1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1 - MUTAÇÃO DINÂMICA
Avanços na área de Genética Molecular permitiram o
desenvolvimento
de
técnicas
eficazes
para
o
isolamento
e
caracterização molecular de genes, refletindo diretamente na
aquisição de um maior conhecimento acerca das desordens de
etiologia genética. No início da década de 90, foi descrito um novo
mecanismo mutacional caracterizado pela expansão instável de
seqüências repetidas in tandem que ocorrem como polimorfismos
naturais nas populações. Este tipo de mutação, inicialmente
detectado
em
indivíduos
com
a
síndrome
do
X
frágil
foi
denominado de mutação dinâmica (Fu et al., 1991; La Spada et al.,
1991; Oberlé et al., 1991; Richards & Sutherland, 1992).
O mecanismo proposto para explicar a mutação dinâmica
envolve a expansão e a instabilidade de arranjos seqüenciais de
DNA que existem como pequenos segmentos estáveis distribuídos
por todo genoma humano (Gusella & MacDonald, 1996; Reddy &
Housman, 1997). As repetições mutantes são caracterizadas por
apresentarem tanto instabilidade somática quanto germinativa e,
mais freqüentemente, se expandem do que se contraem nas
sucessivas gerações (Masino & Pastore, 2001). Em grande parte
dos casos ocorre o fenômeno da antecipação que é a manifestação
mais precoce dos sintomas e/ou a maior severidade da doença nas
sucessivas
gerações,
estando
normalmente
relacionado
aos
tamanhos maiores de expansão da repetição e que pode ser
3
influenciado pela origem parental dos alelos (Richards & Sutherland,
1992; McInnis, 1996; Cummings & Zoghbi, 2000a; Richards, 2001).
A mutação dinâmica é responsável por uma série de
desordens neurológicas causadas por expansões de repetições
trinucleotídicas (Zoghbi & Orr, 2000; Sinden, 2001; Siyanova &
Mirkin, 2001) que, em geral, apresentam padrão de herança ligado
ao cromossomo X ou autossômico dominante (Cummings &
Zoghbi, 2000b).
1.2
-
DOENÇAS
ASSOCIADAS
A
REPETIÇÕES
TRINUCLEOTíDICAS
Baseando-se na localização das repetições no gene, as
doenças causadas por expansões trinucleotídicas
podem
ser
subdivididas em duas classes: a classe I onde as repetições
ocorrem na região não-codificadora dos genes e a classe II que é
caracterizada por repetições exônicas CAG que codificam domínios
de poliglutamina, exceto na distrofia muscular oculofaríngea
(OPMD) provocada pela expansão de repetições trinucleotícas GCG
na região codificadora do gene PABP2 (Brais et al., 1998;
Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi & Orr, 2000; Sinden, 2001)
(quadro 1).
4
Alterações envolvendo expansões trinucleotídicas foram
identificadas, ainda, nos loci KCNN3, ERDA1 e CTG18.1, mas
nenhum fenótipo associado foi identificado (Jin et al., 2001). Além
disso, foi observado que diversos genes associados a doenças em
humanos apresentam variações no número de repetições de
seqüências trinucleotídicas, o que sugere que números variáveis de
repetições em tandem (VNTRs) de seqüências genéricas possam
estar associados à manifestação de doenças (De Fonzo et al., 1998).
Variantes
alélicas
apresentando
seqüências
de
repetições
trinucleotídicas expandidas ou contraídas foram descritas em
associação à pseudoacondroplasia (PSACH), displasia múltipla
epifiseal (MED), displasia cleidocranial (CCD), simpolidactilia (SYN)
e holoprosencefalia (HPE). Nestes casos, entretanto, o mecanismo
proposto para a alteração difere da mutação dinâmica, sendo
atribuído à recombinação somática ou à duplicação (Mundlos et
al., 1997; Ohara, 2001; Brown et al., 2001).
5
Quadro 1: Características genéticas das doenças causadas por
repetições trinucleotídicas
DOENÇA
CLASSE
I
CLASSE
II
GENE E
LOCUS
REPETIÇÃO E
LOCALIZAÇÃO
Síndrome do X Frágil
FMR1/Xq27.3
Retardo Mental FRAXE
FMR2/Xq28
Distrofia Miotônica (DM)
DMPK/19q13
Ataxia de Friedreich
X25/9q13-21.1
Ataxia Espinocerebelar 8 (SCA8)
SCA8/13q21
Ataxia Espinocerebelar 12 (SCA12) PP2R2B/5q31-33
CGG - 5’ UTR
GCC- 5’ UTR
CTG - 3’ UTR
GAA – intron
CTG – 3’ UTR
CAG – 5’ UTR
Ataxia Espinocerebelar 1 (SCA1)
SCA1/6p23
Ataxia Espinocerebelar 2 (SCA2)
SCA2/12q24.1
Ataxia Espinocerebelar 3 (SCA3)
MJD1/14q32.1
Ataxia Espinocerebelar 6 (SCA6)
SCA6/19p13
Ataxia Espinocerebelar 7 (SCA7)
SCA7/3p12-13
Atrofia dentatorubral palidolusiana DRPLA/12p13.31
(DRPLA) e Síndrome de Haw-River
(HRS)
Doença de Huntington
HD/4p16.3
Doença de Kennedy (SBMA)
AR/Xq13-21
Ataxia Espinocerebelar 17 (SCA17)
TBP/6q27
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
CAG – seqüência codante
Baseado em OMIM 2002
1.2.1 - Classe I – Doenças Decorrentes da Amplificação de
Repetições Localizadas em Regiões Gênicas Não-Codificadoras
Esta classe de desordens é representada pela síndrome do
X frágil (FRAXA), que é causada por expansões de repetições
trinucleotídicas CGG, localizadas na região 5’ não traduzida do
primeiro exon do gene FMR1 sendo a segunda causa genética de
deficiência mental, só suplantada em freqüência pela síndrome de
Down (Meadows et al., 1996).
Também estão incluídos nesta classe, o retardo mental
FRAXE que é causado por expansões de repetições GCC na região
6
5’ não traduzida do gene FMR2; a distrofia miotônica (DM) uma
doença
de
herança
autossômica
dominante,
causada
pela
amplificação de seqüências trinucleotídicas CTG localizadas na
região 3’ não traduzida do gene DMPK; a ataxia espinocerebelar
tipo 8 (SCA8) que pertence ao grupo das ataxias hereditárias e que
é causada por expansões de trinucleotídeos CTG repetidos em
tandem localizadas na região 3’ não traduzida do gene SCA8; a
ataxia espinocerebelar tipo 12 (SCA12) que é uma desordem rara
causada pela amplificação de seqüências trinucleotídicas CAG
localizadas na região 5’ não traduzida do gene PP2R2B e a ataxia
de Friedreich (FRDA), única desordem do grupo a apresentar
padrão de herança autossômico recessivo sendo causada por
expansões de trinucleotídeos GAA presentes no primeiro intron do
gene X25 (Cummings & Zoghbi, 2000a).
As doenças pertencentes a esta classe são, tipicamente,
caracterizadas por apresentarem expansões longas e variáveis de
repetições que resultam em disfunção e/ou degeneração em
múltiplos tecidos. As manifestações fenotípicas variam de doença
para doença, assim como o mecanismo patogênico que pode ser
caracterizado pela perda ou ganho de função das respectivas
proteínas. Nestas desordens, em geral, ocorre a presença de alelos
intermediários, também denominados de pré-mutados, que podem
se expandir e tornarem-se mutados após a transmissão para a
geração subseqüente (Cummings & Zoghbi, 2000b; Sinden, 2001).
A transição entre os alelos pertencentes a faixa normal de
7
repetições e a faixa pré-mutada é dependente, entre outros fatores,
da estrutura primária do alelo, sendo que, a capacidade de
expansão está diretamente associada à perda de trinucleotídeos
intercalantes na repetição. As proteínas codificadas pelos genes
responsáveis pelas doenças desta classe são, geralmente, ausentes
ou expressas em níveis baixos (Masino & Pastore, 2001).
1.2.2 - Classe II – Doenças Decorrentes da Amplificação de
Repetições Localizadas em Regiões Codificadoras dos Genes
Esta classe de desordens é causada por expansões de
repetições CAG que são transcritas e traduzidas em longos
domínios poliglutamínicos na proteína codificada (Kakizuka, 1998).
São, caracteristicamente, doenças progressivas que se iniciam, em
geral, na idade adulta causando aumento da disfunção neuronal e,
eventualmente, perda total das funções neuronais 10 a 20 anos
após o aparecimento dos sintomas (Zoghbi & Orr, 2000). À exceção
da SBMA, todas estas desordens neurodegenerativas apresentam
padrão de herança autossômico dominante. Nesta classe, os alelos
normais situam-se na faixa entre 4 a 40 repetições trinucleotídicas
CAG, enquanto que os alelos expandidos apresentam entre 41 a
pouco mais de 100 repetições CAG (Gusella & MacDonald, 1996;
Paulson & Fischbeck, 1996).
8
Estudos realizados em modelos animais e em sistemas de
cultura de células têm revelado que estas desordens são causadas
por um mecanismo de ganho de função da proteína mutante, que
passa a exercer um efeito tóxico sobre a célula. Este fato sugere
que os tratos poliglutamínicos expandidos sejam, provavelmente, o
centro da patogênese, apesar das diferenças fenotípicas observadas
entre os pacientes e da especificidade dos tecidos afetados
(Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi, 2000). A presença de
agregados de proteína ou inclusões nucleares (INs), freqüentemente
encontrados no núcleo de células do sistema nervoso afetadas,
sugere um mecanismo patológico comum para estas desordens e
diversos estudos demonstram uma evidência substancial de que as
inclusões nucleares são tóxicas para as células neuronais e que,
conseqüentemente,
sua
presença
é
uma
causa
direta
da
patogênese (Fischbeck, 2001; Masino & Pastore, 2001). Entretanto,
outros estudos envolvendo modelos animais e cultura de células
sugerem que a formação destes agregados de proteína podem não
estar diretamente relacionados à toxicidade celular e, neste caso,
as inclusões nucleares formadas desempenhariam um papel
protetor nas células neuronais, consistindo de tentativas celulares
de degradar proteoliticamente ou inativar as proteínas tóxicas
expandidas (Cummings & Zoghbi, 2000b; Zoghbi & Orr, 2000;
Masino & Pastore, 2001).
Estão incluídas nesta classe a doença de Kennedy (SBMA)
que é uma desordem com herança ligada ao cromossomo X
9
recessiva,
a
doença
de
Huntington
(HD),
as
ataxias
espinocerebelares do tipo 1 (SCA1), 2 (SCA2), 3 (SCA3), 6 (SCA6), 7
(SCA7) e 17 (SCA17), a atrofia dentato-rubral palidolusiana
(DRPLA) e a síndrome de Haw-River (HRS).
1.3 - AS ATAXIAS
A ataxia consiste em uma alteração da motricidade que é
caracterizada pela falta de coordenação no movimento e no
equilíbrio,
podendo
resultar
de
qualquer
alteração
da
ação
conjugada da sensibilidade profunda, do labirinto e do cerebelo,
elementos
determinantes
na
coordenação
dos
movimentos
voluntários (Rosenberg, 1992).
Na maioria dos casos, as ataxias resultam de um dano ou
atrofia do cerebelo e podem ser divididas em duas categorias: as
ataxias
adquiridas,
de
caráter
não-genético
e
as
ataxias
hereditárias. As formas adquiridas são resultado da influência de
fatores ambientais tais como, exposição química, tumor ou trauma
cerebral. As ataxias hereditárias constituem um grupo extenso e
complexo
de
doenças
degenerativas
do
sistema
nervoso.
Entretanto, a etiologia genética é reconhecida apenas em poucos
casos. O espectro das ataxias hereditárias é amplo, apresentando
desde um envolvimento cerebelar puro ao acometimento cerebelar
10
e dos gânglios da base, incluindo síndromes medulares associadas
à neuropatia periférica (Imbert et al., 1996; Furtado et al., 1998;
Klockgether & Evert, 1998; Bürk et al., 1999).
As ataxias hereditárias podem ser classificadas em ataxias
autossômicas
recessivas
e
ataxias
de
herança
autossômica
dominante (Furtado et al., 1998). As ataxias recessivas são
causadas pela perda da atividade de proteínas que são essenciais
para a sobrevivência e função de uma população específica de
neurônios. A ataxia de Friedreich é o tipo mais comum desta forma
de ataxia. As ataxias autossômicas dominantes são caracterizadas
por uma grande heterogeneidade genética e por apresentarem
mecanismos patogênicos diferentes que as dividem em dois grupos:
o grupo I, representado pelas ataxias espinocerebelares do tipo
1(SCA1), 2 (SCA2), 3 (SCA3 ou doença de Machado-Joseph), 4
(SCA4), 5 (SCA5), 6 (SCA6), 7 (SCA7), 8 (SCA8), 10 (SCA10), 11
(SCA11), 12 (SCA12), 13 (SCA13), 14 (SCA14), 15 (SCA15), 16
(SCA16) e 17 (SCA17), e o grupo II, representado pelas ataxias
episódicas 1 (EA1), 2 (EA2), 3 (EA3) e 4 (EA4) (Klockgether & Evert,
1998; NAF, 2002) (quadro 2).
11
Quadro 2: Aspectos genéticos das ataxias hereditárias
DOENÇA
MUTAÇÃO
PROTEÍNA
Autossômicas Recessivas
Ataxia de Friedreich (FRDA)
Ataxia telangiectasia (AT)
Expansão GAA
Deleção, Inserção
Abetalipoproteneimia
Mutação Missense
Frataxina
Fosfatidilinositol –
3’quinase
Proteína Microsomal
transferidora de
triglicerídeo
Proteína transferidora de
α-Tocoferol
Esterol 27- hidroxilase
Ataxia com deficiência isolada de
Deleção
vitamina E
Cerebrotendinosa Xantomatosa Mutação Missense
Autossômicas Dominantes
Grupo I
SCA 1
SCA 2
SCA 3
SCA 4
SCA 5
SCA 6
SCA 7
SCA 8
SCA 10
SCA 11
SCA 12
SCA 13
SCA 14
SCA 15
SCA 16
SCA 17
Grupo II
EA -1
EA -2
Expansão CAG
Ataxina-1
Expansão CAG
Ataxina-2
Expansão CAG
Ataxina-3
?
?
?
?
Expansão CAG CACNA1A (canal de Ca 2+)
Expansão CAG
Ataxina-7
Expansão CTG
?
Expansão ATTCT
?
?
?
Expansão CAG
PP2R2B
?
?
?
?
?
?
?
?
Expansão CAG
Proteína de ligação ao
TATA-box
KCNA1(canal de K +)
Deleção, mutação CACNA1A (canal de Ca 2+)
Mutação Missense
por splicing
EA -3
EA -4
?
?
?
?
12
1.4 - ATAXIAS CEREBELARES AUTOSSÔMICAS DOMINANTES
As ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ADCA)
constituem
um
grupo
heterogêneo
de
doenças
neurológicas,
geralmente de manifestação tardia (por volta de 30 a 40 anos), que
são
caracterizadas
por
ataxia
progressiva
que
resulta
na
degeneração do cerebelo e de suas vias aferentes e eferentes
levando à falta de coordenação generalizada (Bürk et al., 1999). Há
poucos relatos sobre a prevalência mundial das ADCA, mas
estima-se que esta varie entre 0,3 e 2,0/100.000 habitantes (van
de Warrenburg et al., 2002).
As ADCA podem ser classificadas, clinicamente, em três
categorias (Harding, 1982): ADCA I (ADCA tipo I) que é a forma
mais comum sendo caracterizada por ataxia associada a outros
fatores neurológicos, entre eles, o envolvimento do sistema nervoso
central e periférico e que inclui as ataxias espinocerebelares do tipo
1 (SCA1), tipo 2 (SCA2), tipo 3 (SCA3/MJD) e tipo 4 (SCA4); ADCA
II
(ADCA
tipo
II)
que
associa
uma
síndrome
cerebelar
à
degeneração retiniana (maculopatia pigmentar) e é representada
pela ataxia espinocerebelar do tipo 7 (SCA7); e ADCA III (ADCA tipo
III) que se apresenta como uma síndrome cerebelar relativamente
pura sendo geneticamente heterogênea e que inclui as ataxias
espinocerebelares do tipo 5 (SCA5), tipo 6 (SCA6), tipo 10 (SCA10) e
tipo 11 (SCA11) (Worth et al., 1999).
13
A maioria dos genes responsáveis pelas ADCA apresenta o
mesmo tipo de mutação, a expansão instável de um polimorfismo
constituído de trinucleotídeos CAG (Orr et al., 1993; Dürr et al.,
1996; David et al., 1997; Geschwind et al., 1997; Michalik et al.,
1999).
1.5
-
A
DOENÇA
DE
MACHADO-JOSEPH
OU
ATAXIA
ESPINOCEREBELAR DO TIPO 3
Em 1972, Nakano e colaboradores descreveram a “doença
de Machado”, uma forma de ataxia hereditária em uma família
originária da ilha açoreana de São Miguel, a família de William
Machado. Em 1976, uma desordem semelhante à doença de
Machado foi descrita em uma família da Califórnia com ancestrais
de várias ilhas dos Açores, tendo sido denominada “doença de
Joseph” (Rosenberg et al., 1976). No início dos anos 80, diversos
estudos demonstraram que as doenças de Machado e Joseph
constituíam a mesma entidade. A partir de então, a doença passou
a ser referida como doença de Machado-Joseph (MIM# 109150).
Inicialmente descrita em duas famílias norte-americanas
originárias das ilhas portuguesas dos Açores e considerada uma
desordem distinta da doença de Machado-Joseph (MJD), a ataxia
espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) é considerada a forma mais
comum das ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ADCA)
14
(Rosenberg,
1992),
respondendo
por
15
a
40%
dos
casos
sugestivos, dependendo da população em estudo (Ranum et al.,
1995). Após a caracterização molecular do gene responsável pela
SCA3, ela passou a ser reconhecida como a mesma anomalia que
acometia os portadores da doença de Machado-Joseph (Takiyama
et al., 1993; Kawagushi et al., 1994).
Sequeiros e Coutinho (1993) sugeriram que o evento
mutacional que deu origem à SCA3 ocorreu em Portugal e se
estendeu aos Açores durante o período de colonização ao longo dos
séculos XV e XVI e, através da alta taxa de emigração para este
arquipélago no final do século XIX, se estendeu aos Estados Unidos
e Canadá. A SCA3 apresenta uma freqüência elevada (1/3.700
habitantes) nas ilhas portuguesas açoreanas de São Miguel e
Flores, sendo também considerada a forma mais comum das
ataxias hereditárias na Alemanha, no Brasil, nos Estados Unidos e
no Japão (Schöls et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997;
Geschiwind et al., 1997; Takano et al., 1998). Recentemente, em
um estudo, envolvendo 145 famílias holandesas com ADCA, foi
demonstrada a alta freqüência da SCA3 também nesta população,
onde 44% das famílias foram diagnosticadas com esta desordem
(van de Warrenburg et al., 2002).
A
enfermidade
progressiva,
associada
extrapiramidais,
atrofias
caracteriza-se
à
por
oftalmoplegia,
musculares
ataxia
sinais
distais
e
cerebelar
piramidais
retração
e
das
pálpebras. As manifestações da doença se iniciam, geralmente, na
15
idade adulta e se intensificam com o aparecimento dos sintomas
mais severos da doença (Kawagushi et al., 1994; Maciel et al.,
1995; Schöls et al., 1997). As diferentes manifestações clínicas da
doença de Machado-Joseph resultaram numa classificação em três
tipos: tipo I, grupo no qual a evolução da doença é mais rápida e
seu início é precoce (entre 20 e 30 anos), com sinais clínicos
geralmente mais severos (ataxia, oftalmoplegia e sinais piramidais e
extrapiramidais); tipo II, considerado o grupo mais comum, que
apresenta o início entre 30 e 40 anos e as manifestações clínicas
são limitadas a ataxia associada à oftalmoplegia e tipo III, onde o
início é o mais tardio (entre 40 e 60 anos) e a evolução da doença é
lenta, caracterizando-se por sinais periféricos com adição das
características do tipo II (Lopes-Cendes et al., 1997; Münchau et
al., 1999).
O locus da doença foi inicialmente mapeado no braço longo
do cromossomo 14, em 14q24.3-q32.1 (Takiyama et al., 1993). Em
1994,
Kawagushi
e
colaboradores
descreveram
a
localização
precisa do gene MJD1, também denominado de SCA3, em 14q32.1,
a partir do rastreamento de uma biblioteca de c-DNA do cérebro
humano utilizando uma sonda oligonucleotídica com 13 repetições
GTC, complementares às repetições CAG. O gene MJD1 é composto
por três exons e codifica a proteína ataxina-3. A SCA3 é decorrente
da expansão de seqüências trinucleotídicas CAG, localizadas na
região codificadora no terceiro exon deste gene. Esta expansão não
altera a transcrição nem a tradução do gene, porém leva à
16
formação
de
tratos
anormais
de
poliglutamina
na
proteína
(Kawagushi et al., 1994).
O polimorfismo do locus SCA3 foi avaliado em diferentes
populações, tendo sido caracterizado o grupo de alelos normais,
compreendendo uma faixa de repetições (CAG)n entre 12 e 40
unidades. Já os alelos mutantes apresentam entre 55 e 86
unidades da repetição (Igarashi et al., 1996) (Figura 1). Foi
observada
em
uma
família
alemã
à
presença
de
alelos
intermediários contendo 53 e 54 repetições (van Alfen et al., 2001).
Gene MJD1
1
2
3
Alelos Normais
CAG (12 - 40)
1
2
3
Alelos Mutados
CAG (55 - 86)
Figura 1: Representação esquemática do gene MJD1 com seus três
exons e as duas classes de alelos: normais e mutados; os exons 1,
2 e 3
; os introns
e a região polimórfica CAG no terceiro
exon
Kawaguchi e colaboradores (1994) realizaram um estudo
envolvendo 12 pacientes com SCA3 e 36 indivíduos normais
pertencentes à população japonesa e verificaram que em indivíduos
17
normais os alelos variaram entre 13 e 36 repetições CAG, enquanto
que alelos mutados apresentaram entre 69 e 72 repetições. No
quadro
3
estão
relacionados
os
dados
de
alguns
estudos
populacionais referentes ao locus SCA3.
Quadro 3: Caracterização do número de repetições CAG no gene
MJD1 em diferentes populações do mundo
Maciel
et al., 1995
População
Zhou
Pujana
et al., 1997 et al., 1999
Basu
et al., 2000
Várias
Chinesa
Espanhola
Indiana
Alelos
Normais
12-37
14-32
14-36
14-32
Alelos
Mutados
62-84
72-86
67-77
62-79
A transmissão de alelos expandidos está associada ao
aumento no comprimento da seqüência trinucleotídica (Gusella &
MacDonald, 1996) e o grau de instabilidade na transmissão destes
alelos apresenta diferenças de acordo com o sexo do genitor, sendo
mais freqüente a expansão por transmissão paterna (Maruyama et
al., 1995; Takiyama et al., 1995; Igarashi et al., 1996; Riess et al.,
1997). Assim como nas demais formas de ataxias espinocerebelares
descritas,
há
uma
correlação
inversa
entre
a
extensão
da
18
amplificação e a idade de aparecimento dos sintomas (Ranum et
al., 1995).
A ataxina-3, proteína codificada pelo gene MJD1 apresenta
359 resíduos e peso molecular estimado de 42 kDa sendo a menor
proteína descrita no grupo das doenças poliglutamínicas. Esta
proteína não apresenta função conhecida ou homologia com
nenhuma outra proteína já descrita (Tait et al., 1998). O trato
poliglutamínico ocorre na região carboxi-terminal, sendo a única do
grupo de doenças neurodegenerativas progressivas com
esta
característica (Kawagushi et al., 1994; Paulson & Fischbeck, 1996;
Paulson et al., 1997). Em 1997, Schmit e colaboradores isolaram e
caracterizaram o gene SCA3 em ratos e observaram que a ataxina3 destes é altamente homóloga a dos humanos, com uma
homologia na seqüência de aminoácidos de 88%. Entretanto, a
região carboxi-terminal da proteína isolada em camundongos difere
significativamente da seqüência descrita em humanos.
A
ataxina-3
é
encontrada,
predominantemente,
no
citoplasma em células de indivíduos normais, entretanto, em
tecidos de pacientes afetados pela SCA3, é também encontrada no
interior do núcleo das células destes tecidos, formando estruturas
denominadas inclusões nucleares (INs). Embora a ubiquitinação da
proteína mutante e a agregação nuclear tenham sido descritas, o
mecanismo
molecular
que
pode
explicar
como
ocorre
a
neurodegeneração ainda está pouco esclarecido (Paulson et al.,
19
1997). Os modelos propostos para explicar a patogênese incluem a
alteração da função da proteína e a aquisição de propriedades
interativas com outras proteínas, além da capacidade de agregação
com a proteína selvagem (Paulson et al., 2000) (Figura 2).
Normal
Afetado
Fonte: www.stanford.edu/group/hopes/rltdsci/trinuc/f6.html
Figura 2: Localização sub-celular da proteína ataxina-3. Em
células
de
indivíduos
normais
a
ataxina-3
localiza-se
preferencialmente no citoplasma, entretanto nas células de
indivíduos afetados esta se encontra no núcleo formando agregados
Não há relatos específicos sobre o polimorfismo do número
de repetições CAG no gene da ataxia espinocerebelar do tipo 3
(SCA3) ou doença de Machado-Joseph em indivíduos normais na
população do Estado do Rio de Janeiro. Entendemos que a
caracterização dos alelos na população de nosso Estado e,
particularmente, nos indivíduos acometidos de ataxia de causa
20
desconhecida é de extrema importância, já que esta doença faz
parte de um grupo que apresenta uma grande sobreposição de
fenótipos.
Conseqüentemente,
o
oferecimento
deste
tipo
de
avaliação em Serviços de Genética Humana permitirá o diagnóstico
da doença, possibilitando determinar a freqüência desta desordem
em nossa população.
21
2. OBJETIVOS
22
2.1 - OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho tem por objetivo realizar um estudo molecular
dos alelos do locus SCA3 na população do Estado do Rio de
Janeiro,
permitindo
a
caracterização
do
polimorfismo
na
população normal e entre indivíduos acometidos por ataxia
espinocerebelar de causa desconhecida.
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Caracterização dos alelos MJD1 em uma amostra de
indivíduos normais da população do Rio de Janeiro;
•
Determinação do padrão de distribuição dos diferentes
alelos do locus SCA3;
•
com
Identificação de alelos MJD1 mutantes entre indivíduos
sintomas
sugestivos
etiologia desconhecida.
de
ataxia
espinocerebelar
de
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
24
3.1 - OBTENÇÃO DE AMOSTRAS DE MATERIAL BIOLÓGICO
A análise do polimorfismo do locus SCA3 na população do
Estado do Rio de Janeiro foi realizada em 246 indivíduos, sendo
237 indivíduos anônimos normais e 9 indivíduos portadores de
ataxia espinocerebelar de etiologia desconhecida, pertencentes a
diferentes famílias.
A amostra de indivíduos normais consistiu de 118 homens
e 119 mulheres (faixa etária: 18 - 60 anos), doadores do Banco de
Sangue Herbert de Souza do Hospital Universitário Pedro Ernesto
(UERJ). Para manter o anonimato das amostras foi utilizado um
sistema de codificação alfanumérica, com indicação do sexo (M
para masculino e F para feminino). Foram analisados também 9
pacientes (3 homens e 6 mulheres – faixa etária: 7-68 anos)
portadores de ataxia espinocerebelar. Estes foram encaminhados
ao Serviço de Genética Humana da UERJ (SERVGEN) por médicos
neurologistas ou geneticistas do Hospital Universitário Pedro
Ernesto (HUPE/UERJ),
da
Maternidade
Escola
(UFRJ)
e
do
Instituto Fernandes Figueira (FIOCRUZ).
Amostras de sangue periférico para realização dos testes
genéticos somente foram colhidas após assinatura de um termo de
consentimento informado (Anexo I). A amostra de DNA de um
paciente portador de SCA3 apresentando alelos com 14 e 71
repetições CAG foi utilizada como controle, tendo sido gentilmente
25
cedida pela Drª. Íscia Lopes Cendes (Faculdade de Ciências
Médicas – UNICAMP).
A coleta de sangue periférico foi realizada por um técnico
em
análises
clínicas
seguindo
normas
de
plena
assepsia.
Utilizando-se tubos vacutainer com anticoagulante EDTA, foram
coletados 5 mL de sangue dos indivíduos normais e 10 mL dos
indivíduos com sintomas sugestivos de ataxia espinocerebelar,
referidos para análise molecular.
Este trabalho teve a aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) (Anexo II).
3.2 - EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
A extração do DNA genômico das amostras de sangue
periférico
seguiu
o
procedimento
descrito
por
Miller
e
colaboradores (1988), com pequenas modificações.
O tubo contendo sangue foi suavemente homogeneizado e o
sangue foi transferido para um tubo cônico de 50mL. Adicionou-se
a este volume, 3,5 vezes o volume inicial de tampão de lise de
hemácias (155 mM NH4Cl -Merck-, 10 mM KHCO3 -Merck-, 1 mM
EDTA -Amersham Pharmacia Biotech-) pH 7,4. O material foi
homogeneizado e incubado em gelo por 30 minutos. Em seguida, o
material foi centrifugado (Centrífuga Excelsa Baby II modelo 206-
26
R/Fanem) por 15 minutos em uma velocidade de 1500 rpm.
Terminada a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e ao
material precipitado foram adicionados 5 mL de tampão de lise de
hemácias. O material foi novamente homogeneizado, ressuspenso
cuidadosamente com o auxílio de um agitador para tubos do tipo
vórtex (Phoenix) e submetido a uma nova centrifugação por 15
minutos a 1500 rpm (Centrífuga Excelsa Baby II modelo 206R/Fanem).
Após centrifugação, todo sobrenadante foi descartado e o
precipitado ressuspenso com o auxílio do agitador para tubos do
tipo vórtex em 3mL de tampão de lise de núcleo (10 mM Tris-HCl Amersham Pharmacia Biotech, 400 mM NaCl -Isofar-, 2 mM EDTA)
pH 8,2. Foi então adicionado a este material 70µL de proteinase K
(20mg/mL – Gibco BRL-) e 150µL de SDS 20% (Amersham
Pharmacia Biotech) seguido de leve homogeneização. Em seguida, o
tubo foi incubado em banho de aquecimento (Fanem modelo 100) a
37°C por 20 horas.
Transcorridas às 20 horas, adicionou-se ao material 800 µL
de uma solução saturada de cloreto de sódio 6M e agitou-se
vigorosamente o tubo por 15 segundos. Para precipitação das
proteínas,
o
material
foi
submetido
a
uma
centrifugação
(Centrífuga Hitachi modelo Himac CR21) por 30 minutos a uma
velocidade de 6000 rpm/rotor 27. Terminada a centrifugação,
transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mL
27
ao qual foi adicionado 2 vezes o volume de etanol absoluto (Isofar)
gelado para a precipitação do DNA.
O precipitado foi lavado duas vezes em etanol 70% e
transferido
para
um
tubo
de
microcentrífuga
para
secar
a
temperatura ambiente por 24 horas. O DNA foi ressuspenso em
1mL de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) pH 7,4 e deixado
solubilizar em banho de aquecimento (Fanem modelo 100) a 37°C
por 3 dias. Após a solubilização, o DNA foi armazenado a 4°C.
3.3 - ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO DO DNA
As eletroforeses foram realizadas em gel de agarose 0,8%
(Gibco BRL) em tampão TBE 1X (89 mM Tris, 89 mM H3BO3 -Gibco
BRL-, 2 mM EDTA), em cuba horizontal (Horizon 58 - Gibco BRL-)
por 1 hora a 60 V.
As amostras foram preparadas utilizando-se 1 µL de DNA
que foi misturado a 4 µL de água milliQ e 1 µL de corante de
corrida (0,25% azul de bromofenol -Sigma-; 0,25% xileno cianol –
Merck- ; 40% glicerol -Merck-). Após o tempo da corrida, o gel de
agarose foi corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL -Sigma-) por
5-10 minutos. A estimativa da concentração das amostras de DNA
foi feita através da comparação destas com padrão de 100 ηg do
DNA do bacteriófago λ (Gibco BRL). Após a quantificação, uma
28
alíquota do DNA foi diluída a uma concentração de uso de 50 ηg/µl
e o restante do material foi armazenado a 4°C.
3.4 - AMPLIFICAÇÃO DO FRAGMENTO INTERNO DO GENE
MJD1 ATRAVÉS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
(PCR)
A amplificação do fragmento que contém o polimorfismo
CAG através da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada
utilizando-se
a
metodologia
descrita
por
Kawagushi
e
colaboradores (1994), com algumas modificações.
As
seqüências
dos
oligonucleotídeos
utilizados
neste
trabalho estão descritas abaixo:
• Primer MJD52 (FORWARD) – 5’ CCA GTG ACT ACT TTG ATT
CG 3’.
• Primer MJD25 (REVERSE) – 5’ TGG CCT TTC ACA TGG ATG
TGA A 3’.
As
reações
de
PCR
foram
realizadas
em
tubos
de
microcentrífuga de 200 µL com parede fina e incluíram 100ηg de
DNA genômico, tampão de reação 1X (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl
-Biotools-), 10% dimetilsulfóxido – DMSO - (Gibco BRL), 2,0 mM
MgCl2 (Biotools), 0,1% Triton X-100 (Gibco BRL), 0,25 mM de dNTP
(1 mM de dATP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dTTP e 1 mM de dGTP -
29
Amersham Pharmacia Biotech-), 5 pmol dos oligonucleotídeos
MJD52 e MJD25 (Kawagushi et al., 1994) e 2 U Taq DNA
polimerase (Biotools) em um volume final de 25 µL.
As reações foram conduzidas em um termociclador modelo
PTC-150 (MJ Research), e as condições de ciclagem estabelecidas
incluíram uma desnaturação inicial a 94° por 5 minutos, seguida
de 32 ciclos que incluíram três etapas: desnaturação a 94°C por 1
minuto, anelamento a 62°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1
minuto e, em seguida uma etapa de extensão a 72°C por 5
minutos.
3.5 - ANÁLISE DO POLIMORFISMO DOS ALELOS MJD1
Os fragmentos gerados por PCR foram separados através
eletroforese
vertical
(cuba
V16
-
Gibco
BRL-)
em
gel
de
poliacrilamida 12% não-desnaturante composto de 8,8 mL de uma
solução de acrilamida:bis acrilamida 30% (Gibco BRL), 4,4 mL de
TBE 5X (445 mM Tris, 445 mM H3BO3, 10 mM EDTA), 135 µL de
persulfato de amônio (APS) a 10% (Gibco BRL), 8,65 mL de água
milliQ e 15 µL de TEMED (Gibco BRL), utilizando-se TBE 1X (89
mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM EDTA) como tampão de corrida.
A
um
acrescentados
volume
2
µL
de
de
5µL
tampão
de
de
amostra
corrida
de
PCR
(0,25%
foram
azul
de
30
bromofenol, 0,25% xileno cianol, 40% glicerol) e aplicados em gel
para corrida eletroforética. Para determinação dos tamanhos dos
alelos, em paralelo às amostras de DNA amplificadas, foram
aplicados 5 µL de marcador de peso molecular 1kb DNA ladder
(Gibco BRL) e 5 µL de DNA de bacteriófago λ digerido com a enzima
de restrição PstI (Gibco BRL). A eletroforese foi realizada à
temperatura ambiente por 20 - 22 horas a 140V.
Após a eletroforese, o gel foi submetido à coloração por
prata (Santos et al., 1993). Primeiramente, o gel foi incubado sob
agitação moderada em uma solução fixadora contendo 10% de
etanol e 0,5% de ácido acético (Isofar) a 40°C por 3 minutos e, em
seguida, em uma solução de 10% etanol, 0,5% de ácido acético e
0,2% de nitrato de prata (Merck) a 40°C por 10 minutos. Após a
coloração, foi realizada uma lavagem de 20 segundos com água
MilliQ à temperatura ambiente. O gel foi revelado em solução
contendo 3% de hidróxido de sódio (Isofar) e 150 µL de formaldeído
(Merck) à temperatura ambiente por 15 minutos. Para intensificar
a coloração das bandas submetemos o gel a uma solução de 10%
de etanol e 0,5% de ácido acético a 40°C por 3 minutos.
Após o procedimento de coloração, o gel foi seco em uma
secadora de géis do tipo Gel Air Dryer (Bio-Rad).
31
3.6 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
Para determinar o número de repetições CAG nos alelos
SCA3, foi realizada uma conversão da medida da migração da
banda em cm para kb. O valor em kb foi obtido por meio de um
gráfico gerado através das medidas da migração dos padrões de
peso molecular (1kb DNA ladder e λPstI), utilizando-se o programa
Instat da Graph Pad Software, San Diego, USA.
O
número
de
repetições
CAG
nos
alelos
SCA3
foi
determinado pela fórmula N = A – 161/3, onde N é o número de
repetições CAG do alelo, A é o tamanho encontrado em pares de
bases no alelo, 161 é o fragmento mínimo a ser amplificado,
dividido por 3 por serem repetições trinucleotídicas.
A distribuição dos alelos MJD1 e das freqüências genotípicas da
população foram avaliadas quanto ao equilíbrio de Hardy-Weinberg
através do teste de qui-quadrado, ao nível de significância de 0,05. O
teste não-paramétrico U de Mann-Whitney foi aplicado para estabelecer
as diferenças entre o perfil de distribuição total das freqüências alélicas
entre homens e mulheres, também ao nível de significância de 0,05. O
uso do teste U de Mann-Withney deve-se ao fato dos nossos dados não
seguirem a distribuição normal, conforme verificado pela aplicação do
teste de Kolmogorov-Smirnov.
32
4. RESULTADOS
33
4.1 - ANÁLISE MOLECULAR DO GENE MJD1 EM INDIVÍDUOS
NORMAIS
Um total de 237 indivíduos anônimos da população do
Estado do Rio de Janeiro, sendo 118 do sexo masculino e 119 do
sexo feminino, com faixa etária compreendida entre 18 e 60 anos
foram avaliados neste estudo. O perfil de migração apresentado
pelos alelos MJD1 na separação eletroforética em um gel de
poliacrilamida 12% está representado na figura 3.
01
02
03
04 05
06
07 08
09
10 11
12
13 14
15 16
396pb ¾
344pb ¾
½339pb
298 pb¾
½264pb
½247pb
220pb ¾
201pb ¾
38
33
35
26
39
30
32
30
34
17
17
17
32
27
31
12
39
14
26
13
26
13
25
25
34
23
37
12
Figura 3: Perfil de migração apresentado pelos alelos MJD1 após
eletroforese em gel de poliacrilamida 12%. Raias 1-5, 7, 10-13, 15, 16 indivíduos heterozigotos; raias 6 e 14 – indivíduos homozigotos; raia 8 1Kb DNA Ladder; raia 9 – λPstI. O limite de tamanho entre alelos
normais e mutados está representado pela linha preta, que corresponde
a alelos com 326 pb equivalentes a 55 repetições CAG. O número de
repetições CAG apresentado por cada indivíduo está indicado na parte
inferior da figura
½216pb
½200pb
34
A análise molecular dos 474 alelos normais do gene MJD1
revelou um grau elevado de polimorfismo no padrão de distribuição
do número de repetições CAG,
tendo sido identificados
29
tamanhos diferentes de alelos. Os alelos normais apresentaram
entre 12 e 40 unidades de repetição CAG e a média dos tamanhos
dos alelos foi de 25,75 ± 6,53. A taxa de heterozigose observada foi
de 79% (tabela 1). A distribuição do número de repetições CAG foi
bimodal, apresentando um pico de alelos contendo 16 repetições e
um pico de alelos contendo 26 repetições (figura 4). Quando
analisados em conjunto, os alelos com 16 e 26 repetições CAG
representaram 17% do total da amostra analisada. Foi observado
somente um alelo contendo 40 repetições, sendo este o de menor
freqüência
(0,21%).
Cerca
de
51%
dos
alelos
analisados
apresentaram um tamanho compreendido na faixa entre 21 e 30
repetições CAG. Não foi observada em nossa distribuição a
presença de alelos intermediários que correspondem à faixa de
repetições entre 45 e 54.
35
Tabela 1: Distribuição da freqüência de repetições CAG nos alelos
MJD1 na população normal do Estado do Rio de Janeiro
Número de
repetições CAG
Número
de Alelos
Freqüência
Populacional (%)
12
4
0,84
13
4
0,84
14
9
1,90
15
18
3,79
16
33
6,96
17
26
5,49
18
10
2,11
19
7
1,48
20
6
1,27
21
2
0,42
22
6
1,27
23
9
1,90
24
20
4,22
25
39
8,23
26
48
10,13
27
37
7,81
28
28
5,91
29
28
5,91
30
26
5,49
31
24
5,06
32
19
4,00
33
20
4,22
34
13
2,74
35
7
1,48
36
15
3,16
37
7
1,48
38
4
0,84
39
4
0,84
40
1
0,21
Total
474
100
Figura 4: Padrão de distribuição do número de repetições CAG do gene MJD1 em indivíduos normais da população
do Estado do Rio de Janeiro
36
37
A distribuição total do número de repetições CAG nos alelos
de homens e mulheres foi comparada, utilizando-se o teste nãoparamétrico de Mann-Whitney, e observamos que os tamanhos dos
alelos
masculinos
e
femininos
apresentaram
uma
diferença
significativa (MW= 24630; P=0,206).
Ao compararmos, através do teste do qui-quadrado, o
número de repetições trinucleotídicas apresentado pelos alelos
encontrados em homens e em mulheres observamos uma diferença
significativa entre os alelos com 25 (χ2(1)=7,410; P<0,05), 29
(χ2(1)=5,143; P<0,05), 30 (χ2(1)=7,538; P<0,05) e 32 (χ2(1)=6,368; P<0,05)
repetições CAG.
Em indivíduos do sexo feminino foi verificado que os alelos
contendo 25 repetições CAG foram os mais freqüentes representando,
aproximadamente, 12% da amostra analisada, enquanto que em
indivíduos do sexo masculino estes alelos somente ocorreram em,
aproximadamente, 5% da amostra. Por outro lado, os alelos contendo
26 repetições apresentaram maior freqüência em homens, sendo este o
segundo tamanho de alelo mais freqüente na amostra de mulheres
(tabela 2 e figura 5).
38
Tabela 2: Distribuição do número de repetições CAG no gene MJD1
entre homens e mulheres da população normal do Rio de Janeiro
Nº de
repetições
CAG
Nº de
alelos ♂
Freqüência
em ♂ (%)
Nº de
alelos ♀
Freqüência
em ♀ (%)
12
3
1,27
1
0,42
13
1
0,42
3
1,26
14
4
1,70
5
2,10
15
10
4,24
8
3,36
16
13
5,51
20
8,40
17
13
5,51
13
5,46
18
3
1,27
7
2,94
19
5
2,12
2
0,84
20
1
0,42
5
2,10
21
0
0
2
0,84
22
5
2,12
1
0,42
23
3
1,27
6
2,52
24
9
3,81
11
4,62
25
11
4,66
28
11,77
26
24
10,16
24
10,08
27
23
9,75
14
5,88
28
13
5,51
15
6,30
29
20
8,48
8
3,36
30
6
2,54
20
8,40
31
13
5,51
11
4,62
32
15
6,36
4
1,68
33
10
4,24
10
4,20
34
8
3,39
5
2,10
35
5
2,12
2
0,84
36
10
4,24
5
2,10
37
4
1,70
3
1,26
38
1
0,42
3
1,26
39
2
0,84
2
0,84
40
1
0,42
0
0
Total
236
100
238
100
Figura 5: Gráfico demonstrando a variação do número de repetições CAG no gene MJD1 entre indivíduos do sexo
masculino (azul) e feminino (amarelo) da população normal do Estado do Rio de Janeiro
39
40
Objetivando a avaliação da distribuição de genótipos na
população e considerando a amplitude da amostra, os alelos MJD1
foram agrupados em três classes, de acordo com o número de
repetições CAG: pequenos (12 a 20 repetições), medianos (21 a 30
repetições) e longos (31 a 40 repetições). Após a genotipagem dos
indivíduos a distribuição dos alelos por classe foi avaliada entre os
sexos, conforme apresentado na tabela 3.
Tabela 3: Distribuição dos alelos normais do gene MJD1 entre
indivíduos do sexo masculino e feminino. Os alelos estão agrupados em
três classes de acordo com o número de repetições: pequenos (A) 12 -20
CAG; medianos (B) 21 - 30 CAG e longos (C) 31 - 40 CAG
Grupo de
Alelos
N
Freqüência
N♂
Populacional (%)
Freqüência
em ♂ (%)
N♀
Freqüência
em ♀ (%)
A (12-20)
117
24,7
53
22,5
64
26,9
B (21-30)
243
51,3
114
48,3
129
54,2
C (31-40)
114
24,0
69
29,2
45
18,9
Total
474
100
236
100
238
100
A avaliação do perfil de distribuição das classes alélicas
através do teste do qui-quadrado revelou que o número de
repetições nos alelos, por classe, entre homens e mulheres
apresentou diferença significativa (χ2(1)=5,053; P<0,05) nos alelos com
repetições maiores, sendo observado um excesso destes entre
indivíduos do sexo masculino. Este dado foi confirmado através da
41
análise
do
equilíbrio
de
Hardy-Weinberg
para
os
diferentes
genótipos. Esta análise revelou que a freqüência do genótipo AC
(pequenas-longas repetições) em indivíduos do sexo masculino foi
maior do que o esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg
(χ2(1)=7,529; P<0,05). Por outro lado, a freqüência do genótipo AA
(pequenas
repetições)
em
indivíduos
do
sexo
feminino
diferiu
significativamente do esperado no equilíbrio (χ2(1)=5,40; P<0,05), sendo
quatro vezes maior do que a observada em homens (tabela 4).
Tabela 4: Distribuição genotípica e freqüências relativas dos alelos do
gene MJD1 na população normal. Os alelos estão agrupados como
descrito na tabela 3
Genótipo
N
Freqüência
Populacional (%)
N♂
Freqüência
em ♂ (%)
N♀
Freqüência
em ♀ (%)
χ2
AA
15
6,3
3
2,5
12
10,0
5,400*
AB
53
22,4
22
18,6
31
26,0
1,528
AC
34
14,4
25
21,2
9
7,6
7,529*
BB
69
29,1
31
26,3
38
31,9
0,710
BC
52
21,9
30
25,4
22
18,5
1,230
CC
14
5,9
7
5,9
7
5,9
-
Total
237
100
118
100
119
100
-
* significante ao nível de P<0.05
42
4.2 - ANÁLISE MOLECULAR DO GENE MJD1 EM INDIVÍDUOS
ACOMETIDOS POR ATAXIA ESPINOCEREBELAR
A análise molecular do gene MJD1 foi realizada em 9
probandos (03 do sexo masculino e 06 do sexo feminino - faixa
etária: 7-68 anos) com sinais clínicos de ataxia espinocerebelar,
encaminhados por neurologistas e geneticistas ao Serviço de
Genética Humana da UERJ. Na análise destes pacientes utilizamos
como controle positivo uma amostra de DNA obtida de um paciente
portador de SCA3, que apresentava um alelo normal contendo 14
repetições e um alelo expandido com 71 repetições CAG.
Em 6 dos casos avaliados (pacientes SCA001, SCA003,
SCA004, SCA005, SCA006 e SCA007 – tabela 5), a análise
molecular revelou a presença de alelos contendo um número de
repetições CAG dentro da faixa de normalidade. Em 3 casos
(pacientes SCA002, SCA008 e SCA009 - tabela 5) identificamos a
presença de alelos expandidos, característicos dos portadores da
ataxia espinocerebelar tipo 3 (figura 6).
A partir da identificação da mutação no gene MJD1 em um
dos probandos (paciente SCA008 – tabela 5), realizamos também a
análise molecular deste gene na irmã da paciente (SCA008B- 40
anos) que apresentou sintomas de ataxia espinocerebelar aos 32
anos. Sua análise molecular revelou a presença de um alelo na
faixa normal, contendo 19 repetições CAG e um alelo expandido
43
contendo 69 repetições (figura 6). O heredograma da família é
mostrado na figura 7.
Tabela 5: Distribuição do número de repetições CAG dos alelos
MJD1 em pacientes com ataxia espinocerebelar de etiologia
desconhecida, encaminhados para análise molecular
Paciente
Sexo
Idade
N
SCA001
F
14
17 e 26
SCA002*
F
19
20 e 73
SCA003
M
7
20 e 23
SCA004
F
23
12 e 20
SCA005
F
45
20 e 26
SCA006
M
50
23 e 23
SCA007
F
67
18 e 23
SCA008*
F
37
19 e 68
SCA009*
M
19
28 e 72
o
de repetições CAG
* Pacientes portadores de SCA3
Figura 6: Análise molecular do gene MJD1 em indivíduos
portadores de SCA3. Raias: 1-SCA008, 2- SCA008B, 3-SCA009, 4 λPstI, 5 - 1Kb DNA ladder, 6- C+ SCA3, 7-SCA002. Os alelos
expandidos encontram-se acima da linha preta, que representa um
segmento de 326pb contendo 55 CAG. O número de repetições
CAG calculado para cada amostra está indicado na parte superior
da figura
01 02 03 04 05 06 07
19 19 28
68 69 72
14 20
71 73
½396pb
½344pb
339pb¾
½298pb
264pb¾
247pb¾
216pb¾
211pb¾
½220pb
½201pb
44
Figura 7: Heredograma do paciente SCA008. Após a confirmação
do diagnóstico clínico no probando (III-6), a avaliação molecular
revelou a presença de um alelo expandido em sua irmã (III-5), que
também apresenta os sintomas da doença
I
1
II
1
III
1
2
IV
2
3
4
5
[ ]
1
/
- normal
/
- portador de ataxia espinocerebelar
6
7
2
III5 e III6 – portadores de SCA3 confirmados por análise molecular.
Nas figuras 8A e B apresentamos os heredogramas dos
pacientes
SCA002
e
SCA009
(tabela
5)
identificados
como
portadores de expansões CAG no gene MJD1. Nenhum familiar foi
referido para avaliação molecular nestas famílias.
45
Figura 8: Heredograma dos pacientes SCA002 (8A) e SCA009 (8B).
I
1
A
II
1
2
3
4
5
III
6
7
1
1
I
1
II
B
1
III
IV
8
2
1
/
- normal
/
- portador ataxia espinocerebelar
2
3
4
5
3
6
7
8
2
(8A) – II5 portador de SCA3 confirmado por análise molecular
(8B) – IV portador de SCA3 confirmado por análise molecular
Os resultados obtidos no presente trabalho originaram o
manuscrito "Genetic characterization of MJD1 alleles and molecular
analysis of SCA3 patients from Rio de Janeiro, Brazil" (Anexo III),
submetido para publicação no periódico Genetic Testing.
46
5. DISCUSSÃO
47
A ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) ou doença de
Machado-Joseph foi originalmente descrita em famílias norteamericanas com ancestrais de portugueses açoreanos. Supõe-se
que, durante o período de colonização nos séculos XV e XVI, esta
desordem tenha sido disseminada por vários países, incluindo o
Brasil (Sequeiros & Coutinho, 1993; Gaspar, 2001).
O locus SCA3 é altamente polimórfico tanto em indivíduos
normais como em indivíduos portadores da doença e diversos
estudos moleculares vêm sendo realizados em várias populações
com objetivo de se obter maiores informações sobre a variação do
número de repetições CAG neste gene (Kawaguchi et al., 1994;
Maciel et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997; Zhou et al., 1997;
Matsuyama et al., 1999; Maciel et al., 2001; Silveira et al., 2002),
particularmente, porque a delimitação da faixa de alelos normais e
de alelos mutados varia entre as populações.
A distribuição do número de repetições CAG nos alelos
MJD1 (tabela 1) observada em nossa amostra de indivíduos
normais do Rio de Janeiro foi semelhante a de outras populações
do mundo já estudadas, apresentando 29 diferentes tamanhos de
alelos e com variações de repetições entre 12 e 40. Kawagushi e
colaboradores (1994) realizaram um estudo em 72 alelos normais
do gene SCA3 na população japonesa e observaram tamanhos de
repetições variando entre 13 e 36. Em um outro estudo, realizado
por Maciel e colaboradores (1995) em 186 alelos normais de
indivíduos de diversas etnias, o número de repetições CAG
48
observado encontrava-se na faixa entre 12 e 37. Matsuyama e
colaboradores
(1999)
realizaram
um
estudo
em
uma
ampla
amostra da população japonesa, tendo observado entre 2134 alelos
normais do gene SCA3 avaliados, um número de repetições maior,
com variações compreendidas entre 14 e 47 trincas CAG. Assim
como em outras populações estudadas, em nossa amostra não
foram observados alelos do gene MJD1 na faixa intermediária (entre
45 e 54 repetições) (Maciel et al., 1995; Lopes-Cendes et al., 1997;
Maciel et al., 2001; van de Warrenburg et al., 2002). Entretanto,
van Alfen e colaboradores (2001) reportaram a presença de alelos
contendo 53 e 54 repetições, associados com fenótipos anormais,
em dois indivíduos de uma família alemã e sugeriram que tais
repetições poderiam ser patológicas.
De maneira semelhante ao observado em outras populações
estudadas, em nossa distribuição de repetições CAG no locus
SCA3,
observamos
uma
taxa
elevada
de
heterozigose
(aproximadamente 80%). Em 1997, foi realizado um estudo na
população brasileira onde foi estimada a taxa de heterozigose para
o locus SCA3 em 91,3% (Lopes-Cendes et al., 1997). A análise do
gene MJD1 na população espanhola demonstrou uma taxa de
heterozigose em torno de 86% (Pujana et al., 1999) enquanto que
na população indiana esta variou entre 82% e 87% (Basu et al.,
2000).
A distribuição do número de repetições CAG no gene MJD1,
na população estudada, apresenta dois picos, um deles de alelos
49
contendo 26 repetições e outro de 16 repetições, sendo considerada
bimodal (figura 4). Os alelos mais freqüentes apresentaram 26
(10%), 25 (8%) e 16 (7%) repetições CAG. Nossos dados são
similares aos reportados por Maciel e colaboradores (1995) em uma
amostra
de
indivíduos
de
diferentes
origens
étnicas,
que
apresentaram uma distribuição bimodal com um pico em 24
repetições (18%) e um pico alternativo em 14 (9,5%). Entretanto,
nossos dados diferem dos relacionados à população japonesa que
apresentou distribuição unimodal, tendo como moda 14 repetições
(Kawagushi et al., 1994; Matsuyama et al., 1999). Por sua vez, na
população indiana foi observado que os alelos normais mais
freqüentes no locus SCA3 apresentaram 23 (30%) e 27 (20%)
repetições
CAG
(Saleem
et
al.,
2000).
heterogeneidade
genética
da
população
É
provável
brasileira
que
possa
a
ter
influenciado, significativamente, o padrão de distribuição do
número de repetições CAG dos alelos MJD1 em indivíduos normais.
Também
foi
observada
em
nossa
distribuição,
uma
freqüência elevada (51%) de alelos na faixa entre 21 e 30 repetições
CAG. Este dado é concordante com o relatado por Pujana e
colaboradores (1999), que encontraram uma freqüência de 52%
nesta mesma faixa de alelos em estudo realizado na população
espanhola e por Maciel e colaboradores (2001) no estudo realizado
em
Portugal
onde
aproximadamente 51%.
foi
observada
uma
freqüência
de
50
Verificamos através do teste não-paramétrico de MannWithney que a distribuição do número de repetições CAG nos
alelos normais do gene MJD1 entre os sexos apresentou diferença
significativa. A comparação entre os tamanhos individuais dos
alelos entre indivíduos do sexo masculino e feminino demonstrou,
através do teste do qui-quadrado, uma diferença significativa
envolvendo quatro diferentes tamanhos de alelos: 25, 29, 30 e 32
(figura
5).
Os
alelos
com
25
e
30
repetições
foram
significativamente mais freqüentes em mulheres, no entanto, em
homens, os alelos com 29 e 32 repetições foram os mais
freqüentes. Não há relatos específicos sobre estudos realizados em
outras populações onde haja comparação das freqüências dos
tamanhos de alelos observadas entre homens e mulheres.
Os alelos encontrados com maior freqüência na população
masculina foram os com 26 repetições CAG, sendo este o segundo
tamanho mais freqüente na população feminina. Nesta, os alelos
com 25 repetições apresentaram maior freqüência, representando
aproximadamente 12% do total da amostra de alelos femininos
analisado.
Ao subdividirmos os tamanhos dos alelos MJD1 em 3
classes, de acordo com o número de repetições CAG, verificamos
um desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg, através do teste do
qui-quadrado, na análise das classes entre os sexos, sendo
observado um excesso de alelos normais com longas repetições em
homens (χ2(1)=5,053; P<0,05) (tabela 3). Matsuyama e colaboradores
51
(1999) realizaram um estudo analisando alelos de indivíduos
normais da população japonesa, onde os tamanhos de alelos
encontrados foram divididos em quatro grupos: A (14-17 CAG), B
(18-23 CAG), C (24-25CAG) e D (26-47CAG), entretanto, estes
autores não observaram diferença significativa na análise dos
grupos entre os sexos.
Em nosso estudo, os alelos classificados por tamanho foram
avaliados quanto à distribuição de genótipos entre indivíduos do
sexo masculino e do sexo feminino. O genótipo AC, constituído por
alelos contendo repetições pequenas e longas foi significativamente
mais freqüente em indivíduos do sexo masculino (χ2(1)=7,529;
P<0,05). Entretanto, em mulheres observamos um aumento significativo
do genótipo AA, constituído somente por alelos contendo pequenas
repetições (χ2(1)=5,400; P<0,05) (tabela 4). Foi relatado para a SCA3 que
os alelos de herança paterna são mais sujeitos à expansão do que os
alelos de herança materna (Maruyama et al., 1995; Takiyama et al.,
1995).
Em
1996,
Igarashi
e
colaboradores
identificaram
um
polimorfismo nucleotídico CGG/GGG próximo à região 3’ da repetição
CAG e observaram que há um risco 75 vezes maior de expansão em
indivíduos do sexo masculino que apresentam o haplótipo (alelo
expandido ligado ao trinucleotídeo CGG e alelo normal ligado ao
trinucleotídeo GGG). Sendo assim, a elevada freqüência de alelos
normais com longas repetições observada nos indivíduos do sexo
masculino em nossa população pode estar relacionada à transmissão
52
preferencial do alelo mutado por via paterna. Torna-se, então,
necessária a avaliação do polimorfismo CGG/GGG nestes indivíduos.
A análise do padrão de repetições CAG nos alelos SCA3
realizada
em
9
probandos
acometidos
por
ataxia
de
etiologia
desconhecida, revelou a presença de 3 casos de ataxia espinocerebelar
tipo 3, além da confirmação do diagnóstico clínico em um familiar .
Todos os pacientes acometidos apresentaram o alelo expandido
em heterozigose. Os alelos expandidos encontrados situaram-se na
faixa compreendida entre 68 e 73 repetições (tabela 5). Resultados
similares foram observados nas populações avaliadas por Maciel e
colaboradores (1995) (diferentes etnias), Lopes-Cendes e colaboradores,
(1997) (Brasil) e Zhou e colaboradores (1997) (China).
Um aspecto interessante identificado neste trabalho foi a idade
de manifestação dos sintomas. Os pacientes que apresentaram alelos
com expansões maiores (SCA002 - 73 repetições CAG e SCA009 – 72
repetições) relataram um início precoce da doença (a paciente SCA002,
aos 19 anos, já se encontrava em cadeiras de rodas e no paciente
SCA009, os sintomas manifestaram-se inicialmente aos 17 anos), o que
está de acordo com a ocorrência de antecipação, já estabelecida em
famílias que apresentam SCA3. A análise molecular dos genitores
destes pacientes seria necessária para a confirmação do fenômeno.
Entretanto, os relatos destes pacientes sugerem que os sintomas dos
ancestrais potencialmente acometidos tenha sido mais tardio.
53
6. CONCLUSÕES
54
ƒ
A
análise
molecular
do
número
de
repetições
trinucleotídicas CAG no gene MJD1 realizada em 237 indivíduos
normais da população do Estado do Rio de Janeiro revelou um elevado
grau de polimorfismo, tendo sido identificados 29 tamanhos diferentes
de alelos. O número de repetições CAG variou entre 12-40 (X = 25,75 ±
6,53) e a taxa de heterozigose observada foi de 79%. A distribuição
do número de repetições CAG é bimodal, apresentando um pico
com alelos contendo 16 repetições e um pico com alelos contendo
26 repetições.
ƒ
A distribuição do número de repetições CAG nos alelos
normais do gene MJD1 entre homens e mulheres apresentou uma
diferença significativa, sendo observado um excesso de alelos normais
com maior número de expansões (31-40 repetições CAG) em homens.
ƒ
A
análise
molecular
do
número
de
repetições
trinucleotídicas CAG no gene MJD1 realizada em 9 indivíduos
portadores de ataxia de etiologia desconhecida revelou a presença de
alelos expandidos (68-73 repetições CAG) em 3 indivíduos, confirmando
a SCA3 nestes indivíduos.
ƒ
As condições ótimas para o diagnóstico molecular da
mutação responsável pela SCA3 foram estabelecidas com sucesso e a
metodologia
se
mostrou
apropriada
para
diferenciar
pacientes
portadores de ataxia espinocerebelar do tipo 3 dos portadores de outras
formas de ataxia espinocerebelar.
55
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Karube Y, Shimazaki H, Soutome M, Endo K, Ohta S, Kagawa Y,
Kanazawa I, Mizuno Y, Yoshida M, Yuasa T, Horikawa Y, Oyanagi K,
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67
8. ANEXOS
68
ANEXO I:
TERMO DE CONSENTIMENTO
Título
do
Estudo:
ESTUDO
MOLECULAR
DAS
ATAXIAS
ESPINOCEREBELARES
AUTOSSÔMICAS
DOMINANTES
NA
POPULAÇÃO DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Instituição: Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Unidade: Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes
Pesquisadores:
Stênio Fernando Pimentel Duarte
Raquel de Souza Gestinari
Marcelo Aguiar Costa Lima
Márcia Mattos Gonçalves Pimentel
Nome do Paciente:____________________________________________________
Número:____________________
Eu, _________________________________________________como responsável
pelo paciente acima citado, estou ciente e autorizo a sua participação
na pesquisa desenvolvida pelo Serviço de Genética Humana (SERVGEN)
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro visando à investigação
diagnóstica de casos ataxia espinocerebelar autossômica dominante,
através de metodologias de biologia molecular.
Declaro ter compreendido que o trabalho tem como objetivo a
implementação de novas técnicas laboratoriais para investigação de
doenças genéticas, a partir de indivíduos com sintomas sugestivos de
ataxia espinocerebelar. De acordo com o que me foi informado, o estudo
beneficiará os pacientes, através dos diagnósticos encontrados, e
também suas famílias com relação ao aconselhamento genético
apropriado.
Para realização dos exames serão extraídos 10mL de sangue periférico.
Esta quantidade é suficiente para as análises em questão, mas, caso
não haja obtenção de material biológico suficiente para a análise, o
paciente poderá ser convidado, futuramente, para nova colheita. O
material somente será utilizado para a finalidade deste projeto.
Declaro que me foi informado, que o referido exame não apresenta risco
ao paciente, sendo realizado com material descartável e acompanhado
pelos pesquisadores responsáveis. Os exames serão realizados no
laboratório da Instituição envolvida.
69
A participação do paciente neste estudo é voluntária e o responsável
poderá recusar-se a participar ou se afastar dele a qualquer momento,
não havendo prejuízo algum no acompanhamento do paciente nesta
Instituição.
O sigilo e a confidencialidade das informações levantadas serão
preservados, assim como a identidade dos envolvidos não será revelada.
Cada amostra de material biológico fará parte de um banco de dados,
sendo identificada por códigos específicos. Os resultados, tanto
positivos como negativos, serão entregues a cada família e também
serão utilizados com fins científicos, podendo ser publicados em
revistas científicas, estando os registros disponíveis para uso da
pesquisa.
O responsável terá todo e qualquer esclarecimento sobre este estudo
durante e após a duração da pesquisa.
Declaro que li e entendi o que me foi explicado.
Rio de Janeiro, ________de _____________________de __________________.
Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Assinatura do responsável:____________________________________________
Assinatura do pesquisador:____________________________________________