Aplicação presentes e futuras na Alergologia
TESTE DE ACTIVAÇÃO DE
BASÓFILOS POR CITOMETRIA DE
FLUXO
Introdução
 O diagnostico das reacções alérgicas na
prática medicinal resulta tanto do historial
clínico como de testes e demonstrações a
imunoglobulinas E específicas do soro e dos
tecidos do indivíduo.
 BAT
Princípios
 Basófilos são granulócitos que
representam menos de 1% dos
leucócitos.
 A activação do basófilo pode
seguir dois caminhos principais:
a degranulação anafilática (AND)
e
a
degranulação
fragmentada
(PMD),
caracterizada por alterações
morfológicas e secreção do
conteúdo do grânulo sem
exocitose.
 Marcadores principais: FcεRI,
CD36,CD203c, P38 MAPK
Colheita e Preservação
 Uso até 3H após a recolha, tubo sem
endotoxinas, anticoagulante EDTA ou
heparina e temperatura ambiente
 Uso ate 24H após a recolha, anticoagulante
EDTA e temperatura 4ºC
Sangue Total ou Basófilos
Isolados
 É simples isolar os leucócitos do sangue total,
utilizando técnicas de centrifugação e de
gradientes de densidade.
Condições de Estimulação
 Após a estimulação, os basófilos reagem
imediatamente, se as condições se
encontrarem ideais.
 O pré-aquecimento de sangue, bem como o
contacto com os reagentes por 15 min a 37ºC
melhora significativamente a latência e
magnitude de anti-IgE mediada por CD63.
Marcação com IL-3
 Alguns autores têm mostrado que uma curta
pré-incubação com IL-3 pode aumentar a
sensibilidade dos ensaios baseados em CD63,
mas esta medida não parece ser crucial para
os potentes alérgenos proteicos e de
estimulação com soro de pacientes com
urticária auto-imune.
Estimulação do Controlo
Positivo e Negativo
 Para que haja uma interpretação correcta da
BAT é necessário ter em conta a influência
dos estímulos positivo e negativo.
 Tradicionalmente, o controlo positivo é um
anticorpo policlonal ou monoclonal anti-IgE.
 Na ausência de estimulação controle positivo,
torna-se
impossível
interpretar
correctamente os resultados negativos das
reacções alérgicas.
Estimulação do Alergénio
 A análise de fluxo assistida e quantificação in
vitro de basófilos activados geralmente
depende da utilização de extractos de
alérgenos naturais.
Experiência de dosagem
 As respostas dos basófilos podem ser
extremamente heterogéneas entre diferentes
indivíduos.
 No entanto, a fosforilação de alérgenos
específicos de p38 MAPK, de CD63 e
CD203c geralmente não é restrita a um único
estímulo,
mas
implica
diferentes
concentrações de estimulação que se
estendem por várias escalas.
Marcadores de Identificação
 Na maioria dos estudos correntes foi aplicado
um anticorpo anti-IgE na amostra de sangue
periférico com o objectivo de identificar os
basófilos.
 Como outras células do sangue podem ser
apresentar este anticorpo, para o estudo de
citometria de fluxo a amostra deve contem
CD203c, uma vez que a expressão desta é
exclusiva da superfície dos basófilos.
Marcadores de Activação
 No presente, os marcadores de activação
mais utilizados são CD63 e CD203c.
Análise de Basófilos do
Paciente
 Actualmente, a análise de fluxo assistida e
quantificação de basófilos activados in vitro
mostrou-se sensível e específica para o
diagnóstico de várias alergias mediadas por
IgE, incluindo os clássicos alérgenos inalantes
(ácaros, epitélio do gato, e pólen), alergia ao
veneno de hymenoptera, alergia natural ao
látex de borracha, alergias primárias e
secundárias a alimentos e medicamentos.
Análise de Basófilos de
dadores atópicos
 A análise de fluxo assistida e quantificação de
basófilos in vitro activados também pode ser
aplicada em células obtidas de indivíduos
atópicos
Aplicações da Pesquisa
 A
citometria de fluxo pode fornecer
resultados referentes à dose de respostas e
cinética de fosforilação de p38 MAPK
qualitativamente similares aos dados obtidos
com a técnica Wesern-blot.
 A citometria de fluxo oferece diferentes
oportunidades que a tornam mais
adequado para aplicação clínica.
CONCLUSÃO, PERSPECTIVAS,
PONTOS DE VISTA
ESPECULATIVOS
JOANA VINES, CIÈNCIA VIVA, FACULDADE DE CIÈNCIAS MÉDICAS DE LISBOA