividade natural entre as espécies e linhagens de leveduras; técnicas empregadas no processo de fermentação e valores de pH do mosto (ZAGORC et al., 2001). Estes aspectos podem justificar os distintos percentuais de isolados killer encontrados entre as sete destilarias estudadas, visto que as mesmas se encontram localizadas em distintas regiões e a Tabela 09 demonstra oscilações das condições fermentativas do mosto ocorrentes entre elas quanto aos valores de pH, temperatura e °Brix. Contudo, segundo Magliani et al. (1997), embora as leveduras killer possam ser encontradas em baixa frequência, ainda assim podem ser muito importantes para a ecologia de sua comunidade de origem, limitando a proliferação de outras linhagens sensíveis presentes no mesmo habitat. O autor ainda comenta que a probabilidade de uma toxina killer produzida por uma levedura matar uma determinada linhagem susceptível depende das características ambientais e ecológicas do habitat em que ambas as linhagens (killer e sensível), foram coletadas. Também há indícios de que diferenças na incidência de leveduras killer entre os diversos nichos possam ser explicadas por variações na concentração de açúcar dos substratos em que as leveduras encontram­se associadas, sob a alegação de que substratos ricos em açúcar oferecem melhores condições para a célula de levedura suportar energeticamente a custosa produção da toxina (MAGLIANI et al., 1997). A coleta representativa de todas as fases de cada ciclo fermentativo pode ter contribuído para o número total de isolados com atividade killer obtido neste trabalho, pois permitiu o isolamento de leveduras associadas a todas elas, não se esquecendo de considerar o alto percentual encontrado na destilaria número 1 (86%) que contribui para a elevação do percentual geral (Tabela 10). Em um processo fermentativo, a habilidade para produzir toxinas killer pode conferir as leveduras fermentadoras vantagens seletivas sobre linhagens competitivas sensíveis e contaminantes (CECCATO­ANTONINI et al., 2004), provavelmente, nas fermentações realizadas na destilaria número 1, a manifestação da atividade killer entre as leveduras associadas ao mosto seja de fundamental importância para a definição das espécies e linhagens fermentadoras dominantes durante todas as etapas do processo fermentativo. E, de fato, como mostra a Tabela 11, os 31 isolados de levedura killer encontrados nesta destilaria apresenta­se muito bem distribuídos entre as fases da fermentação. Foram isolados 10 de cada fase inicial e intermediária e 11 da fase final, sugerindo que muitos deles possam estar representando uma mesma linhagem. O ciclo fermentativo ocorreu em menos de 12 horas em
ambas as dornas (Tabela 09), indicando que o predomínio de uma biota estável de linhagens killer no mosto em fermentação esteja contribuindo para esta alta eficiência como consequência da inibição de leveduras contaminantes (CECCATO­ANTONINI et al., 2004). Tabela 10. Percentual de isolados com fenótipo killer por destilaria e sua distribuição de acordo com as fases da fermentação alcoólica. Destilar ia DEST 1 DEST 2 DEST 3 DEST 4 DEST 5 DEST 6 DEST 7 TOTAL Isolados testados 36 54 36 54 54 36 54 324 N° de dor nas 02 03 02 03 03 02 03 18 Isolados com atividade killer 31 (86%) 0 05 (14%) 01 (02%) 09 (17%) 0 05 (09%) 51 (16% ) Isolados killer associados às fases da fer mentação 10 (I); 10 (In); 11 (F) ­ 02 (I); 03 (F) 01 (I) 01 (I); 02 (In); 06 (F) ­ 01 (I); 02 (In); 02 (F) 15 (I); 14 (In); 22 (F) (I) Fase inicial; (In) Fase intermediária; (F) Fase final. De maneira geral, o maior número de isolados de levedura killer associados à fase final de fermentação pode estar refletindo a vantagem competitiva, conferida por este fenótipo killer às leveduras, que contribui para a seleção das mesmas durante a sucessão ecológica de espécies e linhagens que ocorre durante o ciclo de fermentação espontânea para produção de cachaça de alambique (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 2002). A presença do fenótipo killer em leveduras fermentadoras industriais confere vantagens como assegurar a permanência da linhagem durante todo o ciclo fermentativo (CECCATO­ANTONINI et al., 2004) aumentando a eficiência do processo pela diminuição dos microrganismos sensíveis contaminantes (LOPES et al., 2006). Provavelmente, as leveduras isoladas na fase final da fermentação, também possuem alta tolerância ao etanol, o que seria ainda mais interessante quando pensa­se em uma cultura iniciadora de fermentação para a produção de cachaça e etanol combustível. As variações percebidas no decorrer das fermentações realizadas nas sete distintas destilarias, quanto ao tempo de duração do processo, variação de °Brix, temperatura e pH do
mosto (Tabela 09), provavelmente sejam consequências de aspectos inerentes à cada região produtora, como por exemplo clima e temperatura média anual (FILHO e OLIVEIRA, 1999), e de cada produtor, pois em uma mesma região tem­se diferentes fermentações, preparo de “pé­de­cuba”, variedades de cana­de­açúcar, equipamentos e níveis de higienização, fatores que também podem influenciar na fisiologia e definição da biota de linhagens fermentadoras associadas à cada região produtora (ANGELIS et al., 1992; PATARO et al., 2002). Segundo Zagorc et al. (2001), variações nas técnicas empregadas no processo de fermentação representa uma das principais causas de variações no número de leveduras killer associadas às fermentações espontâneas. Sendo assim, a influência dos fatores citados acima, isoladamente ou em conjunto, provavelmente justifiquem a ausência de isolados de levedura killer provenientes das destilarias 2 e 6, bem como a obtenção de apenas um isolado da destilaria número 4. Baseado nas particularidades de produção da destilaria 4, percebidas durante a coleta, o isolamento deste único isolado pode ser explicado pelo predomínio do processo fermentativo por leveduras sem atividade killer (neutras ou sensíveis) e más fermentadoras, ou até mesmo bactérias acéticas que retardam a fermentação alcoólica (GUIDI, 2000; LOPES et al., 2006). Através da observação da Tabela 09, nota­se que, embora nos três ciclos fermentativos desta destilaria o teor de sacarose inicial do mosto apresentou­se relativamente baixo, variando entre 10 °Brix nas dornas 2 e 3 e 14 °Brix na dorna 1, quase 96 horas foram necessárias para que este teor chegasse à zero, concluindo o processo na dorna 1 e mais de 48 horas para o término na dorna 2. Somente na dorna 3, justamente de onde foi isolada a única levedura com atividade killer associada às fermentações realizadas nesta destilaria, o processo fermentativo foi concluído dentro do tempo ideal, chegando ao fim em pouco menos de 24 horas. Como durante as três fermentações realizadas, as condições de pH (4,0) e temperatura inicial (25°C) apresentadas foram propícias para a atividade de toxinas killer (Tabela 09), e mesmo assim somente uma foi isolada, provavelmente, o número de leveduras killer associadas ao mosto inicial fosse insuficiente para que predominassem sobre outras, neutras ou sensíveis, possivelmente má fermentadoras e assim contribuintes para a lentidão do processo. Embora haja contradições sobre os níveis necessários de leveduras killer num inóculo iniciador para que elas possam predominar num ciclo fermentativo, Petering et al. (1991) apenas encontraram tal predomínio quando o inóculo de leveduras killer correspondeu a mais que 50%. A possibilidade de bactérias acéticas estarem associadas às fermentações nesta destilaria, parte da observação de que no momento da coleta das amostras um cheiro
característico de ácido acético foi percebido, sugerindo a ocorrência de fermentação acética realizada por bactérias contaminantes (CARDOSO, 2006). Em concordância com os resultados de diversidade encontrados por diversos estudos (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 1998; GUERRA et al. 2001; LIMA et al., 2007) que mostram que Saccharomyces cerevisiae é a espécie de levedura predominante durante as fermentações espontâneas para produção de cachaça de alambique, a grande maioria das 51 leveduras killer obtidas dos mesmos processos no estado da Bahia, também mostraram­se pertencer a mesma espécie (Tabela 11). Somente quatro isolados, D1­25, D1­29, D1­30 e D1­ 31, todos obtidos da destilaria 01, foram identificados bioquimicamente como não S. cerevisiae reforçando os indícios de que estas leveduras constituem­se em potenciais contaminantes deste tipo de fermentação, pois a maioria delas confere características indesejáveis em fermentações alcoólicas para produção de cachaça e vinho (OLIVEIRA et al., 2005b; LOPES et al., 2006). A influência da temperatura (25°C, 28°C e 32°C) sobre a atividade killer de cada um dos 51 isolados encontrados também foi investigada in vitro (Tabela 12), pois geralmente as oscilações de pH do meio e temperaturas acima de 25°C desestabilizam as micocinas produzidas impedindo a manifestação da atividade killer (MAGLIANI et al., 1997). No entanto, como os valores de pH das distintas fermentações estudadas neste trabalho permaneceram inalterados em 4,0, exceto para a destilaria 2 onde os valores de pH permaneceram em 3,0; sua influência sobre a atividade killer não foi avaliada neste trabalho e desde os testes iniciais de triagem para detecção do fenótipo killer o meio foi tamponado para o pH 4,0 objetivando representar as condições gerais do mosto. Como pode ser verificada na tabela 12, a elevação da temperatura de 25 °C para 28 °C foi suficiente para inibir a atividade killer de todos os isolados. Quanto à atividade dos isolados provenientes das destilarias 1 e 3, ainda foi possível observar pequenos halos de inibição, no entanto, desacompanhados da zona azul de células mortas que indica morte celular e fundamental para caracterizar a presença do fenótipo killer (YOUNG, 1987). No entanto, quando a temperatura de incubação foi alterada para 32 °C nem mesmo um pequeno halo de inibição foi possível observar em nenhum dos isolados encontrados (Figura 13).
Tabela 11. Características do mosto da cana­de­açúcar (°Brix, pH e temperatura), origem de isolamento (fase da fermentação, dorna, tempo e colônia) e identificação bioquímica de cada isolado de levedura killer associado às fermentações realizadas em cinco das sete distintas destilarias investigadas. Código Fase da Dorna do isolado fer mentação D1­1 D1­2 D1­3 D1­4 D1­5 D1­6 D1­7 D1­8 D1­9 D1­10 D1­11 D1­12 D1­13 D1­14 D1­15 D1­16 D1­17 D1­18 D1­19 D1­20 D1­21 D1­22 D1­23 D1­24 D1­25 D1­26 D1­27 D1­28 D1­29 D1­30 D1­31 Inicial Inicial Inicial Inicial Inicial Inicial Intermediária Intermediária Intermediária Intermediária Final Final Final Final Final Final Inicial Inicial Inicial Inicial Intermediária Intermediária Intermediária Intermediária Intermediária Intermediária Final Final Final Final Final 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 02 D3­1 D3­2 D3­3 D3­4 D3­5 Final Inicial Inicial Final Final 01 02 02 02 02 D4­1 Inicial 02 D5­1 D5­2 Final Inicial 02 03 Tempo Colônia DESTILARIA 1 0 2 0 1 0 3 1 1 1 2 1 3 3 1 3 2 3 3 4 2 6 1 6 2 6 3 5 1 5 2 5 3 0 1 0 3 1 1A 1 3 3 1A 3 2A 3 3 4 1A 4 2 4 3 6 1A 6 2A 7 1B 7 2A 7 3B DESTILARIA 3 7 3 0 2 0 3 7 3 8 3 DESTILARIA 4 0 1 DESTILARIA 5 9 3A 0 19 °Br ix pH Temp. (◦C) Id. 12 12 12 10,5 10,5 10,5 5,5 5,5 5,5 4 0 0 0 1,5 1,5 1,5 12,5 12,5 11 11 7 7 7 5 5 5 2 2 0 0 0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 21 21 21 24 24 24 28 28 28 28 30 30 30 30 30 30 22 22 26 26 28 28 28 30 30 30 35 35 34 34 34 Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc NSc Sc Sc Sc NSc NSc NSc 0 15 15 0 0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 34 26 26 34 34 Sc Sc Sc Sc Sc 10 4,0 25 Sc 0 16 4,0 4,0 38 24 Sc Sc
D5­3 D5­4 D5­5 D5­6 D5­7 D5­8 D5­9 Intermediária Intermediária Final Final Final Final Final 03 03 03 03 03 03 03 D7­1 D7­2 D7­3 D7­4 D7­5 Inicial Intermediária Intermediária Final Final 01 02 03 03 03 4 1 4 3 7 17 7 19 8 12 8 13 8 15 DESTILARIA 7 1 14 4 13 3 3 6 15 7 15 7 7 0 0 0 0 0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 37 37 39 39 39 39 39 Sc Sc Sc Sc Sc Sc Sc 12 7 8 2 0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 25 34 34 36 33 Sc Sc Sc Sc Sc (Id.) Identificação bioquímica realizada pela aluna do PPGBiotec Alice Ferreira da Silva durante seu trabalho de mestrado; (Temp.) Temperatura; (Sc) Saccharomyces cerevisiae; (NSc) Não Saccharomyces cerevisiae. Magliani et al., 1997 afirmam que elevadas temperaturas de incubação normalmente são uma das causas da perda, em curto espaço de tempo, da propriedade killer em leveduras isoladas de frutos tropicais tornando estes isolados não mais aptos a aplicação em processos biotecnológicos. Também de acordo com Santos et al. (2002) e Golubev (2006), leveduras killer com potencial de aplicação biotecnológica dos seus metabólitos de interesse, precisam possuir simples condições de cultivo e resistir a situações não favoráveis como variações de pH e temperatura.
A D1­4 D1­3 D1­2 D1­1 D1­8 D1­7 D1­6 D1­5 K1 D1­11
D1­9 D1­10 B D1­4 D1­8 K1 D1­3 D1­7 D1­2 D1­6 D1­11 D1­10 D1­1 D1­5 D1­9 C D1­3 D1­4 D1­8 K1 D1­7 D1­2 D1­1 D1­6 D1­11 D1­10 D1­5 D1­9 Figur a 13. Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados D1­1 a D1­11, inoculados em forma de ponto sobre Candida glabrata Y­55 ATCC90525 previamente semeada sobre o meio ágar YEPD­MB. (A) Incubação a 25°C e verificação da atividade killer em todos os isolados; (B) Incubação a 28 °C e presença de pequena zona clara de inibição, mas ausência de células coradas em azul (não considerado atividade killer ); (C) Incubação a 32 °C e ausência de atividade killer . (K1) Levedura padrão de atividade killer Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006, inoculada como controle positivo. Foi observado que a temperatura de 25 °C que favoreceu a atividade das toxinas killer dos isolados é a mesma encontrada na fase inicial da grande maioria dos processos fermentativos estudados (Tabela 09). Isto viabiliza a utilização destes isolados encontrados como inóculo iniciador de processos fermentativos, possibilitando o controle do número de leveduras sensíveis contaminantes nesta fase do processo, na qual é frequente encontrar uma maior diversidade de leveduras (PATARO et al., 2002). Além do mais, como grande parte dos isolados killer foram provenientes da fase final do processo fermentativo, tais isolados provavelmente resistem às altas concentrações de etanol características deste momento. Isto aumenta ainda mais a probabilidade de que estes isolados predominem como agentes da fermentação durante todo o ciclo. Segundo Cardoso (2006), o controle da temperatura do processo fermentativo representa um dos vários aspectos importantes que se destacam quando se quer produzir cachaça de qualidade. Este controle se faz necessário, pois a fermentação alcoólica é um processo exotérmico e, quando realizada em regiões de altas temperaturas médias anuais, a temperatura do mosto em fermentação tende a aumentar, ultrapassando a faixa desejada (25 a 32°C) para o metabolismo fermentativo das leveduras (ANGELIS et al., 1992). Do contrário, em regiões de clima muito frio, a faixa de temperatura ideal para o início do processo pode não ser alcançada, causando fermentações lentas e incompletas ou com baixo rendimento de etanol. Contudo, como a estabilidade das toxinas killer tende a diminuir com o aumento da temperatura (SOARES e SATO, 2000; LIMA et AL., 2007) e geralmente encontra­se ótima entre 20 e 28°C (IZGU et al., 1997), o controle da temperatura do mosto em fermentação além de evitar interferências prejudiciais na ação fermentativa das leveduras, pode contribuir para a atividade das toxinas presentes no mosto, favorecendo a continuidade da atividade killer no sistema fermentativo e consequentemente diminuir e/ou evitar a contaminação por leveduras indesejáveis.
Tabela 12. Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados Isolado Killer D1­1 D1­2 D1­3 D1­4 D1­5 D1­6 D1­7 D1­8 D1­9 D1­10 D1­11 D1­12 D1­13 D1­14 D1­15 D1­16 D1­17 D1­18 D1­19 D1­20 D1­21 D1­22 D1­23 D1­24 D1­25 D1­26 Temper atura de incubação Temper atura de incubação 25 °C 28 °C 32 °C Isolado 25 °C 28 °C 32 °C Killer D1­27 + +/­ ­ + +/­ ­ +/­ D1­28 +/­ + ­ + ­ +/­ D1­29 +/­ + ­ + ­ +/­ D1­30 +/­ + ­ + ­ + +/­ ­ D1­31 + +/­ ­ +/­ D3­1 +/­ + ­ + ­ +/­ D3­2 +/­ + ­ + ­ +/­ D3­3 +/­ + ­ + ­ +/­ D3­4 +/­ + ­ + ­ +/­ D3­5 +/­ + ­ + ­ +/­ D4­1 + ­ + ­ ­ +/­ D5­1 + ­ + ­ ­ +/­ D5­2 + ­ ­ + ­ +/­ D5­3 + ­ ­ + ­ +/­ D5­4 + ­ ­ + ­ +/­ D5­5 + ­ ­ + ­ +/­ D5­6 + ­ ­ + ­ +/­ D5­7 + ­ ­ + ­ +/­ D5­8 + ­ ­ + ­ +/­ D5­9 + ­ ­ + ­ +/­ D7­1 + ­ ­ + ­ +/­ D7­2 + ­ ­ + ­ +/­ D7­3 + ­ ­ + ­ +/­ D7­4 + ­ ­ + ­ + +/­ ­ D7­5 + ­ ­ +/­ + ­ (+) Resultado típico de atividade killer (zona clara de inibição e halo de células mortas coradas em azul) contra as leveduras Saccharomyces cerevisiae NCYC1006 e Candida glabrata Y­55 ATCC90525, utilizadas como padrão de sensibilidade killer ; (+/­) Formação de pequena zona clara de inibição e ausência de células coradas em azul; (­) Ausência de atividade killer . 5.3 AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS Dentre as 51 leveduras killer encontradas, 16 inibiram in vitro 12 dos 20 isolados pertencentes ao grupo S (Tabela 13) dos tempos iniciais da fermentação. Quanto ao fenótipo killer, provavelmente, todas as oito leveduras que apresentaram resistência sejam neutras (K ­ R + ), pois os isolados integrantes deste grupo apresentaram­se negativos nos testes iniciais para determinação da atividade killer restando apenas serem classificados como neutros (K ­ R + ) ou
sensíveis (K ­ R ­ ). Pode­se constatar através da tabela 23 que nestes testes houve determinação de atividade killer entre isolados originados de distintas destilarias, de forma que cada um dos 16 distintos isolados que exercerem ação letal sobre leveduras do grupo S provenientes de sua destilaria de origem, também apresentaram atividade sobre leveduras isoladas de outras destilarias. Por exemplo, dos 31 isolados de levedura killer encontrados na destilaria 01, sete (D1­1; D1­3; D1­6; D1­17; D1­18; D1­20 e D1­28) tiveram atividade sobre outros isolados do grupo S provenientes das destilarias 2, 3, 4, 5 e 7. É válido destacar a atividade killer do isolado D5­2 que dentre todos foi o que apresentou maior ação tendo atuado sobre seis leveduras no total, provenientes de cinco distintas destilarias, sugerindo que sua toxina pode apresentar um amplo espectro de atividade killer, principalmente, sobre linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Os isolados D1­28, D3­5, D5­9 e D7­5 também merecem destaque, pois entre os 16, são os únicos provenientes da fase final do processo fermentativo, sendo assim, possivelmente resistentes a altas concentrações de etanol, como já mencionado anteriormente. Os achados do presente trabalho confirmam que a manifestação da atividade killer é mais frequente entre leveduras originadas de diferentes ambientes do que dentro do mesmo habitat, pois nesta última condição as leveduras tendem a adaptar­se para a resistência killer devido à pressão seletiva (MAGLIANI et al., 1997). Sendo assim, a utilização destas 16 leveduras como culturas starter de processos fermentativos realizados, principalmente entre as destilarias estudadas, poderia minimizar os níveis de contaminação do mosto por leveduras sensíveis indesejáveis provenientes de outros nichos e/ou processos fermentativos. Segundo Guidi (2000), leveduras contaminantes da fermentação alcoólica são definidas como todas aquelas presentes no processo fermentativo, que não sejam a espécie ou linhagem selecionada para a condução do mesmo. O autor ressalta que estes contaminantes muitas vezes superam a levedura selecionada devido a fatores como agressividade na competição por nutrientes, maior velocidade de multiplicação, pressão de seleção favorável e proporção inicial significativa. De acordo com Gomes et al. (2008), quando o fermento iniciador é composto por leveduras nativas selecionadas, o mesmo apresenta maior estabilidade populacional durante o ciclo fermentativo do que quando se utiliza de fermentação espontânea com “pé­de­ cuba” não selecionado e preparado de forma aleatória, pois este último apresenta uma maior diversidade de cepas de leveduras com características fermentativas diferentes. Os resultados de atividade apresentados na Tabela 13 também confirmam a vantagem competitiva que as leveduras killer podem exercer sobre as que não possuem esta característica numa comunidade mista de leveduras (MARQUINA et al., 2002), uma vez que
todos os isolados integrantes do grupo S apresentaram­se negativos nos testes de triagem inicial para determinação do fenótipo killer . Entretanto, é válido ressaltar que estas 16 leveduras killer encontradas demonstraram ação inibitória contra leveduras da espécie S. cerevisiae isoladas da fase inicial da fermentação. Todas as leveduras integrantes do grupo S utilizadas nestes testes foram isoladas a partir desta fase pelo fato da mesma apresentar as melhores condições de temperatura, em torno de 25 °C (Tabela 05), necessárias para a estabilização das toxinas produzidas por todos os 51 isolados de levedura killer (Tabela 12). Algumas linhagens nativas de S. cerevisiae, embora predominem em uma fermentação, também podem conferir características indesejáveis para produção de cachaça de alambique como, por exemplo, baixa eficiência fermentativa e produção exagerada de compostos secundários indesejáveis (OLIVEIRA, 2001; OLIVEIRA et al., 2004). É importante ressaltar que, além da capacidade de produzir toxinas killer , outras características desejáveis em leveduras selecionadas para cultura starter aplicadas a fermentações para produção de bebidas de um modo geral são: (i) alta produtividade e eficiência de fermentação; (ii) tolerância ao etanol e à temperaturas elevadas; (iii) resistência às altas concentrações de açúcares; (iv) produção de adequadas concentrações de compostos secundários desejáveis para a qualidade da bebida e habilidade de flocular (HAMMOND, 1995). Sendo assim, quanto ao comportamento killer in vitro, os 16 isolados demonstrados na Tabela 13, principalmente D1­28, D3­5, D5­9 e D7­5 pelo fato de possivelmente resistirem a altas concentrações de etanol e D5­2 por ter sido o isolado que demonstrou atividade killer sobre o maior número de leveduras, representam isolados que podem proporcionar proteção ao mosto contra leveduras contaminantes às fermentações para produção de cachaça de alambique. Além disso, estes isolados podem conferir às fermentações outras vantagens que são conseqüências da atuação de leveduras killer em processos fermentativos como o aumento da probabilidade de permanência da linhagem durante todo o processo e o consequente aumento da eficiência fermentativa (MARQUINA et al., 2002; CECCATO­ANTONINI et al., 2004; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007b). De modo geral, estes resultados de inibição demonstrados pelos 16 isolados citados acima, indicam que assim como para o vinho, a presença da característica killer em leveduras deve ser um dos critérios utilizados durante o processo de seleção de espécies e linhagens mais adequadas e adaptadas a produção de cachaça de alambique para uma região particular (LIMA et al., 2007).
Tabela 13. Ação dos 51 isolados killer , sobre leveduras identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação e que não apresentaram atividade killer (Grupo S) Levedur as do gr upo S Isolado killer inibidor DEST2 D2 T0 6 DEST2 D2 T1 3 DEST2 D2 T1 10 DEST3 D1 T0 1 DEST3 D1 T0 2 DEST3 D1 T0 3 D5­2 D3­3; D7­1 D1­17; D3­5 0 0 D1­1; D1­3; D1­6; D1­17; D1­18; D1­20; D3­2; D3­3; D4­1; D5­9; D7­1 D1­1; D1­3; D1­6; D1­17; D1­18; D1­20; D3­2; D3­3; D4­1; D5­9; D7­1 0 D1­6; D1­18; D1­20; D3­2; D3­3; D3­5; D4­1 D1­3; D1­18; D1­28; D3­3; D4­1; D5­2 0 D1­3; D3­3; D5­2 D5­2 0 0 0 0 D5­2 D5­2 D1­6; D1­28; D7­1; D7­3; D7­5 DEST3 D1 T1 1 DEST3 D1 T1 2 DEST4 D3 T0 3 DEST4 D3 T1 1 DEST4 D3 T1 2 DEST5 D2 T0 1 DEST5 D2 T0 3 DEST5 D2 T0 12 DEST6 D1 T0 1 DEST6 D1 T1 3 DEST6 D2 T0 2 DEST7 D2 T1 1 DEST7 D2 T1 2 DEST 7 D2 T1 3 (0) Resistência a todos os 51 isolados de levedura killer. Através da Tabela 14 pode­se constatar que somente três, DEST5 D2 T1 13A, DEST7 D2 T0 10B e DEST7 D2 T0 24, das 21 leveduras não S. cerevisiae associadas aos ciclos fermentativos estudados foram sensíveis às leveduras killer . No entanto, entre as três, DEST7 D2 T0 10B demonstrou alta sensibilidade ao ser sensível a 28 distintos isolados de levedura killer. As outras duas leveduras sensíveis, DEST5 D2 T1 13A e DEST7 D2 T0 24, apenas foram inibidas pelos isolados D1­25 e D1­24, sendo que D1­25 demonstrou ação letal sobre todas as três leveduras que apresentaram sensibilidade citadas acima e representa um dos quatro isolados de levedura killer identificados bioquimicamente como não S. cerevisiae (Tabela 11). Entretanto, embora o isolado killer D1­24 tenha apresentado atividade apenas sobre a levedura DEST5 D2 T1 13A, ele merece destaque por representar o único isolado de levedura killer identificado bioquimicamente como S. cerevisiae a demonstrar atividade killer
sobre uma levedura não S.cerevisiae que não fosse DEST7 D2 T0 10B, sensível a 28 distintos isolados de levedura killer. As leveduras killer são originalmente definidas como aquelas capazes de matar outras sensíveis de mesma espécie ou gênero, sendo que, a levedura produtora é imune a sua toxina (BEVAN e MAKOWER, 1963). Embora este espectro de ação atualmente tenha se ampliado bastante, com a verificação de leveduras killer matando outras de táxons não relacionados e até fitopatógenos (WALKER et al., 1995; CABRAL et al., 2009), as estatísticas ainda mostram que a grande maioria demonstra maior atividade contra outras pertencentes a táxons relacionados (BUZZINI et al., 2007). Esta baixa atividade inibitória das 51 leveduras killer sobre espécies de leveduras não S. cerevisiae pode ser explicada por este aspecto inerente à definição deste fenômeno, já que a ação das toxinas sobre células sensíveis é mediada por receptores específicos de superfície celular os quais estruturalmente alteram­se bastante de acordo com a classificação das leveduras (GOLUBEV, 1998). De acordo com variados níveis de inibição das leveduras killer apresentados pelas tabelas 13 e 14, é importante citar que, de acordo com Magliani et al. (1997) e Santos et al. (2000), da mesma forma que existem alterações estruturais nos receptores β­1,6­glicana (específicos para cada toxina produzida por linhagens da espécie S. cerevisiae), as variabilidades na ação do fenótipo killer em leveduras, de maneira geral, são justificadas de acordo com a seletividade dos receptores situados na parede celular, os quais são na maioria das vezes característicos de cada cepa. Existe uma gama de toxinas killer distribuídas entre as diferentes espécies de leveduras e estas se ligam a diferentes receptores celulares (SCHIMITT e BREINIG, 2002). Sendo assim, considerando que a presença de receptores específicos na composição da parede e membrana celular da célula alvo é um critério necessário para a ação das toxinas (MARQUINA e SANTOS, 2004), estas características podem explicar os variados resultados de inibição dos 51 distintos isolados de levedura killer contra leveduras integrantes dos grupos S e NS. Walker et al. (1995), também encontraram em seus resultados uma certa diversidade no mecanismo de ação da toxina killer dependendo da espécie de levedura estudada e sugere que as toxinas produzidas por cada espécie sejam bioquimicamente distintas umas das outras. Baseado nestas considerações, provavelmente, a resistência da grande maioria das leveduras integrantes do grupo NS verificada na Tabela 14 pode ser reflexo da incompatibilidade bioquímica entre a maioria das toxinas produzidas pelas leveduras killer inicialmente encontradas e os receptores de superfície das 21 leveduras identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae, já que entre as leveduras killer, somente D1­25, D1­ 29, D1­30 e D1­31 foram identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae. Por outro
lado, também houve afinidade de ligação entre o receptor de superfície da levedura DEST7 D2 T0 10B e toxinas killer produzidas por diversos isolados, pois a mesma foi inibida por 28 distintos isolados de leveduras killer originados de cinco distintas destilarias (Tabela 14). Contudo, entre todas as leveduras killer identificadas bioquimicamente como S. cerevisiae, somente D1­24 produziu uma toxina capaz de matar uma levedura integrante do grupo NS (DEST5 D2 T1 13A), que não fosse a que demonstrou alta sensibilidade (DEST7 D2 T0 10B). Além de D1­24, somente D1­25 (não S. cerevisiae) teve ação sobre este isolado, indicando que a presença desta primeira numa fermentação alcoólica poderia inibir leveduras contaminantes indesejáveis pertencentes a determinadas espécies não S. cerevisiae. A contaminação de fermentações alcoólicas industriais para produção de bebidas pode representar uma grande perda de produção, ocasionando sérios prejuízos, através da redução no rendimento, maior tempo de fermentação e problemas operacionais, além de acarretarem perda de qualidade da bebida (IZGU et al., 1997). Esta informação reforça a aplicabilidade dos 16 isolados de leveduras killer , com ação detectada sobre leveduras integrantes dos grupos S (Tabela 13), e D1­24 (Tabela 14) em fermentações realizadas para produção de cachaça, principalmente nas suas respectivas destilarias de origem, como culturas fermentadoras capazes de reduzir os níveis de contaminação por leveduras indesejáveis.
Tabela 14. Ação dos 51 isolados killer , sobre leveduras identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae (Grupo NS) Levedur a do gr upo NS Isolado killer inibidor DEST1 D2 T1 2A DEST1 D2 T4 2 DEST1 D2 T5 1A DEST1 D2 T7 1A DEST1 D2 T7 1B DEST1 D2 T7 2A DEST1 D2 T7 3A DEST1 D2 T7 3B DEST4 D3 T0 2 DEST4 D3 T0 1 DEST4 D3 T2 1 DEST4 D3 T0 14 DEST5 D2 T1 17 DEST5 D2 T1 19 DEST5 D2 T3 16 DEST5 D2 T4 3 DEST5 D2 T1 13A DEST7 D2 T0 3 DEST7 D2 T0 15 DEST7 D2 T0 10B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D1­24; D1­25 0 0 D1­13; D1­16; D1­17; D1­20; D1­22; D1­25; D1­28; D1­29; D3­1; D3­2; D3­3; D3­4; D3­5; D4­1; D5­1; D5­2; D5­3; D5­4; D5­5; D5­6; D5­7; D5­8; D5­9; D7­1; D7­2; D7­3; D7­4; D7­5 D1­25 DEST7 D2 T0 24 (0) Resistência a todos os 51 isolados de levedura killer. 5.4 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN ­ KSP) DAS LEVEDURAS KILLER Baseado na sensibilidade diferencial de cada um dos 51 isolados de levedura killer frente a leveduras killer de referência de nove distintas classes (K1 a K9) (Tabela 07 e Apêndice A) foi possível discriminá­las por biotipagem, através da obtenção de padrões de sensibilidade killer (KSPs), em distintos biótipos (Tabela 15). Polonelli et al. (1983) através da utilização destas mesmas nove leveduras de referência, pertencentes aos gêneros Hansenula e Pichia , propuseram um sistema de biotipagem capaz de estabelecer 512 distintos KSPs os quais foram eficientemente utilizados na diferenciação de linhagens da espécie
Candida albicans isoladas de ambientes hospitalares, monitorando a distribuição epidemiológica das linhagens mais patogênicas. A utilização do KSP na discriminação de linhagens de leveduras constitui­se numa técnica eficiente, pois diversos estudos já demonstraram que a manifestação do fenótipo killer ocorre de forma altamente polimórfica sendo possível a detecção de numerosos biótipos com grande variabilidade entre distintas linhagens de uma mesma espécie, permitindo a realização de investigações elaboradas sobre as relações de sensibilidade às toxinas killer (POLONELLI et al., 1983; VAUGHAN­MARTINI et al., 1988; VAUGHAN­MARTINI et al., 1996; BUZZINI et al., 2007). Sangorrín et al. (2002) monitorou a ocorrência de linhagens S. cerevisiae em fermentações espontâneas para produção de vinho através do KSP obtido por sensibilidade diferencial a 10 leveduras killer de referência as quais eficientemente discriminaram 152 isolados desta espécie em 24 distintos biótipos ou linhagens nativas. Neste estudo, os autores encontraram duas linhagens que permaneceram por um período de seis anos associadas ao mosto de fermentação representando a evidência de que fermentações espontâneas são dominadas por algumas linhagens locais de S. cerevisiae. Foi possível constatar que os 51 isolados de levedura killer encontrados neste trabalho, apresentaram KSPs capazes de diferenciá­los em cinco grupos de forma que cada um deles reúne isolados que apresentaram KSPs semelhantes (Figura 14). Os isolados de cada um dos cinco grupos apresentaram sensibilidade diferencial a um conjunto particular de leveduras de referência killer (K1 a K9), de forma que as diferenças de sensibilidade entre todos eles possibilitaram discriminá­los em 13 distintos biótipos ou linhagens, os quais são representados por cada ramo terminal do dendograma exibido na Figura 14.
Tabela 15. Padrão de sensibilidade killer (KSP) de cada um dos 51 isolados de levedura killer encontrados, frente às nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9. Isolado killer D1­1 D1­2 D1­3 D1­4 D1­5 D1­6 D1­7 D1­8 D1­9 D1­10 D1­11 D1­12 D1­13 D1­14 D1­15 D1­16 D1­17 D1­18 D1­19 D1­20 D1­21 D1­22 D1­23 D1­24 D1­25 D1­26 Padrão de sensibilidade killer (KSP) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Isolado killer D1­27 D1­28 D1­29 D1­30 D1­31 D3­1 D3­2 D3­3 D3­4 D3­5 D4­1 D5­1 D5­2 D5­3 D5­4 D5­5 D5­6 D5­7 D5­8 D5­9 D7­1 D7­2 D7­3 D7­4 D7­5 Padr ão de sensibilidade killer (KSP) 0 K3 K4 K5 K9 K3 K4 K5 K9 K3 K4 K5 K9 K3 K5 K9 K7 K9 K2 K7 K9 K2 K7 K8 K2 K7 K9 K2 K7 K9 K1 K6 0 0 0 K6 K8 K1 K6 K1 K6 K1 K6 K8 K1 K6 K8 0 K1 K4 K3 K4 K1 K3 K4 K4 0 (0) Biótipo com resistência às nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9. Cada algarismo precedido pela letra “K” refere­se à classe da levedura killer de referência com ação letal sobre os isolados de levedura killer .
5
4 3 2 1 Figur a 14. Dendograma gerado com o método UPGMA baseado no índice SM, utilizando os dados de sensibilidade dos 51 isolados de levedura killer às nove leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9. Os algarismos sobre os ramos destacam os cinco grupos de isolados que apresentaram semelhantes KSPs. Entre parênteses, após o código de cada um dos isolados, está o padrão de sensibilidade killer que definiu cada biótipo ou linhagem. O biótipo (0), entre os 13 distintos mostrou ser o mais frequente, agrupando 27 dos 31 isolados de levedura killer da destilaria 1. Somente quatro isolados desta destilaria, D1­28, D1­29, D1­30 e D1­31 demonstraram distintos padrões de sensibilidade, e destes quatro, D1­ 28, D1­29 e D1­30 apresentaram o biótipo (K3 K4 K5 K9) sendo que D1­31, biótipo (K3 K5 K9), foi diferenciado por demonstrar resistência à levedura killer de classe K4. Os 5 isolados da destilaria 3 apresentaram sensibilidade às leveduras das classes K2, K7, K8 e K9, sendo discriminados em três distintos biótipos, (K2 K7 K9), (K2 K7 K8) e (K7 K9) devido à sensibilidade diferencial a estas classes. Entre os 9 isolados da destilaria 5, alguns apresentaram sensibilidade às leveduras das classes K1, K6 e K8, sendo assim discriminados em quatro distintos biótipos. Por sua vez, todos os 5 isolados de levedura killer da destilaria 7 foram discriminados em cinco distintos biótipos ou linhagens, de acordo com suas respectivas diferenças de sensibilidade as leveduras das classes K1, K3 e K4 (Figura 14). O único isolado de levedura killer da destilaria 4 demonstrou o mesmo biótipo, (K1 K6), apresentado por dois isolados da destilaria 5. Este foi o único caso de compartilhamento de biótipo entre isolados de distintas destilarias que apresentou sensibilidade a alguma levedura de referência killer (K1 a K9). Somente o biótipo (0), resistente às nove classes de leveduras, foi compartilhado entre isolados de distintas destilarias, de maneira que só não foi exibido pelos isolados da destilaria 3 e pelo único isolado da destilaria 4. A prevalência do biótipo (0) na destilaria 01 (Tabela 15) sugere que, neste ambiente fermentativo houve estabelecimento de uma biota particular de leveduras com predomínio de uma única linhagem, representada pelo próprio biótipo (0), durante as fermentações. Isto indica que, provavelmente, durante a realização da coleta e isolamento esta linhagem tenha sido isolada várias vezes das fermentações realizadas nesta destilaria. Este resultado corrobora com Santamaría et al. (2005), que em trabalho realizado com leveduras associadas à fermentação espontânea para produção de vinho, verificou que linhagens de leveduras killer nativas podem tornar­se estáveis após anos de atividade fermentativa podendo predominar durante sucessivos ciclos fermentativos. De acordo com os KSPs apresentados pelos 51 isolados de levedura killer neste trabalho, similares entre isolados de mesma destilaria e diferentes entre aqueles obtidos de distintas destilarias, Vaughan­Martini et al. (1988) e Buzzini et al. (2007) comentam que a ultraespecificidade do fenômeno killer pode estar relacionada a origem ambiental das linhagens, de maneira que leveduras ecologicamente relacionadas normalmente exibem semelhantes padrões de sensibilidade killer. De fato, através da observação da Figura 14, percebe­se que os isolados do mesmo ambiente de fermentação (destilaria), quase em sua totalidade, estão reunidos em um mesmo grupo e
exibem padrões similares de sensibilidade ao painel formado pelas nove distintas classes de leveduras de referência (K1 a K9). Entretanto, baseado na evidência de que a composição química da parede celular de leveduras é uma característica relacionada ao táxon (GOLUBEV, 2006) e na informação de que a ligação entre toxinas killer e receptores de parede celular é necessária para a ação letal da toxina (MARQUINA et al., 2002; GOLUBEV et al., 2006); Golubev (2006) sugere que perfis de KSP também podem ter importância taxonômica. Este autor cita que a resistência às toxinas killer geralmente ocorre ao nível de parede celular, de forma que as leveduras resistentes não apresentam receptores específicos e que, se diferenças em sua composição química está relacionada ao táxon, a característica de resistência ou sensibilidade às toxinas killer também deve ser uma propriedade taxonomicamente relacionada. Esta possível relação entre KSP e táxon, talvez explique o fato de que, entre os únicos quatro isolados da destilaria 1 identificados bioquimicamente como não S. cerevisiae, D1­25, D1­29, D1­30 e D1­31, somente D1­25 apresentou o biótipo (0), predominante nesta destilaria. Os demais apresentaram padrões de sensibilidade totalmente distintos, demonstrando sensibilidade diferencial às leveduras de referência pertencentes às classes K3 K4 K5 e K9 (Tabela 15). Nenhum padrão de sensibilidade killer comum a todas as destilarias foi detectado entre os isolados, indicando que uma biota particular de leveduras deve estar associada a cada região produtora e/ou ambiente de fermentação. Esta correlação obtida entre os distintos padrões de sensibilidade e origem dos biótipos pode permitir auxiliar o monitoramento dos isolados de levedura killer obtidos neste trabalho, em processos fermentativos que possivelmente os utilizem como culturas iniciadoras em fermentações na produção de cachaça de alambique. Além disto, os isolados de biótipo (0) provavelmente possuam o fenótipo killer resistente (K + R + ), pois resistiram às nove distintas classes de leveduras killer pertencentes a dois gêneros, Hansenula e Pichia , e cinco distintas espécies de levedura (Tabela 07). Tal fenótipo pode conferir a estes isolados uma maior vantagem competitiva, permitindo maior resistência contra levedura killer contaminante (MAGLIANI et al., 1997). Estes resultados mostram a diversidade de leveduras associadas à fermentação do caldo de cana para a produção de cachaça utilizando o perfil killer e sugere que as linhagens mais adaptadas às características ecológicas e ambientais de cada região produtora sejam utilizadas como fermento iniciador, após outros testes para seleção das leveduras com potencial de serem utilizadas como cultura starter na produção de cachaça, como forma de preservar a própria biodiversidade natural que é tão importante para a padronização na produção da cachaça de alambique e manutenção da identidade típica de cada região (OLIVEIRA et al., 2005b).
Quanto à dinâmica dos 51 isolados de levedura killer durante os processos fermentativos, pode­se constatar através da Figura 15 que em cada destilaria, exceto a destilaria 4 por ter apresentado somente um isolado, houve sucessão de linhagens de levedura killer ao longo das três fases (inicial, intermediária e final) da fermentação. Este resultado está de acordo com Pataro et al. (2000), que através de análises moleculares baseadas em PCR e PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) concluíram que houve sucessão de linhagens geneticamente distintas de S. cerevisiae ao longo das fermentações espontâneas para produção de cachaça. Neste trabalho, através da utilização de distintos padrões de sensibilidade killer estabelecendo biótipos ou linhagens, esta sucessão é claramente observada entre as fermentações realizadas nas destilarias, principalmente, pela detecção de biótipos nas fases intermediária e final que não foram detectados na fase inicial (Figura 15). Como uma das vantagens propiciadas pela atuação de leveduras killer em processos fermentativos é a manutenção das mesmas durante as fases da fermentação, inibindo linhagens contaminantes devido à vantagem competitiva que elas podem exercer sobre as demais (MARQUINA et al., 2002; CECCATO­ANTONINI et al., 2004), é notável através da observação da Figura 15 que os biótipos detectados na fase inicial também estiveram presentes na fase final. Destaque para o biótipo (0) que se manteve presente durante as três fases dos processos fermentativos realizados nas destilarias 1 e 5. Esta dinâmica dos biótipos killer só não foi observada na destilaria 7 que teve todos os seus cinco isolados discriminados em diferentes biótipos e para destilaria 4 que não foi possível tirar tal conclusão devido à obtenção de somente um isolado killer. Além do mais, como dito anteriormente, a maioria das leveduras killer foram isoladas da fase final (Tabela 10) sugerindo que as mesmas tenham chegado ao fim do processo como consequência da vantagem competitiva exercida sobre as demais durante a sucessão de leveduras.
(K4)
(K1K4) (K3K4) (K1K3K4) (K6K8) (K1K6K8) (K1K6) (K7K9) (K2K7K8) (K2K7K9) (K3K5K9) (K3K4K5K9) T In Int F T In Int F T In Int F T In Int F T In Int F DEST 1 DEST 3 DEST 4 DEST 5 DEST 7 (0) Destilaria e Fase da fermentação Figur a 15. Distribuição dos 13 distintos biótipos, representativos dos 51 isolados de levedura killer , ao longo das três fases (Inicial (In), Intermediária (Int) e Final (F)) do ciclo fermentativo de cada uma das cinco destilarias (DEST 1, DEST 3, DEST 4, DEST 5 e DEST 7) de origem. (T) refere­se ao número total de isolados killer e de distintos biótipos originados de mesma destilaria. Ao lado é dada a legenda das cores correspondentes a cada biótipo. 5.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR As 16 distintas leveduras killer por apresentarem atividade inibitória contra 12 isolados do grupo S (Tabela 13), D1­24 pelo fato de ter sido o único identificado bioquimicamente como S. cerevisiae a inibir um isolado do grupo NS (Tabela 24) e todas as 21 leveduras integrantes deste grupo (Tabela 06), foram os 38 isolados de levedura escolhidos para serem identificados em nível molecular através da análise de suas sequências de DNA correspondentes à região D1/D2 do gene 26S do rDNA (Figura 08) a fim de se confirmar a prévia identificação bioquímica. Após extração do DNA total e realização da PCR, foi possível confirmar a amplificação das sequências de cada uma das leveduras citadas acima através da visualização das bandas de DNA com tamanho aproximado de 900 pares de bases em corrida eletroforética (Figura 16). 2000pb 900pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb 2000pb 900pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb
Figur a 16. Produtos da PCR referente às 38 leveduras selecionadas, submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1X, 5V/cm, 1,5 hrs, corado com brometo de etídio e fotografados pelo sistema de fotodocumentação Edas 290 (Kodak). O marcador (M) utilizado foi o “Gene Ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas). Foi possível notar que, após análise das respectivas sequências de DNA obtidas das 38 leveduras, somente DEST4 D3 T0 1 e DEST4 D3 T0 14, bioquimicamente identificadas como não S. cerevisiae foram identificadas apenas ao nível de gênero, sendo ambas pertencentes ao táxon Candida sp. (Tabela 16). Também pode ser constatado um alto índice de similaridade nos alinhamentos entre as sequências obtidas de cada levedura e as de referência no GenBank, refletido pelos altos percentuais de cobertura e identidade. Houve divergências entre as prévias identificações bioquímicas e a identificação molecular, em nove das 21 leveduras integrantes do grupo NS que foram identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae e que após análise molecular mostraram­se pertencer à espécie S. cerevisiae (Tabela 16). As outras 12 leveduras pertencentes ao grupo NS foram identificadas em dois gêneros, Pichia e Candida , sendo que duas foram identificadas somente ao nível de gênero como Candida sp. e as outras dez distribuídas em cinco distintas espécies: Pichia anomala (1); P. guilliermondii (2); P. membranifaciens (2); Candida albicans (1) e Candida californica (4). Todos os 17 isolados de levedura killer foram confirmados pela análise do seqüenciamento como pertencentes ao táxon S. cerevisiae. Os resultados de identificação obtidos através de análise molecular apresentam maior confiabilidade do que os obtidos pelas prévias identificações bioquímicas, pois de acordo com Kurtzman e Fell (2006), entre os genes da região gênica do rDNA, o 26S é aquele que apresenta as sequências menos conservadas, e por isso, foi escolhido para estudos de filogenia de espécies e grupos taxonômicos mais relacionados. Segundo esses autores, a grande maioria das leveduras apresenta a região D1/D2 do 26S rDNA seqüenciada (banco de dados altamente representativo), sendo portanto capaz de diferenciar quase todas as espécies de leveduras testadas visando estudos de taxonomia. A biologia molecular está cada vez mais sendo utilizada como importante ferramenta auxiliar na identificação de leveduras, pois métodos convencionais de identificação, baseados em análises bioquímicas e características micromorfológicas, muitas vezes não permitem obter uma identificação correta em nível de espécie e até mesmo de gênero (FUENTEFRIA et al., 2008). As leveduras contaminantes de fermentações do mosto da cana­de­açúcar para produção de cachaça de alambique, geralmente são classificadas nos gêneros Saccharomyces e Candida (PATARO et al., 2000). Analisando o mosto de uma unidade produtora de álcool durante a safra de 1996, Basso et al. (1996) também constataram que o principal gênero contaminante era Saccharomyces. Isto reforça a sugestão de que a utilização dos 17 isolados de levedura killer, que tiveram identificação confirmada como S. cerevisiae (Tabela 16), como culturas starters em fermentações alcoólicas, podem ser eficazes no combate a este tipo de contaminação. Pois a atividade killer dos mesmos, foi mais frequente sobre leveduras do grupo “S” (Tabela 13), pertencentes à mesma espécie através de prévia identificação bioquímica, do que sobre outras espécies pertencentes ao grupo NS (Tabela 14) e que tiveram identificação confirmada pela análise do sequenciamento (Tabela 16). Vale destacar que a levedura do grupo “NS”, DEST5 D2 T1 13A, sobre a qual o isolado killer D1­24 demonstrou atividade (Tabela 14), foi identificada molecularmente como Pichia guilliermondii e DEST7 D2 T0 10B, também pertencente ao grupo NS e sensível a 28 distintos isolados de levedura killer (Tabela 14), como Candida californica . Esta última espécie, com quatro isolados identificados, foi a mais frequente encontrada entre as 12 leveduras não S. cerevisiae identificadas molecularmente (Tabela 16).
Tabela 16. Caracterização molecular das 38 leveduras escolhidas para identificação, baseada em análises da sequência do domínio D1/D2 do gene 26S do DNA ribossomal. Código do isolado N° de par es de bases Código de acesso no GenBank C* I* Organismo r elativo Leveduras killer com ação letal sobre outros isolados da fermentação (grupos “S” e “NS”) D1­1 774 Z73326.1 100% 100% Saccharomyces cerevisiae D1­3 746 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D1­6 811 Z73326.1 100% 99% S. cerevisiae D1­17 801 Z73326.1 99% 100% S. cerevisiae D1­18 795 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D1­20 716 Z73326.1 96% 100% S. cerevisiae D1­24 800 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D1­28 809 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D3­2 817 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D3­3 698 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D3­5 622 AY048154.1 100% 100% S. cerevisiae D4­1 880 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D5­2 762 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D5­9 817 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D7­1 726 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D7­3 801 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae D7­5 659 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae Leveduras integrantes do grupo “NS” (identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae) DEST1 D2 T1 2A 834 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T4 2 846 EU057562.1 100% 99% Pichia anomala DEST1 D2 T5 1A 764 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T7 1A 877 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T7 1B 793 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T7 2A 661 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T7 3A 781 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST1 D2 T7 3B 818 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST5 D2 T1 17 702 DQ318797.1 100% 99% P. guilliermondii DEST5 D2 T1 19 828 EU057561.1 100% 100% P. membranifaciens DEST5 D2 T3 16 838 X70659.1 100% 93% Candida albicans DEST5 D2 T4 3 924 Z73326.1 100% 100% S. cerevisiae DEST5 D2 T1 13A 706 DQ318796.1 96% 99% P. guilliermondii DEST4 D3 T0 2 829 EU057561.1 100% 100% P. membranifaciens DEST4 D3 T0 1 815 DQ438188.1 100% 91% Candida sp. DEST4 D3 T2 1 816 EF550230.1 100% 99% Candida californica DEST4 D3 T0 14 844 DQ438188.1 100% 91% Candida sp. DEST7 D2 T0 3 838 EF550230.1 100% 99% Candida californica DEST7 D2 T0 15 831 EF550230.1 100% 100% Candida californica DEST7 D2 T0 10B 811 EF550230.1 100% 100% Candida californica DEST7 D2 T0 24 816 Z73326.1 100% 99% S. cerevisiae * (C) Cobertura ­ Percentual correspondente ao tamanho da sequência obtida da levedura que foi alinhado com a sequência do organismo relativo depositada no GenBank; (I) Identidade entre os nucleotídeos alinhados das duas sequências.
Após a confirmação, através da identificação molecular, de que todos os 17 isolados de levedura killer pertencem ao táxon S. cerevisiae, é possível relacioná­los aos correspondentes biótipos killer (Tabela 17) como forma de caracterizar a diversidade intra­ específica ao nível de linhagens. Segundo Sangorrín et al. (2007), a relação entre o número de isolados analisados pertencentes à mesma espécie e o número de biótipos killer caracterizados pode ser considerado um índice aproximado de biodiversidade (R) para cada espécie de levedura. Portanto, como através da observação da Tabela 17 é possível verificar no total, 7 distintos biótipos entre os 17 isolados pertencentes à espécie S. cerevisiae, encontrou­se R= 2,4 como resultado da relação 17/7. Este valor demonstra uma alta variabilidade intra­ específica dentro da população de S. cerevisiae, semelhante aos resultados obtidos por Sangorrín et al. (2007) (R= 1,8) e Lopes et al. (2005) (R= 2,6), sendo que este último combinou análises de RFLP com determinação de KSP, o que aumentou ainda mais a capacidade discriminatória entre os isolados. Contudo, o índice apresentado neste trabalho provavelmente seja reflexo da alta diversidade encontrada entre as destilarias, a qual foi corroborada pelos resultados de KSP descritos acima que indica que cada uma delas parece apresentar uma biota particular de espécies e linhagens de leveduras (Tabela 15 e Figura 14). Este resultado evidencia que a resposta diferencial às toxinas killer pode ser variável mesmo entre as linhagens de uma mesma espécie de levedura isoladas de um mesmo ambiente de fermentação, sendo por isso capaz de discriminá­las. Em um trabalho de diversidade e comportamento killer de leveduras associadas às fermentações espontâneas para produção de vinho na Argentina, Sangorrín et al. (2007) obtiveram resultados sugestivos de que fatores geográficos e o uso de leveduras comerciais possam ter alterado a composição da biota nativa de leveduras dominantes que são determinantes para as propriedades enológicas excepcionais que contribuem para manutenção das características do vinho que são típicas de cada região. Este achado reforça os indícios de que as 7 distintas linhagens de leveduras killer representativas dos 17 isolados identificados como S. cerevisiae obtidos neste trabalho, quanto ao comportamento killer , são boas candidatas a serem utilizadas como culturas starter em processos fermentativos para produção de cachaça de alambique no estado da Bahia. Pois além de poder minimizar e/ou prevenir contaminações do mosto por leveduras contaminantes indesejáveis, elas pertencem à linhagem de levedura que normalmente predomina nas fermentações espontâneas daquela região e à espécie, S. cerevisiae, que na maioria das vezes confere características desejáveis para produção de cachaça de alambique quando comparadas as não S. cerevisiae (PATARO et
al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005b; GOMES et al., 2008), bem como estão adaptadas às condições ambientais e ecológicas de suas respectivas regiões de origem. Tabela 17. Discriminação intra­específica, através dos distintos KSPs, dos 17 isolados de levedura killer identificados como S. cerevisiae por meio de análise das sequências da região D1/D2 da subunidade (26S) do rDNA. Isolados killer S. cerevisiae D1­1 D1­3 D1­6 D1­17 D1­18 D1­20 D1­24 D1­28 D3­2 D3­3 D3­5 D4­1 D5­2 D5­9 D7­1 D7­3 D7­5 Padr ão de sensibilidade killer (KSP) 0 0 0 0 0 0 0 K3 K4 K5 K9 K2 K7 K9 K2 K7 K8 K2 K7 K9 K1 K6 0 0 K1 K4 K1 K3 K4 0 (0) Biótipo com resistência às nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9. Cada algarismo precedido pela letra “K” refere­se à classe de levedura killer com ação letal sobre os isolados de levedura killer identificados como S. cerevisiae. Analisando a árvore filogenética (Figura 17) obtida a partir das sequências da região D1/D2 do gene 26S do DNA ribossomal, utilizada na identificação de cada um dos 17 isolados de levedura killer como Saccharomyces cerevisiae, percebe­se que somente houve suporte estatístico, dado por valores do bootstrap acima de 50%, para a formação de dois grupos (A e B) e dois subgrupos (C e D). O grupo B apresentou um suporte estatístico de 96% e reuniu 14 distintos isolados provenientes de cinco distintas destilarias (1, 3, 4, 5 e 7) que foram previamente discriminados em sete biótipos de acordo com seus respectivos KSPs. O grupo A, com valor de bootstrap de 100%, reuniu os isolados D1­18, D5­9 e D1­1 que apresentaram o biótipo (0), sendo que, D5­9 e D1­1 constituíram o subgrupo C com valor de bootstrap de 66%. Dois outros isolados de biótipo (0), integrantes do grupo B, apresentaram
similaridade de sequência baseado no valor estatístico significativo de 52%, formando o subgrupo D. Estes resultados mostram que a análise molecular, baseada nas sequências de DNA das 17 leveduras, mesmo sendo realizada a partir de uma região (D1/D2 do gene 26S do rDNA) relativamente variável (KURTZMAN e FELL, 2006), e capaz de identificá­las ao nível de espécie, no entanto, não discriminam ao nível intra­específico como foi feito previamente através da obtenção dos 13 distintos padrões de sensibilidade killer (Tabela 15). Para a discriminação ao nível intra­específico, seria necessário sequenciar regiões ainda mais variáveis, como ITS e IGS (BRUNS et al., 1991; HILLS e DIXON, 1991), entretanto, o objetivo principal do sequenciamento dos domínios D1/D2 do gene 26S do rDNA dos isolados foi validar a identificação bioquímica prévia.
52 D
96 B 100 A 66 C __ 0.05 substitutions/site Figur a 17. Árvore filogenética dos 17 isolados de levedura killer identificados molecularmente como Saccharomyces cerevisiae, obtida por análise de neighbour­joining (modelo de Kimura dois parâmetros) do domínio D1/D2 do gene 26S do rDNA. Schizophyllum commune (N°. de acesso no Gen Bank GQ241260.1) foi incluído para enraizar a árvore. Os valores em porcentagem do bootstrap de 1000 replicações são mostrados sobre os ramos que definem os grupos (A e B) e subgrupos (C e D) (valores abaixo de 50% não são mostrados). Entre parênteses, após a designação do código de cada isolado killer , é dado o KSP que define o biótipo correspondente a cada isolado, exceto no grupo externo. 6 CONCLUSÃO A detecção de leveduras killer (16%) entre as destilarias estudadas no estado da Bahia, principalmente associadas à fase final da fermentação, e a presença de algumas linhagens (biótipos) durante as três fases do processo, indica que a atividade killer pode conferir vantagem competitiva às leveduras durante fermentações espontâneas para produção de cachaça de alambique. A temperatura de 25°C, correspondente às fases iniciais dos processos fermentativos estudados, determinada como a melhor entre as testadas para atividade das toxinas killer produzidas pelas leveduras encontradas, permite inferir que a ação protetora do mosto contra leveduras contaminantes ocorra durante o início da fermentação. Assim, para a continuidade da atividade killer durante as fermentações, o controle da temperatura das dornas deve ocorrer, lembrando que a 28°C e 32°C a atividade killer foi inibida em todos os isolados previamente verificados como ativos a 25°C. Isto mostra a importância do acompanhamento da temperatura nas dornas de fermentação caso seja utilizada cultura start de leveduras com atividade killer . A evidente atividade killer de 17 leveduras (ação antagonista vista em placa), sobre isolados associados a fermentações espontâneas realizadas em destilarias situadas em áreas geográficas distintas, reforça o potencial de aplicação biotecnológica destas leveduras em suas respectivas destilarias de origem como forma de minimizar os níveis de leveduras sensíveis contaminantes. Os estudos do comportamento killer mostraram 13 distintos padrões de sensibilidade apresentados pelas 51 leveduras killer e foram capazes de discriminá­las associando à sua destilaria de origem, sugerindo que cada ambiente de fermentação estudado apresente uma determinada biota residente de espécies e/ou linhagens. Através da identificação molecular, as 17 leveduras com atividade killer demonstrada contra leveduras associadas a processos fermentativos de outras destilarias, foram confirmadas como S. cerevisiae, espécie predominante em fermentações espontâneas para produção de cachaça de alambique. As mesmas foram discriminadas em sete distintas linhagens de acordo com seus respectivos KSPs, constituindo­se em boas candidatas, quanto ao comportamento killer , para serem utilizadas como fermento iniciador de processos fermentativos em suas destilarias de origem. Estudos adicionais que demonstrem a atividade killer destas leveduras sob condições naturais do mosto em fermentação são importantes para a constatação dos reais benefícios
concedidos pelas leveduras killer aos processos fermentativos. Além disto, pesquisas que detectem outras características desejáveis para produção de cachaça se fazem necessárias para que as leveduras killer encontradas neste estudo sejam utilizadas como culturas starter visando à produção de cachaça de alambique com melhores padrões de qualidade.
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APÊNDICES APÊNDICE A – Teste para deter minação do Padrão de Sensibilidade Killer. K3 K2 K5 K1 K4 K6 K7 K9
K8 A levedura D5­5 foi semeada sobre a superfícice do meio ágar YEPD­MB e sobre ela foram inoculadas em forma de ponto nove leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9. Foi detectado o padrão de sensibilidade (K1K6), pois somente as leveduras de classes 1 e 6 demonstraram atividade killer sobre D5­5. Em K7 e K8 não foi considerado atividade killer , pois não houve formação do halo de células mortas coradas em azul. APÊNDICE B – Sequências amplificadas do domínio D1/D2 do gene 26S do r DNA 1. Sequência do isolado killer D1­1, Saccharomyces cerevisiae 5’tacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgtcccaacagc tatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattgtgcatcttgcgaggccccaacctacgtt cactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacg ggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccaca ggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggatttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtga aatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaaaacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaa caatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggt ctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcg aaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaaca tagacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattacaactcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttg agcttttgccgcttcactcg 3’ 2. Sequência do isolado killer D1­3, S. cerevisiae 5’tttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatc ccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtg ggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaa agaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgtttt gtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaat ccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgac gtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatg cgagtgtttgggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatc gaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcc tgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaat 3’ 3. Sequência do isolado killer D1­6, S. cerevisiae 5’agtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaact ttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgc ggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatcta aagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagag tgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgt gggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttg cctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctgg cataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaa acccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctgatgtctt cggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccag aggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaattgggatag 3’ 4. Sequência do isolado killer D1­17, S. cerevisiae
5’tcacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggaga gggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcg aggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaat tccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttga aaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctg ctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaat gtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaag gatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttg ggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcct gatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggt gaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgat 3’ 5. Sequência do isolado killer D1­18, S. cerevisiae 5’atttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcac catctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattgtgcacct cttgcgaggccccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcgcatagacgttag actccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgcagtcctc agtcccagctggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggatttatcctgcc accaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaaaacaccatgt ctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttcc atcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctg cattcccaaacaactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattctcaccct ctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattacaactcgggca ccgaaggtaccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcactcgcc 3’ 6. Sequência do isolado killer D1­20, S. cerevisiae 5’gccccctgaaagttagagtagttttccgcagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaac aggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagt tgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaac aagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagg gcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagc atcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactg ccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacac ggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttg gggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttggg acccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggtt 3’ 7. Sequência do isolado killer D1­24, S. cerevisiae 5’gaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttc cttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaag agtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccga tagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaa agggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcact gggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgg gaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtct tgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaac gtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatag ctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtag cggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcgaaagact 3’ 8. Sequência do isolado killer D1­28, S. cerevisiae
5’acggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagg gcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgag gagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattc catctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaa agagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgct ccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgt agcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaagga tgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttggg tgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctga tgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtga agccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaat 3’ 9. Sequência do isolado killer D3­2, S. cerevisiae 5’gcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttgggg ccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttct ttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagcta aatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaa agtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtag gggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcgg taagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataat ggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccat acgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctgatgtcttcggatg gatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaa ctctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcgaaaga 3’ 10. Sequência do isolado killer D3­3, S. cerevisiae 5’acggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagg gcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgag gagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattc catctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaa agagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgct ccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgt agcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaagga tgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttggg tgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctga tgtcttcggatggatttgagtaaga 3’ 11. Sequência do isolado killer D3­5, S. cerevisiae 5’ggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagtt gtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaa tcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaag tgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatga aaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgtt ttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataa atccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcg acgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtcta tgcgagtgtttgggtgtaaaaccc 3’ 12. Sequência do isolado killer D4­1, S. cerevisiae 5’ggaaaagaaaccaaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggta ccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggac
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5’accgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccg agttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtg agaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctc taagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaag atgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatgg tgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcagg ataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggac tgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacg tctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgc acaatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaac tatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggt 3’ 17. Sequência do isolado killer D7­5, S. cerevisiae 5’aaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgccc gagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggt gagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagct ctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaa gatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatg gtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcag gataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgagga ctgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaac gtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttgggg 3’ 18. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T1 2A, S. cerevisiae 5’ctagatggttcgattagtctttcgcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacga gcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgc tcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattgtgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcac tttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgg gcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccacag gctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggatttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaa atgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaaaacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaac aatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtc tctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcga aggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacat agacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattacaactcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttga gcttttgccgc 3’ 19. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T4 2, Pichia anômala 5’aaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctagcaccttcggt gtttgagttgtaatttgaagatggtaaccttgggtttggctcttgtctatgttccttggaacaggacgtcataga gggtgagaatcccgtctgatgagatgcccattcctatgtaaggtgctatcgaagagtcgagttgtttgggaatgc agctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatg gaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcattagatcaga cttggtgttttacgattatcttctcttcttgagttgtgcactcgtatttcactgggccagcatcgattcggatgg caagataatggcagttgaatgtggcttcacttcggtggagtgttatagcttctgctgatattgcctgtctggatc gagggctgcgtcttttgactaggatgctggcgtaatgatctaatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagt ctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtgagagctctttttt gagtgcatcatcgaccgatcctgatgttttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatg gtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcg atcgtcgaatttgggtatagggg 3’ 20. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T5 1A, S. cerevisiae
5’agagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttact caaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattgtgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcactttcatt acgcgtatgggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcat ataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccacaggctataa tacttaccgaggcaagctacattcctatggatttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgag attcccctacccacaaggagcagagggcacaaaacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttca cgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgcc aatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggcact ttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaag gaacggccccaaagttgccctctccaaattacaactcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttgagcttttg ccgcttcactcgccgt 3’ 21. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T7 1A, S. cerevisiae 5’acggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagg gcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgag gagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattc catctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaa agagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgct ccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgt agcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaagga tgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttggg tgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatcgaccgatcctga tgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtga agccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggc gaaagactaatcgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttccctcagga 3’ 22. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T7 1B, S. cerevisiae 5’tcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcagg catagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcga ttgtgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcgca tagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgt cgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggat ttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaa aacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttt tcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccaccca cttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacggga ttctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattac aactcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttgagcttttgcc 3’ 23. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T7 2A, S. cerevisiae 5’acggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagg gcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgag gagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattc catctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaa agagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgct ccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgt agcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaagga tgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttggg tgtaaaacccatacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttggggcctcgcaagaggtgcacaatc 3’
24. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T7 3A, S. cerevisiae 5’acgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcat agttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattg tgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcgcatag acgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgc agtcctcagtcccagctggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggattta tcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaaaac accatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttca tctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccactt agagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattc tcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattacaac tcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttga 3’ 25. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST1 D2 T7 3B, S. cerevisiae 5’tatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttca ccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatca ggatcggtcgattgtgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacaccc aaacactcgcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatcc ttgacttacgtcgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctaca ttcctatggatttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagc agagggcacaaaacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctctttt caaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaa tttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctc gccacacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggaacggccccaaagttgccct ctccaaattacaactcgggcaccgaaggtaccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcactcgccgt 3’ 26. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST5 D2 T1 17, Pichia guilliermondi 5’ctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatgatgcactca aaagagccctcacctacgttcactttcattacgcgtacgggtttaacacccaaacactcgcatagacgttagact ccttggtccgtgtttcaagacgggcggtttgggatcattatgccagcatccttgataaaatcgcagtcctcggtc taggcaggcagcatcaacgcaggctataacacttcaccgaagcaaagtcacattcctacgccattatcctaccgc ccaaaccgatgctggcccgataagctgcgggtcaccccgccacgaaggcaaggctcacaaaatatcgagtctgat ctcaaacccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcac tgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattc ccaaacaactcgactcttcgaaagcaccttacataggattgggcatctcatcgcacgggattctcaccctctgtg acgtcctgttccaagaaacatagacaagagccaaccccaaggttacaatcttcaaattacaactcggacaccgaa ggtgccagatttcaaatttgagctttgcc 3’ 27. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST5 D2 T1 19, P. membranifaciens 5’cgattagtctttcgcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccacca gagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaa atccatccgataaacatcaggatcggtcgatcgtgccccccgaaggggtccgacctacgttcactttcattacgc gtacgggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggtccatgtttcaagacgggcggtattgcg ccgttgtgccagcatccgagacagaagccgcagtcctcggtccccgcacgcggtatctggcgccggctataacac tccgaagagccactttccggcacccattctcccgcagcaagaaccgatgctggcccagagagcgcccagagcgcc gcctacaagagacagcggtgcgcactccccatgtcgggcccaatacccttccctttcaacaatttcacgtgctgt ttcactctcttttcaaagtgcttttcatctttccttcacagtacttgttcgctatcggtctctcgccagtattta gccttagatggaatttaccacccacttggagctgcattcccaaacaactcgactcgtcagcagggcctcagagct
tcgcacggcaccccacggggctctcaccctctcaggcgccctgttccaagggacttggacaccgtgctccacaaa gactcccgcctacactctacaactcgtgccaaaaaaattagcacgatttcaaatctgagctcttgccgcttcact cgccg 3’ 28. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST5 D2 T3 16, Candida albicans 5’agtctttcgcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtt tcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatcca tccgaagacatcaggatcggtcgatagtgcactcctaaaggaggtcctacctacgttcactttcattacgcgtac gggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcgacttaagatcat tatgccaacatcctaggccgaagccgcagtcctcagtctaagctggcagtatcgacaaagactataacacactac cgaagcagtgccacatttctttgcacttatcctaccgctcaaactgatgctggcccggtaaactgtagaggccac ccccgagagagtaacatacaaaataccaagtctgatctcaagcccttccctttcaacaatttcacgtactttttc actctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagct ttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggaactttacataggtc tgggacatctcatcgcacgggattctcaccctctgtgacgttctgttccaagaaacatagacaagagccagaccc aaagataccttcttcaaattacaactcggacactgaaagtgccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcact cgccgctactgaggc 3’ 29. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST5 D2 T4 3, S. cerevisiae 5’cggcaggaaccagctactagatggttcgattagtctttcgcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcac gtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgg gtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgattgtgcacctcttgcgaggc cccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggt ccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttacgtcgcagtcctcagtcccagct ggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatggatttatcctgccaccaaaactg atgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcacaaaacaccatgtctgatcaaat gcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtac ttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaa caactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgggattctcaccctctatgacgtc ctgttccaaggaacatagacaaggaacggccccaaagttgccctctccaaattacaactcgggcaccgaaggtac cagatttcaaatttgagcttttgccgcttcactcgccgttactaaggcaatcccggttggtttcttttcctccgc ttattgatatgcttaagttcagcggg 3’ 30. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST5 D2 T1 13A, P. guilliermondi 5’tgccttagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcaccttcggtgtccgagttgtaa tttgaagattgtaaccttggggttggctcttgtctatgtttcttggaacaggacgtcacagagggtgagaatccc gtgcgatgagatgcccaatcctatgtaaggtgctttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtggg tggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaag aactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggtttgagatcagactcgatattttgt gagccttgccttcgtggcggggtgacccgcagcttatcgggccagcatcggtttgggcggtaggataatggcgta ggaatgtgactttgcttcggtgaagtgttatagcctgcgttgatgctgcctgcctagaccgaggactgcgatttt atcaaggatgctggcataatgatcccaaaccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgag tgtttgggtgttaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtgagggctcttttgagtgcatcatcgaccga tcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatacctgaata gggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaat 3’ 31. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST4 D3 T0 2, P. membranifaciens 5’gcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctgg cttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgataa
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5’caacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaagagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagt tgtagagtgtaggtgggagtctctgcggagcacagtgtccaagtcccttggaacagggcgcctgagagggtgaga gccccgtggggtgctgtgcgaagctttgaggccctgctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagcgg gtggtaaattccatctaaggctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtactgtgaaggaaagatgaaaa gcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagggtattgggcccgacatggggagtgc gcaccgctgtctcttgtaggcggcgctctgggcgctctctgggccagcatcggttcctgctgcgagagaaagggt tccggaaagtggctcttcggagtgttatagccggggccagatgtcgcgtgtggggaccgaggactgcggcttctg tctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgaaacatggaccaaggagtctaacgtctatgcgagt gtttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtcggaccctttgggggcacgatcgaccgatcc tgatgtttatcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagg gtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtaccggtttctgacttgcaaatcgatcgtcgaatttgggtata ggggcgaaagactaa 3’ 36. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST7 D2 T0 15, C. californica 5’acagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaagagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagttg tagagtgtaggtgggagtctctgcggagcacagtgtccaagtcccttggaacagggcgcctgagagggtgagagc cccgtggggtgctgtgcgaagctttgaggccctgctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagcgggt ggtaaattccatctaaggctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtactgtgaaggaaagatgaaaagc actttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagggtattgggcccgacatggggagtgcgc accgctgtctcttgtaggcggcgctctgggcgctctctgggccagcatcggttcctgctgcgagagaaagggttc cggaaagtggctcttcggagtgttatagccggggccagatgtcgcgtgtggggaccgaggactgcggcttctgtc tcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgaaacatggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgt ttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtcggaccctttgggggcacgatcgaccgatcctg atgtttatcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggt gaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggg gcgaaaga 3’ 37. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST7 D2 T0 10B, C. californica 5’tatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttca ccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgataaacatc aggatcggtcgatcgtgcccccaaagggtccgacctacgttcactttcattacgcgtacgggttttacacccaaa cactcgcatagacgttagactccttggtccatgtttcaagacgggcggtattgcgccgttgtgccagcatccgag acagaagccgcagtcctcggtccccacacgcgacatctggccccggctataacactccgaagagccactttccgg aaccctttctctcgcagcaggaaccgatgctggcccagagagcgcccagagcgccgcctacaagagacagcggtg cgcactccccatgtcgggcccaatacccttccctttcaacaatttcacgtgctgtttcactctcttttcaaagtg cttttcatctttccttcacagtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagccttagatggaatttacca cccgcttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcagcagggcctcaaagcttcgcacagcaccccacgggg ctctcaccctctcaggcgccctgttccaagggacttggacactgtgctccgcagagactcccacctacactctac aactcgtgccgaaacacgatttcaaatctgagctcttgccgcttcactcgccgctactgaggc 3’ 38. Sequência da levedur a do gr upo “NS” DEST7 D2 T0 24, S. cerevisie 5’attcgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattca ggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtc gattgtgcacctcttgcgaggccccaacctacgttcactttcattacgcgtatgggttttacacccaaacactcg catagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatataaccattatgccagcatccttgacttac gtcgcagtcctcagtcccagctggcagtattcccacaggctataatacttaccgaggcaagctacattcctatgg atttatcctgccaccaaaactgatgctggcccagtgaaatgcgagattcccctacccacaaggagcagagggcac aaaacaccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttct tttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacc cacttagagctgcattcccaaacaactcgactcttcgaaggcactttacaaagaaccgcactcctcgccacacgg gattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggacggccccaaagtagcttcttcaaattac aactcggacaccgaaggtgccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcactcgccgtgactaaggc 3’
ANEXOS Todo material de laboratório, meios de cultura, soluções e tampões utilizados foram esterilizados em autoclave, a 121º C por 15 minutos. ANEXO A ­ Meios de cultura 1. Ágar SCY Composto de caldo­de­cana 10% (v/v), extrato de levedura 0,1% (p/v), ágar 2% (p/v) e cloranfenicol 0,01% (p/v). 2. Ágar Sabouraud (Sabouraud, Ann. Der mat and Syphilol, 1953) Composto de glicose 2,0% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v), peptona 1,0% (p/v) e ágar 2% (p/v). 3. Ágar YEPD Composto de extrato de levedura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), glicose 2% (p/v) e ágar 2% (p/v). 4. Ágar YM (WICKERHAM, 1951 apud MAZUR, 1961) Composto de extrato de levedura 0,3% (p/v), extrato de malte 0,3% (p/v), peptona 0,8% (p/v), glicose 1,0% (p/v) e ágar 2,0% (p/v) dissolvidos em água destilada; pH 6,2. 5. GYMP Composto de glicose 2,0% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v), extrato de malte 1,0% (p/v), Na2HPO4 0,2%.
ANEXO B ­ Soluções, tampões e reagentes 1. Solução de Tr is­HCl 1,0 M (pH 8,0) Dissolveu­se 121,1 g de Trizma base em 800 mL de água milli­Q, ajustando o pH para 8,0 com HCl e completando­se o volume para 1000 mL com água milli­Q. 2. Solução de Ácido etileno diamino tetra acético (EDTA) 0,5 M (pH 8,0) Dissolveu­se 37,22 g de EDTA em 160 mL de água milli­Q, ajustando o pH para 8,0 com pastilhas de NaOH e completando­se o volume para 200 mL com água milli­Q. 3. Tampão de extração de DNA, modificado de Doyle e Doyle (1987) Dissolveu­se (em banho­maria 65ºC) 2 g de CTAB em 28 mL de NaCl 5,0 M, 10 mL de Tris­HCl 1,0 M (pH 8,0) e 4,0 mL de EDTA 0,5 M. Em seguida, acrescentou­se 2 g de PVP­40 e pôs no agitador por 10 h, sendo o volume completado para 100 mL com água milli­ Q.
4. Tampão Tr is­EDTA (TE) Misturou­se 1,0 mL de Tris­HCl 1,0 M (pH 8,0) com 0,2 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0), completando o volume com água milli­Q para 100 mL. 5. Tampão Tr is­Acetato/EDTA (TAE) 50X Dissolveu­se 242 g de Trizma base em 57,1 mL de ácido acético glacial e 100 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0), sendo o volume completado para 1000 mL com água milli­Q. 6. Solução de ácido acético 0,05 M Misturou­se 0,29 mL de ácido acético em 100 mL de água milli­Q. 7. Solução de acetato de sódio 0,05 M Dissolveu­se 0,41 g de acetato de sódio em 100 mL de água milli­Q. 8. Tampão acetato 0,05 M (pH 5,0) Misturou­se 14,8 mL da solução de ácido acético com 35,2 mL da solução de acetato de sódio, sendo o volume completado para 100 mL com água milli­Q.
9. Solução de Ácido Cítr ico 0,1 M Dissolveu­se 1,92 g de ácido cítrico em 100 mL de água milli­Q. 10. Solução de Fosfato de sódio dibásico (heptahidratado) 0,2 M Dissolveu­se 5,36 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado em 100 mL de água milli­Q. 11. Tampão Citrato­Fosfato 0,5 M (pH 4,0) Misturou­se 30,7 mL da solução de ácido cítrico 0,1 M com 19,3 mL da solução de fosfato de sódio dibásico (heptahidratado) 0,2 M, sendo o volume completado para 100 mL com água destilada.